Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка экспресс-методов диагностики ботулизма

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка экспресс-методов диагностики ботулизма"

На правах рукописи

МУСТАФИН ТИМУР РУСТЕМОВИЧ

РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС - МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ БОТУЛИЗМА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2014

1 о АПР 2014

005546962

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ») г. Казань

Научный руководитель: Чернов Альберт Николаевич

доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Алимов Азат Миргасимович - доктор ветеринарных

наук, профессор, заведующий кафедрой биологической и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»

Муртазина Гульнара Харисовна - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Чувашская государственная

сельскохозяйственная академия»

Защита состоится « » ¿¿егЗЛ- 2014 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д - 220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» по адресу: 420075, г. Казань, Научный городок — 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Автореферат разослан «хУ>> ^¿¡¿¿^ 2014 г. Полный текст диссертации и автореферата, отзыв научного руководителя размещены на официальном сайте ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» vyww.vnivi.ru: объявление о защите - на официальном сайте ВАК РФ www.vak2.gov.ru.

Ученый секретарь /1 /

диссертационного совета Степанов В. И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Ботулизм - тяжелая интоксикация, возникающая в результате употребления в пищу продуктов, содержащих токсины Clostridium botulinum и характеризующаяся преимущественным поражением центральной и вегетативной нервной системы [7].

В настоящее время известно 8 типов возбудителя ботулизма (А, В, Са, Ср, D, Е, F, G), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками [11].

Анализируя литературные данные по диагностике ботулизма, можно заключить, что наиболее перспективными являются люминесцентный анализ с применением флуоресцирующих антител [2], иммуноферментный анализ [1, 12], который находит широкое применение для определения и количественной дифференциации типов ботулини-ческих токсинов [15], реакция непрямой гемагглютинации [9], полимеразная цепная реакция [14]. Вместе с тем, самым распространенным в настоящее время методом индикации ботулинического токсина является биопроба с реакцией нейтрализации токсина на белых мышах [6, 7, 10, 13]. Однако, данный метод занимает длительное время исследования. На сегодняшний день ветеринарная медицина не располагает средствами и методами экспресс - индикации возбудителя ботулизма и обнаружения ботулинического токсина. Всё вышеописанное и обуславливает актуальность настоящей работы и необходимость разработки экспресс анализа для обнаружения возбудителя ботулизма и его токсинов.

Степень разработанности проблемы. Диагностика ботулизма имеет целый ряд проблем. Это, во-первых, связано со сложностью культивирования клостридий как ана-робов и отсутствием селективных питательных сред для них. Кроме того, единствен-ым методом, позволяющим с высокой чувствительностью идентифицировать ботули-ические нейротоксины, является биопроба на мышах в сочетании с реакцией нейтра-изации специфическими анатоксинами. Данный метод требует большого количества абораторных животных, использование которых в настоящее время принято считать еэтичным. Помимо этого, биопроба не всегда обеспечивает получение необходимой нформации. По статистическим данным, 65% клинических случаев ботулизма не име-т лабораторного подтверждения.

Цель и задачи. Целью работы являлась разработка методов экспресс-индикации озбудителя ботулизма и его токсина в объектах ветеринарного надзора.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка полиспецифической композиционной смеси ботулинических

антигенов.

2. Получение высокоактивной поливалентной антиботулинической сыворотки.

3. Создание полиспецифического антигенного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА.

4. Получение полиспецифического антительного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА.

5. Разработка полиспецифического люминесцирующего ботулинического глобулина дляМФА.

6. Получение полиспецифического пероксидазного иммуноферментного коньюгата для экспресс-диагностики ботулизма методом ИФА.

Научная новизна. Впервые составлена восьми компонентная композиция антигенов, включающая в себя корпускулярные антигены возбудителя Cl.botulinum типов А, В, С, D и их анатоксинов, которая в свою очередь послужила основой для получения высокочувствительного полиспецифического антигенного эритроцитарного диагностикума и препарата для гипериммунизации кроликов с целью получения высокоактивных поливалентных сывороток, на основе которых разработаны: высокочувствительный полиспецифический антительный эритроцитарный диагностикум, люминесцирующий глобулин, а также иммуноферментный коньюгат для экспресс-диагностики возбудителей Cl.botulinum и их токсинов в объектах внешней среды и патологическом материале в РНГА, МФА и ИФА. Разработанные диагностикумы дают возможность получать результаты в течение 4-5 ч, в то время как общепринятые методы индикации - биопроба и реакция нейтрализации позволяют получать результат в течение 10 суток.

Теоретическая и практическая значимость. Всестороннее и детальное изучение возбудителей ботулизма и их токсинов позволило разработать метод получения высокоактивной поливалентной антиботулинической сыворотки и на её основе получить высокоспецифичные диагностикумы, которые пригодны для экстренной индикации данного возбудителя и его токсина в объектах внешней среды и патологическом материале в течение 4-5 часов.

Методология и методы исследований.

При проведении исследований применяли методы:

1) клинические - заражение возбудителем Cl. botulinum и наблюдение за подопытными животными (белые мыши, морские свинки, кролики). Взятие крови, гипериммунизация;

2) бактериологические - посевы Cl. botulinum на МПА с 2% глюкозой, среду Китга-Тароцци, бульон Хоттингера с 1% глюкозой, выделение чистых культур, получение и наработка бактериальной массы и продуцируемого ими токсина;

3) культурально-морфологические и биохимические — изучение сахаролитических и протеолитических свойства штаммов Cl. botulinum;

4) микроскопические — световая и люминесцентная микроскопия;

5) серологические - постановка РН; РНГА; ИФА;

6) радиобиологические - инактивация возбудителя Cl. botulinum на гамма - установке «Исследователь» с источником излучения 60Со;

7) химические - инактивация возбудителя Cl. botulinum и перевод их токсинов в анатоксины с использованием 40%-ного раствора формалина.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка полиспецифической композиционной смеси ботулинических антигенов;

- получение поливалентной гипериммунной антиботулинической сыворотки;

- создание полиспецифического антигенного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РИГА;

- разработка полиспецифического антительного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РИГА;

- получение полиспецифического люминесцирующего ботулинического глобулина для МФА;

- разработка полиспецифического пероксидазного иммуноферментного коньюгата.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на производственных совещаниях лаборатории, на ежегодных заседаниях ученого совета ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» при обсуждении отчетов о НИР за 2010-2014 г.г. и на Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» (Казань, 2013 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 5

- в изданиях, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки Российской Федерации.

Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, основную часть, заключение, список сокращений и условных обозначений, список литературы, список иллюстративного материала и приложения, состоящий из 169 источников, в том числе 84 иностранных авторов и приложение. Диссертация содержит 14 таблиц.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2010-2014 г.г. в лаборатории музей штаммов особо опасных болезней ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в соответствии с планом научных исследований (№ гос. регистрации 01200202604).

В процессе выполнения работы были использованы:

Подопытные животные: 384 белых мышей массой 18-20 г., 46 морских свинок массой 300-350 г., 38 кроликов породы «Шиншилла», массой 2-3 кг., 1 баран-донор.

Штаммы и микробные антигены: Музейные штаммы возбудителя ботулизма: тип А - штамм № 98, получен из США в 1931 году, токсичен для белых мышей — 50000 Dlm/мл; тип В - штамм 16-Я, получен в НИВИ 1980 году, токсичен для белых мышей -3000 Dlm/мл; тип С - штамм № 91, выделен в 1956 году, токсичен для белых мышей - 75 Dlm/мл; тип D - штамм SHU, выделен в 1956 году, нетоксичный; тип Е - штамм 153, выделен в 1977 году, токсичен для белых мышей - 30000 Dlm/мл; тип F - штамм 5964, выделен в 1974 году, токсичность для белых мышей - 100000 Dlm/мл; тип G - штамм 1352, выделен в 1977 году, токсичность для белых мышей - 1000 Dlm/мл.

Стандартные моновалентные антигены Cl.botulinum А, В, С, D, Е, F, G: 1) изготовленные из возбудителей с содержанием не менее 1млн. м.к. /см , 2) изготовленные из токсинов с содержанием не менее 300 Dim.

Гетерологичные штаммы: CI. perfringens, B.anthracis штамм 55, E.coli, В. subtilis.

Все перечисленные возбудители из коллекции музей штаммов особо опасных болезней ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ», где и выполнялась данная работа.

Оборудование и реактивы. Для инактивации микробных клеток использовали гамма - установку «Исследователь» с источником излучения 60Со, холодильники, термостаты, анаэростат, водяные бани, центрифуги, магнитные мешалки.

В микробиологических, иммунологических, серологических исследованиях применяли стандартные растворы, питательные среды, метаболиты, необходимые химические растворы, сыворотки и антисыворотки, согласно межгосударственному стандарту (ГОСТ 10444.7-86) «Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum», Москва 2002 г.

Исследования проводили с соблюдением санитарных правил СП 1.2.036-95 по работе с возбудителями особо опасных болезней I и П группы патогенности.

2.2 Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств С1. botulinum

Для получения ботулинического антигена и анатоксина из типов А, В, С, D, Е, F, G возбудителя Cl. botulinum были использованны музейные штаммы: № 98; 16-Я; 91; SHU; 153; 5964; 1352; культуры проверены по культурально-биохимическим, морфологическим, токсигенным свойствам.

По результатам исследования штаммы: № 98 - тип А; 16-Я - тип В; 91 - тип С; SHU - тип D; 153 - тип Е; 5964 - тип F; 1352 - тип G возбудителя Cl. botulinum для соответствия паспортным данным, проводили их пассаж на морских свинках. Для этого животным вводили ботулиническую культуру внутрибрюшинно в концентрации по 200 млн. м.к./мл в дозе 3 см3. У павших животных отбирали органы (тонкий, толстый отдел кишечника и др.) и растирали в ступке с добавлением физиологического раствора. По-

лученную гомогенную взвесь оставляли на 1,5-2 ч при комнатной температуре для экстрагирования, затем профильтровывали и высевали на питательные среды.

Вышеуказанные культуры высевали в среду Хоттингера (рН 5,0; под вазелиновым маслом - готовят по ГОСТ 10444,1-84), а также в среду Китг-Тароцци с 1% глюкозой (рН 7,4; под вазелиновым маслом - готовят по ГОСТ 10444,1-84) для получения бактериальной массы. Посевы культивировали в термостате при температуре 26-35 С (в зависимости от штамма) в течение 8 сут для накопления токсина, с последующей проверкой их по культурапьно-биохимическим, морфологическим свойствам и токсичности, после пассажа на морских свинках, по вышеописанным методикам (табл.1).

Таблица 1 - Культурально-биохимические свойства пассажированых штаммов С1. botulinum ___

Штаммы Cl.botulinum Обезжиренное молоко мпж H2S Среда Гисса

глюкоза лактоза сахароза маннит мальтоза

98 топ А пепт. разж. обр. к/- к/- к/г к/г к/г

16-Я тип В пепт. разж. обр. к/г к/- к/- к/г к/г

91 типС пепт. разж./г необр. к/- к/г к/г к/- к/-

SHU тип D пепт./г разж. обр. к/г к/г к/г к/г к/-

153 типЕ пепт. разж. обр. к/- к/г к/- к/г к/г

5964 тип F пепт./г разж. необр. к/- к/- к/г к/- к/-

1352 тип G пепт./г разж. обр. к/г к/г к/- к/г к/г

Условные обозначения: К-кислота, Г-газ, + реакция положительная, - реакция отрицательная

2.2.1 Получение антигенов из Cl.botulinum типов А, В, С, D

Для наработки бактериальной массы пассажированные штаммы Cl.botulinum № 98 - тип А; 16-Я - тип В; 91 - тип С; SHU - тип D высевали на мясо-пептонный агар с 2% глюкозой, культивировали в анаэростате при температуре 35°С в течение 3-х суток, после чего культуру смывали 0,85% изотоническим раствором NaCl. Бактериальную взвесь отмывали дважды стерильным физиологическим раствором для освобождения от пептона. Из осадка микробных клеток готовили 200 млн. взвесь по стандарту мутности им.Тарасевича. Эти манипуляции проводились отдельно с каждым типом возбудителя.

Полученную взвесь использовали для получения антигенов тремя методами: без воздействия - нативный, радиационный и химический.

Радиационный метод - заключался в воздействии гамма-лучей на бактериальную клетку с целью её инактивации на установке «Исследователь» с источником излучения

60Со. При этом определена доза поглощения для образцов, которая составила 30 кГр., путем проверки на стерильность посевами на МПА с 2% глюкозой. Инкубировали при температуре 35°С в анаэростате в течение 15 сут, при отсутствии роста, бактериальную взвесь использовали для дальнейшей работы в качестве инактивированного корпускулярного антигена [3].

Химический метод - заключался в инактивации образцов путем внесения в нее 40%-го формалина в количестве 0,35-0,55% к общему объему, определения конечной концентрации его бактерицидного действия. После внесения формалина образцы С1. botulinum культивировали в среде Китт-Тароцци с 1% глюкозой в термостате при температуре 34°С в течение 4-х недель, проверяли на стерильность путем посева на МПА с 2% глюкозой, инкубированием при температуре 35°С в анаэростате в течение 5 суток. При отсутствии роста, инактивированную бактериальную взвесь использовали для дальнейшей работы в качестве инактивированного липополисахаридного антигена.

2.2.2 Получение анатоксинов из Cl.botulinum типов А, В, С, D

Для получения анатоксина, пассажированные штаммы Cl.botulinum N2 98 - тип А; 16-Я - тип В; 91 - тип С; SHU - тип D, высевали в среду Хотгингера с 1% глюкозой (pH 5,0 под вазелиновым маслом - готовили по ГОСТ 10444,1-84) и культивировали в течение 8 суток. С помощью градуированной пипетки удаляли с поверхности среды вазелиновое масло. После удаления вазелинового масла содержимое колбы центрифугировали при 8000 об/мин в течение 25 мин и отсасывали надосадочную жидкость. Проверяли надосадочную жидкость на наличие токсина, для этого жидкость вводили белым мышам внутрибрюшинно в дозе по 0,5 см3. Результаты учитывали в течении 10 дней. Эти манипуляции проводились отдельно с каждым типом возбудителя.

В надосадочной жидкости, на основании результатов биопробы и реакции нейтрализации, установлено присутствие токсинов в типах А, В и С. Для Cl.botulinum штамма SHU - тип D токсигенность отсутствовала, что совпадает с паспортными данными возбудителя.

Из полученной и проверенной надосадочной жидкости осаждали токсин. Для этого супернатант ставили на магнитную мешалку при температуре +4° С на 20 мин, добавляя высушенную соль сульфата аммония (оптимальная концентрация для осаждения токсина 50% к общему объему). По истечении этого времени, насыщенную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин, в течение 30 мин, надосадок удаляли, а осадок растворяли стерильной дистиллированной водой (pH 4,0) 1:10 от общего объема. Затем растворенный осадок переносили в диализный мешок и ставили на диализ против кар-бонатно-бикарбонатного буфера на 2 недели. В работе по созданию диагностикума исходя из паспортных данных возбудителей допускается активность токсина не менее 1000 Dim для типов А, В, С; тип D — при токсинообразовании является нетоксигенным,

что не мешает ему служить в качестве специфического антигена. Токсичность полученного препарата определяли биопробой на белых мышах по общепринятой методике. Эти манипуляции проводились отдельно с каждым типом возбудителя.

Полученный после диализа концентрированный токсический комплекс переводили в анатоксин путем добавления 40%-ного формалина в объеме 0,35-0,55% к общему объему и выдерживали в термостате в течение 3-х недель, при температуре 35° С, периодически проверяя остаточную токсичность на белых мышах и морских свинках по общепринятой методике.

2.2.3 Изыскание оптимального состава антигенной композиции CI. botulinum типов А, В, С, D

Были изготовлены 3 вида комплексных антигенов, отличающихся между собой способами воздействия на антиген (нативный - без воздействия; биологический - радиационный; химический — формалинизация).

В первом случае нами была составлена 8-ми компонентная композиция антигенов, состоящая из нативных корпускулярных антигенов Cl. botulinum типов А, В, С, D и их анатоксинов.

При этом в качестве базового компонента композиции брали по 2 части (20%) нативных корпускулярных антигенов Cl. botulinum типов А, В, С, D и 0,5 частей (5%) анатоксинов этих типов.

Практически 100 мл композиции содержала по 20 мл нативных корпускулярных антигенов каждого типа (А20 мл + В20 мл + С20 мл + D20 мл = 80 мл ), при этом каждый антиген содержал 2*107 м.к./мл и по 5 мл анатоксинов этих типов (А5 мл + В5 мл + С5 мл + D5 = 20 мл ).

Во втором случае вместо нативных антигенов, брали инактивированные радиоци-онным методом, корпускулярные антигены Cl. botulinum типов А, В, С, D и их анатоксины в тех же соотношениях, что и в первом случае.

В третьем случае использовали инактивированные химическим методом липопо-лисахаридные антигены Cl. botulinum типов А, В, С, D и их анатоксины в тех же соотношениях, что и в первом и втором случаях.

2.2.4 Изыскание оптимального варианта гипериммунизации кроликов с целью получения высокоактивной антиботулинической поливалентной сыворотки

В опыты были взяты 3 группы кроликов — с различным составом антигенов, дозами и местом гипериммунизации. Для получения гиперииммунной сыворотки использовали следующую схему иммунизации: 1-ое введение- 0,5см3, 2-ое - 1,0 см , 3-е -2,0 см3 в краевую ушную вену. Интервал между введениями составлял 3-е сут, на 7-й день после последнего введения антигена, проводили тотальное обескровливание лабораторных

животных методом пункции сердца с соблюдением правил асептики и безопасности Сыворотки крови отделяли общепринятым в микробиологии методом, определяли и титр, специфичность в отношении к определенному типу токсина. Результаты исследо вания приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Схема гипериммунизации и титры антител в сыворотках крови кроликов

№ п/п Кол-во жив-ых I Способ введения Кратность введения Доза введения (мл) Титр AT в сыворотке крови в РНГА

после 2-го введения после 3-г< введения конечный титр

1гр. АГ формалинизиро-ванный Cl. botulinum типовА,В,С,Б + их анатоксины 4 в/в 0,5 1/8++++ 1/16+++

в/в 3 1 1/4+++

в/в 2

4 п/к 3 0,5 1/8++ 1/16++ 1/8+++

в/в 1

в/в 2

4 п/к 3 0,5 1/2++++ 1/4 +-Н- 1/8+++

в/м 1

в/в 2

2гр. АГ гамма-облученный Cl.botulinum типов A3.C.D + их анатоксины 4 в/в 3 0,5 1/8+++ 1/8++++ 1/16+++

в/в 1

в/в 2

4 п/к 3 0,5 1/8 ++++ 1/16 +++ 1/I6++

в/в 1

в/в 2

4 п/к 3 0,5 1/2 -Н-+ 1/4++++ 1/8+++

в/м 1

в/в 2

Згр. АГ нативная (без воздействия) Cl. botulinum типов A,B,C,D + их анаток- 4 в/в 3 0,5 1/8+++ 1/32++++ 1/64+++

в/в 1

в/в 2

п/к 0,5 1/8-ьн- 1/32+++ 1/32+++

4 в/в 3 1

в/в 2

сины п/к 0,5 1/4+++ 1/16+++ 1/16++++

4 в/м 3 1

в/в 2

4 группа контроль РНГА + - стандартная положительная сыворотка 1/8 1/8 1/8

контроль РНГА - сыворотка крови до гипериммунизации - - -

Из данных таблицы 2 видно, что наиболее перспективным при получении поливалентных сывороток является использование 8-ми компонентной композиции антигенов,

состоящей из иативиых (без воздействия) корпускулярных антигенов CI. botulinum типов А, В, С, D и их анатоксинов, по сравнению с инактивированными антигенами, при трехкратной внутривенной схеме введения.

2.3 Разработка полиспецифического антигенного эритроцитарного

диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА

На основе 8-ми компонентной композиции антигенов (см. 2.2.3), получали глобулины, затем путем осаждения сульфатом аммония и на его основе создали антигенный эритроцитарный ботулинический диагностикум (РНГА) для обнаружения возбудителя и его токсина в сыворотке крови (табл.3).

Получение антигенного эритроцитарного диагностикума включала следующие этапы: формалинизацию эритроцитов по L.Csizmas; танизацию эритроцитов по S.V. Boyden; сенсибилизацию эритроцитов по В.А. Шамардину [5].

Таблица 3 - Активность и специфичность антигенного эритроцитарного ботулиниче-ского диагностикума в РНГА

Тип сыворотки (штамм) Результаты исследования поливалентного апти генного эрптрацнтарного ботулинического диагностикума в РНГА

Тип А (98) 1/32++++

Тип В (16-Я) 1/64 +-Н-+

Тип С (91) 1/32++++

Тип D (SHU) 1/32++++

Tim Е (153) 1/8++++

Тип F (5964) 1/8 ++++

Тип G (1352) 1/16++++

Поливалентная сыворотка ABCD 1/64++++

Образец сыворотки кошки, погибшей от ботулизма (частный сектор) тип В 1/16+++

Clostridium perfringens -

B.anthracis штамм 55 -

E.coli -

В. subtilis -

Нормальная кроличья сыворотка -

Нормальная лошадиная сыворотка -

Контроль -

Из результатов таблицы видно, что специфичность эритроцитарного ботулиниче-ского антигенного диагностикума распространяется на все типы ботулизма.

2.4 Разработка полиспецифического антительного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РИГА

Из полученной нами поливалентной антиботулинической сыворотки, состоящей из смеси нативных корпускулярных антигенов Cl. botulinum типов А, В, С, D и их анатоксинов, наработанная (см. 2.2.4) с конечным титром антител 1/64 в РИГА, получали глобулины, путем осаждения сульфатом аммония и на его основе создали антительный эригроцитарный ботулинический диагностикум (РИГА) для обнаружения возбудителя и его токсина в объектах внешней среды (табл. 4).

Таблица 4 - Активность и специфичность антительного эритроцитарного ботулини-ческого диагностикума в РИГА

Антиген Тип антигена Результаты исследования поливалентного антительного эритраци-тарного ботулинического диагностикума в РНГА

Тип А (98) возбудитель 1/32++++

Тип А (98) токсин 1/16++++

Тип В (16-Я) возбудитель 1/32++++

Тип В (16-Я) токсин 1/16++++

Тип С (91) возбудитель 1/32++++

Тип С (91) токсин 1/16++++

Тип D (SHU) возбудитель 1/16++++

Тип D (SHU) токсин 1/16 +++

ТипЕ (153) возбудитель 1/16++++

Тип Е (153) токсин 1/4+++

Тип F (5964) возбудитель 1/8++++

Тип F (5964) токсин 1/2++++

Тип G (1352) возбудитель 1/8 ++++

Тип G (1352) токсин 1/2+++

Clostridium perfringens вегетативная форма -

B.anthracis штамм 55 вегетативная форма -

E.coli вегетативная форма -

В. subtilis вегетативная форма -

Контроль - -

Из таблицы 4 видно, что поливалентный диагностики давал положительный результат со всеми типами возбудителя С1. botulinum (А, В, С, D, Е, F, G) в титрах от 1/8 до 1/32 при антигенах изготовленных из возбудителя, а при антигенах изготовленных из токсина, титр типов А, В, С, D составлял 1/16 , а Е, F, G от 1/2 до 1/4, при отрицательных результатах в контроле. Пороговая чувствительность для антигенов изготовленных из возбудителей составила не менее 500000 м.к./см3, а для антигенов изготовленных из токсинов 150 Dim для типов А, В и 300 Dim для типа С. Результаты исследований показывают возможность применения поливалентного ангительного эритроци-тарного ботулинического диагностикума для экспресс индикации ботулизма в объектах внешней среды и патологическом материале.

2.5 Разработка полиспецифического люминесцирующего ботулинического глобулина для метода флуоресцирующих антител (МФА)

Для получения полиспецифического флуоресцирующего ботулинического глобулина использовали разработанную нами поливалентную антиботулиническую сыворотку (см. 2.2.4) с конечным титром антител в сыворотке крови 1:64 в РИГА по общепринятой методике в нашей модификации.

Принцип метода МФА заключается в том, что антитела, соединенные с флуоро-хромом, сохраняют способность вступать в специфические реакции с соответствующими антигенами. При просмотре в люминесцентном микроскопе происходит свечение комплекса антиген-антитело, это является результатом поглощения возбуждающей энергии атомами веществ, входящих в эту систему.

Результаты исследований показали высокую активность полиспецифического флуоресцирующего ботулинического глобулина. При люминесцентной микроскопии мазков С1. botulinum наблюдалось свечение микробных клеток со всеми типами А, В, С, D, Е, F, G при рабочем разведении сыворотки 1:128 в 4 - креста и границей чувствительности не менее 500000 м.к./см3, которая не вступала в перекрестную реакцию с ге-терологичными культурами B.anthracis шт. 55, E.coli, Cl.perfringens.

2.6 Разработка полнспецифического пероксидазного ботулинического коньюгата для иммуноферментного анализа (ИФА)

Для получения полиспецифического иммуноферментного ботулинического коньюгата использовали разработанную нами поливалентную антиботулиническую сыворотку (см. 2.2.4), с конечным титром антител в сыворотке крови 1:64 в РИГА по общепринятой методике в нашей модификации.

Для коньюгирования иммуноглобулинов с ферментом использовали коваленгаыи способ. Принцип сшивки основан на окислении углеводной части фермента с образова-

нием альдегидных групп, которые впоследствии взаимодействуют с аминогруппами иммуноглобулина.

Иммунопероксидазные конъюгаты готовили по методике В. М. Wilson и Р. К. Nakane [16]. Для этого 5 мг пероксидазы хрена растворяли в 1 мл дистиллированной воды и вносили 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М NaJ04. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 20 мин, после чего диализировали в течение 18-20 ч против 100 мл 0,01 М ацетатного буфера, pH 4,4, при температуре (4±2)°С, полученный пе-роксидазный альдегвд доводили с помощью 0,2 М раствора карбоната натрия до pH 99,5 и сразу же вносили 1 мл иммуноглобулина, содержание белка в котором должно быть 8-10 мг/мл. При содержании белка более 10 мг/мл его концентрацию доводили до требуемого показателя добавлением 0,01 М КББ pH 9,5. Смесь фермента с иммуноглобулином перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре и проводили диализ против 0,85% раствора хлористого натрия, pH 7,3-7,6, в объеме 3 л, в течение 18-20 ч при температуре (4±2)°С. По окончании диализа иммунопероксидазные конъюгаты проверяли на стерильность, активность и специфичность (табл.5).

Таблица 5 - Результаты исследования полиспецифического пероксидазного богули-нического иммуноферментного коньюгата в ИФА

Антиген Tan антигена Результаты исследования полнспецифиче ского пероксидазного ботулинического коньюгата в ИФА

Тип А (98) возбудитель 1/256 ++++

Тип А (98) токсин 1/128 ++++

Тип В (16-Я) возбудитель 1/256++++

Тип В (16-Я) токсин 1/128 ++++

Тип С (91) возбудитель 1/128 ++++

Тип С (91) токсин 1/64 ++++

Тип D (SHU) возбудитель 1/128 ++++

Тип D (SHU) токсин 1/64++++

ТипЕ (153) возбудитель 1/64 ++++

ТипЕ (153) токсин 1/8+++

Тип F (5964) возбудитель 1/128 ++++

Тип F (5964) токсин 1/4++++

Тип G (1352) возбудитель 1/64++++

Тип G (1352) токсин 1/4++++

CLperfringens вегетативная форма -

В. subtilis вегетативная форма

E.coli вегетативная форма -

В. anthracis 55 вегетативная форма -

Контроль - -

Проведенные исследования в ИФА, с использованием полиспецифического им-муноферментного пероксидазного ботулинического коньюгата, показали положительную реакцию со всеми типами ботулизма (А, В, С, D, Е, F, G) в тех случаях, когда образцами исследований служили антигены приготовленные из возбудителя, при этом титры в среднем составляли 1/128 - 1/256. Титры к антигенам, приготовленными из токсинов А, В, С, D так же составляли в среднем 1/64 - 1/256, титры токсинов типов Е, F, G составляли 1/4 - 1/8, при отрицательных результатах в контроле. Пороговая чувствительность метода ИФА к антигенам, изготовленным из возбудителей Cl.botulinum, составила не менее 100000 м.к./см3, а к антигенам из токсинов 100 Dim - для типа А, 130 Dim - для типа В и 200 Dim - для типа С. Что свидетельствует о высокой активности иммуноферментного пероксидазного ботулинического коньюгата к возбудителям ботулизма и продуцируемым ими токсинам типов А, В, С и D.

2.7 Обнаружение возбудителя Cl.botulinum и его токсинов в объектах ветеринарного надзора с помощью поливалентного флуоресцирующего глобулина и поливалентного иммуноферментного коньюгата

Отбор и подготовку проб пищевых продуктов (консервы), силоса и патологического материала проводили согласно ГОСТам 26668-85; 26669-85; 8756.18-70.

Для отбора проб с объектов ветеринарного надзора и их исследования на наличие возбудителя и его токсина мы имитировали заражение Cl.botulinum типами А, В, С, D, Е, F, G в дозе по 500 м.к./см3 на каждую банку рыбной консервы (350 г) и силоса (350 г) для каждого типа. Эта же доза микробной взвеси в сочетании с токсином была использована для заражения лабораторных животных (белая мышь) с целью получения патологического материала. После чего консервы инкубировали в термостате при температуре 30-35°С в течение 15 сут до бомбажного состояния. Предварительно место ве- . дения культуры, крышку банки, залили сургучом - для создания анаэробных условий. Силос инкубировали в анаэростате при 30-35°С в течение 15 сут. Белым мышам вводили культуру внурибрюшинно в дозе по 1 см3, наблюдение вели в течение 10 суток.

Полученные образцы проб исследовали методами: биопроба на белых мышах, посев на среду Китг-Тароцци, МФА, ИФА (табл.6).

Таблица 6 - Обнаружение возбудителя СКЬоШНпит и его токсина в объектах ветеринарного надзора

тип В консервах В силосе В пат. мап герпал е

МФА ИФА посев био проба МФА ИФА посев био проба МФА ИФА посев био проба

А i i i i 1/128 + + 1 1 1 1 1/64 + + i i i i 1/256 + +

Продолжение таблицы 6

В 1111 1/256 + + +++ 1/128 + + 1 1 [ I 1/256 + +

с 1 1 1 1 1/128 + + +++ 1/64 + + мм 1/128 + +

D +++ 1/64 + - -Н-+ 1/64 + - 1 1 1 1 1/128 + -

Е +++ 1/64 + + ++ 1/32 + + +++ 1/64 + +

F ++ 1/64 + + +++ 1/64 + + +++ 1/64 + +

G +++ 1/32 + + ++ 1/16 + + +++ 1/64 + +

Конт. ■ - - - - - - - - - - -

Результаты проведенных исследований с образцами CI.botulinum типов А, В, С, D, Е, F и G, выделенных из консерв, силоса, патологического материала показали высокую активность и специфичность как поливалентного флуоресцирующего глобулина (свечение микробных клеток наблюдалось во всех образцах), так и поливалентного иммуно-ферментного конъюгата (минимальный титр антител составил 1/16 для типа G, выделенного из силоса, максимальный титр составил 1/256 для типа А и В - в патологическом материале и для типа В - в консервах).

2.8 Способы хранения культур Cl. botulinum и диагностических биопрепаратов

В последние годы в лабораториях коллекций микроорганизмов используют методы лиофилизации, низкотемпературного замораживания, криоконсервации и хранения в нативном ввде.

Нами были проведены сравнительные исследования культур Cl. botulinum в лио-филизированном и нативном виде хранения. Для определения жизнеспособности возбудителя и изучения их культурально-биохимических свойств использовали питательные среды: обезжиренное молоко, МПЖ, среду Гисса (малый пестрый ряд) и среда на образование сероводорода (табл. 7 и 8).

Таблица 7 - Сравнительная оценка культурально-биохимических свойств лиофили-зированных штаммов Cl. botulinum и их паспортных данных

Наименование штаммов Тип Культурально-биохнмические свойства

Обезжнр. молоко МПЖ IIjS Среда Гнсса

глюкоза лактоза сахароза мальтоза

1980 2013 1980 2013 1980 2013 1980 2013 1980 2013 1980 2013 1980 2013

35 А п п Р Р о о к/г к * к - -

Продолжение таблицы 7

Примечание: п - пелтонизирует, р - разжижает, о - образует сероводород, к - кислоту, г- газообразование

Таблица 8 - Сравнительная оценка культурально-биохимических свойств нативных штаммов Cl. botulinum и их паспортных данных

Наименование штаммов

Культурально-биокнмическне свойства

Обезжир. молоко

МПЖ

р/обр газ

-/обр

О НС значит

Среда Гисеа

мальтоза

Обозначение: п-пептонизирует, р-разжижает, о-образует сероводород к-кислоту, г-газообразование

Проведенными исследованиями культурально-биохимических свойств 7 типов возбудителя Cl. botulinum через 33 года их хранения методом лиофилизации и ежеквартальными пересевами (128 раз) показало преимущество метода лиофилизации перед

методом нативного хранения.

По истечении 3-х лет лиофилизированные диагностические препараты (полиспецифический люминесцирующий ботулинический глобулин и полиспецифический боту-линический пероксидазный коньюгат) были проверены в реакциях: метод флуоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментный анализ (ИФА) (табл. 9).

Таблица 9 - Результаты проверки диагностических препаратов

Тип АГ Результаты МФА Титры АГ в ИФА

Тип А (98) 1 1 1 1 1/128 ++++

Тип В (16-Я) 1111 1/128 ++++

Тип С (91) +++ 1/64 ++++

Тип D (SHU) +++ 1/64++++

Тип Е (153) -Н- 1/32++++

Тип F (5964) +++ 1/64++++

Тип G (1352) ++ 1/32++++

Контроль - -

По результатам проведенных исследований в реакциях МФА и ИФА наблюдалось незначительное снижение чувствительности диагностических препаратов.

Все вышеизложенное позволяет сделать вывод, что для долгосрочного хранения как микроорганизмов, так и биопрепаратов надежным является метод лиофильного высушивания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1) Разработан оптимальный состав и технология получения ботулинической композиции антигенов, состоящей из смеси 4-х типов корпускулярных антигенов С1. botulinum (А, В, С и D), содержащих 200 млн. м.к./см3 каждый и 4 типа анатоксинов (А, В, С и D), содержащих не менее 1000 Dim для типов А, В, С. Тип D - не токсичен и является дополнительным специфическим антигеном.

2) На основе полиспецифической ботулинической композиции антигенов получена высокоактивная полиспецифическая антиботулиническая сыворотка CI. botulinum А, В, С и D с титром антител не менее 1/64.

3) Для экспресс-диагностики ботулизма и его токсинов в сыворотке крови на основе ботулинической композиции антигенов разработан полиспецифический антигенный эритроцитарный ботулинический диагностикум для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), с титром антител 1/32 для CI. botulinum типов А, В, С и D и 1/8 - для Е, F и G.

4) Для экспресс - индикации возбудителей С1. botulinum и их токсинов в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале, на основе высокоактивной полиспецифической антиботулинической сыворотки Cl. botulinum А, В, С и D, разработан полиспецифический антительный эритроцитарный ботулинический диагностикум для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), улавливающий все типы возбудителя С1. botulinum в титрах антигена 1/8 - 1/32, а так же токсины типов А, В, С и D, составляющие в среднем 1/16, с установленной чувствительностью 500000 м.к./см3 для возбудителя и 150 Dim - для токсинов типов А, В и 300 Dim - для типа С.

5) Для экстренной индикации возбудителя ботулизма в патологическом материале и объектах ветеринарного надзора на основе высокоактивной полиспецифической антиботулинической сыворотки Cl. botulinum А, В, С и D, разработан полиспецифический люминесцирующий ботулинический глобулин для метода флуоресцирующих антител (МФА), с границей чувствительности не менее 500000 м.к./см3.

6) Разработан полиспецифический иммуноферментный пероксидазный коньюгат, на основе высокоактивной полиспецифической антиботулинической сыворотки, для экстренной индикации возбудителя Cl. botulinum и их токсинов в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале методом иммуноферментного анализа (ИФА), при котором титр антигенов для возбудителя Cl. botulinum всех типов составил 1/128 - 1/256, а для токсинов типов А, В, С и D 1/64 - 1/256, для типов Е, F и G 1/4 -1/8, при пороге чувствительности для возбудителей не менее 100000 м.к./ см и токсинов -100 Dim для типа А; 130 Dim - для В и 200 Dim - для типа С.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные диагностикумы для экспресс - индикации ботулизма и их токсинов дают положительную реакцию со всеми типами Cl. botulinum, при отрицательных результатах с гетерологичными культурами, однако не типируют их, но не смотря на это имеют неоспоримый плюс - быстрота ответа, что, на наш взгляд, в купе с существующими и зарекомендовавшими себя методами диагностики ботулизма (биопроба и реакция нейтрализации) могут составлять комплекс диагностических мероприятий по индикации ботулизма и его токсинов в объектах ветеринарного надзора, патологическом материале и сыворотке крови.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бочарова, Н. Г. Новая тест система обнаружения специфических антител / Н. Г. Бочарова// Сб. науч. трудов ВИЭВ. - Москва, 1979. - Вып. 4. - С. 157-161.

2. Бусыгин, К. Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных / К. Ф. Бусыгин. - М.: Колос, 1975.-160 с.

3. Иванов, А. В. Радиовакцины: проблемы и перспективы / А. В. Иванов, Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов. -Казань, изд-во: КГУ, 2008 - 498 с.

4. Иванова, М. А. Ботулизм : учеб.-метод. пособие / М. А. Иванова. - Минск: БГМУ, 2009.-24 с.

5. Каральник, Б. В. Эритроцитарные диагностикумы / Б. В. Каральник. - М.: «Медицина», 1976. -163 с.

6. Лабинская, А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А. С. Лабинская. - М.: Медицина, 1978.-С. 391.

7. Матвеев, К. И. Ботулизм / К. И. Матвеев. - М., 1959.-408 с.

8. Михайлов, В. В. Ботулизм / В. В. Михайлов. - Л.: Медицина, 1980.-200 с.

9. Никитин, В. М. Справочник серологических реакций / В. М. Никитин. -Кишинев, 1977.-205 с.

10. Никифоров, В. Н. Ботулизм / В. Н. Никифоров, В. В. Никифоров. - М.: Медицина, 1985.-198 с.

11. Никифоров, В. В. Ботулизм : учебно - методическое пособие для врачей / В. В. Никифоров, Н. А. Малышев, Б. И. Санин. - М., 2003. - 32 с.

12. Папуниди, К. X. Иммуноферментный метод для серологической диагностики ботулизма / К. X. Папуниди, Г. А. Адагамова // Материалы научной конференции ВНИВИВВиЛ. - Покров, 1992. - 4.2. - С. 273 - 274.

13. Пяткин, К. Д. Микробиология / К. Д. Пяткин, Ю. С. Кривошеин. - М.: Медицина, 1981.-511 с.

14. Lindstrom, М. Multiplex PCR Assay for Detection and Identification of Clostridium botulinum Types А, В, E and F in food and fecal material / M. Lindstrom, R. Keto, A. Mark-kula, S. Hielm, H. Korkeala // Applied and Environmental Microbiology. - Dec 2001. - P. 5694 - 5699.

15. Shone, C. In vitro assays for botulinum toxin an antitoxins / C. Shone, N. Appllton, P. Wilton-Smith, P. Hambleton, N. Modi, S. Gatley, J. Melling // Reduct.Anim.Usage new and Conf.BioI.Prod.Proc.Symp. London. - 1986. —P. 141-145.

16. Wilson, В. M. Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies / B.M. Wilson, P.K. Nakane; In: Immunofluorescence and related staining techniques, 1978.-216 p.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов, А.В. Получение полиспецифических ботулиновых сывороток для индикации возбудителя и его токсина / Иванов А.В., Мустафин Т.Р., Мустафина Э.Н. // Ветеринарный врач. - Казань, 2013. -№ 3. - С. 8-10.*

2. Мустафин, Т.Р. Получение полиспецифической флуоресцирующей ботулинической сыворотки для экспресс - диагностики и индикации возбудителя ботулизма методом

флуоресцирующих антител (МФА) / Мустафин Т.Р. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2013. - Т. 213.-С. 156-158.*

3. Мустафин, Т.Р. Разработка полиспецифического эритроцитарного ботулинического антигенного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации / Мустафин Т.Р., Иванов А.В., Мусгафина Э.Н., Садыков Н.С. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2013. - Т. 213.-С. 158-162.*

4. Мустафин, Т.Р. Разработка поливалентной сыворотки для экспресс-диагностики и индикации возбудителя ботулизма методом флюоресцирующих антител / Мустафин Т.Р., Иванов А. В., Садыков Н. С., Мусгафина Э. Н„ Юсупов Р. X. / Материалы Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием. «Микробиология в современной медицине» // Казань, 2013. - С. 74-78.

5. Мустафин, Т. Р. Создание полиспецифического ботулинического коньюгата для иммуноферментного анализа / Мустафин Т.Р., Мусгафина Э.Н., Чернов А.Н., Садыков Н.С. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2014. - Т. 217. - С.172-175*

6. Мустафин, Т. Р. Разработка полиспецифического эритроцитарного антителыюго ботулинического диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации / Мустафин Т.Р., Иванов А.А., Мусгафина Э.Н., Садыков Н.С. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2014. - Т. 217.-С. 169-172.*

* - публикации в изданиях, включенных в Перечень ВАК России

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 19.03.2014 г Печ.л. 1,3 Заказ Л« К-73 73. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Мустафин, Тимур Рустемович, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И

БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

............На правах рукописи

и^и'1417522

Мустафин Тимур Рустемович

РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС - МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

БОТУЛИЗМА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Чернов А. Н.

Казань-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................10

1.1 Биология возбудителя ботулизма..................................................................10

1.2 Химический состав и антигенная структура возбудителя ботулизма

и его токсина.....................................................................................................26

1.3 Лабораторная диагностика и идентификация возбудителя ботулизма

и его токсина....................................................................................................32

2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................44

2.1 Материалы и методы исследований................................................................44

2.2 Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств

Cl. botulinum.......................................................................................................45

2.2.1 Получение антигенов из Cl.botulinum типов А, В, С, D..............................49

2.2.2 Получение анатоксинов из Cl.botulinum типов А, В, С, D..........................50

2.2.3 Изыскание оптимального состава антигенной композиции Cl. botulinum типов А, В, С, D................................................................................................52

2.2.4 Изыскание оптимального варианта гипериммунизации кроликов с целью получения высокоактивной ботулинической поливалентной сыворотки.. 53

2.3 Разработка полиспецифического антигенного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА.....................57

2.4 Разработка полиспецифического антительного эритроцитарного

диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА................. 61

2.5 Разработка полиспецифического люминесцирующего ботулинического глобулина для метода флуоресцирующих антител (МФА).........................65

2.6 Разработка полиспецифического иммуноферментного конъюгата

для иммуноферментного анализа (ИФА)........................................................69

2.7 Обнаружение возбудителя Cl.botulinum и его токсина в объектах ветеринарного надзора с помощью поливалентного флуоресцирующего глобулина и поливалентного иммуноферментного

конъюгата............................................................................................................75

2.8 Способы хранения культур Cl. botulinum и диагностических биопрепаратов....................................................................................................78

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................84

СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ТЕРМИНОВ......................................................97

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................................98

СПИСОК ИЛЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА...................................113

ПРИЛОЖЕНИЕ..................................................................................................114

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Ботулизм - тяжелая интоксикация, возникающая в результате употребления в пищу продуктов, содержащих токсины Clostridium botulinum и характерезующаяся преимущественным поражением центральной и вегетативной нервной системы.

В настоящее время известно 8 типов возбудителя ботулизма (А, В, Са, Ср, D, Е, F, G), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками.

Возбудитель ботулизма относится к политропным представителям микробов, которые в ходе инфекционного процесса занимают ряд последовательных локализаций в организме, тем самым обнаруживая свою адаптированность к ряду различных органов и тканей, однако это есть единая форма болезни, в которой разные локализации возбудителя соответствуют разным стадиям болезни (кишечник, печень, легкие, нервная система).

Токсин ботулизма представляет собой протеин, состоящий как бы из двух фрагментов, связанных дисульфидными мостиками и попадая в кишечник животного всасывается в кровь и разносится по всему организму. Вследствии разрушения нервных центров продолговатого мозга развиваются параличи глотки, жевательных мышц и языка. Токсин подавляет выделение ацетилхолина, что ведет к расслаблению скелетных мышц, нарушению движения, параличам дыхательных и сердечных мышц, асфиксии и смерти животных. Люди наиболее восприимчивы к ботулиническим ядам типов А и С; лошади - типу В; крупный рогатый скот - типам D и С; овцы - типам А и С; птицы и норки - к типу С.

Впервые возбудитель ботулизма Clostridium botulinum (синоним Bacillus botulinus) был описан Е. Van Ermengem (1896).

Анализируя литературные данные по вопросу обнаружения антигенов и антител вообще, токсинов микробного происхождения в частности, можно заключить, что в этих целях наиболее перспективными являются иммуноферментный анализ (Бочарова Н.Г. Новая тест система обнаружения специфических антител // Сб.

науч. трудов. 1979. Вып.4. С.157-161), реакция непрямой гемагглютинации (Никитин В.М. Справочник серологических реакций. Кишинев, 1977. 205с.), хотя самым расрастраненным в настоящее время методом индикации ботулинического токсина является биопроба с реакцией нейтрализации токсина на белых мышах (Матвеев К.И. Ботулизм. М., 1959. 408с.; Лабинская A.C. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. 391с.; Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М.: Медицина, 1981. 511с.; Каздобина И.С. Специфическая индикация биологических средств и лабораторная диагностика инфекционного заболевания // ВПБЗН. 1985. Вып. 32. С.5-13; Никифоров В.Н., Никифоров В.В. Ботулизм. М.: Медицина, 1985. 198с.; Dezfulian М., Bartlett H.G. Kinetics of growth and toxigenicity of Clostridium botulinum in experimental wound botulism // Infec. and Im-mun. 1985. V.49. №2. P.452-454).

РНГА для индикации ботулинических токсинов во внешней среде применяли (Булатова Т.И., Матвеев К.И. К вопросу о применении РНГА для обнаружения ботулинических токсинов // ВПБЗН. 1966. Вып. 10. С. 167; Шамсутдинова А. X., Папуниди К. X., Кирилюк Д. А. и [др.]. Методическое указание по индикации ботулинических токсинов в объектах ветеринарного надзора реакцией непрямой гемагглютинации // ГУВ при ГК СМ СССР. 1989).

Иммуноферментный анализ находит широкое применение для определения и количественной дифференциации типов ботулинических токсинов (Notermans S.N. The Enzyme — linked immunoabsorbent assay (ELISA) for the detection and determination of Clostridium botulinum toxins А, В and E // Methods Enzymol. 1984. P.223-239; Kozahi S., Dufrenne I., Hagehaars A.M. Enzymelinked immynosorbent assay (ELISA) for detection of Clostridium botulinum type В toxin // Ja-pan.J.med.Sci.Biol. 1979. V.32. P.199-205; Dezfulian M., Bartel I. Detection of Clostridium botulinum type A toxin by enzyme-linked immunosorbent Assay with antibodies produced in immunologically tolerant animals // J. of clinical Microbiology. 1984. V.19. P.645-648; Kamata R., Yamamoto Т., Matsumoto K. [et.al.]. A serratial protease causes vascular permeability reaction by activation of the Hageman factor-dependent pathway in guinea pigs // Infect. Immun. 48. 1985. P.747-753; Никифоров B.H. Боту-

лизм. 198с.; Shone С., Appllton N., Wilton-Smith P., [et al.]. In vitro assays for botulinum toxin an antitoxins // Reduct.Anim.Usage new and Conf.Biol.Prod.Proc.Symp. London. 1986. P.141-145; Папуниди K.X., Адагамова Г.А. Иммуноферментный анализ для серологической диагностики ботулизма // Вопр.вет. вирусологии,микробиологии и эпизотологии. 1992. ч.2. С.273-274).

Люминесцентный анализ с применением флуоресцирующих антител (Бусыгин К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных. М.: Колос, 1975.160с.; Булатова Т.И., Кабанова Е.А., Кульберг А.Я. Применение люми-несцирующих антител для выявления возбудителей ботулизма // Люминесци-рующие антитела в микробиологии. М. 1962. С.98-116).

На сегодняшний день нет средств и методов экспресс - индикации возбудителя ботулизма, обнаружения ботулинического токсина ускоренными методами. Всё вышеописанное и обуславливает актуальность настоящей работы и необходимость создания экспресс анализа для обнаружения возбудителя ботулизма и его токсинов.

Все вышесказанное определило направление наших исследований.

Степень разработанности темы.

Диагностика ботулизма имеет целый ряд проблем. Это, во-первых, связано со сложностью культивирования клостридий как анаэробов и отсутствием селективных питательных сред для них. Кроме того, единственным методом, позволяющим с высокой чувствительностью идентифицировать ботулинические нейроток-сины, является биопроба на мышах в сочетании с реакцией нейтрализации специфическими анатоксинами. Данный метод требует большого количества лабораторных животных, использование которых в настоящее время принято считать неэтичным. Помимо этого, биопроба также не всегда обеспечивает получение необходимой информации. По статистическим данным, 65% клинических случаев ботулизма не имеют лабораторного подтверждения.

Цель и задачи исследований - разработка методов экспресс-индикации возбудителя ботулизма и его токсина в объектах ветеринарного надзора. Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

- разработка полиспецифической композиционной смеси ботулинических антигенов;

- получение высокоактивной поливалентной антиботулинической сыворотки;

- создание полиспецифического антигенного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РИГА;

- получение полиспецифического антительного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА;

- разработка полиспецифического люминесцирующего ботулинического глобулина для МФА;

- получение полиспецифического пероксидазного иммуноферментного коньюгата для экспресс-диагностики ботулизма в ИФА.

Научная новизна работы. Впервые составлена 8 компонентная композиция антигенов, включающая в себя корпускулярные антигены возбудителя С1.ЬоШНпит типов А, В, С, Б и их анатоксинов, которая в свою очередь послужила основой для получения высокочувствительного полиспецифического антигенного эритроцитарного диагностикума и препарата для гипериммунизации кроликов с целью получения высокоактивных поливалентных сывороток, на основе которых разработаны: высокочувствительный полиспецифический антительный эритроцитарный диагностикум; люминесцирующий глобулин; а также иммуно-ферментный коньюгат для экспресс-диагностики возбудителей С1.ЬоШНпиш и их токсинов в объектах внешней среды и патологическом материале в РНГА, МФА и ИФА. Разработанные диагностикумы дают возможность получать результаты в течение 4-5 часов, в то время как общепринятые методы индикации - биопроба и реакция нейтрализации позволяют получать результат в течение 10 суток.

Теоретическая и практическая значимость работы. Всестороннее и детальное изучение возбудителей ботулизма и их токсинов позволило разработать метод получения полиспецифической композиционной смеси ботулинических антиге-

нов с последующим получением на ее основе высокоактивной поливалентной ан-тиботулинической сыворотки, необходимой для изготовления высокоспецифичных диагностикумов для экстренной индикации данного возбудителя и его токсина в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале в короткие сроки 4-5 часов.

Разработаны методические рекомендации по изготовлению композиционной смеси ботулинических антигенов.

Методология и методы исследований.

В исследованиях применяли клинические, бактериологические, культурально-морфологические, биохимические, микроскопические, серологические, радиобиологические и химические методы.

Работа выполнена в 2010-2014 г.г. в лаборатории музей штаммов особо опасных болезней ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в соответствии с гос. заданием по НИР.

Отдельные фрагменты работы были выполнены с участием к.в.н. Мустафиной Э.Н.; д.в.н., профессора Садыкова Н.С.

Методы исследований

1) клинические - заражение возбудителем Cl. botulinum и наблюдение за подопытными животными (белые мыши, морские свинки, кролики). Взятие крови, гипериммунизация;

2) бактериологические - посевы Cl. botulinum на МПА с 2% глюкозой, среду Китта-Тароцци, бульон Хоттингера с 1% глюкозой, выделение чистых культур, получение и наработка бактериальной массы и продуцируемого ими токсина;

3) культурально-морфологические и биохимические - исследования штаммов Cl. botulinum на сахаролитические ( путем посева на «малый пестрый ряд») и про-теолитические свойства;

4) микроскопические - световая и люминесцентная микроскопия;

5) серологические - постановка РН; РНГА; ИФА;

6) радиобиологические - для инактивации возбудителя Cl. botulinum использовали гамма - установку «Исследователь» с источником излучения 60Со;

7) химические -инактивация возбудителя Cl. botulinum и перевод их токсинов в анатоксины с использованием 40%-ного раствора формалина.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка полиспецифической композиционной смеси ботулинических антигенов;

- получение поливалентной гипериммунной антиботулинической сыворотки;

- создание полиспецифического антигенного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА;

- разработка полиспецифического антительного эритроцитарного диагностикума для экспресс-диагностики ботулизма в РНГА;

- получение полиспецифического люминесцирующего ботулинического глобулина для МФА;

- разработка полиспецифического пероксидазного иммуноферментного коньюга-та.

Степень достоверности и апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на производственных совещаниях лаборатории, на ежегодных заседаниях Ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» при обсуждении отчетов о НИР за 2010-2014 г. и на Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» (2013 г.).

Статистическую обработку полученного в ходе экспериментов цифрового материала осуществляли на компьютере с использованием прикладных программ Microsoft Excel, Word 2010.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Биология возбудителя ботулизма

Первые упоминания о ботулизме относятся к 1793 году, когда в Германии после употребления в пищу копченой кровяной колбасы заболело 13 человек, 6 из которых скончались. Аналогичные пищевые отравления колбасой с гибелью большого числа людей наблюдались в Германии во время войны с Наполеоном в 1795-1813 годах. Тогда считалось, что эта смертность связана с отсутствием гигиены питания в деревнях в связи с войной.

Первым ученым, который занялся сбором статистики по случаям подобных отравлений и их симптомов, был профессор медицины Heinrich Ferdinand Autenreith из Тюбингенского университета. Опубликованный им в газете в 1817 году список симптомов включал желудочно-кишечные нарушения, двоение в глазах и расширение зрачка. Также Autenreith обнаружил связь между силой действия яда и степенью прожарки колбасы.

Одним из медиков, представивших профессору описания случаев отравления, был санитарный врач Justinus Kerner. В дальнейшем J. Kerner значительную часть своей жизни посвятил изучению ботулинического токсина, и считается крестным отцом его исследований. Проводя испытания на животных и на самом себе, он пытался выделить из колбасы неизвестный токсин, который сам называл «колбасный яд», «жирный яд» или «жировая кислота». Результаты этих исследований были опубликованы им в 1822 году в монографии, описывавшей 155 случаев отравления у человека и эксперименты на животных, в соответствии с которыми делался вывод о том, что действие токсина заключается в нарушении передачи импульса в волокнах периферической и автономной нервных систем. J. Kerner также предположил биологическое происхождение данного яда на основании сходства действия токсина с действием атропина и змеиного яда.

Впервые эти бактерии выявил в 1895 году бельгийский микробиолог Эмиль Пьер ван Эрменгем (Emile Pierre van Ermengem), ученик Роберта Коха. Используя методы микробиологических исследований, он выделил из кишечника людей,

скончавшихся после дегустации различных сортов колбас и ветчины, подозрительные бактерии, которые не встречались в кишечной флоре здоровых людей. Он назвал их Bacillus botulinus, что в переводе с латыни означает Бацилла колбасная. Так вошло в современную медицину страшное заболевание - ботулизм.

Ботулизм - остро протекающая кормовая токсикоинфекция, вызываемая токсином анаэробного спорообразующего микроба Bacillus botulinus. Эпидемиология ботулизма исключительно специфична и не укладывается в классические представления об эпидемиологии инфекционных болезней. По данным Громашевского J1. В., источником заболевания может служить только больной человек или больное животное ( Громашевский JI.В. Механизм передачи инфекции. Киев: Госмед-издат, 1958. 332с.). С другой стороны широкое распространение возбудителя ботулизма в природе послужило причиной мнения, что возбудитель убиквитарен и может размножаться и образовывать токсин в почве.

В настоящее время известно 7 типов возбудителя ботулизма (А, В, С, D, Е, F, G), вырабатывающих соответственно 7 токсинов, в свою очередь палочка типа С вырабатывает два различных токсина (Месробяну Л., Пэунеску Э. Физиология бактерий. Бухарест: Меридиане, 1963г. 808с.; Булатова Т.И. Ботулизм и его профилактика // Метод, указания. М.:Медгиз. 1966. 37с.), что позволяет говор