Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации Clostridium botulinum типов А и В

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации Clostridium botulinum типов А и В"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

на правах рукописи

Шттнкковз Океана Валерьевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДНК-ГИБРИДИЗАЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ( ПЦР) ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ CLOSTRIDIUM BOTULINUM ТИПОВ А и В.

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Российской АМН.

Научный руководитель - доктор медицинских наук Ю.В.Вертиев

Официальные оппоненты - д.б.н. Ильина Т.С.

д.б.н., профессор, заслуженный деятель науки Куваева И,Б.

Ведущее учреждение: ММА им. И.М, Сеченова

/-Л. 1995 года в ^ча

Защита состоится ¿ти1 ' ' 1995 года в ""часов на заседании диссертационного Совета К 001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Российской АМН ¡123098 г.Москва, ул.Гамалеи, 18).

о

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им.Н.Ф.Г амалеи

//

Автореферат разослан _1995г.

Ученый секретарь диссертационного Согзета,

доктор мсдииинских наук Е.И.Коптелопа

Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы..

Ботулизм • тяжелое заболевание человека и животных нервно-паралитического характера, «асто имеющее летальный исход. 8 1992 г. в ГйССи« иаршисширонано 400 Cfr/r"" ддинсги оабо<1евания.

Clostridium botulinum, анаэробные спорообразующие микроорганизмы, продуцируют нейротоксины, являющиеся самыми сильными токсинами природного происхождения, в среднем, летальная . доза для мышей составляет Ю пг ботулиническога нейротоксина [ Sakagochi G..I983]. В настоящее время известно 7 серологически различных типов иейротоксинов: А, В, С. D, Е. F и G. Все они продуцируются различными штаммами С. botulinum, но имеют сходные размеры и молекулярную организацию. Это достаточно большие белки, состоящие из 2 полипептидных цепей - легкой (50-59 KDa) и тяжелой (85-<05 кОа). соединенных между собой как минимум одной дисульфидной связью t Smith L.D.,1977 ]. I юпадая в организм человека или животных, ботулинические нейротоксины действуют на уровне периферической нераной системы, где блокируют выделение медиатора - ацегилхолина [Sctiin LC.,1981]. Несмотря на то, что заболевание ботулизмом известно уже более 200 лет, в настоящее время детальный механизм действия нейротоксинов недостаточно изучен, в особенности на молекулярном уровне. Считается, что нейропаралитический эффект токсина достигается в результате прохождения им 3 стадий: связывания токсичной молекулы на поверхности пресинаптической мембраны, энергозависимого

проникновения части молекулы внутрь клетки и ингибирующей стадии f Simpson L.L, 1981].

Лекарств против ботулизма сейчас не существует. Полагают, что ботулизм человека вызывается 4 типами нейротоксинов • А, В, Е и F. Кроме классических штаммов С. botulinum, как было обнаружено, причиной ботулизма могут являться некоторые другие микроорганизмы, как, например, С. butyricum, продуцирующий нейротоксин типа Е [McCroskay L.M.,1986], и С. barati, продуцирующий нейротоксин типа F { Hall J.D., 1985]. Сравнительно недавно были расшифрованы нуклеотидные последовательности генов нейротоксинов типов А [ Binz Т., 1990, Thompson D.E.,1990], В [ Whelan S.M.,1992], С [Hauser D.,1990], D [ Binz Т.,1990], E [Whelan S.M.,1992], F {Thompson D.E., 1993].

Что касается диагностики ботулизма, то она имеет целый ряд проблем. Это, во-первых, связано со сложностью культивирования клостридий как анаэробов и отсутствием селективных сред для них. Кроме того; единственным методом, позволяющим с высокой чувствительностью идентифицировать ботулинические нейротоксины, является биопроба на мышах в сочетании с реакцией нейтрализации специфическими антитоксинами. Данный метод требует большого количества лабораторных животных, использование которых в настоящее время принято считать не этичным. Помимо этого, биопроба также не всегда обеспечивает получение необходимой информации. По статистическим данным, 65% клинических случаев ботулизма не имеют лабораторного подтверждения. Разработанные на настоящее время иммунологические методы определения нейротоксинов не нашдк

широкого применения ввиду недостаточной чувствительности [ Oguma К..1980, Oguma К., 1984].

В последние годы для выявления целого ряда патогенных бактерий разработаны методы, основанные на использовании ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции, которые достаточно хорошо зарекомендовали себя в практике.

В связи со сказанным выше становится очевидной iir>r)fixnfiw«<v-Tu применения для дкппюстики ботулизма современных милскушрно-биологических методов.

Цели»_и_аадачи... исследован ия.

Целью настоящей работы являлась разработка молекулярно-биологических методов для идентификации С. botulinum. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) Получение зонда для гибридизации, специфичного для гена нейротоксина С. botulinum типа А.

2) Разработка метода ДНК-гибридизации для выявления С. botulinum

А.

3) Разработка метода ПЦР для идентификации С. botulinum типа А.

4) Разработка метода ПЦР для идентификации С. botulinum типа В.

5) Оценка возможности использования методов ДНК-гибридизации и ПЦР для тестирования биологических проб.

HayattaajQBHSHajijipaKmyecKaaJuejiBQCT^^

В данной работе показана возможность использования ДНК-зондов для идентификации Clostridium botulinum типа А. Методом гибридизации по Саузерну впервые было выявлено наличие 2 групп штаммов С.

botulinum А, различающихся по областям ДНК, расположенным перед геном нейротоксина. Эти данные могут быть, в частности, использованы при исследований^лидемиологии ботулизма.

В последние годы зарубежными учеными предприняты попытки адаптировать метод ПЦР для выявления С. botulinum [ Szabo E.A.,1992, 1993]. В России подобные исследования проводятся впервые. Разработан метод ПЦР для идентификации С. botulinum типов А и В, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью (1 пг ДНК), который может быть использован в диагностических лабораториях для выявления данных микроорганизмов. Метод ПЦР прост в исполнении, обеспечивает быстроту получения результатов <5 часов от начала исследования) и особенно удобен в тех случаях, когда необходимо протестировать большое число проб. Полученные данные поданы в ГИСК им. Тарасевича для составления Временной фармакопейной статьи.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Метод ДНК-гибридизации для идентификации Clostridium botulinum типа А.

о

2. Штаммы С. botulinum типа А можно разделить на группы при помощи гибридизации по Саузерну, используя полученный зонд.

3. Метод полимеразной цепной реакции для выявления С. botulinum типов А и В.

Апрабаиия диссертационной работы проведена на научной конференции лаборатории клостридиозов 19 января 1995 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 печатная работа.

Объем и- структура лиссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 разделов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и мушкхлрипоиэнз г7 vi u i¿¿блицами. (,пиг-гчс

содержит 133 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы.

Бактериальные штаммы. Штаммы Clostridium botulinum разных типов, Clostridium sporogenes, Clostridium putrificum, Clostridium tetani были взяты из лаборатории клостридиозов.

Культивирование штаммов. Штаммы С. botulinum выращивали на средах Китт-Тароцци и казеиново-дрожжевой (состоящей из кислотного гидролизата казеина - 3.5%, экстракта кормовых дрожжей - 1%, кукурузного экстракта - 2%, тиогликолата натрия - 0.1%. Культивирование проводили при 35°С для штампов типов А, В, С, D и при 28°С для штаймов типов Е, F и G.

Выделение ДНК из клостридий. Клетки 18- или 24 ч. культур суспендировали в. 1/3 первоначального обьема буфера, имеющего состав: 50 тМ трис-НС) рН 8.0, ! тМ ЭДТА, 6.7% сахарозы. Добавляли лизоцим до концентрации 5 мг/мл, Инкубировали при 37°С от 1 до 36 ч, в зависимости от типа С. botulinum. Затем клетки осаждали при 4000 об/мин в течение ¡5 мин и ресуспёндировали в 1/20 первоначального объема того же буфера. Добавляли ЭДТА до концентрации JO тМ, клетки лидировали добавлением . ДДС, до концентрации 1%. Белки удаляли

последовательным экстрагированием равными объемами фенола, смеси фенол:хлороформ и хлороформа. ДНК осаждали добавлением 2.5 объемов холодного этанола, промывали 70% этанолом и растворяли в буфере ТЕ, содержащем ЮтМ трис-HCI pH 8.0, ImM ЗДТА.

Выделение плазмидной ДНК проводили no [ Maniatis Т.,1989].

Дефосфорилирование вектора проводили в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCI pH 8.3, 1 мМ ZnCI2 щелочной фосфатазой (0.6 ед./мкг ДНК) 60 мин, 65°С. Фосфатазу удаляли при помощи фенола.

Трансформацию Е. coli проводили по [ Chung С.Т.,1988].

Получение зонда для гибридизации ДНК. Hinc II - фрагмент гена ботулинического нейротоксина типа А, находящийся в составе плазмиды, вырезали соответствующей рестриктазой и фракционировали в 1%-ном агарозном геле. Искомый фрагмент размером 700 н.п. выделяли из геля при помощи легкоплавкой агарозы [Maniatis Т., 1989].

Внесение метки в зонд. Для мечения зонда пользовались наборами, выпускаемыми фирмой Amersham (радиоактивные изотопы) или Boehringer mannheim в соответствии с прилагаемыми инструкциями.

Гибридизация ДНК-ДНК. Гибридизацию с радиоактивно меченым зондом проводили в стандартных жестких условиях no [Maniatis Т.,1989]. Гибридизацию с зондом, меченым не радиоактивно, проводили в точном соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя тест-системы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Реакционная смесь для проведений ПЦР содержала: 67 тМ трис-HCI pH 8.8, 16.6 mM (NH4)2S04, 1.5 тМ MgCI2l 0.01% Tween 20, по 125 тМ dNTP, 1 pmoles праймеров, аликвоту ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Каждый цикл амплификации включал денатурацию, при 94°С 1 мин, отжиг при 55°С 2 мин,

Полимеризацию при 72°С 2 мин. Амплификацию проводили в 30 циклов на приборе "ТАМП 250" (Биоком-сервис, Москва).

Иммуноферменгный метод определения ~»ботулиничсских йейротоксинов. Для определения нейротоксинов С, botulinum использовали тест-систему, разработанную И.С.Каздобиной с соавт. в лаборатории клосгридиозов НИИЭМ им.Гамалеи. По 200 мкл *иТуГП™йТ*ССьПГи t'CüwCriuliti^iiriüCi-Ciru ti кйициш

0.02 мг/мл вносили в лунки планшета. Инкубировали 4 ч при 37°С или 1618 ч при 4°С. Затем лунки отмывали, подсушивали. Каждую пробу, подлежащую исследованию, вносили в 2 лунки в объеме 100 мкл, инкубировали при 37"С 1 ч, лунки промывали . Пробы обрабатывали коньюгатом ботулинического иммуноглобулина с пероксидазой хрена.

. Биопроба на мышах. Использовали белых мышей весом 18-20 г. Для титрования токсина исследуемые образцы разводили желатиново-фосфатным буфером и по 0.5 мл из каждого разведения вводили внутрибрюшинно 2 мышам. Для постановки реакции нейтрализации с целью определения типа ботулинического нейротоксина использовали противоботулиническую типоспецифическую сыворотку концентрации 1 IU {интернациональная единица) в 0.1 мл. К 1.2 мл исследуемого материала добавляли 0.3 мл сыворотхм, ' по 0.5 мл этой смеси вводили внутрибрюшинно 2 мышам. Контролем служили мыши, получившие такое же количество материала без сыворотки. Результаты опытов учитывали через 4 ч, 24 ч и далее на протяжении 4 суток.

1. Разработка метода ДНК-ДНК гибридизации для идентификации Clostridium botulinum А.

На первом этапе работы было необходимо получить зонд, специфичный для гена нейротоксина С. botulinum А. Нуклеотидная последовательность данного гена была известна, и поэтому мы решили получить зонд при помощи полимеразной цепной реакции. Была сконструирована плазмида, включающая Hincll-фрагмент гена нейротоксина, соответствующий части легкой и части тяжелой цепей белка. Данная последовательность (1032-1714 н. от стартового кодона) была встроена в Hindi-сайт полилинкера вектора pUC 19. Зонд для гибридизации получали из рекомбинантной плазмиди, названной pBTAla, после гидролиза ее Hincll и очистки фрагмента размером 682 н.п., соответствующего части гена нейротоксина типа А.

Для оценки специфичности метода гибридизации были использованы ДНК 10 штаммов Clostridium botulinum типа A, 11 штаммов типа В, 6 штаммов типа С, 2 штаммов типа О, 6 штаммов типа Е, 1 штамму типа F, 1 штамма типа G, а также таких штаммов клостридий, кац Clostridium sporogenes, С. putrificum, С. tetani и штаммов некоторых грамотрицательных бактерий, таких как Е. coli, Y. pseudotuberculosis. Как следует из данных, представленных на рисунке 1, положительный гибридизационный сигнал при использовании в качестве зонда Hincll-фрагмента наблюдался только с ДНК, выделенными из штаммов С. botulinum типа А - это все 10 исследованных штаммов. В то же время при испытании методом гибридизации ДНК штаммов других видов бактерий всегда регистрировался отрицательный результат. Это свидетельствует о высокой специфичности метода.

jcfyiÄÄ

о о о Ф

А501 А98 Amern. Aam. А363

АРР M/2 A4/6 A32 А85

В бол 8YB B18 BI9 В! 75

BS В311 B83 B30 В346

---;"' 3 • j * • ииэ

Е138 El 53 E563 E341 Ebf;l

Е070 его сгз1 СЗ14 C502

est. С59 С sp. С pu. E coli

C.te. Y.ps. L.pn. Lis. pUC19

Рис.1, Гибридизация ДНК различных штаммов С; Ьо(иНпит и некоторых других ДНК.

Для определения чуцг.изительности метода гибридизации нами были использованы ДНК штамма A Memphis Clostridium botulinum и ДНК рекомбинантной плазмиды. Из препаратов ДНК с исходной концентрацией 1 мг/мл (для плазмиды) или 500 мкг/мл (для тотальной ДНК С.botulinum) готовили ряд .десятикратных разцедений до концентраций 10 нг/мл или 500 нг/мп, соотпетстпенно. Из ;:л:;гм"гп разведения препарата отбирали 1 мкл и наносили сю на нитроцеллюлозный фильтр, который после соответствующей обработки Гибридизовали с ДНК- зондом в стандартных жестких условиях. Как мы выяснили, метод позволяет выявить'наличие гена не ftp о токсина типа А как минимум в 5 нг хромосомной ДНК и 100 пг - в плазмидной ДНК.

Из данных литературы известно, что при помощи метода гибридизации по Саузерну можно разделить штаммы возбудителей, не. различимые другими способами. Этот подход, в частности, применяют в

изучении эпидемиологии патогенных микробов. Поэтому на следующем этапе мы решили сравнить гены нейротоксина у разных штаммов С. botulinum типа А, имеющихся в нашей лаборатории. Для этого были проведены эксперименты по блоттинг-гибридизации. С этой целью мы выбрали рестриктазу TaqI, имеющую 2 сайта внутри данного гена. . ДНК всех штаммов типа А гидролизовапи этим ферментом, фракционировали в агарозном геле и после переноса на фильтры гибридизовали с зондом. Как следует из данных, представленных на рис.2, все штаммы можно разделить на 2 группы в отношении сайта TaqI, находящегося перед геном. Для первой группы (штаммы 50), Memphis, 363, РР, 32, 86) размер фланкируемого фрагмента составлял 4200 н.п., а для второй (штаммы 98, Американский, 4/2, 4/6) - 3600 н.п. Для другой рестриктазы - ВдШ - была получена аналогичная картина, т.е. штаммы разделились на те же 2 группы, а размер образующихся фрагментов составлял 7200 и 5100 н.п., соответственно. Данные различия между штаммами можно объяснить так: либо в области, находящейся перед началом гена нейротоксина, у одной из групп произошла делеция фрагмента ДНК, либо ген расположен в разных местах хромосомы у разных трупп штаммов.

Таким образом, в процессе работы нами была сконструирована плазмида рВТА1а, несущая участок гена нейротоксина типа А, которая может служить источником ДНК-зонда. Кроме! того, отработан метод гибридизации для выявления Ciosiridium botulinum А, который является специфичным и достаточно чувствительным.

It

1Z 345E 7 89 10

— ев - - ca ев о* «m

ООО

Рис.2. Гибридизация рестриктов Taql ДНК С. botulinum Л с Hincll-фратментомрВТА1а. 1 -А 501. 2 - А98.3"-А Memphis, 4 - А 363, 5 - А РР, 6 - А 32, 7 - А 36, 8 - A American, 9 - А 4/2, 10 - А 4/6.

2. Разработка метода полкмеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации С. botulinum типоп А и В.

2^иШР^иде1Ш1фицируюишн.С^Ьа1и11пип1Липо л. Для разработки метода были подобраны последовательное!« 2 слигонуклеотидов, а также осуществлен их синтез.

Прямой праймер (AL) соответствовал 913-932 нуклоотидпм от старта последопательности гена аейротоксина: 5' GGTACTACTGGTTCATTACA Обратный праймер (AR), 1852-1871 нуклеотиды: 5' GTAGTACTTACTTCGCTAGT

Эти 2 праймера фланкировали область гена нейро токсина /шиной 958 нуклеогидных нар, включающую часть легкой и часть тяжелой цепей белка.

Для проверки специфичности ПЦР нами были использованы ДНК 10 штаммов С. botulinum типа А, 11 штаммов С. botulinum типа В, 5 штаммов С. botulinum типа С, 2 штаммов С. botulinum типа D, 6 штаммов С. botulinum типа Е, 1 штамма С. botulinum типа F, 1 штамма С. botulinum типа G, 1 штамма С. tetani, 1 штамма С. sporogenes и 1 штамма С. putrilicum. Штаммы С. botulinum различных типов, а также штамм С. tetani были выбраны для исследования ввиду того, что между генами ботулинических нейротоксинов и геном столбнячного нейротоксина обнаруживается значительная гомология . Выбор штаммов С. sporogenes и С. putrificum был обусловлен тем, что присутствие этих бактерий является наиболее частой причиной ложноположительных результатов при выполнении иммуносерологических реакций. Как следует из полученных данных (рис.3), специфический продукт полимеразной реакции не регистрировался в наших опытах ни с одним из штаммов, отличных от штаммов С. botulinum А.

Таким образом, метод ПЦР является специфичным методов детекции С. botulinum А.

Для оценки чувствительности метода были использованы препарать ДНК, а также клетки С. botulinum типа А. Мы выяснили, что rei нейротоксина можно обнаружить при наличии в пробе как минимум 1 п ДНК или 10-100 клеток после 30 циклов амплификации.

В связи с тем, что ботулизм человека вызывается С. botulinum

ом

f-Mt..j..O>ic«!iiPHP "Гпппь^пвяики ЛНК разных типов С. botulinum. 1 - X/Hindiil, 2 - A Memphis, 3 - В 30, Л - С 20, 5 - D 194, 6 - Е 183-20, 7 - F 470, 8 - G 39, 9 - С. tetani.

■Ч

типа В практически так же часто, как и типа А, мы разработали метод ПЦР для идентификации этих бактерий.

С этой целью мы подобрали 2 олигонуклеотидных праймера, при этом прямой праймер BL соответствовал 2106-2126 нуклеотидам от начала гена и имел состав:

5' CGCAATGGCTCTCAACAGTTA Обратный праймер BR соответствовал 2657-2677 нуклеотидам: 5' CTCGACTCCATCATATACCTC

Для проверки специфичности метода мы использовали ДНК всех имеющихся в лаборатории штаммов типа В, а также ДНК некоторых других штаммов, и частности, Clostridium botulinum А Memphis, А 363, С 20, С Stockholm, D 194, Е 188-20, Е Beluga, F 470, G 89, Clostridium sporogenes 289, С. putrificum 332, Е. coli JM109, Yersinia pseudotuberculosis, Legionella pneumophila. Мы показали, что

специфический продует полимеразной реакции размером 571 и.п. образовывался только в тех случаях, когда в реакционной смеси для ПЦР присутствовали ДНК или клетки токсигенных штаммов C.botulmum типа В. ДНК штаммов, отличных от С. botulinum В, не реагировали с праймерами к типу В (рис. 4).

Рис.4. Элоктрофореграмма продуктов ПЦР при использованииДНК различных штаммов С. botulinum. 1 - 1/HindMI, 2 - В 175, 3 - В 364, 4 - В 346, Ь - В 311. 6 - В 19, 7 - В 83, 8 - В болгарский, 9 - В 30. 10 - А Memphis. 11 - С 20, J2 - О 194, 13 - Е 188-20, 14 - F 470, 15 - G 89.

Полученные результаты свидетельствуют о специфичности метода ПЦР с данной парой праймеров по отношению к гену ботулинического нейротоксина типа В.

Чувствительность метода, хак и а случае типа А, составляла 1 - 10 яг ДНК или 100 клеток С. botulinum типа В-

3. Тестирование биологических проб методами ДНК-гибридизации и ПЦР.

На следующем этапе мы оценили возможность применения молекулярно-биологических методов для тестирования биологических проб. Поскольку пищевая форма ботулизма чаще всего связана с

--(тлтрпКпаиш» uamhnnvauw^TpDuuuv глигрпплй ппи мппрлшых пимтн

были выбраны следующие продукты: коммерческие консервированные зеленый горошек, свекла, печеночный паштет, тушеное мясо, ветчина и кабачковая икра. Перечисленные продукты заражали. 3-суточными культурами С. botulinum штаммов А 98 и А 4/2, а также штаммов Е 188-20, В 175 и. стандартного контрольного штамма - Clostridium sporogenes 289. При этом продукты содержали 10е клеток/г. Пробы тестировали методом ПЦР с праймерами к гену нейротоксина типа А, а для сравнения - ИФА. При этом продукты, имеющие жидкую фазу, использовали в реакции непосредственно, а твердые гомогенизировали с равным обьемом 0.9% раствора NaCI. Мы попытались определить те максимальные разведения проб, которые давали положительный ответ в том или другом случае. Как следует из полученных нами данных, метод ПЦР позволяет выявить ген нейротоксина типа А в больших на 2 порядка разведениях образцов, чем токсин с помощью ИФА.

Для определения чувствительности ПЦР был выбран томатный сок как жидкий продукт. Как мы выяснили, ПЦР позволяет обнаружить С. botulinum в пробах в разведениях до 10"6, что соответствует 10-100 клеткам.

Поскольку в реальной жизни происходит размножение С. botulinum в зараженных продуктах, следующую серию опытов мы спланировали таким

образом. Томатный сок, фасоль и грибы заражали 1-суточным? культурами С. botulinum 3 штаммов типа А (98, Memphis, 345), 2 штаммо« типа В (346 и 175), 3 штаммов типа Е (188-20, 153, 563). Пробь инкубировали 5 суток при 30°С и затем' дополнительно 10 суток npv комнатной температуре. После этого часть проб тестировали на наличие гена нейротоксина типа А методом ПЦР, а в другой части определяли с а* токсин методом титрования на мышах. Как видно из приведенных данны: (таблица 1), с помощью ПЦР удается идентифицировать С. botulinum тип; А в тех же разведениях образцов, что и токсин биопробой, например дл! штамма А 98 в томатном соке или грибах, а в некоторых случаях даже i больших ( томатный сок и фасоль для штаммов А 345 и A Memphis соответственно). Специфичность ПЦР подтверждается тем, что продук реакции не обнаруживался при наличии в пробах штаммов,, отличных q штаммов типа А.

В настоящее время диагностику ботулизма проводят по стандартно! схеме, включающей выявление в образцах нейротоксинов < установлением их типа, а также обнаружение продуцирующих эти токсин» клостридий, через получение обогащенной и чистой культур. Mt рекомендуем использовать метод ДНК-гибридизации на этаги обогащенной культуры после того, как из нее выделена ДНК, а методе» ПЦР можно тестировать как обогащенную культуру, так и исходны! образцы. ' . "

Таким образом,'мы показали, что идентификация С. botulinum npi помощи ПЦР может быть осуществлена в целом ряде пищевых продукто с весьма высокой чувствительностью и специфичностью.

Таблица 1

Определение предельных разведений зараженных продуктов, которые позволяют выявить наличие в них ботулинического токсина или С. botulinum А

Штамм Вид продукта и метод его определения (1)

С botulinum

томатный сок фасоль грибы

1 -- _ t - ; ' - —г.-, - ; П| ID "" - ■ йипппоба 1 ПНР

А 93 1x10 ' 10 - 5x10"* 10'* V'IO"4 1

A Memphis 5x10 4 10'4 2х104 10'5 7,5х10'4 105

А 345 5x10'4 10'5 2х10'5 10'5 5x10'" ю-4

В 346 1x10 4 - 5х10'4 - 2x10"4 -

В 175 5x10"' - 1x10'4 - 1х10'4 -

Е 188-20 1х10"4 - 5x10"а - 1х10'3 -

Е 153 1х10"2 - IxlO"3 - 5x10* -

E5G3 5х10'4 - 2х10"4 - 5х10"г -

(1)- Максимальное разведение, в котором обнаруживается нейроюксин или продукт амплификации гена нейротоксина типа А. (-)- Результаты ПЦР отрицательны.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована плазмида р£ЗТА1а, которая может служить Источником получения зонда для специфической идентификации гена ботулинического нейротоксина типа А. Рекомбинантная плазмида состоит

из векторной плазмиды pUC19 и Hincll-фрагмента гена ботулинического нейротоксина типа А.

2. Разработан метод ДНК-гибридизации для идентификации клостридий, несущих ген ботулинического нейротоксина типа А. Показана высокая специфичность и достаточная чувствительность метода ( 5 нг ДНК ).

3. С помощью метода гибридизации по Саузерну установлено, что штаммы Clostridium botulinum типа А могут быть разделены на 2 группы, отличающиеся по размеру областей ДНК, расположенных перед стартовым кодоном гена нейротоксина. Внутри гена блоттинг-гибридизацией подобных различий выявлено не было. Данный факт может бытъ использован для проведения генотипирования при эпидемиологическом расследовании источника ботулизма. .

4. Разработана полимеразная цепная реакция для идентификации С. botulinum типа А. Показано, что для этой цели могут быть использованы в качестве праймеров синтетические олигонуклоотиды, соответствующие

нуклеотидной последовательности гена ботулинического нейротоксина

с

типа А в положениях 913-932 и 1852-1871. При использовании этих праймеров и стандартного режима амплификации синтез ДНК размером 958 н.п. происходит только в тех случаях, когда в реакционной смеси присутствует в качестве матрицы либо клетки Clostridium botulinum типа А, либо их ДНК. Чувствительность метода составляет 1 пг ДНК .

5. Разработана полимеразная цепная реакция для идентификации С. botulinum типа В. Показано, что для этой цели могут быть использованы в качестве праймеров синтетические олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидной последовательности гена ботулинического нейротоксина

типа В в положениях 2106-2126 и 2657-2677. Метод является специфичным. Чувствительность метода составляет I -10 пг ДНК.

6. В сравнительных зкслеримешах ииг-аллпс, тго ¡"гг.г"."» Or botulinum типа А или В может быть обнаружено с помощью ПЦР а тех же разведениях образцов, в которых может быть выявлен нейротоксин биопробой на мышах.

7. В модельных экспериментах показано, что идентификация клеток С. botulinum с помощью ПЦР может быть осуществлена в целом ряде пищевых продуктов."

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Шляпникова О.В., Каздобина И.С., Ефименко А.Н., Вертиев Ю.В. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации Clostridium botulinum А в пищевых продуктах.// Прикладная биохимия и микробиология.-1995. T.3t. N5. С.610-615.