Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и адаптация молекулярно-биологических технологий для диагностики дифтерийной инфекции и изучения штаммов Corynebacterium diphtheriae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и адаптация молекулярно-биологических технологий для диагностики дифтерийной инфекции и изучения штаммов Corynebacterium diphtheriae"

' ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНЭПИДНАДЗОРА РФ 0 МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ Э 1:-Л) : .ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

МИХАЙЛОВИЧ Владимир Михайлович

Разработка и адаптация молекулярно-биологических технологий для диагностики дифтерийной инфекции и изучения штаммов СогупеЬас(епит сИрМЬвпав.

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Лаборатории диагностики дифтерийной инфекции Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского ГК санэпиднадзора РФ.

Научные руководители: доктор медицинских наук

И.К. Мазурова, доктор биологических наук Н.Т. Тихонова.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, проф.

С.С. Белокрысенко, кандидат биологических наук Т.П. Турова.

Ведущее учереждение:

Кафедра микробиологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится " " окГ 1995 г. в /'О час. на заседании диссертационного совета Д.176.01.01. Московского научно - исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского ГК санэпиднадзора РФ по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно - исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского ГК санэпиднадзора РФ.

Автореферат разослан: " 11 " сентября 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Е.М. Горская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сложившаяся эпидемиологическая ситуация с дифтерийной инфекцией требует активизации дальнейшего совершенствования ускоренных методов диагностики и разработки надежных методов эпидемиологического надзора за возбудителем заболевания.

Традиционно используемая схема бактериологического анализа при дифтерийной инфекции по продолжительности занимает 3-5 суток, что не позволяет своевременно подтверждать клинический диагноз и проводить необходимые мероприятия в очагах дифтерийной инфекции и в клинике.

К настоящему времени хорошо изучен и охарактеризован основной фактор патогенности Corynebacterium diphtheriae - дифтерийный токсин, который детерминируется геном tox, интегрированным в хромосомальную ДНК коринебактерий в составе лизогенных фагов. Также известно, что в популяции C.diphtheriae встречаются, так называемые, потенциально-вирулентные штаммы, имеющие в геноме последовательность /ох-гена, но не продуцирующие токсин [N.Groman, 1953,1983]. Получение информации о распространении и генетической структуре таких штаммов определит их эпидемиологическую значимость и позволит лучше понять механизмы формирования популяции токсигенных микроорганизмов.

Интенсивное развитие молекулярно-биологических методов исследования предоставляет возможность применить принципиально новый подход, основанный на определении специфических нуклеотидных

последовательностей генетических детерминант факторов патогенности, в диагностике дифтерийной инфекции и в изучении генотипических признаков C.diphtheriae.

Представляется перспективным использование метода гибридизационного анализа со специфическими ДНК-зондами, которые способны связываться с комплементарными последовательностями нуклеиновой кислоты (НК) в геноме изучаемого микроорганизма с

образованием двуцепочечных структур. Возникновение таких структур позволяет сделать заключение о присутствии искомой последовательности в изучаемом образце.

Целесообразно применять несколько (набор) ДНК-зондов. В этом случае появляется возможность выбора наиболее чувствительного и специфичного зонда для выполнения гибридизации с диагностическими целями и получения более полной информации о генотипических признаках микроорганизма (определения не одной, а нескольких генетических детерминант) для изучения штаммов в процедуре гибридизационного анализа.

В 1991 г. М. Pallen разработал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae в чистой культуре. Реакция основана на накоплении (амплификации) специфических последовательностей НК до количества, необходимого (достаточного) для детекции. Использование принципа этого метода явилось основой для создания новой технологии ускоренной диагностки возбудителя дифтерийной инфекции.

Цель: на основе технологий ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной цепкой реакции разработать и адаптировать для практического использования: 1) метод для определения генетических детерминант токсинообразования у штаммов Corynebacterium diphtheriae и 2) ускоренный метод диагностики дифтерийной инфекции.

Задачи исследования;

1. Создать полный набор специфических ДНК-зондов для детекции /ох-гена дифтерийного токсина и его фрагментов (А и В) для использования последних в процедуре гибридизации;

2. Оптимизировать технологию ДНК-ДНК гибридизации для обнаружения последовательности фрагментов А, В и АВ (целого гена) toc-гена дифтерийного токсина с использованием набора специфических зондов;

3. Разработать диагностический метод на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий обнаружить токсигенные коринебактерии в клиническом материале;

4. Определить чувствительность, специфичность и прогностическую значимость положительных и отрицательных результатов методов ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР для правильной интерпретации результатов исследования.

Научная новизна работы:

Разработана оригинальная диагностическая технология на основе ПЦР для дифференциации токсигенных штаммов С.сИрЫИепае, адаптированная к условиям практических лабораторий.

Создан штамм-продуцент специфического ДНК-зонда к фрагменту В гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина.

Создан полный набор специфических ДНК-зондов для детекции последовательности фрагментов А, В и АВ (целого гена) /ох-гена дифтерийного токсина.

Оптимизирован метод ДНК-ДНК гибридизации с использованием созданного набора специфических ДНК-зондов к фрагментам А, В и АВ гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина, для изучения генома коринебактерий на наличие указанных генетических детерминант токсинообразования. Определены параметры, определяющие эффективность метода: чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов.

Практическая значимость работы:

1) В Коллекцию штаммов ГИСК им. Тарасевича депонирован штамм-продуцент зонда (ох В' для обнаружения фрагмента гена дифтерийного токсина методом гибридизации (Справка № 00-13/15 от 07.09.1993);

2) Метод для обнаружения токсигенных штаммов С.сИрЫИепае, основанный на полимеразной цепной

реакции, адаптированный для практического применения включен в «Лабораторное Руководство по диагностике дифтерийной инфекции» (Москва, 1995 г.). Метод позволяет получить результат в течение 24 часов о наличии токсигенных коринебактерий в исследуемом образце.

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Разработан ускоренный метод на основе ПЦР для обнаружения токсигенных C.diphtheriae в клиническом образце, позволяющий получить результат через 24 часа от начала исследования;

2. Создан полный набор специфических ДНК-зондов к фрагментам А, В и АВ гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина;

3. Оптимизирован метод ДНК-ДНК гибридизации с . использованием набора специфических ДНК-зондов для определения генетических детерминант токсигенности.

Апробация работы проведена на заседании секции Ученого Совета МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний» (Протокол № 2 от 15.03.95). Основные положения диссертационной работы доложены на Международном совещании «Эпидемия дифтерии в Европе» (С.- Петербург, 1993), научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики» (Пермь, 1993), на Первом международном совещании Лабораторной рабочей группы по дифтерии (Лондон, 1994).

Публикации: по материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации:

Работа изложена на 111 страницах машинописи, включает 90 страниц текста, 25 таблиц и рисунков и

состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 55 отечественных и зарубежных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Бактериальные штаммы:

Для конструирования штамма-продуцента

специфического ДНК-зонда /охВ использованы штаммы: Escherichia coli DH5« (pSS6 toxВ') - предоставлен Гараевым М.М. (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН РФ); E.coli С600 гт~ - из коллекции Федеральной референс-лаборатории дифтерийной инфекции;

В качестве штаммов-продуцентов специфических ДНК-зондов toxА' и taxAB' использовали E.coli С600 гт~ (pAZ219 toxA'), E.coli C6Q0 r~m~ (pABC124 ioxAB') соответственно - из коллекции Федеральной референс-лаборатории дифтерийной инфекции;

Изучено в реакции ДНК-ДНК гибридизации - 259 штаммов токсигенных и нетоксигенных культур C.diphtheriae, выделенных в РСФСР, преимущественно во Владимирской и Пензенских областях за период с 1986 по 1989 гг., - из коллекции Федеральной референс-лаборатории дифтерийной инфекции;

Изучено в ПЦР - 140 токсигенных и 80 нетоксигенных штаммов C.diphtheriae, выделенных на территории РФ с 1985 по 1994 гг. и 4 штамма Staphylococcus aureus, - из коллекции Федеральной референс-лаборатории дифтерий-ной инфекции;

В качестве референс штаммов C.diphtheriae использовались: CCUG #17398 - gravis, токсигенный и CCUG #18645 - mitis, нетоксигенный - из Коллекции Гетеборгского университета (Швеция).

Клинический материал:

42 клинических образца от 30 больных дифтерией и бактерионосителей и 12 больных ангинами - получены из детского отделения клинической инфекционной больницы №1 г. Москвы.

Питательные среды:

Для культивирования штаммов E.coli использовали жидкую и агаризованную среду LB [Т.Маниатис и др.,1984], с добавлением 30 мкг/мл ампициллина;

Для культивирование штаммов C.diphíheriae, изучаемых в процедуре гибридизации применяли Columbia Blood Agar («Oxoid», Великобритания).

Для первичного выделения C.diphíheriae использовали кровяной теллуритовый агар (КТА);

Материалы:

Рестриктазы: Hind III и Крп I («Sigma», США); ферменты: лизоцим («Sigma»), панкреатическая рибонуклеа-за («Sigma»), протеиназа Т («Sigma»), дезоксирибонуклеозид-трифосфаты («Sigma» и производства ВНИИГСМ); 5'«-32Р dCTP (г. Ташкент); набор «Мечение ДНК» («Fermentas», Латвия); 4 пары специфических праймеров (синтезированы в CDC, США и в CPHL, Великобритания); AmpliTaq -полимераза («Boeliringer», Germany и «Perkin Elmer Cetus», США).

Методы:

Трансформацию клеток E.coli С600 гт~ плазмидной ДНК pSS6 toxВ' проводили по стандартному методу с применением хлористого кальция [Т.Маниатис и др., 1984].

Проверку идентичности плазмидной ДНК, выделенной из штамма E.coli DH5, (pSS6 tatB') и E.coli С600 г~т~ (pSS6 tox В'), осуществляли методом электрофореза в 0.7%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий в концентрации 0.5 мкг/мл [Т.Маниатис и др.,1984].

Вырезание последовательности фрагмента В гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина, из ДНК

плазмиды pSS6 toxВ' проводили рестриктазами Hind III и Крп I по стандартному методу [Т.Маниатис и др.,1984].

Введение радиоактивного изотопа в зонды осуществляли методом «рассеянной затравки», согласно инструкции фирмы-изготовителя набора «Мечение ДНК» («Fermentas», Латвия).

Включение радиоактивного изотопа в зонд проверяли на сцинтилляционном счетчике «Rockbeta-1217» (LKB).

Радиоавтографию гибридизационных фильтров выполняли на пленке РМ-В «Свема» в течение 18 часов.

Статистическую обработку результатов метода ДНК-ДНК гибридизации определяли по Laslo J. и Власову В. на выборке, состоящей из 259 (134 токсигенных и 125 нетоксигенных) штаммов C.diphtheriae.

Метод ПЦР для обнаружения токсигенных коринебактерий дифтерии в чистой культуре выполняли по М. Pallen, 1991.

Микробиологические методы выделения и идентификации C.diphtheriae выполняли по инструкции «Бактериологическая и серологическая диагностика коринебактерий дифтерии».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Конструирование штамма-продуцента специфического ДНК-зонда к фрагменту В tox-re на дифтерийного токсина (трансформация плазмидной ДНК). Создание набора специфических ДНК-зондов для обнаружения фрагментов А, В и AB гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина методом гибридизации.

Имеющиеся в референс-лаборатории штаммы-продуценты специфических ДНК-зондов к фрагментам toxА - E.coli С600 гт~ (pAZ219 toxA') и toxAB - E.coli С600 гт~ (рАВС124 toxAB') не позволяли создать полную батарею специфических зондов для процедуры ДНК-ДНК гибридизации, поскольку последняя должна содержать зонд

к фрагменту tox В гена дифтерийного токсина. Предоставленный Институтом вирусологии штамм-продуцент зонда /охВ1 - E.coli DH5<x (pSS6 taxB') не обеспечивал высокий выход плазмиды pSS6 и отличался по генотипу от штаммов С600. По указанным причинам плазмидой pSS6 tox В' был трансформирован штамм E.coli С600 гтг. Новый продуцент давал высокий и стабильный выход плазмидной ДНК. Идентичность плазмид, выделенных из «старого» и «нового» штаммов-продуцентов подтверждена электрофоретически. Полученный продуцент зонда toxW позволил создать полный (логически завершенный) набор специфических зондов для обнаружения генетических детерминант токсигенности ■ C.diphtheriae методом ДНК-ДНК гибридизации.

2. Оптимизация условий выполнения ДНК-ДНК гибридизации. Определение чувствительности, специфичности и прогностической значимости метода.

Созданная батарея (полный набор) ДНК-зондов проверена в процедуре гибридизации на 259 токсигенных и нетоксигенных штаммах C.diphtheriae. Гибридизация проводилась в 3 этапа - с каждым специфическим ДНК-зондом в отдельности. Оптимизирован температурный режим гибридизации и отработана схема изучения штаммов в данном методе. (Условия выполнения процедуры гибридизации подробно изложены в диссертационной работе.)

Препараты ДНК из штаммов, имеющих в геноме фрагменты гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина, дают четкое пятно засвечивания на рентгеновской пленке. Пример ауторадиографии гибридизационного фильтра представлен на рис.1. (На фотографии виден и, так называемый, слабый гибридизационный сигнал, интерпретация которого, как будет рассмотрено ниже, влияет на чувствительность и специфичность метода ДНК-ДНК гибридизации.)

1 2 3

JJ

III®

® ш & !

О О О

Рис.1. Рентгенограмма гибридизационного фильтра. 1- положительный контроль (ДНК C.diphtheriae #665-68, gravis, токсигенный); 2- отрицательный контроль (ДНК C.diphtheriae #12-68, mitis, нетоксигенный); 3- слабый гибридизационный сигнал (ДНК испытуемого штамма C.diphtheriae #124-86).

Рассчитаны параметры, определяющие эффективность технологии в зависимости от типа применяемого зонда и варианта интерпретации слабого гибридизационного сигнала (табл.1.).

Таблица 1.

Результаты определения параметров

диагностической технологии ДНК-ДНК

гибридизации.

Вариант А.

Используемый зонд pAZ219 tax А' Чувствительность 97 Специфичность Прогностическая значимость положительных/отрицательных результатов

98 98/97

рABC 124 toxAB' 97 98 98/97

pSS6 toxB' 99 94 95/99

Вариант В.

Используемый зонд Чувствительность Специфичность Прогностическая значимость положительных/отрицательных результатов

pAZ219 toxА' 97 88 82/98

рАВС124 tox AB' 97 87 90/98

pSS6 toxB' 97 94 95/98

В таблице 1.А слабый гибридизационный сигнал условно принимается за положительный, в таблице 1.В - за отрицательный. Используя эти данные, в зависимости от целей исследования можно выбрать соответствующий зонд и /или/ вариант интерпретации сигнала.

3. Изучение штаммов C.diphtheriae методом ДНК-ДНК гибридизации с использованием специфических зондов для обнаружения fox-гена дифтерийного токсина и его фрагментов.

Изученная выборка 125 нетоксигенных штаммов C.diphtheriae по результатам гибридизации гетерогенна и содержит, так называемые, потенциально-вирулентные штаммы: 7% всех нетоксигенных штаммов имеют неэкспрессирующийся /ох-ген или его фрагменты. Из них: около 5% штаммов содержат генетическую детерминанту фрагмента В молекулы дифтерийного токсина, около 1.5% штаммов содержат полную последовательность гена. Штаммы, имеющие в геноме только последовательность taxА, не обнаружены (табл.2).

4. Создание ускоренного метода на основе ПЦР для диагностики дифтерийной инфекции.

Модифицирован метод, предложенный М. Pallen в 1991г. для детекции токсигенных коринебактерий в чистой

культуре, в частности: изменена последовательность специфических праймеров; оптимизирован температурный режим реакции и внесены изменения в электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов. Изменения, внесенные в технологию, существенно повысили чувствительность и специфичность реакции. (Отличия модифицированного метода подробно изложены в диссертационной работе.)

Таблица 2.

Результаты определения наличия фрагментов 4ох-гена дифтерийного токсина методом ДНК-ДНК гибридизации у нетоксигенных штаммов С .(ИрЫкепае.

Количество Количество штаммов, имеющих

тести- Биовариант в геноме фрагменты

руемых (абс. величина/в %)

штаммов ^хА ^хВ (охАВ

62 gravis 0/0 3/4.8 1/1.6

63 тШв 0/0 3/4.8 1/1.6

Всего: 125 0/0 6/4.8 2/1.6

Модифицированный метод стал основой для создания диагностической технологии, позволяющей обнаруживать токсигенные корикебактерии в течение 24 часов в условиях практических лабораторий. Предлагаемый диагностический метод включает два этапа: селективное накопление культуры и собственно ПЦР.

Порядок выполнения метода следующий: Собранный материал из зева и /или/ носа засевается на агар Ноу1е и инкубируется в термостате в течение 18-20 часов при температуре 37°С до получения видимых микроколоний бактериальных клеток. Содержимое нескольких (3-5) колоний от одного больного переносится бактериальной петлей в 1.5 мл полипропиленовую пробирку для микропроб однократного применения, содержащую 0.5 мл дистиллированной воды. Образец кипятится в водяной бане в течение 20 мин, а затем центрифугируется 1 мин при

8,000g. 3 мкл препарата переносится в 0.5 мл пластиковую пробирку, содержащую 50 мкл реакционной смеси. Состав реакционной смеси: 10 шМ Tris-HCL, рН= 8.3; 50 шМ KCL; 1.5 шМ MgCl2; 200 гаМ р-р каждого dNTP; 2.5 Un AmpliTaq-полимеразы (Perkin Elmer Cetus). В состав реакционной смеси также входят два праймера: 5'- АТС САС ТТТ TAG TG С GAG AAC СТТ CGT CA -3' и 5'- GAA AAC ТТТ TCT TCG TAC САС GGG ACT AA- 3', которые вносятся по 0.5 мкл каждого из 100 шМ водного раствора и специфичны к флангам фрагмента tox-гена дифтерийного токсина, длиной в 248 п.о. На полученную смесь наслаивается 2 капли (из 200 мкл наконечника) легкого минерального масла (что предотвращает изменение объема реакционной смеси, связанного с испарением). Режим проведения ПЦР: 94.5°С -30 сек (2 мин для первого цикла); 53°С - 30 сек; 72°С- 50 сек (10 мин - для последнего цикла); количество циклов -35.

После проведения ПЦР образцы подвергаются электрофорезу в 1.5%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий (75 В, около 30 мин). Появление полосы, соответствующей фрагменту, длиной в 248 п.о., указывает на присутствие в образце ДНК, несущей ген дифтерийного токсина (рис. 2.), и vice versa - отсутствие вышеупомянутой полосы свидетельствует об отсутствии указанной последовательности.

В качестве положительного контроля используется высокоочищенная ДНК токсигенного штамма C.diphtheriae и препарат ДНК токсигенного штамма, в качестве отрицательного - вода и препарат ДНК нетоксигенного штамма данного вида.

Ввиду того, что определение токсигенных свойств в указанном методе проводится косвенным путем (определяется не токсический белок, а ген его детерминирующий) важно учитывать, что результат свидетельствует только о наличии (или отсутствии) последовательности tox-гена в испытуемом штамме, а не об истинной токсигенности штамма. (Такое ограничение

накладывается на все методы, основанных на детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот.)

Рис.2. Фотография продуктов ПЦР (20 мкл), разделенных в 1.5%-ном агарозном геле. Лунки: 1 и 3 - отрицательные контроля (вода и препарат ДНК нетоксигенного штамма C.diphtheriae CCUG 18645 соответственно); 2 и 4 - положительные контроли (очищенная ДНК токсигенного штамма C.diphtheriae CCUG 17398 и препарат из этого штамма соответственно); 5,6,8-12 - испытуемые препараты из штаммов токсигенных коринебактерий; 7- испытуемый препарат из нетоксигенного штамма; 13 - маркер.

5. Определение достоверности результатов

диагностического метода на основе ПЦР на статистически достаточном количестве штаммов возбудителя. Испытание технологии на клинических образцах.

В разработанной диагностической технологией было исследовано 140 токсигенных и 80 нетоксигенных штаммов C.diphtheriae, а также 4 штамма S.aureus. Результаты исследования методом ПЦР сопоставлялись с результатами, полученными в тесте на токсигенность (EIek test) (табл.3). Все токсигенные штаммы C.diphtheriae были определены в

1 2. 3 4 5 б ^ 8 Э И 12 1Ь

248 п.о.

ПЦР как «токсигенные», нетоксигенные штаммы и S.aureus -определены как «нетоксигенные».

Дополнительно, методом, включающим селективное накопление культуры и собственно ПЦР, исследовано 42 клинических образца (от больных дифтерией, бактерионосителей и ангинозных больных). Результаты, полученные при использовании данной технологии, не имели расхождений с результатами бактериологического анализа. Общая продолжительность диагностического исследования не превышала 24-х часов с момента посева клинического материала.

Реакция также выполнялась с заменой импортных реактивов высокой степени очистки и питательных сред отечественными аналогами (за исключением праймеров, синтезированных в Centers for Disease Control). Себестоимость в этом случае снизилась, но достоверность полученных результатов не исказилась.

Таким образом, можно резюмировать, что полученные в предлагаемой диагностической технологии результаты в 100% случаев коррелируют с результатами бактериологического исследования, а метод на основе полимеразной цепной реакции может служить в качестве надежного ускоренного метода для диагностики дифтерийной инфекции. Метод позволяет получить результаты на 2-3 суток раньше в сравнении с традиционной схемой бактериологической диагностики.

Высокие значения чувствительности и специфичности делают технологию конкурентноспособной по отношению к современным методам диагностики и удовлетворяющей требованиям, предъявляемым к внедрению новых диагностических процедур.

t I

Таблица 3.

Результаты определения токсигенных свойств штаммов C.diphtheria, полученные в ПЦР и Elek-тесте.

I Место Кол-во Год Клини- Биотип ПЦР Elek-

выделения штаммов выделе- ческий тест

I ния диагноз

Владимир 14 1985-93 дифтерия mitts + +

Владимир 3 1985-93 ангина rnitis - -

Владимир 12 1985-93 дифтерия gravis + +

Владимир 5 1985-93 ангина gravis - -

Владимир 7 1985-93 носитель mitis + +

Владимир 3 1985-93 носитель mitis - -

Владимир 6 1985-93 носитель gravis + +

Владимир 3 1985-93 носитель gravis - -

Липецк 4 1994 носитель mitis + +

Липецк 6 1994 носитель gravis + +

Москва 2 1994 дифтерия mitis + +

Москва 1 1994 ангина mitis - -

Москва 13 1994 дифтерия gravis + +

Москва 5 1994 ангина gravis - -

Москва 6 1994 носитель gravis + +

Мурманск 5 1994 дифтерия mitis + +

Мурманск Э 1994 дифтерия gravis + +

Мурманск 3 1994 ангина gravis - -

Мурманск 2 1994 носитель mitis - -

Мурманск •3 и 1994 носитель gravis -

Барнаул 6 1994 дифтерия mitis + +

Барнаул 6 1994 ангина mitis - -

Барнаул 10 ' 1994 дифтерия gravis + +

Барнаул 6 1994 ангина gravis - -

Барнаул 1 1994 носитель mitis + +

Барнаул 5 1994 носитель mitis - -

Барнаул 6 1994 носитель gravis + +

Барнаул 8 1994 носитель gravis - -

Владивосток 9 1994 дифтерия mitis + +

Владивосток 6 1994 ангина mitis - -

Владивосток 14 1994 дифтерия grams + +

Владивосток 10 1994 ангина gravis - -

Владивосток 3 1994 носитель mitis + +

Владивосток 7 1994 носитель mitis - -

Владивосток 7 1994 носитель gravis + +

Владивосток 4 1994 носитель gravis - -

выводы

1. Разработан ускоренный метод диагностики дифтерийной инфекции на основе полимеразной цепной реакции, позволяющий обнаруживать токсигенные штаммы C.diphtheriae в исследуемом материале в течение одних суток;

2. Сконструирован штамм-продуцент специфического зонда pSS6 tox В1, обеспечивающий высокий выход и стабильность плазмидной ДНК;

3. Создан набор специфических зондов pAZ219 toxА', рАВС124 ioxAB' и pSS6 toxB' для обнаружения /ох-ген а или его фрагментов (А и В) в процедуре ДНК-ДНК гибридизации;

4. Оптимизированы условия выполнения метода гибридизации для изучения и дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae при использовании созданного набора ДНК-зондов;

5. Определена прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов, чувствительность и специфичность ускоренного метода на основе ПЦР и метода ДНК-ДНК гибридизации с использованием набора специфических ДНК-зондов для правильной интерпретации результатов исследования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мазурова И.К., Заикин В.Л., Комбарова С.Ю., Михайлович В.М. Характеристика штаммов коринебактерий дифтерии, циркулирующих в России // В кн.: Эпидемия дифтерии в Европе. Материалы междунар. совещания (Санкт-Петербург, 5-7 июля 1993 г.).- 1993.- С.99-100.

2. Михайлович В.М., Паринов C.B., Мазурова И.К. Полимеразная цепная реакция может служить надежным альтернативным методом при диагностике дифтерийной инфекции / В сб. Состояние и перспективы разработки

препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики // Сб. тез. докл. Всерос. научно-практич. конференции.- Пермь,- 1993,- С.83-84.

3. Михайлович В.М., Заикин В.Л., Мазурова И.К. Использование метода ДНК-ДНК гибридизации для изучения штаммов Corynebacterium diphtheriae // Мол. генетика, микробиол. и вирусология.- 1994,- №6.- С.29-31.

4. Mazurova I., Kombarova S., Mikhailovich V., Melnikov V., Platonova T. Laboratory diagnosis of diphtheria in Russia // In: Proceedings of the 1st Internat. Meeting of the Europ. Lab. Working Group on Diphtheria, Public Health Lab. Serv., London, 1995,- p.20.

5. Михайлович В., Мельников В., Попович Т. (Popovic Т.), Мазурова И. Ускоренный метод диагностики дифтерийной инфекции на основе полимеразной цепной реакции. // Ж. микробиол., эпидемиол., иммунол.-1995.- (В печати).

6. Mikhailovich V.M., Melnikov V.G., Izabella К. Mazurova, I.Kaye Wachsmuth, Jay D. Wenger, Melinda Wharton and Tanja Popovic. Application of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains isolated during the Russian diphtheriae epidemic, 1990-1994

Подписано х печати 10 сентября 1995 г. Заказ 201 Объем 3,25 п.л. Формат 60x84 1/16 Тир 50

Отпечатано на ризограф© в НИЦ ИТЭП.