Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции"

На правах рукописи

КОМБАРОВА СВЕТЛАНА ЮРЬЕВНА

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2007

003058361

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор медицинских наук Мазурова Изабелла Константиновна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Шендеров Борис Аркадьевич

доктор медицинских наук, профессор Русакова Екатерина Владимировна

доктор биологических наук Бобкова Марина Ридовна

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им И И Мечникова Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится « » Лсбс^ 2007 г в час на

заседании диссертационного совета Д 208 046 01 в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу 125212, г Москва, ул Адмирала Макарова, Д Ю

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского

Автореферат разослан «

1о » 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Лютов А Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАНО! Ы Актуальность проблемы

Введение в России в 1959 г планомерной массовой иммунизации детей дифтерийным анатоксином привело к значительному снижению заболеваемости дифтерией Так, если в 1958 г показатель заболеваемости на 100 тысяч населения (ПЗ) составил 68,0, то к 1975 г он снизился до спорадического уровня (ПЗ 0,03) Однако в следующие два десятилетия вновь зарегистрированы эпидемические подъемы В 80-е годы на фоне продолжения массовой вакцинопрофилактики дифтерии наблюдалась интенсификация эпидемического процесса в 1983-1985 г г с максимальным ПЗ 0,93 в 1984 1 (Маркина С С и др , 1989, Максимова Н М и др , 2003)

В 90-с годы распространение дифтерийной инфекции в России приобрело характер эпидемии с пиком в 1994 г, когда ПЗ составил 26,9 Благодаря расширению масштабов иммунизации детей и взрослых, контролю за состоянием антитоксического иммунитета населения и своевременному проведению мероприяшй по его коррекции, повышению качества клинической и лабораторной диагностики, а также совершенствованию методов лечения дифтерии произошло снижение уровня заболеваемости этой инфекции К 20032004 г г ПЗ снизились до 0,48 - 0,35 соответственно, к 2005 - 2006 г г - до 0,35 - 0,12 соответственно Вместе с тем, среди непривитых, по-прежнему, регистрируются тяжелые формы заболевания и летальные исходы, что указывает на скрытое протекание эпидемического процесса, который поддерживается, главным образом, за счет носительства токсигенных СогупеЬаМегтт (¡/рк/Иегше и ле1ких форм заболевания у привитых (Маркина С С и др , 1993, 1996, 2000, 2002, 2005, 2006)

Исследованиями российских и зарубежных ученых установлены основные причины поддержания эпидпроцесса дифтерии 1) антитоксический поствакцинальный противодифтерийный иммунитет, предотвращая летальные исходы и тяжелые формы заболевания, не препятствует носительству

токсигенных С скркЖепае (Фаворова Л А и др , 1988, Костюкова Н Н , 1991, 1999, Шмелева ЕЛ и др , 2002, 2005, Маркина С С и др , 2005 2006), 2) массовая вакцинопрофилактика дифтерии не привела к ослаблению вирулентных свойств возбудителя этой инфекции (Костюкова НН, 1967, Черкасова ВВ, 1988, Мазурова ИК, 1993, Платонова ТВ, 1991, Борисова ОЮ , 1999), 3) высокая гетерогенность вида С сЬрЫгегюе по биологическим свойствам способствует формированию популяции со сложной клональной структурой, что облегчает адаптацию возбудителя к постоянно меняющимся условиям сущей вования (Крылова М Д , 1976, Тренин С А , 1986, ЕГь1га1юи А , й а1, 1995, Ророую Т , е1 а1, 1996, 2000, ТПоу Ь Р , е1 а1, 2003, Мельников В Г и др , 2004, Мазурова И К , 1996, 2006)

Указанные причины определяют трудности борьбы с дифтерией на современном этапе и невозможность эрадикации ее возбудителя с помощью существующих средств вакцинопрофилактики Поэтому важным компонентом системы эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией является наблюдение за циркулирующими штаммами С ейрЫкепае (Фаворова Л А и др, 1981, 1988, Мазурова И К и др , 1993, 1998, Максимова Н М и др 2002)

Современные молекулярно-биологические технологии расширили возможности исследователей по изучению возбудителей инфекционных заболеваний, тк позволяют наблюдать за формированием микробных популяций, выявлять возможную эволюционную изменчивость бактерий, а также оценивать и прогнозировать тяжесть эпидемического и инфекционного процессов (Шагинян И А , 2000, УегеаЬую I, ег а1, 2002, ТагазеуюЬ I V , е! а1, 2003, Мазурова И К и др , 2005)

Представлялось актуальным использовать методический прием, включающий классические микробиологические и молскулярно-генетичсские методы исследования, при мониторинге С ЖрЫИепае в динамике эпидемического процесса

Цель исследования

Научное обоснование системы комплексного микробиологического и молекулярно-гснетического мониторинга возбудителя дифтерийной инфекции и установление особенностей его распространения в условиях высокой и низкой интенсивности эпидемического процесса

Задачи исследования

1 Провести молскулярно-генетическое типирование (риботнпирование, энзимтипирование) токсигенных и нетоксигенных штаммов С сЬрЫкепае, выделенных в России в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции

2 Разработать ускоренный метод типирования С ЖрЫкепае, основанный на технологии полимеразной цепной реакции

3 Изучить с помощью метода секвенирования структуру генов Юх и ЛхК, ответственных за синтез дифтерийного токсина - основного фактора патогенности возбудителя дифтерии

4 Провести наблюдение за распространением токсигенных и нетоксигенных штаммов С ЖрЫкепае основных биоваров на территории России

5 Сформировать базу данных по риботипам С скрЫкепае, выделенных в России

Научная новизна

Получены новые сведения по фенотипической и генотипической характеристике С ЖрЫкепае, свидетельствующие о клональном распространении штаммов возбудителя дифтерии в период последней эпидемии в 90-е годы XX века Формирование эпидемической клональной группы штаммов, установленное в динамике наблюдения, началось за несколько лет до повышения показателей заболеваемости дифтерией, что

явилось предвестником осложнения эпидемиологической ситуации В период эпидемического подъема эти штаммы доминировали в популяции и были распространены на всей территории России Доминирующие штаммы характеризовались высоким уровнем токсинообразования, относились к биовару gravis, энзимтипам комплекса 8, риботипам 'Sankt-Peterburg/Rossija', отличались по структуре гена дифтерийного токсина (tox) и регуляторного гена dtxR от недоминирующих штаммов, все штаммы доминирующей клоналышй группы имели мутационные изменения в регуляторном гене dtxR в положении 440 (замена нуклеотида С на Т), что, вероятно, привело к повышению уровня токсинообразования При снижении показателей заболеваемости популяция возбудитетя дифтерии длительное время сохраняет гомогенную структуру, что обусловлено широким распространением доминирующих штаммов В условиях низкой интенсивности эпидемического процесса (80-е годы XX века) популяция возбудителя дифтерии гетерогенна по штаммовому составу (биоварам, риботипам, энзимтипам)

Впервые выявлена мутация в гене tox в положении 1252 (замена нуклеотида G на С), приводящая к изменению домена R фрагмента В дифтерийного токсина, ответственного за первичное взаимодействие токсина с рецепторами чувствительной эукариотической клетки Полученные данные опровергarai сложившееся представление о невозможности генетических изменений гена дифтерийного токсина, приводящих к изменению структуры дифтерийного токсина - основного фактора патогенности возбудителя дифтерии

Получены новые данные, свидетельствующие об участии нетоксигенных штаммов в формировании популяции возбудителя дифтерии выявлена взаимосвязь процессов циркуляции токсигениых и нетоксигенных штаммов С diphtheriae, филогенетическая связь между ними, обусловленная общностью генов рРНК и регуляторного гена dtxR, показана способность нетоксигенных

штаммов, выделенных в современный период, приобретать ген дифтерийного токсина

Теоретическая значимость

Усшновленные особенности формирования популяции возбудителя дифтерии, внутривидовое разнообразие С diphthenae по признаку токсигенности, биоварам, риботипам, энзимтипам и аллельным вариантам по генам tox и dtxR. ответственным за токсинообразование, являются теоретическим обоснованием невозможности полного искоренения (эрадикации) возбудителя дифтерии вследствие его высокой жизнеспособности Новые сведения об изменчивости генов tox и dtxR, контролирующих структуру и функцию дифтерийного токсина, указывающие в ряде случаев на несоответствия структуры этих генов у циркулирующих штаммов и вакцинного штамма Park Wilhams 8, в дальнейшем, при накоплении подобных фактов, помогут объяснить причину заболевания правильно привитых лиц и теоретически обосновать новые подходы к совершенствованию вакцинопрофилактики при дифтерии

Практическая значимость

С помощью усовершенствованной системы мониторинга возбудителя дифтерии, включающей комплекс микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методов исследования уточнены механизмы формирования популяции возбудителя дифтерии в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции Полученные результаты позволяют повысить эффективность микробиолотического мониторинга при соствлении более точных прогнозов развития эпидемического процесса

Учитывая, что негоксигенпые С diphthenae могут оказывать влияние на формирование популяции возбудителя дифтерии, целесообразно проводить наблюдение за нетоксигенными штаммами в специализированных центрах и

научно-исследовательских институтах, изучающих проблему дифтерии Установление механизма блокирования продукции дифтерийного токсина у нетоксигенных токснесущих штаммов риботипа 'Moskva' позволило разработать метод дифференциации нетоксигенных токснесущих штаммов С diphtheriae от «истинно» токсигенных штаммов (защищено патентом № 2209831)

Пополнена уникальная, единственная в мире коллекция штаммов С diphtheriae, выделенных в России, которая включена в единую информационную систему «Генетические и биологические (юоло1ические и ботанические) коллекции Российской Федерации

(http //www sevin lu/collections/index html) Включение коллекции в единый реестр расширяет возможности ученых России и всего мира по исследованию возбудителя дифтерии с целью создания новых препаратов и биотехнологий, направленных на совершенствование лабораторной диагностики и средств иммунопрофилактики дифтерии

Созданная база данных по риботипам С diphtheriae позволяет проводить сравнихельные исследования генетической структуры штаммов С diphtheriae с целью регистрации новых, ранее не циркулировавших штаммов, и наблюдать за их распространением Штаммы риботипов С diphtheriae, выделенных в России, включены в коллекцию Федеральной референс лаборатории по диагностике дифтерийной инфекции МНИИЭМ им Г Н Габричевского Штаммы риботипов 'Sankt-Peterburg', 'Rossya', 'Vladimir', 'Kaliningrad' и 'Moskva', впервые зарегистрированные в России, представлены в Международную базу данных риботипов С diphtherше в Институте Пастера (Париж)

Апробация работы

Диссертация обсуждена и одобрена на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им Г Н Габричевского, протокол № 6 от 2 ноября 2006 г Основные результаты исследований доложены и обсуждены на 5-ги

Российских и 14-ти международных конференциях съездах Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997, 2002), Российских научно-практических конференциях «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000), «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004), «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006), на международных конференциях «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1995, 1998, 2003), на 95ом Съезде американского общества по микробиологии (95th General Meeting of American Society for Microbiology - Вашингтон, 1995), на 1ом Конгрессе общества европейских микробиологов (1 FEMS Congress of European Microbiologists - Любляна, 2003), на совещаниях Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по дифтерии и проекта по контролю за дифтерией в странах Европейского Союза (International Meetings of the European Laboratory Working Group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria Surveillance Network, DIPNET - Лондон, 1994, Хельсинки, 1995, Париж, 1996, Бухарест, 1997, Халхидики, 1998, Брюссель, 2000 г, Вена, 2002, Копенгшен, 2004, Вольягмени, 2006)

Публикации

Основное содержание работы отражено в 53 научных публикациях в статьях - 16, в том числе в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК России - 8 (5 в отечественных, 3 - в иностранных журналах), в материалах всероссийских и международных конференций - 30, в патенте на изобретение -1, в инструктивно-методических документах - 6

Объем и структура диссертации

Работа изложена на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы Библиография включает 258 наименований работ

отечественных и зарубежных авторов Общий объем диссертации составляет 225 страниц машинописного текста Текст иллюстрирован 33 таблицами и 28 рисунками

Работа выполнялась в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Эпидемиология, микробиология», Федеральной целевой программы «Вакцинопрофилактика», Международных проектов 1псоСорегшсиз, ШТАБ, Международного научно-технического центра (МНТЦ), деятельности Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по диф1ерии

Положения, выносимые на защиту

1 Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг позволяет выявлять фенотипические и генотипические особенности циркулирующих штаммов С сЬрЫЬепае в динамике эпидемического процесса В период, предшествующий эпидемическому подъему заболеваемости дифтерией, популяция возбудителя дифтерии гетерогенна по биологическим свойствам циркулирующих штаммов При активизации эпидемического процесса популяция приобретает относительную гомогенность, которая сохраняется длительное время при снижении интенсивности эпидемического процесса

2 В период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией в 90-е годы XX века распространение возбудителя дифтерии на территории России носило выраженный клональный характер Циркулирующие штаммы возбудителя дифтерии характеризовались высоким уровнем токсинообразовапия, что определено особенностями регуляторного гена с/гхЯ Структура генов гох и скхЯ, ответственных за синтез дифтерийного токсина, полиморфна у циркулирующих штаммов

3 Филогенетическая связь между токсигенными и нетоксигенными и С diphtheriae, а также особенности их циркуляции подтверждают роль последних в формировании популяции возбудителя дифтерии

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Штаммы бактерий. Использовали штаммы С diphtheriae, выделенные в период 1945 - 2003 г г па территориях семи Федеральных округов России (Центральном, Северо-Западном, Приволжском, Южном, Уральском, Сибирском, Дальневосточном) (табл 1, 2) Коллекционные штаммы бактерий представлены в табл 3 Штаммы С diphtheriae и коринефаги с известной последовательностью иуклеотидов генов tox и dtxR, представленные в базе данных Gene Bank (http //www nebí nlm mh gov), приведены в табл 4

Таблица 1

Штаммы С diphtheriae, выделенные на территории России в 1945 — 2003 г г

Котачество штаммов Характеристика

токсигенные нетоксигеиные

биовара gravis биовара milis биовара gi avis биовара milis

3193 1226 936 346 685

Таблица 2

Штаммы С diphtheriae, изученные с помощью иммунохимических и молекулярно-гснетических методов исследования

Количество штаммов Изучено с помощью различных методов исследования

РИГА " ПЦР 21 УП-ПЦГ J) риботипиро 1 МЭЭ4' вание секвенирование

гена toх гена díxR

2162 1074 667 1068 222 48 54

" реакция непрямой гемагглкминации, 2) полимеразная цепная реакция, 3> полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами,4'мультилокусный энзимный электрофорез

Таблица 3

Коллекционные штаммы бактерий, использованные в исследовании

Вид микроорганизма и номер штамма Котлекция Характеристика штамма

токсигенные свойства биовар

1 С diphtheriae 664 ГИСК им Л А Тарасевича1' + gravis

2 С diphtheriae 665 ГИСК им JI А Тарасевича2) + gravis

3 С diphtheriae 41 МНИИЭМ им Г Н Габричевского - gtavis

4 С diphtheriae Park Wilhams 8 (PW 8) ГИСК им Л А 1арасевича3> + mitis

5 С diphtheriae 10 ГДР МНИИЭМ им Г Н Габричевского4' + gravis

6 Citrobacter kosen 105177 Институт Пастера, Франция, Париж - н/о

'' штамм получен в 1957 г из Национальной коллекции типовых культур Великобритании (Лондон) (NCTC 7282), серотип 2 (Robinson and Peeney),2) получен в 1957 г , NCTC 7285, 3) получен в НИИВС (Уфа) в 1992 г, используется в России для производства дифтерийного анатоксина, 4)фаготип OPQRSTg (Маркина С С , 1971)

Таблица 4

Штаммы С diphtheriae и коринефаги с известной нуклеотидной последовательностью генов tox и dtxR

Вид Микроорганизма № GeneBank accession number Токсигенные свойства Биовар Риботип

С diphtheriae С 7 (-)'' 144970 - mitis не опр

С diphtheriae PW 82> 80838 + mitis 'PW 8'

С diphtheriae NCTC 13129" BX 248353 + gravis 'Rossijj'

Коринефаг ß4) КО 1722 + - -

Коринефаг со3' V011536 + - -

'' Boyd et al, 1990, 2) Boyd et al, 1992, данные по риботипу данного штамма получены из «Международной базы данных по риботипировачию», Grmiont et al, 2004, 1 шгачм использован в проекте по расшифровке генома С diphthe'iae, выделен в 1997 г от больной дифтерией, после ее возвращения в Великобританию из круиза по Балтийскому морю, Cerdeno-Tarraga et al, 2003, 4,Greenfild et al, 1983, 5) Ratli et al, 1983

Микробиологический мониторинг осуществляли при использовании комплекса методов Собирали штаммы С diphtheriae, выделенные от больных и бактерионосителей в регионах России, проводили их референс идентификацию с определением биоваров, токсигенных свойств и уровня токсинообразования (УТ) в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), пополняли коллекцию культур Изучали интенсивность циркуляции С diphtheriae на территории России, используя отчеты областных Центров гигиены и эпидемиологии

Исследования генетической структуры популяции С diptheriae проводили с помощью молекулярно-генетических меюдов Для типирования (маркирования) циркулирующих штаммов использовали риботипирование, мультилокусный энзимный электрофорез (энзим-шпироваиие), полимеразную цепную реакцию с универсальными праймерами (УГГ-ПЦР), характеризующие геном (хромосомальную ДНК) бактериальной клетки Структуру отдельных генов (tox и dtxR), ответственных за токсинообразование возбудителя дифтерии, изучали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования ДНК

Микробиологическое исследование культур С diphtheriae проводили согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции» (Мазурова И К и соавт , 1998)

Распространение С diphtheriae на территории России оценивали, анализируя удельный вес биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов и показатели выделяемости (ПВ) токсигенных и нетоксигенных С diphtheriae (количество положительных находок на 1000 лиц, обследованных с целью выявления С diphtheriae)

РНГЛ проводили с помощью коммерческого эритроцитарного дифтерийного диагпостикума (производства НИИЭМ им Пастера, Санкт-Петербург, разработанног о совместно с МНИИЭМ им Г Н Габричевского при нашем непосредственном участии) Для наблюдения за УТ циркулирующих штаммов ежегодно высчитывали среднеарифметический показатель обратных

титров РИГА Соответственно, штаммы подразделяли на три группы высокого УТ (показатели УТ 32-128), среднего У Г (показатели УТ 8-16), низкого УТ (показатели УТ 2-4)

ПЦР по выявлению гена дифтерийного токсина проводили с помощью коммерческой тест-системы «Ампли-Сенс-ПЦР» (производство ЦНИИЭ, Москва)

УП-ПЦР проводили при использовании коммерческого набора Ready То Go RAPD Analysis Beads Kit (Pharmacia Biotech, Poscataway, N J , USA) Из шести праймеров, входящих в состав набора, эксиеримешально подобраны праймеры № 3 - GTAGACCCGT и № 4 - AAGAGCCCGT, характеризующиеся наибольшей дифференцирующей способностью для С diphtheriae

Риботипировапие проводили в соответствии с рекомендациями Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по дифтерии (МЛРГД) (Grimont Р et al, 2004) и данными ряда научных статей, посвященных этому вопросу (Lefresne В et al, 2004, Popovic Т et al ,1993, Graves L , Swammathan В , 1993) Результаты интерпретировали визуальным способом и с помощью компьютерной программы "Taxotron" (Grimont Р, 2000) МЛРГ ВОЗ по дифтерии сформирована база данных по риботипам С diphtheriae, зарегистрированным в мире, и разработана номенклатура риботипов по принципу географических названий Например, 'Sankt-Peterburg', 'Rossja', 'Lyon', 'Moskva', и т д Номенклатура, использованная нами ранее, приведена в соответствие с международной для сопоставления результатов, получаемых в разных лабораториях мира Если для какого либо рибогипа не обнаруживали соответствия, то для него оставляли старое название, включающее номер (1, 2, 3 и т д ), перед которым ставили букву длч обозначения биовара (G - gravis, М - rut is)

Энзштшпированис проводили по методу (Seiander R, 1986) в модификации (Reeves М et al, 1989) Результаты интерпретировали с помощью построения дендрограммы по методу (Jakobs D , 1990)

Секвенирование генов tax и dtxR. Амплификацию генов tox и dtxR осуществляли по методике Н Nakao и др (1996) Секвенирование выполнено на фирме «Пинии» с помощью ABI PRISM BigDye Terminator Cycle sequencing ready reaction kit на ABI DNA-секвенаторе ("Perkm Elmer Applied Biosystems")

Эксперименты no фаговой конверсии нетоксигенных С diphtheriae в токсигепные. Индукцию коринефагов из лизогенных токсигенных культур С diphtheriae, заражение коринефагами нетоксигенных культур с помощью метода агаровых слоев, титрование суспензий коринефагов осуществляли по общепринятым методикам (Адаме М , 1961, Наумов Л С , 1967, Крылова М Д, 1976)

Статистическая обработка результатов Использованы методы математической статистики, принятые в биологии и медицине (Гланц С , 1999)

Результаты исследования Генотипические и фенотипические особенности С. diphtheriae в динамике эпидемическо1 о процесса

В качестве основного метода при установлении особенностей генетической структуры популяции С diphtheriae использовали рибогипирование, в котором штаммы объединяют в группы - риботипы по общности генов рРНК Гены рРНК соответствуют ряду требовании, которым должны удовлетворять молекулярные филогенетические маркеры 1) присутствуют у всех представителей исследуемой группы родственных организмов, 2) происходят от общего предка и функционально постоянны, 3) генетически стабильны, т е относя ich к iax называемым генам «домашнего хозяйства» (housekeeping genes), обеспечивающим основу жизнедеятельности клетки В генах рРНК чередуются константные (консервативные), а таюке высоко вариабельные области (Ленгелер Й и др , 2005)

Зарегистрирован 31 риботип, что свидетельствует о генетической гетерогенности популяции С diphtheriae, циркучирующей на территории

России (рис 1) Токсигенные штаммы сгруппированы в 23 риботипа, нетоксигенные - в 20 риботипов, 12 риботипов включали как токсигснные, так и нетоксигенные штаммы

1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16 1718 19 20 2122 23 л124 25 26 27282930 31 32 m

1 M 14 12 'var Preston' (M 7) 23 NTTB 3

2 'Sankt-Petersbuig' (G 1) 13 'Washington' (M 7) 24 'Iasi'

3 'Buzau' (G 3) 14 'Lyon' (Mil) 25 'Dagestan'

4 'Rossija' (G 4) 15 'Atlanta 767' (M 8) 26 'Kaliningrad'

5 'Vladimir' (G 4v) 16 M 9 27 'Londmium'

6 'Vladimir 713' (M 5) 17 'Burmum' (M 10) 28 'Pakistan'

7 'Otchakov' (M 1) 18 'Vladimir 711' (M3) 29 'Ras-el-Ma'

8 'Otchakov' (M lv) 19 'M 15 30 'Schwarzenberg'

9 'Cohndale' (M 4) 20 'Moskva' 31 'Versailes'

10 'Cluj' (M 13) 21 NTTB 1 32 'Vrancea'

11 'Atlanta 724'(M 8) 22 NTTB2

Рис 1 BstE II блот-профили риботипов С diphtheriae, зарегистрированных в России А - учет результатов визуальным способом, Б — учет результатов с помощью программы "Taxotron" М - маркер молекулярного веса (т п о )

Изученные 847 токсигенных штаммов распределены по риботипам неравномерно (рис 2 ) Преобладали штаммы риботипов 'Sankt-Peterburg' и 'Rossija' (72,3 %) На основании сходства бло1 -профилей данные риботипы объединены в общую группу 'Sankt-Peterburg/Rossija' (рис 3) Вторым по величине удельного веса являлся риботип 'Otchakov' (15,1 %), коюрый также состоял из двух близкородственных риботипов, ранее обозначенных нами как М 1 и М lv Удельный вес риботипа 'Lyon' составил 5,9 % Остальные риботипы включали от 1 до нескольких штаммов, их совокупный удельный вес

составил 6,7 %. Таким образом, доминировали штаммы риботипов РеСегЫлу2'Вл55. уа' и 'ОсЬакс«'. Первый состоял преимущественно из штаммов биовара ¿гау/л- (95,4 %) второй - из штаммов биовара тШ$ (100 %).

М 1

г з

4 5

ä,ü ~ 1А

□' Sankt-Р eterburp/'Ro ssij а'

□ 'Otchakov' т 'Lyon'

я -qtaj'

□ другие риботипы

Рис. 2, Удельный вес токсигенных С. diphtheriae различных риботипов.

LS

Рис 3. BstE-блот профили риботипов С. diphtheriae высокого удельного веса.

М - маркер молекулярного веса линия 1 - риботяп 'Lyon' (М 11) линии 2,3 - риботип 'OichakoV (М 1, МI v) линии 4 - риботип 'Sankt-Peterburg' (G 1) линия 5 - риботип •Rossija' (G 4)

Учитывая трудоемкость, длительность и высокую стоимость риботипирования, с целью ускоренной индикации риботипов высокого удельного веса *$алк?-Ре{егЬиг£Ж.о$5ца' разработан метод УП-ПЦР. УП-ПЦР заключается в амплификации (синтезе) нескольких фрагментов ДНК из различных участков генома микроорганизм ов при помощи п ран мер а с произвольной последовательностью нуклеотидов. Штаммы с одинаковым набором фрагментов объединяют в группы - УП-ПЦР типы. Штаммы риботипов '$апк1-Ре1егЬщ8/11оБ8уа' в УП-ПЦР характеризовались четкими,

72,3%

стабильными УП-ПЦР типами (профилями) (рис. 4). Поэтому при изучении генетической структуры популяции С ¿ИрЫНочае в динамике эпидемического процесса проводили индикацию в УП-ПЦР штаммов риботипов '8апк1-РегегЬиг^Козауа', затем в рнботипировании изучали выборочно штаммы данной группы, а также все штаммы, не относящиеся к группе 'Запкь Ре1егЬиг§/коя5^а'.

I J 3 4 S е 7 8 ? 10 IJ

.

Рис. 4. У11-11ЦР профили (Л) и BstE П блот профили риботилов С. diphtheriae (Б).

Линии 1, 2, 3, 4. 5, б - ПЦР профили и BstE II блот-профили (риботипы) 'Sankt-Pelerburg/Rossija'; линия 7 — УП-ПЦР профиль и BstE I] блот-профилв 'Vladimir'; линии 8, 9, 10 -УП-ПЦР профили и BstE II блот-профили 'Otchakov'; линия 11 - УП-ПЦР профиль и BstE II блот-профи ль М 15.

Отличительной особенностью в развитии эпидемического процесса дифтерийной инфекци и в России является периодичность подъемов и спадов заболеваемости. Особое внимание в работе уделено характеристике штаммов, циркулировавших во время последнего эпидемического подъема дифтерии 90-х годов XX века (1990 - ¡995) и спада заболеваемости на фоне массовой иммунизации детей и взрослых (1996 - 2003 г.г.). Периодами сравнения явились Предыдущий циклы дифтерийной инфекции: период высокой заболеваемости до введения в 1958 г. планомерной массовой иммунизации детей дифтерийным анатоксином (1945, 1950, 1963) и спада заболеваемости на

фоне иммунизации (1966, 1967, 1971 - 1979 гг), период спорадической заболеваемости (1981 - 1989 г г), включающий некоторую активизацию эпидемического процесса в 1983 - 1985 г г при сравнительно невысоких показателях заболеваемости (рис 5)

Биовар gravis риботип 'Lyon* (84,6

Биовар шЛь рпботипы 'OtchakoV (29,4 %) 'Sankt- Pete rburg1, 'Ro^sija' (21,S %) другие б риботипов (47. П

26 9 1%

■ »24 О

Биовар gravis, риботипы 'Sankt-Peterburg', 'Rossija' (до 96,1 %)

ЧФ* # ^ Л" ^ & ^

■ Удельный вес биовара gravis - Удел» ш ni вес биовар-i ulitis

" " - Показатели заболеваемости днфюрисн на 100000 населения

Рис 5 Структура популяции токсигенных С ЖрЫИепае, выделенных в России в различные периоды эпидемического процесса дифтерии

В 40-70-е годы XX века доминировали штаммы биовара gravis риботипа 'Lyon' (84,6 %), в 80-е годы при доминировании биовара mitis популяция была гетерогенна по риботипам (6 риботипов) (рис 5) По удельному весу выделялись штаммы биовара mint риботипа 'Otchakov' (29, 4 %) и штаммы биовара gravis риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija' (23,5 %)

Во время последнего эпидемического подъема произошла смена доминирующего биовара возбудителя дифтерии, на смену биовару mitts вновь пришел биовар gravis На всей территории России последовательно увеличивался удельный вес штаммов риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija', впервые зарегистрированных нами в 1987 г (рис 5, 6) Во время стабилизации

и начала снижения 113 дифтерией в 1995 и в 1996 г.г. удельный вес риботипов 'ХапЙ-РегегЬиг^Яокзуа' составил 87,3 % и 96,1 % соответственно- Среди других риботипов регистрировали только риботип '01сЬакоу' (рис. 6).

19К5- 1990- 1994 1495 1996 1997- 2(Ю1-1989 1993 2000 2003

■ 'Saiikt-PeTcibiirg/Rossija' □ 'Otcliakov' □ другие риботины

Рис. 6. Удельный вес (в процентах) риботипов то кс и генных С, diphtheriae, выделенных в России в 1985-2003 г.г.

Доминирование риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossijа' сохранялось и при дальнейшем снижении интенсивности эпидемического процесса, однако с 1997 г. в популяции возбудителя дифтерии отмечаются изменения. Постепенно снижается удельный вес риботипов 'Sankt-i'eterburg/Rossija' (до 72, 1% к 2003 г.), удельный вес риботип а 'Otcakov', напротив, увеличивается (до 17,0 % в 2003 г.)(рис.6).

Весьма показательна структура недоминирующих риботипов, количество которых возросла к 2003 г. до 10 ('Otchakov', 'Londinium', 'C1uj\ 'Lyon', 'Schwarzenberg' 'Ras-cl-Ma' 'Vrancea', M!4, 'Vladimir', 'Pakistan'), их совокупный удельный вес увеличился до 10,9 %. В большинстве своем (7 из 10) они принадлежали к биовару mitis. Преобладали штаммы работала "Otchakov1 (64,7 %). По удельному весу выделялись также риботипы 'Londinium' (10,3 %),

'Lyon' (10,3 %) и 'Cluj' (5,9 %) Ряд риботипов ('Londimum', 'Vrancea', 'Pakistan', Schwarzenberg' и 'Ras-el-Ma') зарегистрированы впервые только в период снижения уровня заболеваемости в 2001 - 2003 г г

Таким образом, несмотря на сохраняющееся доминирование штаммов биовара gravis риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossya', в популяции возрастает роль биовара mitis других риботипов, происходят изменения, указывающие на формирование гетерогенного состава штаммов возбудителя дифтерии Появление в циркуляции штаммов новых риботипов является настораживающим фактором, тк некоторые из эгих штаммов вноследывии могут преодолеть колонизационную резистентность слизистых оболочек большого числа людей и получить широкое распространение Таким образом, каждому эпидемическому циклу дифтерийной инфекции соответствовало преимущественное распространение штаммов одного из биоваров С diphtheriae и определенных риботипов

Клепальный состав и патогенные свойства циркулирующих штаммов возбудителя дифтерии. Структура генов tox и dlxR, ответственных за синтез дифтерийного токсина

Клональный состав популяции С diphtheriae изучен с помощью энзимтипирования, в котором устанавливают электрофоретическую подвижность метаболических энзимов, определяющих характер жизнедеятельности клетки Структура данных энзимов четко корелирует с генотипом штамма

В энзимтипировании обнаружена более детальная внутривидовая дифференциация С diphtheriae, чем в риботипировании На рисунке 7 представлена дендрограмма, показывающая степень родства индивидуальных энзимтипов 156 штаммов С diphtheriae, выделеных в период до и во время эпидемического подъема 90-х годов прошлого века (1985 - 1994) Зарегистрировано 76 энзимтипов Среди многообразия энзимтипов выделялись

две группы, каждая из которых включала комплекс близкородственных энзимтипов Первая группа (14,1 % штаммов), названная энзимтипы комплекса 6 (1 енетическая дистанция < 0,18), состояла из тринадцати энзимтипов Вторая группа (50,6 % штаммов) с более выраженной степенью родства (генетическая

Генетическая дистанция

Рис 7 Дендрограмма эчзимшпов С скрЫкепае, выделенных в России в период 1985-1994 г г (ЭТ—энзимтип, РТ—риботип)

дистанция < 0,11), названная энзимтипы комплекса 8 (ЭТ комплекса 8), представляла четырнадцать энзимтипов Установлена четкая взаимосвязь клоналыюй группы ЭТ комплекса 6 с риботипом 'СНсИакоу' и клональной группой ЭТ комплекса 8 с риботипами '8апк1>Ре1егЬиг§/11о55уа'

Остальные 49 энзимтипов (35, 3 % штаммов) не формировали комплексы Подобный характер распределения энзимтипов позволил считать ЭТ комплекса 6 и ЭТ комплекса 8 доминирующими энзимтипами

Штаммы клональной группы ЭТ комплекса 8, впервые зарегистрированные в 1987 г, распространились в годы эпидемического подъема повсеместно на территории страны В 1996 г, когда ПЗ дифтерией начали снижаться, штаммы клональной группы ЭТ комплекса 8 и риботипов '8апк1-Ре1егЬи^/11о85уа' по-прежнему доминировали, однако в ее составе появилось 13 новых индивидуальных энзимтипов, генетическая дистанция между ними увеличилась до 0,13 Следовательно, в данной группе уже в 1996 г зарегистрирована тенденция к диссоциации штаммов по различным энзимтипам и уменьшения степени генетическою родства между ними

Таким образом, с помощью энзимтипирования установлено клональное распространение штаммов риботипов '8апк1-Ре1егЬи^/Коь5уа', что определило их повсеместную циркуляцию и является доказательством происхождения из единого источника

Уровень токсинообразования (УТ), определяемый в РИГА, у штаммов возбудителя дифтерии, циркулирующих в 80-е и 90-е годы, был высоким (рис 8) Вместе с тем, зарегисфированы различия в показателях УТ шиммоп этиу двух периодов В период спорадической заболеваемости в середине 80-х годов среднестатистические показатели УТ равны 43,0 - 44,0 Однако к 1987 г УТ снизился до 27,0 (разница статистически достоверна) В последующие два года, несмотря на снижение показателей заболеваемости дифтериеи, наблюдалось увеличение показателей УТ до 45,0 и 53,3 соответственно Это свидетельствовало о начале перестройки популяции возбудителя дифтерии с

селекцией выеокотоксигенных штаммов. В период эпидемического подъема при доминировании штаммов биопаров gravis риботгтон 'Sanki-Peterburg/Rossija', ЭТ комплекса 8 показатели УТ достигли высоких значений -56,9 — 59,0. Во время снижения уровня заболеваемости дифтерией высокие показатели УТ сохранились, ко на несколько более низком уровне, чш в период эпидемического подъема (разница статистически не достоверна).

100%

90% ■• (

80% -

а

1-70%

Л

* 60% v)

50% • -3 ¿0% -5 30% £

20% 10% 0%

65i3% 64,1 %

■ «13%

53.0%

Л','

>8.

В),?

5,5'

80,0% 80.6% 77,2%'".™

га

150 130

n s

110 5

90 a.

70 g

50 s

-22 £

30 «

ijs-l л

T 10 •10

# & £ # & ^ £ ^ ^ ^ ¿p # / #

■■улслышн нее бш тара gravis ' i удельный вес биоиара mil is —i—Показатели уровня токсинообразования - - • Показатели заболеваемости дифтерией на 100000 населенна

Рис. 8. Показатели заболеваемости дифтерией, удельный вес биоваров gravis и mitis и уровень токсинообразования штаммов С. diphtherial, распространенных на территории России (1984-2003 г,г,).

За способность продуцировать дифтерийный токсин отвечают определенные генетические структуры, прежде всего ген дифтерийного токсина (ген tox) и регуляторный геи dtxR.

Ген tox, находящийся в составе профага, определяет способность клетки-хозяина продуцировать дифтерийный токсин. Однако экспрессия структурного гена tox не регулируется фаговыми генами, необходимыми только для размножения фага или лизогении. Продукция токсина находится под контролем

хромосомального регуляторного гена dtxR, ответственного за синтез регуляторного железозависимого белка-репрессора DtxR В операторе гена tox имеется участок ДНК, с которым взаимодействует белок-репрессор, препятствуя считыванию /ох-мРНК и, следовательно, продукции дифтерийного токсина При дефиците железа белок-репрессор инактивируется и начинается синтез токсина (Holmes R , 2000)

Структуру генов tox и dtxR у циркулирующих штаммов изучали с помощью секвенировапия при сравнении с нуклеотидной последовательностью данных генов у российского производственного вакцинного штамма PW 8 Несоответствия нуклеотидов у изучаемых штаммов со штаммом PW 8 определяли как «мутации»

При изучении 48 токсигенных штаммов обнаружено, что большинство из них (60,9 %) отличались по структуре гена tox от вакцинного штамма PW 8 Зарегистрировано 7 точковых мутаций (табл 5) Мутации встречались в различных сочетаниях, на основании которых установлено десять аллельных вариантов гена tox Показана определенная кореляция между принадлежностью к аллсльному варианту и эпидемической клональнои группе (штаммам биовара gravis, риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija', ЭТ комплекса 8) 1ак, среди зарегистрированных десяти аллельных вариантов два варианта - III, IV близкородственны и состояли преимущественно из штаммов эпидемической клоналыюй группы (65,7 %) Аллельный вариант III (39,1 %) полностью идентичен гену tox штамма PW 8 Штаммы риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija', выделенные в период снижения уровня заболеваемости дифтерией, принадлежали к аллельному варианту VII, который отличался от варианта IV наличием одной мутации в положении 1704 Для штаммов других риботипов и энзимтипов корреляции с аллельными вариантами не наблюдалось

Большинство мутационных изменений в гене tox не приводили к изменению структуры белка - дифтерийного токсина, что подтверждает мнение исследователей о консервативности гена tox (Гараев М М и соавт, 1990, Blanke

S , et al, 1994, Weiss M , et al, 1995, Nakao H , et al, 1997) Следовательно, структура дифтерийного токсина, продуцируемого большинством современных штаммов, соответствует структуре анатоксина, получаемого из вакцинного штамма PW 8

Таблица 5

Особенности структуры гена дифтерийного токсина (tox) цпаммов С diphtheriae _____

Аллель-ный пари-ант Количество штаммов в аллельном варианте Положение нуклеотида в нуклеотидной пос ледовагельности гена lor

Промотор Фрагмент А Фрагмент В 3' некодир область

-58 415 1083 1233 1252 1590 1704

Корииефчги 1 ß" С G G G G С

III со2' С I G G G G 1

Контрольные штаммы С dip/it hei tae III 1 (PW 8, Россия) С Т G G G G т

Vil 1 (NCTC 131293' * * А * *

X 1 (665) * * А * * * с

«Дикие» штаммы С diphtheriae I 1 * * * * * * с

II 1 * * * * А с

III 18 * * * * * * *

IV 16 * * * А * * *

V 3 * * А * А с

VI 1 * С * * * * *

VII 2 * * * А н- * с

VIII 2 * * * А С» * с

IX 1 т * А * * * с

Всего штаммов 48

Примечания * - нуклеошды, идешичные нуктеотидам гена tox вакцинного штамма PW8, 1 - замена нуклеотида, которая приводит к замене аминокислоты, III, IV - аллелышс варианты, включающие преимущественно (65,7 %) штаммы С diphthenae эпидемической клональной группы, — Greenfiki и соавт , 1983, GenBank assession number КО 1722, 21 - Ratli и соавт, 1983, GenBank assession number V01 1536, 3> - Cerreno-Tarraga и соавт, 2003, GenBank assession number BX248353

Исключение составили два штамма биовара mitii риботипа 'Otchakov', выделенных в г Санкт-Петербург во время вспышки дифтерии в 2002 г В гене tox этих штаммов обнаружена точковая мутация в положении 1252 (замена нуклеотида G на С) (рис 9) Такая перестановка соответствовала замене

глицина на аргинин в аминокислотной последовательности дифтерийного токсина положении 393 (039311) (рис, 10}. Замена локализована во фрагменте В домена Я дифтерийного токсина, содержащем основные антигенные детерминанты, к которым вырабатываются антитоксические антитела.

1252

положение иуклеотида

1 76

665

1680

ФрЛЛ1СН1 Л

' /ос п.«.

Фра! мбнт В гена Лп I «1(1 и.а.

Рис, 9. Схематическое изображение Локализации мутации в положении 1252 гена/от штаммов С. с\iphiheriae 31-02 и 33-02 риботипа '01сЬакоу\

639311

Пилажснис

аминокислотного I остатка

1Яб

336

-а ,-1 1

Фрагмент А Фрагмент В

Доыен С Домен Т . Домен К

Рис. 10. Схематическое изображение аминокислотной замены (1393К в структуре дифтерийного токсина.

Глицин - простейшая в химическом отношении аминокислота с отчетливо выраженной низкой полярностью (-2,4), в то время как аргинин представляет одну из наиболее химически сложных аминокислот. 1лго молекула является сильноосиовной, полярной, несущей высокий положительный заряд (+20), Отличительная особенность аргинина заключается в высокой способности к молекулярным взаимодействиям. Таким образом, произошла замена гидрофобной аминокислоты на гидрофильную. Именно такие контрастные

замены, изменяя конформацию белковых молекул, влияют на функциональное состояние белков (Алтухов Ю П , 2003)

Результаты показали, что гену дифтерийного токсина свойственна генетическая изменчивость, приводящая к изменениям на аминокислотном уровне Поэтому продолжение исследований по контролированию соответствия структуры гена tox у вакцинного штамма PW 8 и циркулирующих штаммов остается актуальным, г к возможное изменение биологических свойств дифтерийного токсина может оказаться причиной заболевания дифтерией правильно привитых людей

Экспрессией гена tox руководит ген dtxR У большинства штаммов (73, 1 %) выявлен высокий уровень полиморфизма гена dtxR - зарегистрировано 16 точковых мутаций (табл 6) По совокупности мутаций определено десять аллельных вариантов Штаммы эпидемической клональной группы (ЭТ комплекса 8, риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossya' представляли 4 родственных алельных варианта по гену dtxR - 1, 2, 3, 4 Штаммы риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija', выделенные в период снижения заболеваемости дифтерией принадлежали к аллельным вариантам 5 и 6, близким по структуре к вариантам 1, 2, 3, 4 У штаммов эпидемической клональной группы выявлены мутации, приводящие к заменам аминокислот в регуляторном белке DtxR замена С на А в положении 640, приводящая к замене лейцина на изолейцин в положении 214 (L214I) и замена С на Т в положении 440, приводящая к замене аланина на валин в положении 147 (A147V) Первая мутация зарегистрирована только у четырех штаммов Вторая мутация характерна для всех без исключения штаммов эпидемической клональной группы В период снижения заболеваемости дифтерией мутация A147V сохранилась у штаммов риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija' Так, она была зарегистрирована у штамма, выделенного в 2002 году в г Смоленске и у 20 штаммов, выделенных в 2003 году в г Омске

Особенности структуры гена dtxR штаммов С diphtheriae

1 Штаммы j С diphtheriae Аллечьный вариант Количество штаммов Почожение нуклеотидов в посчедовательности гена dtxR

со -21 66 225 273 440 474 504 507 516 558 564 579 639 640 654

\ Контрольные штаммы 8 1 (PW8, Россия) С С А Т С С С Т С Т С Т С С С Т

5 1 (NCTC 131291 * * I* * * т т А Г С т А т 1 А' С

10 1 (665) т т * с т * * * * * * * * А * *

«Дикие» штаммы 1 15 * * * * * Т' * А т С * * * * *

2 1 * * * * * Т! * А т с т А т Т А1 С

3 6 н- * * * т Т' * А т с * * * + * *

4 1 * * * * т Т' * А т с т А т т А' с

6 1 * * * с * Т' * А т с т А т т А' с

7 14 * * * * * * * * * * * * * *■ * *

8 2 * * * * т * * * * * * * * * * *

9 1 * * * * т * * * * * * * * А *

10 9 т т * с т * * * * * * * * А * *

Bcei о штаммов 53

*- нукчеотиды, идетичлые нуклеотидам гена dtxR штамма PW 8, мутации, которые приводят к замене аминокислот, 1, 2, 3, 4 - алчельные варианты, включающие штаммы С diphtheriae эпидемической клональной группы, 5,6- алчельные варианты штаммов С diphtheriae риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija', вылеченных в период снижения уровня заболеваемости дифтерией, ' — Cerdeno-Tarraga и соавт, 2003, GenBank accession number ВХ248353

А147

L214I

«МОСТИК» ИЗ 23 И МНII OK IIС Л 01

Рис. 11. Локализация аминокислотных замен в структуре регуляторного белка DtxR.

вспомогательный сайтсвязывания иона штнлла

-л

«мост и к», С-теринпальныЙ 0о[атый

доме" пролимом

ULIEHUEHJH

Сайт

спи зыианнн

ними

металла

apo-N-

термНВальн 1,111

Д0МС11

apo-N-

термниальный дом си

Стадия 1

apo-DlxR <> apo-DtxR

(открытия форма) (закрытая форма)

Стадия 2

apo-DtxR + Fe2' < > apo-DtxR

Стадия 3

apo-DtxR (Fe) + FeJ+< >apo-DtxR(Fe)(Fe)

Рис. 12. Предполагаемая трех-стадийная модель активации белка apo-DtxR с помощью ионов металла (Love J. et, al, 2004). apo-DtxR - неактивная форма белка DtxR.

На рисунке 11 показана локализация мутаций в структуре регуляторного белка DtxR Мутация A147V расположена в области богатого пролином «мостика», связывающего N- и С- терминальные домены Более того, в положении 147 находится последняя, 23-я аминокислота этого мостика, примыкающая непосредственно к С-терминалыюму домену Данная структура («мостик») участвует в связывании С- и N- терминальных доменов друг с другом при активации белка DtxR с помощью ионов железа (рис 12)

Учитывая более низкую подвижность валина по сравнению с аланином, можно предположить недосышчно эффективное связывание С- и N-терминальных доменов у мутантного белка DtxR штаммов эпидемической клональной группы Следствием мутации могло явиться снижение активности белка DtxR, что и привело к повышению продукции токсина В экспериментах по химическому мутагенезу гена dtxR R Holmes и соавторы (1994) показали, что мутация A147V способна нарушать функцию белка DtxR и приводить к повышенной экспрессии гена tox

Таким образом, в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией преимущественно были распространены штаммы, принадлежащие к риботипам 'Sankt-Peterburg/Rossija', энзимтипам комплекса 8, аллельным вариантам по гену tox - III и IV и аллельным вариантам по гену dtxR - 1, 2, 3, 4 Отличительной особенностью данной группы явилось наличие мутации в гене dtxR в положении 440 (замена нуклеотида С на Т), приводящей к изменению структуры белка DtxR (замена аланина на валин в положении 147) и повышенному уровню продукции дифтерииного токсина

Филогенетическая связь между токсигенными, нсюксигепными и нетоксигснными, несущими неэкспрессирующийся, «молчащий» геи днфтернйного токсина штаммами С. diphtheriae

Вид С diphthci ше включает не только токсигенные микроорганизмы, но и нетокешенные, которые не вызывают дифтерию Учитывая способность нетоксигеиных штаммов к приобретению гена tox посредством фаговой

конверсии, а также возможность рекомбинации неконвертирующих фагов с дефектными генами 1ох с образованием функционального гена 1ох, проведен сравнительный анализ циркуляции и биологических свойств токсигенных и нетоксигенных С ^рЫкепае

— —Показатель выделяемое™

нетоксигенных штаммов С сЬрЫЬепае на 1000 обследованн ых ли ц 0 Показатель выделяемости токсигенных шыммов С с^рМЬспаена 1000 обследованных лиц

- - - Показатель заболеваемости

дифтерией на 100 000 населения

Рис 13 Распространение токсигенных и нетоксигенных штаммов С с1.грШкепае на территории России (1993 - 2003 г г )

Изучение распространения С рЬЛспае проводили на 65 территориях семи Федеральных округов России По каждой территории построены графики, отражающие особенности изменения ПВ токсигенных и нетоксигенных С скрЬЛепае в динамике эпидпроцесса Поскольку графики имели сходный характер, то были высчитаны средние ПВ токсигенных и нетоксигенных С (ЬрЫкепае, циркулирующих на всей территории России (рис 13)

Полученные данные свидетельствуют о более интенсивной циркуляции нетоксигенных С ¿1рЫкепае по сравнению с токсигенными Однако динамика распространения как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов соответствовала динамике показателей заболеваемости дифтерией

■3| о у 0.5| О 46 0

1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

При анализе удельного веса биоваров нетоксигенных штаммов выявлена противоположная тенденция, а именно, доминирование биовара mitis нетоксигенных штаммов при доминировании биовара gravis среди токсигенных штаммов Таким образом, среди нетоксигенных преобладает биовар, который будет доминировать в следующем эпидемическом цикле среди токсигенных штаммов

У нетоксигенных штаммов обнаружен ген dtxR Показано, что аллельные варианты 7 и 10 по гену dtxR включали как токсигенные, так и нетоксигенные ниаммы Полученные результаты подтвердили наличие на хромосоме нетоксигенных С diphtheriae системы негативной регуляции экспрессии гена tox, при отсутствии последнего у нетоксигенных С diphtheriae

Генетическая структура нетоксигенных штаммов С diphtheriae гегерогенна Зарегистрировано 20 риботипов*, доминирования каких либо риботипов не выявлено Вместе с тем, некоторые риботипы все же отличались от других по удельному весу 'Sankt-Peteburg/Rossija' - 14,8 %, 'Cluj' - 16,3 %, 'Londmium' - 12,3 %, 'Moskva' - 23,6 %, 'Iasi' - 7,4 %, 'Otchakov' - 5,4 % Остальные 14 риботипов включали не более 7 штаммов (1,0 % -3,5 %)

Среди нетоксигенных С diphtheriae с помощью метода Г1ЦР обнаружено

16.8 % нетоксигенных токснесущих штаммов (НТТН-штаммов), имеющих в геноме неэкспрессирующийся («молчащий») ген дифтерийного токсина Все НТТН-штаммы принадлежали к биовару mitis, среди которого они составляли

23.9 % Распространены НТТН-штаммы практически повсеместно (Москва, Санкт-Петербург, Калининград, Смоленск, Пенза, Астрахань, Красноярск, Челябинск, Анадырь)

Учитывая высокий удельный вес и широкое распространение НТТН-ипаммов, изучена их С1р>ктура по риботипам Выявлено 11 риботипов, которые распределены неравномерно по годам наблюдения В начальный

* Автор бла!одарит л м н О В Нарвскую за совместную работу по риботипировапию нетоксигенных С diphtheriae, выделенных на территории России в 2001-2003 г г

период снижения заболеваемости после эпидемического подъема 90-х годов выделялись преимущественно гомогенные по генетической структуре НТТН-штаммы, принадлежащие, к риботипу 'Moskva1 (91,8 %) и к трем другим близкородственным риботипам - NTTB 1, NTTB2, NTTB 3 (8,2 %) При дальнейшем снижении уровня заболеваемости их структура стала гетерогенной ('Otchakov', 'Moskva', 'Cluj', 'Dagestan', 'Londmium', 'Schwarzenberg', 'Iasi') Доминирования какого-либо риботипа не наблюдали, однако по распространенности и удельному весу выделялись риботипы 'Iasi' (33,3 %) и 'Cluj' (16,7%)

Совместно с В Г Мельниковым, О Ю Борисовой, Н В Воложанцевым, И К Мазуровой, Г Popovic и другими установлено два механизма блокирования гена tox у НТТН-штаммов Обнаружена делеция в гене tox одного из нуклеотидов G в положении 52-55 Последняя приводит к сдвигу открытой рамки считывания и образованию стоп-кодона в положении 112 Вместо «полноценной» молекулы ДТ, которая состоит из 560 аминокислотных остатков, продуктом гена tox является пептид, состоящий из 37 аминокислот Второй механизм связан с наличием в составе гена tox инсерционно! о элемента (IS элемента) Первый механизм характерен для НТТН-штаммов риботипа 'Moskva', второй - для НТТН - штаммов риботипа 'Otchakov', 'Versailes', 'Cluj'

Как следует из данных риботипирования токсигенных и нетоксигенных С diphtheriae (табл 7), из 31 зарегистрированного риботипа, 12 риботипов (38,7 %) включали как гоксигенные, так и нетоксигенные штаммы Иными словами, между токсигенными и нетоксигенными С diphtheriae существует филогенетическая связь Особо обращает внимание принадлежность некоторых нетоксигенных штаммов к риботипам 'Sankt-Pterburg/Rossya', доминирующих среди токсигенных штаммов, а также наличие нетоксигенных штаммов в риботипе 'Otchakov', доминирующего среди токсигенных штаммов биовара mitis Из 12 риботипов, объединяющих токсигенные и нетоксигенные штаммы,

5 риботипов включали в том числе и НТТН-штаммы ('Otchakov', 'Cluj', 'Dagestan', 'Londimum', 'Shchwarzenberg')

Таблица 7

Филогенетическая связь между представителями вида С diphtheriae, различающихся по признаку токсигенности

PhSothh Pei истрация риботипов среди штаммов С diphtheriae

среди токсигенных среди нетоксигенных

«истинно» нетоксигенных нетоксигенных токснесущих

1 'Sankt-Peterburg'(0 1) + +

2 'Rossija' (G 4) + +

3 'Buzau' (G 3) + +

4 'Vladimir (G4v) + +

5 'Otchakov'(M 1,M lv) + + +

6 'var Preston' (M 7) + +

7 'Atlanta' (M 8) + +

8 'Schwarzenberg' + + +

9 'Cluj' (M 13) + + +

10 'Londinium' ь + +

11 'Dagestan' + + +

12 M 14 + +

13 'Lyon' (Mil) +

14 'Kaliningrad' (M 2) +

15 'Vladimir 711' (M 3) +

16 'Colindale' (M 4) +

17 'Vladimir 713' (M 5) +

18 Washington' (M 6) +

19 'Mogilev' (M 9) +

20 'Pakistan' +

21 'Ras-el-Ma +

22 'Vrancea' +

23 M 15 +

24 'Atlanta 767' (M 12) +

25 'Moskva' + +

26 'Iasi' + +

27 'Versailes' + +

28 'Burinum' +

29 NTTB 1 var Ras-el-Ma' + +

30 NTTB2 +

31 NITB 3 + +

Изучено географическое распространение штаммов, имеющих филогенетическое родство, т е объединенных одним риботипом, но различающимся по признаку токсигенности (табл 8) В ряде регионов (Москва, Санкт-Петербург, Калининград, Владимир, Пенза, Красноярский край) зарегистрирована одновременная циркуляция одноименных риботипов токсигснных и нстоксигснных С скрЫкепае

Таблица 8

Циркуляция токсигенных и нетоксигенных штаммов С скркМепие одноименных риботипов на территории России

Регион Год регистрации Риботипы токсигенных и нетоксигенных С diphthenae

Москва 1997, 2001 -2002 'Rossija', 'Otchakov', 'Londinium', 'M14'var Dagestan

Санкт-Петербург 2002 - 2003 ' Sankt-Peterburg/Rossija', 'Londinium', 'Cluj'

Владимир 1988,2002 1990 1992 2001-2002 'Cluj' 'Otchakov' 'Vladimir' 'Sankt-Peterburg/Rossija', 'Londinium', 'Schwarzenberg'

Калининград 1997, 2000, 2001-2002 'Rossija'

Пенза 1988 - 1989 2001-2003 'Cluj' 'Rossija'

Красноярский край 2002 'Rossija'

В 2001 - 2003 г г отмечена циркуляция одноименных риботипов нетоксигенных и НТТН в Москве ('lasi', 'Cluj', 'Londinium', 'Dagestan'), Санкт-Петербурге ('Versailes'), Калининграде ('Cluj'), Пензе ('Cluj'), Красноярске ('Moskva') Во Владимирской области зарегистрированы НТТН - штаммы и токсигенные штаммы риботипа Londinium

Риботип 'ЬопсЬпшт', включающий токсигенные, нетоксигенные и НТТН-штаммы не регистрировали до 2001 г Однако в 2001 - 2003 г г среди токсигенных штаммов недоминирующих риботипов его удельный вес был самым высоким (10, 3 %) Циркуляция данного риботипа отмечена на значительной части территории России - в Центральном и Северо-Западном Федеральных округах Несомненно, штаммы риботипа 'Ьопсйпшт' представляют интерес как возможный резервуар формирования новых доминирующих штаммов возбудителя дифтерии, т к с помощью экспериментов по фаговой конверсии продемонстрирована способность штаммов риботипа 'ЬопсЬпшт' приобретать ген Юх и продуцировать дифтерийный токсин Ковертанты стабильно продуцировали токсин в течение срока наблюдения — 6 месяцев

Установленные особенности распространения токсигенных и нетоксигенных штаммов, филогенетическая связь между токсигенными, нетоксигенными и НТТН-штаммами, способность современных нетоксигенных штаммов приобретать признак токсигенности свидетельствуют о наличии взаимодействия между токсигенными и нетоксш енными С ЛрШкепае в процессе их циркуляции и участии последних при формировании популяции возбудителя дифтерии

Выводы

1 Разработана система микробиологического и молекулярио-генетического мониторинга возбудителя дифтерии, которая предусматривает применение как классических микробиологических и иммунохимических методов исследования (идентификация С ЖрЫкегше с определением токсигенных свойств и биовара), так и молекулярно-генетических методов изучения особенностей генома С скрЫке) ше и отдельных генов, ответственных за синтез основного факюра патогенности возбудителя дифтерии - дифтерийного токсина (риботипирование, энзимтипирование, полимеразная цепная реакция,

секвенирование ДНК) Высокая информативность и дифференцирующая способность данных методов позволила наблюдать за структурой популяции С diphtheriae в динамике эпидемического процесса

2 Проведено типирование С diphtheriae, выделенных в различных регионах России С помощью энзимтипирования, основанного на выявлении метаболических энзимов, структура которых четко корелирует с генотипом штамма и риботипирования, выявляющего особенности генов рРНК, зарегистрировано 89 энзимтипов и 31 риботип (23 риботипа среди токсигенных, штаммов и 20 риботипов среди нетоксигенных штаммов) Выявлены риботипы высокого удельного веса по количеству входящих в их состав штаммов -'Sankt-Peterburg/Rossija' (72,3 %) среди штаммов биовара gravis и 'Otchakov' среди штаммов биовара mitis (15,1 %)

3 Разработан метод генотипирования С diphtheriae - полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для ускоренной идентификации штаммов риботипов высокого удельного веса 'Sankt-Peterburg/Rossija'

4 Показано, что популяция возбудителя дифтерии гетерогенна по фенотипическим и генотипическим характеристикам - биоварам, токсигенным свойствам, риботипам, энзимтипам, структуре генов tox и dtxR, ответственных за токсинообразование, что определяет ее адаптацию к меняющимся условиям существования и способствует сохранению вида

5 Установлено, что в период, предшествующий высокому уровню заболеваемости дифтерией, происходит перестройка гетерогенной популяции, при этом постепенно увеличивается удельный вес определенного биовара и риботипа В 40-70 годы XX века преимущественное распространение имели штаммы биовара giavi<s риботипа 'Lyon' (84,6 %), в 80-е годы спорадической заболеваемости на фоне преобладания биовара ñutís (до 83,1 %) популяция была гетерогенна по риботипам (всего 8 риботипов), однако по удельному весу выделялись рибошгш 'Otchakov' (29,4 %) и 'Sankt-Peterburg/Rossija' (23,5 %), в

90-е годы преобладали штаммы высокого уровня токсинообразования биовара gravis риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossya' (до 96,1 %)

6 Установлена принадлежность большинства штаммов риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija' (95,1 %) к клональной группе энзимтипов комплекса 8 Показано, что штаммы данной группы характеризовались аллельными вариантами III, IV по гену tox и аллельными вариантами 1, 2, 3, 4 по гену dtxR Отличительной особенностью структуры гена dtxR штаммов эпидемической группы явилось наличие мутации в положении 440 (замена нуклеотида С на Т), соответствующей к замене аланина на валин в положении 147 аминокислотной последовательности регуляторного белка DtxR (A147V), что, вероятно, привело к повышенному уровню продукции дифтерийного токсина штаммами эпидемической клональной группы

7 Показано, что доминирование штаммов риботипов 'Sankt-Peteiburg/Rossya' продолжилось и при снижении интенсивности эпидемического процесса вследствие их повсеместного распространения на территории России Вместе с тем, начиная с 1997 г, в популяции отмечаются изменения, связанные с увеличением количества других риботипов (10 риботипов) и их удельного веса (до 27,9 %) Некоторые риботипы ('Londimum', 'Vrancea', 'Schwarzenberg', 'Pakistan', 'Ras-el-Ma') впервые зарегистрированы только во время снижения уровня заболеваемости диф!ерией

8 Впервые выявлена генетическая изменчивость гена tox, приводящая к изменениям на аминокислотном уровне У двух штаммов риботипа 'Otchakov' зарегистрирована мутация в положении 1252 (замена нуклеотида G на С), что соответствует замене глицина на аргинин в положении 393 аминокислотой последовательности дифтерийною токсина (G393R) Данная мутация локализована в области гена tox, кодирующей домен R фрагмента В дифтерийного токсина, ответственном за первичное взаимодействие дифтерийного токсина с чувствительной эукариотическои клеткой

9 Получены новые данные, расширяющие представления о виде С ЖрЫкепае - наряду с токсигенными и нетоксигенными штаммами в 16,8 % случаев встречаются штаммы, несущие неэкспрессирующийся, «молчащий» ген дифтерийного токсина Данные штаммы принадлежали к биовару тйьь, их генетическая структура гетерогенна (11 риботипов) Характер распространения токсигенных и нетоксигенных штаммов С ¿грЫНеггае, соответствующий динамике заболеваемости дифтерией, общность генетической структуры токсигенных, негоксигенных и негоксигенных токонесущих штаммов (генов рРНК, гена с1иК), способность современных нетоксигенных штаммов приобретать ген посредством фаговой конверсии указывают на участие последних в формировании популяции возбудителя дифтерии

Список работ, опубликованных по теме диссертации В журналах и сборниках научных трудов:

1 Мазурова И К , Комбарова С Ю , Мельников В Г Биологические свойства возбудителя дифтерийной инфекции, циркулирующего в настоящее время // Журн микробиол - 1996 - №6 - С 59-60

2 Мазурова И К , Комбарова С 10 , Михайлович В М , Мельников В Г , Ророую Т , ЕГвиаиои А , 2оуза А Молекулярно-биологические методы в диагностике и наблюдении за возбудителем дифтерийной инфекции // Проблемы эпидемиологии, микробиологии и клиники капельных и кишечных инфекций Сборн научн трудов Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им ГН Габричевского/под ред НТ Тихоновой - Москва, 1996 - Часть 1 - С 76-79

3 Мельников В Г , Мазурова И К , Комбарова С Ю , Скороходова Т Г Актуальные вопросы лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых коринебактсриями // Бюллетень лабораторной службы Информ изд Красноярской краевой Ассоциации медицинской лабораторной диагностики -1996 -Вып 2-С 10-20

4 Popovic T , Kombarova S , Reeves M W , Mazurova IК , Nakao H , Wharton M , Wachsmuth I К , Wenger I D Molecular epidemiology of diphtheria in Russia, 1985-1994//J Infect Dis - 1996 -V 174 -P 1064-1072

5 Мельников В Г , Мазурова И К , Платонова Т В , Комбарова С Ю , Феоктистова Г H, Звонарева С В , Кузнецова M В , Борисова О Ю , Пожалостина Л В , Лиханская Е И Микрофлора ротоглотки у дифтерийных бактерионосителей до и после анибиотикотерапии // Вакцинопрофилактике -200 лет Сборн научн трудов Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им Г H Габричевского / под ред H Т Тихоновой - Москва, 1997 - С 32-35

6 Комбарова С Ю , Мельников В Г , Борисова О Ю , Popovic Т , Мазурова И К Характеристика штаммов С diphtheriae, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции// Там же - С 27-32

7 Мазурова И К , Борисова О Ю , Комбарова С Ю , Мельников В Г, Герасимова С В , Андрусенко Е Э , Цепляева Э Д , Калугина Л П Некоторые особенности циркуляции биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов С diphtheriae // Проблемы инфекционных болезней Часть 1 Сборн научи трудов Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им Г H Габричевского /под ред В А Алешкина- Москва, 2000 -С 52-55

8 Комбарова С Ю , Мельников В Г , Борисова О Ю , Костюкова H H , Мазурова И К Риботипирование штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России // Там же - С 42-47

9 Комбарова С Ю , Мельников В Г , Борисова О Ю , Платонова Т В , Соков Б H , Смердов Г II, Ушакова H С , Степанова H И , Бугаев Е А , Мазурова И К Усовершенствование методики постановки полимерзной цепной реакции для выявления гена дифтерийного токсина // Там же- С 47-52

10 Платонова ТВ, Мазурова ИК, Комбарова СЮ, Мельников В Г Биологические свойства С diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у

непривитых детей в условиях различной интенсивности эпидемического процесса // Там же - С 55-59

11 Мазурова И К , Борисова О Ю , Мельников В Г , Комбарова С Ю , Платонова Т В, Андрусенко Е Э, Эфстратиоу А, Энглер К Антибиотикорезистентность штаммов Corynebactermm diphtheriae - новая проблема инфекционной патологии // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия - 2000 - Т 2 - Приложение 1 — С 27-28

12 Комбарова СЮ, Мазурова ПК, Мельников ВГ, Костюкова НН, Волковой КИ, Борисова 010, Платонова ТВ, Efstiatiou А Генетическая структура штаммов Corynebactermm diphtheriae, выделенных в России при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии // Журн микробиол -2001 - №3 С 3-8

13 Kombarova S Yu , Kim Ch , Melmkov V G , Reeves M W , Bonsova О Yu , Mazurova IК , Popovic T Rapid identification of Corynebactermm diphtheriae clonal group associated with diphtheria epidemic, Russian Federation // Emerg Inf Dis -2001 -V 7 - № 1 -P 133-136

14 Kombarova S Yu , Melmkov V G , Borisova О Yu , Mazurova I К Ribotyping of Corynebactermm diphtheriae isolated in Russia, 1945-2002 // FEMS Microbiol Lett - 2003 -V 222 - Suppl 1 - P 497

15 Мельников В Г , Комбарова С Ю , Борисова О Ю , Воложанцев Н В , Веревкин В В , [Волковой К И, Мазурова И К Характеристика нетоксигенных штаммов Corynebactermm diphtheriae, несущих ген дифтерийного токсина // Журн микробиол - 2004 - № 1 - С 3-7

16 Мазурова И К , Борисова О Ю , Комбарова С Ю , Захарова Н С , Алешкин В А Молекулярно-гснетическая характеристика штаммов В pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции//Мол ген микробиол вирусол -2005 -№4 - С 21-25

В инструктивно-методических материалах, патенте на изобретение:

17 Мазурова ИК, Мельников В Г, Комбарова СТО Лабораторная

диагностика дифтерийной инфекции Руководство - М Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1995 - 76 с

18 Мазурова И К , Чайка Н А , Мельников В Г , Михайлович В М , Комбарова С Ю Дифтерия Руководство по лабораторной диагностике дифтерии (перевод на русский язык руководства ВОЗ) - 62 с

19 Мазурова И К , Мельников В Г, Комбарова С Ю , Борисова О Ю , Жилина НЯ Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции Методические указания МУ 4 2 698-98 -М Интэрсэн, 1998 -47 с

20 Мазурова И К , Комбарова С Ю , Мельников В Г , Борисова О Ю Характеристика СогупеЪааегтт скрЫкепае циркулирующих в России в период 1984-1998 г г (микробиологический мониторинг в системе опиднадзора за дифтерийной инфекцией) Пособие для врачей - Москва, Минздрав РФ, 3 декабря 1999 г , протокол № 4 - 20 с

21 Мазурова ИК, Комбарова СЮ, Мельников ВГ, Борисова ОЮ, Платонова ТВ , Бугаев НА Ускоренный метод лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерииной инфекции Методические рекомендации - Москва, Минздрав РФ, 26 апреля 2001 г , № 2001/56

22 Пат № 2209831 Россия, 7 С 12 0 1/68, в 01 N 33/48 Способ дифференциации СогупеЬа^епит скрЫкепае, содержащих функционально активный ген дифтерийного токсина от СогупеЬаМепит скрШкепае, содержащих функционально неактивный ген дифтерийного токсина / В Г Мельников, И К Мазурова, С Ю Комбарова, ГУ МНИИЭМ им Г Н Габричевскою - № 2001135409/14, Заявл 28 12 2001, опубл 10 08 2003 Бюл №22

23 Комбарова С Ю , Борисова О Ю , Мельников В Г , Зотина Г К , Лимещенко Е В , Кривопалова Н С , Нарвская О В , Мазурова О В Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами СогупеЪа^егшт ЛрЫкепае

Пособие для врачей - Москва, Минздрав РФ, 2 декабря 2004 г , протокол № 5 -34 с

В материалах всероссийских и международных конференций:

24 Mazurova I К , Kombarova S Yu , Mikhailovich V М , Platonova Т V

Laboratory diagnosis of diphtheria m Russia // Proceeding of the first international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, 21-22 April 1994 ed by A Efstratiou - London, 1994 -P 20

25 Мазурова И К , Мельников В Г, Комбарова С Ю , Михайлович В М, Осипова ТФ, Барашкова ЛИ, Жебруи А Б Лабораторная диагностика в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями Матер междунар конф, посвященной году Пастера, 6-10 июня 1995 г - Санкт-Петербург, 1995 - С 16

26 Wachsmuth I К , Reeves М W , Mazurova I К , Kombarova S Yu , Wengei J D , Wharton M , Popovic T Molecular characterization of Corynebactermm diphtheriae isolates from Russia // Proceeding of 95th General meeting of American society for microbiology - Washtngton D С , 1995 -P 197

27 Mazurova I К , Kombarova S Yu , Melmkov V G , Popovic T Monitoring of the diphtheria infection agent // Programme and abstracts book of the second international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, 21-24 June 1995 ed by A Efstratiou -Helsinki, 1995 -P

28 Mazurova I К , Kombarova S Yu , Melmkov V G , Bonsoba О Yu Modern methods of diphtheria laboratory diagnosis and supervision // Programme and abstracts book of the third international meeting of the European laboratory working group on diphtheria (ELWGD), 6-7 June 1996 ed by A Efstratiou -Pans, 1996 -P 13

29 Мазурова И К , Комбарова С Ю , Мельников В Г , Борисова О Ю Современные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 28-31 января 1997 г - Москва, 1997 - Т 1 - С 482-463

30 Мельников В Г , Комбарова С Ю , Борисова 010 , Мазурова И К Идентификация микроорганизмов рода Corynebactermm // Там же - С 468-469

31 Комбарова С 10 , Мельников В Г , Popovic Т , Reeves М W , Аржевитина К В , Цепляева Э Д , Мазурова И К Молекулярная характеристика штаммов Coiynebacterium diphtheriae // Там же - С 204 - 205

32 Mazurova I К , Melmkov V G , Platonova Т V , Korabaiova S Yu , Borisoba OYu, Kuznetsova MV Throat microflora in diphtheria carriers befoie and aftei antibiotic therapy // Programme and abstracts book of the fourth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, 25-27 June 1997 ed by A Efstratiou -Buharest, 1997 -P 28

33 Mazurova IК, Kombarova S Yu, Melmkov V G, Borisoba О Yu Characteristics of С diphthei lae strains circulating through different periods of the epidemic process of diphtheria infection m Russia // Ibidem — P 38-39

34 Борисова О 10 , Мельников В Г , Комбарова С Ю , Платонова Т В , Барашкова JIH, Осипова ТФ, Жебрун АБ, Мазурова И К Патшенные свойства штаммов С diphtheriae, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса дифтерии в России // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями Матер второй междунар конф, посвященной 75-летию Института им Пастера, 2-4 сентября 1998 г - Санкт-Петербург, 1998 - С 177

35 Мазурова И К , Комбарова С Ю , Борисова 010 , Мельников В Г , Платонова Т В Наблюдение за нетоксигенными штаммами С diphtheriae в период снижения заболеваемости дифтерией в России // Там же - С 186

36 Комбарова С 10 , Мельников В Г , Борисова О 10 , Popovic Т , Reeves М W , Мазурова И К Применение ПЦР с универсальными праймерами, риботипирования и мультилокусного энзимного электрофореза для анализа штаммов С diphtheriae, выделенных в России в 1995-1997 г г // Там же - С 184

37 Mazurova I К , Bonsova О Yu , Kombarova S Yu , Melmkov V G , Platonova T V , Reiss J A , Kim С , Popovic T Characterization of non-toxigenic tox-bearing

Corynebacterium diphtheriae in the waning Russian epidemic // Progiamme and abstracts book of the fifth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, 24-27 June 1998 ed by A Efstratiou - Halhidiki, 1998 - P 33

38 Popovic T , Reeves M W , Vitek С , Kombarova S Yu , Mazurova I К Evolution of the diphtheria epidemic clonal group in Russia//Ibidem -P 32

39 Мазурова И К , Платонова Т В , Комбарова С Ю , Мельников В Г , Борисова О Ю , Костюкова Н Н Молекулярно-биологические свойства С diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в периоды различной интенсивности эпидемического процесса // Инфекционные болезни на рубеже XXI века матер научн - практ конф, 24-26 мая 2000 г — Москва, 2000 -Часть 1 - С 75

40 Mazurova I К , Platonova Т V , Kombaorva S Yu , Melnikov V G , Borisova О Yu Diphtheria in Russia clinical and epidemiological features // Programme and abstracts book of the sixth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, 21-24 June 2000 ed by A Efstratiou - Brussels, 2000 -P 3334

41 Melnikov V G , Zoysa A , Mazurova I К , Kombarova S Yu , Borisova О Yu , Engler К, Efstratiou A Molecular screening for the "identification" of non-tangenic tox bearing strains of Corynebacterium diphtheriae from Russian Federation // Ibidem -P 61

42 Мазурова И К , Комбарова С Ю , Мельников В Г , Борисова О Ю , Нарвская О В , Костюкова Н Н , Платонова Т В , Волковой К И , Прохоров В А , Салова Н Я , Аидрусеико Е Э , Цепляева Э Д , Калугина JIП , Кривопалова II С Молекулярная эпидемиология дифтерии в России // Матер VIII Всерос съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - Москва, 2002 - Т 1 — С 6869

43 Borisova О Yu, Melnikov V G , Kombarova S Yu, Mazurova I К Antibiotic-resistant Corynebacterium diphtheria strains circulating in Russia // Programme and

abstracts book of the seventh international meeting of the European laboratoiy working group on diphtheria, 12-14 June 2002 ed by A Efstratiou — Vienna, 2002 -P 68-69

44 Mazurova I К , Melmkov V G , Kombarova S Yu , Borisova О Yu , Bugaev E A Laboratory diagnosis of diphtheria as a part of diphtheria surveillance in Russia // Ibidem -P 53

45 Melmkov V G , Kombarova S Yu , Borisova О Yu , Mazurova IК Etiological value of non-toxogem io.t-bearing (NTTB) Corynebacterium diphtheriae И Ibidem -P 80

46 Kombarova S Yu , Melmkov V G , Borisova О Yu , Platonova T V , Mazurova 1К Genotype characteristics of Corynebacterium diphtherias strains in a period of low diphtheria incidence in Russia 1997 to 2001 //Ibidem - P 79

47 Мазурова И К , Комбарова С 10 , Мельников В Г , Борисова О 10 , Пиери В С , Беренс Т Т Микробиологический мониторинг дифтерийной инфекции // Идеи Пас гера в борьбе с инфекциями Матер третьей междунар конф, посвященной 80-летию Института им Пастера, 4-5 сентября 2003 г - Санкт-Петербург, 2003 -С 31

48 Комбарова С 10 , Мельников В Г , Борисова О Ю , Мазурова И К Молекулярно-генетические методы в системе наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции // Генодиагностика инфекциоонных болезней Сборн трудов 5-ой Всерос научн -практ конф , 19-21 октября 2004 г / Под ред В И Покровского - Москва, 2004 -Т2 -С 291-292

49 Borisova О Yu , Kombarova S Yu , Berens T T , Narvskaya О V , Viazovaya A , Mazurova IK Phenotypic and genotypic chaiactenstics of toxigenic С diphtheriae stanns isolated m the Central Federal District ol Russia during 2002-2003 // Programme and abstracts book of the eighth international meeting of the European laboratory working gioup on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNBT), 16-18 June 2004 ed by A Efstratiou - Copenhagen, 2004 -P 45

50 Kombarova S Yu , Zotina R K, Bonsova О Yu , Narvskaya О V , Limeshenko E V , Mazurova I К Circulation of to.rogenic and non-toxigennic Corynebacterium diphtheriae in the period of decreasing morbidity of diphtheria in Russia // Ibidem -P 43

51 Kombarova S Yu , Bonsova О Yu , Melnikov V G , Mazurova I К Monitoring the genes responsible for Corynebacterium diphtheriae toxin production // Programme and abstracts book of the ninth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNET), 16-18 June 2004 ed by A Efstratiou - Voliagmeni, Gieece, 2006 -P 65

52 Bonsova О Yu , Kombarova S Yu , Volozhantsev N V , Mazurova IК Investigation of the amylase gene structure of Corynebacterium diphtheriae И Ibidem - P 67

53 Мазурова И К , Борисова О 10 , Комбарова С 10., Петрова М С , Грачева Н М , Герасимова А Г , Ллешкин В А , Савинкова В С , Скачкова В Г , Захарова Н С , Мерцалова Н У, Шинкарев А С , Семенов Б Ф Особенности генетической структуры производственных штаммов для АКДС-вакцины и циркулирующих в настоящее время штаммов возбудителей коклюша и дифтерии // Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней Матер Всерос научн -практ конф , 21-22 ноября 2006 г - Москва, 2006 - С 60-61

Список сокращений

МЛРГДВОЗ - Международная лабораторная рабочая группа по дифтерии

под эгидой Всемирной ор| анизации здравоохранения

мээ мультилокусный энзимный электофорез

(энзимтипирование)

пв показатели выделяемое! и С сЬрЫкепае

пз показатели заболеваемости дифтерией на 100 тыс

населения

нттн- нетоксигенные токснесущие штаммы

штаммы

ПЦР полимеразная цепная реакция

РИГА реакция непрямой гемагглютинации

рРНК рибосомальная рибонуклеиновая кислои

УП-ПЦР полимеразная цепная реакция с универсальными

праймерами

УТ уровень токсинообоазования штаммов возбудителя

дифтерии

эт энзимтипы комплекса 6

комплекса 6

ЭТ энзимтипы комплекса 8

комплекса 8

сИхИ. регуляторный ген, кодирующий железо-зависимый белок-

репрессор

ЕИх11 белок-репрессор, кодируемый геном ЛхЯ

1ох ген дифтерийного токсина

Отпечатано в копицентрс «СТ ПРИН Г» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stprint ru e-mail 7akaz@stprmt ru тел 939-33-38 Тираж 150 экз Подписано в печать 13 04 2007 г

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Комбарова, Светлана Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Биология возбудителя дифтерии.

1.1. Микробиологическая характеристика возбудителя дифтерии и принципы лабораторной диагностики.

1.2. Дифтерийный токсин - основной фактор патогенности возбудителя дифтерии.

1.2.1. Структура и функции дифтерийного токсина.

1.2.2. Генетика токсиногенеза С. ИрЫкепае.

1.2.3. Регуляция экспрессии гена дифтерийного токсина.

Глава II. Основы микробиологического мониторинга возбудителей инфекционных заболеваний.

2.1. Фенотипические методы наблюдения за С. сИрЫкепае.

2.2. Молекулярно-генетические методы мониторинга возбудителя дифтерии и других инфекционных заболеваний.

2.2.1. Маркеры, используемые при разработке методов молекулярной диагностики и типирования.

2.2.2. Полимеразная цепная реакция как инструмент исследования генов микроорганизмов.

2.2.3. Секвенирование ДНК.

2.2.4. Рестрикционный анализ хромосомной ДНК и блот-гибридизация нуклеиновых кислот.

2.2.5. Мультилокусный энзимный электрофорез (энзимтипирование).

2.2.6. Методы типирования, основанные на технологии полимеразной цепной реакции.

СОБСТВЕННЫ ЕИССЛЕДОВАНИ Я.

Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Штаммы бактерий.

3.2. Идентификация культур С. diphtheriae.

3.3. Наблюдения по распространению С. diphtheriae на территории России

3.4. Реакция непрямой гемагглютинации.

3.5. Полимеразная цепная реакция.

3.6. ПЦР с универсальными праймерами.

3.7. Риботипирование.

3.8. Мультилокусный энзимный электрофорез.

3.9. Секвенирование генов tox и cfcti?.

3.10. Фаговая конверсия.

3.11. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава IV. Особенности циркуляции возбудителя дифтерии на территории России.

4.1. Риботипы С. diphtheriae, зарегистрированные в России.

4.2. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами как ускоренный метод наблюдения за генетической структурой популяции С. diphtheriae.

4.3. Структура популяции возбудителя дифтерии в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции.

4.3.1. Периодичность эпидемического процесса дифтерийной инфекции.

4.3.2. Распространение биоваров токсигенных С. diphtheriae.

4.3.3. Генетическая структура штаммов возбудителя дифтерии, выделенных в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции.

4.3.4. Клональный состав популяции С. diphtheriae.

Глава V. Патогенные свойства штаммов С. diphtheriae.

5.1. Уровень токсинообразования штаммов возбудителя дифтерии, распространенных в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции.

5.2. Изучение нуклеотидной последовательности генов tox и dtxR.

5.2.1. Структура гена tox.

5.2.2. Структура гена dtxR.

Глава VI. Генетическая структура нетоксигенных С. diphtheriae.

6.1. Распространение токсигенных и нетоксигенных С. diphtheriae на территории России.

6.2. Риботипы нетоксигенных С. diphtheriae, зарегистрированные в России

6.3. Эксперимент по лизогенной конверсии нетоксигенных С. diphtheriae в токсигенные in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции"

Актуальность проблемы

Внедрение в 50-60-е годы XX века в практику здравоохранения России массовой иммунизации детей дифтерийным анатоксином привело к значительному снижению заболеваемости дифтерией. Однако периодичность в развитии эпидемического процесса, характерная для этой инфекции, сохранилась. Как и в допрививочный период, основные причины подъемов остаются неизменными: накопление неиммунных, отсутствие антиколонизационной резистентности к инфицированию возбудителем дифтерии, ухудшение социальных условий жизни людей [28, 45, 48, 50, 52, 57, 77].

В 90-е годы распространение дифтерийной инфекции в России приобрело характер эпидемии с пиком в 1994 г., когда показатель заболеваемости на 100 тыс. населения (ПЗ) составил 26,9. Благодаря массовой кампании по иммунизации детей и взрослых, контролированию состояния антитоксического иммунитета населения, качества клинической и лабораторной диагностики, а также совершенствованию методов лечения дифтерии произошло снижение уровня заболеваемости этой инфекции. К 2003-2004 г.г. ПЗ снизились до 0,48-0,35 соответственно, к 2005-2006 г.г. - до 0,35-0,12 соответственно. Вместе с тем, среди непривитых, по-прежнему, регистрируются тяжелые формы заболевания и летальные исходы, что указывает на скрытое протекание эпидемического процесса, проявляющегося, главным образом, в виде носительства токсигенных Corynebacterium diphtheriae и легких форм заболевания у привитых [48, 50, 49, 51, 52, 53, 54, 77].

Существенной причиной поддержания эпидемического процесса дифтерии является продолжающаяся циркуляция возбудителя даже при высоком уровне антитоксического иммунитета у людей. Сохранению возбудителя дифтерии в природе способствуют следующие факторы: 1) антитоксический поствакцинальный противодифтерийный иммунитет не препятствует носительству возбудителя дифтерии [26, 67, 71, 84, 85]; 2) массовая вакцинопрофилактика не привела к ослаблению вирулентных свойств возбудителя [6, 22, 39, 63, 64, 75]; 3) высокая гетерогенность вида С. сИрЫЬепае по биологическим свойствам (биохимическим, токсигенным, антигенным, генетическим) приводит к формированию популяции со сложной структурой, что облегчает адаптацию возбудителя к постоянно меняющимся условиям существования [6, 33, 39,46, 68, 75].

Таким образом, на современном этапе отсутствуют предпосылки к ликвидации дифтерийной инфекции, включая эрадикацию ее возбудителя как биологического вида [27]. Поэтому в системе эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией отдельным положением выделено наблюдение за циркулирующими штаммами С. сИрЫкепае [44, 70].

Микробиологический мониторинг С. сИрЫИепае должен строится на соответствующей методической основе с учетом особенностей биологии данного микроорганизма. В 90-е годы в Федеральной референс лаборатории по диагностике дифтерийной инфекции при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (ФРЛДДИ) разработана комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции, основу которой составляли классические микробиологические, а также иммуно-химические (реакция непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ, иммуноэлектрофорез) и молекулярно-генетические методики (ДНК-ДНК гибридизация нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция по выявлению гена дифтерийного токсина). Применение такого комплексного подхода позволило установить, что биологические свойства возбудителя дифтерии могут влиять на развитие эпидемического и тяжесть инфекционного процесса [6, 36, 39,40, 56, 57].

В 1993 г. комиссия Европейского регионального бюро ВОЗ, высоко оценив систему эпиднадзора за дифтерией, разработанную в России, подтвердила необходимость контроля за дифтерией в других странах мира и создала Международную лабораторную рабочую группу ВОЗ по дифтерии. Приоритетным направлением работы группы является унификация методов лабораторной диагностики и наблюдения за циркулирующими штаммами С. diphtheriae, изучение их генетической структуры [118].

Развитие и усовершенствование молекулярно-биологических технологий расширило возможности исследователей по изучению возбудителей инфекционных заболеваний. Представлялось актуальным дополнить существующую систему микробиологического мониторинга возбудителя дифтерии в России современными методами изучения генетической структуры, позволяющими наблюдать за формированием популяции С. diphtheriae в динамике эпидемического процесса, выявлять их возможную эволюционную изменчивость, оценивать и прогнозировать тяжесть эпидемического и инфекционного процессов при дифтерии.

Цель исследования: Научное обоснование системы комплексного микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга возбудителя дифтерийной инфекции и установление особенностей его распространения в условиях высокой и низкой интенсивности эпидемического процесса.

Задачи:

1. Провести молекулярно-генетическое типирование (риботипирование, энзимтипирование) токсигенных и нетоксигенных штаммов С. diphtheriae, выделенных в России в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции.

2. Разработать ускоренный метод типирования С. diphtheriae, основанный на технологии полимеразной цепной реакции.

3. Изучить с помощью метода секвенирования структуру генов tox и dtxR, ответственных за синтез дифтерийного токсина - основного фактора патогенности возбудителя дифтерии.

4. Провести наблюдение за распространением токсигенных и нетоксигенных штаммов С. diphtheriae основных биоваров на территории России.

5. Сформировать базу данных по риботипам С. diphtheriae, выделенных в России.

Научная новизна

Получены новые сведения по фенотипической и генотипической характеристике С. diphtheriae, свидетельствующие о клональном распространении штаммов возбудителя дифтерии в период последней эпидемии в 90-е годы XX века. Формирование эпидемической клональной группы штаммов, установленное в динамике наблюдения, началось за несколько лет до повышения показателей заболеваемости дифтерией, что явилось предвестником осложнения эпидемиологической ситуации. В период эпидемического подъема эти штаммы доминировали в популяции и были распространены на всей территории России. Доминирующие штаммы характеризовались высоким уровнем токсинообразования, относились к биовару gravis, энзимтипам комплекса 8, риботипам 'Sankt-Peterburg/Rossija', отличались по структуре гена дифтерийного токсина (tox) и регуляторного гена dtxR от недоминирующих штаммов; все штаммы доминирующей клональной группы имели мутационные изменения в регуляторном гене dtxR в положении 440 (замена нуклеотида С на Т), что, вероятно, привело к повышению уровня токсинообразования. При снижении показателей заболеваемости популяция возбудителя дифтерии длительное время сохраняет гомогенную структуру, что обусловлено широким распространением доминирующих штаммов. В условиях низкой интенсивности эпидемического процесса (80-е годы XX века) популяция возбудителя дифтерии гетерогенна по штаммовому составу (биоварам, риботипам, энзимтипам).

Впервые выявлена мутация в гене tox в положении 1252 (замена нуклеотида G на С), приводящая к изменению домена R фрагмента В дифтерийного токсина, ответственного за первичное взаимодействие токсина с рецепторами чувствительной эукариотической клетки. Полученные данные опровергают сложившееся представление о невозможности генетических изменений гена дифтерийного токсина, приводящих к изменению структуры дифтерийного токсина - основного фактора патогенности возбудителя дифтерии.

Получены новые данные, свидетельствующие об участии нетоксигенных штаммов в формировании популяции возбудителя дифтерии: выявлена взаимосвязь процессов циркуляции токсигенных и нетоксигенных штаммов С. diphtheriae, филогенетическая связь между ними, обусловленная общностью генов рРНК и регуляторного гена dtxR, показана способность нетоксигенных штаммов, выделенных в современный период, приобретать ген дифтерийного токсина.

Теоретическая значимость

Установленные особенности формирования популяции возбудителя дифтерии, внутривидовое разнообразие С. diphtheriae по признаку токсигенности, биоварам, риботипам, энзимтипам и аллельным вариантам по генам tox и dtxR, ответственным за токсинообразование, являются теоретическим обоснованием невозможности полного искоренения (эрадикации) возбудителя дифтерии вследствие его высокой жизнеспособности.

Новые сведения об изменчивости генов tox и dtxR, контролирующих структуру и функцию дифтерийного токсина, указывающие в ряде случаев на несоответствия структуры этих генов у циркулирующих штаммов и вакцинного штамма Park Williams 8, в дальнейшем, при накоплении подобных фактов, помогут объяснить причину заболевания правильно привитых лиц и теоретически обосновать новые подходы к совершенствованию вакцинопрофилактики при дифтерии.

Практическая значимость

С помощью усовершенствованной системы мониторинга возбудителя дифтерии, включающей комплекс микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методов исследования уточнены механизмы формирования популяции возбудителя дифтерии в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции. Полученные результаты позволяют повысить эффективность микробиологического мониторинга при составлении более точных прогнозов развития эпидемического процесса.

Учитывая, что нетоксигенные С. diphtheriae могут оказывать влияние на формирование популяции возбудителя дифтерии, целесообразно проводить наблюдение за нетоксигенными штаммами в специализированных центрах и научно-исследовательских институтах, изучающих проблему дифтерии. Установление механизма блокирования продукции дифтерийного токсина у нетоксигенных токснесущих штаммов риботипа 'Moskva' позволило разработать метод дифференциации нетоксигенных токснесущих штаммов С. diphtheriae от «истинно» токсигенных штаммов (защищено патентом № 2209831).

Пополнена уникальная, единственная в мире коллекция штаммов С. diphtheriae, выделенных в России, которая включена в единую информационную систему «Генетические и биологические (зоологические и ботанические) коллекции Российской Федерации http://www.sevin.ru/collections/index.html). Включение коллекции в единый реестр расширяет возможности ученых России и всего мира по исследованию возбудителя дифтерии с целью создания новых препаратов и биотехнологий, направленных на совершенствование лабораторной диагностики и средств иммунопрофилактики дифтерии.

Созданная база данных по риботипам С. diphtheriae позволяет проводить сравнительные исследования генетической структуры штаммов С. diphtheriae с целью регистрации новых, ранее не циркулировавших штаммов, и наблюдать за их распространением. Штаммы риботипов С. diphtheriae, выделенных в России, включены в коллекцию Федеральной референс лаборатории по диагностике дифтерийной инфекции МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Штаммы риботипов 'Sankt-Peterburg', 'Rossija', 'Vladimir', 'Kaliningrad' и 'Moskva', впервые зарегистрированные в России, представлены в Международную базу данных риботипов С. diphtheriae в Институте Пастера (Париж).

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов:

1. Дифтерия. Руководство по лабораторной диагностике дифтерии (перевод на русский язык руководства ВОЗ). Санкт-Петербург, 1995. Мазурова И.К., Чайка H.A., Мельников В.Г., Михайлович В.М., Комбарова С. 10.

2. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Руководство. - М.: Информационно - издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1995. -76 стр. Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю.

3. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания. МУ 4.2.698-98, Минздрав РФ, 1998. - 47 стр. Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю.

5. Способ дифференциации Corynebacterium diphtheriae, содержащих функционально активный ген дифтерийного токсина от Corynebacterium diphtheriae, содержащих функционально неактивный ген дифтерийного токсина. Патент на изобретение № 2209831. Приоритет от 28.12.2001. Мельников В.Г., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю.

6. Характеристика штаммов Corynebacterium diphtheriae, циркулирующих в России в период 1984-1998 г.г. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией). Пособие для врачей. Минздрав РФ, 3 декабря 1999 г., протокол № 4. Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю.

7. Ускоренный метод лабораторной диагностики дифтерийной инфекции. Методические рекомендации Минздрав РФ, 26 апреля 2001 г., № 2001/56. Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю.

8. Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae. Пособие для врачей. Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г., Зотина Р.К., Кривопалова Н.С., Мазурова И.К. Роспотребнадзор, 2 декабря 2004 г., протокол № 5.

Апробация работы

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на 5-ти Российских и 14-ти международных конференциях: съездах Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997; 2002); Российских научно-практических конференциях «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000), «Генодиагностика инфекционных заболеваний (Москва, 2004), «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на международных конференциях «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1995; 1998; 2003); на 95ov съезде американского общества по микробиологии (95th General Meeting of American Society for microbiology -Вашингтон, 1995); на 10м конгрессе европейских микробиологов (1 FEMS Congress of European Microbiologists - Любляна, 2003); на Международных совещаниях Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по дифтерии и проекта по контролю за дифтерией в странах Европейского Союза (International meetings of the European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network, DIPNET - Лондон, 1994;

Хельсинки, 1995; Париж, 1996; Бухарест, 1997; Халхидики, 1998; Брюссель, 2000 г., Вена, 2002; Копенгаген, 2004; Вольягмени, 2006).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 53 научных публикациях: в статьях - 16, в том числе в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК России - 8: (5 в отечественных, 3 - в иностранных журналах), в материалах всероссийских и международных конференций - 30, в патенте на изобретение -1, в инструктивно-методических документах - 6.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 258 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Общий объем диссертации составляет 225 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 33 таблицами и 28 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Комбарова, Светлана Юрьевна

В ы В ОД ы

1. Разработана система микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга возбудителя дифтерии, которая предусматривает применение как классических микробиологических и иммунохимических методов исследования (идентификация С. diphtheriae с определением токсигенных свойств и биовара), так и молекулярно-генетических методов изучения особенностей генома С. diphtheriae и отдельных генов, ответственных за синтез основного фактора патогенности возбудителя дифтерии -дифтерийного токсина (риботипирование, энзимтипирование, полимеразная цепная реакция, секвенирование ДНК). Высокая информативность и дифференцирующая способность данных методов позволила наблюдать за структурой популяции С. diphtheriae в динамике эпидемического процесса.

2. Проведено типирование С. diphtheriae, выделенных в различных регионах России. С помощью энзимтипирования, основанного на выявлении метаболических энзимов, структура которых четко коррелирует с генотипом штамма и риботипирования, выявляющего особенности генов рРНК, зарегистрировано 89 энзимтипов и 31 риботип (23 риботипа среди токсигенных штаммов и 20 риботипов среди нетоксигенных штаммов). Выявлены риботипы высокого удельного веса по количеству входящих в их состав штаммов - 'Sankt-Peterburg/Rossija' (72,3 %) среди штаммов биовара gravis и 'Otchakov' среди штаммов биовара mitis (15,1 %).

3. Разработан метод генотипирования С. diphtheriae - полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для ускоренной идентификации штаммов риботипов высокого удельного веса 'Sankt-Peterburg/Rossija'.

4. Показано, что популяция возбудителя дифтерии гетерогенна по фенотипическим и генотипическим характеристикам - биоварам, токсигенным свойствам, риботипам, энзимтипам, структуре генов tox и dtxR, ответственных за токсинообразование, что определяет ее адаптацию к меняющимся условиям существования и способствует сохранению вида.

5. Установлено, что в период, предшествующий высокому уровню заболеваемости дифтерией, происходит перестройка гетерогенной популяции, при этом постепенно увеличивается удельный вес определенного биовара и риботипа. В 40-70 годы XX века преимущественное распространение имели штаммы биовара gravis риботипа 'Lyon' (84,6 %), в 80-е годы спорадической заболеваемости на фоне преобладания биовара mitis (до 83,1 %) популяция была гетерогенна по риботипам (всего 8 риботипов), однако по удельному весу выделялись риботипы 'Otchakov' (29,4 %) и 'Sankt-Peterburg/Rossija' (23,5 %); в 90-е годы преобладали штаммы высокого уровня токсинообразования биовара gravis риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija' (до 96,1 %).

6. Установлена принадлежность большинства штаммов риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija' (95,1 %) к клональной группе энзимтипов комплекса 8. Показано, что штаммы данной группы характеризовались аллельными вариантами III, IV по гену tox и аллельными вариантами 1, 2, 3, 4 по гену dtxR. Отличительной особенностью структуры гена dtxR штаммов эпидемической группы явилось наличие мутации в положении 440 (замена нуклеотйда С на Т), соответствующей замене аланина на валин в положении 147 аминокислотной последовательности регуляторного белка DtxR (A147V), что, вероятно, привело к повышенному уровню продукции дифтерийного токсина штаммами эпидемической клональной группы.

7. Показано, что доминирование штаммов риботипов 'Sankt-Peterburg/Rossija' продолжилось и при снижении интенсивности эпидемического процесса вследствие их повсеместного распространения на территории России. Вместе с тем, начиная с 1997 г., в популяции отмечаются изменения, связанные с увеличением количества других риботипов (10 риботипов) и их удельного веса (до 27,9 %). Некоторые риботипы ('Londinium', 'Vrancea', 'Schwarzenberg', 'Pakistan', 'Ras-el-Ma') впервые зарегистрированы только во время снижения уровня заболеваемости дифтерией.

8. Впервые выявлена генетическая изменчивость гена tox, приводящая к изменениям на аминокислотном уровне. У двух штаммов риботипа 'Otchakov' зарегистрирована мутация в положении 1252 (замена нуклеотида G на С), что соответствует замене глицина на аргинин в положении 393 аминокислотной последовательности дифтерийного токсина (G393R). Данная мутация локализована в области гена tox, кодирующей домен R фрагмента В дифтерийного токсина, ответственном за первичное взаимодействие дифтерийного токсина с чувствительной эукариотической клеткой.

9. Получены новые данные, расширяющие представления о виде С. diphtheriae - наряду с токсигенными и нетоксигенными штаммами в 16,8 % случаев встречаются штаммы, несущие неэкспрессирующийся, «молчащий» ген дифтерийного токсина. Данные штаммы принадлежали к биовару mitis, их генетическая структура гетерогенна (11 риботипов). Характер распространения токсигенных и нетоксигенных штаммов С. diphtheriae, соответствующий динамике заболеваемости дифтерией, общность генетической структуры токсигенных, нетоксигенных и нетоксигенных токснесущих штаммов (генов рРНК, гена dtxR), способность современных нетоксигенных штаммов приобретать ген tox посредством фаговой конверсии указывают на участие последних в формировании популяции возбудителя дифтерии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Комбарова, Светлана Юрьевна, Москва

1. Адаме М. Бактериофаги. М.: ИЛ, 1961. - 527 с.

2. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М.: Академкнига, 2003.-431 с.

3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2002. - № 3. С. 3-23.

4. Барашкова Л.Н. Разработка способов получения эритроцитарных диагностикумов из чистых антител для специфической индикации микробных антигенов и токсинов: Автореф. дис. канд. биол. наук. -Ленинград, 1986.

5. Бондаренко В.М. Острова патогенности бактерий. // Журн. Микробиол. -2001.-№4.-С. 67-74.

6. Борисова О.Ю. Патогенные и молекулярно-генетические свойства штаммов С. diphtheriae, циркулирующих на территории России в течение 1994-1998 г.г.: Автореф. дис. канд. мед. наук. -М., 1999.

7. Бочкова В.А. Антибактериальный иммунитет при дифтерийной инфекции: Автореф. дис. докт. мед. наук. Москва, 1978.

8. Высоцкий В.В., Шмелева Е.А., Мазурова И.К. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение 8 представителей рода Corynebacterium, выращенных на твердой питательной среде в стационарной фазе развития. // Журн. Микробиол. 1976. - № 10. - 121126.

9. Высоцкий В.В., Шмелева Е.А., Мазурова И.К. К вопросу об экстрацеллюлярном материале некоторых представителей рода Corynebacterium (электронно-микроскопический аспект). // Журн. Микробиол. 1977. - № 8. - С. 90.

10. Ю.Гаврилова H.A. Особенности роста, биосинтеза дифтерийного токсина и клеточных белков при культивировании Corynebacterium diphtheriae в условиях дефицита железа: Автореф. дис. канд. биол. наук. М.,2000.

11. П.Гараев М.М., Казеннова Е.В., Бобков А.Ф., Казаков Б.Г., Ковган A.A., Бобкова М.Р., Жданов В.М. Рестрикционный анализ ДНК токсигенных коринефагов BF, ф 984, ф 9 и С. II Вопросы вирусологи. 1987. - № 5. -С. 554-560.

12. Гараев М.М., Бобкова М.Р., Бобков А.Ф., Лукашевич Н.В. Клонирование и экспрессия гена дифтерийного токсина и его отдельных субъединиц в бактериях Е. coli. //Генетика. 1990. - Т. 26. - № 6. - 990-999.

13. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. - 459 с.

14. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение./ Перевод с англ. под ред. Янковского H.K. М.: Мир, 2002. -590 с.

15. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов. М.: Медицина, 1980.-224 с.

16. Инфекционные заболевания в России. Статистический справочник. М.: Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора

17. России; Российский республиканский информационно-аналитический центр, 1992. 40 с.

18. Ковган A.A., Бобков А.Ф., Карамов Э.В., Гараев М.М., Маныкин А.И., Жданов В.М. Биология и некоторые физико-химические свойства фагов Corynebacterium diphtheriae ß (Freeman), cp 9, cp 984. // Вопросы вирусологии. 1986. - № 5. - С. 577-584.

19. Костюкова H.H., Блинова H.H. Изучение вирулентности свежевыделенных культур Corynebacterium diphtheriae на куриных эмбрионах. //Журн. Микробиол. 1967. - № 8. - С. 37-42.

20. Костюкова H.H., Фаворова JI.A. Патогенные свойства дифтерийных бактерий, выделенных в течение эпидемического процесса. // Журн. Микробиол. 1968. - № 5. - С. 69-75.

21. Костюкова H.H. Дифтерийное бактерионосительство (бактериологические и иммунологические исследования): Автореф. дис. докт. мед. наук. -М., 1971.

22. Костюкова H.H., Переверзев H.A. Адгезия С. diphtheriae. // Журн. Микробиол.- 1985.-№ 11.-С. 30-33.

23. Костюкова H.H., Карась С.Р. Адгезивная активность дифтерийных штаммов в зависимости от вызываемого ими инфекционного процесса. // Журн. Микробиол. -1991. -№11. С. 24-27.

24. Костюкова H.H. Микробиологические факторы, определяющие иосительство при воздушно-капельных инфекциях. // Журн. Микробиол. 1997.-№4.-С. 10-15.

25. Костюкова H.H. Уроки дифтерии. // Журн. Микробиол. 1999. - № 2. -С. 92-96.

26. Корженкова М.П., Платонова Т.В., Черкасова В.В., Малышев H.A., Кудряшова О.В., Берко А.И., Арсеньев В.А. Особенности клиники дифтерии в условиях циркуляции возбудителя дифтерии высокой степени токсигенности. Пособие для врачей. М., 2002. - 31 с.

27. Корженкова М.П. Клиника дифтерии в период высокой и низкой заболеваемости. // Бюллетень «Вакцинация». 2006. - № 14(3). - С. 4-6.

28. Крылова М.Д. Вирусы коринебактерий дифтерии в генетическом маркировании и таксономии: Автореф. дис. докт. мед. наук. М., 1973.

29. Крылова М.Д. Дифтерийная инфекция (биологические, генетические и эпидемиологические аспекты). М.: Медицина, 1976.

30. Мазурова И.К. Разработка и применение реакции пассивной гемагглютинации для обнаружения дифтерийных противомикробных антител у больных дифтерией: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1971.

31. Мазурова И.К., Бочкова В.А., Филллиппова JT.M. Гуморальные показатели антимикробного иммунитета при дифтерии. // Журн. Микробиол. 1971. - № 4. - С. 86-89.

32. Мазурова И.К., Потемкина Е.Е., Свиридов В.В., Зайцев Е.М. Детекция токсина и оценка степени токсинообразования с помощью иммуно-ферментного анализа. // Журн. Микробиол. 1989. - № 6. - С. 66-71.

33. Мазурова И.К. Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерии: Автореф. дис. докт. мед. наук. -М, 1993.

34. Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Руководство. М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1995.-76 с.

35. Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Жилина Н.Я. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания. МУ 4.2.698-98. М.: Интэрсэн, 1998. - 47 с.

36. Максимова Н.М., Маркина С.С., Костюкова H.H. Дифтерия. В кн. Покровский В.В., Онищенко Г.Г., Черкасский В.Л. Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке. М.: Медицина, 2003. - С. 214-236.

37. Маркина С.С. Метод фаготипирования токсигенных коринебактерий дифтерии типа gravis и его применение в эпидемиологии дифтерийной инфекции: Автореф. дис. канд. мед. наук. -М., 1971.

38. Маркина С.С., Тымчаковская И.М., Максимова Н.М., Сухорукова Н.Л. Эпидемический процесс дифтерийной инфекции в РСФСР в условиях внедрения эпидемиологического надзора. // Журн. Микробиол. 1989. -№ 5.- С. 38-40.

39. Маркина С.С., Максимова Н.М., Богатырева Э.Я. Заболеваемость дифтерией в России в 1992 г. // Здоровье населения и среда обитания. Ежемесячный информационный бюллетень. 1993. - № 1. - С. 3-8.

40. Маркина С.С., Максимова Н.М., Котова Е.А., Жилина Н.Я. Заболеваемость дифтерией в России в 1993-1995 г.г. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997. - № 4. - 8-10.

41. Маркина С.С., Максимова Н.М. Характеристика эпидемического процесса дифтерии в начале нового тысячелетия. // Матер. VIII Всерос. съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2002. -Т.1.-С.81.

42. Маркина С.С., Максимова Н.М., Лазикова Г.Ф. Заболеваемость дифтерией в настоящее время. // Журн. Микробиол. 2005. - № 1.-31-37.

43. Маркина С.С., Максимова Н.М., Черкасова В.В., Кошкина Н.И. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в настоящее время. // Бюллетень «Вакцинация». 2006 - № 1 (43). - С. 7-11.

44. Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Воложанцев Н.В.,

45. Веревкин В.В., Волковой К.И.,| Мазурова И.К Характеристика нетоксигенных штаммов СогупеЬас1егшт сИрЫЪепае, несущих ген дифтерийного токсина // Журн. микробиол. 2004. - № 1. - С. 3-7.

46. Михайлович В.М., Заикин В.Л., Мазурова И.К. Использование метода ДНК-ДНК гибридизации для изучения штаммов СогупеЬаШпит сИрЫкепае. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 194. - № 6. - С. 27-29.

47. Михайлович В.М. Разработка и адаптация молекулярно-биологических технологий для диагностики дифтерийной инфекции и изучения штаммов СогупеЬаМепит сИрЫкег1ае: Автореф. дис. канд. биол. наук. -М, 1995.

48. Нарвская О.В., Мокроусов И.В. Применение полимеразной цепной реакции для диагностики дифтерии и изучения возбудителя. Пособие для врачей. Санкт-Петербург, 1995.

49. Мокроусов И.В., Нарвская О.В., Ценева Г.Я., Михайлов Н.В., Попель И.Р. Генетическое типирование штаммов Corynebacterium diphtheriae, с помощью полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами. // Журн. Микробиол. 1996. - № 5. - С. 73-75.

50. Наумов JT.C. Зависимость активности дыхания от токсигенных и лизогенных свойств коринебактерий дифтерии: Дис. канд. мед. наук. -М, 1967.

51. Нисевич Н.И. Течение дифтерии в связи с типом дифтерии. // Педиатрия. 1947.-№3,-С. 44-51.

52. Определитель бактерий Берджи. ТII. М.: Мир., 1997. - 368 с.

53. Платонова Т.В. Клинико-иммунологические особенности дифтерии в период спорадической заболеваемости: Автореф. дис. канд. мед. наук. -М., 1991.

54. Современная микробиология. Прокариоты: в 2-х томах. Т. 1. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. / Пер. с англ. под ред. А.И. Нетрусова, Т.С. Ильиной. М.: Мир., 2005. - 496 с.

55. Суслова B.C. Серологический типаж дифтерийных бактерий, выделенных на территории Советского Союза. // Журн. Микробиол. -1964-№9.-С. 13-16.

56. Сухорукова Н.Л. Эпидемиологическая оценка дифтерийной инфекции в условиях высокого уровня противодифтерийного иммунитета: Автореф. дис. докт. мед. наук. -М., 1978.

57. Тренин С.А. Гетерогенность дифтерийных коринебактерий. // Журн. Микробиол. 1986. - № 6. - С. 92-97.

58. Трофимова О.Д. Метод корицинотипирования и корициногенотипирования и его использование в эпидемиологическом анализе: Автореф. дис. канд. мед наук. М., 1986.

59. Фаворова Л.А., Сухорукова Н.Л., Иванова Л.М. Об эпидемиологическом надзоре. // Журн. Микробиол. 1981. - № 8. - 8-13.

60. Фаворова Л.А., Астафьева Н.В., Корженкова М.П., Черкасова В.В., Шмелева Е.А. Дифтерия. -М.: Медицина, 1988.-208 с.

61. Хрущева В.А., Меклер С.С. Микробиологическая характеристика возбудителя дифтерии в послевоенные годы. // В кн. Дифтерия. -Казань, 1964. С.45-48.

62. Черкасова В.В. Возбудитель дифтерии и его свойства. // В кн. Фаворова Л.А., Астафьева Н.В., Корженкова М.П., Черкасова В.В., Шмелева Е.А. Дифтерия. М.: Медицина, 1988. - С. 6 - 29.

63. Черкасский Б. Л. Руководство по общей эпидемиологии. М.: Медицина, 2001.-560 с.

64. Чистякова Г.Г., Филатов H.H., Корженкова М.П., Солодовников Ю.П., Лыткина И.Н., Максимова Н.М., Маркина С.С. Крупная эпидемия дифтерии в Москве в последние годы: закономерности развития. // Журн. Микробиол. -2001. № 1.-С. 18-21.

65. Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Петрова М.С. Мельникова Ф.М., Скачкова В.Г. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве. // Журн. Микробиол. -2005. № 5 - С. 18-21.

66. Шагинян И.А. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфекций. // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 54-59.

67. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. -Т.2. - №3. - 82-95.

68. Шагинян И.А. Идентификация и типирование патогенных бактерий: современные подходы. // Вестник РАМН. 2000. - № 1. - С. 22-28.

69. Шмелева Е.А. Биологическая функция клеточной стенки Corynebacterium diphtheriae и научно-производственная разработка иммуномодулирующего препарата: Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1991.

70. Шмелева Е.А., Макарова С.И., Корженкова М.П. Некоторые показатели иммунитета при дифтерийной инфекции. // Эпидемиологи и вакцинопрофилактика. 2002.- № 3-4. - С. 31-35.

71. Шмелева Е.А., Макарова С.И., Батурина И.Г., Корженкова М.П., Чистякова Г.Г., Ксенофонтова М.К., Филатов Н.Н. Специфические антитела и их роль в формировании противодифтерийного иммунитета. // Журн. Микробиол. 2005. - № 1. - С. 38-43.

72. Эмироглоу Н. Заболеваемость дифтерией в Европейском регионе ВОЗ. Рекомендации ВОЗ по лечению и профилактике дифтерии. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. -Т. 3. - № 3. - С. 247-249.

73. ЕЦелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. - 496 с.

74. Якубович Н.В., Земляная Н.Ю., Ермакова Л.М., Новикова И.С., Крылова М.Д., Янковский Н.К., Дебабов В.Г. Клонирование в Escherihia coli мутантного гена, кодирующего дифтерийный токсин. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 1985. - № 1. - С. 17-22.

75. Ahtman M. Global epidemiology of meningococcal disease. In Meningococcal disease. Cartright F., ed. Chishester, England: John Wiley and® Sons, Ltd. 1995-P. 159-175.

76. Bodley J.W., Dunlop P.C. Diphthamid elongation factor 2: ADP ribosylation, purification and properties. I I Methods Enzymol. 1984. - Vol.106. - P. 378387.

77. Boyd J., Oza M.M., Murphy J.R. Molecular cloning and DNA sequence analysis of a tox iron-dependent regulatory element (dtxR) from C.diphtheriae. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - № 15. - P. 5968-5972.

78. Boyd J., Kimberly C.H., Murphy J.R. DNA sequence and characterization of DtxR alleles from C. diphtheriae PW 8 (-), 1030 (-) and C7hm 723 (-). // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. - № 7. - P. 1268-1272.

79. Buck G.A, Cross R.E., Wong T.P., Loeta J., Groman N. DNA relationship among some tox-bearing corynebzcteriophages. // Infect. Immun.- 1985. Vol. 49. - № 3. - P. 679-684.

80. Cabiaux V., Mindell J., Collier R.J. Membrane translocation and channel-forming activities of diphtheria toxin are blocked by replacing isoleucine 364 with lysine. // Infect. Immune. 1993. - Vol. 61. - № 5. - P. 2200-2202.

81. Carniel E. The Yersinia high-pathogenicity island: an iron-uptake Iisland. //Microbes Infect. -2001. Vol. 3.-№ 7. - P. 561-569.

82. Cianciotto N.P., Groman N.B. Characterization of bacteriophages from tox-containing non-toxigenic isolates of Corynebacterium diphtheriae. II Microb. Pathog. 1997. - Vol. 22. - № 6. - P. 343-351.

83. Claridge III J.E. Impact of 16S tRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. // Clin. Microbiol. Rev. 2004 - Vol. 4. - № 4. - P. 840-862.

84. Collier R.J., Kandej J. Structure and activity of diphtheria toxin. I. Thiol-dependent dissociation of a fraction of toxin into enzymically active and inactive fragments. // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. - № 5. - P. 14961453.

85. Collier R.J. Diphtheria toxin: mode of action and structure. // Bacteriol. Rev. 1975. - Vol. 39. - № 1. - P. 54-85.

86. Coyle M.B., Groman N.B., Russell J.Q., Harnishch J.R., Rabin M., Holmes R. The molecular epidemiology of three biotypes of Corynebacterium diphtheriae in the Seatle outbreak, 1972-1982. // J. Infect. Dis. 1989. - Vol. 159.-№4.-670-679.

87. Cryz S.J., Russel L.M., Holmes R.A. Regulation of toxinogenesis in Corynebacterium diphtheriae: mutations in bacterial genome that alter the effect of iron on toxin productions. // J. Bacteriol. 1983. - Vol. 154. - № 1. -P. 245-252.

88. Damian M., Grimont F., Narvskaya O., Staut M., Surdeanu M., Cojocaru R., Mokrousov I., Diadonescu A., Andronescu C., Melnik L., Grimont P.A.D., Study of Corynebacterium diphtheriae strains isolated in

89. Romania, northwest Russia and republic of Moldova. // Res. Microbiol. -2002. Vol. 153 - №. 2. - P. 99-96.

90. Damian M., Ucein C.R., Luca B., Florea M., Diadonescu A. Molecularcomparison of non-toxigenic, toxigenic and converted Corynebacteriumth diphtheriae strains with respect to the Ins. Sites. // Abstr. 8 International

91. Meeting of the European Working Group on Diphtheria, Denmark,

92. Copenhagen, 16-18 June. 2004. - P. 40.

93. Dang Hong V., Le Thi L., Nguyen Ai T., Bach Thi On., Duong Hong O., Le Van B., Le Kum H., Le Van H., Dinh Dug K. // http//www.ncbi.hlm.nih.gov. 2003. - GeneBank AJ 596101.

94. Efstratiou A., Roure C., Members of the European Laboratory Working Group on Diphtheria. The European laboratory working group on diphtheria: a global microbiological network. // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. -Suppl. l.-P. 146-151.

95. Feil E. Population structure and ultra-species divergence of bacterial pathogens. // Ferns. Microbiol. Lett. 2003. - Vol. 222. - Suppl. 1. - P. 7.

96. Forbes K.J., Bruce K.D., Jordens J.Z., Ball A., Peninfiision T.H. Rapid method for DNA fingerprinting. // J. Gen. Microbiol. 1991. - Vol. 137. - № 9.-P. 2051-2058.

97. Funke G., von Geaeventiz A., Claridge III J.E., Bernard K.A. Clinical microbiology coryneform bacteria. // Clin. Microbial. Rev. 1997. - Vol. 10. - № l.-P. 125-129.

98. Funke G., Altwegg M., Frommelt L., vonGravenitz A. Emergence of related nontoxigenic Corynebacterium diphtheriae biotypes mitis strains in Western Europe. // Emerging Infect. Dis. 1999. -Vol. 5. - № 3. - P. 983989.

99. Galazka A.M., Robertson S.E., Oblapenko G.P. Resurgence of Diphtheria. // Eur. J. Epidemiol. 1995. - Vol. 11. - P. 95-105.

100. Gandon S., MacRinnon M., Nee S., Read F. Imperfect vaccines and the evolution of the pathogen virulence. // Nature. 2001. - Vol. 414 (6865). -751-756.

101. Gandon S., MacRinnon M., Read A. Imperfect vaccination: some epidemiological and evolutionary consequences. // Proc. Biol. Sei. 2003. -Vol. 7. - № 270 (1520). - 1129-1136.

102. Gill D.M., Dinius L.L. Observations on the structure of diphtheria toxin. // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. - №. 5. - P.1485-1491.

103. Gill D.M., Pappenheimer A.M.J. Structure-activity relationships in diphtheria toxin. // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. - № 5. - 1492-1495.

104. Gill D.M., Uchida R.A., Singer R.A. Expression of the diphtheria toxin genes carried by integrated and non-integrated phage beta. // Virology. -1972. Vol.50. - № 3. - P. 664-668.

105. Glushkevich T.G., Nekrasova L.S., Zherebko N.N. The etiology ofAdiphtheria in the Ukraina. // Abstr. 6 International Meeting of the European Working Group on Diphtheria, 21-24 June, Brüssel, Belgium. 2000. - P. 37.

106. Gulber J., Huber-Schneiner C., Altwegg C. An outbreak of nontoxigenic Corynebacterium diphtheriae infection among swiss drug users. // Clin. Infect. Dis. 1998. - Vol. 27. - № 5. - P. 1295-1298.

107. Graves L.M. Swaminathan B. Universal DNA isolation procedure. In diagnostic molecular molecular microbiology. Principles and applications. Prsing D.H., Smith T.F., Tennover F.C. White T.J., eds. Washington, ASM Press, 1993.-P. 573-583.

108. Greenfild L., Bjorn M.J., Horn G. Nucleotide sequence of the structure gene for diphtheria toxin carried by toxigenic corynebacteriophage beta. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983 - Vol. 80. - № 22. - P. 6853-6857.

109. Grimont F., Grimont P.A.D. Ribosomal acid gene restriction patterns as potential taxonomic tools. // Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 1986. - Vol. 137B.-P. 165-175.

110. Grimont F., Grimont P.A.D. Determination of RNA gene restriction patterns. // In Methods in molecular biology. Vol. 146.: Diagnostic bacteriology protocols. Howard J. and Whitcombe D.M., eds. Totowa NJ, Humana Press Inc., 1988.-P. 181-189.

111. Grimont P.A.D. Taxotron 2000 users manual. France, Paris: Institute Pasteur, 2000.- 197 pages.

112. Grimont P.A.D., Grimont F., Colin M., Ruckly C., Martin-Delautre S.iL

113. The Corynebacterium diphtheriae ribotype database project. // Abstr. 6 International Meeting of the European Working Group on Diphtheria, Brussel, Belgium, 21-24 June. 2000. - P. 55.

114. Grimont P.A.D., Grimont F., Efstratiou A., Zoysa A., Mazurova I., Ruckly C., Lejy-Collin M., Martin-Delautre S., Regnault B. International nomenclature for Corynebacterium diphtheriae ribotypes. // Res. Microbiol. -2004.-Vol. 155. -№3. -P. 162-166.

115. Groman N.B. The relation of bacteriophage to the change of Corynebacterium diphtheriae from avirulence to virulence. I I Science. 1953. -Vol. 117.-P. 297-299.

116. Groman N.B., Cianciotto N., Bjorn M., Rabin M. Detection and expression of DNA homologous to the toxin nontoxigenic isolates of

117. Corynebacterium diphtheriae. II Infect. Immun. 1983. - Vol. 42. - № 1. - P. 48-56.

118. Groman N. Conversion by corynephages and its role in the natural history of diphtheria. // J. Hyg. 1984. - Vol. 93. - № 3. - P. 405-412.

119. Groman N.B., Cianciotto N. A beta related corynebacteriophages which lack a tox allele that can acquire it by recombination with converting phage // Infect. Immun. 1985. - Vol. 49. - № 1. - P. 32-35.

120. Hacker J., Bllum-Ochers G., Muhldorfer I., Ischape H. Pathogenecity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23. - № 23. - P. 1089-1097.

121. Hantke K. Iron and metal regulation in bactera. // Curr. Opin. Microbiol. 2001. - Vol. 4. - № 2. - P. 172-177.

122. Hentschel U., Hacker J. Pathogenicity islands: the tip of the iceberg. // Microbes and Infect. 2001. - Vol. 3. - P. 545-548.

123. Holmes R., Barksdale W. Comparative studies with tox and tox' corynebacteriophages. // J. Virol. 1970. - Vol. 5. - № 6. - P. 783-794.

124. Holmes R. Genetic aspects of toxinogenesis in bacteria. // In Microbiology. Schlessinger D., ed. Washington, ASM, 1975. P. 296-301.

125. Isenberg H.D. Clinical microbiology procedures handbook. -Washington, ASM Press, 2004.

126. Jacobs D. SAS/GRAPH software and numerical taxonomy. In Proceeding of the 15th annual Users Group International Conference. Carry, NC, SAS Institute. 1990.-P. 1413-1418.

127. Jansen R.J., vanEnbden J.D.A., Gpastia W., Schonls L.M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in procaryots. // Mol. Microbiol. -2002. Vol. 43. - P. 1565-1575.

128. Joon K.O., Senzel L., Collier R.J., Finkelstein A. Translocation of the catalitic domain of diphtheria toxin across planar phospholipids billayers by its own T domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 84678470.

129. Kaper J.B., Hakcer J. Pathogenicity island and other mobile virulence elements. Washington, ASM, 1993.

130. Kourova N., Caro V., Weber C. Comparisson of the Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis isolates circulating in Sankt-Peterburgbetween 1998-2000 with Russian vaccine strains. // J. Clin. Microbiol. Vol. 41. - № 8. - P. 3709 - 3711.

131. Kunkle C.A., Schmitt M.P. Analysis of a DtxR-regulated iron transport and siderophorebiosynthesis gene cluster in Corynebacterium diphtheriae. II J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187. - № 2. - P. 422-433.

132. Lai S., Efstratiou A. report on the Sixth international meeting on the European Working Group on Diphtheria, Brussels, Belgium. // Eurosurveilance, Mouthly. 2002. - Vol. 7. - № 1. - P. 7-12.

133. Lanzerein M., Falnes P.O., Sand O., Olsens S. Structure-Function relationship of the ion chanel formed by diphtheria toxin in Vero cell membranes. // J. Membr. Biol. 1997. - Vol. 156. - № 2. - P. 141-148.

134. Lefrensne G., Latrille E.F., Irlinger F., Grimont P.A.D. Repeatability and reproducibility of ribotyping and its computer interpretation. // Res. Microbiol.-2004.-Vol. 155.-№3.-P. 154-161.

135. Leong D., Murphy J.R. Characterization of the diphtheria tox transcript in Corynebacterium diphtheriae and Escherihia coli. II J. Bacteriooool. -1985. Vol. 163. - № 3. - P. 1114-1119.

136. Love J.F., Murphy J.R. Design and development of a novel genetic probe for the analysis of repressor-operator interactions. // J. Microbiol. Methods 2002. - Vol. 51. № 1. - P. 63-72.

137. Mazurova I.K., Melnikov V.G., Kombarova S.Yu., Borisova O.Yu. and others. Project INTAS 2001-2289 "Study of the role of nontoxigenic Corynebacterium diphtheriae in the epidemiology of diphtheria. 2004.

138. Matsuda M.L., Barksdale L. Phage-directed synthesis of diphtherial toxin gene in non-toxigenic Corynebacterium diphtheriae. //Nature. 1966. -Vol.210 (5039).-P. 911-913.

139. Matsuda M.L., Barksdale L. System for the investigation of the bacteriophage-directed synthesis of diphtherial toxin. // J. Bacteriol. 1967. -Vol. 93.-P. 722-730.

140. Mattos-Guaraldi A.L., Formiga A.L., Camell T.C., Pereira G.A., Yirata R., Halperin M. Corynebacterium diphtheriae threats in cancer patients. // Rev. Argent. Microbiol. 2001. - Vol. 33. - № 2. - P. 96-100.

141. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeshenko E., Vyazovaya A. Efficient discrimination within Corynebacterium diphtheriae clonal group by a noval macroarray-based method // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - № 4. - P. 662-668.

142. Mothershed E.A., Cassiday P.K., Pielson K., Mayer L.W., Popovic T. Development of a real-time PCR assay for rapid detection of the diphtheria toxin gene. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - № 12. - P. 4713-4719.

143. Mullis K., Fallona F., Schart S., Saiki R., Horn G., Erich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. // Gold Spring Harbor Symp. Quant. Brol. 1986. - Vol. 51 (Pt. 1). - P. 263273.

144. Murphy J.R., Pappenheimer A.M., Borms S.T. Synthesis of a tox-gene products in Escherichia coli extracts. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. -Vol. 71.-№ l.-P. 11-15.

145. Murphy J.R., Skiver Y., McBride G. Isolation and partial characterization of a corynebacteriophage p, tox operator constitutive-like mutant lysogen of Corynebacterium diphtheriae. II J. Virol. 1976. - Vol. 18. -№ l.-P. 235-244.

146. Nakao H., Mazurova I.K., Glushkevich T., Popovic T. Analysis of heterogeneity Corynebacterium diphtheriae toxin gene, tox, and its regulatoryelement, dtxR, by direct sequencing. // Res. Microbiol. 1997. - Vol. 148. -№ 1.-P. 45-54.

147. Nakao H., Popovic T. Development of a direct PCR assay for detection of the diphtheria toxin gene. // J. Clin. Microbiol. Vol. 35 № 7. - P. 16511655.

148. Neiladss J.B. Microbial envelope proteins related to iron. // Annu.Rev. Microbiol. 1982. - Vol. 36. - P285-309.

149. Neiladss J.B. Siderophores: structure and functions of microbial iron transport compounds. // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - № 45. - P. 26723-26726.

150. Van Ness B.G., Howard J.B., Bodley J.W. ADP-ribosylation of elongation factor 2 by diphtheria toxin. NMR spectra and proposed structure of ribosyl-diphthamide and its hydrolysis products. // J. Biol. Chem. 1980. -Vol. 225. - № 22. - P. 10710-10716.

151. Oh K.J., Scnzel L., Collier R.J., Finkerlshtein A. Translocation of the catalytic domain of diphtheria toxin gene across planar phospholipids bilayers by its own T domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - № 15.-P. 8467-8470.

152. Olive D.M., Bean P. Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. -№6.-P. 1661-1669.

153. Oppenheimer N.J., Bodley J.W. Diphtheria toxin. Site and configuration of ADP-ribosylation of diphthamid in elongation factor 2. // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256. - № 16. - P. 8579-8581.

154. Pallen M.J., Haj A.J., Puckey L.H., Efstratiou A. Polymerase chain reaction for screening clinical isolates of corynebacteria for the production of diphtheria toxin. // J. Clin. Pathology. 1994. - Vol. 47. - № 4. - P. 353-356.

155. Pappenheimer A.M., Uchida T., Harper A.A. An immunological study of the diphtheria toxin molecula. // Immunochemistry. 1972. - Vol. 9. - P. 891-906.

156. Pappenheimer A.M. Diphtheria toxin. // Annu. Rev. Biochem. 1977. -Vol. 46.-P. 69-94.

157. Pappenheimer A.M. The story of a toxic protein, 1888-1992. // Protein Sci. 1993. - Vol. 2. - №2. - P. 292-298.

158. Pappenheimer A.M., Murphy J. The study of the molecular epidemiology of diphtheria. // Lancet. 1983. - Vol. 2 (8356). - P. 923-926.

159. Peel M.M., Palmer G.G., Stacpoole A.M., Kerr T.G. Human lymphadenitis due to Corynebacterium pseudotuberculosis: report of ten cases from Australia and review. // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol. 24. - № 2. -P. 185-191.

160. Pohl E., Quix A., Must L.M., Holmes R.K., Hoi W.G. Comparisson of high resolution structures of the diphtheria toxin repressor in complex withcobalt and zinc at the cation-anion binding site. // Protein Sci. 1997. - Vol. 6.-№ 5.-P. 1114-1118.

161. Popovic T., Dopp C.A., Olsvik O., Kiehlbauch J.A. Ribotyping in molecular epidemiology. In Diagnostic molecular microbiology. Persing D.H., Smith T.F., Tenover F.C., White F.J. (eds). ASM, Washington, 1993. -P. 573-583.

162. Popovic T., Kim Ch., Ries J., Reeves M., Nakao H., Golaz A. Use of molecular subtyping to document long-term persistence of Corynebacterium diphtheriae in South Dakota. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - № 4. -P. 1092-1099.

163. Popovic T., Mazurova I.K., Efstratiou A., Vuopio-Varkila J., Reeves M., Zoysa A., Glushkevich T., Grimont P. Molecular epidemiology of diphtheria. // J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - Suppl. 1. - P. S168-S177.

164. Quian Y., Lee J.H., Holmes R.K. Identification of DtxR-regulated operon that is essential for siderophore-depended iron uptake in Corynebacterium diphtheriae. II J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - № 17. -4846-4856.

165. Rappuoli R., Michel J.L., Murphy J. Restriction endonuclease map of corynebacteriophage coctox+ isolated from the Park-Williams 8 strain of Corynebacterium diphtheriae. II J. Virology. 1983. - Vol. 45. - № 2. - 524530.

166. Rappuoli R., Ratti G. Physical map of the chromosomal region of Corynebacterium diphtheriae containing corynephage attachment sites attBl and attB2. // J. Bacteriol. 1984. - Vol. 158. -№ 1. - P. 325-330.

167. Rappuoli R., Perugini M., Enevold F. Molecular epidemiology of the 1984-1986 outbreak of diphtheria in Sweden. // N. Engl. J. Med. 1988. -Vol. 318. -№ l.-P. 12-14.

168. Rappuoli R., Gross R. Ait sites, tox gene and insertion elements as tools for the diagnosis and molecular epidemiology of Corynebacterium diphtheriae. II In Gene probes for Bacteria. Macaria A. (ed). San Diego, CA, Academic Press, 1990.- P.205-231.

169. Ratti G., Rappuoli R., Giannini G. The complete nucleotide sequence of the gene coding for diphtheria toxin in the corynebacteriophage omega (tox +) genome. //Nucleic Acids Res. 1983. - Vol. 11. - № 19. - P. 6589-6595.

170. Reacher M., Ramsay M., White J., Zoysa A., Efstratiou A., Mann G., MacKay A., Georg R. Non-toxigenic Corynebacterium diphtheriae an emerging pathogen in England and Wales? // Emerg. Infect. Dis. 2000. -Vol. 6.-№6.-P. 640-645.

171. Regnault B., Grimont F., Grimont PAD. Universal ribotyping method using a chemically labeled oligonucleotide prope mixture. // Res. Microbiol. -1997.-Vol. 148. -№ 8. P. 649-659.

172. Russel L.M., Holmes R.K. Initial characterization of the ferric iron transport system of Corynebacterium diphtheriae. // J. Bacteriol. 1983. -Vol. 155. -№3. -P. 1439-1442.

173. Russel L.M., Holmes R.K. Highly toxigenic but avirulent ParkWilliams 8 strain Corynebacterium diphtheriae does not produce siderophore. // Infect. Immun. 1985. - Vol. 47. - № 2. - P. 575-578.

174. Sanger F., Nicklen S., Coulsoen A.R. DNA sequencing and chain terminating inhibitors. // Proc. Natl. acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - № 12.-P. 5463-5467.

175. Saragea A., Maximescu P. Nouveal types phagoques dans le shema de lysotyple de C. diphtheriae. // Archives Romaines de patholgie Experimentale et de microbial. 1969. - Vol. 28. - P. 1053-1058.

176. Savelkoul P.H.M, Aarts H.J.M., Haas J., Dykshoorn L., Duim B., Otsen M., Rademarker W., Schoults L., Lentstra J.A. Amplified-fragment length polymorphism analysis: the state of art. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37.-№ 10.-P. 1661-1669.

177. Seardic D., Corbel M.J. Testing for neutralizing potential of serum antibodies to tetanus and diphtheria toxin. // Lancet. 1992. - Vol. 340 (8821).-P. 337-338.

178. Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H., Musser J.M., Gilmour M.N., Whittman T.S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetic and systematic. // Applied and Environmental Microbiol. -1986-Vol. 55.-№ 5.-873-883.

179. Schiller Y., Groman N., Coyle M. Plasmid in Corynebacterium diphtheriae and diphtheroids mediating erytromicin resistance. // Antimicrob. Agents. Chemother. 1980. - Vol. 18. -№ 5. - P. 814-821.

180. Skogen V., Cherkasova V.V., Maksimova N.M., Marston Ch., Sjursen H., Reeves M., Olsvik 0., Popovic T. Molecular characterization of Corynebacterium diphtheriae isolates, Russia, 1957-1987. // Emerg. Inf. Dis.- 2002. Vol. 8. - № 5. - P. 125-128.

181. Spiering M.N., Ringe D., Murphy J.R., Marietta M.A. Metal stoichionary and functional studies of the diphtheria toxin repressor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. - № 7. - P. 3809-3813.

182. Swaminathan D., Matar G. Molecular typing methods. // In Diagnostic molecular microbial. Principles and application. Persing D.H., Smith T.F., Tenover F.C., White TJ. (eds). Washington, ASM, 1993, P. 26-50.

183. Swierczynski A., Ton-That H., Type III pilus of corynebacteria: pilus length is determined by the level of its major pilin subunit. // J. Bacteriol. -2006.-Vol. 188.-№ 17.-P. 6318-6325.

184. Tao X., Murphy J.R. Determination of the minimal essential nucleotide sequence for diphtheria tox repressor binding by in vitro affinity selection. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - № 20. - P. 9646-9650.

185. Todar K. Diphtheria. University of Wisconsin-Madison., 2002. (http//www.textbookofbacteriology.net).

186. Ton-That H., Schneewind O. Assambly of pili on the surface of Corynebacterium diphtheriae. II Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 50. - № 4. -1429-1438.

187. Ton-That H., Marrafini L., Schneewind O. Sortases and pilin elements involved in pilus assembly of Corynebacterium diphtheriae. II Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 53. - № 1. - P. 251-261.

188. Tyler K.D., Wang G., Tyler S.D., Jonson W.M. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification-based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. -№2.-P. 339-346.

189. Uchida T., Kannei C., Yoneda M. Mutations in corynephage P that affect the yield of diphtheria toxin. // Virology. 1977. - Vol. 77. - № 2. - P. 876-879.

190. Versalovic J., Lipski J.R. Molecular detection and genotyping of pathogens: more accurate and rapid answers. // Trends Microbiol. 2002. -Vol. 10. - Suppl. 10.-P. 15-21.

191. Wang Z., Schmitt M.P., Holmes R.K. Characterization of mutations that inactivate the diphhthera toxin repressor gene (dtxR). II Infecti. Immun. -1994.-Vol. 62.-№5.-P. 1600-1608.

192. Welkos S., Holmes R.K. Regulation of toxinogenesis in Corynebacterium diphtheriae. I. Mutations in bacteriophage P that alter the effect of iron on toxin production. // J. Virology. 1981. - Vol. 37. - № 3. -P. 936-945.

193. Welsh J., McClelland M.F. Fingerprintig genomes using PCR with arbitrary primers. // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - № 24. - P. 72137218.

194. Weiss M.S., Dlanke S.R., Collier R.J., Eisenberg D. Structure of the isolated catalytic domain of diphtheria toxin. // Biochemistry. 1995. - Vol. 34.-№3. - P. 773-781.

195. Williams J.G.K., Hubelic A.R., LiVar K.J., Rafalski J.A., Tunsey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.//Nucleic Acids Res. 1990.-Vol. 18.-P. 6531-6535.

196. World Health Organization. Diphtheria epidemic in Europe: emergency response report on WHO meeting, St.-Petersburg, Russia, 5-7 July, 1993. Regional office for Europe and Foundation Marsel Merieux, 1994.

197. Yanagawa R., Honda E. Presence of pili in spesies of human and animal parasites and pathogens of the genes Corynebacterium. II Infect. Immun. 1976. - Vol. 13. - № 4. - P. 1293-1295.

198. Zaidi N., Konstantinou JL, Zervos M.D. The role of molecular biology and nucleic acid technology in the study of human infection and epidemiology. // Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 2003. -Vol. 127.-№9.-P. 1098-1105.

199. Zasada A.A., Zaleska M., Podlasin R.B., Seferyska I. The first case of septicemia due to nontoxigenic Corynebacterium diphtheriae in Poland: case report. // Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2005. - Vol. 4. - P. 8.

200. Zhang H.J., Zhang S.H., Zhang H. // http://www. ncbi.nlm.nih.gov/ GeneBank accession number AY 820132.

201. Zoysa A., Efstratiou A., Georg R.C., Vuopio-Varkila J., Jakhola M., Rikushin Y. Diphtheria and travel (letter). // Lancet. 1993. - Vol. 342 (8868).-P. 446.

202. Zoysa A., Efstratiou A., Hawkey P.H. Molecular characterization of diphtheria toxin repressor (dtxR) genes present in nontoxigenic

203. Corynebacterium diphtheriae strains isolated in the United Kingdom. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - № 1. - P. 223-228.2261. Благодарности