Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и использование некоторых молекулярно-генетических методов для характеристики C. diphtheriae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и использование некоторых молекулярно-генетических методов для характеристики C. diphtheriae"

Госкомитет санэпиднадаора РФ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ • имени Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

^ г »» »

К 11 «л

I 7 пВ '

гчп ттпяггг п\пмшч!*п

КОМБАРаВА Свешана Юрьевна

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ

ХАРАКТЕРИСТИКИ С.(НрИЛепа?

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссгртлшш на соискание ученой степени какщщата биологических наук

Москва -1995

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии нм. Т.Н. Габричевского Госкомитета Санэпиднадзора РФ. ,

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ* Доктор медицинских наук И. К. МАЗУРОВА.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ Доктор медицинских наук, проф. С. С. БЕЛОКРЫСЕНКО Кандидат биологических наук Е. В. КАЗЕННОВА

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И .И .Мечникова РАМН.

Защита состоится " ^ " -МИ^Мй-_1995 г.

в часов на заседании специализированного совета Д 176.01.01

Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Госкомитета санэшщнадаора РФ по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

У

Автореферат разослан февраля 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Е. М. ГОРСКАЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Постоянная циркуляция возбудителя

дифтерия в окр)~:зюиич среде приводит к риску ■ вознихнозеши

габслгз?л!1я особенно среди ненммунних н лиц с ослабленным

иммушгпггом (Н.Н.Костккова, 1971; 1993; HJI. Сухорукова, 1978;

лл.шашшпня и гпиит.. ivhi ». ri r-onrrntiriroii шрптяпни. няттяя п I wii t

uvhi ; V 4 **H И""»' I'poi^-.1 miMi' "J-* !!!'.-"?!!

икфекиин. Показатели заболеваемости (ПЗ) по сравнению со средними многолетними показателями возросли в 1990 г. - в 1,6 р., в 1991 г. - в 2,6 р., в 1992 г. - в 5,2 р., з 1993 г. - в 20 р. (С.С. Маркина и соавт., 1993; ЕА.Котова и соавт., 1994).

В этой связи очевидна необходимость наблюдения за штаммами C.diphlheriae - изучения их токсигенных свойств для прогнозирования потенцивдьнон опасности и типирования для определения путей распространгш'я инфекции (Н.Н.Костюкова, JLA. Фавсроза, 1968;

B.В.Чсркзсова и соавт., 1975; С.С.Маркина, 1971; И.К.Мазурова, 1993; A.Saragca, P.Maximescu, 1969; A-Andronescu, 1993; A.Efslratiou et. al., 1994).

Традиционные методы диагностики и типирования C.diphtheriae, основанные на фенотипическом выражении биологических-свойств, не всегда дают объективную оценху циркулирующих штаммов. Например, некоторые иггаммы проякляют токснгетгую активность в реакции преципитации в геле (РП) только после многократных пассажей на питательных средах (И.К. Мазурова и соавт., 1989).

Из существующих систем ткгп'ропания только метод биохимической дифференциации стабильно подразделяет C.diphtheriae на три биоварйанга, однако .этого недостаточно из-за высокой гетерогенности

C.diphtheriae внутри каждого биоварианта. (A-Anderson, 1993; Coyle, 1993; Bergey's manual, 1994). Другие системы типирования по фен оптическим признакам - серо- фаго- и хорицинотипнрование часто не позволяют проводить внутривидовую дифференциацию C.diphtheriae по ряду причин. Серстип определяется поверхностными антигенами, подверженными изменчивости. Смена антигенного состава приводит к появлению штаммов, для которых не разработаны сер оптовые сыворотки (В.С.Суслова, 1964; МД.Крылова, 1976; В.В.Черкасова 1988; L.Gibson, G.Colman, 1973).'уИмеющимйся 'коллекциями фагов подразделяются на фаговарианты в основном штаммы биоварианта gravis, mitis - лишь в незначительном проценте случаев (С.С.Маркина и соавт., . 1983). Корипшлгптирование имеет ограниченное применение из-за громоздких

схем маркирования (НА.Кравченко, ОД.Трофимова, 1980; 1981). Поэтому поиск принципиально иного методического подхода представлялся актуальным.

Современная микробиология интенсивно использует методы молекулярной биологии, которые могут по-новому раскрыть структурные особенности клетки и механизмы распространения патогенных микроорганизмов. В диагностике и наблюдении за рядом инфекций - широкое распространение .получили молекулярно-генетические методы, характеризующие возбудителей ' инфекционных заболеваний по особенностям нуклеотидного состава ДНК, вне зависимости от проявления биологических свойств (М.Р.Бобкова и соавт., 1985; АЛ.Гинцбург, 1989; РЗавомгеку <А. а1., 1979; Т/У/оосЬ. а1., 1982; А.РарреЛадпег, 1983; ЬШтотап, 1984; Р.ЯиЬт ей а1„ 1985; Я-НарриоН ей а1., 1987; 1988; 1990; Р.Тепоуег, 1988; 1993; В.Зууатша(Ьап, О.Маеаг, 1993).

Целью настоящей работы явилась разработка и использование молекулярно-генегическнх методов для индикации возбудителя дифтерийной инфекции по наличию гена дифтерийного токсина (ДТ) и для типирования С.(1грЬ1Ьепае на основе знания генетической структуры клетки.

Основные задачи исследования:

1. Разработать метод молекулярной гибридизации с ДНК-зондом, комплементарным гену ДТ, для .дифференциальной диагностики токсигенных и нетоксигенных С.&рЫЬепае.

2. Адаптировать методы генотипирования - ресхрикционный анализ хромосомной ДНК, блрт-гибридизацию со специфическим ДНК-зондом и универсальным рРНК-зоцдом (рнбопшнрование) и изучить возможности их применения для внутривидовой дифференциации С.с^рЬЛепае.

3. Охарактеризовать штаммы С.&рЫЬепае с применением разработанных молехулярно-генегических методов исследования.

Научная новизна работы.

Впервые применен молехулярно-генеттгческий подход для изучения токсигенных свойств и типирования штаммов С.сНрЬЛглае. Разработан метод спот-гибридизации дня' индикации 'Токсигенных С.сКрЫЬепае. Проведен скрининг штаммов на наличие гена ДТ. Установлено, что при широком скрининге целесообразно использовать безвекторный ДНК-зонй, не содержащий нукяеогпщных последовательностей векторной и фаговой ДНК.

Им«тся азторскос свид.тггяъство "Сггосс5 "цеезли:: тсксигенных • С.шпЫЬепае" (совместно с А.Ф.Бобковым, М РбСйковой, М.М.Гарагш.:м и пр.) л'2 1616991 от 1 сентября 1990 г.

Определены возможности методов генотияирова.чия для внутривидовой дифференциации штаммов С.&р1иЬелае. ПпопемонсгошзовЕно преимущество риботипирования - утшасрсалъного

МС1ииЦ С ПЫьиКиП "" *Г" 1----■ I, , .„ . .. .. J —. ^ Л Г ■ ~ „ . .

Вперт,¡с праведепо изучат: штаммов С.ЛрЬ£Ьепае в рнбопшировании. Показано, что популяция С.<МрЫЬепае гетерогаша по ' генетической структуре. В годы подъема заболеваемости получают преимущественное распространение отдельные клоны, состоящие из генетически идентичных штаммов.

Практичепсая значимость работы.

Комплексное применение методов индикации возбудителя дифтерии по токсину и гену токсиксобразования дает возможность в полном объеме ьыяалягь эпидемически опасные токсигенные штаммы. В практике диагностических и эпидемиологических исследований метод спот-п:5рцд1~ацни может быть рекомендован Центральным и Референс-лабораториям для изучения нггаммов С.<КрЬШепае, показывающих сомнительные результаты в РП, РНГА и ИФА.

Метод риботипирования позволяет наблюдать за процессом формирования ¡атонального состава популяции С.сПрЫЬепае в динамике по годам на различ1Л1х территориях. Интенсивное распространение определенных клонов может явиться прогностическим признаком, сзвдетелъствующнм сб эпидемическом неблагополучии. Метод может быть рекомендован Референс-лабораториям.

Сравнительное изучение С.ШрЫЬепае бактериологческими, имунно-химическимн и молекулярно-генетнчесюши методами дало возможность

совершенствовать лабораторную диагностику дифтерийной ннфекцни.

Н а основе полученных данных составлены:

1. Методические рекомендации "Индикацня дифтерийного токсина методами ИФА и РНГА (совершенствование лабораторной диагностики дифтерийной инфекции)", утв. МЗ РСФСР, 1991 г. (совместно с И.К.Мазуровой, Е.Е.Потемкиной, А.Б.Жебруном, В.В.Свиридовым и др.).

2. Раздел "Методы нитрования C.diphtheriae" для Руководства по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции по заказу Госкомсанэтзднадзора.

Настоящая работа является частью комплексных исследований, проведенных совместно с лабораторией биотехнологии ' Института вирусолопш им. ДЛЛвановского (рук. д.б.н. пр'оф. М.М.Гараев), лабораторией биотехнологии С.-Петербургского НИИЭМ им. Пасгера (рук. д.бл. проф. А-Б.Жебрун), лабораторией моноклональных антител ЦНИИВС им. И Л.Мечникова (рук. к-м.н. В.В.Свирцдов), лабораторией диагностики дифтерийной инфекции МНИИЭМ им. ГЛРгбричевского (рук. Д.ил. И.К.Мазурова). Исследования по рибопшированию проводили в рамках международной программы, пркнлтой на Международном • совещании "Эпидемия дифтерии в Европе'' (С.Петербург, 1993).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод спот-гибридизации с безвектсрньш ДНК-зондом, строго специфичным гену ДТ, позволяет дифференцировать тохсигенные и нетоксигениые штаммы C.diphtheriae.

2. Адаптированные для C.diphtheriae методы генотитаровання г рестрикцаонный анализ хромосомной ДЦК, ..блот-х^брцдизация со. специфическим ДНК-зовдом и универсальным РНК-зондом обладают высокой дискриминирующей способностью, что создает преимущество перед фенотипическими методами типирования.

3. Универсальность и высокая разрешающая способность выделяют рнбохипирование в ряду других молекулярно-генетических методов типирования, что позвапшо наблюдать за процессом формирования клонального состава популяции C.diphtheriae. ~

Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета 'Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний" МНИИЭМ им. Г Л .Габричевского 28 декабря 1994 г.

Материалы работы доложены на конференциях молодь« ученых МНИИЭМ им. Габричевского (1986; 1988), Юбилейной конференции С.-Петербургского НИИЭМ им. Пасгера (1993), I Международном • совещании рабочей лабораторной, группы.ВОЗ по дифтерии. (Лондон,. 1994).

Публикации. По mie диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 1 авторское свидетельство.

Структура !. обт.^-м работы. Диссертация написана по обычному ivrany i; состоит из гг.едсния, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, ззхлточения, выводов, списка использованной литературы, •включающего 1ri источник . Работа иллюстрированна Í5 рисунками, 20 таблицами, S фотографиями. Общий объем диссертации ¡46 страниц .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

лттгтеиатм. г^ер-«с-11гхамны: C.ilipiilhenae üíi.- ¡ox .

C.pseudodiphfericum, St. aureus (ГИСК им. ЛА.Тарасевпча), C.diphtheriae 46С lox*C.ulcerans to"+ (лаборатория диагностики дифтерийной инфекции МНИИЭМ им. Г.Н.Га5ричевского), E.coli х 925, Exo?i/pBR322 - дерипат х 925, несущий векторную плазмнду pBR.322 (лаборатория биотехнологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского), E.coli 257-6 дикого типа (лаборатория микробиологии и профилактики кишечных инфекций

МНИИЭМ им. Г.Н.ГабричеЕского).

C.cí¿ptíhet¿M,

Изучены штаммы с различных территорий РФ. циркулировавшие в 1985-1993 г.г. (коллекция лабораторий диагностики дифтерийной инфекции. МНИИЭМ. им. Г.Н.Габр1п;евского). С применением мологулярно-генетических методов исследования проанализировано 1S5 штаммов, в иммуно-химических методах (РП, ИФА, РНГА) - 273 штамма.

Бактериальные плазмида ptox4.1 и рА5, содержащие полную нукпео-тидную последовательность гена ДТ коринефага ф 984 сконструированы в лаборатории биотехнологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (А.Ф.Бобкоз и соавт., 1986; М.М.Гараев и соавт., 1990).

Методы исследования. Микробиологические а пммуно-хиничсскке нетоды. Нде1ш:фш:?,ц;ао C.diphtheriae с определением кулътурально-биохимических и токсигенных свойств проводили согласно "Инструкции . по бактериологической и серологической индикации возбудителя дифтерии и его токсина"(приложение № 4 к приказу № 450 МЗ СССР, 1986 г.).

Молгкулярно-генстические методы. Хромосомную ДНК C.diphtheriae выделяли фенольиым методом (J.Shilier et. al., 1980) и в градиенте хлористого цезия (Т.Маниатис н соавт., 1984). При проведении риботипирования ДНК выделяли по универсальной методике (L.Graves, B.Swamiaathan, 1993). Выделение плазмидной ДНК E.coIi проводили по методу (M.Bazaral, D.Helinski, 1968).

Элекгрофорстический анализ препаратов ДНК, препаративное выделение индивидуальных фрагментов ДНК, гидролиз ДНК специфическими эндонукпеазами, перенос фрагментов ДНК с агарозного геля на шггроцеллюлозную мембрану по Саузерену, гибридизацию с 35Р-мечеными ДНК-зондами осуществляли по методикам, описанным Т.Маниатис и соавт., (1984). 4v

\

Радиоактивно-меченые зонды получали методом ник-трансляции (P.Pigby et. al., 1977; Т.Маниатис и соавт., 1984). Биотинилирование ДНК-зонда проводили химической модификацией нуклеиновой кислоты с помощью фото активируемого реагента (А.В.Карпухин и соавт., 1991). Универсальный К.ДНК-зонд получали в реакции обратной транскрипции рРНК E.coli, мечение осуществляли дигоксигенинсм с использованием коммерческого набора реагентов Genus 2DNA Labeling Kit, "Boehringer".

Слот-гибридизацию с радиоактивными зондами проводили, как описано М.РЛЗобковой (1987), с биотинклированным зондом -М.М.Гараевым и соавт. (1990). '

Риботипирование проводили по методике T.Popovic et. al., (1993), разработанной для микроорганизмов других видов.

Методы статистической обработки экспериментальных данных. Для оценки _ дискриминирующей. способности методов типирования,-C.diphtheriae рассчитывали индекс дискриминации (Д) (P.Himter, M.Gaston, .1988). При установлении наличия коррелятивной связи был применен принцип корреляции максимумов (В.Н.Вапншс, А-Я.Червонинкис, . 1974; А.Т.Фоменко, 1990). Количественно коррелятивную связь характеризовали коэффициентом корреляции (И.П.Ашмарин, А.В-Воробьев, 1962).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка метода спот-гпбршшзащт для индикации гена ДТ.

В методе ДНК-ДНК гибридизации нуклеиновых кислот индикация возбудителей инфекционных заболеваний осуществляется в результате взаимодействия нуклсотидных. последовательностей ДНК, кодирующих синтез факторов патогенносги с комплементарными последовательностями ДНК-зондов (R.Britten, 1985; F.Tenover, 1988). В избранном варианте метода - слот-гибридизации не требуется использования высохоочищенных препаратов ДНК изучаемых мироорганизмов, достаточно довесш процесс очистки до стадии клеточных шпатов (М.Р.Бобкова, 1S87; J.Matthews et.

ci., I5BS). Бьша отработана оптимальная схема лизиса с учетом строения клеточной стенки C.diphtlieriae для эффективного выхода ДНК без ее деградации. Культуру выращивали на тггатсльной среде Brain Heart Infusion неполным' детергентом Tweeri80 (0,Z' %). Разрушение клеточных стенок проводили 5мг/мл лизоцима в течение 2-3 часов с последующей обработкой ионным детергентом - 1 % SDS.

UunrraHTPTn-Hn/Ti. и^гпля ппи mvnli пмя» шпага елтвика 1П4 _ 1 П5 imrrmr/Timin И in пг ¡¡Нк

В качестве зовдов изучены плазмиды ptox4.I и рА5 (рис. I).

PBR322 ~>- ПЛАЗМИДА -Рисх

Рис. I. Схема гибридаых плазмид, содержащих нуклеотидную последовательность гена ДТ.

Плазмида ptox4.1 включает BamHI - Hindlll -фрагмент ДНК коринефага <р 984 размером 2,88 т.п.н., клонированный в составе векторной плазмиды pBR322. На долю гена ДТ приходится часть фрагмента размером 1,9 т.п.н., другая часть размером 0,98 т.п.н. принадлежит фаговой нуклеотпллой последовательности. Плазмида рА5 представляет собой EcoRI - Hind III фрагмент ДНК того же фага, соответствующий гену ДТ и клонированный в составе вехтора pUC8. Синтез ДТ в последнем поставлен под контроль лактозного оперона (1ас-оперона). Мультикопиниость pUC8 позволяет получать высокие препаративные количества ДНК (2,0 - 2,5 мкг/мкл).

Несмотря на то, что рА5 не имеет "балластной" фаговой последовательности, использовать ее для индикации гена ДТ оказалоь

9

< г 3 ® 5 б % 7 8

ф # % # % 1

а © е Ф X

В

2 3 к 5 6 7 8.

ш. ш

9 -

«Г _

2 3 5 6 7 8

Ф Ф %

•<7 'Ф 0 •

Рис. 2. Спот-гибридизация лизатов С.сИрЫЬепае с 32р ДНК-зондами: А - р1ох4.1, Б - рВЯ322, В - А5'

Референс - штаммы:

1 - С.ШрЬИзепае 1ох-№ 12

2 - С.РБеи11о(Цр11Лепсит 5,6 - Е.соН 257-6

7 - Б^аигеиз

8 -Е.соН/рВ11322

9 - С-ШрЬШепае 1ох+ № 665

10 - С.<2!рЫЬспае 1ох* № 46С И • С.ЫСегап*

Штаммы дикого типа:

12,13,14, 21,22- С.ШрЫЬепае

3,4,15,16,17,18,19,20," С.ШрЬ&епаг 1ох- "

слозмлжяым из-.<а положительных гибридшацнонных сигналов у нсюкеш енных штаммов, обусловленных, вероятно, гомологией к генам 1ас-опсрона.

Скрининг 139 штаммов проводили зондом ptox4.1. Метод спот-гиб-

рндизашш с этим зондом зыявил 1ох-ген у J00 % токсигснных штаммов. Однако 8 (11,8 %) нетоксигенных штаммов давали положительные гибрн-дизационные сигналы (рис. 2А).

показали, что принта неспецнфнчесхнх сигнасов не связана с этой частью зонда, а обусловлена другой частью, которая несет ген ДТ с фрагментами фаговой ДНК (рис. 2Б). Однако нельзя исключить гомологию некоторых штаммов с вектором pBR322.

Учитывая это, был получен безвекторный зонд, строго специфичный гену ДТ, не содержащий фаговой ("балластной") последовательности. Основой такого зонда послужила плазмида рА5, мультикопийность

которой создает преимущество перед ptox4.! лз-за возможности получения змсококонцентрированкых препаратов ДНК.

Схема создания зонда состояла в вьщелешш ДНК рА5, вырезании фрагмента, соответствующего гену ДТ, специфическими эндонуклеазамн рестрикции и вьщелении его из реакционной смеси. Подобранные эндонуклеазы Apal и Kpnl имели сайты прикрепления на нуклсотидной последовательности гена ДТ, расстояние между которыми равно 1562 п.н. В результате гидролиза плазмиды рА5 совместно ферментами Apa I и Kpnl, разделении полученных фрагментов в гадьздезярофорезе и электроэлгоцнн го агарозного геля был получен Apa I - Кра I фрагмент (А5') (pife..-).

При гибридизации с зондом А5' лнзаты кошралыш и диких токси-генных штаммов показывали положительные гибридизационные сигналы, в то время как нетоксигенные C.diphtheriae - отрицательные, в том числе и штаммы, дававшие положительные сигналы засветки с зондом ptox4.1 (рис. 2В).

Радиоактивные зонды обладают серьезными недостатками: короткий период полураспада, радиационная опасность, необходимость в специально;? оборудовании для трудоемких процедур мечения и детекции н пр. Была проведена замена способа мечения зонда. Вместо радиоактивного способа (32р) применили химический (биотином). Чувствительность ' биотинилированного зоода соответствовала

чувствительности радиоактивного и составила 0,1 иг. Тестирование 50 штаммов СлйрЫЬепае и других микроорганизмов показало специфичность зонда - все пягигенные штаммы проявляли окрашивание, указывающее на ' наличие 1ох-гена, это явление не наблюдалось у нетоксигенных штаммов.

Таким образом, разработан метод индикации возбудителя дифтерии по гену ДТ. ' - ;

12 3 4

Рис. 3.Электрофорез в агароз'ном гене препаратов ДНК:

1 -плазмидырА5

2 - фрагментов ДНК рА5, полученных, в процессе гидролиза

эндонуклеазами Ара1 иКрп!

3 - фрагмента А5'

4 - маркер молекулярных весов: РбЦ - фрагменты ДНК фага Я,

(вп.н.)

В ряде случаев только при обнаружении 1ох-гена, особенно у штаммов с иизташ уровнем токсинообразоваиия, возможна четкая дифференциация С-ШрИЛепае по признаку токсигенности.- В табл. 1 представлены результаты изучения 273 штаммов комплексом иммуно-химических методов - общепринятым РП и РНГА и ИФА, разработанными в процессе совместных исследований (И.К.Мазурова, Е-Е-Погешсина, Г.К.Григорян, А-БОКебрун, ЛЛ.Барашкова, В.В.Свиридов, Е.М-Зайцрв).

Таблица.1

ИНДИКАЦИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА МЕТОДАМИ РП, РИГА, НФА

1 метол КОЛИЧЕСТВО Р Е 3 У Л Ь Т А Т ЬТ • '

1 НПДЧ^.ЦН!! ЦГГАММОЕ СОЛНИТЕГ ЬНЫЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ОТРН11ЛТЕПЬНЫЕ

| ^ абс % абс % абс %

1 ИТ I < ТТ2 1 к "Л ■ V» ЧГ1 1X1' пп ч

( РНГА 273 1 0 3,7 89 32,6 174 66,3

| ИФА 273 1 0 3,7 88 32,2 175 64,1

Продукция токсина зарегистрирована в РП, РНГА и ИФА у 82, 89, 88 штаммов соответственно. Не выявлен токсин по данным РП, РНГА и ИФА у 181, 174, 175 штаммов соответственно. Таким образом, наблюдались расхождения - результатов индикации ДТ иммуно- 4

химическими методами: обнаружено 7 штаммов, характеризуемых в ГП как нсгоксигенные, а и РНГА и ИФА хак токсигснные. Эти данные свидетельствуют о том, что общепринятым в практическом здравоохранении методом РП отслеживаются не все токсигенный штаммы. Вместе с тем, обнаружен 1 штамм, характеризуемый в РП и РНГА хак токсигенный, а в ИФА - как нетоксигенный. Расхождение результатов для последнего объясняются некоторыми структурным» изменениями в СООН-хонцезой части В-фрагмента молекулы ДТ. Моноклональные антитела к хонцевон части молекулы, используемые в ИФА, оказались неспецифичными для структуры токсина данного штамма. Дет 10 штаммов были зафиксированы сомнительные результаты во всех трех методах (слабые дшаш преципитации в РП и низкие титры в РНГА нИФА).

Спот-гибридизация выявила наличие Юх-гена у всех 18 штаммов, что позволило отнести их к токсигенным. Таким образом, метод спот-гибридизации обладает более высокой дифференцирующей способностью по сравнению с иммуно-хнмнчеекнми методами при подразделении С.ШрЫЬепае на токсигенные и нетоксигенные штаммы. Метод целесообразно применять для подтверждения наличия пршнаха токсигенносги у С.йфЫЬепае.

. Высокочувствительные методы индикации ДТ РНГА н ИФА (0,001 -0,0005 ЬГ/мл и 0,0002 - 0,0009 ЦУмл соответственно), являясь доступным]! практическим лабораториям могут дополнить, а в некоторых случаях (при

массовых обследованиях с профилактической целью и по эщщпоказ алиям) заменить менее чувствительную РП.

2. Рестрикционный анализ и бяот-гибридизания со специфическим ДНК-зондом для внутривидовой дифференциации C.diphtheriae.

Основой большинства методов ГЕНтгипирования является рестрикционный анализ, в котором штамм овые различия определяют по характеру расщепления ДНК специфическими эвдонуклеазами (ресгриктазами) - ферментами, имеющими строго определенные сайты узнавания нанукпеотидной цепи ДНК (P.Sadowski et. al., 1979; K.Forbes et. al., 1991: B.Swammathan, G.Matar, 1993).

Показано, что для C.diphtheriae применимы ресггриктазы, распознающие последовательности с преимущественным содержанием G и С нуклеотидов в составе ДНК (Bgll и Slal). Методика рестрикционного анализа посте оптимизации условий лизиса к выделения ДНК заключалась в следующем: 2 мкг препарата ДНК, выделенного в градиенте хлористого цезия обрабатывали ферментом Bgll (или Slal) поэтапно - 3 ед. фермента при 2 час. инкубации и 1 ед. при 1 - 2 час. инкубации при 37° С. Этим приемом было сведено к минимуму деградирующее действие ффмента на хромосомную ДНК. Электрофорез осуществляли в 0,8 - 0,9 % агарозе при напряжении 60 В в течение 16-18 часов.

Возможность использования метода для тапнровання C.diphtheriae н его высокая дискриминирующая способность продемонстрирована при изучении штаммов, выделенных с различных территорий (табл. 2). По признаку общности рестрикционного расщепления 13 штаммов разделены на 7 групп. Каждой группе соответствовал определенный биовариант, фагегшп и географический район. Индекс дискриминации рестрикционного анализа (D) - 0,9, что" выше D метода биохимической дифференциации и фаготипирования (0,4 и 0,8 соответственно).

При изучении C.diphtheriae, выделенных с одной территории (Владимирская обл.), также была обнаружена их гетерогенность: 27 штаммов разделены ка 4 рестрикционные группы (рис. 4А), среди которых выделялась группа I высокого удельного веса (62,2 %).

Однако из-за большого количества и недостаточно четкого проявления полос на элезярофореграммах рестрикционный анализ требует введения другой технологии, позволяющей повысить разрешающую способность метода. Была использована гмбридизациокная технология, а именно, один из вариантов молекулярной гибридизации - блот-

Таблица 2

ВНУТРИВИДОВАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ШТАММОВ С.ЛрЫЪслас, ВЫДЕЛЕННЫХ В РАЗНЫХ ГЕОГРАФИЧЕСКИХ РЕГИНАХ МЕТОДАМИ БИОХИМИЧЕСКИМ, РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА И ФАГОТИПИРОВАНИЯ

| I I I

Л* штамма 1 и ч г 1 выделения вариант ¿р>'10ш ио реприкщганиому анализу

I Анапа А Т

2 Анапа gravis А Т

3 " Анапа Л т

4 Челябинск етах^ь В АЬ5

5 Чй1Яб.'П1ЯС В АВа

6 Омск §ГНУ15 С ОРЙТц

Омсзс с ОРЭТй

с т„ ¡чкров Ф/У

9 Киров и Ф/у

10 еладимир 111111!. Е Ф/У

И Красноярск тШх И Ф/У

\1 Красноярск тШз Р Ф ГУ

13 Коллекционный штамм gгavis О ОР<}К&Тё

ИНДЕКС ДИСКРИМИНАЦИИ 0,4 0,9 0,8

Ф/У. - штамм фагоустойчив

А Б В

РЕСТРИКЦИОННЫЕ БЛОТ-ВАРИАНТЫ "ОБЩИЕ" ГРУППЫ ГРУППЫ

1 2 3 4 I II III

-«-4,1-43 -»-2,9-3,0 -«-1,9-2,0

4-1

3-1

Рис. 4 Внутривидовая дифференциация штаммов С.йрЬЛепае, выделенных во Владимирской области, при использовании:

А - РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА

Б - БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИИ СО СПЕЦИФИЧЕСКИМ ДНК-ЗОНДОМ, КОМПЛЕМЕНТАРНЫМ ГЕНУ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА

В - КОМПЛЕКСНОГО СПОСОБА ' (РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ + БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИЯ)

1,2,3,4- номера рестрнкционных групп

1,11, III - номера блот вариантов

1-1,1-Ш, 2-1,2-И, 2-Ш, 3-1,4-1 - номера "обшю?п>упп

стрелками указаны молекулярные веса В{£1 • фрагментов ДНК (т.п.н.), несущих ген ДТ

гибридизация. В этом методе фрагменты гидролизованной ДНК перепоет с агарозного геля на шггроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и гнбридшуют с печеной ДНК зонда. В результате выявляются не все фрагменты хромосомной ДНК, а лишь гомологичные нуклеотнднон последовательности зонда. Зонды могут быть как специфические (для определенного вида или свойства микроорганизма), так и универсальные

1игго ттлмгл ™.,г-„ ----------Г—"С^^Т-С.!_.1. lYjI.

м. К*птп>м; ?t -!.. I?«?; ?<?»Я; JJ.o_tít el. IS?:, IL7<-cbsiiiu;i> и. 1991).

Со специфическим зондом рА5 гибриднзовалн Bgll- фрагменты хромосомной ДНК штаммов Владимирской области. ' Поскольку рестриктаза Bgll не содержит сайтов узнавания на нухлеотидной последовательности гена ДТ (M.Kaczarec, 1983), то молекулярный вес BglI-фрагмента, несущего ген ДТ и гибрйованного с зондом определяется характером гидролиза ДНК соответствующего профага. Таким образом, разпРЛ";я между штамма?..н возможно выявлять по оеобенносгям их профагоз. Установлена гетерогенность C.diphtheriae по конвертирующим фаг~м. Штаммы Выли сгруппированы в три блот-варняпта, каждый из которых имел определенный молекулярный вес Bgll- фрагментов ДНК, несущих ген ДТ (рис. 4Б). I блот-вариант имел наиболт,пп:й удельный пес -74/. %.

Мы предполагали, что существует срорство между рестр'-пашонной группой (бактериальной хромосомой) и блот-вариатггом (конвертирующим фагом). Однако полного соответствия рестркционных групп и блот-

Tir.Tiuштпн м/» О^Н»1Л ' 'Г -"тглгггл).

Совместное исполтлование рестрикционного н блот-анаянзоь позволило установить тонкие различия между штаммами, не выявляемые при раздельном применении методов. Изученные штаммы были более дробно разделены на группы (рнс. 4В). Каасдой нз 7 "общ1гх" групп соответствовала группа рестрщщнонного анализа (арабская цифра) .ч нартмнт по блот-гнбрвдизанпн (римской цифра). На фоне высокой внутривидовой гетер огенн о ста выделялась "общая" группа 1 -I с удельным 5К0М 55,5 %, что свидетельствовало о преобладании одного клона в поликлонздъной популяции C.diphtheriae.

Обнаруженное несоответствие рестршсционных групп н блот-вар'иантов снижает ценность блот-гибрндизации со специфическим зондом как самостоятельного метода типировання. Совместное использование двух методов затруднено из-за сложности учета результатов в

рестрикционном анализе. Необходимо было примешпъ более совершенный методический подход при типировании C.diphtheriae.

3. Блот-гибрнднзация с универсальным рРНК-зовдом (риботипи-рованнеУ

Метод блот-гнбриднзации с универсальным рРНК-зондом позволяет выявлять особенности генома бактериальной клетки по консервативным генам рРНК. Гены рРНК, малоподверженные изменениям, присутствуют практически во всех эубактериях. Следовательно, рРНК отвечает 1ребоваяиям, которые можно предъявить ко всеобщему генетическому маркеру. Наличие в составе геномов бактерий мультихопийных рибосомальных оперонов приводит к получению в реакции блот-гибридизации 8-12 штаммоспецифичных гибридизацнонных фрагментов, что значительно упрощает учет результатов (F.Grimout et. aL, 1986; 1991; 1992; Woods et. al., 1988; K.Wachsmuth et. aL, 1992; M£lumgerg et. al., 1992; D.Blanc, 1993).

Была адаптирована методика T.Popovic et. al., (1993), разработанная для других микроорганизмов. Из 4х изученных рестриктаз (PstI, EcoRI, Bstell, PvuII) выбраны 2: EcoRI, и Bstell. Предварительные эксперименты показали, что группы по риботшшрованию г риботипы (РТ) совпадали с "общими" группами, установленными при совместном проведении рестрикционного и блот-анализов. Эти данные позволили считать, что методом риботшшрования без .использования комплексного., способа можно устанавливать иггаммовые различия, определяемые бактериальной и фаговой хромосомами.

При дальнейшем изучении 60 штаммов C.diphtheriae, выделенных в 1985 - 1993 г.г. во Владимирской области и в 1989 - 1993 г.г. в других регионах России, было определено 13рнботипов.

На рис. 5А представлена схема блот-профияей, полученных при использовании ресгриктазы Bstell. Каждому риботклу соответствовал определенный блот-профияь. Другая рестриктаза EcoRI так же позволила сгруппировать эти же штаммы в 13 риботипов (рис. 5Б). Каждый риботип включал однородные по признаку токсигенностн и биоварианту штаммы: 53 токсигенных штамма разделены на 9 риботипов (из них биоверианта mitis - 5, gravis-4), 7 нетоксигенных штаммов разделены на 4 риботипа (биоварианта miVis -3, gravis -1).

Риботипы неравнозначны по количеству входящих в них штаммов. Удельный вес штаммов РТ1, РТ10, РПЗ, составил 23,3 %, 23,3 % и 26,7 %

контроль ^ а з ч 5 6 г? а з ю н к -\ъ

М0Л.СЕМ6

1-1 •<1

Рис. 5А. Схема блот профилей (риботшюп) С.й'фЫЬепае,

полученных при использовании эндонуклеазы ВБи!.

нТвешь 4 % 3 А 5 6' 7 3 9 Ю И 'О

Рис. 51з, Схема блот-профилйй (риботнпов) С.сНрЫЬепае, полученных при использовании эндонуклеазы ЕсоШ.

ДЕСЯТИ

соответственно. В сумме -73,3 %. Штаммов других риботилов - 23,3 %. РТ1, РТ10, РТ13 явно преобладали и включали только токснгенные штаммы.

Днфференцированность C.diphtheriae по рнботипам свидетельствовала о потшхлональном составе популяции. Внутри множества клонос (РТ2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12,) > наблюдались отдельные югоны высокого удельного веса (РТ!,РТЮ, РТ13}-

пыяипсим» рйсг^и^ринсии* ¡нкчпыюз вчсского н

низкого удельного веса во времени позволило подразделить их на доминирующие и мозаичные (рис. б).

1985 86 87 88 89 90 91 92 93

Ч-1--i-1-1 11-1—к

сосст ото

AAA АА А А

Владимирская оби.

Российская Федерация

Plie. 6. Распространение штаммов C.diphteriae доминирующих и мозаичных риботилов по годам.

ДОМИНИРУЮЩИЕ: У^} — РТ1 (mit is) РТ10 (gravis) — PTi3 (gravis)

МОЗАИЧНЫЕ: Çy _ mitis tox' Q ~ gravis tox* Д _ mitis tox-— gravis tox-

Доминирующие риботипы, имея длительный период распространения (до 6 лет), с течением времени последовательно сменяли друг друга. РТ1 был заменен РТ10 и далее РТ13. Вместе с тем, несколько дет

2 риботнпа существовали одновременно. Во Владимирской области в 1935 -1990 г.г. при преимущественной циркуляции биоварианта mitis (89,0 - 81,8 %) распространялся РТ1 (mitis). Начиная с 1987 г. до 1990 г. циркулировали два риботипа -РТ1 (milis) и РТ10 (gravis). В последующие годы (1990 -1993) большего удельного веса биоварианта gravis (76,2 -79,2 %) циркулировали РТ10 и РТ13 (оба gravis). В РФ ту же закономерность наблюдали начиная с 1989 г. Мозаичные риботипы токсигенных штаммов во Владимирской области имели короткий период распространения и встречались до 1989 г. В РФ с 1989 г. мозаичньк рибоптов также выявлено не было.

Обнаружена тенденция взаимосвязи между распространение»! доминирующих риботипов среди токсигенных штаммов (Владимирская обл.) и ПЗ дифтерией. С Í985 по 1987 г.г. снижение удельного веса доминирующих риботипов (с 57,1 до 33,3 %) сопровождалось снижением ПЗ (с 1,7 до 0,6). В1988 - 1989 г.г. удельный вес доминирующих риботипов достиг 100 % при сохранении.низких ПЗ (0,8; 0,9). Однако начиная с 1990 г., при сохранении удельного веса доминирующих риботипов на уровне 100 % регистрируется резкое повышение заболеваемости (до 5,52 в 1993 г.) (рис. 7). Чтобы устранить влияние случайных ошибок в наших рассуждениях, связанных с трудностями подбора штаммов для исследования и некоторым разбросом цифровых показателей, был применен принцип корреляции максимумов, суть которого' состоит в усреднении полученных данных (В.Н.Вапинк, А-Я.Червоншпшс, 1.974; А.Т.Фоменко, 1990). Сглаженные кривые, представленные на рис. 8 очевидным образом указывают на наличие тенденции взаимосвязи показателей удельного веса доминирующих риботипов и заболеваемости. Обращает внимание (рис. 7, 8), что повышение удельного веса доминирующих риботипов произошло существенно раньше, чем повышение ПЗ дифтерией (рис. 7, 8). Вероятно, интенсивное распространение определенных клонов (доминирующих риботипов) ■ на больших территориях может явиться прогностическим признаком, свидетельствующим об эпидемическом неблагополучии.

Учитывая, что исследования C.diphtheriae в риботипировании только начаты, выводы о взаимосвязи процесса формирования клонального состава популяции C.diphtheriae с ПЗ дифтерией следует рассматривать как предварительные, демонстрирующие необходимость мониторинга за генетической структурой циркулиующих штаммов.

Таким образом, в ряду изученных методов генотнпнрования C.diphtheriae рибопщирование имеет явное преимущество. Обладая

Рис. 7. показателей удельного веса доминирующих

риботилов (-----) и заболеваемости (-) во

Владимирской области.

1.ПСС О)

ЖЕарУ; рн-

>П«!ОВ

Л пз А

100

80 60

•10 4 20

4_

¡985 Ь'5

57

39, га

91 41 93 ГОДЫ

Рис. 3 Дингмкха усредненные псхпзатвлей (по дрищдшу корреляции максимумов) удельного веса доминирующих

риботапов(-----) и заболгваемостн (-)во

Владимирской области.

высокой разрешающей (8 -12 гибридизацио:шых фрагментов) н дискриминирующей способностью (Л = 0,9), метод пригоден дая дифференциации штаммов, вьщеленных с различных территорий РФ. в динамике наблюдения по годам. Дальнейшее накопление данных позволит проследить за формированием клональной структуры популяции и путями распространения инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны молехудярно-геняические методы индикации возбудителя дифтерии по гену токсинообразования. и типироаания' штаммов С.дгрШгепае.

2. Изучение условий лизиса клеток, специфических ДНК-зовдов позволило разработать метод спот-габридизации для выявления гена ДТ. Показано, что для дифференциальной диагностики токсигенных и нетоксигенных С.&рЫЬепае целесообразно использовать ДНК-зонд^ строго специфичный 1ох-гену, - не ' содержащий нуклеотидных последовательностей векторной и фаговой ДНК.

. 3. Метод спот-гибридизацни выявляет токсигенные, эпидемически опасные штаммы вне зависимости от уровня продукции токсина.

4. Адаптированы дая- С.&рЫЬепае методы генотипирования: рестрикционкый анаша хромосомной ДНК, блот-гибрщцпация со специфическим ДНК-зондом и универсальным рРНК-зондом (риботипирование).

5. Определены информативные, характеристики методов генотипирования. Продемонстрировано преимущество риботипирования -универсального метода с высокой разрешающей и дискриминирующей способностью. Появилась возможность изучать клональную структуру популяции С.&рЬЛепае на разных территориях и наблюдать за ее изменениями во времени.

6. Установлено, что. популяция С.ШрЫЬепае гетерогенна по-генетической структуре. На фоне гетерогенности наблюдаются отдельные доминирующие клоны, имеющие преимущественное распространение при высоких показателях заболеваемости.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

.1.-Изучение, токсинообразования СогупеЪас1епит .¿¡рЫЬспае ¡¡а различных питательных средах и индикация згаотоксина экспресс или ускоренными методами диагностики /И.К.Мазурова, Г.К.Григорян, В А.Бочкова и др.' //V Всерос. съезд микгобиол- и ч"»"""— Т". „—.. -

\ I « л-— —

2. Методические указания по бактериологической и серологической индикации возбудителя дифтерийной инфекции и его токсина Л1.К.Мазурова, С.КХКомбарова, Г.П.Салькикова и др. //Приложение № 4 к Приказу № 450 МЗ СССР, 1956.

3. Характеристика коринебактерий дифтерии, выделенных в очагах дифтерийной инфекции /С.Ю.Комбарова, И.К.Мазурова, М.М.Гараев //Мед. реф, журн. - 1988. - Раздел III. - № 8, - Пз'бл. 3052.

4. Рестрикцнснныи анализ и определение первичной струзпуры генов токсииосбразованим корилефагов /С.В.Шуленин, С.Ю.Комбарова, Н.В.Лухзшсяич и др. //Новые направления биотехнологии. Тез. конф. -Пущино - на - Оке, 1988. - С. 13.

5. Реакция коагглютннации дня пыявлешш дифтерийного токсина /И.К.Мазурова, С.Ю.Комбарова, Л.М.Яровая и др. //Ж.микробиол., эпидемиол., нммупол. - 1981). - № 3. - С. 68 -71.

6. Применение фингерпригазюго анализа для- дифференциации токсигенных С.с!фЫЬепае /М.Р .Бобкова, С.Ю.Комбаппп?., С.В Липпс и ГГ?. //Там же. - 1980. - № 7. - С. 28 - 30.

7. Бг.'.териологическин потрав» как элемент эпцднадзора за дифтерийной инфекцией /И.К.Мазурова, Е.Е.Потемкииа, СЛО.Комбарова //XVIII Всесоюзный съезд микробиол., эпидемиол. и паразитол. Тез. докл. - "" М., 1939.-С.79-80.

8. Молекудярно-биологические метода] в системе эпидемиологического надзора за возбудителем дифтерийной инфекции /И.К.Мазурова, С.Ю.Комбарова, ВЛ.Зашеин и др. //Эпидешшлогичег-хин налзор осксга профилактики капельных, и кишечных инфекций. Сб. научн. трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. - М., 1990. - С. 80 -86.

~ 9. Индикация дифтерийного токсина методом иммуно-ферментного анализа и . в реакции непрямой гемагглтотинацми (совершенствование лабораторной диагностики дифтерийной инфекции) /И.К.Мазурова,

ЕЛПотемкина, С.Ю.Комбарова //Методические рекомендации, утв. МЗ РСФСР, 1991.

10. Молекулярно-эпидемнологичесхое обследование " очагов дифтерийной инфекции /С.Ю.Комбарова, И.К.Мазурова //Актуальные проблемы инфекционной патологии. Ч I. Кишечные и респираторные инфекции. Сб. научн. трудов С.- П. НИИЭМ им. Пастора. - С,- П., 1993. -С. 130.

11. Идентификация токсигенных корннебактсрий дифтерии методом молекулярной гибридизации с биопшлларованным ДНК-зондом /С.Ю.Комбарова, И .К.Мазурова, М.М Хараев //Состояние а перспективы разработкипрепаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики. Материалы докл. Всерос. научн.-прахг. конф. - Пермь, 1993. - С. 55.

12. Выявление антигенов и антител в лабораторной диагностике дифтерийной инфекции /Н.К.Мазурова, Т.В.Платонова, С.Ю.Комбарова /ГГам же. - С. 76.

13. Характеристика штаммов коринебактерин дифтерии, циркулирующих в России /И.К.Мазурова, ВЛ.Заикин, С.КХКомбарова //Совещание по эпидемии дифтерии в Европе. Тез. докл. - С.- П., 1993. - С. 99. '

14. Способ индикации токсигенных корйнебактерий дифтерии /А.Ф.Бобков, М.Р.Бобкова, М.М.Гараев //Авт. свидетельство № 1616991 от 01.09.1990 г. . ,

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПЗ - показатель заболеваемости РП - реакция преципитации в геле РНГА - реакция непрямой гемагглютинации ИФА - нммуно-ферментный анаша ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота РТ -риботип • •

вИЗ - додецилсульфат натрия