Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллеза"

На правах рукописи

ГАРАНИНА Светлана Борисовна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСШИ, ОСНОВАННОЙ НА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ, ДЛЯ ДЕТЕКЦШ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1996

- г -

Работа выполнена в Российской наушю-исследовазельсю промиювояуяиош инаящпю "Микроб"

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Попов Ю.А., доктор медицинских наук, стрший научный сотрудник Кумичен;

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Анисимова Т.И., кандидат биологических наук, доцент Тихомирова Л. А.

Ведущая организация. Волгоградский научыо-исслвдриаясл протвочушшй шюшггут.

Защита состоятся 'тЛ>0 " декабря 1906 г. в_; ча

на заседании специализированного ученого совета Д. 074.32 при Российском научно-исследовательском противочумном инс "Микроб" (410071 г.Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиоте РосНИПЧИ "Микроб"

Автореферат разослан "АЁ." ноября 1096г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биологических наук Г.А.Корнее

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее роемя эпидситуация по бруцеллёзу в России значительно ухудшилась. В обеспечении санитарно-эпидемиологического Эдагополучия и з профилактике этого заболевания ватаое место отводится вопросам качественной и своевременной диагностики. Традиционная лабораторная диагностика бруцеллеза основана на определении широкого спектра фенотипических признаков возбудителя и в значительной степени зависит от экспрессии генов, контролирующих эти признаки. Высокая вариабельность, диссоциативная изменчивость и существование L-вариантов бруцелл обусловливают определенные сложности чри их обнаружении. Серологические тесты, основанные на детекции ачти-ЛПС антител бруцелл,. как отмечено' многими исследователями, дают перекрестные реакции с Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Francisella tularensis , S.enteritidis (Зыкин Л.Ф. с соавт., 1993, Никитина Г.А. с соавт., 1991), а эффективность гемагглютинйционньк тестов в большей мере зависит от качества иммуноглобулинов и диагностикумов.

Б последние годы для обнаружения патогенных микроорганизмов, наряду с традиционными, всё чаще используют новые методы, основанные на выявлении участков генома. Среди них наибольшее практическое значение имеет полимеразная цепная реакция. Она в полной мере-отвечает требованиям, предъявляемым к современным тест-сис-

темам, таким как - быстрота, высокая чувствительность, специф иость, независимость детекции от экспрессии генов.

К началу нашей работы по созданию праймеров и разра' гке : ловий регчции едя детекции штаммов рода Brucella были извес лшь эксперименты A. Fekete с соэбт. , 1990, посвященные той проблеме, в которых авторы использовали ГЩР для работы с бакте] альныыи взвесями бруцелл. Олигонуклеотидные последовательно праймеров, выбранных на основе гена, отвечающего за синтез одн1 из поверхностных антигенов-бруцелл 43кДа, опубликованы не бы. Несколько позднее были предложены праймеры ла основе 16S РНК б| целл (Herman L., DeRlder H. ,1993). В вышеназванных работах рассматривались возможности метода для детекции бруцелл в кл№ ческих образцах и объектах внешней, среды, не был освещен це. комплекс проблем, возникающих при практическом использовании ГЕ

Основная цель работы

Разработать методические подходы для детекции возбудителя целлеза в биологических образцах и объектах внешней среды при оши полимеразной цепной реакции.

Основные задачи исследования

1) Сконструировать родоспецифичные пракмеры на основе консер-ивной последовательности гена, кодирующего белок наружной Эраны бруцелл 31кДа.

2) Определить основные параметры одностадийной и двухстадий-(гнездовой) ПЦР для специфичного обнаружения всех видов бру-

I.

3) разработать способы учета результатов ЩР, повышающие разворую способность метода. •

4) Выбрать универсальный способ выделения ДНК из биологичес-образцов и оценить эффективность ЩР при детекции бруцелл в

(ическом материале, объектах внешней среды, молоке.

Нзучная новизна и теоретическая значимость

Впервые на основе нуклеотидной последовательности гена, коди-,его белок внешней мембраны 31кДа сконструированы родоспеци-ые олигонуклеотидные праймеры, позволяющие детектирорать ДНК .видов бруцелл при помощи полимеразной цепной реакции. Прове-

дси компьютерный анализ и проанализирована эффективность 3 ш прайкеров. Выбраны праймеры, обеспечиватацие наиболее высокий ур; ьекь разрешения в одностадийной ПЦР. Показала возможность спец; фичцой амплификации ДНК представителей рода Brucella независи; от стадии диссоциативной изменчивости (S, R, S-R формы).

Проведено сравнительное исследование эффективности принцип; ально отличных способов выделения ДНК бруцелл из молока, кров; !.;очи и почвы: с использованием лизирукгдпх буферов на основе пр* теиназы К, фенолыю-щелочная экстракция, использование) непрерц кого проточного электрофореза, сорбция ДНК на нуклеосорбенте присутствии' гуанидинтиоцианата. Определен оптимальный способ -использованием силккагеля совместно с гуанидинткоцианатом - п;. годный для выделения ДНК из любого исследованного на;.;:*. биолог чнекого материала, позволяющий осуществлять уровень'разрешен метода - 1хЮг - 1x10 Зм.к./мл.

Показана высокая эффективность „гнездовой" ЩР с использована вяешшх и внутренних праймеров. 'Использование двухстадийной Г; позволяет повысить чувствительность метода з 10 раз, что актузг но при работе с биологическим материалом.

Определены методические подходы для учета емплифицированнс продукта, повышающие чувствительность метода: гибридизация фильтре с нерадиоактиавамеченым ДНК-зондом и гибридизация в и: роплашаетах с мечеными в ЩР ампликонами.

Показана возможность обнаружения бруцелл в материале от 6cj ных хроническим бруцеллезом людей (крови, моче,слюне) и в инфи: ровалном молоке от коров.

Пракпгческал значимость

1) Методические рекомендации "Идентификация' возбудителя бруцеллеза с использованием полкмеразной цепной реакции" (протокол ¡1 12 от 6 декабря 1994г.) одобрены Ученым Советом РосШШЧМ "Микроб" и утверждены директором института.

2) По результатам работы разработана нормативно-техническая документация (фармакопейная статья, экспериментально-производственный регламент, инструкция по применению) на диагностический набор "Тест-система для выявления ДНК бруцелл методом ПЦР", одобренная Ученым Советом РосНИПЧИ "Микроб" а Ученым Советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Успешно пропли контроль в ГИСК им. Л.А. Тарасе-вича 3 экспериментально-производственные серии препарата и одобрена программа Госиспытаний (протокол N2 от 30 мая 1996г.) Материалы переданы на испытание в комитет МИШ.

Основные положения выносимые на защиту

1) Олигонуклеотидные праймеры, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок наружной мембраны бруцелл 31 кДа, обеспечивают специфичную детекцию в ПЦР всех видов бруцелл.

2) Одностадийная ПЦР с использованием одной пары праймерон Вги1-Вги2 и гнездовая ПЦР с использованием двух- пар праймеро* Вги1-Вги2, ВгиЗ-Вги4 позволяют обнаруживать бруцеллы с чувств;? тельностью 1х102 м.к./мл и 10 м.к./мл, соответственно.

3) Способ детекции амплифицированног'о ПЦР-продукта путем •

рздизации ампликонов с биотинилированным олигонукяеотидным зон, на фильтре или гибридизации меченых биотином ампликоков ДНК-зондом на иммунологических планшетах повышает чувс^вите. ность метода в 10 и 100 раз, соответственно.

4) Методический подход, заключающийся в совместном исполь; вании гуанидинтиоцианата и нуклеосорбента является наиболее пр тым и эффективным -для экстракции ДНК из различного биологическ материала.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации доложены:

- на Всероссийской научной конференции "Состояние и перепек еы разработки препаратов для диагностики вирусных гкпатитов и фекций, управляемых специфическими средствами профилакти (Пермь, 1993); . •

- на итоговой научной конференции РНИПЧИ "Микроб" (Са •Т0В.1994); ' •

- на I мевдународной конференции молодых ученых (Бищк 1994); "

- на межгосударственной научной конференции "Профилактика меры борьбы с чумой" (Алматы, 1994);

- на I Всероссийской научно-практической конференции "Приме ние полимеразной цепной реагщии для диагностики инфекционных болеваний. Методы лечения" (Сочи,1996);

- на международной конференции "Гомеостаз и инфекционный г цесс" (Саратов, 1996).

Основное содержание диссертационной работы отражено в 7 опуО-ованных тезисах и 1 статье.

Структура и о&ьсн диссертации

^Диссертация состоит из введения, двух глав, посвященных об-у литературы, семи глав собственных исследований, заключения, одов и библиографического указателя, включающего ссылки на 150 от, из них 94- зарубежных. Диссертация иллюстрирована 20 ри-ками и 4 таблицами. Общий объем диссертации 122 страницы.

- СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали штаммы микроорганизмов различ-родов семейства Eriterobacteriaceae: Yersinia, Salmonella, Es-ichia; семейства Vibrlonaceae рода Vibrio; а также родов Brula и Francisella. Для культивирования микроорганизмов семейс-Enterobacteriaceae использовали агар и бульои Хотткнгера или (рН 7,2). Для Vibrio cholerae щелочной агар Хоттингера (рН ). Бруцеллы выращивали на эритрит или BHI-агаре (бульоне) с авлением 1% гемолизированной крови (рН 7,2). Francisella tula-sis - на желточной среде Мак-Копя (рН 7,0). Иерсинии инкубиро-и при 28°С, прочие штаммы при 37°С.

Суммарную ДНК из бактериальных клеток выделяли модифицирован-методом фенольной экстракции (Birnboim С.H., Doly J., 1979).

Реакцию гибридизации ачплифицированной в ЩР ДНК-матрицей с меченым биотином олигонуклеотидным ДНК-зондом проводили в ускоренной модификации метода (Bellak S. and Ballagi-Pördany, 1993). Для гибридизации использовали фильтры марки "Hybond", "Biodine". Гибрздлэацию проводили з гибрид&йзере фирмы "Techne".

ДНК-ДНК гибридизацию в лунках иммунологических планшетов i иммобилизацию ЛНК-вонда в стрипах проводили модифицированным метр Испольаовали иммунологические плажзеты фирмы "Beranan".

При подборе нуклеотидного состава праймеров руководствовали« npasjn--ai.ni описанными (Lowe Т. et al, 1990) и компьютерной прог-. рда-юл "Зепе Runner".

Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25-50 мкл i микрсцеятрифушшх пробирках (500 и 1500 мкл) на программируемых термоциклерах фирм "Techne" (Англия), "Биоком" (Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ЩР С. ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРАЙМЕРОВ НА ОСНОВЕ НУКЛЕОГИДКОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА, КОДИРУКЕЕГО БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ БРУПЕЛЛ 31 кДа

На первом этапе необходимо было определить специфичную нук-еотидкуа последовательность пригодную в качестве ДНК-матрицы для ..юьоп идентификации бруцелл, позволяющей выявлять штаммы возбу-• бруцеллеза независимо от их фенотипа.

' этой целью мы остановили свой выбор на участке ДНК, содер-

;ем фрагмент гена, кодирующего белок внесшей мембран;! 31 кДа iy field J.E et al., 19S8). Данний гея отвечает га синтез одного поверхностных антигенов бруцелл, который характеризуется высо-í консервативностью (Hailing- S.M., Zehr Е.З., 1090).

Для осуществления ПИР были выбраны и проанадкзгфсеенц нес--,ько пар г.раймеров.

iapa:Bar 1-Bar2 - амг.лифицировали Фрагмент ДНК рагмерс» 200п.н., iapa:Brul-Bru2 - амплкфицировалк фрагмент ДНК расм^ссм £5Э п.н. iapa:Bru3-Bru4 - амллифицировали фрагмент ДНК размером 175 п.н.

До начала экспериментов был проведен комыстерный а:!&::яз зймерсв с помоеыо программы "Gene Runner". В целом, анализ эуктуры всех пар прапмеров показал наличие незначительного «ис-стабйдькых дилеров к их теоретическую пригодность для успешной ициация реакции амплификации.

В предварительных экспериментах, заключающихся п проведен;:;! Р с ДНК из штамма Brucella abortus 1GBA, все три пары прзймероз плифицировали соответствующий по размеру фрагмент ДНК. что так-свидетельствовало о правильном выборе олкгонукдеотидных прай-ров.

' Для оценки чувствительности ПДР со всеми парами праймеров пользовали 10-кратные разведения культуры В. abortus 19ВД т107 до 10 КОЕ/мл).

Показано, что чувствительность ПНР с праймераыи Ваг1-Баг2 рядка 100 -1000 КОЕ/мл; с праймерами Brul-Bru2 - 100 КОЕ/мл; с вймерами Bru3-Bru4 - 1000 КОЕ/мл. Наибольший выход ППР-продукта м работе с бактериальными взвесями в одностадийной ЩР отмечен праймерами Brui-Bru2. Эти праймеры, как наиболее" эффективные, ши использованы в дальнейших экспериментах при исследовании

различного материала с целью обнаружения бруцелл.

Для повышения чувствительности была использована модифика! метода с проведением в два этапа - " гнездовая" 'ЩР. Нами Э7 подход был использован также для подтверждения специфичное ЩР-продукта, фланкированного праймерами Brul-Bru2. На nepi этале добавляли лизаты клеток бруцелл, на втором этапе в нов реакционную смесь добавляли аликвоты наработанного ЩР-продукт В результате было продемонстрировано повышение чувствигельност "Гнездовая" ЩР позволяла, детектировать 10 м.к./мл бруцелл, есть увеличивала разрешающую способность метода примерно на ол порядок.

В экспериментах по проверке специфичности ЩР с праймера Brul-Bru2 тестировали 24 штамма бруцелл и 8 штаммов гетерологи ных видов. Со всеми представителями р,Brucella были получены п> ложительные результаты. Cç птаммами других групп микроорганизме; в том числе Y.enterocolitlca 0:9, S.enteritidis, дакшх наибол! часто перекрёстные серологические реакции с бруцеллезными диэи ностикумами, положительных результатов не было ни в одном случа*

Помимо этого в ЩР тестировали 14 штаммов, находящихся стадии S-R изменчивости, идентификация которых, при использован! бактериологических методов была затруднительна (предоставле! к.м.н. Балахонов C.B. из ГОИ Сибири и Дальнего Востока). Получе! ные в ЩР результаты были положительны со всеми культурами, чт свидетельствовало о пригодности' метода для детекции атипичных вг риантов бруцелл, независимо от стадии их диссоциации.

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ ПОДГОТОВЬ!

ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА В ЩР

При уже отработанных параметрах реакции, именно способ экс-эакции ДНК из клинических материалов и объекте® внешней среды :рает важную роль и определяет уровень чувствительности метода, зшей следующей задачей являлась оптимизация способов подготовки 5разцов для исследования в ЩР. В качестве опытных материалов визировали кровь, мочу, молоко и почву - объекты наиболее час) используемые при проведении анализов на бруцеллез.

Изучалась возможность исследования в ЩР нативных . образцов, юсимых непосредственно в реакционную смесь без предварительной [истки. Показано , что при внесении непосредственно в ЩР. (1-22) юви, мочи или молока, лизированных кипячением возможна детекция нсроорганизмов, но с чувствительностью не ' выше 1х106 м.к./мл (ля почвы 1х105 м.к./г).

Особое внимание в нашей работе было уделено разработке мето->в подготовки исследуемых проб, которые кроме лизиса клеток, >лхны обеспечивать очистку ДНК-матриц от нежелательных примесей концентрацию ДНК. Испытывали принципиально отличающиеся способы деления ДНК: с помощью неионных детергентов (нонидета-П40, тви-I 20, тритона Х-100) и протеиназы К; щелочной лизис в сочетании фенол-хлороформовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом; лию гуайидинтиоцианатом с сорбцией ДНК на силикагеле; отделение 'акции микробных клеток методом электрофореза в свободном потоке ИСП) с лизисом их кипячением.

• В экспериментах по сравнительной оценке различных способов

подготовки, исследуемого в ШР материача, сделаны выводы об эффективности. Показано, что при использовании метода лизиса н то!: с помоцьу неиониих детергентов и прогеиназы К возможк дез пил микробных клеток в биологическом материале с чувствите костью 1хЮэ-104 м. к./мл; с помогаю ЭССП возможно разрешение 1х104 м.к./мл; при использовании щелочного лизиса с фенол-хле формовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом чувствительнс составляет - 1х102-10э м.к./мл; методический подход основанные лизисе гуакидинтиоцианатом с одновременной сорбцией ДНК на с: кагеле обеспечивает разрешение - 1x10*'-103 м.к./мл. Наивьк уровень чувствительности был получен при использовании мето; основанных на фенол-хлороформовой экстракции и нуклеосорбции. нако, способ получения ДНК-матриц на основе фенол-хлороформ! экстракции имеет ряд недостатков - многоэтапность процесса и выаешшй риск перекрестной контаминации проб затрудняющет од ременное выполнение большого числа анализов. Наиболее оптимад и перспективным в плане практического использования представл ся подход, основанный на выделение ДНК-матрицы с помощью нук сорбции з присутствии гуанидинтиоцианата, который проще в ис нении и обеспечивает высокую степень очистки ДНК.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ДНК-ДНК ГИБРИДИЗАЦИИ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕ!

РАЗРЕШАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ АНАЛИЗА . НА ЭТАПЕ ДЕТЕКЦИИ ЩР-ПР0ДУ1'

Самым распространенным й общедоступным способом оценки зультатов ПЦР является гель-электрофорез с визуализагчей фрш тов ДНК, обработанных этидиумом бромида, в ультрафиолете. О, известно. что при низком содержании ДНК-матриц в исследуема

лале (менее 10 копий) количество наработанных специфичных амп-эпов в ходе одностадийной ПЦР недостаточно для их дезуазизасп! гарозном геле. Как уже говорилось, один из путей поззо.::-.1:'ц;ил ысить разрешение метода - проведение "гнездовой" ПЦР. Другой ь приводящий к повышению чувствительности - использование для екции ачплифицированного продукта гибридизационного анализа. Нами был сконструирован олигонуклеотидный ДНК-зонд, преде:ав-¡щий собой меченый биотипом фрагмент ДКК размером 21 нуклеотид. [-матрицы, амплифицировачные в ЩР с прапмерами Вги!-Вги2 нано-1И на фильтр и проводили гибридизации. Данный способ д»т«кц::;: )волил выявлять 10 м.к./мл, то есть обеспечивал уровень чувс-'.тельнссти аналогичный таковому при использовании „гнездовой

э

Для проведения гибридизационного анализа в имауногонрискйх аншётах попользовали в качестве зонда фрагмент ДНК размером 175 к., полученный з ПЦР с праймерами ВгиЗ— Вги-1. Зонд иммебплизо-ли в лунках иммунологического планшета. В качестве тестируемого Р-продукта добавл :ли амлликокы меченые биотипом, подученные з Р с праймерами Вгио-Вги2. Мечение осуществлялось за счет вклю-;ния бкотинилированного праймера Вги5. Гибридизации проводили с течение 30 минут. Данный способ детекции позволял выявлять 1 к./мл, то есть обеспечивал наязысшую разрешающую способность, ^достатками этого способа учета реакции являются относительная яожность методики и необходимость больного числа дополнительных ? активов, что затрудняет его использование в диагностических ла-эраториях.

АПРОБАЦИЯ ТЕСТ- СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА В КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ И МОЛОКЕ

На основе проведенных экспериментов была предложена днагнс тическая тест-система, для обнаружения возбудителя бруцеллез« клинических образцах и объектах внегшей среды. Она должна cocí ять из следующих компонентов - набора для выделения ДНК с помой нуклеосорбента и гуанидинтиоцианата, набора для проведения ПЩ праймерами Brul-Bru2. Учет реакции осуществляется метод гель-электрофореза ПЦР-продукта. Данная тест-система позвол» обнаруживать бруцеллы с чувствительностью lxlO2 - lxlO3 м.к./ь С целью повышения разрешающей способности метода предложена i полнительная пара праймеров "Tu3-8ru4 для проведения второго эт па гнездовой ЦЦР, что позволяет выявлять 10-100 м.к./мл.

Апробация созданной нами тест-системы проведена на клиниче ком материале от больных людей'и пробах молока от инфицировачи животных. Была показана принципиальная возможность обнаружен • возбудителя бруцеллеза в пробах мочи,- слюны и крови, взятых больных хроническим бруцеллезом. Продемонстрирована возможное выявления возбудителя бруцеллеза в молоке инфицированных коро 1<аке после длительного хранения в течение 11 месяцев в заыореже ном состоянии. Показа.что ПЦР не уступает по своей чувств гельности и специфичности ТИФА и аллергической пробе Бюрне превосходит такие методы как реакция Хэддельона, Райта. РПГ кольцевая реакция преципитации. ■

Таким образом, в результате проведённой нами работы был работай основанный на анализе генома бруцелл метод д-.. гекции во

дителя бруцеллеза. Предложены спосрбы подготовки исследуемого териала, обеспечивающие лизис клеток и очистку ДНК от веществ, азывающих отрицательный эффект на анализ, способы повышения вствительности и подтверждения специфичности реакции с помощью иездовой" ПЦР, способы визуализации ЩР-продукта с использова-?м ДНК-ДНК гибридизации. Показано, что тест-система для детек-л возбудителя бруцеллеза пригодна для практического использова-

ВШОЛЫ:

tsmt-OmZuBatS'BiMH

1) ПраймерыЛсконструированные на основе консервативной нук->тидной последовательности гена, кодирующего белок внешней йраны бруцелл 31 кДа обеспечивают специфичную амплификацию 1Гментов ДНК размером 269 п.н-. и 175 п.н., соответственно. Разданные оптимальные параметры ПЦР с данными праймерами позво-iT специфично детектировать микроорганизмы рода Brucella, неза-имо от стадии 3-R изменчивости.

2) Наиболее простым и эффективным способом экстракции -мишени из биологического материала, является сорбция ДНК на икагеле в. присутствии гуанидинтиоцивната. Универсальность спо-а доказана в экспериментах по детекции бруцелл в молоке, кро-

моче и почве.

3) Использование "гнездовой" ЩР с применением внутренних ймеров 8ru3-4 позволяет повысить чувствительность и детектиро-ь 10-100 м.к. бруцелл в миллилитре.

4) Применение для визуализации ПЦР-продукта метода гибриди-<и на фильтре с меченым ^иотином ДНК-зондом и гибридизации в

лунках иммунологических планшетов с иммобилизованным неме* ДНК-зсндом позволяет увеличить чувствительность ПЦР-анализа и 100 раз, соответственно.

5) Разработанная тест-система, основанная на ЩР ekje набор компонентов для выделения IHK с использованием нукле бента и гуакидинтиоционата, реактивы для проведения ЩР, к некты для детекции амплифицированкого продукта с примен электрофореза в агарозно.м геле и позволяет обнаруживать бру в биологическом материале с разрешающей способностью lxl 1х103 м.к/мл.

6) Применение метода ЩР при диагностике хронического целлеза у людей более эффективно в сравнении с серологии? методами (реакциями Хэддельсона, Райта, РИГА) и позволяет яять бруцелды в образцах крови, слюны и мочи от больных лэд

7) Полимеразная цепная реакция позволяет обнаруживать целлы в молоке инфицированных коров и показывает 100 Z совп результатов с данными полученными с помощью ИФА. Оба методе ются более информативными по сравнению с кольцевой реакцие ципктации. '

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1". Разработка подходов для детекции инфекционных агентов в крови при помощи полимеразной цепной реакции. //В сб. "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфе!щий, управляемых специфическими средствами профилактики". - Матер. Всероссийск. научн-практич. конф. - Пермь.-1993. - С.67-68. (Соавт.: Куличенко А.Н., Норкина 0.В., Тучков И.В., Куличенко М.А., Попов Ю.А., Дроздов И.Г.).

2. Способ детекции бруцелл при ■ г.омоаи полимеразной цепной реакции. '//В сб. Пробл. особо опасных инфекций. - 1994.- Саратов.-N4(74). С. 165-172. (Соавт. Куличенко А.Н., Амплеева 3.А., Попов Ю.А., Дроздов И.Г.). "

3. Применение электрофореза в свободном потоке для повышения чувствительности метода детекции микроорганизмов с использованием полимеразной цепной реакции. // В сб. Ыатер. межгосударств, ка-учн. конф. "Проф. и меры борьбы с чумой".- 1994.- Алматы. -С.99-100. (Соавт. Корсуков В.Н., Куличенко А.Н., Попов Ю.А., Дроздов И.Г.).

4. Обнаружение бруцелл при помощи полимеразной цепной реакции. //В сб. Актуальн. пробл. разработки мед. средств и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил. - Из-во Мин. обороны РФ. - 1994. - С. 131. (Соавт. Куличенко А.Н., Шпулчн Г.А., Попов Ю.А... Шипулина О.Ю., Федоров H.A.).

5. Выделение чумного и бруцеллезного микробов из' проб почвы с использованием электрофореза в свободном потоке. //В сб. Акту-

альн. пробл. проф. особо опасных и приодно-очаговых инфекекцюн-ных болезней. - Иркутск.- 1994.- С.131-132. (Соавт. Корсуков В.Н., Коровкин С.А., Полунина Т.А., Попов Ю.А., Куличенко А.Н., Дроздов И.А.).

6. Оценка различных способов подготовки проб при детекции бру-целл в молоке при помощи полимеразной цепной реакции. //В сб. Ак-туальн. вопр. проф. чумы и других инф. заболеваний. - 1994. -Ставрополь. - С. £14-216. (Соавт. Куличенко А.Н., Попов Ю.А., Корсуков В.Н.).

7. Адаптация, основанного на ПЦР, метода для детекции бруцелл при работе с биологическими образцами и объектами внешней среды. //Генетика. - 1994.- Т. 30. Прилож. - С. 101.

8. Конструирование ПЦР-тест-системы для обнаружения опасных патогенных бактерий: возбудителей чумы, бруцеллеза и сибирской язвы. //В сб. "Применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний. Методы лечения". - Матер. I Всероссийской научн.-практич. конф. - 1996.- Сочи.- С.67-70. (Соавт. Куличенко А.Н., Тучков И.В., Нрркина О.В., Ивашенцева Л.Н., Касьян И.А., Попов Ю.А., Самойлова Л.В., Дроздов И.Г.).

». -¡и/. ч.ео.