Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генная и серологическая диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлов, Александр Александрович

Перечень условных обозначений и сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы ч

1.1. Распространение бруцеллеза на территории РФ

1.2. Методы диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных

1.2.1. Серологическая диагностика бруцеллеза

1.2.2. Аллергическая диагностика бруцеллеза

1.3. Полимеразная цепная реакция 31 Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материал для исследования

2.2. Выявление ДНК бруцелл методом ПНР

2.3. Серологические методы

2.4. Статистические методы исследования

Глава 3. Применение тест-системы "Ген-Бру" для молекулярнобиологической диагностики бруцеллеза животных

3.1. Оценка эффективности ПЦР при обследовании иммунизированного крупного рогатого скота и больных бруцеллезом животных

3.2. Использование ПЦР в комплексе с серологическими реакциями (РА, РСК)

Глава 4. Оценка информативности ПЦР-анализа при исследовании различных образцов диагностического материала

4.1. Выбор диагностического материала от животных для детекции бруцелл методом ПЦР

4.2. Изучение диагностической чувствительности ПЦР при исследовании сыворотки крови и цельной крови у больных и иммунизированных против бруцеллеза животных

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генная и серологическая диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота"

Актуальность исследования.

Бруцеллез сельскохозяйственных животных широко распространен на территории нашей страны. География бруцеллеза в Российской Федерации обширна: Крайний Север, Сибирь, Дальний Восток, Ставрополье, Северный Кавказ, Нечерноземная зона, Поволжье [Урбан В.П., 1980].

В настоящее время наметилась тенденция к снижению уровня заболеваемости сельскохозяйственных животных бруцеллезом. Если в 1998 году в России неблагополучными по этой инфекции было 169 населенных пунктов (около 1,2 млн. голов скота), то к началу 2001 года зарегистрировано 72 населенных пункта (около 500 тыс. голов скота). За 2000 год удельный вес заболеваемости бруцеллезом среди крупного рогатого скота составил 4,49 %, инфекционным эпидидимитом мелкого рогатого скота (возбудитель В. ovis) - 6,19 % [Яременко Н.А., 2002]. Главную роль в улучшении эпизоотической ситуации сыграло применение методов специфической профилактики в системе мер по борьбе с бруцеллезом и, в частности, иммунизация поголовья рогатого скота вакцинными штаммами В. abortus 19, В. melitensis Rev-1, а в последующем В. abortus 82.

Несмотря на выше изложенное, на сегодняшний день 18 территорий России остаются неблагополучными по бруцеллезу крупного рогатого скота и 6 регионов по бруцеллезу мелкого рогатого скота.

Потенциально опасным с эпизоотической точки зрения может быть импорт племенного скота из ряда стран дальнего и ближнего зарубежья: Голландии, Венгрии, Армении и Прибалтийских республик и мелкого рогатого скота из Польши, США, Австралии.

Не исключена угроза распространения бруцеллеза животных с территории сопредельных государств Среднеазиатского региона и, прежде всего, Казахстана [Косилов И.А. с соавт., 1999].

Ситуация усугубляется тем, что бруцеллез наносит огромный экономический ущерб животноводству, который складывается из недополучения животноводческой продукции (утилизация поврежденных органов и тканей) и снижения ее качества, затрат на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий по ликвидации очага инфекции, яловости и абортов маточного поголовья, нарушения племенной работы из-за выбраковки ценных племенных животных.

Одним из наиболее надежных способов предупреждения энзоотий и ликвидации очагов бруцеллеза является эффективная диагностика инфекции, основанная на лабораторных методах исследования [Антонов Б.И., 1986; Наставления по диагностике бруцеллеза животных, 2000].

Поэтому актуальной задачей является разработка и внедрение усовершенствованных методов диагностики бруцеллеза, а также выбор оптимального комплекса диагностических тестов. Только в этом случае можно с большей вероятностью гарантировать выявление не только манифестных, но и латентных, стертых случаев проявления бруцеллеза, вызванных диссоциированными SR-, R-, L-формами бруцелл.

Решение подобных задач возможно благодаря использованию в ветеринарной практике новых диагностических подходов, в частности, основанного на достижениях современной молекулярной биологии и генной инженерии метода - полимеразной цепной реакции.

Этот генетический способ выявления ДНК микроорганизмов отличают - специфичность (до 100 %), высокая чувствительность - lxl 02-1x103 м.к./мл, экспрессность анализа (6-8 часов), биологическая безопасность для персонала, возможность выявления диссоциированных и L-форм бруцелл без специальной подготовки.

Вместе с тем важной проблемой для практического использования ПЦР является разработка оптимальной схемы анализа, стандартизация условий исследования, что позволяет снизить вероятность получения ложноотрицательных ответов и правильно интерпретировать полученные результаты. Для достижения максимальной эффективности ПЦР диагностики необходимо использование для анализа биологических образцов с наиболее высокой вероятностью содержания бруцелл, применение универсальных методов пробоподготовки. Важным является определение контингента животных, подлежащих исследованию в ПЦР, оценка диагностической точности применения полимеразной цепной реакции в комплексе с методами иммуноанализа, специфичности и чувствительности ПЦР-тест-систем различных производителей. Только в этом случае возможно максимальное использование высокого потенциала метода для эффективного выявления бруцелл, определение места ПЦР-анализа в системе лабораторной диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных.

Цель исследования - изучение эффективности генной и серологической диагностики бруцеллеза, разработка оптимальной схемы ПЦР-анализа при обнаружении бруцелл у сельскохозяйственных животных.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ эффективности традиционных серологических методов (РА, РСК) и ПЦР, а также оценить перспективы их комплексного применения для лабораторной диагностики бруцеллеза.

2. Оценить диагностическую точность применения тест-системы для выявления Brucella spp. методом ПЦР («Ген-Бру») производства РосНИПЧИ «Микроб» при исследовании материала полученного от животных с верифицированным диагнозом - бруцеллез.

3. Определить возможность применения родоспецифичных праймеров Bru 31-32 для анализа материала от крупного рогатого скота иммунизированного живой вакциной из штамма Бруцелла абортус № 82 в разные сроки после вакцинации.

4. Определить клинический материал для ПЦР-анализа, который обеспечивает надежное и стабильное обнаружение ДНК у сельскохозяйственных животных, больных бруцеллезом.

5. Разработать оптимальную схему выделения ДНК Brucella spp из различного биологического материала от животных при исследовании методом ПЦР.

Научная новизна. Впервые показана высокая диагностическая точность, чувствительность и специфичность тест-системы "Ген-Бру" при лабораторной диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Получены новые данные о сравнительной эффективности ПЦР и серологических методов (РА, РСК) в лабораторной диагностике бруцеллеза. Показано, что ПЦР превосходит по чувствительности РА и РСК в 2-2,4 раза. Выявлено, что наибольшая чувствительность ПЦР-анализа достигается при использовании в качестве диагностического материала образцов крови животных. Установлена возможность детекции ДНК вакцинного штамма В. abortus № 82 в поздние сроки после иммунизации, что свидетельствует о его длительной приживаемости в организме вакцинированных животных. Показано, что частота выявления ДНК бруцелл в крови коррелирует с интенсивностью инфекционного процесса.

Практическая ценность диссертации

В работе детально рассмотрены важные вопросы, касающиеся схемы ПЦР-анализа на бруцеллез у сельскохозяйственных животных. Рекомендовано использование в качестве материала для исследования кровь, применение модифицированной схемы подготовки материала для ПЦР, при анализе проб молока. Установлена возможность сочетанного применения нескольких ПЦР-тест-систем для повышения верификации анализа.

По результатам исследований составлены «Методические рекомендации по применению ПНР-анализа для лабораторной диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных», (утверждены УМС ИВМиБ протокол №16 от 6.09.02).

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы СГАУ им. Н.И. Вавилова при чтении курса дисциплины "Ветеринарная микробиология" для студентов специальности "Ветеринария".

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и доложены на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000), III общественных слушаниях «Эпидемиология инфекционных заболеваний, окружающая среда и здоровье» (Саратов, 2001), ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава СГАУ им. Н.И. Вавилова (Саратов, 1999, 2002).

Материалы работы вошли в отчеты о научно-исследовательской работе «Разработка и внедрение эффективных методов, специфических средств и интегрированной системы мероприятий по борьбе с туберкулезом и бруцеллезом в Саратовской области»

Диссертация обсуждена и одобрена на межкафедральной научной конференции СГАУ им. Н.И. Вавилова (протокол №20 от 21.06.02).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 3 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Павлов, Александр Александрович

Выводы.

1. Диагностическая чувствительность ПЦР-анализа на бруцеллез животных в 2,0-2,4 раза превышает чувствительность РА и РСК.

2. ПЦР-тест-система «Ген-Бру» может быть применена для диагностики бруцеллеза у неиммунизированных противобруцеллезными вакцинами сельскохозяйственных животных, при этом чувствительность анализа составляет 80-98 % и специфичность - 100 %.

3. Наибольшая вероятность обнаружения ДНК бруцелл методом ПЦР, при инфекционном процессе, возможна при исследовании крови больных животных. У иммунизированного поголовья вероятность обнаружения ДНК бруцелл в крови и в сыворотке крови является одинаковой.

4. С помощью ПЦР возможно выявление ДНК вакцинного штамма № 82 спустя 2 года после реиммунизации, что может свидетельствовать о его длительной приживаемости в организме привитых животных.

5. Тест-система «Ген-Бру» может быть применена для обнаружения ДНК бруцелл в молоке сельскохозяйственных животных, как метод оценки санитарного благополучия пищевых продуктов животного происхождения.

6. Показана высокая эффективность модифицированного метода выделения и очистки специфической ДНК с применением ацетона из молока крупного рогатого скота больного бруцеллезом. , ф X

Заключение

С момента открытия бруцелл Брюсом (1887) и Бангом (1897) произведено колоссальное количество исследований в разных странах и изучен широкий перечень вопросов, относящихся к бруцеллезу животных. Однако и в наши дни эта хроническая инфекционная болезнь представляет большую проблему глобального масштаба и для органов здравоохранения и для ветеринарных специалистов.

Первые сведения о бруцеллезе сельскохозяйственных животных в России относятся к 1860 году, когда в Московской губернии отмечались массовые случаи «повального выкидыша» у коров. Проведенный ретроспективный анализ имеющихся эпизоотологических данных показал, что в появлении и распространении бруцеллеза в нашей стране основную роль сыграл импорт племенного скота из стран Западной Европы -Голландии, Дании и Германии [Урбан В.П. с соавт., 1980]. Каких-либо специальных мер борьбы с бруцеллезом в то время не существовало, единственный способ диагностики - регистрация факта аборта. Примечательно, что самих животных после выкидыша считали выздоровевшими.

В настоящее время бруцеллез сельскохозяйственных животных на территории РФ распространен почти повсеместно. Очаги бруцеллеза регистрируются на Крайнем Севере, в зоне промышленного оленеводства [Калиновский А.И. с соавт., 1997], в Нечерноземье, Сибире, Дальнем Востоке, Поволжье и юге России [Димов С.К., 1980; Желудков М.М. с соавт., 1997]. Спектр возбудителей энзоотий бруцеллеза, протекающих в данных регионах, представлен В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. ovis и в отдельных случаях В. canis.

Основу борьбы с бруцеллезом составляют плановые предупредительно-профилактические мероприятия. Их важными составляющими являются лабораторные методы диагностики инфекции и контроля эпизоотического статуса поголовья. Поэтому успех в ликвидации очага бруцеллеза во многом определяется качеством применяемых диагностических тестов, главными критериями которых являются специфичность, высокая чувствительность и эффективность. Строгое соблюдение этих условий может гарантировать выявление всех инфицированных животных. К сожалению, в арсенале ветеринарных лабораторий на данный момент нет таких методов, которые бы в полной мере сочетали в себе приведенные выше требования. Это объясняется многими факторами и, прежде всего, принципиальными особенностями применяемых диагностических подходов, ограничивающими их возможности, а также чрезвычайной «пластичностью» возбудителя (наличие S-, R-, SR-, L-, М-форм), медленным ростом на питательных средах, перекрестными серологическими реакциями с большим количеством микроорганизмов [Вершилова П.А., 1972; Триленко П.А., 1980; Соколова Е.Е., 1986].

В последнее время наблюдается интенсивное развитие ДНК-технологий, объективными причинами которого стали революционные открытия в области молекулярной биологии и генной инженерии (Стент Г., 1974). Это обусловило возникновение нового направления в лабораторной методологии - генодиагностики инфекционных болезней. Принцип генетической диагностики заключается в определении различными способами специфичного для искомого микроорганизма участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Основными направлениями генодиагностики являются ДНК-зондирование и методы амплификации нуклеиновых кислот.

Наибольшее распространение из них получила полимеразная цепная реакция. Техника постановки ПЦР относительно доступна и вместе с тем обеспечивает достаточно высокие эффективность, специфичность и чувствительность анализа. Продолжительное время ПЦР оставалась прерогативой научно-исследовательских лабораторий и институтов.

Применение этого метода в ветеринарной практике носило единичный характер [Шумилов К.В. с соавт., 1996]. В 1995 году ситуация коренным образом изменилась с выходом приказа МСХ и П № 350, направленного на интенсивное внедрение ПЦР в ветеринарию.

На данный момент полимеразная цепная реакция разработана для детекции у животных Mycobacterium spp., Chlamidia spp., Salmonella, Listeria monocytogenes, Y. enterocolitica, Micoplasma spp., Campilobacter jejuni, Lyssavirus и в том числе для обнаружения Brucella spp. Применение ПЦР позволило обеспечить эффективную детекцию бруцелл с чувствительностью 1х102-1х103 м.к./мл в различном материале, независимо от степени диссоциации возбудителя, а также исключить ложноположительные результаты реакции в присутствии Y. enterocolitica 0:9, Е. coli 0:157 и других микроорганизмов, имеющих общие с бруцеллами антигенные детерминанты.

Наиболее перспективной нуклеотидной последовательностью для конструирования ПЦР-тест-систем в целях детекции бруцелл является ген, кодирующий белок наружной мембраны молекулярной массой 31 кДа. Примером использования выше названной последовательности в качестве ДНК-мишени является ПЦР-тест-система для выявления Brucella spp. («Ген-Бру»), которая была разработана в РосНИПЧИ «Микроб». Тест-система включает амплификацию специфичного фрагмента ДНК размером 175 п.н. двумя парами праймеров (Bru 31- Bru 32, Bru 3 - Bru 4) по типу nested-ПЦР. Универсальный способ выделения ДНК гуанидинтиоционатом, сочетающий нуклеосорбцию на силикагеле, позволяет исследовать разнообразный клинический материал, пищевые продукты и объекты внешней среды.

Было целесообразно определить возможность применения данной тест-системы в ветеринарии. Нами были проведены исследования, которые показали возможность выявления ДНК бруцелл в образцах крови инфицированных животных с высокой чувствительностью - 98 %. Данные специальной литературы свидетельствуют, что при анализе на бруцеллез в ПЦР возможно исследовать различный клинический материал: кровь [Гаранина С.Б., 1996; Matar G.M. et al., 1996; Quepo-Ortuino M.I. et al., 1997; Sifuentes-Ricon A.M. et al., 1997], мочу, слюну [Гаранина С.Б. 1996], молоко [Leal-Klevezas et al., 1995], суспензии внутренних органов (печень, селезенка, лимфатические узлы) животных [Шумилов К.В. с соавт., 1996], а также содержимое брюшной полости, желудка, бурс и гигром, плаценту и плодовые оболочки после аборта [Наставление, 2000].

Сравнительный анализ диагностической ценности для ПЦР различных образцов клинического материала от больных бруцеллезом людей (кровь, моча, слюна, сыворотка крови), проведенный Дентовской С.В. [2000], показал, что наибольшей эффективностью обладает кровь (образование специфичного продукта ПЦР наблюдалось в 87,2 % случаев). Отмечено, что наличие и количество инфекта в той или иной биологической жидкости или ткани не одинаково и напрямую связано с клинической формой течения бруцеллезной инфекции [Вершилова П.А., 1972, 1974].

Определение диагностической ценности отдельного биологического материала для ПЦР при анализе на бруцеллез является важным и при обследовании животных.

Известно, что у большинства инфицированного поголовья бруцеллез протекает в первично-хронической форме [Юсковец М.К., 1960; Наставление по диагностике бруцеллеза, 2000], нередки случаи стертой и бессимптомной инфекции [Косилов И.А., Дегтяренко Л.В., 1980]. Эти обстоятельства в значительной мере повышают актуальность проблемы выбора биологического материала для ПЦР.

Для изучения этого вопроса нами был проведен сравнительный анализ, определяющий частоту обнаружения специфической ДНК в различных клинических образцах. Спектр анализируемых проб мы ограничили кровью, молоком, цервикальной слизью от инфицированного крупного рогатого скота. При исследовании проб молока с целью повышения эффективности ПЦР- анализа впервые у естественно инфицированных животных применили модифицированный метод выделения и очистки ДНК, который заключался в дополнительной обработке ацетоном осадка нуклеосорбента, содержащего нуклеиновую кислоту. Результаты показали очевидное превосходство при исследовании цельной крови (80 % положительных результатов) над остальным материалом (молоко - 30 %, цервикальная слизь - 5 %). Таким образом, данные наших исследований позволяют утверждать, что кровь инфицированного крупного рогатого скота обеспечивает надежное и стабильное обнаружение бруцелл. Именно этот материал является наиболее предпочтительным для ПЦР-анализа на бруцеллез. Отрицательные результаты ПЦР при исследовании молока и цервикальной слизи не позволяют исключить бруцеллезной инфекции.

Альтернативным диагностическим материалом на ряду с выше описанными может служить сыворотка крови. Необходимость использования для ПЦР-анализа сыворотки крови может быть продиктована отсутствием в присланном материале для исследования цельной крови, целесообразностью удаления ингибиторов ПЦР (гем, тотальная ДНК), что возможно при получении сывороток.

Наличие ДНК-бруцелл в образцах сывороток крови можно объяснить «свободной» внеклеточной фазой существования бруцелл [Григорьева Г.И. с соавт., 1998], а также присутствием лейкоцитов (если при получении отсутствовал этап центрифугирования), в цитоплазме которых могут находиться данные микроорганизмы. Тем не менее, при анализе в ПЦР сывороток крови от инфицированных крупного рогатого скота и морских свинок мы наблюдали образование специфичного продукта реакции в 10,9 % и 12,5 % случаев соответственно. Однако при сравнении с результатами исследования крови, частота выявления ДНК бруцелл в последней была в 7 раз выше, чем при анализе сывороток.

Огромный интерес для ветеринарных специалистов представляют исследования направленные на решение проблемы дифференциации иммунизированных живыми противобруцеллезными вакцинами (из штамма № 82 и др.) животных от естественно инфицированных, так как применяемые в данный момент иммунобиологические методы в большинстве своем не дают такой информации. Ситуация несколько изменилась с внедрением в практику реакции иммунной диффузии (РИД) с О-ПС антигеном. Но эффективность этого метода к сожалению оказалась ниже таковой, чем у комплекса РА и РСК.

Учитывая выше изложенное, нами были проведены исследования, определяющие возможность применения тест-системы «Ген-Бру» при обследовании вакцинированного против бруцеллеза поголовья. Установлено, что ДНК бруцелл при анализе в ПЦР крови иммунизированных животных выявляется на всем протяжении времени от первичной вакцинации (в 18,7 %) и спустя 2 года после ревакцинации (в 10 % случаев). Наибольшая частота положительных результатов ПЦР отмечалась через 25 суток после введения вакцины (1 вакцинация - 42,8 %, 2 вакцинация - 55,5 %). Полученные в ходе этого исследования данные полностью совпадают с наблюдениями некоторых авторов [Падалица А.Г., 1983; Муллакаев О.Т. с соавт., 2001], которые отмечали возможность длительной персистенции диссоциированных вакцинных штаммов, в том числе и шт. № 82.

Для установления с помощью ПЦР возможных различий между инфекционным и иммунным процессами провели анализ крови и сыворотки крови на наличие ДНК бруцелл от зараженных B.melitensis шт. № 565 и привитых В.abortus шт. № 82 морских свинок. Материал исследовали на 25 сутки, с расчетом на то, что в эти сроки вероятнее всего наступит генерализованная инфекция (в первом случае) и явление бактериемии (в обоих случаях) [Здродовский П.Ф., 1948; Вершилова П.А. с соавт., 1974].

Сопоставление результатов ПЦР-анализа крови и сыворотки крови от двух групп животных показало, что, во-первых, исследование крови было предпочтительным при инфекционном процессе (87,5 % положительных проб), а при иммунной перестройке статистически достоверной разницы в вероятности обнаружения ДНК бруцелл в крови и сыворотки крови не установлено (21,4 % и 35,7 %( соответственно). Во- Л вторых, частота обнаружения специфической ДНК в крови инфицированных животных оказалась в 4 раза выше, чем у иммунизированных морских свинок. Это может отражать интенсивность процесса взаимоотношений макро- и микроорганизма. Наиболее динамично, как правило, развивается процесс инфицирования организма.

Таким образом, уровень распределения ДНК бруцелл вирулентного и вакцинного штаммов в компонентах крови отражает степень завершения фагоцитоза. Как известно, при инфекционном процессе, вызванном бруцеллами, имеет место незавершенный фагоцитоз [Вершилова П.А. с соавт., 1974]. Это означает, что основная масса бруцелл будет находиться в полиморфноядерных лейкоцитах и нейтрофилах, следовательно и наивысшая результативность ПЦР будет наблюдаться при исследовании материала, богатого этими клеточными элементами (в данном случае -крови). При попадании в организм слабовирулентных и вакцинных штаммов бруцелл фагоцитоз обычно завершается лизисом микробных клеток. Поэтому основная масса бруцелл в этом случае будет находиться в свободном состоянии, а в фагоцитах - лишь остаточное количество еще не разрушенных клеток. На первый взгляд это обстоятельство должно обусловливать высокую диагностическую ценность сыворотки крови по , сравнению с цельной кровью. На самом деле результаты наших , исследований показали, сыворотка крови и кровь иммунизированных морских свинок при ПЦР-анализе были равнозначны, поскольку сыворотка является одним из компонентов крови. Именно ее наличие и определило выявление в большинстве случаев ДНК бруцелл в крови.

Это еще раз доказывает факт «универсальности» образцов крови как диагностического материала. Уровень распределения ДНК бруцелл, выявляемый в ПЦР, косвенно свидетельствует о завершении фагоцитоза, а определение частоты выявления специфического фрагмента в реакции при исследовании крови показывает интенсивность инфекционного процесса.

Полученные таким образом данные могут быть использованы при интерпретации результатов ПЦР-анализа и разработке схемы дифференциации поствакцинального процесса от инфекции.

Для определения диагностической точности ПЦР в общей схеме лабораторной диагностики бруцеллеза животных было актуальным сравнить эффективность тест-системы «Ген-Бру» и традиционных методов иммуноанализа (РА, РСК). С этой целью мы провели исследования 110 сывороток крови, полученных от не иммунизированного противобру-целлезными вакцинами крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. Наибольшее количество животных больных бруцеллезом выявлено в ПЦР - 12 (10,9 %). Данные РА и РСК полностью совпадали с результатами в ПЦР, в то время, как применение ПЦР позволило обнаружить дополнительно 6 (50 %) инфицированных животных.

Таким образом, проведенный сравнительный анализ диагностической точности методов позволяет сделать вывод о том, что ПНР-анализ является эффективным методом лабораторной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота. Применение ПЦР позволяет выявлять в 2 раза больше больных бруцеллезом животных, чем комплекс РА и РСК. При использовании в ПЦР-анализе тест-системы «Ген-Бру» (РосНИПЧИ «Микроб») вместе с аналогичной «Ампли-Сенс-100» (ЦНИИЭ) продемонстрирована высокая специфичность (100 %) и одинаковая чувствительность обоих тест-систем, которая при исследовании чистой культуры В. abortus шт. № 19 составила 1х102 м.к./мл, а при анализе образцов крови больных бруцеллезом животных значения этого показателя достоверно не различались и составляли в «Ген-Бру» - 80,0 %, в «АмплиСенс-100» - 85,0 %.

Данные обстоятельства указывают на возможность комплексного применения обоих тест-систем для повышения вероятности обнаружения бруцелл при расшифровке сложных случаев в ПЦР-диагностике, вызванных возможной делецией или точковой мутацией в нуклеотидной последо-вательности ДНК-мишени.

Конец XX столетия ознаменовался стремительными темпами научно-технического прогресса во многих областях естествознания и в том числе в биологии. Одним из следствий этого явились разработка и внедрение в клиническую практику молекулярно-биологических методов исследования. Технология амплификации нуклеиновых кислот и, в первую очередь, ПЦР позволили поднять на качественно новый уровень диагностику многих инфекционных заболеваний.

Применение ПЦР-анализа для выявления бруцелл позволило разрешить такие проблемы, как обнаружение измененных форм возбудителя (SR-, R-, L-клеток), исключение перекрестных реакций с другими микроорганизмами, повышение чувствительности анализа до 1x102-1 х 103 м.к./мл и сокращение его сроков до 8 часов. Это значительно расширило возможности ветеринарных специалистов в выявлении всех больных бруцеллезом животных, что является залогом для оздоровления неблагополучных стад и успешной ликвидации очагов инфекции.

Исследования, проведенные в данной научной работе, позволили получить новые сведения о схеме ПЦР-анализа на бруцеллез при обследовании животноводческих хозяйств с различным эпизоотологическим статусом, изучить динамику циркуляции специфической ДНК при иммунном процессе, определить диагностическую ценность различного биологического материала, грамотно и рационально использовать преимущества генной диагностики перед другими методами.

84

В настоящее время перед генодиагностикой стоят важные задачи по ДНК-типированию бруцелл и дифференциации вирулентных и вакцинных штаммов. Решение перечисленных проблем - дело будущих исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлов, Александр Александрович, Саратов

1. Абдулин Х.Х. Серологическая диагностика бруцеллеза и пути повышения ее эффективности //Научные труды КазНИВИ., Казань, 1980.-Т. 135. -С.16-20.

2. Абузаров Ю.Ш., Латыпов Д.Г. Факторы, определяющие явление серопозитивности у животных, привитых противобруцеллезной вакциной из шт. 82 // Научные труды Казанского государственного ветеринарного института им. Н.Э Баумана. 1980. - Т. 135. - С. 90-91.

3. Абуталитов А.А. Изучение диагностической ценности реакции иммунофлуоресценции при бруцеллезе животных: Автореф. дисс. канд. вет. наук. Алма-Ата, 1983. - 24 с.

4. Альтон Дж., Джонс Л.М. Методы лабораторных исследований по бруцеллезу. ВОЗ. Женева, 1968. С. 20-25.

5. Антонов Б.И. Лабораторные исследования в ветеринарии. М.: Агропромиздат, 1986. -265 с.

6. Антонов Б.И., Шумилов К.В., Скляров О.Д., Селезнев Н.А., Чурилов А.А. Воробьев В.И., Чекишев В.М. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) с О-ПС антигеном ИЭВС и ДВ при диагностике бруцеллеза кр. рог. скота //Ветеринария. 1994. - № 11 - С.

7. Арбулиева Е.А. Клинико-патогенетическое значение инфекционной антигенемии при различных формах бруцеллеза. Автореф. дисс. канд. мед. наук. - М., 1985. - 21 с.

8. Бажин М. А. Иммунологическая память и толерантность у телят при бруцеллезе // Ветеринария . 1984. - № 1 - С. 29-30.

9. Базанова Е.А. Лямперт И.М. Выделение макрофагами цитотоксина при гиперчувствительности замедленного типа к антигенам микроорганизмов // Иммунология. 1983. - № 1. - С. 52-55.

10. Базиков И.А. Бондаренко А.И. Ультраструктура L-форм бруцелл и культур-ревертантов //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1991. - № 1. - С. 17-20.

11. Беклемишев Н.Д. Инфекционная аллергия. Алма-ата, 1968. - 374 с.

12. Белоусов Е.С., Ощепков В.Г. Иммуноферментный метод для диагностики бруцеллеза КРС // Сельскохозяйственная биология. -1986.-№ И.-С. 122-132,

13. Белохвостов А. С. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1995. - № 2. - С. 21-26.

14. Бельченко В.Б. РНГА для диагностики бруцеллеза телят // Ветеринария. 1973. - № 1. - С. 16-19.

15. Бельченко В.Б., Сайдашева С.Е. Роз-бенгал проба при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана. 1980. - № 4. - С. 66-68.

16. Вагина Л.А. Диагностика бруцеллеза северных оленей методом иммунофлуоресценции // Ветеринария. 1972. - № 1. С. 14-17.

17. Вартапетян А. Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная биология. 1991. - Т. 25. - № 4. - С. 926-935.

18. Вершилова П.А. Бруцеллез. Изд. 2-е. М.: Медицина. 1972. - 440 с.

19. Вершилова П.А., Чернышева М.И. Применение реакции пассивной гемагглютинации для диагностики бруцеллеза у людей и животных в СССР // Бюллетень ВОЗ. 1975. - 51. - № 2.

20. Вершилова П.А., Чернышева М.И., Князева Э.Н. Патогенез и иммунология бруцеллеза (экспериментальные данные). М.: Медицина. - 1974. - 272 с.

21. Гаранина С. Б. Конструирование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллеза: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1996. - 20 с.

22. Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., Петухова О.С., Коха A.M., Алексеева JI.A. Методические рекомендации по обнаружению возбудителя бруцел-леза иммуноэритроадсорбционным методом. -Иркутск, 1988. 7 с.

23. Гольцов А.С. Аллергическая проба для эпизоотической оценки нетелей иммунизированных вакциной из штамма 82 // Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Сб. научных трудов ВНИИБТЖ. -Омск, 1989.-С. 112-114.

24. Гордиенко С.М. Гиперчувствительность замедленного типа и неспецифический клеточный иммунитет. Роль моно- и полинуклеарных фагоцитов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1986. - № 3. - С. 51-61.

25. Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Антигенная структура бруцелл //Успехи современной биологии. 1991. - Т. 111, Вып. 6. - С. 890-904.

26. Григорьева Г.И., Сочнев В.В., Бацанов Н.П., Филиппов Н.В. Бруцеллы и бруцеллез. Микробиология, иммунология и биотехнология. Н. Новгород. - 1998. - 245 с.

27. Дегтяренко JI.B., Павлова И.П., Разницина Г.В. Результаты изучения реакции иммунофлуоресценции при диагностике диссоциированных форм бруцелл // Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Сб. научных трудов ВНИИБТЖ. Омск, 1989. - С. 52-55.

28. Деитовская С.В. Бруцеллез в Саратовской области клинико-эпидемиологические аспекты совершенствования лабораторной диагностики: Автореф. Дис. канд. мед. наук. Саратов, 2000. - 22 с.

29. Дентовская С. В., Куличенко А. Н. Генотипорование бруцелл.// Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2000. - С. 133-137.

30. Димов С.К. Аллергическая диагностика инфекционного эпидидимита баранов: Автореф. Дис. канд. вет. наук. Новосибирск, 1980. - 18 с.

31. Желудков М. М., Чернышева М. И. Использование аллерготеста in vitro для дифференциальной диагностике бруцеллеза и иерсиниоза у людей // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1985.-№2. С. 92-95.

32. Желудков М.М. Характеристика специфических антител и иммунологических реакций к перекрестнореагирующим антигенам. (Y. enterocolitica 0:9): Автореф. дисс. канд. мед. наук. М., 1983. -22 с.

33. Желудков М.М., Кулаков Ю.К. Использование в иммуноферментном анализе белковых антигенов бруцелл, синтезированных в клетках Escherichia coli //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1998. - № 5. - С. 74-77.

34. Желудков М.М., Маликов В.Е., Таран И.Ф. Бруцеллез в Российской Федерации //Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 1997. - Т. 1 -С. 73-74.

35. Загоскина Т.Ю. Полисахаридсодержащие антигены бруцелл и новые высокочувствительные методы их обнаружения: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1990. - 20 с.

36. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Алексеева JI.A. Методические рекомендации по обнаружению антигенов бруцелл с использованием антител, меченных частицами коллоидного золота. -Иркутск, 1996. 7 с.

37. Загоскина Т.Ю., Меринов С.П. Характеристика рутинных методов выявления антигенов бруцелл // Журнал инфекционной патологии. -1998.-Т. 5, №4.-С. 12-17.

38. Здродовский П.Ф. Бруцеллез. М., 1948. - 230 с.

39. Здродовский П.Ф. Бруцеллез. М.: АМН СССР, 1953. - 320 с.

40. Зыкин Л.Ф., Васильев Д.А. L-формы возбудителей зооантропонозов. -Ульяновск, 2000. 68 с.

41. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций. Саратов: издательство СГУ им. Н.И. Чернышевского, 1993. - 112 с.

42. Иванов М.М. Диагностика и борьба с бруцеллезом // Научные труды ГНКИ.- 1975.-21.-С. 125-134.

43. Кайтмазова Е.И., Чернышева М.И. Лабораторная диагностика бруцеллеза //Бруцеллез: под ред. П.А. Вершиловой, 2-е изд-е. М.: Медицина, 1972.-242 с.

44. Кайтманов И.И., Островская Н.И. К вопросу о характеристике бруцелл, выделенных на территории СССР // Микробиология. 1966. - № 1. - С. 12-16.

45. Карпова Т.А., Объедков Г.А. Об аллергическом лейкоцитозе при бруцеллезе крупного рогатого скота // Достижения ветеринарной науки и передового опыта животноводству: Межведомственный сборник. - Минск, 1974. - Вып. 1. - С. 20-23.

46. Касьянов А.И. Аллергический метод диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных //Научные труды ВИЭВ. 1979. -49.-С. 114-122.

47. Касьянов А.И. Значение аллергической диагностики при исследовании крупного рогатого скота на бруцеллез в свежезараженных стадах //Научные труды ВИЭВ. 1974. - 42. - С. 269-273.

48. Касьянов А.И., Дуранов B.C. Бруцеллин ВИЭВ при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота // Научные труды ВИЭВ. -1984. 61. - С.26-29.

49. Коротков В.Б. Пути совершенствования эпидемиологического надзора за зоонозными инфекциями: Автореф. дис. докт. мед. наук. М., 1998.-30 с.

50. Косилов И.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. -Новосибирск, 1992. 259 с.

51. Косилов И.А., Аракелян П.К., Димов С.К., Хлыстунов А.Г. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Новосибирск, 1999. - 342 с.

52. Куличенко А.Н. Конструирование молекулярно-генетических систем детекции возбудителей ООИ: чумы, бруцеллеза, сибирской язвы: Автореф. дисс. докт. мед. наук. Саратов, 1995. - 38 с.

53. Лукашев И.И. Частная эпизоотология. М.: Гос. изд-во сельскохозяйственной лит-ры. 1961. - С. 32-37.

54. Маматова З.Б., Искандеров М.И. Иммуноферментный анализ для выявления бруцеллезных антигенов // Ветеринария. 1987. - № 4. - С. 26-27.

55. Маскаев Н.Н. Изучение схем иммунизации противобруцеллезными вакцинами // Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Сб. научных трудов ВНИИБТЖ. Омск, 1989. - С. 20-26.

56. Мельниченко В.И., Артюхин С.К., Фомин Б.А. Идентификация Л-форм бруцелл реакцией ДНК-ДНК гибридизации // Бюллетень ВИЭВ. М., 1987. - Вып. 64. - С. 75-79.

57. Наставления по диагностике бруцеллеза животных. М.: ФГНУ "Росинформагротех". - 2000. - 92 с.

58. Нуратинов Р.А., Ургуев К.Р. , Юсупов О.Ю., Нажалов М.И. Серологическая диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота // Ветеринария. 1993. - № 2. - С. 25-28.

59. Объедков Г.А. Основные достижения в изучении патогенеза бруцеллеза, совершенствования его диагностика // Совершенствование систем и методов в борьбе с бруцеллезом и туберкулезом животных. Новосибирск, 1987. - С. 7-12.

60. Островская Н.Н. Микробиология бруцеллеза // Бруцеллез: под. ред. П. А. Вершиловой, 2е изд-е М.: Медицина, 1972 С. 43-105.

61. Ощепков В. Г., Гордиенко А. Н. Свойства L-вариантов, полученных из S и R вариантов В. abortus под действием пенициллина // Диагностика, патогенез и лечение инфекционных и инвазионных заболеваний с/х животных. - Омск, 1984 - С. 60-64.

62. Падалица А. Г. Противоэпизоотическая эффективность вакцины из штамма Br. abortus № 82: Автореф. дис. канд. вет. наук. -Новосибирск, 1983. 20 с.

63. Панкратов С. А., Стуказова Е. Ю. Динамика поствакцинальных реакций у крупного рогатого скота после применения противобруцеллезных вакцин // Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Сб. научных трудов ВНИИБТЖ. Омск, 1989 - С.90-92.

64. Первушин Б. П. Лабораторные методы диагностики бруцеллеза // Бруцеллез: под. ред. X. С. Котляровой. Свердловск, 1947. - С. 71-91

65. Переходова С. К., Пацула Ю. И. Динамика формирования иммунных реакций к бруцеллезному антигену у мышей // Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Сб. научных трудов ВНИИБТЖ. -Омск, 1989. С. 62-68.

66. Пинигин А. Ф. Бруцеллез северных оленей. Иркутск, 1971. - 199 с.

67. Пинигин А. Ф., Петухова О. С., Донская Д. Н. Проблема изменчивости бруцелл и перспективы ее изучения. // Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций: Тезисы докладов научной конференции. Иркутск, 1984. - Ч. И. - С. 93-95

68. Плотникова Э. М. Оценка эффективности иммунологических тест-систем при бруцеллезной инфекции животных // Материалы научно-практической конференции. Казань, 2001. - Часть I - С. 66-68.

69. Подунова А. Г., Котова Е. А., Жилина Н. Я., Пургаев Е. И. Состояние инфекционной заболеваемости в 1993 г. // Информационный бюллетень "Об инфекционных и паразитарных заболеваниях в Российской Федерации за 1993 год". М., 1994. - С. 5-19.

70. Придыбайло Н. Д. Иммунодефицита у сельскохозяйственных животных и птиц, профилактика и лечение их иммуномодуляторами. -М., 1991-156 с.

71. Ромахов В. А. Реакция непрямой гемагглютинации и реакция нейтрализации антител при диагностике инфекционной эпидидимитабаранов // Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных: Труды ВИЭВ. М., 1978. - Т. 47. - С. 46-83.

72. Салмаков К. М. К вопросу изыскания новых вакцинных штаммов бруцелл: Автореф. дисс. канд. вет. наук. Казань, 1964. -20 е.

73. Саркисян Т. Е. Разработка методов дифференциации больных бруцеллезом крупного рогатого скота от сохраняющего в крови антитела в связи с иммунизацией вакциной из шт. 19: Автореф. дисс. канд. вет. наук. Ереван, 1969. - 20 с.

74. Сепетлиев Д. Статистические методы в научных медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1968. - 420 е.

75. Соколова Е. Е. Изучение перекрестных серологических реакций, вызванных Y. enterocolitica серовара 09 и бруцеллами: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1986. - 22с.

76. Стент Г. Молекулярная генетика. М.: "Мир", 1974. - 531 с.

77. Таран И. Ф., Лямкин Г. И. Бруцеллез. Ставрополь, 1996. - 176 с.

78. Таран И. Ф., Цибин Б. П., Крылова А. А. Изучение L-форм бруцелл, их ревертантов и исходных культур // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1981. - № 6. - С. 39-43.

79. Таршис М. Г. Эпизоотологический прогноз и противоэпизоотический план. М.: Россельхозиздат. - 1979. - 112 с.

80. Толмачева Т. А., Кац Л. М. Биологические свойства и ультраструктура бруцелл в процессе L-трансформации и реверсии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1977. - № 1.-90-95с.

81. Триленко П. А., Гиндзбург В. 3., Огородникова Т. Н. Инфекционный эпидидимит баранов, вызываемой Br. ovis // Ветеринария. 1968. - № 10.-С. 40-43.

82. Триленко П. А., Орлов Е. С., Передерсов Н. И. и др. Инфекционный эпидидимит баранов // Ветеринария. 1970. - № 7. - С. 51-54.

83. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Л.: Колос. - 1976.-280 с.

84. Урбан В. П. Краевая эпизоотология Нечерноземной зоны РСФСР. М.:"Колос". 1980. - С. 66-75.

85. Федоров Н. А., Суханов Ю. С. , Асади Мобархан А. X., Артемьев М. И. Полимеразная цепная реакция. М.:"Мила", 1996 - 34 с.

86. Хаиров Г. С. Сравнение чувствительности РПГА с РА, РСК, РБП // Новые методы диагностики зоонозных инфекций. Минск, 1982 - С. 105-114.

87. Хамзин К. А., Фомин А. М. Приживаемость бруцелл вакцинного штамма 82 в организме морских свинок // Применение вакцины против бруцеллеза сельскохозяйственных животных: Научные труды КГВИ им Н. Э. Баумана. Казань, 1980. - Т. 135. - С.119-123

88. Хотько Н. И., Величко JL Н. К эпидемиологии бруцеллеза в Поволжье и на Урале // Современные аспекты профилактики зоонозов: Тезисы докладов научной конф. Иркутск, 1984. - С. 122-124.

89. Цирельсон Л. Е. Феномен бластной трансформации при бруцеллезе // Антропозоонозы в Казахстане. Алма-ата. - 1975. - С. 163-169.

90. Шарова И. Н. Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 2001. - 20 с.

91. Шестопалов М. Ю. Практические аспекты использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике бруцеллеза: Автореф. дис. канд. мед. наук. Иркутск, 1999. - 22 с.

92. Шумилов К. В., Скляров О. Д., Обухов И. JL, Груздев К. Н., Шипулин Г. А., Шипулина О. Ю. Идентификация бруцелл методомполимеразной цепной реакции (ПЦР) // Ветеринария. 1996. - № 12. -С. 19-23.

93. Юсковец М. К. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. М.: Изд-во сельскохоз. лит-ры. - 1960. - 490 с.

94. Яковлев А. Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин В. С. Иммуноферментный анализ в микробиологии. Саратов: Изд-во СГУ, 1990. - С. 75-80.

95. Яременко Н. А. Эпизоотическая ситуация в мире и Российской Федерации в 2000-2001. М. - 2002. - С. 24-29.

96. Allen R.C., Graves G., Budowle В. Polymerase chain reaction amplifification prodacts on rehydratable polyacrilamid gels and stained with silver.// BioTechnicues. 1989. - V. 7. - P. 736-744.

97. Baily G.G., Krahn I.B., Drasar B.S., Stoker N.G. Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification // J. Trop. Med. Hyg. 1992. - V. 95. - № 4. - P. 271-275.

98. Bhongbhibhat N., Elberg S., Chen T. Characterisation of Brucella skin test antigens // J. Infect. Dis. 1970. - V. 122. - P. 70-82.

99. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. - V.28. - P. 495.

100. Bricker B.J., Hailing S.M. Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR // J. Clin. Microbiol.- 1994.- V. 32.- P. 2660-2666.

101. Burstain J.M., Grimprel E., Lukenhart S.A. et al. Sensetive detection of Treponema pallidum by using the polimerase chain reaction // . Clin. Microbiol. 1991. - V.29. - № 1. - P. 62-69.

102. Caroff M., Bundle D.R., Perry M.B., Cherwonogrodzky J.M. Antigenic S-type lipopolysaecharide of Brucella abortus 1119-3 // Infect. Immun. -1984.-46.-P. 384-388.

103. Chappel R.J., Hayes J., Brain G.J., Narght D.S. A modified radioimmunoassay for antibodies against Brucella abortus // J. Hygiene. -1982.-V. 88.-P. 1-9.

104. Chernysheva M.I., Rakhimbaeva R.A., Zheludkov M.M. Detection of allergy in vitro in Brucellosis patients // 3rd Intern. Symp. on Brucellosis, Algiers, Algeria, 1988, Develop. Biol. Standard. Basel: S. Karger. 1984. -56.-P. 385.

105. Chukwu C.C. Comparison of the brucellin skin test with the lymphocyte transformation test in bovin brucellosis // J. Hygiene. 1986. - 96. - № 3. -P.403-413.

106. Cloeckert A., Salih-Alj Debarrh H., Zygmunt M.S., Dubray G. Polimorphism at the dnaK locus of Brucella species and identification of a Brucella melitensis species-specific marker // J. Med. Microbiol. 1996. -V. 45. - №3. - P. 200-213.

107. Corbel M.J. Brucellosis: an overview // Emerg. Infect. Dis. 1997. - V. 3. -№ 2.-P. 213-221.

108. Fekete A.,. Bantle J.A, Hailing S.M., Stich R.W. Amplification fragment length polimorphism in Brucella strains by use of polimerase shain reaction with arbitrary primers // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - № 23. - P. 77787783.

109. Fluit A.C., Widjojatmodjo M.N., Box A.T.A. и др. Rapid detection of salmonellae in poultry with the magnetic immuno-polymerase chain reaction assay. // Appl.Environ.Microbiol.- 1993.- V.59.- P.1342-1346.

110. Francel G., Riley L., Giron J.A. и др. Detection of Shigella in feces using DNA amplification. // J. Jnfect. Diseases. 1990.

111. Lamb V.L. Jones L.M. Schurig G.G., Berman D.T. Enzyme linked immunosorbent Assay for Bovin immunoglobulin Subclass Specific

112. Response to Brucella abortus Lipopolysaccharides // Infect, and Immun. 1979. -V. 26. - №1. - P. 240-247.

113. Leal-Klevezas D.S., Lopes-Merino A., Martinez-Soriano J.P. Molecular detection of Brucella spp.: rapid identification of Brucella abortus bv 1 using PCR // Arch. Med. Res. 1995. - V.26. - P.263-267.

114. Leong D., Diaz R., Wilson J.B. Identification of the toxic component of Brucella abortus endotoxin and it labeling with radioactive chromate //J. Bacteriol. 1968. - V. 95. - № 2. - P. 612-617.

115. Lindberg A.A., Haeggman S., Karlson K., Carlssson H.E., Mais N.S. Enzyme immunoassay of the antibody response to Brucella and Yersinia enterocolitica 09 infection in humans // J. Hyg. 1982. - 88. - № 2. - P. 295-307.

116. Lugtenberg R. Structure and Function of outer membrane proteins // Enterobact. Surface Antigens: Meth. Mol. Characterist. 1985. - P. 3-16.

117. Matar G.M., Kheisser I.A., Abdelnoor A.M. Rapid laboratory confirmation of human brucellosis by PCR analysis of a target sequence on the 31-kilodalton Brucella antigen DNA // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. -P. 477-478.

118. Ouahrani-Bettashe S., Soubrier M.P., Liautard JP. IS-6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains // J. Appl. Bacteriol. 1996. -V. 81.-P. 154-160.

119. Perera V.Y., Creasy M.T., Winter A.J. Nylon bead enzymo-linked immunosorbent assay for detection of sub-quantities of Brucella antigens // J. Clin. Microbiol. 1983. -V. 18. - P. 601-608.

120. Picard C., Ponsonnet C., Paget E. и др. Detection and enumeration of bacteria in soil by direct DNA extraction and polymerase chain reaction. // Appl. and Environ. Microbiol. 1992. - V.58. - P. 2717-2722.

121. Pomale-Leborn A., Stinebryng W.R. Intracellular multiplication of Brucella abortus in normal and immune mononuclear phagocytics // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.-1957.-94.-P. 78-84.

122. Quepo-Ortuno M.I., Morata P., Ocon P. et al Rapid diagnosis of human brucellosis by peripheral-blood PCR assay // J. Clin. Microbiol. 1997. -V. 35.-P. 2927-2930.

123. Rasmussen S., Timms P. Detection of Chlamydia-psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. // FEMS Microbiol. Lett. 1991. - V.77. - P. 169-173.

124. Rijpens N.P., Jannes G., Van Asbroeck M. Direct detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse hybridization with 16S-23S rRNA spacer probes // Appl. Environ. Microbiol 1996. - V. 62. - P. 1683-1688.

125. Rolfs A., Schuller I., Finckh U., Weber-Rolfs I. PCR: Clinical diagnostics and research. N.Y., Springier Verlag Berlin Heidelberg. - 1993. - 21 p.

126. Romero C., Gamazo C., Padro M., Lopez-Coni I. Specific detection of Brucella DNA by PCR // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33. - P. 615-617.

127. Sifuintes-Ricon A.M., Revol A., Barrera-Saldana H.A. Detection and differentiation of the six Brucella spp. by PCR // Mol. Med. 1997. - V. 3. -P. 734-739.

128. Tenover F.C. Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious diseases.// Clin.Microbiol.Rev.-1988.-V.l.- N.I.

129. Thoen C.O., Pietz D.E., Armbrust A.L., Harrington R. Enzyme immunoassay for detecting Brucella antibodies in cows milk // J. Clin. Microbiol. 1979. - V.10. -P.222-225.

130. Wu D.Y., Pal B.K., Qian J., Wallace B. The effect of temperatur and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by polimerase chain reaction // DNA and Cell Biology. -1991.-№ 10.-P. 233-238.