Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бруцеллез в Саратовской области: клинико-эпидемиологические аспекты совершенствования лабораторной диагностики

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бруцеллез в Саратовской области: клинико-эпидемиологические аспекты совершенствования лабораторной диагностики"

На правах рукописи

РГБ О А

та " :0

ДЕНТОВСКАЯ Светлана Владимировна

Бруцеллез в Саратовской области: клинико-эпидемиологические аспекты совершенствования лабораторной диагностики

03.00.0 7-микробиолог и я 14.00.30-эпидемиология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2000

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" МЗ РФ (Саратов). Научные руководители:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник А Н. Куличенко; доктор медицинских наук, старший научный сотрудник В В. Кутырев.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.Ф. Зыкин; доктор биологических наук, профессор П. А. Чиров.

Ведущая организация:

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится 7.12.2000 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 но присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" МЗ РФ (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

"Автореферат разослан 1.11.2000 г.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ "Микроб".

Ученый секретарь диссертационного совета р ^ ^Д ^^^^ '— '''

доктор биологических наук, профессор [ ! ^ р д Корнеев

общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Бруцеллез до настоящего времени остается одним из зооиозов, причиняющих значительный экономический и социальный ущерб (Черкасский Б.Л., Иванова A.A., 1996). По данным ВОЗ заболевания людей отмечаются в 73 странах Азии, Африки, Америки и Европы. 11а территории Российской Федерации ежегодно регистрируется около 500 случаев впервые выявленного бруцеллеза (Отпценко Г".Г. с соант., 1999). Начавшийся в конце 80-ых годов рост заболеваемости был обусловлен ухудшением эшпоотологической ситуации по бруцеллезу вследствие формального подхода при проведении ветеринарно-санитарных мероприятий, увеличения доли сельскохозяйственных животных в неконтролируемом ветеринарной службой частном секторе, отсутствия надлежащего контроля за свободно реализуемыми продуктами животноводства (Федоров Ю.М., Горошеико В.В., 1989).

Ликвидация в 60-ые годы очагов козье-овечьего бруцеллеза во многих областях России привела к относительному увеличению удельного веса больных, заразившихся от крупного рогатого скота (КPC) (Вершнлова П.А. с соавт., 1972). В Саратовской области с конца 70-ых годов, как и в большинстве регионов страны, основным источником инфекции стал КРС, а возбудителем -Brucella ahortus, что способствовало изменению эпидемиологических особенностей бруцеллеза (Коротков В.Б., 1998). Наличие "прозрачных" границ с Западным Казахстаном и близость Северо-Кавказского региона, где до настоящего времени регистрируются очаги бруцеллеза мелкого рогатого скота (MPC), усупбляют сложную ситуацию по данной инфекции. Эпидемиологии бруцеллеза п Саратовской области посвящено ограниченное число исследований (Лохов М.М., 1961; Селин ВН., 1990; Коротков В.Б., 1998). Часть вопросов, имеющих теоретическое и практическое значение, пе решена до настоящего времени. Так, районирование территорий области проводилось только но интенсивности эпидемических проявлений бруцеллеза без учета эпизоотического фона. Нет данных о значении отдельных методов лабораторной диагностики для решения задач борьбы с этим заболеванием. Сложная ситуация по бруцеллезу н области определяет необходимость углубленного изучения особенностей эпидемиологической обстановки по этой инфекции в целях определения конкретных путей совершенствования системы эпидемиологического надзора, в том числе и методов лабораторной диагностики.

Преобладание первично-хронических, латентных и стертых форм бруцеллеза часто является причиной неверной или поздней диагностики болезни (Беклемишев Н.Д., 1965). По нашим данным в последние годы около 70% больных направляются в инфекционный стационар не после профилактического осмотра, а в связи с наличием жалоб на снижение трудоспособности. При профилактических обследованиях на бруцеллез до настоящего времени применяются реакции Хеддльсона и Райта, которые не позволяют выявлять всех инфицированных. Используемые в стационарных условиях методы лабораторной диагностики (бактериологический и РИГА) тоже не оказывают существенного влияния на верификацию диагноза. По данным ЦГЭСН по Саратовской области

¡a все нрсмя существования на территории peí попа очагои бруцеллеза КРС от больных по было выделено ии одной культур!.! fí. abortas. Высокая вариабельность, диссоциативная изменчивость и существование I,-вариантом бруцелл создают определенные сложности при их обнаружении (Веришлова П.А. с со-апт., 1972). Положительный результат внутрнкожной аллергической пробы Бюрпс, на которую опираются клиницисты при постановке диагноза, доказывает существование сенсибилизации но отношению к бруцеллезному антигену, но не отражает степень компенсации процесса, и может длительно сохранятся после выздоровления (Беклемишев П.Д., 1965). При повторных постановках бру-целлин усиливает сенсибилизацию организма и может вызывать возникновение очаговых и общих реакций (Первушин Б.Г1., 1937; Щербак Ю.Ф., 1967).

Пн одни из используемых в настоящее время лабораторных тестов не удовлетворяет современным требованиям медицинской службы. В связи с вышеизложенным очевидна актуальность совершенствования приемов лабораторной диагностики бруцеллеза у людей для решения практических задач лечебно-профилактических учреждений п Центров ГСЭП. Разработка рационального сочетания лабораторных тестов при обследовании люден на бруцеллез с целыо наиболее раннею н полного выявления инфицированных позволит повысить эффективность лечения и обеспечить своевременное проведение необходимых противоэпидемических мероприятий.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - получение новых сведений о современных особенностях бруцеллеза в Саратовской области, разработка рациональной схемы лабораторной диагностики заболевания на основе определения клинико-эпидемиологпчсской значимости традиционных и новых лабораторных методов.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Обобщить и проанализировать статистические материалы но заболеваемости бруцеллезом людей и сельскохозяйственных животных в Саратовской области за 1978-1999 гг.

2.Определит!, основные эннзоотологнческие и эпидемиологические особенности бруцеллеза, характерные для Саратовской области в 1978-1999 гг. Провести эпидемиологическое районирование Саратовской области по величине показателя эпидемической опасности территории по бруцеллезу.

3. Провести оптимизацию схемы ГПЦР-аиализа при диагностике бруцеллеза у людей, определить чувствительность метода при исследовании различного клинического материала.

4. Провести сравнительный анализ чувствительности и специфичности традиционных методов лабораторной диагностики бруцеллеза (РХ, РА, РИГА, РБ), непрямого варианта ИФА н Г1ЦР.

5. Определить возможность использования ПЦР-аналнза в комплексе методов лабораторной диагностики при проведении эпидемиологического обследования очага инфекции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Определены основные эпизоотологические и эпидемиологические особенности бруцеллеза в Саратовской области в 1978-1999 гг.: доминирующая роль крупного рогатого скота в качестве основного источника инфекции для людей; регистрация заболеваний животноводов в хозяйствах, являющихся по данным ветеринарной службы благополучными по бруцеллезу; основное значение в заболеваемости контактного пути заражения на фоне снижения роли алиментарного; сохранение преимущественного поражения бруцеллезом женского населения и лиц трудоспособного возраста. Показано, что улучшение эпизоотологической ситуации привело к снижению заболеваемости населения.

Впервые проведено эпидемиологическое районирование территории области по величине показателя эпидемической опасности. Выявлено, что 39 % административных районов относятся к территориям высокой эпидемическом опасности.

Впервые доказана высокая специфичность и чувствительность ГТЦР-тест-системы с праймерами Вги31-Вги32 и ВшЗ-Вги4 при лабораторной диагностике бруцеллеза у людей. Показано, что наибольшая эффективность ПЦР-анализа при бруцеллезе достигается при исследовании образцов цитратной крови больных.

Впервые в медицинской практике показано, что ПЦР в сочетании с непрямым вариантом ИФА при диагностике заболевания у людей и проведении эпидемиологического обследования обладают максимальной диагностической точностью.

Показана возможность применения ПЦР для обнаружения ДНК бруцелл в объектах окружающей среды при эпидемиологическом обследовании очага инфекции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ДИССЕРТАЦИИ.

Результаты исследований вошли в отчет о государственных приемочных испытаниях тест-системы для обнаружения бруцелл методом ПЦР и послужили основанием для рекомендации ее внедрения в практику здравоохранения (Акт внедрения использования ПЦР-анализа при обследовании людей на бруцеллез. Утвержден директором ГИСК им. Л.А. Тарасевича 17.05.2000 г.). Разработанные методические подходы лабораторной диагностики бруцеллеза у людей применяются в ММУ "2-ая клиническая больница" (Акт внедрения сочетанного использования ИФА и ПЦР-анализа при обследовании людей на бруцеллез. Утвержден главным врачом ММУ "2-ая клиническая больница" 26.05.2000 г.) и ЦГСЭН по Саратовской области (Акт внедрения сочетанного использования ИФА и ПЦР-апализа при обследовании людей на бруцеллез. Утвержден главным врачом ЦГСЭП по Саратовской области 26.05.2000 г).

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей по особо опасным инфекциям при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб".

г.

основный ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Основные эиизоотологпческие п эпидемиологические особенности бруцеллеза в Саратовской области н 1978-1999 гг. заключаются в доминирующей роли крупного рогатого скота в качестве основного источника инфекции для люден; регистрации заболеваний животноводов в хозяйствах, являющихся по данным ветеринарной службы благополучными по бруцеллезу; нропГиШДН-шш контактного пути заражения; преимущественном те»р:1Же!Ш11 Пруцелле'ЮМ женского населения и лиц трудоспособного возраста.

2. Оптимальная схема проведения ПЦР-диагностики бруцеллеза у людей включает исследование нитратной крови с использованием тест-системы, основанной на двухстадинной ГИДР с праймерами Вш31-32 и ВгиЗ-4.

3. При лабораторной диагностике бруцеллеза по чувствительности ГТЦР-аиализ сопоставим с непрямым вариантом ИФА и превосходит традиционные методы диагностики этой инфекции.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и представлены на: научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); II Всероссийской конференции "Полиме-разная цепная реакция в диагностике н контроле лечения инфекционных заболеваний" (Москва, 1998); И Всероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1998): Международной научно-практической конференции "Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территорий стран СНГ" (Саратов, 1998); научной конференции учреждений но борьбе и изучению нриродно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999); научно-практической конференции областной ассоциации инфекционистов (Саратов, 1999), итоговой научно-практической конференции РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2000); VI Республиканской научно-практической конференции "Зоонозы: актуальные вопросы в клинике н эксперименте" (Махачкала, 2000).

Диссертация обсуждена н одобрена на межлабораторпой научной конференции РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 35 от 13.06.2000 г.).

ПУБЛИКАЦИИ.

Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Работа состоит из введения; 1 главы обзора литературы; 4 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований, изучения эпидемиологических и эпизоотологичсских особенностей проявления бруцеллеза; экспериментальной части: заключения; выводов; списка литературы, включающего 194 цитируемые работы. Общий объем диссертации 127 страниц. Текст иллюстрирован 12 таблицами и 15 рисунками.

содержание работы

Материалы п методы

Для ретроспективного анализа и изучения эпидемических и эпизоотических проявлений бруцеллеза в Саратовской области были использованы архивные материалы за 1978-1999 гг. Центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора и Управления ветеринарии по Саратовской области. Анализировались годовые отчеты и объяснительные записки к ним, карты эпидемиологического обследования случаев заболевания бруцеллезом, журналы учета больных бруцеллезом в области. В архиве ММУ "2-ая клиническая больница" изучено 852 истории болезни больных с впервые установленным диагнозом бруцеллез, находившихся на стационарном лечении с 1978 по 1999 гг.

Ретроспективный эпидемиологический анализ выполняли по общепринятой методике (Марченко Б.И., 1997). Для выявления многолетней тенденции заболеваемости проводили выравнивание по параболе динамического ряда показателей заболеваемости за анализируемый период методом наименьших квадратов. Выраженность многолетней тенденции оценивали путем расчета среднего темпа прироста (Марченко Б.И., 1997). »

Эпидемиологическое районирование административных территорий Саратовской области проводили путем определения показателя эпидемической опасности по бруцеллезу, учитывая три вида средних показателей за 19781999 гг.: заболеваемость на 100 тыс. населения, процент зараженности животных, количество больного бруцеллезом скота в неблагополучных хозяйствах, а так же абсолютное количество зарегистрированных за данный период неблагополучных хозяйств на территории административного района с использованием картографического метода.

В серолог ических реакциях и ПЦР был исследован клинический материал от четырех групп населения Саратовской области:

• I группа (50 человек) - здоровые доноры, проживающие в г. Саратове.

• II группа (47 человек) - больные с документированным диагнозом бруцеллез.

• III группа (57 человек) - животноводы Росплемконезавода (РПКЗ) "Петровский" и владельцы бруцеллезного КРС с. Сосновоборское Петровского района.

• IV группа (48 человек) - пациенты с различными заболеваниями небруцеллезной этиологии (ннфекционио-аллергическнй полиартрит, остеохондроз различных отделов позвоночника с корешковым синдромом, хронпосепснс).

В реакции Хеддльсона, реакции агглютинации, РИГА и непрямом варианте ИФА исследовали 202 сыворотки крови лиц 1-1 У-ой группы. Внутрнкож-ную аллергическую пробу Бюрне ставили 19 больным Н-ой и 18 больным I У-ой группы. Постановку и учет реакций осуществляли в соответствии с "Методическими указаниями по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей" (1980) и инструкцией, прилагаемой к диагностической иммунофер-ментнон тест-системе производства "Ниармедик" Москва.

В ШДР исследовали образцы нитратной крови 202 пациентов I-IV-o" «•рушил, 47 проб мочи и слюны, полученных от больных 11-ой груши.;, т.п. проб подстилки и навоза и пять смывов с поверхностей, взятых на молочнотоварной ферме РГ1КЗ "Петровский". Для выделения ДНК использовали метод нуклеосорбции па сшшкагеле в присутствии гуапиднптиоцнаната (Boom R. et al, 1990) d модификации С.Б. Гараниной (1996). Кроме того, в ПЦР тестировали образцы нативпой сыворотки, а также ДНК, выделенную методом щелочного лизис-осаждения из 32 проб сыворотки крови больных П-ой группы (Шесто-наловМ.Ю., 1999).

Для амплификации участка геномной ДНК бруцелл в ncsted-ПЦР использовали олигонуклеотидпые нраймеры Вги31-Вш32 ("внешние") и ВшЗ-Вги4 ("внутренние"), комплементарные гену, кодирующему 31 кДа белок внешней мембраны В. abortus (Mayfield J.П. et al., 1988), ограничивающие участки ДНК размерами 299 и 175 п.н. соответственно. Чувствительность реакции с чистыми культурами бруцелл составляла 10-100 м.к./мл1.

Продукты ПЦР анализировали методом гель-электрофореза в 1,5%-нон агарозе согласно общепринятым рекомендациям (Maniatis T. et al., 1982).

Результаты 11 сс л едо it a 1111 ii

Бруцеллез сельскохозяйственных животных регистрировался на террито-•рни области еще в конце прошлого века. Эпидемическое состояние по бруцеллезу в до- и послевоенные годы, как и в остальных регионах страны, определялось наличием этой инфекции у MPC, в основном у овец. С середины 50-х годов в Саратовской области начинают осуществляться комплексные ветерннар-но-саннтарные и медицинские мероприятия, включающие плановые диагностические исследования сельскохозяйственных животных, изоляцию и ликвидацию больного поголовья, специфическую вакцинацию КРС и MPC вакциной на основе штамма В. abortus 19 и профилактические прививки профессионально угрожаемых контннгентов в активных очагах козье-овечьего бруцеллеза. Это позволило к концу 70-х годов существенно улучшить эпизоотическую и эпидемическую ситуацию (Селин В.Н. с соавт., 1990) Однако в 1979-1986 гг. произошла активизация эпизоотического процесса, проявившаяся в увеличении числа неблагополучных но бруцеллезу КРС хозяйств, заносу инфекции в ранее благополучные или оздоровленные, увеличении числа инфицированных животных (рис. 1).

Практически на протяжении всего анализируемого периода в хозяйствах области имела место передержка скота с положительными серологическими реакциями на бруцеллез. До 1987 г. это явление носило массовый характер, количество оставшегося скота исчислялось в тысячах голов. Создание бруцеллезных изоляторов, концентрация и перемещения больных животных активизировали естественный эпизоотический процесс. Именно в эти годы зараженность КРС бруцеллезом сохранялась на высоком уровне (0,4-0,8 % от числа обследован-

1 Описанные условия проведения ПЦР были оптимизированы и подобранны в серии предварительных экспериментов, проведенных совместно с И.Н. Шаровой (РосНИПЧИ "Микроб").

пых животных), что не могло не отразиться на эпидемиологической ситуации по бруцеллезу.

1978 1980 1982 1984 1986

•Имелось на конец года

1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 ГОДЫ

—А— Оздоровлено —•— Вновь выявлено

Рисунок 1. Количество неблагополучных но бруцеллезу КРС хозяйств Саратовской области (1978-1999 гг.)

В 1978-1999 гг. в Саратовской области относительный показатель заболеваемости на 100 тыс. человек колебался от 0,5 ±0,14 до 2,5 ±0,3, превышая в отдельные годы среднероссийский в 2-5 раз (рис. 2).

g 2,5 i

:3 1,5 ¡3

£ 0,5 а

1-1-1-1-1-1-1-г-1-1-1-1-1-1-г-1-1-1-1-1-1-1

1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998

годы

♦ Заболеваемость населения Саратовской области —и— Заболеваемость населения России

-Тенденция заболеваемости населения Саратовской области

0

Рисунок 2. Многолетняя динамика уровня заболеваемости бруцеллезом населения Саратовской области н сс тенденция в 1978-1999 гг. (на 100 тыс. населения).

За анализируемый отрезок времени в многолетней динамике заболеваемости бруцеллезом можно выделить несколько характерных особенностей. Во-

первых, совпадающие показатели в начально]"! п конечной части представленного периода в несколько раз ниже, чем в его середине (рис. 2). Во-^о^л,., подъемы заболеваемости отмечаются каждые 3-5 лет. Максимальное количество заболевших регистрировалось в 1983, 1988, 1991 и 1996 гг. Исходя из особенностей многолетней динамнкн заболеваемости, изучаемый период был разделен на 2 отрезка: 1978-1988 гг. и 1989-1999 гг. В 1978-1988 гг. данный показатель характеризовался выраженным ростом с Тпр = +120%, второй отрезок -снижением с Тщ, = -89 %.

Проведенное нами эпидемиологическое районирование территории показало, что наиболее пораженными бруцеллезом за анализируемый период являются одиннадцать районов левобережья и четыре - правобережья области (рис. 3).

Рнсунок 3. Эпидемиологическое районирование территории Саратовской облает но бруцеллезу (1978-1999 гг.)

В 1978-1999 гг. в среднем около 43 % ежегодной заболеваемости регистрировалось в хозяйствах, являющихся по данным ветеринарной службы благополучными по бруцеллезу.

Бруцеллез остается инфекцией, поражающей преимущественно сельское население. Из общего числа выявленных за анализируемый период больных жители сельской местности составили (90 ± 1,0)%. Заболеваемость городского населения регистрировалась в 11 городах и наиболее часто была связана с профессией (работники мясных и молокоперерабатывающих комбинатов, ветеринарных лабораторий) или употреблением сырых молочных продуктов.

Анализ динамики роли MPC и КРС как источника инфекции позволил ус. ....j-.то единичные случаи острого бруцеллеза, обусловленные заражением от MPC в хозяйствах области и подтвержденные выделением культуры В. meliíensis из крови больных, наблюдались до 1985 гг. С указанного времени в области нет хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу MPC. В последующий период от больных людей, мелкого и крупного рогатого скота возбудитель ко-зье-овечьего бруцеллеза не выделялся. Из абортированных плодов КРС ежегодно выделяются культуры В. abortus (по 2-3 вирулентных штамма). Таким образом, наши исследования подтверждают данные В. Б. Короткова (1998) о том, что основным источником инфекции для людей в настоящее время является больной КРС, а возбудителем В. abortus.

Наиболее частым путем передачи инфекции от животных к человеку в анализируемый период являлся контактный (91 %). Характерным для бруцеллеза в области было преимущественное поражение групп населения профессионально связанных с уходом за животными или переработкой животноводческого сырья. Что касаетзя пола и возраста заболевших, то нам также не удалось выявить особен ноете!! специфичных для Саратовской области. Преобладание среди заболевших женщин и лиц наиболее трудоспособного вовраста (2049 лет) является следствием их преимущественного участия в обслуживании больного скота и обработке сырья животного происхождения.

При сравнении полученных данных с результатами аналогичных исследований, выполненных М.Г. Лоховым в Саратовской области в 1935-1954 гг., определены общие черты и основные отличия, присущие бруцеллезу на протяжении этих двух временных периодов. Основными особенностями современного бруцеллеза в области являются: смена источника инфекции, снижение уровня заболеваемости людей и ее профессиональный характер, регистрация больных в пунктах официально благополучных по бруцеллезу, уменьшение роли алиментарного пути заражения, при условии сохранения преимущественного поражения бруцеллезом женского населения и лиц трудоспособного возраста.

Таким образом, долгое время Саратовская область являлась регионом неблагополучным по бруцеллезу. На протяжении последних трех лет наметилось некоторое улучшение эпизоотической и эпидемиологической ситуации по данной инфекции, проявляющееся в полном оздоровлении неблагополучных хозяйств и тенденции к снижению заболеваемости населения.

К моменту начала настоящих исследований существовало небольшое количество публикаций, посвященных диагностике бруцеллеза у людей с помощью ПЦР. Как правило, в них для обнаружения бруцелл использовали кровь больных (Гаранина С. Б., 1996; Matar G. M .et al., 1996; Quepo-Ortuno M.I. et al., 1997; Sifuentes-Ricon A.M. et al, 1997). У ограниченного числа пациентов описана возможность обнаружения ДНК бруцелл в моче и слюне (Гаранина С.Б., 1996), а так же в сыворотке крови (Шестопалов М.Ю., 2000).

Нами проведено сравнительное изучение диагностической ценности ПЦР при исследовании различных видов клинического материала (кровь, сыворотка крови, моча, слюна) от 47 больных с документированным диагнозом бруцеллез. Образование специфичного ПЦР-продукта выявлено в образцах ДНК из крови

41 больного (87,2 ±4,9%), из мочи у 16 (34,0 + 6,9%), из слюны у девяти (19,1±5,7%). Нам удалось обнаружить ДНК бруцелл лишь в одном (3,0 ± 3,0 %) из 32 исследованных образцов нативной сыворотки крови.

Как показывают результаты, высокая диагностическая эффективность ПЦР-анализа достигалась лишь при исследовании крови больных, в то время как анализ мочи, слюны, сыворотки крови позволил подтвердить диагноз бруцеллеза в гораздо меньшем проценте случаев. Информативность анализа крови превосходила таковую при исследовании в ПЦР образцов ДНК мочи, слюны и сыворотки крови соответственно в 2,5 раза, в 4,5 раза и в 29 раз (Р < 0,001). Второе место по частоте обнаружения у больных ДНК бруцелл занимала моча. Число положительных проб было в 1,8 раз больше, чем при исследовании слюны и в 10 раз - чем сывороток крови (Р <0,001). Информативность исследования сывороток крови оказалась очень низкой и в 6-29 раз уступала эффективности использования в ПЦР-анализе других видов клинического материала. На наш взгляд, именно внутриклеточный характер паразитирования бруцелл (Spink W.W., 1956) обусловливает высокую эффективность их выявления в биологической жидкости богатой фагоцитирующими клеточными элементами. Наличие же первичной и повторных гематогенных генерализаций инфекции позволяет использовать именно кровь в качестве клинического "материала выбора" для тестирования в ПЦР.

Специфичность ПЦР изучена нами при исследовании клинического материала от 98 людей, 50 из них - доноры, 48 - лица с различными заболеваниями (инфекционно-аллергический полиартрит, остеохондроз различных отделов позвоночника с корешковым синдромом, хрониосепсис). Образцы клинического материала контрольной группы во всех случаях были серо- и ПЦР-негативными.

Для определения чувствительности ПЦР-анализа исследовали 47 образцов крови: два - от больных с острым, четыре - с латентным и 41 образец от пациентов с хроническим бруцеллезом. Одновременно сыворотки крови больных тестировали в РХ, РА, РНГА и непрямом варианте ИФА.

При острой и латентной форме бруцеллеза наблюдаемый в 100 % случаев положительный результат в ПЦР совпадал с положительными результатами традиционно применяемых серологических методов лабораторной диагностики и непрямого варианта ИФА. Информативность внутрикожной аллергической пробы Бюрне при остром и латентном бруцеллезе была ниже (60 ± 4,5) %. Ограниченное число больных острым и латентным бруцеллезом не позволяет сделать вывод об истинной диагностической точности ПЦР на данных стадиях течения инфекционного процесса, но высокая эффективность метода, на наш взгляд, не вызывает сомнений.

Если диагностика острых форм заболевания сравнительно проста, то постановка диагноза при хроническом бруцеллезе до сих пор вызывает значительные затруднения. Полиморфизм клинических проявлений, отсутствие в настоящее время высокочувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики хронического бруцеллеза часто ведут к диагностическим ошиб-

--^временная постановка верного диагноза, отсутствие адекватного ..счеиня приводят около 9 % больных к инвалидности.

При обследовании 41 больного хроническим бруцеллезом только у двух образование специфичного ПЦР-продукта наблюдалось при отрицательных результатах всех серологических реакций. У четырех больных при положительных серологических реакциях получен ПЦР-отрицательный результат. При исследовании материала от двух пациентов при использовании всех методов не было получено ни одного положительного результата (табл. 1). Таблица 1. Результаты сравнительного изучения ссролошческнх реакций,

реакции Нюрпе и ПЦР при хроническом бруцеллезе в стадии суб- и декомпенсации2_

Мгтоды исследования Кол-во rxvn.in.ix Из 1пк положигслип.гс ОСрт п.е знача п га пиров** апппел Х±т

а(х. кал-го %+т Р* с лрутмн методами исслед> ваиия

ПЦ Р (кровь) 39 35 89,7 ±4,9 сРА-0,00! сШГАиРХ-0,01

ИФА 39 32 82,0 ±6,2 сРХ-0,05 сРА-0,001 540 ±25

РИГА 39 16 41,0+13 сРА-0,01 320 + 60

РА 39 5 12,8 ±3,5 оо воачнР< 0,001 160±120

РХ 39 22 56,4+10,8 сИФА-0,05 сРА-0,001 -

РБ 14 12 85,7 ±10,5 сРХ-0,05 сРА-0,001 -

Примечания:

*- уровень значимость различий;

**- средняя геометрическая титров.

При хронической форме бруцеллеза наиболее высокий процент положительных ответов зарегистрирован для ПЦР, ИФА и РБ. Различия по проценту положительных проб для этих трех методов незначительны (Р<0,1). Чувствительность РА, РИГА и РХ при данной форме инфекции достоверно уступала ПЦР в 7, в 2,2 и 1,6 раз соответственно. На основании этих данных можно сделать заключение о низкой диагностической эффективности РА у больных хроническим бруцеллезом. В свою очередь результативность ИФА на данной стадии течения инфекционного процесса практически не отличается от аналогичных показателей ПЦР.

Из общего числа больных 39 человек были направлены в клинику в связи с ухудшением самочувствия и клиническими признаками рецидива бруцеллеза

2 В таблице не приведены двое больных с хроническим бруцеллезом в стадии компенсации, имевших отрицательные результаты по всем лабораторным тестам.

(фаза суб- и декомпенсации). Как показывают результаты, ГИДР позволяет выявлять ДНК бруцелл у больных хронической формой инфекции. Обнаружение ДНК бруцелл в крови 35 пациентов данной группы больных, вероятно, служит маркером активности инфекционного процесса, подтверждая наличие повторной гематогенной генерализации. НЦР-отрицательные результаты у четырех из 39 больных хроническим бруцеллезом при наличии в сыворотке крови проти-вобруцеллезных антител могли быть обусловлены присутствием в образцах ДНК после этапа выделения ингибиторов ПЦР: гемоглобина, денатурированных альбуминов и др. или концентрацией бруцелл ниже порога детекции (Rolfs Л. et al., 1992.; Morata Р. et al., 1998).

При сборе эпидемиологического анамнеза оказалось, что двое больных, у которых образование специфического ПЦР-продукта наблюдалось при отрицательных результатах всех серологических реакции, длительное время работают в хозяйствах, неблагополучных по бруцеллезу крупного рог атого скота. Многократное инфицирование в данных случаях могло привести к отсутствию выраженных иммунологических сдвигов (Таран И.Ф., 1967).

Многие авторы указывают на отрицательные результаты высевов бруцелл из крови пациентов в стадии компенсации хронического бруцеллеза (Грин-фельд A.A., Нейман М.В., 1940). Двое из обследованных нами больных хроническим бруцеллезом поступили в стационар в состоянии ремиссии заболевания (стадия компенсации) перед очередным переосвидетельствованием в бюро медико-социальной экспертизы, что подтверждается отсутствием в момент обследования клинических признаков обострения заболевания, ДНК бруцелл в крови и отрицательными результатами всех серологических реакций.

Затяжной, хронический характер инфекции, длительное сохранение возбудителя в организме, возможность возникновения рецидивов, волнообразный характер иммунологических сдвигов являются основными особенностями бруцеллеза. Установить стадию заболевания н оценить активность течения инфекционного процесса можно с помощью выявления различных классов антител в сыворотке крови. В ходе выполнения следующего этапа настоящего исследования памп подтверждена возможность дифференциации стадий течения бруцеллеза при помощи определения классов специфических антител в сыворотке больных в непрямом варианте ИФА. Мы обнаружили противобруцеллезиые IgG-аптитсла в сыворотках у 94,1 % больных хроническим бруцеллезом. Установлено, что IgG-антитела выявлялись в сыворотках пациентов с тяжелым и срсдиетяжелым течением заболевания. При сопоставлении результатов выявления IgG-аитнтел в сыворотке 34 больных с хронической формой инфекции с частотой обнаружения ДНК бруцелл в их крови, оказалось, что положительный результат в ПЦР в 94 % случаев сопровождался выявлением иммуноглобулинов G. Очевидно, что при хроническом бруцеллезе наличие у больных антител тина IgG п выявление ДНК бруцелл в крови методом ПЦР может служить показателем активности и тяжести течения инфекционного процесса. Наши результаты согласуются с данными М.И. Чернышевой с соавг. (1971), Т. Pellicer et al. (1988) н J.L. Reddin et al. (1965), обнаруживавшим IgG-антитела в 90 % сывороток больных хроническим бруцеллезом в фазе де- и субкомпенсации. В цитиро-

ванных выше работах было показано, что присутствие иммуноглобулинов к.к.сса О связано с наличием в организме больного возбудителя инфекции и, как следствие этого, с усиленной антигенной стимуляцией.

Важным разделом нашей работы было определение возможности использования ПЦР для проведения эпидемиологического надзора за бруцеллезом и оценки информшншюыи различных методов лабораторной диагностики при обследовании реального очага ННфекщт. Нами совместно с ЦГСЭ11 но Саратовской области проведено обследование на бруцеллез работников Р1ЖЗ "Петровский" и жителей с. Сосновоборское Петровского района. Выбор данного хозяйства объясняется наличием в нем активно протекающей эпизоотии бруцеллеза, подтвержденной выделением культур В. аЬог/н.ч из абортированных плодов. и случаями острого бруцеллеза у обслуживающих КРС животноводов. 11а-ми обследовано 57 человек. Из них 47 - работники Роснлемконезавода "1 !етров-скнй" и 10 - дети из семей, в личном хозяйстве которых был выявлен бруцеллезный КРС. По результатам комплексного обследования выявлено 15 человек, с положительными реакциями на бруцеллез, что составило 26,3 % от общего числа обследованных (габл. 2).

Таблица 2. Рсзуш.тагы сравнительного изучения серолотческнх ре-

акции, ИФА и ПЦР при эпидемиологическом обследовании

Методы ■ кенс/пешш Кол-во обследованных Из них положшельпых Обратные значения титров** антител, X + т

абсолютное кол-во %±т Уровень достоверности раз-личин (Р) с РА

11ЦР (кровь) 57 13 22,8 + 5,6 0,02 -

ИФА* 57 13 22,8 + 5,6 0,02 520 ± 15

РИГА* 57 12 21,1+5,4 0,05 150+10

РХ* 57 11 19,3+5,2 0,05 -

РА* 57 4 7 ±3,4 85 ± 10

Примечания:

* - учитывали только диагностически значимые результаты реакций;

** - средняя геометрическая титра.

У двух человек положительный результат в ПЦР наблюдался при отрицательных результатах всех серологических реакций. В двух случаях образцы кропи были отрицательными в ПЦР, но положительными в ИФД. При обследовании нами не установлено достоверных различий по проценту выявленных положительных ответов между РХ, РИГА, непрямым вариантом ИФА и ПЦР. РА уступала но результатам исследования перечисленным методам в 2,7-3,2 раза. Сочетанное использование ПЦР и ИФА, направленного на выявление противобруцеллезных антител, обладало максимальной диагностической информативностью, позволяя выявлять всех инфицированных.

Результаты анализа профессионального состава инфицированных свидетельствуют о том, что больше всего лиц с положительными реакциями на бруцеллез выявлено среди работников молочно-товарной фермы (табл. 3). Из 10

человек, временно привлекавшихся к работам па форме, заболел один плотник, ремонтировавший коровник, где содержался больной скот. Таким образом, в очаге бруцеллеза вероятность заражения этой инфекцией наиболее высока для лиц, нспосрсдствешю контактирующих с больными животными.

Таблица 2. Профессиональный состап положительно ротирующих и боль_пых бруцеллезом работников РНКЗ "Петровский"_■ -

Профессиональные группы Всего обелен довано Абсолютное число положительно реагирующих Из них больных

Зоовстработшиш 4 1 1

Доярки, скотники, телятницы 29 9 6

Лина других профессий МТФ 4 1 1

Лпцм, временно привлекаемые для работ на МТФ 10 1 1

Из 16 человек шести семей, имевших бруцеллезных коров, у шести выявлены положительные реакции на бруцеллез, трое из них являлись работниками Росплемконезавода и могли заразиться также от общественного скота. Трое остальных - дети (6, 10 и 13 лет) из одной семьи, употреблявшие сырые молочные продукты от личной коровы, больной бруцеллезом. Среди 15 инфицированных преобладали лица среднего и старшего возраста (80 %) Таким образом, инфи-цированность животноводов, соприкасавшихся с больными животными, была в четыре раза выше, чем у детей, употреблявших некипяченое молоко от больных коров.

Нами впервые было апробировано применение III 1Р-анализа для обнаружения бруцелл в объектах внешней среды в реальном очаге инфекции. В результате исследования навоза и подстилки, а также смывов с поверхностей, взятых на ферме РПКЗ "Петровский" в одном из десяти объектов обнаружена ДНК бруцелл. Однако, учитывая то, что нраймеры, использованные нами, являются родосиецифнчнымн, мы не можем с уверенностью отнести обнаруженную ДНК к вакцинному или вирулентному штамму бруцелл. На наш взгляд, это еще раз подтверждает, что для обнаружения бруцелл в очаге инфекции с помощью ПЦР при установлении источника и факторов передачи бруцелл в ходе эпидемиологического расследования необходимо использовать не только ро-доспецнфичные праймеры, но, в первую очередь, нраймеры, позволяющие дифференцировать как отдельные виды, так и штаммы бруцелл.

выводы

1. Установлено, что заболеваемость населения Саратовской области бруцеллезом в 1978-1999 гг. имеет тенденцию к снижению, что связано с улучшением эпнзоотологической ситуации по данной инфекции.

2. Эпидемиологическими особенностями бруцеллеза в Саратовской области в современных условиях ухудшения социально-экономической ситуации являются:

• доминирующая роль крупного рогатого скота в качестве основного источника инфекции для людей;

• регистрация заболеваний животноводов в хозяйствах, являющихся по данным ветеринарной службы благополучными по бруцеллезу;

• основное значение в заболеваемости контактного пути заражения на фоне снижения роли алиментарного;

• сохранение преимущественного поражения бруцеллезом женского населения и лиц трудоспособного возраста.

3. С целью совершенствования системы эпидемиологического надзора за бруцеллезом проведено районирование территории области но величине эпидемической опасности по бруцеллезу. Установлено, что наиболее высокий показатель эпидемической опасности характерен для 39 % районов области.

4. Впервые в клинической практике доказана высокая эффективность генной диагностики бруцеллеза у людей. При использовании ГТЦР-тест-сиетемы с праймерами Вги31-Вги32 и ВшЗ-Вш4 чувствительность анализа составила 87,2 %, специфичность - 100 %, диагностическая точность - 96 %.

5. Вероятность детекции бруцелл методом III |,Р в крови больных выше, чем при анализе других биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, слюна). Чувствительность ПЦР при исследовании крови составила 87,2 %, мочи - 34,0 %, слюны - 19,1 %, сыворотки крови - 3,0 %.

6. Подтверждено, что ПЦР позволяет выявлять бруцеллы в крови больных на разных стадиях течения инфекционного процесса. Установлено, что при хроническом бруцеллезе ПЦР превосходит но чувствительности традиционные методы диагностики этой инфекции: РИГА в 1.5 раза, РХ в 1,6 раза и РА в 3,6 раза.

7. Наибольшая диагностическая точность лабораторной диагностики бруцеллеза при подтверждении клинического диагноза у больных и проведении эпидемиологического обследования очага инфекции достигается при комплексном использовании ПЦР и непрямого варианта ИФА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дсптовская C.B., 1 аранина С Б., Куличенко A.II, Кокуuikhu A.M., Миронова II.И. ПЦР-диагностика бруцеллеза у людей // ГИДР в диагностике н контроле лечения инфекционных заболевании: Материалы II Всероссийской конференции.-М., 1998.-С. 111-112.

2. Денговская C.B., Щербакова С.А., Гаранина С.Б., Куличенко А Н., Миронова Н.И., Казакова Г..С. Изучение диагностической ценности ПЦР и ИФА при бруцеллезе // Гомеостаз и инфекционный процесс: Материалы II Всероссийской конференции (Саратов, 20-21 мая 1998г). - Саратов, 1998. - С. 22.

3. Денговская C.B., Щербакова С.А., Куличенко А.Н., Миронова Н.И. Применение ПЦР и ИФА для диагностики хронического бруцеллеза у людей И Карантинные и зооиозные инфекции в Казахстане - Вып. 1, юбилейный. Алма-ты, 1999. - С. 193-195.

4. Дентовская C.B., Куличенко A.11. Использование молекулярио-генетическнх подходов в лабораторной диагностике бруцеллеза // Проблемы особо опасных инфекций. - Выи. 79. - Саратов Изд-во "Слово", 1999. - С. 3-11.

5. Дентовская C.B., Кокушкнн A.M Бруцеллез в Саратовской области // Эрдем мшнжилгээнпн бггпл (Бангалийп голомтог халдварт овчнийг эсэргтуцэн судлах тев). - Улаанбаатар, 1999 - Дугаар 7. - С. 195.

6. Дентовская C.B., Щербакова С.А.. Миронова Н.И, Куличенко A.II. Клинические аспекты применения ПЦР при диагностике хронического бруцеллеза // Зоонозы: Актуальные вопросы в клинике и эксперименте: Сборник научных трудов VI Республиканской научно-практической конференции и норматив-но-методическнх материалов. - Махачкала: ДГМА, 2000. - С. 213-218.

7. Куличенко А.П., Майоров I I В.. Гаранина С.Б., Дентовская C.B. Внедрение современных методов генной дна! ностпки в практику здравоохранения Саратовской области // Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии: Материалы научной конференции. - Саратов Изд-во Саратовского ун-та, 1999. - С. 23023 Г

8. Шарова И.Н., Гаранина С.В., Дентовская C.B., Малахаева А.Н., Куличенко A.M. Совершенствование ПЦР-тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза // Зоонозы: Актуальные вопросы в клинике и эксперименте: Сборник научных трудов VI Республиканской научно-практической конференции н нормативно-методических материалов. - Махачкала: ДГМА, 2000. -С. 218-221.

9. Дентовская C.B., Куличенко A II. Геиоттширование бруцелл // Проблемы особо опасных инфекций. - Bi.ni 80 - Саратов: Изд-во "Слово", 2000. -С. 133-137.