Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шарова, Ирина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Пути совершенствования ПЦР-диагностики инфекционных болезней.

1.2. Лабораторная диагностика бруцеллеза.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов.

2.2. Среды и условия культивирования.

2.3. Лабораторные животные.

2.4. Подготовка проб.

2.5. Бактериологический анализ

2.6. Иммунологические методы лабораторной диагностики

2.7. ПЦР-анализ.

2.7.1. Выбор праймеров.

2.7.2. Выделение ДНК.г.

2.7.3. Полимеразная цепная реакция.

2.7.4. Гель-электрофорез.

2.8. Статистическая обработка полученных данных.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

- Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов

- иммуноферментный анализ

- колониеобразующие единицы

- крупный рогатый скот

- липополисахарид

- микробная клетка

- мелкий рогатый скот

- молочнотоварная ферма

- пара нуклеотидов

- полимеразная цепная реакция

- реакция агглютинации

- реакция агглютинации латекса

- реакцию иммунофлюоресценции

- реакция Кумбса

- реакция нейтрализации антител

- реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации

- реакция связывания комплемента

- реакции Хедцльсона

- хемютоминесцентный иммуноанализ

Центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР"

Актуальность проблемы

Бруцеллез продолжает оставаться серьезной экономической и социальной проблемой как в здравоохранении, так и в сельском хозяйстве [Таран И.Ф. с соавт., 1996; Григорьева Г.И. с соавт., 1998; Калиновский А.И. с соавт., 1998; Шахани-на И.Л. с соавт., 1999; Онищенко Г.Г. с соавт., 1999]. Несмотря на сокращение количества неблагополучных пунктов по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота, уровень заболеваемости, связанный с профессиональным фактором в общественном секторе, остается высоким (до 90 %). Только в 2000 г. в Российской Федерации зарегистрировано 423 впервые выявленных случая заболевания людей бруцеллезом, что на 20,8 % выше аналогичного показателя 1999 г. Этому способствует несвоевременное оздоровление бруцеллезных хозяйств, позднее выявление и изоляция больных животных, неудовлетворительные условия труда в хозяйствах и на перерабатывающих предприятиях. Кроме того, отсутствие надлежащего сани-тарно-ветёрйнарного контроля за реализацией среди населения продукции животноводства и животноводческого сырья может привести к попаданию в торговую сеть зараженных возбудителем бруцеллеза продуктов, среди которых молоко и молочные продукты как факторы передачи инфекции имеют большое значение.

Важное место в системе эпидемиологического надзора за бруцеллезом отводится качественной и своевременной диагностике этого заболевания. Для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей и животных используют бактериологический анализ, достаточно трудоемкий и длительный метод. Применяемые иммунологические реакции также имеют ряд существенных недостатков: невысокую чувствительность (1х105-106 м.к./мл), возможность перекрестных реакций с Yersinia 6 enterocolitica, Francisella tularensis, Vibrio choleras, кроме того, эффективность методов во многом зависит от качества иммуноглобулинов и диагностикумов [Соколова Е.Е., 1986; Загоскина Т.Ю. с соавт., 1998; Кулаков Ю.К. с соавт., 1997].

В последнее десятилетие для диагностики бруцеллеза активно разрабатывается полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Fekete A. et al, 1990; Baily G.G. et al, 1992; Bricker B.J. et al, 1994; Leal- Klevezas D.S. et al, 1995; Romero C. et al, 1995; Куличенко A.H., 1995; Rijpens N.P. et al, 1996; Гаранина С.Б., 1996; Шумилов K.B. с соавт., 1996, 1998]. К достоинствам этой реакции относится ее высокая чувствительность и специфичность, быстрота получения результата, возможность выявления низких концентраций возбудителя инфекции в различном материале. ПЦР незаменима в изучении хронических инфекций, обусловленных персистирующими или труднокультивируемыми формами микроорганизмов, в том числе и бруцелла-ми. ПЦР соответствует всем основным требованиям, предъявляемым к современным методам лабораторной диагностики, и перспективна для широкого практического использования.

Однако до настоящего времени место ПЦР-анализа в общей схеме исследований при диагностике бруцеллеза до конца не определено. Это, прежде всего, связано с отсутствием стандартных препаратов, разрешенных к применению Минздравом России. Как показали наши исследования, используемые рядом отечественных авторов тест-системы, с разработанными ранее праймерами Brul-Bru2 при работе с биологическим материалом не обеспечивают 100 % специфичность и воспроизводимость результатов, что является обязательным для широкого практического внедрения препарата. Несмотря на отдельные публикации по применению ПЦР-анализа для диагностики бруцеллеза у людей [Шестопалов М.Ю. с соавт.,

1997; Шестопалов М.Ю., 1999; Дентовская С.В., 2000], окончательно не определена диагностическая значимость этого метода при обследовании контингентов риска по бруцеллезу. До сих пор не решен вопрос об эффективности использования ПЦР-анализа при исследовании на бруцеллез продуктов питания. С учетом изложенного очевидна актуальность создания и внедрения в практику ПЦР-тест-систем для детекции ДНК бруцелл, разработка оптимальных схем ПЦР-анализа.

Цель работы - разработка специфичных праймеров и совершенствование ПЦР-тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза, оценка ее диагностической эффективности при генной диагностике бруцеллеза у людей и детекции бруцелл в молоке и молочных продуктах.

Основные задачи исследования

1. Подобрать праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны бруцелл, и определить основные параметры ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность реакции.

2. Разработать на основе оптимальных праймеров диагностическую тест-систему, позволяющую выявлять все виды бруцелл в биологическом материале, объектах внешней среды и молочных продуктах.

3. Изучить диагностическую информативность разработанной тест-системы при работе с материалом, полученным от зараженных животных/Сравнить эффективность бактериологического метода и ПЦР при исследовании материала, искусственно инфицированного возбудителем бруцеллеза, а также органов, тканей и биологических жидкостей морских свинок, зараженных различными видами бруцелл. 8

4. Определить возможность использования ГЩР-анализа в комплексе с традиционными методами лабораторной диагностики для обследования контингентов риска по бруцеллезу.

5. Сравнить эффективность различных способов выделения и очистки ДНК, основанных на применении лизирующих агентов, фенольной экстракции, нуклео-сорбции для подготовки проб при ПЦР-анализе молока и молочных продуктов. Оценить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы при исследовании молочных продуктов, искусственно инфицированных возбудителем бруцеллеза.

Научная новизна работы

Разработана тест-система с праймерами ВгиЗ 1-Вги32 и Bru3-Bru4 на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны бруцелл, для исследования биологического материала и объектов внешней среды на наличие возбудителя бруцеллеза методом двухстадийной ("гнездовой") ЯЦР. Доказана ее высокая спецшриность и чувствительность при работе с чистыми культурами возбудителя бруцеллеза (1x102 - 1x103 м.к./мл) и объектами, искусственно инфицированными бруцеллами (1х103 м.к./мл).

Показано преимущество ПЦР-анализа с использованием разработанной тест-системы при исследовании органов, тканей и биологических жидкостей морских свинок, экспериментально зараженных бруцеллезом, и материала, искусственно контаминированного бруцеллами, по сравнению с бактериологическим методом.

Продемонстрирована эффективность использования ПЦР-анализа в комплексе с серологическими тестами для обследования контингентов риска по бруцеллезу (животноводов неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота 9 хозяйств и работников мясоперерабатывающего комбината).

Определены наиболее эффективные способы подготовки проб, обеспечивающие высокую степень экстракции и очистки ДНК при исследовании молочных продуктов методом ПНР.

Впервые показана возможность выявления ДНК возбудителя бруцеллеза методом ПЦР с предложенной тест-системой в молочных продуктах (сливках, сыре, масле) с чувствительностью lxlO3 - lxlO4 м.к./мл (г).

Практическая значимость работы

На диагностический набор "Тест-система для выявления Brucella spp. методом полимеразной цепной реакции" разработана нормативно-техническая документация (экспериментально производственный регламент, фармакопейная статья, фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению).

По программе, утвержденной комитетом МИБП, проведены Государственные приемочные испытания (протокол № 2 от 30.05.96 г.). Результаты Государственных испытаний одобрены ученым советом ГИСК им. JI.A. Тарасевича (протокол № 7 от 16.05.00 г.).

Получено разрешение комитета МИБП на внедрение препарата в практику здравоохранения (протокол №.7 от 05.07.00 г.).

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах повышения квалификации специалистов по ПЦР-диагностике при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб".

Основные положения, выносимые на защиту

1. ПЦР-тест-система на основе праймеров Bru31-Bru32 и Bru3-Bru4 обеспечивает специфичную детекцию всех видов бруцелл с чувствительностью lxlO2

10 lxlO3 m.k./mji при анализе чистых культур и 1х103 м.к./мл при исследовании биологического материала, объектов внешней среды и молочных продуктов, искусственно контаминированных Brucella spp.

2. По эффективности, чувствительности и быстроте выполнения ПЦР-анализ с использованием разработанной тест-системы превосходит бактериологический метод как при исследовании объектов, искусственно контаминированных возбудителем бруцеллеза, так и биологического материала от экспериментально зараженных животных.

3. При обследовании контингентов риска по бруцеллезу (животноводов хозяйств неблагополучных по бруцеллезу КРС и работников мясокомбината) ПЦР-анализ обладает большей диагностической точностью по сравнению с традиционными серологическими методами лабораторной диагностики.

4. Использование разработанной схемы ПНР-анализа позволяет выявлять возбудитель бруцеллеза в молоке и молочных продуктах с чувствительностью lxlO3 - lxlO4 м.к./мл (г).

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); П Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (Москва, 1998); II Всероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1998); Международной научно-практической конференции "Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территорий стран СНГ" (Саратов, 1998); VI Республиканской научно-практической конференции "Зоонозы: актуальные вопросы в

11 клинике и эксперименте" (Махачкала, 2000); I Всероссийской научно-практической конференции "Генная диагностика особо опасных инфекций" (Саратов, 2000). Публикации

Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях. Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 181 цитируемую работу. Общий объем диссертации 128 страниц. Текст иллюстрирован 12 таблицами и 10 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шарова, Ирина Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Подобраны праймеры ВгиЗ 1-ВгиЗ 2 на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез бежа внешней мембраны бруцелл молекулярной массой 31 кДа. Для данных праймеров оптимизированы параметры ПЦР, обеспечивающие высокую специфичность и чувствительность реакции при детекции ДНК возбудителя бруцеллёза.

2. Разработана тест-система для выявления возбудителя бруцеллёза методом двустадийной ПЦР с праймерами ВгиЗ 1-ВгиЗ 2 и Bru3-Bru4, позволяющая детектировать все виды рода Brucella с чувствительностью 1x10 -1x10 м.к./мл при анализе чистых культур и 1х103 - 1х104м.к./мл при исследовании биологического материала, молочных продуктов и объектов внешней среды, инфицированных возбудителем бруцеллёза. Предложенная ПЦР-тест-система сохраняет высокую специфичность и чувствительность в течение 6 месяцев хранения при минус 20 °С и обеспечивает 100 % воспроизводимость результатов.

3. В сравнительных экспериментах на модели бруцеллёзной инфекции у морских свинок доказано преимущество ПЦР-анализа по сравнению с бактериологическим методом. При этом диагностическая чувствительность ПЦР-анализа составила 100 %, время выполнения исследования - 6 часов, соответствующие показатели бактериологического метода - 53 % и 3-7 суток.

4. Показано, что наибольшая диагностическая чувствительность ПЦР-анализа при определении инфицирования организма лабораторных животных возбудителем бруцеллёза достигается при исследовании экстрактов селезёнки (66,6 %), и паховых лимфатических узлов (60 %).

105

5. Продемонстрирована высокая эффективность ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллёзу. Установлено, что при исследовании крови генодиагностический метод превосходит по чувствительности РНГА в 2,2 и РА в 2,5 раза. Достоверность результатов, полученных с помощью ПЦР, подтверждена данными эпидемиологического анамнеза.

6. Предложена модификация метода подготовки проб, основанного на лизисе гуанидинтиоцианатом с нуклеосорбцией на силикагеле, обеспечивающая высокую чувствительность ПЦР-анализа при исследовании жиросодержащих молочных продуктов. Применение ацетона на заключительной стадии обработки образца, позволяет выявлять ДНК бруцелл в молоке, сыре, сливках с чувствительностью lxlO3 м.к./мл(г), в масле - lxlO4 м.к./г. Для выделения и очистки ДНК при ПЦР-анализе молочных продуктов установлена также эффективность метода нуклеосорбции в присутствии Nal после обработки образца ионным детергентом (SDS).

106

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бруцеллез до настоящего времени остается распространенной инфекцией с высокими показателями заболеваемости людей в контингентах риска и наносящий серьезный экономический ущерб животноводству страны. Для обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия, своевременного проведения противо-бруцеллезных мероприятий, выявления и эффективного лечения больных необходима эффективная диагностика этого заболевания. Одним из наиболее перспективных направлений в решении данной проблемы является разработка и внедрение принципиально новых молекулярно-генетических методов, к которым относится полимеразная цепная реакция. Для диагностики бруцеллеза ПЦР разрабатывалась многими отечественными и зарубежными исследователями [Fekete A. et al., 1990; Baily G.G. et al., 1992; Bricker B.J. et al., 1994; Leal- Klevezas D.S. et al., 1995; Romero C. et al., 1995; Куличенко A.H., 1995; Rijpens N.P. et al, 1996; Гаранина С.Б., 1996; Шумилов K.B. с соавт., 1996, 1998]. Однако до наших исследований в Российской Федерации отсутствовали зарегистрированные и разрешенные к применению Минздравом России ПЦР-тест-системы, не было определено место ПЦР-анализа в схеме лабораторной диагностики бруцеллеза при обследовании контин-гентов риска и, особенно, для установления зараженности возбудителем бруцеллеза продуктов питания.

Ряд отечественных авторов для детекции бруцелл методом ПЦР используют праймеры Brul-Bru2 на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны бруцелл [Балахонов С.В. с соавт., 1996, 1999; Шестопалов М.Ю., 1997, 1999]. Но как показали последующие эксперименты при исследовании образцов биологического материа

91 ла методом ПЦР, с использованием данных амплимеров, незначительные изменения параметров реакции, ведут к снижению специфичности метода с получением ложноположительных ответов.

С целью подбора оптимальных праймеров, пригодных для создания диагностической тест-системы, нами с использованием компьютерной программы "Gene Runner" были проанализированы три пары олигонуклеотидов на основе ДНК гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны В. abortus BCSP 31 [Mayfield J.E. et al., 1988; Hailing S.M., Zehr E.S., 1990]. Размер фланкируемого фрагмента ДНК для праймеров, обозначенных Brull-Brul2, составил 571 п.н., для Bru21-Bru22 - 462 п.н. и для ВгиЗ 1-Вги32 - 299 п.н. Данные компьютерного анализа и результаты ПЦР с препаратами ДНК, приготовленными из штамма В. abortus 19ВА, свидетельствовали о возможности использования указанных праймеров для постановки реакции.

В серии экспериментов с лизатами бруцелл и гетерогенных микроорганизмов, а также эукариотической ДНК, подобраны оптимальные параметры реакции (температура отжига, количество циклов амплификации и время каждого шага, концентрации MgCl2 и фермента в реакционной смеси), при которых образование неспецифичных продуктов амплификации отсутствовало. При сравнении чувствительности и специфичности ПЦР с тестируемыми праймерами показано, что только две пары Brul 1-Brul2 и ВгиЗ 1-ВгиЗ2 при оптимальных условиях реакции обеспечивали чувствительность метода lxlO4м.к./мл и 100% специфичность. Однако образование специфичных ампликонов при использовании праймеров Brul 1-Brul2 было заметно снижено (окрашенные фрагменты ДНК слабо визуализировались в агарозном геле). Поэтому для дальнейшего исследования и создания ПЦР-тест

92 системы нами были выбраны праймеры ВгиЗ 1 и Вги32, как наиболее эффективные. ПЦР выполнялась при следующих условиях: реакционная смесь содержала - 10х буфер, рН 8,5, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ дНТФ, 12 пмоль каждого праймера, 1 ед. фермента Год-полимер азы (конечный объем реакционной смеси составил 25 мкл); 35 циклов амплификации проводили по программе: денатурация - (94±0,1)°С -1 мин, отжиг праймеров - (60± 0,1) °С - 1 мин, синтез комплементарной цепи -(72± 0,1) °С - 1 мин. После последнего цикла пробирки прогревали в течение 3 мин при температуре (72 ± 0,1) °С. Для снижения вероятности образования вторичных структур и неспецифичного связывания праймеров пробирки помещали в гнездо термоциклера только после достижения температуры денатурации. Изменение температуры отжига праймеров на ± 1 °С не влияло на специфичность и чувствительность реакции.

Достичь предельно высокой чувствительности ПЦР-анализа позволяет двух-стадийная («гнездовая») ПЦР, при которой образование продуктов реакции осуществляется в два этапа с помощью двух пар праймеров: внешних и внутренних. Для проведения второго этапа ПЦР мы использовали внутренние праймеры ВгиЗ и Bru4, обеспечивающих амплификацию фрагментов первичных ампликонов с образованием вторичных фрагментов ДНК размером 175 п.н. [Гаранина С.Б., 1996].

В контрольных экспериментах чувствительность метода с праймерами л л

ВгиЗ 1-ВгиЗ2 и Bru3-Bru4 составила 1x10 -1x10 м.к./мл. С целью сокращения времени проведения анализа мы уменьшили количество циклов на первом этапе с 35 до 25 и продолжительность каждого шага реакции с 1 мин до 40 сек на первом и до 30 сек - на втором этапах. Это позволило без снижения чувствительности и специфичности метода сократить время проведения ПЦР более чем в два раза.

93

В результате проведенной работы на основе двухстадийной ПЦР была сконструирована тест-система для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР, которая состоит из 11 компонентов:

- водных растворов двух пар олигонуклеотидных праймеров Bru31 и Bru32. ВгиЗ и Вги4.

- ТЦг-полимеразы - термостабильной ДНК-полимеразы в буферном растворе, выделенной из штамма Thermus aquaticus YT-1 («Promega», США).

- дНТФ - водного раствора дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (НПО «Вектор»).

- К+ (полоясительного контроля) - водного раствора ДНК В. abortus 19 В А.

- ЮхБ - 10-кратного буферного раствора рН 8,5.

- MgCl2 - 1 % раствора магния хлорида (ГОСТ 4209-67).

- Н20 - воды деионизованной стерильной (ГОСТ 6709-72).

- Масла - масла вазелинового стерильного (ГОСТ 3164-78).

Диагностическую эффективность разработанной ПЦР-тест-системы оценивали в ходе комиссионных испытаний в соответствии с основными требованиями, предъявляемыми к диагностическим препаратам: специфичность, высокая чувствительность, стабильность, воспроизводимость получаемых результатов, быстрота выполнения исследования. В качестве метода сравнения использовали бактериологический анализ.

Эксперименты проводили с 37 штаммами шести видов бруцелл, 17 штаммами гетерогенных микроорганизмов, имеющих антигенное сходство с бруцеллами. Исследовали также образцы крови, молока, почвы, смывов с поверхностей, искусственно инфицированных различными видами бруцелл, и пробы биологического

94 материала и объектов внешней среды, искусственно контаминированные V. cholerae, Y. enterocolitica, F. tularensis.

В результате проведенной работы была показана высокая чувствительность ПЦР-тест-системы, которая при анализе чистых культур бруцелл составила 1x10^ -1х103м.к./мл, а при исследовании биологического материала и объектов внешней среды, искусственно контаминированных Brucella spp. - lxlO3 м.к./мл. Положительные результаты ПЦР зарегистрированы со всеми 37 штаммами различных видов и биотипов бруцелл. Образование специфичного фрагмента ДНК было отмечено в 100 % случаев при исследовании проб, содержащих возбудитель бруцеллеза в л О концентрации 1x10 м.к./мл, в 80,1 % - в концентрации 1x10 м.к./мл и в 19,4 % - в концентрации 10 м.к./мл. Частота выявления бруцелл в искусственно инфицированных пробах объектов внешней среды (смывы, почва), молока, крови в концен

-5 трации 1x10 м.к./мл составила 100 % (диагностическая чувствительность метода). При тестировании различных штаммов гетерогенных микроорганизмов в 100 % случаев в ПЦР был получен отрицательный ответ. Представленные данные свидетельствуют о высокой специфичности тест-системы и родоспецифичности выбранных нами праймеров.

Сравнительный анализ бактериологического метода и ПЦР с использованием разработанной нами тест-системы показал значительное преимущество ПЦР как по скорости получения результатов, 6-8 ч при ПЦР-анализе и 72-96 ч при культивировании возбудителя in vitro, так и по способности выявлять возбудитель в материале, контаминированном посторонней микрофлорой (объекты внешней среды, молоко). При изучении стабильности препарата было установлено, что в условиях низкотемпературного холодильника (минус 20±2°С) ПЦР-тест-система не снижала

95 свою эффективность в течение 6 мес. и обеспечивала 100 % воспроизводимость результатов. Полученные результаты вошли в отчет государственных приемочных испытаний тест-системы для выявления Brucella spp. методом полимеразной цепной реакции и одобрены ученым советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол № 7 от 16.05.00 г.). Комитетом МИБП разработанный нами препарат рекомендован для внедрения в практику здравоохранения (протокол №.7 от 05.07.00 г).

Материалы исследований свидетельствуют, о том, что разработанная ПЦР-тест-система при исследовании чистых культур различных видов бруцелл и материала, искусственно инфицированного возбудителем бруцеллеза, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Однако они не позволяют дать объективную оценку диагностической точности изучаемого препарата при истинном инфекционном процессе, поскольку бруцеллы являются внутриклеточными паразитами и искусственное заражение материала не отражает подлинной картины инфицирования тканей организма возбудителем бруцеллеза. Поэтому целью следующего этапа нашей работы была оценка эффективности ПЦР по сравнению с бактериологическим методом при исследовании материала от животных, экспериментально зараженных возбудителем бруцеллеза.

При исследовании методом ПЦР суспензий органов морских свинок, зараженных подкожно культурами вирулентных штаммов В. abortus, В. melitensis и В. suis в дозе 1000 м.к., ДНК бруцелл выявлена в 66 из 135 проб (48,8 %). Причем, положительные результаты ПЦР отмечены при исследовании всех зараженных животных (100 %). Более высокая диагностическая эффективность ПЦР-анализа достигалась при исследовании селезенки и паховых лимфатических узлов, где ДНК бруцелл была выявлена в 66,6 % и 60 % случаев соответственно. В печени, легких,

96 почках, парааорталышх лимфатических узлах, крови, мышечной ткани и моче амплификация фрагмента ДНК бруцелл наблюдалась в меньшем проценте случаев (30 - 53 %). С материалом от контрольных (интактных) морских свинок в ПЦР получен отрицательный ответ.

При бактериологическом исследовании культуры возбудителя бруцеллеза выделены только из лимфатических узлов и селезенки, лишь от восьми из 15 животных (53 %) и только в 12 случаях (8,9 %). Преимущественная локализация бруцелл в селезенке и лимфатических узлах при бруцеллезной инфекции установлена В.А. Штритером. [1937], П.А. Вершиловой с соавт. [1954], И.Ф. Тараном с соавт. [1966]. Однако с помощью ПЦР в нашем эксперименте возбудитель бруцеллеза удавалось выявлять в этих органах соответственно в 2,5 и 2 раза чаще, чем при бактериологическом исследовании, что свидетельствует о преимуществе ПЦР-анализа по сравнению с культуральным методом. Еще одним преимуществом ПЦР-анализа является быстрота получения результата. Уже через 6 ч методом ПЦР было подтверждено наличие возбудителя в исследуемом материале от зараженных бруцеллезом морских свинок, в то время как при бактериологическом исследовании выделить культуру бруцелл удалось лишь на 3-й - 7-е сутки.

Сравнительное изучение данных по выявлению бруцелл при заражении морских свинок различными видами возбудителя показало, что больше всего положительных ответов получено при исследовании в ПЦР суспензий органов животных, зараженных вирулентными штаммами В. melitensis и В. suis. Культуры бруцелл в большем проценте случаев также были выделены от животных, зараженными этими видами. Это соответствует данным И.Ф. Тарана [1967] который показал, что морские свинки проявляют большую устойчивость к заражению вирулентным

97 штаммом В. abortus, чем к В. melitensis и В. suis. Однако в наших исследованиях достоверных различий индекса выявляемости бруцелл (аналогичного индексу вы-севаемости при бактериологических исследованиях) в органах и тканях морских свинок, зараженных вирулентными культурами бруцелл не установлено (Р > 0,05). Возможно, это связано с ограниченным количеством животных, взятых в эксперимент, либо с относительно высокой дозой заражения.

Таким образом, нами установлено, что при исследовании зараженных животных методом ПЦР, также как и при бактериологическом анализе, более информативным материалом являются лимфатические узлы и селезенка, т.к. в этих органах возбудитель обнаруживается в большем проценте случаев. Показано преимущество использования ПЦР при исследовании органов и тканей зараженных бруцеллезом морских свинок по сравнению с бактериологическим методом и доказана диагностическая эффективность разработанной тест-системы.

Следующим этапом наших исследований была оценка эффективности ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллезу. Сложная социально-экономическая ситуация, сложившаяся в настоящее время, существенно ограничивает возможность проведения полного комплекса противобруцеллезных мероприятий. Это приводит к тому, что "свежие" случаи заболевания бруцеллезом регистрируются на территории Российской Федерации практически повсеместно. С появлением новых форм и методов ведения животноводства (аренда, семейный подряд, фермерство и др.) изменились условия распространения бруцеллезной инфекции среди лиц занятых животноводством [Баташев В.В., 1996; Баташев В.В. с соавт., 1998]. Отмечается рост заболеваемости людей бруцеллезом в хозяйствах, которые официально считаются благополучными по данной инфекции [Лямкин Г.И. с со

98 авт., 1995; Калиновский А.И., 1997; Панченко В.П. с соавт., 1998 а, б]. Все это обусловливает необходимость изучения заболеваемости и инфицированности населения с учетом эпидемиологических особенностей бруцеллеза в современных условиях и внедрения наиболее чувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики в первую очередь, для обследования лиц, относящихся к континген-там риска.

Для сравнения эффективности ПЦР и ряда традиционных методов диагностики бруцеллеза у людей, таких как РА, РИГА, была определена их диагностическая чувствительность. Совместно с сотрудниками ЦГСЭН по Саратовской области проведено исследование образцов крови и сыворотки крови от 160 чел., относящихся к контингентам риска по бруцеллезу (работники мясокомбината и животноводы хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу КРС) и 50 доноров, проживающих в г. Саратове.

С помощью, разработанной нами ПЦР-тест-системы и общепринятых серологических тестов РА и РИГА среди декретированного контингента выявлено 15 % лиц с положительными реакциями на бруцеллез. ПЦР была положительна у 12,5 % обследованных. Положительные серологические реакции РПГА и РА в диагностических титрах отмечены в 5,8 и 5 % случаев соответственно. Образцы крови и сывороток крови контрольной группы во всех случаях были серо- и ПЦР-негативными.

Нами установлено достоверное различие в диагностической эффективности серологических реакций и ПЦР. Так, диагностическая чувствительность (процент положительных результатов в группе людей с данным заболеванием) РНГА уступала аналогичному показателю для ПЦР в 2,2 раза, РА - в 2,5 раза (Р от 0,05 до

99

0,02). Статистически достоверной разницы между количеством положительных ответов в РА и РНГА не установлено (Р > 0,1).

При обследовании 95 работников животноводческих хозяйств с помощью серологических тестов и ПЦР выявлено 14,7 % лиц с положительными реакциями на бруцеллез. Следует отметить, что в половине случаев факт инфицирования подтвержден установлением клинического диагноза. Причем у всех этих лиц в ПЦР был зарегистрирован положительный результат. Всего при ПЦР-анализе ДНК бруцелл выявлена у 11,5 % работников. Большинство среди инфицированных (64 %) составляют лица, непосредственно занятые обслуживанием животных и переработкой продукции животноводства (скотники, телятница, повар, сепараторщица, боец, ветврач). Высокий процент инфицированных выявлен нами среди работников, временно привлекаемых для работы на ферму (35,7 %). Это подтверждает вывод В.В. Баташева [1996] о том, что в очаге бруцеллеза вероятность заражения этой инфекцией высока для всех работающих.

Среди 65 работников Энгельсского мясоперерабатывающего комбината положительные реакции на бруцеллез, всеми используемыми методами, обнаружены у 10 чел. (15,3 %) из которых у пяти - положительные серологические реакции отмечены ранее при профилактических осмотрах. ПЦР была отрицательна только у одного человека, в то же время титр серологической реакции в этом случае был не диагностическим. Как и в проведенных исследованиях П.А. Вершиловой с соавт. [1972], В.Н. Корзенко [1970], Е.С. Белозерова [1985], наибольшее число инфицированных выявлено нами среди работников бойни, шкуропосолочного и кишечного цехов, т.е. у персонала, имеющего высокую степень контакта с объектами зараженными возбудителем бруцеллеза. Полученные результаты показывают более высо

100 кую диагностическую эффективность ПЦР по сравнению с серологическими реакциями при тестировании крови животноводов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств и работников мясокомбината и свидетельствуют о возможности использования ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллезу. Подтвержден профессиональный характер заболеваемости. Установлена наибольшая заболеваемость лиц трудоспособного возраста, независимо от принадлежности к полу, а также высокая заболеваемость бруцеллезом лиц, временно привлеченных к работе в очаге.

Молоко и молочные продукты, зараженные бруцеллами, неоднократно являлись причиной заболевания людей бруцеллезной инфекцией. В нашу задачу входило установить возможность использования ПЦР-анализа и разработанной нами тест-ситемы для детекции возбудителя бруцеллеза в таких продуктах, как молоко, сыр, масло, сливки.

В проведенных ранее экспериментах при определении специфичности тест-системы мы использовали микроорганизмы, которые имеют антигенное сходство с бруцеллами. Однако существует большое количество возбудителей других инфекций, способных длительно сохранятся в молочных продуктах и при употреблении таких продуктов в пищу вызывать различные инфекционные заболевания (туберкулез, салмонеллез, туляремию, листериоз, лептоспироз, дизентерию, эшерихиозы, кишечный иерсиниоз, кампилобактериоз, гепатит А и др.). Поэтому первым этапом данного раздела нашей работы была проверка специфичности ПЦР-тест-системы при исследовании различных видов бактерий - возбудителей зоонозных, антропо-зоонозных и антропонозных инфекций, передающихся алиментарным путем, прежде всего через молоко. При тестировании в ПЦР 41 штамма таких микроорганиз

101 мов ни в одном случае не отмечен положительный результат, что подтверждает специфичность ПЦР-тест-системы.

При исследовании молочных продуктов, содержащих большое количество различных соединений, способных ингибировать реакцию, успешное проведение ПЦР зависит от качества выделения ДНК-мишени и степени ее очистки. Следующим этапом был выбор оптимального метода выделения ДНК. Сравнивали четыре различных способа:

- метод нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоцианата;

- обработку лизирующим буфером, содержащим иодид натрия, с переосаждением ДНК изопропанолом;

- сорбцию ДНК на нуклеосорбенте в присутствии Nal после обработки образца ионным детергентом (SDS);

- метод фенол-хлороформовой экстракции с последующим переосаждением ДНК этанолом.

Качество очистки ДНК оценивали по эффективности ПЦР-анализа при работе с образцами молока, сливок, масла и рассольного сыра, искусственно инфицированными В. abortus 19ВА.

Полученные результаты показали, что все четыре способа выделения ДНК обеспечивают достаточную очистку проб от компонентов, способных ингибировать реакцию. При исследовании молока, сливок и сыра, независимо от способа выделения нуклеиновых кислот, чувствительность ПЦР-анализа составила lxlO3 м.к./мл (г) продукта, при работе с образцами масла - 1х104м.к./г. Однако степень очистки ДНК была выше при использовании фенол-хлороформовой экстракции и метода нуклеосорбции в присутствии Nal после обработки образца SDS

102 способы 3 и 4), о чем свидетельствовал больший выход ПЦР-продукта. Но оба способа имеют один недостаток - необходимость переноса материала из пробирки в пробирку, что нежелательно из-за риска контаминации. Более низкая степень очистки ДНК другими методами (способы 1 и 2) по-видимому, обусловлена тем, что лизирующие буферы, используемые в этих методах, не содержат органических растворителей, а дополнительная очистка образца ацетоном на заключительном этапе не обеспечивает полное удаление жиров, что снижает эффективность амплификации.

По длительности, процедура выделения ДНК с помощью способа, основанного на фенол-хлороформовой экстракции, занимает почти вдвое больше времени, чем остальные методы. Это ограничивает его использование при исследовании большого количества образцов. Методы, с использованием гуанидинтиоцианата и иодида натрия (1-й и 2-й методы) по быстроте выделения ДНК не отличаются друг от друга, но превосходят способ на основе SDS (3-й метод). Таким образом, применение ПЦР для детекции бруцелл в молоке, сливках, сыре и масле возможно после соответствующей подготовки проб с чувствительностью lxlO3 -lxlO4 м.к./мл (г) продукта.

В результате проведенной работы разработана тест-система для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Показана ее эффективность при исследовании различного биологического материала, объектов внешней среды и продуктов питания, а также более высокая диагностическая чувствительность по сравнению с традиционными серологическими методами при выявлении людей, инфицированных возбудителем бруцеллеза. Тест-система прошла комиссионные испытания и рекомендована для

103 практического внедрения комитетом МИБП Минздрава России. Разработанная тест-система была апробирована в практике Саратовского областного центра Госсанэпиднадзора для диагностики бруцеллеза у людей и может быть использована при обследовании декретированных контингентов, а также при проведении лабораторного контроля молока и молочных продуктов на зараженность возбудителем бруцеллеза.

104

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шарова, Ирина Николаевна, Саратов

1. Аляпкина Ю.С., Аксенов М.Ю., Чернов Б.К., Гинцбург А.Л. Количественный ПЦР-анализ: разработка системы определения содержания амплифицированно-го фрагмента ДНК // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 1994. - № 5. - С. 22-26.

2. Антоненко А.Д. Научное обоснование системы мер профилактики особо опасных инфекционных заболеваний в Ставропольском крае в современных условиях: Дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 2000. - 194 с.

3. Аскалонов С.П., Добриер И.Б., Гордин Б.Л. Микробиологическое исследование и санитарная экспертиза пищевых продуктов. К.: Госмедиздат, 1955. - 295 с.

4. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Ленмедгиз, 1962. - 180 с.

5. Балахонов С.В. Геномные маркеры возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, холеры, бруцеллеза (эпидемиологическое и диагностическое значение): Автореф. дис. . докт. мед. наук. Иркутск, 2000. - 33 с.

6. Балахонов С.В., Шестопалов М.Ю., Калиновский А.И. Оптимизации детекции бруцелл с помощью полимеразной цепной реакции // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 1996. - № 4. - С. 33-35.

7. Балахонов С.В., Шестопалов М.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Опыт107использования полимеразной цепной реакции в диагностике бруцеллеза и холеры // БГХ9ЭС Тэв. Эрдэм шинжилгээний бутээл. Улаанбаатар, 1999. - Дутаар 7. - С. 175-179.

8. Баташев В.В. Эпидемиологическая характеристика бруцеллеза в современных условиях ведения животноводства: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов на Дону, 1996.-20 с.

9. Баташев В.В., Уралева B.C., Кучин Г.А. с соавт. Эпидемиологическая характеристика бруцеллеза в современных условиях // Журн. микробиол. 1998. - № 3. - С. 24-26.

10. Беклемишев Н.Д. Хронический бруцеллез. Алма-Ата, 1957. - 203 с.

11. Белозеров Е.С. Бруцеллез. JL: Медицина. - 1985. - 184 с.

12. Белоусов Е.С., Ощепков В.Г. Иммуноферментный метод для диагностики КРС // Сельскохозяйственная биология. 1986. -№11. -С. 122-123.

13. Бельченко В.Б., Сайдашева С.Е. Роз-бенгал проба при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота // Вестник с.-хоз. науки Казахстана. 1980. - № 4. - С. 66-68.

14. Бельченко В.Б., Иванов Н.П. РНГА для диагностики бруцеллеза телят // Ветеринария. 1973. - № 1. - С. 109-112.

15. Богданов И.К., Пугачева О.Н. Эпидемиологическая ситуация и тактика дальнейшего совершенствования медицинской помощи больным бруцеллезом в Ставропольском крае // Совр. аспекты профилакт. зоонозных инф.: Тез. докл. науч. конф. Ставрополь, 1991. - С. 4-5.

16. Боровик Е.А., Фомин Б.А., Артюшин С.К. Применение ДНК гибридизационного тест-набора для идентификации культур бруцелл. //Тез. докл. III Всес. конф. по108эпизоотологии. Новосибирск, 1991. - С. 164-165.

17. Булашов А.К., Львов В.Л., Дмитриев А.Ф. с соавт. Использование «Поли-Б» антигена для дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. Целиноград, 1989. - 10 с.

18. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекул, микробиол. 1991. -Т. 25, Вып. 4. - С. 926-936.

19. Вершилова П.А., Голубева А.А., Кайтмазова Е.И. Бруцеллез (2-е изд., перераб. и доп.). М.: Медицина, 1972. - 439 с.

20. Вершилова П.А., Чернышева М.Н., Князева Э.Н. Патогенез и иммунология бруцеллеза (экспериментальные данные). М.: Медицина. - 1974. - 272 с.

21. Ворошилова М.К., Жевандрова В.М., Балаян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М.: Медицина, 1964. - 151 с.

22. Гаранина С.Б. Конструирование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллеза: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1996. - 19 с.

23. Говорун В.М., Генерозов Э.В. Некоторые технологические аспекты развития медицинской ПЦР-лаборатории // Генодиагностика в современ. мед.: Тез. докл. 3-й Всероссийск. научн. практич. конф., 25-27 янв. 2000 г. Москва, 2000. - С. 7-11.

24. Григорьева Г.И., Сочнев В.В., Бацанов Н.П., Филиппов Н.В. с соавт. Бруцеллы и бруцеллез. Н. Новгород. - 1998. - 246 с.

25. Дегтяренко Л.В. Некоторые аспекты диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота // Актуал. вопр. профилакт. бруцеллеза и организации мед. помощи больным: Тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. Новосибирск, 24-25 окт. М., 1989. - С. 122-123.

26. Дентовская С.В., Гаранина С.Б., Куличенко А.Н. с соавт. ПЦР-диагностики бруцеллеза у людей // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инф. заболеваний: М-лы II Всерос. конф., 20-22 янв. 1998 г. Москва, 1998.-С. 111-112.

27. Дентовская С.В., Куличенко А.Н. Использование молекулярно-генетических подходов для лабораторной диагностики бруцеллеза // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1999. - С. 3-11.

28. Дранкин Д.И. Продукты питания и инфекция. Саратов.: Изд-во Сарат. ун-та, 1984. -Ч. 1. - 167 с.

29. Дранкин Д.И. Продукты питания и инфекция. Саратов.: Изд-во Сарат. ун-та, 1984. - Ч. 2. - 272 с.

30. Дубинина И.Г., Щербо С.Н. Роль метода полимеразной цепной реакции в генодиагностике // В кн: Новые генетические технологии. М., 1998. - С. 20-37.

31. Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. -Ставрополь, 1996. 131 с.

32. Желудков M.M. Перспективы совершенствования лабораторной диагностики бруцеллёза. // Актуал. вопр. профилакт. бруцеллеза и организации мед. помощи больным: Тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. Новосибирск, 24-25 окт. -М., 1989. -1989. -С.91-92.

33. Желудков М.М., Павлова И.П., Умнова Н.С., Перекопский И.С. Иммуноферментный метод в диагностике бруцеллеза у людей // Журн. микробиол. 1986. - № 8. - С. 59-63.

34. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1993. 112 с.

35. Иванов М.М., Малахова Т.И., Ватке Б. с соавт. Испытание Роз-бенгал антигена при диагностике бруцеллеза у животных // Ветеринария. 1976. - № 9. - С. 8789.

36. Инструкция к набору для подготовки к анализу методом полимеразной цепной реакции (НИИ Микробиологии МО РФ)

37. Инструкция к набору реагентов "Полигеп-С" (НПФ "Литех", г. Москва)

38. Кайтмазова Е.И., Чернышева М.И. Лабораторная диагностика бруцеллеза // Бруцеллез: под ред. П.А. Вершиловой. М.: Медицина, 1972. - 21 с.

39. Касьянов А.И. Аллергический метод диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных // Труды ВИЭВ. 1979. - Т. 49. - С. 114-122.

40. Клевакин В.М., Карцев В.В. Санитарная микробиология пищевых продуктов. -Л.: Медицина, 1986. 176 с.

41. Комяков Я.Е., Сайдулдин Т. Диагностическое значение реакции Кумбса при бруцеллезе // Ветеринария. 1974. - № 3. - С. 27-33.

42. Корзенко В.Н. Особенности бруцеллеза у людей при заражении В. abortus (эпи113демиологические, бактериологические, клииико-иммунологические и экспериментальные исследования): Автореф. дис. . докт. мед. наук. -М., 1974. 33 с.

43. Коромыслов Г.Ф., Фомин Б.А., Артюшин С.К. с соавт. Различия в первичной структуре ДНК микроорганизмов, патогенных для сельскохозяйственных животных // V Всесоюз. биохим. съезд: Тез. стендовых сообщений. М., 1986. -Т. 3. - С. 304.

44. Кузмиченок А.П., Мельниченко В.И. Оптимизация метода идентификации бруцелл реакцией ДНК гибридизации // Современ. аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилакт. особо опасных инф. болезней. Ставрополь, 1993.- С. 71-72.

45. Кулаков Ю.К., Горелов В.Н., Мотин B.JI. с соавт. Высокочувствительная неизотопная система гибридизации ДНК с применением амплификации (ПЦР) для идентификации и индикации бруцелл // Молекул, генет., микробиол. и вирусол.- 1992.- № 7-8. С. 23-27.

46. Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Драновская Е.А., Скавронская А.Г. Сравнительное изучение антигенного состава штаммов Brucella canis методом имму-ноблотинга // Молекул, генет. 1997. - № 3. - С. 15-17.

47. Куличенко А.Н. Конструирование молекулярно-генетических систем для детекции возбудителей особо опасных инфекций: чумы, бруцеллеза и сибирской яз114вы: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1995. - 38 с.

48. Куличенко А.Н., Гаранина С.Б., Амплеева Э.А., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Способ детекции бруцелл при помощи полимеразной цепной реакции // Пробл. особо опасных инф. 1994. - № 4 (74). - С. 165-172.

49. Лившиц Ю.И. Требования к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания // Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М.: Медицина, 1978. - С. 24-26.

50. Лямкин Г.И., Щедрин В.И., Таран И.Ф. Способ индикации возбудителя бруцеллёза // В сб.: Современ. аспекты природной очаговости, эпидемиологии и про-филакт. особо опасных инф. болезней. Тез. докл. науч. конф. Ставрополь, 1993. - С. 231-232.

51. Маматова З.Б. Иммуноферментный метод при диагностике бруцеллеза: Автореф. дис. . канд. вет. наук. М., 1986. - 16 с.

52. Методические указания по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей. М., 1980. - 45 с.

53. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 1 (лекция) // Клин. лаб. диагност. -2000.-№4.-С. 25-33.

54. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 2 (лекция) // Клин. лаб. диагност. -2000.-№ 5. С. 25-32.

55. Оншценко Г.Г. Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней в Сибири. М.: ВУНМЦ МЗ РФ. - 1999. - 211 с.

56. Панченко В.П., Лямкин Г.И., Таран В.Г. с соавт. Эпизоотолого-эпидемиологический анализ современного состояния по бруцеллезу в Ставропольском крае // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Матер. II Междунар. конф. Санкт-Петербург, 1998. - С. 163.

57. Попова О.М. Особенности загрязнения молока ассоциацией аэробных микроорганизмов и их выявление в Саратовской области: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1997. - 19 с.

58. Радюк С.Н., Мацевич Г.Р., Рытов К.А., Ларюкова Т.А. Неизотопный вариант количественного анализа с помощью полимеразной цепной реакции в диагностике ВИЧ-инфекции // Вопр. вирусол. 1996. - Т. 41, № 1. - С. 44-45.

59. Ригельман Р. Как избежать врачебных ошибок. М.: Медицина, 1994. - 186 с.

60. Сазыкин С.П. Клинико-эпидемиологические особенности бруцеллеза типа крупного рогатого скота: Автореф. дис. .канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 1960. -15 с.116

61. Соколова Е.Е. Изучение перекрестных серологических реакций, вызываемых Yersinia enterocolitica серовара 0:9 и бруцеллами // Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1986. - 21 с.

62. Соколова И.А., Лямкин Г.И., Брюханов А.Ф. с соавт. Сравнительное изучение методов подготовки проб материала, содержащего бруцеллы, к проведению ПЦР // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 2000. - Вып. 80. - С. 148-151.

63. Таран И.Ф. Иммунологическая реактивность и вакцинопрофилактика при бруцеллезе: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1967. - 35 с.

64. Таран И.Ф. К изучению некоторых особенностей патогенеза и иммуногенеза при бруцеллезной инфекции // Зоонозы (бруцеллез, лептоспироз и другие): Матер. конф., октябрь 1996 г. Ставрополь-на-Кавказе, 1966. - С. 74-86.

65. Таран И.Ф., Лямкин Г.И. Бруцеллез (микробиология, иммунология, эпидемиология, профилактика). Ставрополь, 1996. - 173 с.

66. Таран И.Ф., Лямкин Г.И. Основные этапы развития учения о бруцеллезе // Матер. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997. - Т. 1. - С. 148.

67. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Л.: Колос. - 1976. -280 с.

68. Федоров Н.А., Суханов Ю.С., Асади Мобархан А.Х., Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). М., 1996. 33 с.

69. Фомин Б.А., Розанцев К.Э., Мельниченко В.И. с соавт. Разработка метода идентификации бруцелл с помощью амплификации ДНК // Матер, науч. конф. по с/х биотехнологии. Целиноград, 1991. - С. 126.

70. Хаиров Г.С. Сравнение чувствительности РПГА с РА, РСК, РБП // Новые методы диагност, зоонозных инф. Минск, 1982. - С. 105-114.

71. Хотющенко Т.И. Использование метода телевизионного микрометрического анализа для повышения эффективности методов серодиагностики и иммуноин-дикации // Дис. . .канд. биол. наук. Саратов, 1996. - 196 с.

72. Чернышева М.И., Асланян Р.Г., Мнацаканян А.Г. Оценка чувствительности реакции непрямой гемагглютинации и других методов диагностики бруцеллеза у людей // Журн. микробиол. 1969. - № 7. - С. 55.

73. Чернышева М.И., Вашкевич Р.Б. Пластинчатая реакция агглютинации с роз-бенгал у северных оленей при бруцеллезе // Ветеринария. 1974. - № 7. - С. 100101.

74. Чернышева М.И., Губина Е.А. Серологическая диагностика бруцеллеза // Тез. докл. Всесоюзн. научн.-практ. конф. по бруцеллезу, Алма-Ата, 1978. М., 1978. - С. 85-86.119

75. Чернышева М.И., Губина Е.А., Желудков М.М., Перекопная Т.И. Диагностическая ценность ускоренной реакции Роз-Бенгал при бруцеллезе у людей // Тез. докл. Всесоюзн. научн.-практ. конф. по бруцеллезу, Алма-Ата, 1978. М., 1978. - С. 93-94.

76. Шарова И.Н., Плотникова Е.А., Самойлова JIB. с соавт. Применение ПЦР для обследования групп риска по бруцеллезу // Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997. - Т. 2. -С. 237.

77. Шаханина И.Л., Филатов Н.Н., Осипова JI.A. с соавт. Экономический анализ в санитарно-эпидемиологической службе г. Москвы // Актуал. вопр. эпидемиологии инф. болезней: М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. Вып. 3. - 320 с.

78. Шестопалов М.Ю. Практические аспекты использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике бруцеллеза: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1999. - 23 с.

79. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов // Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ. / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - С. 395-402.

80. Шимко И.Б. Применение пенициллиназы в качестве маркера в иммуноферментном анализе для диагностики бруцелл. // Автореф. дис. .канд. мед наук. Ставрополь, 1991. - 201 с.

81. Штритер В. Зоонозы. M.-JL: Медгиз, 1937. - 75 с.

82. Шумилов К.В., Скляров О.Д., Обухов И.Л., Груздев К.Н. Идентификация бруцелл методом ПЦР // Ветеринария. 1996. - № 12. - С. 19-23.

83. Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин B.C. Иммуноферментный анализ в микробиологии. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. - 1990,- 112 с.

84. Albert J., Fenyo Е.М. Simple, sensitive and specific detection of human immunodeficiency vims type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 1560-1564.

85. Baily G.G., Krahn J.B. Drasar B.S., Stoker N.G. Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus de DNA amplification // J. Trop. Med. Hyg. 1992. - Vol. 95, №4. - P. 271-275.

86. Bassam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1991. - Vol. 196. - P. 80-83 .

87. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 495.

88. Bricker B.J., Hailing S.M. Differentiation of Brucella abortus bv .1,2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv 1 by PCR // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 2660-2666.

89. Brooks-Adler В., Splitter G. Determination of bovine lymphocyte responses to extracted protein of Brucella abortus by using protein immunobloting // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, № 10. - P. 2581-2586.

90. Byrd J.W., Heck F., Hidalgo R. Evaluation of the enzime-linked immunosorbent122assay for detecting Brucella abortus antibodies //Amer. J.Vet.Res. -1979. Vol. 10. -P. 896-898.

91. Campero C.M., Ladss P. W., Hoffman D.U. et al. Immunopathology of experimental B. abortus strain 19 infection of the genitalia of bulls //Vet. Immunol, and Im-munopatol. 1990. - Vol. 24. - P. 235-246.

92. Casao M.A., Leiva J., Diaz R., Gamazo C. Anti-phosphatidylcholine antibodies in patients with brucellosis // J. Med. Microbiol. 1998. - Vol. 47. - P. 49-54.

93. Chevrier D. et al. PCR product quantification by non-radioactive hybridization procedures using an oligonucleotide covalently bound to Micro Wells // Mol. and Cell. Probes. 1993. - Vol. 7. - P. 187-197.

94. Clementi M., Menzo S., Bagnarelli P. et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology // PCR Methods Appl. 1993. - Vol. 2. - P. 191-196.

95. Cloeckaert A., Salih-Alj Debarrh H. et al. Polymorphism at the dnaK locus of Brucella species and identification of Brucella melitensis species-specific marker // J. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 45, № 3. - p. 200-213.

96. Cross N.C.P. Quantitative PCR techniques and applications // Br. J. Haematol. -1995. Vol. 89. - P. 693-697.

97. Da Costa M., Guillou J.P., Garinbastuji B. et al. Specificity of six gene for the detection of the genus Brucella by DNA amplification // J. Appl. Bacterid. 1996. - Vol. 81.-P. 267-275.123

98. DiDomenico Nicolas, Link Hans, Knobel Rolf et al. COBAS AMPLICOR: Filly automated RNA and DNA amplification and detection system for routine diagnostic PCR // Clin. Chem. 1996. - Vol. 42, № 12. - P. 1915-1923.

99. Don R.H., Сох P.T., Wamwright B.J. et al. Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification // Nucleic Acids Res. 1991. - Vol. 19. - P. 4008.

100. Dutilh В., Bebear C., Rodriguez P. et al. Specific amplification of DNA sequence common to all Chlamidia trachomatis serovars using the PCR // Res. Microbiol.1989.-Vol. 140.-P. 7-16.

101. Fekete A., Bantle J. A., Hailing S. M., Sanborn M. R. Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction // J. Appl. Bacterid.1990.-Vol. 69.-P. 216-227.

102. Fekete A., Bantle J.A., Hailing S.M., Stich R.W. Amplification fragment length polymorphism in Brucella strains by use of polymerase chain reaction with arbitrary primers // J. Bacterid. 1992. - Vol. 174. - P. 7778-7783.

103. Ferre F. Quantitative or semi-quantitative PGR: reality versus myth // PCR Methods Appl. 1992. - Vol. 2. - P. 1-9.

104. Foley K.P., Leonard M.W., Engel J.D. Quantitation of RNA using the polymerase chain reaction // Trends Jenet. 1993. - Vol. 9. - P. 380-385.

105. Gaya P., Sancher J., Medina V., Nunez M. Incidens of Listeria monocytogenes other Listeria species in raw milk produced in Spain // Food Microbiol. 1998. - Vol. 15. -P. 551-555.

106. Hailing S.M., Zehr E.S. Polymorphism in Brucella spp. due to highly repeated DNA // J. Bacterid. 1990. - Vol. 172. - P. 6637-6640.

107. Harney S., Dee J. Rapid diagnosis of Brucella melitensis in blood: some operational characteristics of the BACT/ALERT // J. Clin. Microbiol. -1992. Vol. 30. - P. 222224.

108. Herman L., De'Rider H. Identification for Brucella spp. by using the polymerase chain reaction // Appl. and Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58. - P. 2099-2101.

109. Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A et al. Development and evaluation of a multiplex PCR assay for rapid detection of toxygenic Vibrio cholerae 01 and 0139 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. - Vol. 20. - P. 201-207.

110. Hoyer B.H., McCullough N.B. Homologies of deoxyribonucleic acid from Brucella ovis canine abortion organisms, and other Brucella species // J. Bacteriol. 1968. -Vol. 96. - P. 1783-1790.

111. Hoyer B.H., McCullough N.B. Polynucleotide homologies of Brucella deoxyribonucleic acid // J. Bacteriol. 1968. - Vol. 68. - P. 444-448.

112. Hu Y., Zhang Q., Meitzler J.C. Rapid and sensitive detection of Escherichia coli 0157-.H7 in bovine fasces by a multiplex PCR // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 87, № 6. - P. 867-876.

113. Jelmini S., Orlando C., Sestini R. et al. Quantitative polymerase chain reaction-based homogeneous assay with fluorogenic probes to measure C-erb B-2 oncogene amplification // Clinical Chemistry. -1997. Vol. 43, № 5. - P. 752-758.

114. Kalinina O., Lebedeva I., Broron J., Silver J. Nanoliter scale PCR with Taq Man detection // Nucl. Acid. Res. 1997. - Vol. 25, №. Ю. - P. 1999-2004.

115. Lang R., Pfeffer K., Wagner H., Heeg K. A rapid method for semiquantitative analysis of the human V beta repertoire using Taq Man (K) PCR // J. Immun. Meth. -1997. Vol. 203, № 2. - P. 181-192.

116. Leal-Klevezas D.S., Lopes-Merino A., Martinez-Soriano J.P. Molecular detection of Brucella spp.: rapid identification of Brucella abortus bv lusing PCR // Arch. Med. Res. 1995 a. - Vol. 26. - P. 263-267.

117. Lion Т., Hass O.A. Nonradioactive labeling probes with digoxigenin by polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 1990. - Vol. 118. - P. 1-3.

118. Leal-Klevezas D.S., Martinez-Vazquez I.O., Lopez-Merino A. et al. Single-step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals // J. Clin. Microbiol. 1995 b. - Vol. 33. - P. 3087-3090.

119. Maffezzoli I., Galli A., Cardarelli et al. Detection of Salmonella spp. in food by po126lymerase chain reaction // Ann. Microbiol, and Enzimol. 1995. - Vol. 45, № 1. - P. 165-172.

120. Matar G.M., Khneisser I. A., Abdelnoor A.M. Rapid laboratory conformation of human brucellosis by PCR analysis of a target sequence on 31 kilodalton Brusella antigen DNA // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34, № 2. - P. 477-480.

121. Mayfield I.E., Bricker B.J., Godfrey E. et al. The cloning, expression, and nucleotide sequence of a gene coding for an immunogenic Brucella abortus protein // Gene. 1988. - Vol. 63. - P. 1-9.

122. Myrold D.D., Huss-Danell K. Population dynamics of alnus-infective Frankie in forest soil with and without host trees // Soil. Biol. Biochem. 1994. - Vol. 26. - P. 533-540.

123. Nielsen K., Wright P.F., Cherwonogrodzky J., Duncan J.R. Enzyme immunoassay for diagnosis of bovin brucellosis // 2rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis: Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. - Vol. 138, № 1. - P. 75-79.

124. Ouahrani-Bettache S., Soubrier M.P., Liautard J.P. IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and stains // Appl. Bacteriol. 1996. -Vol. 81, №2.-P. 154-160.

125. Picard C., Ponsonnet C., Paget E. et al. Letection and enumeration of bacteria in soil by direct DNA extraction and polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58. - P. 2717-2722.

126. Recorbet G., Picard C., Normand P., Simonet P. Kinetics of the persistence of chromosomal DNA from genetically engineered Escherichia coli introduced into soil // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - P. 4289-4294.

127. Renoux G, Renoux M. Diagnostic de la brucellose humaine chronique. Son impor127tence en milieu rural // Maroc. Med. 1975. - Vol. 55. - P. 15-17.

128. Rijpens N.P., Jannes G., Van Asbroeck M. Direct detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse hybridization with 16S-23S rRNA spacer probes // Appl. Environ. Microbiol 1996. - Vol. 62. - P. 1683-1688.

129. Rolfs A., Schuller I., Finckh U„ Weber-Rolfs I. PCR: Clinical diagnostics and research. N. Y., Springier Verlag Berlin Heidelberg. - 1992. - 268 p.

130. Romero C., Gamazo C., Padro M., Lopez-Coni I. Specific detection of Brucella DNA by PCR 11 J. Clin. Microbiol. 1995 a. - Vol. 33. - P. 615-617.

131. Romero C., Padro M., Grillo M.J. et al. Evaluation of PCR and enzyme- linked immunosorbent assay on milk for diagnosis of brucellosis in dairy cattle // J. Clin. Microbiol. 1995 b. - Vol. 33. - P. 3198-3200.

132. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K., Rasmussen O.F. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assay and DNA extraction solutions // Intern. J. Food Microbiol. 1992. - Vol. 17. - P. 37-45.

133. Salzano G., Pallotta M.L., Madonni M.F. et al. Identification of Listeria monocytogenes in food and environment by polimerase chain reaction // J. Environ. Sci. and Health A. 1995. - Vol. 30, № 1. - P. 63-71.

134. Scheu Pia M., Berghof K., Stahl U. Detection of pathogenic and spoilage microorganisms in food with the polimerase chain reaction // Food Microbiol. 1998. -Vol. 15, № 1.-P. 13-31.

135. Silbert P.D., Zanick J.W. Competitive PCR // Nature. 1992. - Vol. 359. - P. 557558.

136. Sippel J.E., El-Masry N. A., Farid Z. Diagnosis of human brucellosis // Lancet. -1982, II. P. 19-21.128

137. Snouye S., Hondo R. Microplate hybridization of amplified viral DNA segment // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, № 6. - P. 1469-1472.

138. Thoen C., Hopkins M.P., Armbrust A., Harrington R. Enzyme Immunoassay for Detecting Brucella Antibodies in Cows Milk // J. Clin. Microbiol. -1979. Vol. 10, № 2. - P. 222-225.

139. Verger J.M., Grimont F., Grimont P.A.D. et al. Brucella a monospecific genus as shown by deoxyribonucleic acid hybridization // Inst. J. Syst. Bacterid. 1985. -Vol. 35. - P. 292-295.

140. Verger J.M., Grimont F., Grimont P.A.D. et al. Taxonomy of the genus Brucella 11 Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. (Paris). 1987. - Vol. 138. - P. 235-238.

141. Waage A.S., Vardund Т., Zund V., Kapperud G. Detection of low numbers of pathogenic Yersinia enterocolitica in environmental water and sewage samples by nested polymerase chain reaction // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 87, № 6. - P. 814-821.

142. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acids amplification // Appl. and Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. - P. 3741-3751.

143. Zimmerman S.J., Gilkin S., Sotal N. et al. Case report and seeded blood culture study of Brucella bacterimia. //J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P.2139-2141.