Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Оценка диагностической эффективности РБП с S- и РА с R- бруцеллезными антигенами при бруцеллезе животных

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Оценка диагностической эффективности РБП с S- и РА с R- бруцеллезными антигенами при бруцеллезе животных"

На правах рукописи

005010402

Каликин Игорь Николаевич

ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РБП С в- И РА С И-БРУЦЕЛЛЕЗНЫМИ АНТИГЕНАМИ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат ■

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОЕЗ

ш

Новосибирск - 2012

005010402

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук. ■

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

Дегтяренко Людмила Владимировна

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Храмцов Виктор Викторович,

доктор ветеринарных наук Альбертян Мкртич Погосович

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная

сельскохозяйственная академия»

Защита состоится « 29 » февраля 2012 г. в «Р » часов на заседании диссертационного совета Д 006.045.01 при ХНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «<^6 » января 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Стеблева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бруцеллез животных продолжает оставаться актуальным в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношении.

Несмотря на достигнутые в последнее десятилетие успехи по его ликвидации в Российской Федерации, во многих Федеральных округах сохраняются стационарно неблагополучные пункты и появляются новые. Так, в течение 2010 г. на территории России было выявлено 223 новых неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота пункта, из них на конец года оставалось 112 (О.Д. Скляров, 2011).

В настоящее время повышается вероятность появления новых очагов бруцеллезной инфекции, как среди крупного рогатого скота, так и среди овец по разным причинам, в т.ч. в связи с заносом источника возбудителя из сопредельных территорий.

В ранее оздоровленных стадах и отарах рецидивы инфекции могут быть связаны с латентно больными животными из-за несовершенства официальных диагностических реакций (РА, РСК, РИД) о которых сообщали К.В. Шумилов с соавт. (1981), Н.П. Иванов (1987), О.Д. Скляров (2005), М.П. Апьбертян, М.И. Исканда-ров, А.И. Федоров (2006) и др., в том числе-в связи с изменчивостью антигенной структуры возбудителя и переходом его в менее вирулентные формы - R-, L-(П.А. Триленко, 1976; И.А. Косилов, JI.B. Дегтяренко, 1987; В.Г. Ощепков, Л.Н. Гордиенко 1988 и др.).

При массовой диагностике бруцеллеза животных, особенно в условиях отгонного животноводства, предпочтительно применение экспресс-методов, доступных по цене, простых в исполнении, не требующих дорогостоящего оборудования, обеспечивающих объективную постановку диагноза и максимальное выявление эпизоотически опасных животных.

Кроме того, в связи с применением в системе противобруцеллезных мероприятий живых вакцин из слабоагтлютиногенных штаммов B.abortus 82 и 75/79-АВ экспресс-методы диагностики бруцеллеза должны выполнять и дифференцирующую функцию. -

В РФ для экспресс-диагностики бруцеллеза у неиммунизированных сельскохозяйственных животных используют роз бенгал пробу (РБП), эффективность которой подтверждена многими исследователями (Л.В. Дегтяренко, Б.И. Кондау-ров, 1978; В.Б. Бельченко, 1980; П.С. Уласевич, А.И. Касьянов с соавт., 1981; К.Д. Дусейнов с соавт., 1989 и др.).

Однако целесообразность использования указанного теста при обследовании крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов B.abortus 82 и 75/79-АВ, достаточно не изучена.

Поскольку в антигенной структуре вакцин из штаммов B.abortus 82 и 75/79-АВ преобладают R-компоненты, при определении реактогенных свойств вакцин, реактивности организма привитых животных, проведения дифференциальнодиагностических исследований возникает необходимость использования R-бруцеллезных диагностикумов, которые до настоящего времени в ветеринарной

. практике широко не применяются, хоте РСК с R-бруцеллезными антигенами была успешно апробирована в производственных условиях (А.М. Фомин, Д.А. Ху-зин, 1989; JI.B. Дегтяренко, 1977, 2005; И.П. Никифоров, 1995; С.К. Димов, 1997; В.В. Сочнев, 2004; К.М.; Салмаков с соавт., 2007; М.Ю. Карлова, 2010 и др.).

Сведения о целесообразности применения РА с R-бруцеллезным диагности-кумом для оценки иммунного статуса крупного рогатого скота, иммунизированного слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами из штаммов В.abortus 82 и 75/79-АВ крайне ограничены.

Вышеизложенное и определило направленность исследований.

Цель исследований. Цель исследования - изучение эффективности РБП с S-и РА с R-бруцеллезными' антигенами при диагностике бруцеллеза животных, в том числе в условиях широкого использования живых слабоагглютиногенных противобруцеллезных вакцин.

Задачи исследования:

- изучить эффективность РБП с S-бруцеллезным антигеном в экспресс-

диагностике бруцеллеза животных, в том числе после их иммунизации живыми слабоагглютиногенными вакцинами; .

- изучить дифференциально-диагностическую эффективность РА с R-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях.

Научная новизна. Выявлено соответствие показаний РБП с биофабричным S-бруцеллезным антигеном при оценке степени выраженности реакции в крестах и других официальных серологических тестов у животных при их искусственном и естественном заражении вирулентными бруцеллами.

Доказана возможность использования РБП с биофабричным S-бруцеллезным антигеном при оценке степени выраженности реакции в крестах у крупного рогатого скота через 2 и более месяцев после иммунизации вакциной из слабоагглю-тиногенного штамма В.abortus 82 в качестве дифференциально-диагностического экспресс-метода при эпизоотической оценке стад по бруцеллезу.

В экспериментальных и производственных условиях подтверждено дифференциально-диагностическое значение РА с R-бруцеллезным антигеном, установлена целесообразность ее использования при осуществлении контроля иммунного ответа и эпизоотической оценке по бруцеллезу животных, иммунизированных слабоагглютиногенными вакцинами.

Практическая и теоретическая значимость работы. Внедрение в ветеринарную практику экспресс-теста — РБП по предлагаемой методике оценки степени выраженности реакции позволит проводить дифференциальную эпизоотическую оценку животных по бруцеллезу через 2 и более месяцев после иммунизации их слабоагглютиногенными вакцинами. Применение РБП с учетом степени выраженности реакции в крестах даст возможность более эффективно осуществлять контроль благополучия по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и оздоровление неблагополучных пунктов за счет своевременного и объективного удаления источников возбудителя инфекции.

Применение Я-бруцеллезного антигена в РА позволит контролировать иммунный ответ (реактогенность вакцин) у крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов В.аЬогЫх 82, 75/79-АВ, что повысит качество вакцинопрофилактики. Комплексное использование К-бруцеллезных антигенов в РА и РСК повысит эффективность дифференциально-диагностических исследований и значительно снизит экономический ущерб при проведении оздоровления неблагополучных по бруцеллезу хозяйств за счет исключения необоснованного убоя животных с постаакцинальными реакциями.

Результаты научных исследований могут быть использованы при изучении патогенеза бруцеллеза животных, инфицированных типичными (8-) и диссоциированными (Л, ЯЬ’, 511) формами бруцелл.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 7-й межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008); международной научно-практической конференции «Развитие АПК азиатских территорий» (Новосибирск, 2008); международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы инфекционных и незаразных патологий животных» (Омск, 2010); международной научно-практической конференции «Инфекционная патология животных» (Омск, 2011).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ («Достижение науки и техники АПК», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 19 таблицами, 6 рисунками. Список литературы включает 202 источника, из них 44 - зарубежных.

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований использованы для разработки методических рекомендаций по дифференциальной диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного протвобруцел-лезными вакцинами (прот. № 7 от 24.11.2006 г.); по контролю иммунного ответа крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 (прот. № 5 от 28.11.2007 г.); комплексу противоэпизоотических мероприятий по профилактике и ликвидации хронических болезней животных (прот. № 9 от 15.11.2008г.), утвержденных секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области; «Контроль поствакцинального иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ» (прот. № 4 от 10.11.2009), утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока»

секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхо-закадемии.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения эффективности РБП с S-бруцеллезным антигеном в экспресс-диагностике бруцеллеза животных, в том числе после их иммунизации живыми слабоагглютиногенными вакцинами;

- результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РА с R-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в период 1994 - 2011 гг. в лаборатории (секторе) диагностики бруцеллеза ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных» РоссеЛьхозакадемии, часть исследований проведена в БУ Омской области «Омская областная ветеринарная лаборатория».

В процессе работы использовали 113 морских свинок массой 250-300 г, которых заражали или иммунизировали разными штаммами бруцелл подкожно в дозах от 100 м.к. до 1 млрд м.к. в зависимости от целей и задач опытов, а также 30 кроликов массой 2,5-3,0 кг.

Иммунизацию, заражение животных, отбор материала для бактериологических исследований, посевы на питательные среды, типизацию выделенных культур проводили по общепринятым методикам.

Концентрацию микробных клеток бруцелл устанавливали по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Для заражения животных применяли вирулентные штаммы В.abortus 54;

B.suis 1330 (S-формы), полевые диссоцианты В.abortus 16-71; 68-71 (R-формы). При вакцинации животных использовали штаммы В.abortus 82, 75/79-АВ (RS-формы), B.melitensis Rev-l (S-форма).

Предварительно изучали морфологические свойства штаммов бруцелл с окраской мазков по Грамму, Козловскому, а агтлютинабельные свойства и серологическую специфичность культур бруцелл проверяли при постановке РА пластинчатой с S- и R-бруцеллезными сыворотками из «Набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл». Для определения степени диссоциации бруцеллезных культур проводили пробу с трипафлавином в разведении 1:500, окраску колоний по Уайт-Вилсону.

Производственные испытания изучаемых диагностических тестов осуществляли в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по бруцеллезу при исследовании 55249 проб сыворотки крови от крупного рогатого скота, 5877 овец различных половозрастных групп.

В экспериментах и производственных опытах при исследовании сыворотки крови животных применяли комплекс диагностических тестов: РИГА, РСК, РА

пробирочную с S- и R-бруцеллезными антигенами, РИД с О-ПС антигеном ИЭСиДВ, РБП с биофабричным антигеном, а также КР.

При постановке РБП оценивали количество животных, реагирующих в этом тесте, а также степень выраженности реакции в крестах (от одного до трех): три креста - агтлютинат в виде крупных хлопьев, полное просветление надосадочной жидкости; два креста - агглютинат в виде более мелких хлопьев, надосадочная жидкость имеет неполное просветление; один: крест — агглютинат мелкий, просветление отсутствует; отрицательно - смесь гомогенная, равномерно окрашена.

В РИГА использовали эритроцитарный бруцеллезный диагностикум, разработанный Прикаспийским ЗНИВИ, ВГНКИ, ВНИИБТЖ и изготовленный во ВНИИБТЖ. Кроме того, применяли эритроцитарный бруцеллезный диагностикум, разработанный в ИЭМ им. Н.Ф. Гамалея.

Для диагностики диссоциированных форм бруцелл в РА использовали R-бруцеллезный цветной антиген из «Набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл», изготовленного во ВНИИБТЖ. Для предотвращения самоагглютинации R-бруцеллезного антигена постановку РА проводили на 0,15М фосфатном буферном растворе с содержанием 5 % NaCl.

Сыворотку крови морских свинок в РА исследовали с R-бруцеллезным антигеном в разведении 1:10 и выше, крупного рогатого скота - 1:50 и выше.

В РСК использовали R-бруцеллезный антиген, сконструированный по методике ВНИИБТЖ фенольным способом.

Проведена статистическая обработка опытных данных отдельных экспериментов с помощью критерия Стьюдента (А.Т. Усович, П.Т. Лебедев, 1970).

Часть исследований выполнена совместно с сотрудниками ГНУ ВНИИБТЖ (Л.В. Дегтяренко, В.Г. Ощепковым, М.Ю. Карловой, Г.В. Разницыной,

С.А. Власовой) и ФГБУ «ВГНКИ» (О.Д. Скляровым).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Оценка эффективности РБП с S-бруцеллезным антигеном при

диагностике бруцеллеза животных, в том числе в условиях широкого

использования слабоагглютипогенных противобруцеллезных вакцин

2.2.1.1. Изучепие диагностической ценности РБП в опыте на морских свинках, сенсибилизированных разными штаммами бруцелл

В опыте на 28 морских свинках, длившемся в течение 120 суток, провели сравнительное изучение диагностической эффективности РБП и РА пробирочной с единым бруцеллезным антигеном. В качестве заражающих штаммов использовали вирулентные культуры бруцелл: В.abortus 54, B.suis 1330, вакцинный штамм B.melitensis Rev-1, которые вводили в дозах 100 и 10000 м.к.

При этом установлено, что на протяжении опыта наиболее высокой чувствительностью обладала РА: с ее помощью диагностировано 88,1% сенсибилизированных бруцеллезным антигеном морских свинок. Причем показания теста оставались стабильно высокими во все сроки исследования опытных животных, инфицированных разными дозами и штаммами бруцелл различной вирулентности.

Более низкую чувствительность имела РБП — 76,2% реагирующих. Вместе с тем она позволяла выявлять в ранние, сроки после заражения (14 суток) 60,7% животных, инфицированных культурами бруцелл.

Показания РБП оставались высокими и в более отдаленные сроки исследований - через 120 суток у 100% морских свинок, сенсибилизированных бруцеллезными антигенами.

Необходимо отметить характер проявления РБП у инфицированных морских свинок. Так, на протяжении 120 суток из 96-и серопозитивных проб в РБП, оценку реакции три креста имели 72,8% животных. РБП с оценкой один и два креста регистрировали, соответственно, у 15,9 и 4,8% от общего количества исследованных проб сыворотки крови морских свинок на протяжении опыта.

2.2.1.2. Результаты испытания РБП при бруцеллезе животных

в производственных условиях "

2.2.1.2.1. Результаты изучения специфичности показаний РБП

Специфичность РБП изучали при обследовании непривитого протйвобру-целлезными вакцинами крупного рогатого скота (4569 гол.) и овец (5429 гол.) из благополучных по бруцеллезу хозяйств Омской области.

При этом исследования сыворотки крови животных проводили в РА, РСК с единым бруцеллезным антигеном и РБП.

Во всех случаях в РБП, РА и РСК были получены отрицательные результаты, что подтверждает специфичность тестов. •

2.2.1.2.2. Результаты изучения диагностической чувствительности РБП у неиммунизированного крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу стад

При обследовании 505 гол. непривитого противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств комплексом РА+РСК+РИД+РБП диагностировано 18,4% больных бруцеллезом животных (табл. 1).

Таблица 1~ Результаты серологических исследований сыворотки крови

Название района, хозяйства о Р Реагировали положительно Совпали показатели РБП с:

X 10 РА+ РБП РА РСК РИД РА РСК РИД-

о РСК+ РЙД+ РБП всего + -Н- +++

Щербакульский, 179 20 16 1 2 13 6 19 8 6 16 8

с. Чадск

Исилькульский, 326 73 51 4 17 30 35 62 32 27 32 24

ОПХ «Боевое»

ИТОГО 505 93 67 5 19 43 41 81 40 33 48 32

18,4 13,3 1,0 3,8 8,5 8,1 16,0 7,9 49,3 71,6 47,8

Сравнивая чувствительность разных тестов необходимо отметить, что наиболее высокую диагностическую ценность имела РСК, с помощью которой установлено максимальное количество больных животных - 16% от общего количества обследованных коров.

Несколько уступала в чувствительности РБП: с ее помощью выявлено 13,3% реагирующих на бруцеллез животных. Позитивные показатели РА и РИД были почти равнозначные и составляли, соответственно, 8,1 и 7,9%.

Из 67-и коров, реагировавших в РБП, оценку три креста имели 64,2% животных; два креста - 28,3%, один крест - 7,4% .

Наиболее высокую степень совпадения с позитивными показателями РБП имела РСК. Из 67-и реагирующих в РБП коров у 48 (71,6 %) выявили комплемен-тсвязывающие антитела. С помощью РИД в неблагополучных стадах установили 40 больных бруцеллезом животных, из них у 80 % были позитивными показания РБП.

В РБП дополнительно к показаниям РА, РСК, РИД было выявлено восемь реагирующих животных (1,6 %).

2.2.1.2.3. Результаты испытания РБП на овцах неблагополучных по бруцеллезу отар

При исследовании 448-и проб сыворотки крови неиммунизированных против бруцеллеза овец трех неблагополучных отар комплексом диагностических тестов РА+РСК+РИД+РБП наиболее высокую чувствительность имела РБП: с ее помощью установлено 26,8 % реагирующих, в том числе в 17,9 % случаев реакцию оценивали на три креста, у 5,8 % животных - на два креста и только у 3,1 % - на один крест.

РБП позволила выявить дополнительно к показаниям РА, РСК и РИД 15 больных бруцеллезом животных (3,3 % от общего количества обследованных овец).

2.2.1.2.4. Результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РБП при обследовании животных, иммунизированных вакциной из штамма B.abortus 82, в благополучных по бруцеллезу хозяйствах

Изучение дифференциально-диагностической эффективности РБП провели при исследовании 10855 проб сыворотки крови от крупного рогатого скота, привитого слабоагглютиногенной вакциной из штамма B.abortus 82, в 17-и благополучных по бруцеллезу хозяйствах.

Агглютинины в низких диагностических титрах установили у 17-и (0,2 % обследованных животных), гемагглютинины - у 0,4 %.

S-комплементсвязывающие антитела в низком титре (1:5-1:10) диагностировали у 4,1 % обследованных животных в разные сроки после иммунизации, в т.ч. и ранние.

Отрицательные показатели РИД и отсутствие положительно реагирующих в высоких титрах РА, РСК, РИГА свидетельствовали о благополучии хозяйств по бруцеллезу (благополучие подтверждено и эпизоотологически).

В сыворотках крови 100% животных с наличием S-бруцеллезных антител к единому антигену в РСК диагностировали R-бруцеллезные антитела с помощью R-бруцеллезных антигенов ВНИИБТЖ, в связи с этим серопозитивные реакции по итогам дифференциации отнесли к поствакцинальным.

В РБП выявлено 304 гол. положительно реагирующих животных (2,8% от количества обследованных), при этом РБП с оценкой один крест установили у 166 гол (1,5%), с оценкой два креста-у 124-х гол. (1,1%) и только в 14-и случаях (0,1%) РБП была оценена на три креста.

Следует подчеркнуть, что в ранние сроки после иммунизации вакциной из штамма В.abortus 82 (2, 3, 4 и 5 месяцев) у животных реакции в РБП с оценкой на три креста не отмечены.

2.2.1.2.5. Результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РБП у крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В. abortus 82, в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах

Изучение дифференциально-диагностической эффективности РБП в сравнении с другими тестами продолжили при исследовании 30350-и гол. крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными вакцинами, в шести неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах Омской области.

В связи с оздоровлением хозяйств исследования сывороток крови животных в РА, РСК, РНГА осуществляли не через 6 месяцев, как предусмотрено Наставлением по применению вакцины из штамма В.abortus 82, а в более ранние сроки -

2,3, 4, 5 месяцев после ревакцинации коров.

По разработанной схеме ВНИИБТЖ-ИЭВСиДВ больными бруцеллезом считали животных, реагировавших в эти сроки в высоких титрах РА (200 ME и выше), РСК (1:20 и выше), РИГА (1:400 и выше) и РИД, которые подлежали удалению из стад.

Животных с показателями РА и РСК с единым антигеном в низких титрах, и не реагирующих в РСК, РА с R-бруцеллезными антигенами ВНИИБТЖ, также относили к больным бруцеллезом, а с наличием в сыворотке крови R-бруцеллезных антител оставляли в стадах.

При исследовании 30350 проб сывороток крови комплексом РА+РСК+РНГА+РИД+РБП диагностировано 2697 (8,9%) реагирующих животных, в т.ч. с серопозитивными показателями в РБП - 1401 (4,6%). Оценку теста в три креста имели 631 или 45 животных от числа реагировавших в РБП.

Количество реагировавших в РБП в гурте варьировало в зависимости от напряженности эпизоотической ситуации по бруцеллезу, но во всех неблагополучных хозяйствах диагностировали животных с наличием агглютининов в РБП с оценкой на три креста.

Сравнивая чувствительность разных тестов, установили, что из общего количества обследованных животных во всех неблагополучных хозяйствах наибольшее число положительно реагирующих - 7,3% регистрировали в РСК, с помощью РИГА диагностировали 4,1%, в РА и РИД позитивные показатели были у 1,6 % гол. крупного рогатого скота.

В результате дифференциации серопозитивных реакций у 2697-и животных в соответствии с разработанными во ВНИИБТЖ-ИЭВСиДВ критериями эпизоотической оценки крупного рогатого скота'по бруцеллезу, к больным отнесли 1220 гол. (45,2%).

Из числа больных бруцеллезом животных максимальное количество реагирующих установлено с помощью РНГА - 70,6%, второе место по чувствительности занимала РБП с оценкой три креста - 51,7%, несколько ниже были показатели РСК - 50,1%, РИД с О-ПС антигеном выявила 39,6% серопозитивных проб. Агглютинины в титре 200МЕ и выше установлены в сыворотке крови у 22,8% больных бруцеллезом животных.

Достоверность РБП подтверждается совпадением ее показателей с комплексом диагностических тестов РА+РСК+РНГА в высоких титрах и РИД.

Так, из 1401 гол. крупного рогатого скота, реагировавшего в РБП, в 54,3% случаев установлены агглютинины, гемагглютинины и комплементсвязывающие антитела в высоких титрах, характерных для бруцеллеза.

Необходимо отметить, что из 631-го животного, выявленного с показателями РБП на три креста, серопозитивные реакции в РА установлены у 52,9%, РСК - у 77,8%, РНГА-у 82,9%.

Позитивные показатели РИД с ОПС-антигеном, как одного из достоверных дифференциальных тестов, в 51% совпали с показаниями РБП на три креста.

Следует отметить, что в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах в числе животных, у которых РБП оценена на один и два креста, могут быть и больные бруцеллезом, о чем свидетельствуют показания РИД с О-ПС антигеном. Так, РИД была положительной у 470 гол. (33,5%) крупного рогатого скота, имевших в РБП оценку на два креста и в 73-х случаях (5,2%) один крест. Однако в связи с тем, что в благополучных по бруцеллезу хозяйствах вакцинированный крупный рогатый скот в разные сроки также реагирует в РБП с оценкой один и два креста, эпизоотический статус животных в неблагополучных по бруцеллезу гуртах необходимо определять комплексом тестов: РА, РСК, РНГА, РИД.

2.2.1.3. Изучение эпизоотической опасности животных с положительной РБП

При изучении эпизоотической опасности было отобрано восемь неиммунизи-рованных противобруцеллезными вакцинами коров, принадлежащих частному сектору, которые имели позитивные результаты иммунологических реакций (РА+РСК+РНГА+РИД), в т.ч. РБП с оценкой три креста.

При бактериологическом исследовании биоматериала от них культуры бру-целл выделены у 50% животных. В результате изучения их биологических свойств установлены признаки полевых штаммов бруцелл.

Важно отметить, что у животных, от которых не изолировали возбудителя бруцеллеза, выявлен генетический материал микроорганизмов рода Brucella, что подтверждает достоверность результатов теста и доказывает эпизоотическую опасность крупного рогатого скота, реагирующего в РБП с диагностической оценкой три креста.

Кроме того, при бактериологическом исследовании патологического материала восьми морских свинок, зараженных В.abortus 54, от 50% животных выделена культура бруцелл. При серологическом исследовании сывороток крови морских свинок у всех регистрировали РБП с оценкой три креста.

При изучении эпизоотической опасности животных, положительно реагировавших в РБП с оценкой один, два креста, были проведены бактериологические исследования абортированных плодов и мертворожденных телят, полученных от семи коров, вакцинированных штаммом В.abortus 82, из благополучных по бруцеллезу хозяйств. При этом 100% животных реагировали в РА+РСК в низких титрах с единым бруцеллезным антигеном и РБП с оценкой один, два креста.

В результате проведенггого бактериологического исследования из патологического материала выделены культуры вакцинного штамма В.abortus 82.

Таким образом, исследования показали, что животные, реагирующие в РБП с оценкой три креста, представляют эпизоотическую опасность, так как бруцелло-носительство у них установлено бактериологическим и молекулярнобиологическим (ПЦР) методами.

2.2.2. Дифференциально-диагностическая эффективность РА с R-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях

2.2.2.1. Изучение специфичности R-бруцеллезного антигена для РА

Первоначально изучили специфичность R-бруцеллезных антигенов для РА и РСК при исследовании сыворотки крови от 20-и здоровых кроликов, 88-и морских свинок и 2300 гол. непривитого крупного рогатого скота из пяти благополучных по бруцеллезу хозяйств Омской области. При этом отрицательные результаты получены у кроликов и морских свинок в разведениях сыворотки крови 1:10 и выше, крупного рогатого скота - 1:50 и выше. В РСК с R-бруцеллезным антигеном также получены отрицательные результаты при исследовании лабораторных животных и крупного рогатого скота.

Специфичность R-бруцеллезных антигенов была также подтверждена при исследовании сыворотки крови 10 кроликов, гипериммуннизированных вакцинным штаммом B.abortus 104 М (S-форма). При этом во всех пробах получены отрицательные результаты РА и РСК с R-бруцеллезными антигенами в разведении сыворотки крови 1:10 и выше.

2.2.2.2. Изучение диагностической ценности R-бруцеллезных антигенов

в опыте на морских свинках

Чувствительность R-бруцеллезного антигена для РА испытали при исследовании сывороток крови от 60 морских свинок, которые были иммунизированы или инфицированы подкожно в дозе 1 млрд м.к. RS- (B.abortus 82, B.abortus

75/79-AB), R- (В.abortus 16-71, В.abortus 68-71) формами бруцелл.

Через 14 суток после сенсибилизации бруцеллезными антигенами R-агглютинины обнаруживали в сыворотке крови 100 % морских свинок, иммунизированных В.abortus 75/79-АВ (RS-форма), а также у зараженных штаммом В. abortus 16-71 (R-форма).

В организме морских свинок, сенсибилизированных культурами штаммов B.abortus 82 и B.abortus 68-71, уровень биосинтеза агглютининов был несколько ниже (соответственно у 83,3% и 91,7% от числа исследованных).

На 30 сутки после введения культур бруцелл только в группе животных, инфицированных штаммом B.abortus 16-71 (R-форма), положительно реагировали с R-бруцеллезным антигеном в РА 91,7% гол., в остальных группах - 100%.

Через 60 суток после инокуляции R- и RS-бруцеллезных антигенов R-агглютинины обнаруживали у 100% животных всех групп.

R-комплементсвязывающие антитела диагностировали у животных, сенсибилизированных R-, RS-бруцеллезными антигенами, во все сроки исследований, но максимальное количество морских свинок, реагировавших с R-бруцеллезным антигеном РСК, регистрировали к 60-м суткам (100%).

Необходимо отметить, что морские _ свинки, вакцинированные штаммом B.melitensis Rev-1 (S-форма), на 15-30 сутки реагировали только с единым антигеном в РА, РСК, что указывает на специфичность R-бруцеллезного антигена для РА.

Диагностическая ценность R-бруцеллезного антигена для РА при исследовании сывороток крови морских свинок, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл, через 15 и 30 суток была выше, чем у R-бруцеллезного антигена РСК.

Доказательством достоверности показаний РА с R-бруцеллезным антигеном служит то, что при бактериологическом исследовании патологического материала от 21 морской свинки, вакцинированных штаммами B.abortus 82 и 75/79-АВ, исходные культуры бруцелл выделены у 57,1% животных с позитивными результатами РСК и РА с R-бруцеллезными антигенами ВНИИБТЖ.

При бактериологическом исследовании биологического материала от 21 морской свинки, инфицированных полевыми диссоциантами бруцелл, бруцелло-носительство установлено у 13 (61,9%) гол. При исследовании сывороток крови бруцеллоносителей, R-комплементсвязывающие антитела диагностированы у 61,5%, R-агглютинины - у 76,9%, что указывает на эпизоотическую опасность животных, реагирующих на R-бруцеллезные антигены в РА и РСК.

2.2.2.3 Изучение дифференциально-диагностической эффективности R-бруцеллезного антигена для РА в производственных условиях

2.2.2.З.1. Изучение диагностической эффективности R-бруцеллезного антигена РА в благополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов B.abortus 82,75/79-АВ

Диагностическую эффективность R-бруцеллезного антигена для РА в сравнении с R-бруцеллезным антигеном РСК изучали в 13-ти благополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из

штаммов B.abortus 82, B.abortus 75/79-AB на территории Омской области. При обследовании 4177 гол. крупного рогатого скота в разные сроки после их иммунизации противобруцеллезными вакцинами с помощью R-бруцеллезных антигенов иммунный ответ удалось зарегистрировать у 3155 животных (75,5% от общего количества исследованных).

Наибольшее количество реагирующих выявили в РСК с R-бруцеллезным антигеном - 69,5%. РА с R-бруцеллезным антигеном несколько уступала РСК в чувствительности — 51,1%, но дополнительно позволила установить 244 (5,8%) животных с наличием R-агглютинирующих антител. В отдельные сроки исследований в разных хозяйствах только в РА с R-ангигеном реагировали от 0,3 до 34,1% животных.

Через 1-2 месяца после иммунизации животных противобруцеллезными вакцинами с R-бруцеллезным антигеном в РСК регистрировали 68-100% реагирующих, R-агглютинины в эти же сроки устанавливали в сыворотке крови 61,8-93,9 % животных. .

Следует отметить, что у 512 животных (12,3%) комплексом РА+РСК+РНГА регистрировали S-бруцеллезные антитела, в результате дифференциации их отнесли к поствакцинальньм, т.к. в сыворотках крови были обнаружены R-бруцеллезные антитела в РА и РСК.

2.2.2.3.2. Изучение диагностической эффективности R-бруцеллезного антигена для РА при обследовании крупного рогатого скота,

иммунизированного вакцинами из штаммов B.abortus 82,75/79-АВ в неблагополучных стадах

При обследовании 1397 гол. крупного рогатого скота из пяти неблагополучных по бруцеллезу стад наибольшее количество реагирующих животных диагностировано через 1-2 месяца после иммунизации вакцинами из штаммов B.abortus 82, 75/79-АВ. С помощью R-бруцеллезного антигена РСК выявлено 95,4-98,2% реагирующих животных. Достаточно высокую чувствительность показала РА — 82,183,2% реагирующих.

S-бруцеллезные антитела в РА, РСК, РИГА выявлены у 193 гол. крупного рогатого скота (13,8% исследованных), в том числе в высоких титрах - у 38 гол. (20% из числа реагирующих). С учетом ранних сроков исследований крупного рогатого скота после вакцинации только 38 животных изъяли из стад как больных бруцеллезом. У 155 животных с серопозитивными реакциями в низких титрах с единым бруцеллезным антигеном установили и R-бруцеллезные антитела в РА и РСК, при этом РА выявила дополнительно 21 гол. (13,5% из числа реагировавших).

2.2.2.3.3. Изучение иммунного ответа у телочек, иммунизированных вакциной из штамма B.abortus 82, с помощью R-бруцеллезного антигена РА

Иммунный ответ на введение вакцины из штамма B.abortus 82 изучили на 857 гол. молодняка крупного рогатого скота с применением R-бруцеллезного антигена для РА в сравнении с R антигеном для РСК (табл. 2).

Таблица 2 - Результаты испытания Н-бруцеллезных антигенов при контроле иммунного ответа у телочек, привитых вакциной из штамма В-дЬоНю 82

Название озяйства, района Коли- чество проб Срок после вакци- нации (мес.) Кол:*чество животных, реагирующих . с Я-антигенами: Вь толь щелено ко в РА с ггигеном

РСК РА Я-аь

абс. % абс. % абс. %

СПК «Вольновский», Полтавский 50 49 98,0 42 84,0 1 2,0

ЗАО «Еремеевское», Полтавский 100 1 93 93,0 99 99,0 6 6,0

ЗАО «Нива», отд. 1, Павлоградский 37 I 14 37,8 12 32,4 4 10,8

ЗАО «Нива», отд. 2, Павлоградский 54 I 54 100,0 46 85,2 - -

ЗАО «Нива», отд. 4, Павлоградский 28 28 100,0 22 78,6 - -

ЗАО «Нива», отд. 6, Павлоградский 26 26 100,0 24 92,3 - -

ЗАО «Богодуховское», Павлоградский 61 60 98,4 50 82,0 3 4,9

ОАО «Логиновский», отд.1, Павлоградский 16 13 81,2 7 43,8 6,3

СПК «Овцевод», Марьяновский 54 1 29 53,7 10 18,5

ЗАО «Солнцево», Исилькульский 15 1 15 100,0 15 100,0 - -

«Украинский», Исилькульский 20 1 12 60,0 7 35,0 . - -

ООО «Альянс», Тевризкий 13 1 11 84,6 3 23,1 - -

ОАО АФ Екатериносгсавское, Щербакульский 36 2 27 75,0 20 55,6 3 8,3

ЗАО.«Дружба», МарьяновскиЙ 18 2 9 50,0 4 22,2 - -

ООО «Лузинское молоко» 22 2 9 40,9 6 27,3 ' -

ЗАО «Хлебодаровское», Русскополянск. 74 3 42 56,8 46 62,2 4 5,4

-//- 67 3 4 6,0 8 12,0 6 9,0

-//- 114 3 47 41,2 12 10,5 2 1,8

ООО «Красноярское», Большереченский 52 3 47 90,4 8 15,4 - -

Всего 857 589 М=71,95 ш±6,44 441 М=51,53 ш±7,42* 30 3,5

Примечание: Р <0,05

11-комплементсвязывающие антитела в сыворотках крови устанавливали через 30 суток после вакцинации у 37,8-100% животных, Л-агглютинины - у 18,5100%, через 60 суток, соответственно, у 40,9-75% и 22-55,6%.

Невысокий процент положительно реагирующего молодняка с К-бруцеллезными антигенами РСК и РА в отдельных хозяйствах свидетельствует о низком качестве вакцинации и целесообразности проведения дополнительной иммунизации животных, в сыворотке крови которых не определили Я-бру-целлезных антител.

Наиболее высокую диагностическую значимость при контроле иммунного ответа у телочек, привитых вакциной из штамма В. abortus 82, имеет РСК с R-бруцеллезным антигеном (71,95 ± 6,44% реагирующих). R-агглютинины обнаружены у 51,53 ± 7,42% животных.

Необходимо отметить, что применение РА с R-бруцеллезным антигеном позволило выявить дополнительно 30 реагирующих животных (3,5%), что подтверждает целесообразность использования теста в комплексе с R-бруцеллезным антигеном РСК при контроле иммунного ответа у крупного рогатого скота, в сыворотке крови которого отсутствуют R-комплементсвязывающие антитела.

3. ВЫВОДЫ

1. РБП с биофабричным S-бруцеллезным антигеном у морских свинок, сенсибилизированных вирулентными бруцеллами разных видов, обладала высокой диагностической чувствительностью, выявляя в отдельные сроки исследований 100% инфицированных животных. При этом степень выраженности реакции с оценкой три креста имели 72,8% из числа реагирующих.

2. В эпизоотических очагах с естественным течением бруцеллеза у крупного рогатого скота РБП по диагностической эффективности уступает РСК (13,3 и 16% реагирующих из числа исследованных соответственно). При этом у 64,2% животных в составе реагирующих в РБП степень ее выраженности оценена на три креста.

3. В эпизоотических очагах с естественным течением бруцеллеза у овец РБП обладала наибольшей диагностической чувствительностью в сравнении с РА, РСК и РИД, выявив дополнительно 3,3% реагирующих от общего числа исследованных. В составе реагирующих в РБП животных у 66% степень выраженности реакции была оценена на три креста.

4. У крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма

B.abortus 82, положительные показания РБП с оценкой три креста регистрировали в благополучных по бруцеллезу стадах в 0,1% случаев из общего числа положительно реагирующих в РБП, в неблагополучных стадах - в 44,9% случаев.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования РБП с оценкой степени проявления реакции в крестах как экспресс-метода дифференциальной эпизоотической оценки по бруцеллезу стад крупного рогатого скота через 2 месяца и в последующие сроки после иммунизации вакциной из штамма

B.abortus 82.

5. R-бруцеллезный антиген для РА, изготовленный из диссоциированного штамма B.abortus 16/4, в экспериментах на морских свинках показал специфичность и диагностическую чувствительность, выявляя до 100% животных, сенсибилизированных диссоциированными штаммами бруцелл.

6. В благополучных по бруцеллезу стадах с помощью РА с R-бруцеллезным антигеном через 30-60 дней после иммунизации крупного рогатого скота вакцинами из штаммов B.abortus 82 или 75/79-АВ удается выявлять от 61,8 до 93,9% реагирующих животных, с помощью РСК с R-бруцеллезным антигеном - от 68 до

100%. При этом РА с Я-бруцеллезным антигеном дополнительно выявляет в разные сроки исследований животных от 0,3 до 34,1% реагирующих.

7. В неблагополучных по бруцеллезу стадах через 30-60 дней после иммунизации крупного рогатого скота вакцинами из штаммов В.аЪогЬії 82 или 75/79-АВ в РСК с Я-бруцеллезным антигеном реагировало от 95,4 до 98,2%, в РА - 53,483,2% животных. При этом РА с 11-бруцеллезным антигеном выявляет дополнительно к показаниям РСК с Я-бруцеллезным антигеном в разные сроки исследований от 0,5 до 9,6% реагирующих животных.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности совместного использования К-бруцеллезных антигенов для РА и РСК при контроле иммунного ответа у животных, иммунизированных слабоагглютиногенными вакцинами, а также при проведении дифференциально-диагностических исследований.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные рекомендации, содержащие оптимальные схемы применения РБП с Б-бруцеллезным антигеном и РА с Я-бруцеллезным антигеном в дифференциальной диагностике бруцеллеза животных, а также при контроле иммунного ответа у крупного рогатого скота, привитого слабоагглютиногенными вакцинами, целесообразно использовать практическим ветеринарным специалистам, научным сотрудникам при решении различных проблем диагностики и специфической профилактики бруцеллеза животных, применять в учебном процессе ветеринарных ВУЗов, учреждениях повышения квалификации ветеринарных врачей.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дегтяренко, Л.В. Диагностическая эффективность К-бруцсллез-ных антигенов при бруцеллезе крупного рогатого скота / Л.В. Дегтяренко, МЛО. Карлова, И.Н. Каликин, О.Д. Скляров // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 9. - С. 57-61.

2. Каликин И.Н. Усовершенствование серологической экспресс-диагностики бруцеллеза животных / И.Н. Каликин, Л.В. Дегтяренко, М.Ю. Карлова, О.Д. Скляров // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2012. - № 1-2. - С. 95-99.

3. Дегтяренко, Л.В. Испытание Я-бруцеллезных антигенов в экспериментальных условиях / Л.В. Дегтяренко, Г.В. Разницына, Н.Г. Шпак, И.Н. Каликин, М.Ю. Карлова // Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала: матер, межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 180-летию аграрной науки Сибири. - Омск, ВНИИБТЖ. - 2008. - С. 111-117.

4. Дегтяренко, Л.В. Усовершенствование серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. / Л.В. Дегтяренко, В.Г.Ощепков, Г.В. Разницына, М.Ю. Карлова, И.Н. Каликин // Развитие АПК азиатских территорий: тр. ХІ-Й междунар. науч.-практ. конф. / Россельхозакадемия, Си б. отд-ние. — Новосибирск, 2008. - Т. II. - С. 71-74.

5. Дегтяренко, JI.B. Контроль иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными вакцинами / Л.В. Дегтяренко, Г.В. Разницына, И.Н. Каликин // Тр. ВИЭВ.- М, 2009. - Т.75. - С. 214-218.

6. Дегтяренко, Л.В. Применение R-бруцеллезных антигенов при контроле иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного слабоагглюти-ногенной вакциной из штамма В.abortus 82 / Л.В. Дегтяренко, И.Н. Каликин, М.Ю. Карлова, Г.В. Разницына // Актуальные проблемы инфекционных и незаразных патологий животных: матер, междунар. науч.-практ. конф. - Омск, 2010. -

С. 58-63.

7. Дегтяренко, Л.В. Дифференциальная экспресс-диагностика бруцеллеза

крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82 / Л В. Дегтяренко, И.Н. Каликин, М.Ю. Карлова, Г.В. Разницына // Инфекционная патология животных: матер, междунар. науч.-практ. конф. - Омск, 2011. -

С. 36-41. .

Типография ОмГУПСа, 2012. Тираж 100 экз. Заказ 42. 644046, г. Омск, пр. Маркса, 35.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Каликин, Игорь Николаевич, Омск

61 12-16/69

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БРУЦЕЛЛЕЗА И ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РБП С 8- И РА С К- БРУЦЕЛЛЕЗНЫМИ АНТИГЕНАМИ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

На правах рукописи

Калинин Игорь Николаевич

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук Дегтяренко Л.В.

Омск - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

1.1. 1.1.1. 1.1.2.

1.1.3. 1.1.3.1

1.1.3.2.

1.1.3.3.

1.1.3.4.

1.1.3.5.

1.1.4.

1.1.5.

1.2.

2.1. 2.2.

2.2.1.

2.2.2.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Лабораторная диагностика бруцеллеза Бактериологическое исследование Полимеразная цепная реакция (ПНР) Серологические методы Реакция агглютинации пробирочная (РА) Роз бенгал проба (РБП) Реакция связывания комплемента (РСК) Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) Реакция иммунодиффузии (РИД)

Серологическая диагностика бруцеллеза животных инфицированных диссоциированными (К) формами бруцелл

Дифференциальная диагностика больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами

Заключение к обзору литературы

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Оценка эффективности РБП с 8-бруцеллезным антигеном при диагностике бруцеллеза животных, в том числе в условиях широкого использования слабоагглютиногенных противобруцеллезных вакцин

Изучение диагностической ценности РБП в опыте на морских свинках, сенсибилизированных разными штаммами бруцелл

Результаты испытания РБП при бруцеллезе животных в

5 11 11 11 13

15

16 19 22 24 26

28

32 37 39 39

41

2.2.2.1.

2.2.2.2.

2.2.2.3.

2.2.2.4.

2.2.2.5.

2.2.2.6.

2.3.

2.3.1.

2.3.2.

2.3.3.

2.3.3.1.

производственных условиях

Результаты испытания специфичности РБП на крупном и мелком рогатом скоте

Результаты изучения диагностической чувствительности РБП в неблагополучных по бруцеллезу гуртах крупного рогатого скота

Результаты испытания РБП в неблагополучных по бруцеллезу отарах овец

Результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РБП при обследовании животных, иммунизированных вакциной из штамма В. abortus 82, в благополучных по бруцеллезу хозяйствах Результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РБП у крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма В. abortus 82, в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах

Изучение эпизоотической опасности животных, положительно реагировавших в РБП Дифференциально-диагностическая эффективность РА с R-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях Изучение специфичности R-бруцеллезного антигена для РА Изучение диагностической ценности R-бруцеллезных антигенов в опыте на морских свинках Изучение дифференциально-диагностической

эффективности R-бруцеллезного антигена РА в производственных условиях

Изучение диагностической эффективности R-бруцеллезного антигена РА в благополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота,

49

50

51

52

55

59

80

83 85

85

иммунизированного вакцинами из штаммов В. abortus 82, 75/79-АВ

94

2.3.3.2. Изучение диагностической эффективности R-бруцеллезного антигена для РА при обследовании крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов В. abortus 82, 75/79-АВ, в неблагополучных по бруцеллезу стадах

2.3.3.3. Изучение иммунного ответа у телочек, иммунизированных вакциной из штамма В. abortus 82 96

2.4. Изучение диагностической ценности R-бруцеллезных

антигенов для РА и РСК при выяснении эпизоотической ситуации по бруцеллезу крупного рогатого скота 98

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 124

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7. ПРИЛОЖЕНИЕ

103 122

125 148

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Бруцеллез животных продолжает оставаться актуальным в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношении.

Несмотря на достигнутые в последнее десятилетие успехи по его ликвидации в Российской Федерации, во многих Федеральных округах сохраняются стационарно неблагополучные пункты и появляются новые. Так, в течение 2010 г. на территории России было выявлено 223 новых неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота пункта, из них на конец года оставалось 112 (О.Д. Скляров, 2011).

В настоящее время повышается вероятность появления новых очагов

бруцеллезной инфекции, как среди крупного рогатого скота, так и среди овец

по разным причинам, в т.ч. в связи с заносом источника возбудителя из сопредельных территорий.

В ранее оздоровленных стадах и отарах рецидивы инфекции могут быть связаны с латентно больными животными из-за несовершенства официальных диагностических реакций (РА, РСК, РИД) о которых сообщали К.В. Шумилов с соавт. (1981), Н.П. Иванов (1987), О.Д. Скляров (2005), М.П. Альбертян, М.И. Искандаров, А.И. Федоров (2006) и др., в том числе в связи с изменчивостью антигенной структуры возбудителя и переходом его в менее вирулентные формы - R-, L- (П.А. Триленко, 1976; И.А. Косилов, Л.В. Дегтяренко, 1987; В.Г. Ощепков, Л.Н. Гордиенко 1988 и др.).

При массовой диагностике бруцеллеза животных, особенно в условиях отгонного животноводства, предпочтительно применение экспресс-методов, доступных по цене, простых в исполнении, не требующих дорогостоящего оборудования, обеспечивающих объективную постановку диагноза и максимальное выявление эпизоотически опасных животных.

Кроме того, в связи с применением в системе противобруцеллезных мероприятий живых вакцин из слабоагглютиногенных штаммов В. abortus 82

И 75/79-AB экспресс-методы диагностики бруцеллеза должны выполнять и дифференцирующую функцию.

В РФ для экспресс-диагностики бруцеллеза у неиммунизированных сельскохозяйственных животных используют роз бенгал пробу (РЕП), эффективность которой подтверждена многими исследователями (JLB Дегтяренко, Б.И. Кондауров, 1978; В.Б. Бельченко, 1980; П.С. Уласевич, А.И. Касьянов с соавт., 1981; К.Д. Дусейнов с соавт., 1989 и др.).

Однако целесообразность использования указанного теста при обследовании крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ, достаточно не изучена.

Поскольку в антигенной структуре вакцин из штаммов В. abortus 82 и

75/79-АВ преобладают R-компоненты, при определении реактогенных

свойств вакцин, реактивности организма привитых животных, проведения

дифференциально-диагностических исследований возникает необходимость

использования R-бруцеллезных диагностикумов, которые до настоящего

времени в ветеринарной практике широко не применяются, хотя РСК с R-

бруцеллезными антигенами была успешно апробирована в производственных

условиях (A.M. Фомин, Д.А. Хузин, 1989; Л.В. Дегтяренко, 1977, 2005- ИП

Никифоров, 1995; С.К. Димов, 1997; В.В. Сочнев, 2004; K.M.; Салмаков с соавт., 2007; М.Ю. Карлова, 2010 и др.).

Сведения о целесообразности применения РА с R-бруцеллезным диагностикумом для оценки иммунного статуса крупного рогатого скота, иммунизированного слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ крайне ограничены.

Вышеизложенное и определило направленность исследований.

Цель исследований. Цель исследования - изучение эффективности РБП с S- и РА с R-бруцеллезными антигенами при диагностике бруцеллеза животных, в том числе в условиях широкого использования живых слабоагглютиногенных противобруцеллезных вакцин.

Задачи исследования:

- изучить эффективность РБП с Б-бруцеллезным антигеном в экспресс-диагностике бруцеллеза животных, в том числе после их иммунизации живыми слабоагглютиногенными вакцинами;

- изучить дифференциально-диагностическую эффективность РА с Я-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях.

Научная новизна. Выявлено соответствие показаний РБП с

биофабричным Б-бруцеллезным антигеном при оценке степени

выраженности реакции в крестах и других официальных серологических

тестов у животных при их искусственном и естественном заражении вирулентными бруцеллами.

Доказана возможность использования РБП с биофабричным бруцеллезным антигеном при оценке степени выраженности реакции в крестах у крупного рогатого скота через 2 и более месяцев после иммунизации вакциной из слабоагглютиногенного штамма В.аЬоПш 82 в качестве дифференциально-диагностического экспресс-метода при эпизоотической оценке стад по бруцеллезу.

В экспериментальных и производственных условиях подтверждено

дифференциально-диагностическое значение РА с Л-бруцеллезным

антигеном, установлена целесообразность ее использования при

осуществлении контроля иммунного ответа и эпизоотической оценке по

бруцеллезу животных, иммунизированных слабоагглютиногенными вакцинами.

Практическая и теоретическая значимость работы. Внедрение в ветеринарную практику экспресс-теста - РБП по предлагаемой методике оценки степени выраженности реакции позволит проводить дифференциальную эпизоотическую оценку животных по бруцеллезу через 2 и более месяцев после иммунизации их слабоагглютиногенными вакцинами.

Применение РБП с учетом степени выраженности реакции в крестах даст возможность более эффективно осуществлять контроль благополучия по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и оздоровление неблагополучных пунктов за счет своевременного и объективного удаления источников возбудителя инфекции.

Применение R-бруцеллезного антигена в РА позволит контролировать иммунный ответ (реактогенность вакцин) у крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов В. abortus 82, 75/79-АВ, что повысит качество вакцинопрофилактики. Комплексное использование R-бруцеллезных антигенов в РА и РСК повысит эффективность дифференциально-диагностических исследований и значительно снизит экономический ущерб при проведении оздоровления неблагополучных по бруцеллезу хозяйств за счет исключения необоснованного убоя животных с поствакцинальными реакциями.

Результаты научных исследований могут быть использованы при изучении патогенеза бруцеллеза животных, инфицированных типичными (S-) и диссоциированными (R, RS, SR) формами бруцелл.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 7-й межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008); международной научно-практической конференции «Развитие АПК азиатских территорий» (Новосибирск, 2008); международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных и незаразных патологий животных» (Омск, 2010); международной научно-практической конференции «Инфекционная патология животных» (Омск, 2011).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ

(«Достижение науки и техники АПК», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 19 таблицами, 6 рисунками. Список литературы включает 202 источника, из них 44 - зарубежных.

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований использованы для разработки методических рекомендаций по дифференциальной диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными вакцинами (прот. № 7 от 24.11.2006 г.); по контролю иммунного ответа крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 (прот. № 5 от 28.11.2007 г.); комплексу противоэпизоотических мероприятий по профилактике и ликвидации хронических болезней животных (прот. № 9 от 15.11.2008г.), утвержденных секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области; «Контроль поствакцинального иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ» (прот. № 4 от 1 о. 11.2009), утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения эффективности РБП с 8-бруцеллезным антигеном в экспресс-диагностике бруцеллеза животных, в том числе после их иммунизации живыми слабоагглютиногенными вакцинами-

результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РА с Я-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Лабораторная диагностика

Специфическую диагностику бруцеллеза у животных проводят с использованием различных иммунологических реакций. Диагноз на бруцеллез ставят, основываясь на результаты бактериологического, серологического, аллергического, молекулярно-генетического исследований.

1.1.1. Бактериологическое исследование

Международным подкомитетом по таксономии бруцелл было признано шесть видов бруцелл, вызывающих инфекции у животных: В. abortus, В. melitensis, В. suis, В. neotome, находящиеся в S-форме, и В. canis, В. ovis в R-форме (шестой доклад экспертов по бруцеллезу ФАО-ВОЗ, 1986).

С прогрессирующим развитием новых методов типирования бактерий

происходит процесс расширения рода Brucella. В настоящее время признано

десять разновидностей в пределах рода Brucella: В. abortus, В. melitensis, В. suis,

В. neotome, В. canis, В. ovis, В. ceti, В. pinnipedialis, В. microti, В. inopinata (М.И. Искандаров, 2012).

Бактериологический метод включает микроскопические и бактериологические исследования, в необходимом случае постановку биопробы.

Культуры бактерий, обладающие типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами, дающие положительную РА с S- и R-бруцеллезными сыворотками, относят к бруцеллам.

Виды бруцелл дифференцируют по способности роста в отсутствии повышенной концентрации С02, выделению HS2, чувствительности к фагу Тб, бактериостатическому действию анилиновых красителей и агглютинации моноспецифическими сыворотками.

Применение вакцины из штамма В. abortus 82, обладающей выраженными абортогенными свойствами, на маточном поголовье крупного рогатого скота, а также длительная приживаемость его в организме иммунизированных животных вызвало необходимость дифференциации культур бруцелл, выделенных из органов и плодов привитых животных. Автором вакцины разработана схема дифференциации культур бруцелл, включающая ряд основных биологических признаков. Однако, если учесть выделение значительного количества культур диссоциантов, то можно понять, насколько усложняется дифференциация подобных культур. (Е.А. Тягунина, A.A. Новицкий, 1980).

Эффективность бактериологического метода зависит от качества питательных сред, концентрации возбудителя в исследуемом материале, степени загрязненности последнего посторонней микрофлорой и времени, прошедшего с момента заражения животного (К.В. Шумилов с соавт, 1996; Т.С. Мальцев с соавт., 2011). Поэтому отрицательные результаты бактериологического исследования не могут исключать бруцеллез.

Согласно «Рекомендациям по дифференциальной диагностике бруцеллеза и иерсиниоза и мерам их профилактике» (2000), для культивирования бруцелл рекомендованы такие питательные среды, как картофельный агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночный глюкозо-глицириновый агар и бульон (ПГГА, ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицириновый агар (МППГГА), мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), эритрит-агар и др.

С целью подавления посторонней микрофлоры в среды можно добавлять генцианвиолет (1:200000) или кристаллвиолет (1:100000). При исследовании материала от крупного рогатого скота одну часть посевов инкубируют в атмосфере с содержанием 10-15 % С02, другую - в обычных условиях. Для выделения культур В. ovis и В. abortus используют плотные или полужидкие питательные среды, печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар при содержании 10-15 % С02. В. melitensis

растет в обычных атмосферных условиях. Посевы инкубируют при 37-38 °С течение 30 суток.

1.1.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В последние годы для определения ДНК бруцелл в различных объектах используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая впервые была предложена в 1983 г. Мюллесом.

В 1990 году D. Fekete et al. впервые применили метод ПЦР для детекции бруцелл.

В основе метода ПЦР лежит многократное копирование

(амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является

маркерным для данного вида. ПЦР обладает высокой чувствительностью,

позволяет выявить 100-1000 бактериальных клет