Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научно-экспериментальное обоснование путей повышения эффективности этиотропной терапии бруцеллеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Научно-экспериментальное обоснование путей повышения эффективности этиотропной терапии бруцеллеза"

На правах рукописи

МАЛЕЦКАЯ ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

НАУЧНО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПУТЕЙ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ

ЭТИОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ .

БРУЦЕЛЛЕЗА ^у

03.00.07 - микробиология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Ростов-на-Дону 2004

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Научные консультанты: доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Лямкин Геннадий Иванович

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Ефременко Виталий Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Васильева Галина Ивановна

доктор медицинских наук, профессор Рыбкин Владимир Семенович

доктор медицинских наук, профессор Яговкин Эдуард Александрович

Ведущая организация Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится » 200 ^/v. в SÍ? часов на

заседании диссертационного совета Д 208.082.01 при Ростовском государственном медицинском университете (344022 г, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «а^>> 200 -^г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Н.Я.Корганов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обстановка в стране по бруцеллезу остается напряженной и определяется наличием инфекции среди сельскохозяйственных животных, являющихся в Российской Федерации основным источником заболеваний людей, регистрирующихся в большинстве случаев на территориях с развитым овцеводством. Одним из самых неблагополучных регионов страны по данной инфекции является Северный Кавказ, на долю которого в 2000 году приходилось 53 % общероссийской заболеваемости бруцеллезом [Желудков М.М., Горшенко В.В., 2002].

В Ставропольском крае во многих животноводческих хозяйствах обстановка по бруцеллезу остается достаточно неблагоприятной, а заболеваемость людей этой инфекцией имеет тенденцию к росту. Ежегодно спорадические случаи заболевания людей отмечаются в большинстве административных районов края, 90 % из которых зарегистрировано в хозяйствах, ранее считавшихся благополучными по бруцеллезу. При сложившейся в настояще'е время эпизоотической и эпидемической обстановке существует прогноз неблагоприятной эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в крае в последующие годы [Таран И.Ф., 2002].

Рост заболеваемости в регионах с развитым животноводством ведет к огромным экономическим потерям. Болезнь наносит моральный ущерб человеку, лишая его активной трудовой деятельности. Бруцеллез остается одной из самых сложных проблем инфекционной патологии. На фоне стойкого неблагополучия по бруцеллезу сельскохозяйственных животных, наблюдающегбся роста заболеваемости данной инфекцией людей, и утяжеления ее течения отмечается снижение эффективности в лечении заболевания ранее применявшихся антибиотиков, связанное с их низкой способностью проникать внутрь клетки и с развивающейся резистентностью бруцелл к ним. В связи с этим возникла потребность в расширении арсенала противомикробных' средств лечения бруцеллеза и в совершенствовании методов комплексной терапии этого заболевания.

В последние годы появилось значительное количество антимикробных препаратов, имеющих ряд преимуществ по сравнению с ранее синтезированными антибиотиками и обладающих способностью проникать внутрь клетки, эффективность которых влечении бруцеллезной инфекции не изучена.

|гос,«ЛЩ1ональнд*| 3 БИБЛИОТЕКА I

Длительное течение бруцеллезной инфекции с формированием хронических и затяжных форм является следствием особенности патогенеза данного заболевания, связанной с развитием вторичных иммунодефицитных состояний. Формирование выраженной иммунодепрессии способствует накоплению в фагоцитарных клетках крови жизнеспособных бруцелл и их размножению. На фоне подавленной иммунореактивности снижается клинический эффект применения антимикробных средств [Лусс Л.В. с соавт., 2000; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000; Петров Р.В. с соавт., 2000]. Одним из путей повышения результативности этиотропного лечения бруцеллеза может быть тактика комбинированной терапии путем воздействия антибактериальными препаратами на микроб с одновременным стимулированием защитных механизмов организма.

♦ Внутриклеточное паразитирование бруцелл препятствует непосредственному действию на них антимикробных средств и создает значительные трудности при лечении бруцеллеза. В связи с этим вполне естественны поиски новых форм лекарственных препаратов и их комбинаций, которые обеспечивали бы проникновение лекарств в клетки. Одним из вариантов носителей, позволяющих доставлять терапевтические средства внутрь клеток, являются липосомальные везикулы [Bachhawat В.К.,1985; Jaeschke H. et al., 1987; Давыдов В.Ю, с соавт., 1996]. Препараты, включенные в липосомы, оказываются более эффективными для достижения терапевтических целей [Ефременко В.И., 1999]. Их применение позволяет снизить дозу антибиотиков при сохранении эффективности лечения [Закревский В.И., 1985; Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986; Ротов К.А. с соавт., 1995; Merei M., Mesei А., 1988]:

Снижения вероятности перехода бруцеллезной инфекции в хроническую форму можно достичь с помощью увеличения эффективности этиотропного лечения при использовании различных направлений: тщательного выбора антибактериальных средств, высокоактивных в отношении бруцелл; взвешенного воздействия иммунотропными препаратами на иммунный статус больного с целью повышения его защитных функций; применения лекарственных форм, позволяющих осуществлять целенаправленную доставку препаратов.

Цель исследования

Научно-экспериментальное обоснование путей повышения эффективности лечения бруцеллеза на основе изучения интенсивности элиминации бруцелл из организма и изменения некоторых факторов иммунологической реактивности

макроорганизма при применении новых антибактериальных и иммунокорригирующих средств, в том числе, заключенных в липосомы.

Основные задачи исследования ♦ 1. Экспериментально обосновать выбор новых перспективных для лечения бруцеллеза антибактериальных средств путем оценки их антимикробного действия на бруцеллы in vitro и влияния на интенсивность элиминации бруцелл из макроорганизма в сравнении с действием традиционно используемых при бруцеллезе антибиотиков. Подобрать эффективные дозы препаратов и схемы их введения.

2. Изучить влияние иммунокорригирующих препаратов (глу-токсима, ликопида и полиоксидония) на результаты этиотропной терапии бруцеллеза. Определить оптимальные дозы иммуномодуляторов и время их введения.

3. Изучить эффективность перорального применения липосо-мальных форм антибиотиков и иммуномодуляторов при бруцеллезной инфекции, а также влияние «пустых» липосомальных везикул на результаты терапии этого заболевания. Экспериментально обосновать оптимальный вариант возможных сочетаний липосомальных форм антибиотика и иммуномодулятора для комплексного лечения бруцеллеза.

4. Изучить динамику изменений некоторых показателей клеточного и гуморального иммунитета при лечении экспериментального бруцеллеза традиционно используемыми, а также новыми антимикробными препаратами, иммуномодуляторами и липосомами.

5. Разработать методы контроля эффективности этиотропного лечения бруцеллеза на основе цитоэнзимохимических методов исследования клеток периферической крови и на основе ПЦР-анализа.

Научная новизна

- впервые проведено комплексное изучение взаимоотношений «микроб-хозяин» в различных, модельных системах при лечении бруцеллеза свободными и липосомальными формами антибиотиков и иммуномодуляторов и их сочетаниями;

- впервые предложены для лечения бруцеллеза проти-вомикробные препараты: ломефлоксацин, меропенем, азитромицин, позволяющие расширить арсенал средств антибактериальной терапии бруцеллеза. Показано преимущество азитромицина по сравнению с традиционно используемыми антибиотиками и

другими изученными препаратами - доксициклином, гента-мицином, рифампицином, пефлоксацином, ломефлоксацином и меропенемом;

- показана активация неспецифической резистентности макроорганизма к возбудителю данного заболевания под действием свободных и липосомальных форм иммуномодуляторов. Впервые предложены иммунотропные средства для проведения иммуно-коррекции при бруцеллезе - глутоксим, ликопид, полиоксидоний. Установлено преимущество сочетанного применения азитромицина с левамизолом, глутоксимом, ликопидом и полиоксидонием над самостоятельным введением данного антибиотика. Показано преимущество полиоксидония по сравнению с левамизолом, глутоксимом и ликопидом;

- установлено, что интактные липосомальные везикулы влияют на скорость элиминации бруцелл из организма беспородных белых мышей и величину показателей некоторых факторов клеточного и гуморального иммунитета животных;

- впервые выявлено преимущество липосомальных форм пефлоксацина, ломефлоксацина, меропенема, азитромицина, левамизола и ликопида над их свободными формами при этиотропной и иммунокорригирующей терапии бруцеллеза. Установлено, что включение доксициклина и гентамицина в липосомы позволяет при лечении этой инфекции заменить их инъекционные формы пероральными;

- экспериментально показано, что при бруцеллезе оптимальной схемой лечения является сочетание антибиотика и иммуномодулятора, включенных в индивидуальные липосомальные везикулы;

- выявлена зависимость показателей некоторых неспецифических, факторов клеточного (содержание катионных белков и гликогена, активности миелопероксидазы в нейтрофилах и сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови) и гуморального (активности лизоцима легких) иммунитета от эффективности лечения бруцеллезной инфекции антибиотиками, иммуномодуляторами и липосомальными везикулами;

- предложены способ контроля эффективности антибиотика при лечении бруцеллеза с использованием цитоэнзимохимических методов исследования клеток периферической крови (Патент РФ № 2206898) и способ контроля эффективности проведенной антибиотикотерапии с помощью ПЦР-анализа;

- установлено, что величина титра специфических антител при лечении бруцеллеза находится в обратной зависимости от степени активности используемых при этом лечебных препаратов -антибиотиков, иммуномодуляторов или липосомальных везикул;

- результаты проведенных исследований являются научно-экспериментальным обоснованием совершенствования существующих в практическом здравоохранении средств этиотропной терапии бруцеллеза и позволяют раскрыть некоторые механизмы влияния бруцеллезной инфекции и ее лечения на факторы клеточного и гуморального иммунитета, что, несомненно, представляет теоретический интерес.

Практическая значимость работы

В процессе проведения экспериментальных исследований отработаны методы получения липосомальных форм антибиотиков, что нашло отражение в методических рекомендациях «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных на федеральном уровне первым заместителем министра здравоохранения РФ, главным государственным санитарным врачом России Г.Г.Онищенко 6 апреля 2000 г. Разработанные в эксперименте схемы лечения бруцеллеза липосомальными формами доксициклина, гентамицина, рифампицина, пефлоксацина, меропенема и азитромицина изложены в методических рекомендациях «Схемы лечения особо опасных инфекционных заболеваний (бруцеллез, сибирская язва, туляремия) липосо-мальными антибиотиками», которые утверждены директором СтавНИПЧИ на региональном уровне 26 октября 2001 г. (протокол № 9). Предложены новые антибактериальные и иммуномо-дулирующие средства для лечения бруцеллезной инфекции, что нашло отражение в методических рекомендациях «Бруцеллез. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика, клиника, лечение, диспансерное наблюдение за больными», утвержденных на федеральном уровне первым заместителем министра здравоохранения РФ главным государственным санитарным врачом России Г.Г.Онищенко 12 февраля 2004 г. Предложен способ, контроля эффективности антибиотикотерапии и составлены «Методические рекомендации-по использованию цитоэнзимохимических показателей для контроля лечения антибиотиками бруцеллезной инфекции», утвержденные директором СтавНИПЧИ 28 апреля 2003 года на региональном уровне (протокол № 4). Разработанные критерии выбора иммуномодуляторов, применяемых при лечении бруцеллеза, изложены в «Методических рекомендациях по изучению эффективности иммунокорригирующих препаратов в лечении бруцеллеза», которые утверждены директором СтавНИПЧИ 26 июня 2003 года на учрежденческом уровне (протокол № 6). Усовершенствованы схемы лечения бруцеллеза посредством

включения антибиотиков и иммуномодуляторов в липосомы и путем сочетанного применения антибиотиков с иммуномодуляторами, что служит основанием для их последующего внедрения в практическое здравоохранение. Результаты работы используются в практической работе Ставропольского краевого центра по лечению и диагностике бруцеллеза, а также включены в план лекционных и семинарских занятий учебного процесса кафедры инфекционных болезней Ставропольской государственной медицинской академии и в план подготовки специалистов на курсах повышения квалификации и специализации по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ.

Диссертационная работа выполнена в рамках государственных тем НИР: № ГР 01200004621 «Изучение эффективности новых антибактериальных и иммуномодулирующих препаратов при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции», № ГР 01897080 «Изучение эффективности липосомальных форм иммуномодуляторов при особо опасных зоонозных инфекционных заболеваниях» и темы «Конструирование липосомальных форм антибиотиков и разработка схем лечения особо опасных инфекционных заболеваний (бруцеллез, туляремия, сибирская язва)» по договору № 422-Д от 03.07.2001 в соответствии с Федеральной Целевой Программой «Защита от патогенов».

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые изученные при экспериментальном бруцеллезе новые антибактериальные средства - фторхинолон ломефлоксацин, беталактамный антибиотик карбапенемного ряда меропенем, макролидный препарат азалидного ряда азитромицин эффективны при лечении данного заболевания.

2. Иммунокорригирующие препараты глутоксим, ликопид и полиоксидоний повышают эффективность этиотропной терапии бруцеллезной инфекции.

3. Липосомальные формы антибиотиков и иммуномодуляторов, а.также «пустые» липосомальные везикулы при пероральной терапии экспериментального бруцеллеза увеличивают интенсивность элиминации бруцелл из макроорганизма и повышают эффективность лечения заболевания.

А. Показатели неспецифического клеточного (содержание катионных белков и гликогена, активности миелопероксидазы в нейтрофилах и сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови) и гуморального (активности лизоцима легких) иммунитета свидетельствуют об эффективности комплексной терапии бруцеллеза, включающей применение антибиотиков, иммуномодуляторов и (или) липосом.

5. Цитоэнзимохимические методы исследования клеток периферической крови и ПЦР-анализ обеспечивают быстрый и точный контроль эффективности этиотропного лечения бруцеллеза.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научных конференциях СтавНИПЧИ (Ставрополь, 2000-2003); на научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ, «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); на международной конференции «Проблемы биологической безопасности» (Оболенск, 2000); на научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); на научно-практической конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции МЗ РФ «Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001); на международной научно-практической конференции «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции (г. Талдыкорган, 2001); на международной научной конференции «Природно-очаговые инфекционные болезни» (Уланбатор, 2001); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); на научно-практической конференции, посвященной 50-летию Дагестанской противочумной станции (Махачкала, 2002); на научно-практической конференции, посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002).

Публикации

Основное содержание диссертации изложено в 41 опубликованной работе.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 237 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 428 источников, в том числе 265 работы отечественных и 163 - зарубежных авторов. Материалы исследований иллюстрированы 24 таблицами и 24 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проведены на 3900 беспородных белых мышах обоего пола весом 16-18 г., полученных из питомника СтавНИПЧИ. При выполнении работы использовали 117 штаммов бруцелл, представляющих все виды рода Brucella и включающих референтные, вакцинные и полевые штаммы: В. melitensis — 42; В. abortus - 26; В. suis - 30; В. rangiferi - 4; В. neotomae - 2; В. canis - 3; В. ovis - 10 штаммов.

Антибактериальную терапию осуществляли тетрациклином (тетрациклина гидрохлорид, «Брынцалов Ферейн», Россия), доксициклином (доксициклина гидрохлорид, ЗАО «Брынцалов А», Москва, Россия), рифампицином («Мосхимфармпрепараты им. Н.А.Семашко», Россия), гентамицином (гентамицина сульфат, «Hemofarm», Югославия), азитромицином («Сумамед», «Плива», Республика Хорватия), меропенемом («Меронем», «Zeneca Limited», Великобритания), пефлоксацином («Абактал», «Лек д.д.»,' Любляна, Словения) и ломефлоксацином («Максаквин», «Searle», Франция); иммунокоррекцию - ликопидом (ЗАО Пептек, Москва, Россия), глутоксимом (ЗАО «ФАРМА ВАМ», Москва, Россия), полиокси-донием (ООО «Иммафарма», Москва, Россия) и левамизолом («Декарис», Гедеон Рихтер А.О., Будапешт, Венгрия).

Минимальную подавляющую концентрацию антибиотиков в отношении различных штаммов бруцеллезного микроба определяли методом,серийных разведений на плотной питательной среде [Навашин СМ., Фомина И.М., 1982]. За МПК антибиотика для данного штамма принимали ту, при которой отсутствовали признаки роста культуры на поверхности агара.

Бруцеллезную инфекцию моделировали у беспородных белых мышей путем подкожного введения во внутреннюю поверхность бедра по 0,5 • 105 м.к. высоковирулентного штамма В. melitensis 565. Использовали взвесь двухсуточной культуры возбудителя бруцеллеза, выращенную на агаре Альбими, рН 7,2 при 37 °С, приготовленную по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-85П), 10 единиц которого эквивалентны 1,7-109 бруцелл.

Об эффективности лечения судили по данным бактериологического исследования, которое осуществляли путем посева гомогенизированных паховых, аксиллярных, подчелюстных, парааортальных лимфоузлов и селезенки, взятых от умерщвленных декапитацией животных, на агар Альбими, рН 7,2. Критерием интенсивности обсемененности бруцеллами организма мышей служили: индекс высеваемости (ИВ) - частное отделения количества

органов с положительными результатами бакисследования на количество всех исследованных органов; индекс обсемененности (ИО) - отношение суммы баллов, характеризующих рост к сумме возможного максимального количества баллов; количество животных с отрицательными результатами бактериологического исследования.

Для приготовления липосом использовали фосфатидилхолин, дицетилфосфат («Sigma», США), холестерин («Реахим», СССР) в молярном соотношении 7:2:1. Липосомальные препараты готовили методами «ручного встряхивания» [Me Cown, J.T. et al., 1981], «этанольной инжекции» [Kremer J.M.H. et al., 1977], «выпаривания в обращенной фазе» [Cafiso D.S., Petty H.R., 1981; Szoka F., Papahadjopoulos D., 1978], «замораживания-оттаивания» [Pica U, 1981]. При получении липосомальных препаратов добавляли навеску определенного лекарственного вещества (антибиотика или иммуномодулятора) в соответствии с лечебной дозой [Закревский В.И. с соавт., 1982].

Расчет удельного внутреннего объема липосом проводили, используя в качестве включаемого материала глюкозу как низкомолекулярное, гидрофильное, электронейтральное вещество, неспособное к адсорбции и проникновению через липидную мембрану. После трехкратного удаления не связавшейся глюкозы центрифугированием липосом в 0,01 М фосфатном буфере при 50000 g в течение 1 ч, последующего разрушения липосом определяли количество иммобилизованной глюкозы глюкозооксидазным методом на анализаторе «ЭКСАН-Г» и рассчитывали удельный внутренний объем, то есть отношение внутреннего объема, к количеству липидов, образующих липосомы.

Элекронно-микроскопический контроль образования, размеров и структуры липосом осуществляли при исследовании как нативных препаратов липосом, так и их ультратонких срезов [Закревский В.И. с соавт., 1982].

Липосомы с содержащимся в них лекарственным веществом отделяли от не включившегося материала методом диализа против фосфатно-солевого буфера рН 7,2 в течение 18 ч при 4±0,5 °С с двукратной сменой буфера. Определение количества включенного внутрь липосом антибиотика проводили методом, серийных разведений [Навашин СМ., Фомина И,П., 1974]. Уровень включения иммуномодуляторов в липосомы определяли косвенным методом по удельному внутреннему объему липосом, используя в

качестве включаемого материала глюкозу. В экспериментах использовали липосомы с высоким содержанием антибиотика или иммуномодулятора, включение которых в липосомальные везикулы составляло 72,3±2,4%.

Содержание гликогена в нейтрофилах периферической крови выявляли по Mc. Manus [Пирс Э., 1962] в модификации В:М. Сафроновой с соавт. [1994], катионных белков - по В.Е.Пигаревскому [1978], активность миелопероксидазы - по Р. Лилли [1969],сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов - по Р.П.Нарциссову [1969]. Полуколичественные показатели активности СДГ и МПО, содержания Гл и КБ вычисляли по методу L.S.Kaplow [1955].

Определение титра специфических антител в сыворотке крови беспородных белых мышей проводили микрометодом в реакции непрямой гемагглютинации с использованием набора ингредиентов для серологических реакций и диагностикума бруцеллезного эритроцитарного антигенного сухого (Казахский НИПЧИ, г.Алматы).

Активность лизоцима в легких экспериментальных животных определяли при помощи непрямого метода, основанного на способности фермента лизировать культуру Micrococcus lysodeikticus [Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974].

ДНК выделяли согласно инструктивно-методическим рекомендациям, к набору для выделения ДНК Реакцию амплификации осуществляли на приборе с программным обеспечением MJ Research (США) в соответствии с инструкцией производителя тест-системы для ПЦР-анализа.

Группировку первичных данных, вычисление средних величин, достоверности различий полученных результатов проводили на IBM PC 550, используя компьютерную обработку программой Excel 7.0 по методам биометрии [Лакин Г.Ф., 1990]. Обработку полученных результатов серологического анализа осуществляли с определением средних геометрических титров и ошибки в их определении [Гамбовцев Е.П. с соавт., 1969]. Полученные данные цитоэнзимохимического исследования обрабатывали методом вариационной статистики по И.А.Ойвину [i960] с определением средних величин (М) и их ошибок (m), среднего квадратического отклонения (а) и достоверных различий с помощью критерия t Стьюдента при уровне статистической значимости различий 95 % (р<0,05).

И. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Угнетение неспецифической резистентности организма при развитии бруцеллезной инфекции и внутриклеточная локализация возбудителя создают определенные трудности в лечении этого заболевания. Использование существующих в настоящее время схем и методов лечения бруцеллеза зачастую не обеспечивает освобождения организма от бруцелл и, вследствие этого, приводит к переходу болезни в хроническую форму.

Совершенствование способов лечения бруцеллеза возможно по нескольким направлениям. Поскольку главное место в лечении данной инфекции занимают антибактериальные средства, прежде всего, важен взвешенный подход к выбору используемых препаратов. Применяемые антибиотики должны быть высокоактивными в отношении бруцелл, проникать внутрь клеток макрофагальнсй. системы, не оказывать иммунодепрессивного и токсического действия. Используемые в настоящее время в лечении бруцеллеза антимикробные средства - аминогликозиды (стрептомицин, гентамицин и др.), рифампицин, хлорамфеникол, тетрациклины (тетрациклин, доксициклин), сульфаниламиды при длительном их, применении могут проявлять токсическое действие, усиливать иммунодепрессию организма и, вследствие этого, приводить к дополнительным осложнениям pusczykJ., 1984; Pesic M.C. etal., 1987; Kunin C.M. et al., 1990]. Кроме того, достижения желаемого результата затрудняют низкая способность традиционно применяющихся антибиотиков проникать внутрь клетки и развитие, лекарственной устойчивости возбудителя [Strausbaugh L., 1977]. Антибактериальная терапия, проводимая в клинических условиях, зачастую оказывается недостаточно эффективной. Поэтому арсенал антимикробных средств, используемых при этиотропной терапии бруцеллезной инфекции, необходимо расширять, отдавая/ предпочтение высокоактивным препаратам, фармакокинетика которых позволяет значительно сократить длительность курса антибиотикотерапии при сохранении ее эффективности.

В последние годы в клиническую практику входят антибактериальные средства, представляющие новые группы химиопре-паратов - фторхинолоны, карбапенемы, азалиды и обладающие рядом преимуществ по сравнению с ранее синтезированными антибиотиками. Для них характерны высокая биодоступность, широкое тканевое распределение, постантибиотический эффект, в период которого микроорганизмы более подвержены бактерицидному действию нейтрофилов [Самсыгина Г.А., 1999]. Предварительно нами в опытах in vitro изучена активность в отношении бруцелл препаратов, обладающих вышеперечисленными

свойствами и способных проникать внутрь клеток: монофтор-хинолона - пефлоксацина, дифторхинолона - ломефлоксацина, карбапенемного антибиотика - меропенема и представителя азалидов, новой подгруппы макролидных антибиотиков, -азитромицина. Влияние на бруцеллы новых антибактериальных средств определяли в сравнении с действием наиболее часто применяющихся в лечении данного заболевания препаратов -тетрациклина гидрохлорида, доксициклина, гентамицина и рифампицина [Курманова К.Б., 1998; Покровский В.И. с соавт., 2000]. In vitro антибактериальные препараты проявляли высокую активность по отношению к бруцеллам 117 взятых в опыт штаммов, представляющих все виды рода Brucella - B.abortus, В. melitensis, В. suis, В. rangiferi, В. ovis, B neotomae и В. canis. Наиболее активным из изученных антибиотиков в отношении всех испытуемых штаммов бруцелл был гентамицин, МПК которого составляла 0,25-1,0 мкг/мл. Однако этот препарат может действовать только на внеклеточно расположенные бруцеллы. В клинике его применяют только в комплексных схемах лечения бруцеллезной инфекции.

Все изученные химиопрепараты активно препятствовали росту возбудителя бруцеллеза на питательной среде. При этом диапазон МПК азитромицина и доксициклина был одинаковым (0,25-25,0 мкг/мл), а соответствующий показатель меропенема (0,25-2,5 мкг/мл) был ниже, чем у рифампицина (0,5-5,0 мкг/мл). МПК фторхинолонов - пефлоксацина и ломефлоксацина была равной МПК тетрациклина гидрохлорида (0,25-10 мкг/мл).

Определение активности препаратов in vitro является обязательным этапом микробиологического анализа и основой для разработки схем антибактериальной терапии. Однако величина МПК не дает информации о динамике элиминации возбудителя из очага инфекции. Взаимодействие между антибиотиком, микроорганизмом и макроорганизмом имеет сложный характер. Действие препаратов на микробы in vitro происходит в режиме, значительно отличающемся от условий организма. Влияние вышеуказанных антимикробных средств на бруцеллы in vivo изучали на экспериментальной модели генерализованного инфекционного процесса, вызванного наиболее патогенным видом возбудителя бруцеллеза - В. melitensis. Лечение проводили двумя курсами с интервалом 10 сут. Об эффективности антибактериальных препаратов судили по данным бактериологического анализа, свидетельствовавшим о величине элиминации бруцелл из организма беспородных белых мышей. Для этого животных исследовали после каждого курса лечения и через 14 сут после его окончания, поскольку

известно, что в случае сохранения бруцелл в клетках ретику-лоэндотелиальной системы мышей на 10-12 сут после окончания антибиотикотерапии происходит выход микроорганизмов в кровь, и наблюдается реактивация инфекции.

Проведенные исследования, прежде всего, подтвердили наличие терапевтического эффекта при приеме доксициклина, гентамицина, рифампицина, традиционно применяемых при лечении бруцеллеза, но для мышей он был более выражен при использовании высоких доз указанных препаратов. Освобождения от бруцелл 94,4±1,9 % грызунов удалось достигнуть при использовании доксициклина внутримышечно в суточной дозе 1,25 мг/мышь, что в 2 раза превышало высшую дозу антибиотика, рекомендованную Фармакологическим комитетом (в пересчете для данной биологической модели). При пероральном его введении у 88,2±1,9 % зверьков получены отрицательные результаты бактериологического исследования в случае применения по 2,75 мг/мышь в сут. Эффективное' терапевтическое действие гентамицина и рифампицина при бруцеллезе проявлялось при использовании их в максимальных суточных дозах, предписанных для соответствующего препарата. Лечение гентамицином в дозе 1 мг/мышь в сут при внутримышечном введении приводило к освобождению от возбудителя 80,3±1,5, а при внутрибрюшинном - 83,4±1,9 % мышей. Прием внутрь рифампицина по 1 мг/мышь в сут способствовал полной элиминации бруцелл у 81,6±1,9, а по 2 мг/мышь -у 94,8±2,4 % грызунов.

Из представителей нового поколения хинолонов выраженный положительный результат получен при применении дифтор-хинолона ломефлоксацина, который более интенсивно подавлял бруцеллезную инфекцию, чем монофторхинолон пефлоксацин. В результате использования пефлоксацина по 4 мг/мышь и ломефлоксацина по 2 мг/мышь в сут (курсовые дозы - 40 и 20 мг/мышь), что соответствовало их максимальным рекомендуемым суточным дозам, соответственно 10,3± 1,8 и 51,3±2,1 % животных оказались свободными от бруцелл (табл. 1). Наиболее выраженная эффективность в лечении бруцеллеза достигнута при применении меропенема и азитромицина. Данные антимикробные средства были высокоактивны в среднетерапевтических дозах. Использование меропенема по 4 и 8 мг/мышь в сут (курсовые дозы 28 и 56 мг/мышь) после окончания лечения приводило к освобождению от возбудителя инфекции 64,1 ±0,9 и 89,1 ±1,7 % мышей, а при лечении азитромицином в курсовой дозе 3,9 и 7,8 мг/мышь у 87,3±1,9 и 94,3± 1,7 % грызунов бруцеллы не были обнаружены.

Таблица I. Динамика показателей бактериологического исследования беспородных белых мышей при антибактериальной терапии бруцеллеза

Сроки< иссле доаания Показатели Антибиотик, курсовая доза, мг/мышъ

Контроль Пефлок-сации, 40 Ломе-флоксацин, 20 Меро-пенем, 28 Азитро мицин, 7,8

после I курса лечения ИВ 0,92±0 08 0,57±0,09 0,39±0,06 0,24±0,03 0

ИО 0,76±0,06 0,32±0,05 0,24±0,03 0,21 ±0,02 0

% 0 0 42,6±1,8 46,4±1,4 100

через 14 сут после I курса лечения ИВ 0,88±0,10 0,72±0,07 0,48±0,05 0,36±0,03 0,21±0,03

ИО 0,68±0,07 0,41±0,05 0,37±0,04 0,27±0,03 0,14±0,02

% 0 0 0 0 81,7±1,3

после II курса, лечения ив 0,84±0,!0 0,ЗЙ±0,06 0,2«±0,04 0,15±0,02 0

ИО 0,60±0,07 0,19±0,04 0,11 ±0,02 0,11±0,02 0

% 0 25,2±1J 79,8±1,9 81,в±2,4 100

через 14 сут после II Kjpca лечения ив 0,78±0,09 0,48±0,05 0,3«±0,04 0,2±0,02 0,08±0,0!

ИО 0,52±0,07 0,2510,03 0,18±0,03 0,1±0,02 0,03±0,01

% 0 10,3±1,8 51,3±2,1 й4,1±0,9 94i3±l,7

Обозначения: ИВ - индекс высеваемости; ИО - индекс обсемененности; % - количество животных с отрицательными бактериологическими высевами

Довольно высокая рыночная стоимость меропенема делает использование азитромицина более перспективным. Кроме того, известно, что накопление макролидов в клетках макроорганизма повышает бактерицидную активность его защитных систем [Фомина И.П., 1995; Ufert D.S et ah, 1995J. Азитромицин в терапевтических дозах улучшает основную функцию нейтрофилов - адгезию и хемотаксис, благодаря которым они проникают в очаг воспаления [Labro M.T., 1993]. Макролиды меньше, по сравнению с другими группами антибиотиков, влияют на нормальную микрофлору организма человека. Сохранение защитного барьера нормальной микрофлоры снижает риск развития суперинфекций, распространения устойчивости [Фомина И.П., 1995; Навашин СМ., 1998]. Высокое соотношение между внеклеточными и внутри-

клеточными концентрациями азитромицина определяет действие препарата на внутриклеточно расположенных возбудителей и клинический эффект при вызываемых ими инфекциях. Эффективность азитромицина в терапевтических дозах при лечении бруцеллезной инфекции, особенности фармакокинетики препарата, позволяющие проводить наиболее удобный и короткий курс антибиотикотерапии, позволяют включить этот препарат в арсенал средств этиотропного лечения бруцеллеза и рекомендовать его для клинического использования.

Следует отметить, что удобство применения, меньшие суточная и курсовая дозы, меньшая частота развития побочных реакций, высокая эффективность уравнивают экономические показатели лечения новыми препаратами и ранее синтезированными, несмотря на более высокую рыночную стоимость первых [Фомина И.П 1995].

Антимикробные средства оказывают на возбудителя бактерицидное либо бактериостатическое действие, но конечная элиминация бруцелл происходит за счет действия иммунных сил организма. Нарушение нормального функционирования иммунной системы не только определяет более тяжелое затяжное течение заболевания, но и способствует генерализации процесса, развитию осложнений, снижению или отсутствию клинического эффекта от базисной терапии [Лусс Л.В. с соавт., 2000]. Успех лечения в значительной мере зависит от интенсивности защитных; и репаративных реакций больного [Хаитов P.M. с соавт., 1998]. Развитие бруцеллезной инфекции сопровождается формированием выраженной иммунодепрессии, что приводит к накоплению в фагосомах жизнеспособных бруцелл, способных к размножению, и служит причиной длительного течения заболевания с формированием хронических и затяжных форм. На фоне подавленной иммуно-реактивности действие антибиотиков проявляется менее эффективно. Угнетение неспецифической резистентности организма при развитии бруцеллезной инфекции определяет необходимость воздействия не только на возбудителя, но и на зараженный организм с целью стимулирования его защитных механизмов. Одним из путей повышения эффективности лечения является тактика комбинированной терапии, включающая этиотропные препараты с иммунокоррекцией [Кузнецов В.П. с соавт., 2002].

Нами изучена возможность повышения эффективности лечения бруцеллезной инфекции путем использования отечественных

иммуномодуляторов нового поколения - ликопида, глутоксима, полиоксидония в сравнении с влиянием на результаты антибио-тикотерапии бруцеллеза левамизола, успешно применяющегося в комплексной терапии этого заболевания [Швецова Н.М., 1994; Symoens J. et al. , 1979]. Изученные препараты имеют разный механизм действия, но все они оказывают влияние на гуморальный и клеточный иммунитет, неспецифическую резистентность организма в целом.

Результаты экспериментов показали, что использование вышеуказанных иммуномодуляторов способствовало интенсивному освобождению организма экспериментальных животных от возбудителя и в значительной степени улучшало результаты этиотропного лечения. Несмотря на различный механизм действия, все изученные иммунотропные средства увеличивали эффективность терапии бруцеллеза. В результате экспериментов определены оптимальные дозы и время введения препаратов для проведения иммунокоррекции у беспородных белых мышей при лечении бруцеллеза. Максимальное увеличение интенсивности элиминации бруцелл из макроорганизма наблюдали при применении левамизола в дозе 50, ликопида - 100, глутоксима - 400 и полиоксидония - 120 мкг/мышь. Способность иммунокор-ригирующих средств повышать резистентность организма и увеличивать эффективность этиотропной терапии зависит от времени поступления иммуномодулятора в организм относительно момента инфицирования и начала антимикробной терапии. Элиминация любого возбудителя инфекционного заболевания является, результатом синергидного действия защитных сил макроорганизма и антимикробных агентов. При лечении экспериментального бруцеллеза беспородных белых мышей наиболее эффективным было одновременное использование ликопида или левамизола в сочетании с антибиотиком (азитромицином или меропенемом). В этом случае по возбудителю наносится «двойной удар». Антибактериальное средство понижает функциональную активность микроба, а иммуномодулятор повышает функциональную активность фагоцитарных клеток, за счет чего достигается более эффективная элиминация возбудителя из организма [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1999]

Применение указанных иммуномодулирующих средств даже в минимальных испытуемых дозах способствовало заметному

уменьшению бактериологических индексов при исследовании мышей и увеличению количества зверьков, освободившихся от микробов. Использование же их в подобранных экспериментально для данной биологической модели оптимальных дозировках в сочетании с субтерапевтической дозой азитромицина увеличивало количество освободившихся от бруцелл животных при применении левамизола на 42,2+1,1; глутоксима - на 45,Ш,5; ликопида - на 53,4±1,7; полиоксидония - на 63,6±1,6 % по сравнению с результатами лечения, проводимого без применения иммуномодуляторов.

Известно, что левамизол у крыс вызывает угнетение всех показателей кроветворения [Базарный В.В., Ястребов А.П., 1993], что является одним из проявлений его побочного действия [Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985]. При использовании глутоксима, ликопида и полиоксидония по данным литературы побочных эффектов указанных иммуномодуляторов не обнаружено [Некрасов А.В. с соавт., 1997; Петров Р.В. с соавт., 2000; Некрасов А.В, с соавт., 2000; Иванов В.Т. с соавт., 1996; КогЬетуакп Ь. е1 а1., 1999].

Наиболее выраженное влияние на результаты антибактериальной терапии бруцеллеза вызывало применение полиоксидония (рис. 1). Эффективность этого препарата превосходиладействие всех вышеуказанных иммуномодулирующих средств.

Полиоксидоний - перспективный отечественный иммуномо-дулятор, действующий, прежде всего, на факторы естественной резистентности: клетки моноцитарно-макрофагальной системы, нейтрофилы и КК-клетки, вызывая повышение их функциональной активности при исходно сниженных показателях. Необходимо отметить, что противопоказания для применения полиоксидония отсутствуют [Петров Р.В. с соавт., 2000; Манько В.М.с соавт., 2002]. Препарат характеризуется высокой эффективностью, широтой иммунофармакологических свойств, безопасностью. Принципиальным отличием от других иммунотропных препаратов является его реальная детоксицирующая активность, т.е. он способен резко снижать опасные для организма токсические свойства многих соединений, в том числе фармакологических препаратов, и выводить их из организма [Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., 2002]. Ссочетание базисной терапии и полиоксидония приводит к улучшению переносимости препаратов базисной группы, повышению ее эффективности, определяя пролонгированный клинический и иммунологический эффект терапии [Гришина Т.И.

с соавт., 2002]. Следует отметить, что полиоксидоний эффективен и безопасен при острых инфекциях, что связано с выраженными иммуномодулирующими, детоксицирующими и антиоксидантными его свойствами [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000].

-:- so -

Индскс высеваемости Индекс обсемененности Кояичоетао свободных от

инфекции животных

В Контроль (без лечения) ЕЭАзитромищш

£3 Аппромишт и левамнзол В Азкгромнцнн и глугохеим □ Аттромишш и ликоши В Азитромнцин и полиоксидоний

Рис. 1 - Влияние иммуномодуляторов на эффективность лечения бруцеллеза беспородных белых мышей субтерапевтическими дозами азитромицина

Проведение иммунокоррекции полиоксидонием в сочетании с субтерапевтической дозой азитромицина способствовало максимальной элиминации бруцелл из организма беспородных белых мышей по сравнению с применением других иммуномодуляторов и приводило к освобождению от инфекции после 2 курса лечения 80,3±2,0 % животных, а индексы высеваемости и обсемененности у зверьков этой группы составляли лишь 0,07±0,01 и 0,03±0,01. В то •ж время в группе грызунов, не получавших иммуномодуляторы, 'свободными от возбудителя было только 27Д±Г,3 % мышей, а ИВ и ИО были равны соответственно 0,32±0,04 и 0,24±0,03.

Внутриклеточное паразитирование бруцелл создает трудности для де'йствия антимикробных препаратов.при лечении инфекции,'

вызванной этим возбудителем. Возможность доставки лекарственных средств внутрь клеток макрофагальной системы больных является также одним из возможных вариантов совершенствования методов этиотропной терапии бруцеллезной инфекции. Решение этой проблемы может быть достигнуто при использовании искусственных замкнутых структур, ограниченных бислойной липидной мембраной - липосом. В макроорганизме липосомы захватываются клетками мононуклеарной фагоцитарной системы, а в органах, содержащих большое количество макрофагов, создается повышенная'концентрация нагруженного в липосомальные везикулы препарата, причем на более длительный промежуток времени, чем при использовании свободного лекарства [Ротов К А. с соавт., 1993].

Липосомы, введенные в организм, взаимодействуют с мембранами клеток и, связываясь с ними, передают клетке иммобилизованный в них лекарственный препарат. Кроме того, в организме компоненты бислойной мембраны липосом подвергаются биодеградации и включаются в метаболические процессы, вызывая определенные изменения биохимических показателей и функционального состояние организма, что, в свою очередь, оказывает влияние на течение заболевания. При бруцеллезной инфекции пероральное применение по 0,1 мл интактных липосом, что составляло 15 мкмоль липидов/мышь, однократно в начале 1 и 2 курсов лечения вызывало увеличение элиминации бруцелл из организма мышей и приводило к повышению эффективности антибактериальной терапии бруцеллезной инфекции.Использо-вание «пустых» липосомальных везикул в сочетании с субтерапевтической дозой азитромицина увеличивало количество освободившихся от бруцелл животных на 22,9±1,1 % по сравнению с результатами антибактериальной монотерапии соответствующими дозами.

Эффективность липосомальных антибиотиков и иммуномо-дуляторов в лечении генерализованной бруцеллезной инфекции оценивали в сравнении с действием их свободных форм. Внутриклеточная локализация бруцелл защищает их от обычных доз лекарств и иммунных сил организма. При лечении бруцеллеза традиционно используемые антибиотики - доксициклин, гентамицин,рифампицин эффективны в высоких дозах. Увеличение дозы высокоактивного антимикробного средства повышает и

токсическое действие препарата, поэтому длительное использование их может приводить к нежелательным побочным явлениям. Липосомальные формы лекарств преодолевают мембранно-клеточные барьеры, обеспечивая таким образом возможность снижения дозы вещества. В лечении длительно протекающих хронических инфекций зачастую оказывается более предпочтительно пероральное применение антибиотиков. Доксициклин в традиционной терапии бруцеллеза более активен при парентеральном его введении. Гентамицин используется только парентерально. Устойчивость липосом к действию желудочного сока и способность поглощаться стенками желудочно-кишечного тракта без нарушения структурной целостности делают возможным прием per os липосомальных форм лекарств, которые в свободной форме в желудке инактивируются [Ross D.J. et al., 1980].

Применение доксициклина и гентамицина, включенных в липосомы, способствовало повышению эффективности проводимой пероральной этиотропной терапии бруцеллеза беспородных белых мышей относительно лечения их свободными формами указанных препаратов. При приеме внутрь для достижения одинакового терапевтического эффекта потребовалась вдвое меньшая доза липосомального доксициклина, чем свободного. При применяемой суточной дозе свободного антибиотика 1,25 мг/мышь после окончания лечения у 38,1 ±0,7%, а липосомального -0,6 мг/мышь у 43,5± 1,0 % зверьков бруцеллы не были обнаружены. Использование липосомального доксициклина позволяет заменить внутримышечное введение антибиотика на пероральное. Так, при дозе антибиотика 1,25 мг/мышь в сут в случае внутримышечного применения интактной формы препарата свободными от возбудителя инфекции после окончания лечения оказались 94,4±1,9 % животных, а при пероральном введении липосомального доксициклина бруцеллы не были обнаружены у 82,1 ±1,3 % грызунов. Включение гентамицина в липосомы позволило также использовать его при этиотропной терапии бруцеллезной инфекции путем перорального введения больным животным. Лечение гентамицином по 1 мг/мышь в сут при приеме внутрь интактного антибиотика после завершения терапии приводило к освобождению от бруцелл 11,2±0,6, а липосомального-51,2± 1,2% мышей. Однако внутримышечное введение свободного гентамицина оставалось более эффективным и способствовало освобождению от инфекции - 80,3±1,5 % грызунов.

Пефлоксацин и рифампицин в лечении бруцеллезной инфекции обычно применяются в пероральной форме. Препараты активны в отношении бруцелл, но, однако, имеют ряд недостатков Длительное лечение указанными антибиотиками проводить нежелательно. При антибиотикотерапии бруцеллеза используются высокие дозы указанных средств, что увеличивает вероятность появления нежелательных реакций. В результате проведенного исследования установлено, что для достижения одинакового терапевтического эффекта при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции дозы интактных пефлоксацина и рифампицина при пероральном введении в организм биопробных животных вдвое превышали дозы их липосомальных форм. При антибактериальной терапии свободным пефлоксацином по 4,0,алипосомальным -по 2,0 мг/мышь в сут после завершения 2 курсов лечения от бруцелл освободились 10,3±1,8 и 12,2± 1,4 % грызунов. После окончания лечения беспородных белых мышей рифампицином в свободной форме по 1,0, а в липосомальной - по 0,5 мг/мышь возбудитель инфекции не был обнаружен у 82,1—2,3 и 84,7±2,1 % зверьков соответственно

При проведении этиотропной терапии экспериментальной бруцеллезной инфекции также выявлено преимущество изученных нами антимикробных препаратов - азитромицина и меропенема, включенных в липосомы, перед их свободными формами как при парентеральном (меропенем), так и при пероральном (азитромицин) путях введения в организм экспериментальных животных. Для достижения одинакового терапевтического эффекта при генерализованной бруцеллезной инфекции дозы интактных азитромицина и меропенема вдвое превышали дозы липосомальных форм соответствующих препаратов, что позволяет существенно удешевить стоимость лечения. Антибиотикотерапия свободном меропенемом по 2,0, а липосомальным - по 1,0 мг/мышь в сут приводила к полной элиминации бруцелл после завершения лечения у 39,4±0,4 и 44,2±0,5 % мышей. Использование интактного препарата по 4,0, а липосомального - по 2,0 мг/мышь способствовало очищению от возбудителя инфекции организма 64,1±0,9 и 83,4±1,1 % животных. При лечении азитромицином в свободной форме по 1,3, а в липосомальной - по 0,6 мг/мыщь в сут бруцеллы не были обнаружены у 87,3±1,9 и 88,1±1,7,% грызунов.

Иммунокоррекция при бруцеллезе является важной составляющей частью лечения этого заболевания. Инкапсу-

лирование иммуномодулятора в липосомы дает возможность проникновения его в иммунокомпетентные клетки путем фагоцитоза липидных везикул и для ряда иммунотропных средств облегчает взаимодействие со специфическими сайтами, расположенными внутри клеток. Заключенный в липосомы иммуно-модулятор оказывает свое биологическое действие более длительное время [Калюжин О.В., 1998]. Исследованиями показано, что при бруцеллезе липосомальные формы иммуномодуляторов (левамизола и ликопида) в сочетании с антибиотиками более активно влияли на скорость элиминации бруцелл из организма экспериментальных животных по сравнению с интактными препаратами. Иммуно-коррекция 2 курсами липосомальным ликопидом по 50 мкг/мышь в сочетании с субтерапевтическими дозами азитромицина или рифампицина приводила к увеличению количества освободившихся от бруцелл беспородных белых мышей на 29,0±1,0 % по сравнению с результатами лечения с помощью свободного иммуномодулятора. Использование левамизола в липосомальной форме по 25 мкг/мышь позволило увеличить количество грызунов с отрицательными результатами бактериологического исследования на 25,2±0,9 % по сравнению с итогом терапии, включающей применение интактного препарата.

Итак, использование антибиотиков и иммуномодуляторов, заключенных в липосомы, имеет явное преимущество перед их свободными формами при лечении бруцеллеза. Возможно применение нескольких вариантов сочетаний липосомальных форм антибиотика и иммуномодулятора - один из препаратов заключен в липосомальную везикулу, другой - в интактной форме; "оба лекарственных средства включены в липосому вместе или по отдельности. При проведении 2 трехсуточных курсов терапии азитромицином в субтерапевтической дозе (по 0,4 мг/мышь в сут) и ликопидом по 20 мкг/мышь в сут все комбинации с использованием липосомальных форм данных препаратов приводили к повышению эффективности этиотропной терапии бруцеллезной инфекции (табл 2). Лечение экспериментальных животных липосомальным азитромицином в сочетании со свободным ликопидом способствовало увеличению количества животных с отрицательными бактериологическими высевами до 69,6± 1,3 %, а свободным азитромицином в комплексе с липосомальным ликопидом до 41,1 ±1,4 % по сравнению с 21,2±1,4 % - при лечении зверьков

Таблица 2. Эффективность липосомальных форм азитромицина и ликопида при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции беспородных белых мышей

Препараты Сроки иссзедова- 1ШЯ Индекс высевземэ-сти Индекс обсемененн ости Кол-во животных с отрицательными бак высевами (%)

Контроль I 8,92x0,07 0,72+0,06 9 ,

П 0,«8±0,06 0,6510,04 "8 - ' * '

Свободный азнтромнция + свободный ликолид I 0,36±0,02 0,28±0,02

II 0,29±0,01 0,1910,01 21,2+1,4 .

Липосомальный азтромщип свободный лишпид I 0,26+0,01 0,18+0,02 1 32,Ш,3 4 : Г . .

II 0,15±0,01 0,12±0,01 69,6«,3 1'

Свободгьш азитромицин + липосомальный ликошщ I 0,30*0,01 0,221-0,01 0 - , г >* „

П 0,19^.0,01 0,16+0,01 41,Ш,4 ^

Липропа.то-'ый азитроуацив+ .ягишгмаячвыв лкшпвд " ч. > * ""I 0,1610,0] ' 0,11+0.01 '

II * * ом±ом .. ш+гдь; 1

Азшрочишш и ликошщ, включенные в обш>ю липосоуу 1 0,22±0,02 0,15±0,01 1 - ]

II 0,12±0,01 0,0510,01 •

Обозначения: I - через 14 сут после окончания 1 курса лечения; II - через 14 сут после окончания 2 курса лечения

этими же препаратами в свободной форме. Использование азитромицина и ликопида, заключенных в общую липосому, еще более повышало скорость элиминации бруцелл из организма экспериментальных животных. Исследование мышей после лечения такой лекарственной формой выявило значительное снижение интенсивности обсемененности их внутренних органов, а у 76,2±1,7 %

грызунов возбудитель выявить не удалось. Оптимальным для этиотропной терапии экспериментального бруцеллеза оказалось сочетание антибиотика и иммуномодулятора, инкапсулированных в индивидуальные липосомальные везикулы. После окончания лечения комбинацией липосомальный азитромицин и липо-сомальный ликопид бруцеллы не были обнаружены у 89,3±2,0% мышей. Применение такого сочетания позволило максимально повысить эффективность проводимого лечения данной инфекции по сравнению со всеми изученными нами схемами лечения бруцеллеза при сохранении доз используемых препаратов.

При проникновении бруцелл в организм первыми клеточными элементами внутренней среды, мобилизуемыми организмом для борьбы с ними, являются высокоспециализированные клетки периферической крови - нейтрофильные гранулоциты, основной задачей которых является фагоцитоз [Мечников И.И., 1903; Пигаревский В.Е., 1978]. Их функциональная активность обеспечивается сложной по структуре интралейкоцитарной микробицидной системой [Шубич М.Г., Нагоев Б.С, 1980; Пигаревский В.Е., 1977, 1978; Кокряков В.Н. с соавт., 1981; Маянский А.Н., 1993; Бахов Н.И. с соавт., 1988]. Мы изучили характер изменений некоторых показателей микробицидных систем и энергетических процессов клеток периферической крови в зависимости от применяемых препаратов — антибиотиков, иммуномодуляторов и липосом при лечении экспериментальных животных, инфицированных возбудителем бруцеллеза. Антибиотики и иммуномодуляторы применяли в дозах, не превышающих диапазон суточных дозировок, рекомендованных Фармакологическим комитетом для каждого препарата.

При генерализованной форме бруцеллезной инфекции происходило снижение уровня катионных белков (КБ) в нейтрофилах периферической крови мышей, на 31 сут эксперимента их количество составляло 0,85±0,02, в то время как у интактных зверьков -1,60±0,04. В, динамике исследования содержание КБ немного увеличивалось, оставаясь значительно ниже его уровня у здоровых животных (рис. 2). Первоначальное введение рифампицина, докси-циклина, пефлоксацина и ломефлоксацина усугубляло снижение количества КБ в периферической крови грызунов, но в процессе терапии происходило некоторое увеличение их уровня относительно содержания в соответствующий период у животных контрольной 26

группы. Лечение беспородных белых мышей азитромицином и меропенемом способствовало резкому увеличению искомого показателя уже после 1 цикла терапии, т.е. на 31 сут эксперимента (1,32±0,02 и 1,27±0,01). Начиная с 45 сут эксперимента, прослеживалась зависимость степени восстановления количества КБ от эффективности антибиотика в лечении данной инфекции. Чем ниже были бактериологические индексы и выше число освободившихся от бруцелл грызунов, тем полнее происходило восстановление показателя КБ в нейтрофилах периферической крови. Поданным бактериологического анализа, к 69 сут эксперимента в группе грызунов, леченных азитромицином, 94,3±1,7; меропенемом - 89,1±1,7;рифампицином - 81,6±1,9; ломефлоксацином -51,3±2,1; доксициклином - 38,6+1,4; а пефлоксацином - 10,3±1,8 % зверьков были свободны от бруцелл. Показатели КБ при этом у животных, получавших азитромицин, соответствовали 1,56±0,02; меропенем -1,54±0,01; рифампицин - 1,48±0,03, ломефлоксацин - 1,42±0,02; доксициклин - 138±0,02; пефлоксацин -1,30±0,03.

0,6 -,-1-.-1-1-1-1-.-1->-

21 26 31 36 41 45 50 55 60 65 69 Сроки нсследоважя, сут

Рис. 2 - Динамика содержания катионных белков в нейтрофилах крови беспородных белых мышей при антибактериальном лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции

1.7

0,7-

' ингаиные —в— меропенем

Развитие острого инфекционного процесса при бруцеллезе значительно влияло на активность миелопероксидазы(МПО) нейтрофилов периферической крови мышей. На 31 сут после инфицирования активность фермента у животных контрольной группы составляла 1,98±0,03, в то время, как у интактных зверьков - 1,30±0,02. При этом ИВ в контрольной группе на 31 сут соответствовал 0,92±0,07, ИО - 0,79±0,06. На протяжении эксперимента бактериологические индексы у мышей этой группы оставались высокими и имели тенденцию к незначительному снижению. Активность МПО также оставалась высокой, к 69 сут после введения инфекта ее уровень составлял 1,80±0,03. Лечение всеми изученными антибиотиками приводило к снижению активности МПО. После окончания 1 курса терапии максимальное снижение ее активности (до 1,51 ±0,02) происходило под влиянием азитромицина. При лечении другими антимикробными препаратами показатель МПО снижался менее интенсивно. К 69 сут эксперимента активность МПО в нейтрофилах крови грызунов, леченных меропенемом составляла 1,34±0,02; рифампицином -1,38±0,02;гломефлоксацином - 1,42±0Д5;доксициклином - 1,46±0,02, а пефлоксацином -1,56±0,03. Восстановление активности фермента до исходного уровня происходило лишь при применении азитроми-цина (р>0,05).

На протяжении эксперимента, когда бактериологически подтверждалась высокая активность бруцеллезной инфекции, уровень содержания гликогена Гл) в нейтрофилах периферической крови мышей составлял от 2,20±0,04 до 2,03±0,03, что существенно превышало значение этого показателя у интактных зверьков -1,43±0,03. Первоначальное введение доксициклина, пефлоксацина и ломефлоксацина приводило к дальнейшему накоплению Гл в ней-трофилах периферической крови мышей относительно его исходно увеличенного количества у больных животных. В процессе этиотропной терапии содержание Гл снижалось, но при использовании фторхинолонов и доксициклина оставалось на высоком уровне и после 2 курсов лечения. При применении азитромицина, меропенгма и рифампицина после полного завершения антибио-тикотерапии, к 69 сут исследования, происходило максимальное приближение данного показателя к исходному уровню (1,45±0,02; 1,51 ±0,03 и 1,54±0,02), а при использовании пефлоксацина количество Гл оставалось наиболее высоким (1,85±0,02). 28

При активном бруцеллезном процессе у мышей наблюдалось снижение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ), которая на

31 сут после инфицирования составляла 12,68±0,23, в то время как у здоровых зверьков уровень активности СДГ в лимфоцитах периферической крови соответствовал 16,52±0,32. По мере некоторого снижения бактериальной обсемененности органов экспериментальных животных происходило небольшое повышение активности исследуемого фермента. Первоначальное введение фторхинолонов и доксициклина приводило к дальнейшему подавлению исходно сниженной при бруцеллезной инфекции активности СДГ лимфоцитов периферической крови мышей. В процессе дальнейшей антибиотикотерапии происходило увеличение активности СДГ у всех грызунов. После завершения этиотропного лечения показатели активности СДГ у зверьков, получавших азитромицин, меропенем и рифампицин приближались к их исходному уровню (р>0,05). У животных, подвергшихся лечению доксициклином и ломефлоксацином, активность СДГ была ниже, а у мышей, леченных пефлоксацином, значительно отличалась от показателя СДГ у здоровых грызунов и составляла 14,80±0,25, в то время, как у нелеченых зверьков активность фермента в соответствующий период соответствовала 13,90±0,23.

Итак, функциональное состояние клеток крови беспородных белых мышей зависело не только от стадии развития бруцеллезной инфекции, но и от применяемого антибиотика и связанной с ним эффективности лечения. Величина цитоэнзимохимических показателей находилась в прямой зависимости от данных бактериологического исследования. Чем выше были индексы высеваемости и обсемененности у зараженных животных и меньше количество свободных от инфекции мышей, тем значительнее отличались исследуемые цитоэнзимохимические показатели от таковых у интактных зверьков. При лечении рифампицином, меропенемом и азитромицином происходило максимальное освобождение организма грызунов от бруцелл и наиболее быстрое и полное возвращение показателей активности микробицидных систем и энергетических процессов клеток периферической крови экспериментальных животных к исходному уровню. Таким образом, поскольку восстановление цитоэнзимохимических показателей свидетельствует об эффективности лечения, по изменению состояния интралейкоцитарных микробицидных систем клеток крови (КБ,

МПО, Гл, СДГ) можно судить о целесообразности применяемого антибиотика.

Известно, что применение иммунокорригирующих средств способствует активации противоинфекционного иммунитета. Иммуномодуляторы повышают функциональную активность фагоцитарных клеток, за счет чего достигается более эффективная элиминация возбудителя из организма. Нами изучено влияние иммунотропных препаратов - левамизола, глутоксима, ликопида и полиоксидония на состояние интралейкоцитарной микробицидной системы нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов. Введение всех изученных иммуномодуляторов, как в режиме монотерапии, так и в сочетании с антибиотиком, приводило к увеличению исходно сниженных при интенсивной бруцеллезной инфекции содержания КБ нейтрофилов и активности СДГ лимфоцитов периферической крови мышей, снижению исходно повышенных активности МПО и содержания Гл в нейтрофилах периферической крови животных. Использование полиоксидония в лечении бруцеллеза максимально способствовало возвращению всех указанных показателей к исходному уровню.

Применение при лечении экспериментального бруцеллеза антибиотиков и иммуномодуляторов, инкапсулированных в липосомы, повышало эффективность лечения инфекции по сравнению с использованием их свободных форм. "Пустые" липосомы, введенные per os, способствовали увеличению интенсивности элиминации бруцелл из организма животных. Кроме того, липосомальные везикулы оказывали влияние на характер изменений показателей микробицидных систем и энергетических процессов в клетках крови грызунов, зараженных возбудителем бруцеллеза. Так, введение "пустых" липосом приводило к увеличению исходно сниженных при активной генерализованной бруцеллезной инфекции уровня КБ в нейтрофилах и активности СДГ в лимфоцитах периферической крови беспородных белых мышей, снижению исходно увеличенной активности МПО и уровня Гл в нейтрофилах периферической крови животных. А при использовании в лечении бруцеллезной инфекции включенного в липосомы азитромицина в субтерапевтических дозах происходило восстановление количества КБ и Гл, уровня активности МПО нейтрофилов и активности СДГ лимфоцитов до их уровня у здоровых зверьков.

Специфические гуморальные факторы иммунитета (антитела) при бруцеллезе не играют решающей роли в защите организма [Белозеров Е.С. с соавт., 1978; Муковозова Л.А., 1987]. Титры специфических антител в крови больных зависят от их иммунологической реактивности, от стадии заболевания. Закономерности продукции антител в течение болезни обусловлены особенностями патогенеза в каждом конкретном случае и имеют прямую связь с динамикой патологического процесса и его длительностью. Начальные сроки обнаружения антител зависят от дозы заражения. С увеличением дозы заражения ускоряется выработка специфических иммуноглобулинов. Образование их совпадает, как правило, с началом генерализации инфекции. Величина титра специфических антител при бруцеллезе прямо пропорциональна продолжительности фазы размножения бруцелл в клетках организма [Ходжаев Ш.Х., 1959; Вершилова П.А. с соавт., 1974].

Проведение антибактериальной терапии при бруцеллезной инфекции оказывало влияние на величину титра специфических антител в сыворотке крови животных, а динамика его оставалась прежней. У всех мышей, подвергшихся лечению, как и у животных контрольной группы, происходило нарастание титра специфических иммуноглобулинов до 69 сут после инфицирования (срок исследования). Величина титра антител находилась в обратной зависимости от эффективности проведенной антибактериальной терапии. При лечении азитромицином данные бактериологического анализа зверьков во все сроки исследования свидетельствовали об интенсивной элиминации бруцелл из организма и максимальной эффективности проводимой терапии, а серологические показатели у них были наиболее низкие по сравнению с аналогичными показателями животных всех остальных групп. К 69 сут эксперимента средний геометрический титр антител у грызунов, леченных азитромицином, составил

+ 93

лишь в то время как у мышей контрольной группы -

— 8,5

415,8 (±|Ь1 %).

Все изученные иммуномодуляторы - левамизол, глутоксим, ликопид и полиоксидоний оказывали влияние на величину и

динамику титра специфических антител при бруцеллезной инфекции согласно степени их эффективности при лечении заболевания (рис. 3).

Сроки исследования, сут :

—— контроль (без лечелия)

X азитромнщм и левамюси - й- азпромивдн иликопвд

Рис. 3 - Динамика титра специфических антител при лечении экспериментального бруцеллеза беспородных белых мышей азитромицином и и \1 м у н о м о ду лятор а м и

Уменьшение нарастания титра антител при использовании иммунотропных средств в комплексном лечении бруцеллеза происходило соответственно степени снижения бактериальной обсемененности организма экспериментальных животных. Сокращение фазы генерализации инфекции приводило к торможению синтеза специфических бруцеллезных антител. После окончания лечения мышей азитромицином в сочетании с полиоксидонием средний геометрический титр антител в сыворотке

их крови соответствовал у грызунов контрольной

группы в соответствующий период (55 сут после инфицирования) этот показатель был равен 32

Введение липосомальных везикул (интактных и содержащих

антибиотик) косвенно влияло на величину титра антител, поскольку

увеличивало степень элиминации бруцелл из макроорганизма.

После окончания лечения азитромицином, инкапсулированным в

липосомы, средний геометрический титр специфичен k-my mmmvho-

+ 93

глобулинов в сыворотке крови мышей составлял 45,57 %)при

-8,5

соответствующем показателе у грызунов контрольной группы + 2L4

458,2 ( ——%) в аналогичный период исследования (59 сут после

—17,0

введения инфекта).

Величина титра специфических антител в сыворотке крови беспородных белых мышей с экспериментальной бруцеллезной инфекцией находилась в зависимости от степени эффективности проведенной терапии. Чем длительнее и интенсивнее была фаза генерализации инфекции, тем быстрее происходило нарастание титра бруцеллезных антител. При всех вариантах лечения, способствующих быстрой элиминации бруцелл из макроорганизма, независимо от используемых препаратов, нарастание титра специфических иммуноглобулинов было медленным, а величина титра не достигала больших значений.

Неспецифические гуморальные факторы иммунитета (лизоцим, комплемент) изменяются при развитии бруцеллезной инфекции, о чем свидетельствуют экспериментальные данные и клинические наблюдения [Морозова Э.Я. с соавт., 1976; Грекова Н.А., 1967; Ка-сымова Х.А. с соавт., 1971; Серикова Л.А., 1974].

Лизоцим является одним из ведущих факторов неспецифической, резистентности организма. Он представляет собой сильный лизирующий агент, влияющий на оболочку микроорганизмов. В патогенезе бруцеллеза он играет важную роль. Так, в клетках органов и крови белых крыс с видовой устойчивостью к возбудителю бруцеллеза содержится значительно больше лизоцима, чем в этих же органах чувствительных к бруцеллам животных (морских свинок-, белых мышей) [Вершилова П.А. с соавт., 1974]. У микроорганизмов рода Brucella выявлена способность к ингибированию гуморальных факторов неспецифической резистентности организма - лизоцима и комплемента [Яковлев А.Г. с соавт., 200 лСуществует определенная

33______

i nr\.r* u I

связь между антилизоцимной и антикомплементарной активностью бруцелл и характером течения экспериментальной бруцеллезной инфекции. Чем выше антилизоцимная активность микробов, тем длительнее они сохраняются в организме. При инфицировании экспериментальных животных культурой бруцелл с низкой антилизоцимной активностью наблюдается затухающая инфекция, при инфицировании зверьков культурой с высокой антилизоцимной активностью - затяжная [Шеенков Н.В. с соавт., 2002].

21 26 31 36 ' 41 45 50 55 60 65 69

Сроки исследования, сут —-— интакгные —X— без лечения —В— пефлоксащщ

—О — ломефлоксафн —О— меропенем —■£}— азигромицин

Рис. 4 - Динамика уровня лизоцима в легких беспородных белых мышей при антибактеральной терапии бруцеллеза

При интенсивной генерализованной инфекции, вызванной высокопатогенным штаммом возбудителя бруцеллеза - В. melitensis, в легких беспородных белых мышей на 21 сут после введения инфекта наблюдали увеличение количества лизоцима до 15,8±0,21 мг/мл (рис. 4) относительно его содержания у здоровых животных (14,5±0,23 мг/мл). До 31 сут эксперимента его уровень

еще более увеличился и достиг 31,0±0,32 мг/мл, а к 45 сут после инфицирования происходило резкое угнетение активности лизоцима (4,0±0,12 мг/мл). На 55 сут после инфицирования его количество вновь повысилось до 9,3±0,23 мг/мл, а на 69 сут (срок наблюдения) снова наблюдали некоторое снижение активности фермента.

При проведении антибактериальной терапии пефлоксацином, ломефлоксацином, меропенемом и азитромкцином во всех случаях, но в разной степени происходило изменение активности лизоцима в легких животных. В период генерализации бруцеллезной инфекции величина изменения содержания лизоцима легких беспородных белых мышей находилась в прямой зависимости от степени эффективности антибиотикотерапии и была минимальной при лечении экспериментальных животных азитромицином. При иммунокорригирующей терапии экспериментального бруцеллеза с помощью левамизола, глутоксима, ликопида и полиоксидония наблюдали тенденцию нормализации уровня активности лизоцима легких беспородных белых мышей соответственно показателям в соответствующий период у здоровых животных. Максимальное возвращение содержания лизоцима к уровню интактных зверьков отмечено при использовании полиоксидония. Введение липосомальных везикул - как "пустых", так и с инкапсулированным в них антибиотиком, вызывало изменение активности лизоцима в легких мышей с генерализованной бруцеллезной инфекцией и способствовало нормализации активности лизоцима в легких экспериментальных животных.

Результаты экспериментов показали, что в этиотропном лечении бруцеллеза по степени влияния на изученные факторы клеточного и гуморального иммунитета имеет преимущество азитромицин по сравнению с доксициклином, гентамицином, рифампицином, пефлоксацином, ломефлоксацином и меропенемом, причем, его липосомальная форма более предпочтительна, чем свободная; при проведении иммунокорригирующей терапии -полиоксидоний по сравнению с левамизолом, глутоксимом и ликопидом.

Предлагаемые пути повышения эффективности лечения бруцеллеза позволяют улучшить качество лечения, снизить терапевтические дозы антибиотиков и сократить сроки терапии, уменьшить неблагоприятное влияние высокоактивных препаратов.

Используемый метод лечения должен приводить к полной элиминации возбудителя из макроорганизма. Но интенсивность и степень освобождения организма от бруцелл зависят не только от выбранного препарата и способа лечения, но и от индивидуальных особенностей больного. При хроническом течении бруцеллеза сохранение возбудителя в организме возможно длительное время. И.С.Новицкий [1943] выделял культуры у умерших людей при давности заболевания 13 лет. Существующие клинико-лабораторные методы диагностики не могут в полной мере свидетельствовать о полной элиминации либо о сохранении бруцелл в организме индивидуума после проведенного лечения. Многие традиционные методы диагностики, например серологические, даю г лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Прижизненное подтверждение наличия возбудителя весьма затруднительно. Выявление же специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на его присутствие в пробе [Kingsbeny D.T., Faikow S., 1987]. Мы изучили возможность использования ПЦР-анализа для определения ДНК бруцелл в сыворотке крови экспериментальных животных после лечения и проведения, таким образом, контроля эффективности анти-биотикотерапии.

Экспериментально показано, что у животных, полностью освободившихся от инфекции в результате лечения, наличие специфической ДНК бруцелл в сыворотке крови с помощью ПЦР не определялось. Положительные же результаты ПЦР свидетельствовали о неполной элиминации возбудителя из макроорганизма (что в дальнейшем подтверждалось результатами бактериологического анализа) и, следовательно, о недостаточной эффективности проведенного лечения. Таким образом, результаты ПЦР-анализа, выполненного после окончания лечения, могут свидетельствовать об эффективности проведенной антибиотико-терапии. Использование ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения бруцеллеза у людей можно рекомендовать специальным клиническим лабораториям инфекционных стационаров как дополнительный метод к серологическим, аллергическим и бактериологическим исследованиям. -

Итак, в результате изучения возможных путей повышения эффективности этиотропной терапии бруцеллеза обосновано три основных направления. Прежде всего, это использование 36

высокоактивных антимикробных препаратов нового поколения, обладающих рядом преимуществ по сравнению с традиционно применяемыми химиотерапевтическими средствами, - ломе-флоксацина, азитромицина, меропенема. В значительной мере позволяет повысить результативность лечения включение в комплексные схемы терапии иммунотропных средств - ликопида, глутоксима и полиоксидония. Перспективным направлением в совершенствовании методов лечения бруцеллеза является применение антибиотиков и иммуномодуляторов, заключенных в липосомы, однако, использование липосом в клинике требует дальнейших разработок и утверждения липосомальных форм лекарственных средств Фармакологическим комитетом. В эксперименте максимально эффективной в этиотропной терапии бруцеллеза оказалась схема, включающая все 3 направления -лечение азитромицином и ликопидом, инкапсулированными в липосомы.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изученные при лечении экспериментального бруцеллеза антимикробные препараты - фторхинолон ломефлок-сацин, беталактамный карбапенемный антибиотик меропенем, макролид азалидного ряда азитромицин, как и традиционно используемые в лечении этого заболевания тетрациклина гидрохлорид, доксициклин, гентамицин и рифампицин обладают in vitro высокой активностью в отношении бруцелл независимо от их вида, биовара, места выделения. Ломефлоксацин активен при лечении экспериментального бруцеллеза в максимальной дозе (2 мг/мышь в сут), рекомендованной Фармакологическим комитетом. Азитромицин и меропенем эффективны в средне-терапевтических дозах.

2. Азитромицин в этиотропной терапии бруцеллеза является наиболее перспективным антимикробным средством, способствующим повышению бактерицидной активности защитных систем организма. Его высокая эффективность при лечении этого заболевания подтверждается освобождением от инфекции 94,3±1,7 % экспериментальных животных и полным возвращением к исходному уровню значительно измененных при бруцеллезной инфекции маркеров цитоэнзимохимической активности клеток периферической крови и активности лизоцима легких беспородных белых

мышей при применении антибиотика в курсовой дозе 7,8 мг/мышь перорально 2 курсами по 3-5 дней.

3. Левамизол, глутоксим, ликопид и полиоксидоний в значительной степени улучшают результаты этиотропного лечения бруцеллеза азитромицином. Их применение в количестве 50, 400, 100 и 120 мкг/мышь соответственно при антибактериальной терапии в субтерапевтических дозах способствует увеличению интенсивности освобождения макроорганизма от возбудителя на 42,2±1,1 %; 45,1±1,5 %; 53,4±1,7 % и 63,6±1,6 % по сравнению с результатами лечения, проводимого соответствующей дозой антибиотика без иммуномодуляторов, а также полной или частичной, пропорционально их эффективности, нормализации цитоэнзимохимических маркеров и активности лизоцима легких, измененных при бруцеллезной инфекции.

4. Полиоксидоний является наиболее активным иммуно-тропным средством, повышающим эффективность лечения бруцеллезной инфекции, по сравнению с левамизолом, ликопидом, глутоксимом. Его использование в сочетании с субтерапевтической дозой азитромицина увеличивает элиминацию бруцелл в 3 раза по сравнению с результатами лечения в аналогичной схеме без иммуномодулятора и приводит к полному возвращению изученных показателей интралейкоцитарных микробицидных систем, энергетических процессов клеток периферической крови и уровня лизоцима легких к их значениям у здоровых экспериментальных животных.

5. Пероральное применение интактных липосомальных везикул повышает эффективность лечения бруцеллеза азитро-мицином, о чем свидетельствуют увеличение элиминации бруцелл из организма беспородных белых мышей на 22,9±1,1 % при антибактериальной терапии в субтерапевтических дозах, возвращение к исходному уровню показателей кислородзависимых и кислороднезависимых интралейкоцитарных микробицидных систем и энергетических процессов клеток периферической крови, уменьшение величины отклонения активности лизоцима легких, вызванного инфекцией.

6. Включение доксициклина и гентамицина в липосомы делает возможной замену их инъекционных форм пероральными. Липосомальные формы пефлоксацина, рифампицина, азитроми-цина и меропенема позволяют уменьшить дозы антибиотиков в два раза без потери их терапевтической активности.

7. При лечении бруцеллеза липосомальные формы левамизола и ликопида в сочетании с азитромицином или рифампицином более активны, чем их свободные формы..Их применение увеличивает скорость элиминации бруцелл из организма экспериментальных животных на 25,2±0,9 % и 29,0±1,0 % соответственно по сравнению с использованием в аналогичных схемах лечения интактных иммуномодуляторов.

8. Повышение эффективности этиотропной терапии бруцеллеза достигается путем использования различных вариантов сочетаний липосомальных форм антибиотика и иммуномодулятора

- один из препаратов заключен в липосомальную везикулу, другой

- в интактной форме; оба лекарственных средства инкапсулированы в липосому вместе или по отдельности. Оптимальным вариантом лечения бруцеллезной инфекции является сочетание антибиотика и иммуномодулятора, заключенных в индивидуальные липосомальные везикулы. Применение липосомальных форм азитромицина и ликопида в субтерапевтических дозах увеличивает количество животных, освободившихся от бруцелл, в 4 раза по сравнению с результатами лечения интактными антибиотиком и иммуномодулятором в.тех же дозах.

9. Цитоэнзимохимические маркеры в нейтрофилах и лимфоцитах периферической крови (КБ, МПО, Гл, СДГ) меняют свои показатели при бруцеллезной инфекции, а их нормализация свидетельствует об эффективности лечения этой инфекции.

10. Увеличение титра специфических антител при бруцеллезе происходит в обратной зависимости от эффективности этиотропной терапии данного заболевания. При всех вариантах эффективного лечения с использование антибактериальных, иммуномоду-лирующих средств в интактной или липосомальной формах при быстрой элиминации бруцелл из макроорганизма наблюдается медленное нарастание титра специфических антител, а величина его не достигает больших значений.

11. Полимеразная цепная реакция может быть рекомендована как метод контроля эффективности проведенной антибиотико-терапии бруцеллеза. Отрицательные результаты ПЦР-анализа свидетельствуют об окончательном освобождении организма от бруцелл, положительные - о неполной элиминации возбудителя из макроорганизма и, следовательно, о недостаточной эффективности проведенного лечения этого заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ефременко В.И., Таран. Т.В., Кузякова Л.М., Малецкая О.В. Направленный транспорт лекарств с помощью липосом // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т.- Ставрополь, 1998.- 80с-Деп. в ВИНИТИ П. 12.98. №3637-В98.

2. Логвиненко О.В., Малецкая О.В., Лямкнн Г.И., Таран И.Ф. Сравнительное изучение содержания катионных белков в нейтрофилах периферической крови у экспериментальных биологических моделей с различной чувствительностью к возбудителю бруцеллеза // Материал, юбил. науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МОРФ. - Киров, 1998.-С.141.

3. Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Малецкая О.В., Ариуисанаа Бямбаа, Курилова А.А., Оверченко В.В. Липосомы в иммунологических исследованиях // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т.-Ставрополь, 1998.- 40с- Деп. в ВИНИТИ 16.12.98. №3719-В98.

4. Малецкая О.В., Лямкин Г.И., Дальвадянц В.Г., Ляпустина Л.В., Панченко В.П., Соколова И.А. Иммунологическая реактивность при бруцеллезе (обзор литературы) // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т.-Ставрополь, 1999.- 23с- Библиогр 80 назв.- Деп. в ВИНИТИ 15.11.99. №3358-B99.

5. Малецкая О.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Соколова ИА, Ляпустина Л.В., Дальвадянц В.Г., Панченко В.П. Перспективы использование неспецифических иммунокорригирующих средств в лечении бруцеллезной инфекции (обзор литературы) // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т.- Ставрополь, 1999.- 24с-Библиогр.101 назв.-Деп. в ВИНИТИ 15.11.99. №3359-В99.

6. Малецкая О.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Ляпустина Л.В., Дальвадчнц В.Г., Соколова И.А. Изучение чувствительности бруцелл к некоторым антибактериальным препаратам in vitro'// Проблемы особо опасных инфекций: Сб. науч. тр.- Саратов, 2000.- Вып.80.- С. 178-181.

7. Малецкая О.В., Лямкин Г.И., Логвиненко О.В., Ляпустина Л.В., Соколова И.АлЭффективность некоторых антибактериальных препаратов в лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции // Проблемы биологической и экологической безопасности: Междунар. конф. (22-25 мая).- Оболенск, 2000.- С.66-67.

8. Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Малецкая О.В., Таран В И., Тихенко Н.И., Коготкова О.И., Мисетова Е.Н., Оверченко В.В., Савельева И.В., Бондаренко А.И., Зайцев АА, Ефременко Д.В , Борздов А.А. Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом. Методические рекомендации.-Ставрополь, 2000.- 46с

9. Малецкая О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Лямкнн Г.И., Мисетова Е.Н., Оверченко В.В., Ляпустина Л.В., Соколова И.А Использование липосомальных форм антибактериальных и иммуномодулирующих препарагов в лечении инфекционных заболеваний

(обзор литературы) //Ставропольский н.-и. противочумн. ин-т.- Ставрополь,

2000.- 19с- Библиогр. 73 назв.- Рус- Деп в ВИHИTИ 28.12.00 №3307-В00.

10. Eфременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Малецкая O^., Мисетова E.H,, O.верченко В.В., Савельева И.В. Биотехнология выделения из растительного и животного сырья фосфолипидов, используемых для полученияллипосом // Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы: Сб. материал, науч.-практич. конф., Киров, 22-23 мая 2001 г.-Киров, 2001.-С. 26-27.

11. Логвиненко O^., Малецкая O.В., Лямкин Г.И. Ляпустина Л.В., Соколова И.А. Характеристика изменений некоторых цитохимических показателей крови при антибактериальной терапии экспериментальной бруцеллезной инфекции // Природнр-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика (Сб. науч тр ) -Астрахань, 2001.- С.200-201.

12. Малецкая O.В., Лямкин Г.И., Логвиненко O-В., Ляпустина Л.В., Таран Т.В., Соколова И.А. Дальвадянц В.Г. Течение инфекционного процесса при лечении экспериментального бруцеллеза в зависимости от времени и кратности введения ликопида // Там же.- С.204-206.

13. Малецкая OÄ, ТаранТ.В., Eфременко В.И , Лямкин Г.И., Умнов А.В., Логвиненко O-В., Ляпустина Л.В., Мисетова E.H., Бондаренко E.H. Эффективность липосомального меропенема при экспериментальной бруцеллезной инфекции // Там же.- С.207-208.

14. Таран Т.В., Щ)ременко В.И., Малецкая OÄ, Мисетова E.H. Изучение активности липосомальных антибиотиков in vitro в отношении различных штаммов бруцелл // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Материалы междунар. науч.-практич. конф. "Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы", посвящ. 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции, (г. Талдыкорган, 1-2 авг. 2001 г.).- Ал маты, 2001.-Вып.3.-С. 248-251.

15. Eфременко В.И., Таран Т.В., Бондаренко А.И., Малецкая O-В., Мисетова E.H., Зайцев АЛ, Структура и размеры фосфолипидных везикул, полученных разными методами // Там же.- С. 303-304.

16. Малецкая O-В., Лямкнн Г.И., Ляпустина Л.В., Логвиненко OÄ, Таран Т.В., Соколова И.А., Дальвадянц В.Г. Действие нового иммунокорригирующего препарата - ликопида при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции //Там же.- Вып. 4.- С.213-215.

17. Таран Т.В., Eфременко В.И., Малецкая O-В., Кузякова Л.ГЛ., Мисетова E.H. Уровень включения антибиотиков в зависимости от способа получения липосом // Там рке.- С. 273-276.

18. Maletskaya O.V.. Laymkin G.I., Taran I.К, Laypustina L.V., Dalvadyants V G., Sokolo\a I.A. A study ofthe activity of some new antibiotics to brucella in vitro // "Байгалийн голомтот халдварт овчин" (Эрдэм шинжилгээний бага хурлын илтгэлийн хураангуй) 2001 оны 12-р сарын 6. "Natural infectious diseases" (Abstracts of scientific conference) 6 December

2001.- Ulaanbaatar, 2001.- P. 47-50.

19. Мисетова Е.Н., Ефременко В.И., Таран Т.В., Логвиненко О,В., Малецкая О.В., Борздова И.Ю. Влияние липосом на функциональную активность полиморфноядерных лейкоцитов // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов паразитологов (2628 марта 2002 г., Москва), Москва, РОСИНЭКС, 2002.-Т.2.- С.205-206.

20. Таран Т.В., Малецкая О.В., Мисетова Е.Н., Ефременко В.И., Логвиненко О.В., Борздова И.Ю. Изучение эффективности липосомальной формы азитромицнна при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции // Там же. -Т.4 - С. 11 9-120.

21. Малецкая О.В., Логвиненко О.В., Лямкин Г.И„ Ляпустина Л.В., Соколова И.А Изменения функциональной и ферментативной активности нейтрофилов поддействием антибиотиков при лечении бруцеллеза//Сборник научных трудов.- Махачкала, 2002.- С. 129-131.

22. Малецкая О В. Имм>номодулятор нового поколения - глутоксим в лечении экспериментального бруцеллеза // Там же.- С. 132-135.

23. Малецкая О.В. Эффективность новых и традиционно используемых антибиотиков в лечении экспериментального бруцеллеза // Там же.- С. 135138.

24. Малецкая О.В. Влияние липидных везикул на элиминацию бруцелл из макроорганизма // Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности: Материалы юбилейной науч.-практич. конф. "Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы", посвящ. 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (15-16 октября 2002 г.) - Ставрополь, 2002 г. - С. 158-160.

25. Малецкая О.В. Полиоксидоний в лечении экспериментального бруцеллеза // Там же. - С. 160-163.

26. Малецкая О.В., Логвиненко О.В., Лямкин Г.И., Ляпустина Л.В., Соколова И.А. Контроль эффективности антибиотикотерапии цитохимическими методами при бруцеллезе // Там же. - С. 163-166.

27. Малецкая О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Лямкин Г.И., Умнов А.В., Ляпустина Л.В., Соколова И.А. Липосомальные формы пефлоксацина и рифампицина в лечении экспериментального бруцеллеза // Там же, - С. 166168.

28. Таран Т.В., Ефременко В.И., Малецкая О.В., Коготкова О.И., Тихенко Н.И., Мисетова Е.Н. Разработка схем лечения экспериментальных инфекций (бруцеллез, туляремия, сибирская язва) липосомальными антибиотиками // Проблемы особо опасных инфекшш: Сб. науч. тр.-Саратов, 2002.-Вып. 1(83).-С 134-141.

29. Лямкин Г.И., Ляпустина Л.В., Малецкая О.В , Соколова И.А., Таран И.Ф., Ткаченко Л.И., Тамбовцев А.В Состояние и перспективы лабораторной диагностики бруцеллеза // Клиническая лабораторная диагностика.- 2002.- № 12.- С.46-49.

30. Малецкая О.В. Экспериментальное изучение влияния некоторых комбинаций антибиотиков и иммуномодуляторов на эффективность лечения хронического бруцеллеза // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы, 2002.- Вып 5.- С. 63-67.

31. Малецкая О.В. Эффективность некоторых новых антибиотиков при лечении экспериментального бруцеллеза // Антибиотики и химиотерапия.-2ОО2.-Т.47,№11.-С.13-17.

32. Малецкая О.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Дальвадянц В.Г., Ляпустина Л.В., Соколова И.А. Изучение активности некоторых новых антибиотиков по отношению к бруцеллам // "Байгалийн голомтот халдварт овчин". Эрдэм шинжилгээний бага хурлын илтгэлийн хураангуй. "Natural infectious diseases". Scientific conference.- Уланбаатар, 2002.- P. 67-69.

33. Способ контроля эффективности антибиотика при лечении бруцеллеза: Патент РФ № 2206898, МКИ7 G 01N 33/68 / О.В.Малецкая, О.В.Логвиненко, Г.ИЛямкин, Л. В Ляпустина, И. А.Соколова// Изобретения. Полезные модели. Офиц. бюл. Рос. агент, по патентам и товарным знакам.- М., 2003.- № 17.-С. 791. Опубл. 20.06.2003.

34. Малецкая О.В. Влияние иммуномодулирующих препаратов на эффективность этиотропной терапии при экспериментальном хроническом бруцеллезе // Иммунология.- 2003.- Т.24, № 3.- С. 182-184.

35. Малецкая О.В. Изучение влияния липосомальных везикул на интенсивность освобождения организма белых мышей от бруцелл // Проблемы особо опасных инфекций: Сб. науч. тр.- Саратов, 2003.- Вып. 1(85). - С. 136141.

36. Малецкая О.В. Детекция ДНК бруцелл полимеразной цепной реакцией в крови экспериментальных животных с целью контроля эффективности проведенной антибиотикотерапии //Там же. - С. 176-179.

37. Малецкая О.В. Влияние антибактериальной терапии бруцеллеза на динамику и величину титра специфических антител // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы, 2003.- Вып.7.- С. 78-81.

38. Малецкая О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Логвиненко О.В., Лямкин Г.И., Руднев СМ., Ляпустина Л.В., Пашнева Е.И. Влияние липосом на состояние интралейкоцитарных бактерицидных систем клеток крови при бруцеллезе // Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ.- Киров, 2003.- С. 93-95.

39. Малецкая О.В. Влияние антибактериальной терапии бруцеллеза на активность лизоцима легких биологических моделей // Там же.- С. 90-91.

40. Малецкая О.В. Липосомальные формы азитромицина и ликопида в лечении экспериментального бруцеллеза // Там же.- С. 91-93.

41. Малецкая О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Лямкин Г.И., Мисетова Е.Н., Умнов А.В., Бондаренко А.И., Ляпустина Л.В., Соколова И.А. Новые подходы к лечению бруцеллеза //Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2003.- №6.- С.34-36.