Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АДФ-рибозилтрансфераза С3 Clostridium botilinum С (получение, очистка и метода определения)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "АДФ-рибозилтрансфераза С3 Clostridium botilinum С (получение, очистка и метода определения)"

российская академия щщщшских наук

угчно- ,;сагщцовАтьскш институт эпидемиологии и микробиологии

жени ПОЧЕТНОГО АКАДЕЖКА Н.Ф.ГАММЕИ

На правах рукописи Ефименко Александр Николаевич

адф-рнбоз1ш:рансфераза сз сьобтншш вотташм с

' (ПОЛУЧЕНИЕ, ОЧИСТКА И МЕТОДЫ' ОПРЕДЕЛЕНИЯ) 03-00.07. - микробиология

автореферат

диссэртации на соискание ученой стэпеш. кандидата медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Научно-ассдрцовательском институте эпидемиологии и микробиологии ем.Н.Ф.Гамалеи Российской АМ

Научный руководитель - дс.лор медицински наук

Официальные оппоненты -

доктор медицинских наук, профессор Т.И.Сергеева дс-.тор медицинских наук Г.И.Кремлев

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.М.И.Мечникова Российской АМН.

на заседаний Специализированного Совета К 001.07.01 1 Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микроб® гш нм.Н.Ф.Гамалеи Российской АМН,' (123038, г.Москва, ул.Гамалеи,18).

С диссертацией ызкно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ нм.Н.Ф.Гамалеи Российской АМН.

Ю.В.Вертиев

Защята состоится

Учений секретарь . Специализированного Совета, доктор медицинских наук

Е.И.Коптс-Л!

. .едония о существовании, целого ряда бактериальных токсинов, рсаллзукхцих свой токсический эффект путем рибозилирования внутриклеточных нишенэй [ Poster, 19Q5 L Врт\цу того, что, waic правило, определенный тип токсина встречается у патогенных ште-^юв различных видов бактерий , а не только у штаммов одного кошфзтного вида, 1,'.о:',тю оквдать, что СЗ может синтезироваться не только штаммами Clostridium botulinum с, но и штг мами других клистридай.

В свпгш с Еышесказанным ш поставил! перед собой следующую цель - оценк-Ь распространение АДФ-рибозил трансферазн СЗ Clostridium botulinum. С среди патогенных птаммов клостридий.

Для.этого т считали необходимым решив следующие задачи:

1. Отработать оптимальные условия культивирования штамма-продуцента с цель*, получени максимального выхода Г1 для дальнейшей очистки.

2. Разработать схему получения гомогенных препаратов СЗ и изучи основные физико-химические и пмммунохимические свойства очкг чшого фермента.

> 3. Получить моноспэцифические антисыворотки к СЗ и отработать иммунологические тест-системы, пригодные для идентификации штаммов, продуцирующих СЗ.

4. Провести анализ имеющихся в лаборатории штаммов клостридий с помощью различных методов на опосс- лость продуцировать СЗ.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований установлено, что нейро-токешш Clostridium botulinum типов А, В и С не обладают АДФ-рибозил трансферазной активностью; АДФ-рибозил трансфераза СЗ не имее. антит-бююго родства с неРротоксинами типов А, в, Е и F, но, по-видимому, млеет общие антигенные эпитопы с нейротоксином типа с; выявлена АДФ-рибозил трансфераза у таких видов как Clostridium botulinum та ов В, Е, V и О, а также Clostridium sporogenep и Clcacridiuin putriiioum.

Практическая значимость.

Отоорен штат С20 Clostridium botulinum С -продуцент АДФ-рибо-сил трансферазн СЗ; разработан маа.д очистки АЦФ-рибозил трансферты СЗ, обеспечшзяюций выдэлеше препарата СЗ в гомогзкном вид:; получены коноеп рфшоскиа актисыроротки г СЗ, пригодно для

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ ii ; 1.

Актуальность проблемы. Последнее десятилетке ознаменовалось открь нем целого ряда ковах факторов'патогенности у бактерий, вызывающих различные инфекционные заболег-чия. Стали известны такие факторы как адгезшш, сидерофорры, R-белют, регулирующие экспрессию факторов пат ценности, новые типы бактериальных токсинов. Все это помогает, лучше понять и оценить сложность такой функции бактерий как j—. пэтогенность. Вместе с тем, мяо: .ю вопросы по-прежнему остаются иерешент-ыми. Это касается и такого заболевания как ботулизм. Как яравило, ботулизм развивается у индивидуумов, принимавших в п. ду тонсервированкыо продукты питания. В резу.^тате нарушения техяо„г тин триготовления продуктов в домашних или производственных условиях в шх развиваются бактерии Clostridium botulinum, продуцирующие один 13 7 типов наиболее токсичны., веществ в природе - нейротоксинов. )бычно люди поражаются нейротоксинами типов А, в, в и р, в то $рзмя как животные и птицы - типами сив. Недостаточно четко 'становлена возможность возникновения ботулизма у людей под (г^.ствием нейротокскна типа G.

Однако ботулеям шкет развиваться не только как ш чжсикация, о и как токсикоинфекция. В последнее десятилетие было установлено, то около 50? случаев синдрома внезапной смерти детей составляет етский ботулизм, который развивается к аз: классическая токсиконнфэк-ия [Агпоп.1979]. В последние годы появились сообщения о ботулиз-э у ослабленных операционным вмешательством пациентов, кб!горнй вляется следствием размножения бактерий ботулизма в макросргашзме Ghia,1986]. Зтк фактнв наряду с ранее описанншк случаями раневого этулкзма, свидетельствуют о тон, что имеются патогенные штаммы иостркдай, которые помимо нейротоксинов имеют и другие 'факторы атогенности, способствующие в определенных условиях возникновению и эотеканию инфекционного процесса в классическом его понимании.

В, качестве одного 'из таких факторов патогешости можно осматривать АДФ-рибозил трзнсферэзу <33 Clostridium botulinum С -фмент, рибозилирующий внутриклеточный белок с м.м.21 Кд [Aktorie«, >87]. Основанием для этого является разумная вероятность 'ществсвания нового токсического белка, в который СЗ входит б :чсство составного компонента, т.к. в настоящее время имеются

ионообм шой хроматографии на колонке с шшг-sephadex А-50, урашга-вешанным 50 мМ Трис-HCl рН 7.5 буфером. Хроматография ма-терналэ представлена на рис.3.

Во время проведения хроматографии материал, но сорбируясь на ашонообменике, элкировался с колонки двумя пиками. Ступенчатуй^ градиент NaCl снимал еще А пика, сорбированного на BME-Sephadcx материала. ДДЗ-рибозил трансферазная активность была зарегне; piipo-вана во всех пиках хроматографии, 'зновпая доля фёрментптиБяоЯ' активности определялась во фракциях первого белкового гпжа - птк-мерно 73% (табл.2).Во втором белковом пшга элвировадось примерно 2С>", АДФ-рибозил трансферазной активности, з остальных пиках хрематм рафии ферментативная активность была незначительной. Присутствие (¡ор--ментативной активности во всех пиках" хроматохрафиа позволяет сдслг.ть предполокение, что СЗ вступает в комплекс;! с другиш бе.пкат и а та комплексы сорбируются на данном типе ионообмэника.

"—а Ш в

Рис. 3. Распределение АДФ-рябозилтрансферазчой активности по фракциям .■фомвт&графи'! культураjri'Hoi'о фильтрата Clostrldium ЪогиШмм С fía MíAE-ir'ephartez А -50.

А - хромз-гсл-рзфич кудьтура-лького фклЫ^ата ciostridium

i.'c!и 1 зtr.i-D С ка DEAE-Sephadcs A-SO. Й - Т«б03ИЛ лктивкость

Таким образом, основное количество АДФ-рибозил трансферазы СЗ не сорбируется на данном типе анионообмевика и элкнфуется в первом белковом пике.

Анализируя фракции первого белкового пика методе sds-электро-Jopssa, мы обнаружили, что в них в основном присутствуют два компонента: белок мод.массой 25 кД (соответствует молекулярной массе СЗ) п 32 кД компонент. Кроме того препар ты после частичной очистки на DEiE-Sephadex А-50 давали ^ткую линию преципитащш с антисывор^ гкей к гемагглгтшину.

Поэтому, г. ред наш встала задача - освободиться от контаминации гемагглютинина в наших препаратах. Для этой цели был использован шмуносороент на основе антител к гемагг'штинину, иммобилизованных lia CNBr-Sepharose 4В.

АДФ-рибозил трансфэраза СЗ не сорбируется на шмунносорбенте и элшруется с коленки одш • белковым пике. Компонент гемаглютинина сорбируется на носителе к элшруется 0.2М глицином рН 2.8. Выход АДФ-рибозил трансфзразы СЗ составляет 65 %.

Г. лученный после аффинной хроматографии препарат содержал не-зна,"ттельные примеси, поэтому для окончательной очистки препарата била использована гель-фильтрация через Sephadex G-ЮО. АДФ-рибозил трансфераза СЗ элшруется одним пиком ; выход СЗ составил 61,5 %.

Сведения, которые представлены в таблице 2, характеризуют отдельные этапы очистки и показывают, что, следуя предложенной схеме, удается получать АДФ-рибозил фансС зразу СЗ с выходом 61,5Ж при крат-ости очистки в 23 раза. Удельная активность *?фи этом возрастает с 0,89 х 10Г1 до 1,6 X Ю12 ерт/мг белка.

Для подтвзрадения высокой степени очистки АДФ-рибозил трансфераза СЗ мы использовали электрофорез в ПААГ в присутствии дод_4ил~ сульфата натрия и реакцию иммунодиффузии в гело. При проведении электрофореза в ПААГ обнаруживался один белковый компонент, в то время как в неочищенном материале содержалось более 30 белков. Неочищенные Зрззш СЗ образовывали 4-5 линий преципитации в геле с полийялентнсй гомологичной сывороткой, в то время как очищенные препараты давали только одну линию. При иммунизации животных выделен-ныл белком была получена сыворотка, которая образовывала одну линию преципитации как с очищенными, гак л с неочищенными препаратами.

Таким образом, ка данном зтапе исследований нами была разр;. Jo-танй »¿фиктивна. и достаточно простая технология полу;., лая препара-

:аб.2 Характеристика фракций, полученных на различных стадиях зыделеюш АДФ-рибозпл трансферазн СЗ шташа С-20

Зтал очистки Объем Белок Общая Удельная Выход Степень

активность активность % очистки ерш ерт/мг белка

Сонцентрированный сультуральный [ильтрат 15 75,0 5,2хЮ12 О.бЭхЮ11 100 I

{онообменная хроматография аа )еае-берьайех а-50 40 4,0 3,8хЮ12 0,95х1012 73 13

1ммуноаффинная хроматография 10 2,4 3,4х1012 1,40хЮ12 6Е 20

"ель-фильтрация героз о-юо 8 2,1, 3,2хЮ12 1,60хЮ12 61,5 23

гов АДФ-рибозил трансфзразы СЗ, гомогенных по ^ашшм электрсфэр -лгч8скоро и ишунохнгямоскэго анализов. Это позволило перейти к характеристике основных физико-химических свойств /Щ^-рибознл 'раисфвразк СЗ.

Основные свойства полученных препаратов пре -ставлены в таблице 3. По данным химического анализа в них содержится оелок и фактически отсутствуют углевода и нуклеиновые кислоты. Содержание-¡зота составпяет 15,6". О высокой чистоте препаратов свидетельствует :пектр поглощения в ультрафиолете, характерный дчя белков с минимумом юглощенил при 260 нм и максимумом -- при 280 им. Отношение ^280^260 ¡оставляет 1,8 , что тайке ук; ллзаит на отсутствие в .репарзтах фкмесей нуклеиновых кислот и их продуктов.

Для изучения т ркочуствительности препарата СЗ прогревали р

Таб.З Основные свойства гомогенных препаратов АДН?ибозил " трансфераэы СЗ.

Сеойстео Ееличлна

Азот

Нуклеиновые кислота Углевода

АДФ- рибозил трансферазная активность

11Ад-глкксгидролэзняя. I

активность

Спектр поглощения в УФ мяксимум

шнкмум

Отношение Е263

Термчуьствитежносгь

Молекулярная гласоа

Степень антигенного родства

15,6% О

о

1,4-1,97Л012орш/мг О,5-0.7x10Э орш/мг

280 260

1.8

термоотабилен 95°С,1Б {.тем. 25 ООО -Дальтон

I',

Ишуяологиче скк невдентиче дифтерчйному токсину, тер!,к лабильному токсину глшечнс палочки, 60ТУЛИПГЧ8СКИМ нейротоксиньм уипол Л,В,Е

и р.

С

0,05 М Трис-HGl буф&ре plí 7,5 в течение 15 минут и проверяли на на-лячкв' АД^ряоозилтрансфразноЯ активности, а такжз проводили пмму-нохшический 'чадаз дзшшх образцов в реакции геяь-даффузии с гомологичной aHTKCHBOpoTitoíL Результаты сшгаов показали, что при указанной тепловой обработав полностью сохраняются как ферментативные,, так и антигенные свойства АДФ-рибозил трансферази СЗ, что свидетельствует о термостабилыгастн фермента.

Анализ препаратов СЗ методами гель-фшьтрацим я электрофореза в ПМГ с ДЦС-Na показал, что в них содзрглтся один' белювнй компонент с молекулярной массой 25 кД.

Бкозапагсзские эксперименты на разетшнк тканях. ажвотких показали, что препараты СЗ обладают АДФ-рибозялтрансферазноЭ активностью. Удельная ДЩ-рибозилтрансферазная активность составляет 1,4-1,9 cpm/мг белка.

По данньм литературы известно, что всь АДФ-рпбозп*. трансферази „ бактериального происхождения обладают и ГВД-гликс-гздролчзнсй. активностью. В связи с этим наш был проведен рад экспериментов о целью определения наличия 1Щ-гликоп1дролчзвоЯ активности у гомо: зишх препаратов СЗ. Бремя' инкубации со<„ :евляло от I до 6 чесоз". В качестве контроля использовали реакционную смесь с добаълением вместо СЗ С,2 М раствора Nací. Получьянне дашшо.свидетельствуют о наличии у препаратов 03 БДЦ-гл:-2согидролазной активности. Удельная НАД-глико-гкдролазная активность составляет 0,5-0,7хШ9 cgm/мг белка.

Иимунохимический анализ вуделешгах препаратов СЗ показал, что omi не обнаруживают антигенного родства с таки.«л токсина?,íii, как дифтерийный, терыолабпльннй кишечной палочки и ботулпяическимн -иейротоясинамя патов Ai В, En í1. ■ . . " . • Taran,! обрэзсм, изучение очикеяшх препаратов С-3 показало, что они являются гомогвпннми по данным химического, фазшсо-хлмического, биохшлтеоскбго к галмунохимлческого анализа.

2.2.Тестирование- очищенных препаратов нзйрстоксикоз ' oics^idivra botulír.mi на АЦФ-рибозил трансфертную активность

В конца' 1387 года появило.Ь ряд сообщений о. том,что'пейротокси-ы Clostridium botiilinura С 7, Д обладают АДФ-ри^озял тиапс^еразкой -активностью [ Ohaslri ?t al.]. - .:

Перед наш встала задача подтвердить или отвергнуть данное сообщен- э.-Для этого мы провели ряд. исследований, j среду АЦФ- рибозили-рования BI си ли жультуральшэ фильтраты Clostridium botulinum С штамм С-20 и нейротокслн CI, полученный в лаборатории ботулизма из того же птамма. Культуральные фильтраты гаэют АДФ- рибозил трачсфе-разу, которая tлбозклнрует белей молекулярной массой 21-24 кД, тогда как очищенные препарата нейротокс*ша CI на обладают АДФ-рибсзил трансфертной активностью.

Таким образом „ш установила, что препарата кэйретокенна CI Clostridium totulinu.. С не обладают АДФ-рибозил трансфзразной активностью. По-видимому, японс.таэ исследователи использовгли в своих экспериментах препараты нейротоксинов CI, контаьяшироЕглкнэ АДФ-ры-бозил трансферазой CS. Наши денные согласуются с данными ¿ktoi-ifes'.

Hoist также были протестированы препараты Оотулинических нейротоксинов типов А, В и Е , нв наличие ¿ЦФ-рибозил трансфзразной актив'. хтн. Для опытов брали препараты нейротоксинов .очищенных з лаборатории ботулизма, в концентрации 0,5 мг/мл. Как показали.результаты исследований во всэх пропарятах отсутствовала АДФ-рибозкл траксферазкан активность. ,

Тагош образом ма установила, что ботуливические нейротоксинн типов А, ВкЗ таккэ Fi обладают АДФ-рибозил трансферазной активностью.

3. OTPABOTIiA РЛдасКММУНОЛОГИЧБСКОГО И ттаОФЕР?ЛЕНГНОГО МЕТОДОВ для опрдашюш АДФ-РИБОЗМ ТРАКСФЕРА5Ы сз

ез

Обычно для обнаружения 03 используют биохимический метод определения АШ>-ркбозил трансферазной активности. Однако st'ot метод но всегда доступен в обычшх микробиологических лаборат<рриях ввиду того, что он требует не только специфических реагентов и определенной квалификации, но и предусматривает наличие определенной оснащенности' для работы с радиоактивными изотопами. Кроме toi'o, сама методика определения трудоемка и запишет достаточно большое количество времени (не монвэ двух дней). Все это слупят препятствием для получения результатов по рг.сгрос^р'жэстю АДФ-рибозил траноферазь' СЗ среди ра»-ли-чих шп'ммзь лпоотридий.

Боле.? продуктивно определенна АДЗ- рябого п тожефзразы 03 можно проводить при ладами« мшулос.*"Х»к>гкческчх методов. Однако, в литературе wü не ьстретмда ов^др^ий об кслольэоьб!»»! голого лододь, эз

сличением анализа препаратов с помешу ¡о метода кммуноблотинга псов [Rosenar, 1987 ]. Однако, в этом случае трудно скидать высокой зствит0лько"ти, т.к. обычно кшунофермвнтные метода в среднем в ]0 раз более чувствительны,, чем метод иммуноблотинга .

Тагам образом разработка методов определения СЗ, пригодных i проведения оперативного скрининга представляет вакчую задачу с дль специальных ж следований по распространению этого фермента ¡ди других штаммов клостридий, так и для дальнейших исследований определению локализации и клонированию гена, ответственного за гтез СЗ.

В основу разработанных нами методов была положена способность сорбироваться на нитронеллюлозных фильтрах. Способность нитроцел-шых фильтроз сорбировать белки широко используется для снятия им-шх реплик из полиакрипамидного геля. Применение этого же принципа г выявления СЗ в культуралыигх фильтратах илострида . позволило нам ¡работать новые варианты радиоиммунологического и иммунофермзктно-методов определения СЗ - радкоиммунодот и энзимоиммунодот.

Внявлешю фиксированной на фильтре ДДФ-рибозклтрансфе азы СЗ тцествляется последовательной ол;.аботкой специфической знтискво-жой к ферменту и затем протеином А стафилококков, ..зченшм радио-•иеным кодом или пероксидаз^й. При этом положительный результат •истрируется з виде пятка-автографа после экспозиции с рентгенов-яг пленкой иле зке окрашенного в коричневый цвет пятна после добав-гкя субстрата.

Г'розеление сравнительных опытов по определению АЦФ-рибозил 1ясферазы СЗ с помощью разработанных и ранее описанных, методов утвердило высокую чувствительность радио- и йнзимоиммунодота, рав-I 200 пг в пробе, а такке оперативность при получении результатов.

Подтверждение специфичности разработанных методов было полу^но [ испытании иязестннх СЗ-нродущгруюша и СЗ непродуцируших итам -! Clostridium "botulinum С, а гаккэ других продуктов бактерий, п . как ботулинччасхие кейротоксина типов А, В, С и S, дифсе^'йЬшг! :сйн и термолабильный то:<с:т E.coli. Применение ентисыво]юток, ¡ученных к очидеккому препарату ДД5-ркбозил трансферьзы 03, ■еоляло получать положлтйльк з результаты' только Б случа ; Ci-1'po-друкшх штаммов Clostridium botulinum С.

Так№_ ооразом, ч результате проведенных йсследоъсынй уыаt б'¡ли poöo-rs«xi новые Еариантч радиодамунологтиеекого я ^чуно^лрмонт-

кого кетолов, обладайте высокой чувствительностью, специфичности и оперативностью, и показана возможность их згпользования для зыял лония СЗ « культуралъыых фильтратах кластридий. Это позволило провести исследование по оценке распространения .3 среди штаммов различных КЛОСТрЛДИЙ. ■•

4. ОПЕНКА РАСПРОСТРАНЕНИЯ АДФ-РЖОЗИЛ ТРАНСФЕРАЗЫ 03 ОРЕЩИ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ КЛОСТРИДЩ

АДФ-рибозил тр~нсфераза .03 была обнаружена только у штаммов С1си1г1<Иил1 ЬоЪл1гэтяп о к Б. Специальных исследований по распространении это1ч< оормвнта среди других ботулишчэских штаммов не проводилось, однако но даяннм ЧиЫп et з!.[1938 ] анализ отдельных-1".•, ич'вммов С1оа^г101ига Ьо^;и11пит типов А, В к е не позволил обнаружит у них АДйнрибозил траксферазную активность. Б литературе полностью стсу^отБузог сведения о налагаю: ДЦФ-рио'озкл трансферазы 03 у шташс других югастридий.Всз ьтс. наряду с продолачвдойся нэуверекостью в то?.!, что АДФ-рлбозил трансфараза СЗ представляет собой самостоятельный фермент, а, тага® да.'сиг.м о том, что СЗ имеет антигенные детерминанты» сходнее с нсйрс.оксгноы С1, создает впечатление, что СЗ моЕет иредоузвляэть собой часть 1-цепя кейротоксина 01. 3 польз; э&зго свидетельствуют к предварительные данные о той, что генетические детерминанты СЗ локализованы в гокож бактериофагов [ПиЫп о1в 1988].

Однако наш данные, которые получены с использование!,; этщешых препарат. ьейротонсдаа типа С.Т, свидетельствуют о том, что ¿да-рцбсзал тргнсфзрзза СЗ и кейрогоксш яша 01 являются раакящата бадкама. Ми счкгали, что дополшюельвш доказательств; о пользу том, что СЗ г;е является составной частью нейрохоксина С1 МОГЛИ -Ля быть сводозшя о том, что СЗ продуцируется на только штиааюя е:\озйгМхш! Ьо1иЗ огива о и в3 йо к другдма штаммами клос!р? дай, которая не продуцируют шйротоксиш тштов сии.

Располагая таостцкфлчоской адтисаюротаой к .Со, ш посчитав необходимым проанплазировазъ различные г^й;^ клестрщяа на налита у и; и ЛДФ-рибозил трянсферозы СЗ, что прэдетапляет не только ь самостоятельной интерес, ко и как гарисят ре:кшия указанной вне задачи.Во избежание получения неоднозначных результатов ( нанрймс! за счет сходных антигенных опитогюв па . СЗ л других белках]

кльтратн различных итаммсв клостркдий анализировали не только 'лмуносерологлческим методом, но и биохимическим (АДФ-рибозет транс-зразная акткяносгь).

Таким образом, в результате проведенных исследований установ-эннос что'радиоиммунологический метод определения СЗ пригоден для ¿явления ДЦФ-рибозил трансферазы СЗ у ¡атаммов Clostridium botulinum ;oia С. АДФ-рибосил зттнсфераза СЗ обнаружена у б исследованных гаммов Olcstridiua botulinum С.

Однако, используя биохимический метод определен...! АДФ-рибозил рансфэразной активности, мы обнаружили АДФ-рибозил трансферазпую хтивкость у S штаммов Clostridium botulinum Б, у 2 штаммов lostridium botulinum Е я по одному штамму у Clostridium botulinum

Таблица 4

эрактеристика различных штаммов Clostridium на налгтие ЛДФ--рибоз;гл рансферазной активности

Штамм Кол^ество Количество штаммов,

ислздовашшх ■ • обладай дх АДФ-ркбозил лашов трансфэраз. активностью

lostridium botulinum

TjUI А

тип В таш С тип Е

ТИП F

тип а

9 II 6 4 Г

не обнаружено 6 б

\ 2 ^ I

I

j.

lostridium zerf.rirgens lostridium odematiens lostriuxn ceptisum lostridium nistolyticum Lostridium tetani lostridium sporogene-"» lostridium putrificum Lostridium dii'io?.? -

I Г I I I

КО обнаружено не обнаружено не обнаружено не обнаружено

нь обнаружено

2 I

I I

ав обнаружено

- -20 -I»

.лпов р и G, Clostridium sporogenes и Clostridium putrificum(Ta6. По данным радаоиммунологического анализа АДФ-^чоозил трансфзраза i у этик ит°ммов кэ выявляется. По-видимому указанные штаммы продуц руют АДФ-рибозил трансферазу, отличную от АД2 рибозил трансферазы Clostridium botulinum С.

вывода

1. Отобран еп ..мм-продуцент АДФ-рибозил трансферазы 03 ( штам С-20 Clostridium bo.alinum С), который продуцирует наибольшее количество трансферазы на отвчествепшх питательных ере ;ах. Покаяэш что максимальное накопление трансферазы происходит при культиви-реванш штамма на казэичови -дрожневой среде через 96 часов культивирования, в то время как максимальный выход нейротокоина наблкща( ся через 120 часов. Выход трансферазы при этом составляет 2 мкг/м.

2. разработана ехзма очистки АДФ-рибозил трансферазы СЗ, кот< рая включает: концентрацию исходнох'о материала сульфатом аммония, удаление основных балластных вецестн с помощью БЕАЕ-сефадеяса, ге-маг^лютшиша - с помощьз кммунреэрбента и окончательную гель-хроматографию на сефздексе G-IOü. При этом выход активного материала составляет 61,Ь% при 23-кратной очистке.

3. Показано, что АДФ-рибозил трансфзраза.СЗ представляет беле с молекулярной массой 25 ООО дальтон (по данным ДЦС-Ка-диск элект] £ уреза в полиакрлламвдном геле и "ель-фильтрации;. Фермент обладае как АДФ-рибозил трансфзразной, тек-и Н4Д-гликогндролазж)й активностью. В то же время АДФ-рибозил траксфераза СЗ не обладает токет чеекпми свойствами для лабораторных животных при введении ез в дог до 2 мкг на мншь.

4. Показано, что очищенные препараты АДФ-рибозил трансферазы пригодны для получения антисывороток, которые по данным радисшму1 логического и iммуюхимичоского анализов являются ..моноспецифичесжг

5. Устаноалзно, что ботулинические нейротоксинн типов А, В, С Е ю обладают АДФ-рибозил трвнеферазкой активностью при использовании в качестве субстрата гомсгенатов различных клеток и их фрак;. \ цитезолыюй и мембранной ) и что эта ахтисность присуща отделькс белзеу СЮзtridiuiä botuiinijn о - АДФ-рибозил трансфзразе СЗ.

6.Отработаны радаоиммунологичес.кий к ншуноферментныР. методы определения АДФ-рибозлл трансферазы СЗ в культуралышг. фильтратах

гогенных клостридий, которые зключэют адсорбцию СЗ на нитроцзл-позяых фильтрах, последующую обработку СЗ с помощью моноопецйф"-зких анти-СЗ тнтител и регистрация результата с помощью тыогатов. Чувствительность метода составляет? 200 in? в пробе, мазано, что данные метода в 100 раз более чувствительны, че»/ метод луноблотинга белков, но шее чувствительны, чем биохимический год оцределения дДФ-р. ;озил трансфзрэзной активности.

7.Установлено, что АДФ-рибозил траксфераза СЗ не имеет 1унохимическсго и ишупосзрологического родства с неяротоксияаш 7лизма типов А, В, ВИР..

8. Обнарукено, что АДФ~рибозил трансферазкая активность присуща только штаммам Clostridium botulinuai С, но такие некоторым

¡ммам Clostridium botulinum типа в, Е, Рис, а такче штаммам ¡stridium sporogenss И Clostridium putrificuni.

9. Показано, что АДФ-рибозил трансфераза СЗ продуцируется как :еигеннкми, так и нетоксигзккыми штаммами Clostridium otulinum.c. нсфераза является внеклеточным ферментом, т.к. обнаруживается ъко в культуральной средз и отсутствует в х'омогенатах кло^тря-льных клеток.

Список работ опубликованных яо теме диссертация.

1. Ефимзнко А.Н. г'Степанова М.В., Еертиев Ю.В. Характеристика АДФ-рибозил грансферэзы СЗ Clostridium botulinum С. // Тезисы 2-й Всесоюзной конференции "Бактериальное tokc.hih" Юрмала, Латвия, 1939. (3,37

2. Специфические ДЦФ-рибозкл трансферазы, но не нейротоксия Clostridium botulinun с, вызывает ДДФ-рибозщнгоованиэ белкон, эукариотических клеток. / a.H.SHjmsjl.o, и.В.Шиоаевз, С.й.Гоффзнберг; М.П.Панченко. // Актуальные проблемы прикладной ищуяологки, биотехнологии и прозводствэ бактериях препарэ-тов. - Пермь, 1988 г. - C.2S-30.

3. The 65-VJDa protein from pig heart: a new substrate for Clostridium botulinum ADP-rlbosyltranfjferase (exoepsyine 03) / S.I.Hoi?enberg, v'.O.Ry.ln, A.N.Eiijnsnko ez al. // F1SS

Letters.- 1991Vol.293,W 1,2.-'P.^S-H.

o'J -/)

/ /