Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ АНАЭРОБЫ РОДА CLOSTRIDIUM, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И РОЛЬ В СИЛОСОВАНИИ КОРМОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ АНАЭРОБЫ РОДА CLOSTRIDIUM, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И РОЛЬ В СИЛОСОВАНИИ КОРМОВ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ нменк К. А. ТИМИРЯЗЕВА

АЛЁШИНА Елена Анатольевна

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ АНАЭРОБЫ РОДА CLOSTRIDIUM, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И РОЛЬ В СИЛОСОВАНИИ КОРМОВ

Специальности 03,00.07 — микробиология и 06.02.02 — кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1982

На правах рукописи

Работа выполнена в Московской сельскохозяйственной академий нм. К. А. Тимирязева.

Научный руководитель—доктор биологических наук, профессор В. Т. ЕМЦЕВ.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор И. М, ГРАЧЕВА, кандидат биологических наук П. С. ЛАРИОНОВ.

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт животноводства.

Защита диссертации состоится €¿0 » 1982 г.

в /Г час. на заседании Специализированного совета К. 120.35.06 в,Московской сельскохозяйственной академии им.- К- А. Тимирязева (127550, Москва, Тимирязевская ул., 52, корп, 9).

Автореферат разослан — 1982 г

С диссертацией можно ознакомиться в ДНБ ТСХА.

Ученый секретарь совета — канд. биол, наук

, в- Г. МАРЬЕНКО

т

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из наиболее острых задач в животноводстве является коренное улучшение кормопроизводства и решение проблемы кормового белка. В документах XXVI съезда КПСС подчеркивается необходимость увеличения производства и улучшения качества кормов. Намечено значительно увеличить производство высокобелковых культур, в том числе клевера.

Важную роль в кормлении сельскохозяйственных животных играет силос. Бобовые культуры — ценное сырье для си-.лосопання, однако они являются, как Правило, трудносило-суемыми вследствие низкого содержания растворимых углеводов и повышенной буферное™, Это способствует развитию в силосуемой массе нежелательной микрофлоры, особенно споровых анаэробов рода Clostridium. Споры клостриднй через молоко попадают в сырную массу, где могут развиваться и приводить к порче продукта (Thome, Swartltng, 1953; Гудков и др., 1976). Наиболее подробно изучены маслянокислые (са-харолитнческие) бактерии, превращающие лактат силоса в бутират (Орлов, 1938; Чижик, 1952; Ohshima, 1979). Протео-литнческие клостридни изучены гораздо менее полно. О развитии протеолнтнческих клостриднй в силосе, сопровождающемся катаболизмом аминокислот до аминов и аммиака, сообщали Rosenberger (1959), Ohshima, McDonald, (1978) и др., однако в литературе отсутствуют сведения о биологических особенностях данных бактерий. Острота проблемы белка в кормлении животных требует изучения микрофлоры, участвующей в разрушении азотистых веществ корма. Наличие в составе Clostridium патогенных видов побуждает к исследованию видового состава клостриднй в силосах. Не изучена роль протсолитическнх клостриднй в бобовых силосах при ха-. рактерных для них значениях pH выше 4,2, при которых возможно сосуществование к взаимодействие Clostridium с другими бактериями.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью нашей работы было изучение характерных особенностей и роли протеолитпческих клостриднй в процессе силосования клевера, а также изыскание принципиальных путей

Ц:;. Ойя'эгем

воздействия на их рост н метаболизм в силосе для получения корма высокого качества.

Для выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить численность протеолитнческих п других анаэробов рода Clostridium в снлосах в динамике.

2. Выделить культуры протеолитнческих анаэробов нз сн-лосов па разных этапах силосования, идентифицировать их и изучить их морфологические, культуральные и физиологические особенности.

3. Исследовать влияние некоторых физико-химических и биологических факторов, важных для силосования, на физиологические свойства протеолитнческих Clostridium.

4.. Изучить роль протеолитнческих клостридий в изменении биохимического состава клеверной массы в процессе силосовании в обычных и гнотобнотическнх условиях.

Научная новизна. В работе представлены количественные данные о развитии протеолитнческих анаэробов рода Clostridium в различных снлосах. Впервые нз силосов на разных этапах их созревания выделены представители Clostridium, активно разлагающие белковые вещества. Впервые получены данные о физиологических особенностях протеолитнческих клостридий, развивающихся в силосе, которые свидетельствуют о наличии у них определенной физиологической приспособленности к условиям силосов. Приведены данные о характере взаимоотношений протеолитнческих клостридий с молочнокислыми и гнилостными бактериями силоса. Показана роль некоторых ассоциаций бактерий в биохимических процессах в обычных и гнотобнотическнх сплосах.

Практическая ценность. Результаты исследований позволяют разработать практические рекомендации по совершенствованию технологии силосования бобовых. Полученные данные могут быть использованы также в научно-исследовательской работе по изучению биологии споровых анаэробов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на Всесоюзной научно-технической конференции по улучшению работы и подборе, расстановке, воспитании и подготовке молодых специалистов в свете решений XXV съезда КПСС (Ярославль, 1978) н на VI съезде Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980).

.Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора . литературы, -1 глав собственных исследований, выводов, содержит 154 страницы печатного текста, 35 таблиц, 18 рисунков и список литературы из 435 наименований (из них 247 зарубежных).

Автор выражает искреннюю благодарность канд. - биол. наук, дои. Г. И. Переверзеион, канд. б пол. наук, ст. научн. сотр. Л. В. Гудкову, канд. техн. наук, ст. .'научн. сотр. М. С. Уманскому, канд. биол. наук, ст. научн. сотр. Г. Д. Перфильеву за ценные консультации и помощь в выполнении отдельных разделов диссертации. ''■,

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ. ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы закладки'сил осов н изучения биохимических и физико-химических процессов,' происходящих в . силосах^

В качестве объектов исследований использовали снлосы, по-* лученные в производственных условиях и в лаборатории. Производственные снлосы были получены в 1977 г. в совхозе «Родина» Угличского района Ярославской области в буртах и траншеях из клевера, разнотравья, горохо-овсяиой и клеверо-тимофеечпой смесей'в возрасте 15—90 суток. Пробы отбирали силосным буром. Лабораторные снлосы были заложены в отделе микробиологии ВНИИМС из зеленой массы клевера, полученной с полей вышеназванного совхоза, и* кукурузы—с опытного поля ВНИИ, кормов и кормопроизводства ' им. В. Р. Внльямса: Измельченную массуукладывали в сосуды емкостью 500 мл по 400 г, герметизировали эластичными резиновыми пробками . и- инкубировали^ при 28°С.^ Проведен 1 опыт по силосованию кукурузы; 2.— клевера (Кг 1—в 1978 и »V.' 2— в 1979 гг.), 2 — клевера с молочнокислой закваской ВНИИМС-ИНБИ (Полянин и др., 1975) (в те же годы). Все анализы проводили, в исходной массе, на I, 3, 5, 7, 15, 30 и ■15.сутки, но 3 повторностн в каждый срок. Проведен;;опыт по лабораторному силосованию клевера с внесением сульфата, меди, т. к. медь является ингибитором анаэробов (Перфильев, Гудков, 1979)-Вносили 10 и 100 мг данного соединения в виде водных растворов: на 1 кг массы,ннокулированной Cl.bu-tyricuin, CK sporogenes (по 3.101 клеток/г) и молочнокислыми бактериями (3.104 клеток/г).'Анализы проводили в исходной массе, на 7 и 45'сутки,-. - . .':..;■.

Изучение роли'отдельных групп бактерий! в ходе силосования проводили в лабораторных гнотобиотических снлосах из клеверной массы, простернлизованной облучением у-луча-мн и дробно текучим паром. В облученную, массу вносили: I — молочнокислые' бактерии, II — молочнокислые бактерии -}-протеолитическне клостридшг; III — протеолитическне кло-стрндни, IV'— молочнокислые + гнилостные бактерии (Е. coli, Ps, herbicola и В; inycoides). В массу, простершшзованную дробно, вносили культуры в тех же вариантах, но в 4-м дополнительно' вносили протеолитическне-'клостридинги введен 5-й вариант:, гнилостные аэробы + протеолитическне. клострн-

дни. Дозы внесения: молочнокислых бактерий'— 5. 10* клеток/г в I серии опытов it 106 — во II; гнилостных — Ю5 и про-теолнтнческих клостридий— 103 клеток/г. Анализировали исходную массу, силос на 7 и 45 сутки.

Влажность, общую и активную кислотность, значения сахарного минимума определяли ' общепринятыми методами. Содержание редуцирующих Сахаров в растительной массе оп-' ределялн по Бертрану, летучих кислот и спиртов —методами ГЖХ (Новгородова н др., 1975). Буферность массы опреде-"ляли титрованием сухого образца раствором молочной кисло-Vtu 1 (McDonald et al., 1964).' Общий азот определяли по Кьельдалю, белковый — сжиганием ■ по Кьельдалго белков, осажденных в 'вытяжке^ у- трнхлоруксусной кислотой, амннный азот—"нингидрнновым методом (Починок, 1972), азот аммиака,— по Конвею. Аминокислотный анализ массы проводили методом спектрофотометр«» кислотных :гидролнзатов на анализаторе типа 835—50 (Hitachi, Япония).

Математическую обработку данных в ряде опытов проводили методами вариационной статистики (Рокицкий, 1974),

Микробиологические методы исследования. Учет численности споровых анаэробов в снлосах проводили • методом предельных разведений в жидких питательных средах. Повтор-ность^трехкратная. Количество спор определяли в результате пастеризации посевов при 80°С в течение 10 минут. В результате сравнительного изучения сред для учета численности протеолитнческпх Clostridium была выбрана селективная среда ССПА следующего состава (%): гидролизат казеина; — 50, пептон —3, дрожжевой автолнзат — 4, хлорид натрия — .0,3,.ацетат натрия — 0,1, смесь микроэлементов по Форду (Ford, 1962):— 10 мл/л, дистиллированная вода —до 1 л, рН = 7, 2—7,4-(Горо»а, Гудков, 1978). Селективность среды обусловлена внесением в нее* смеси антибиотиков неомицина Н полимиксина. Без них среда обозначена СПА. 'Для учета ;лактатфсрментнруюшнх клостридий применяли селективную лактатно-ацетатную среду ЛАСА {Гудков, Перфильев, 1978). Для;учета ацетонобутиловых анаэробов был взят 5%-ный ку-« курузный затор, для определения общей численности сахаро-литических анаэробов — пептонно-дрожжевая среда для Cl. pasteurîanum {Мишустнн, Емцев, 1974). Обшее количество спор определяли па среде СДА (Гудков, 1966). Все среды для анаэробов содержали 0,05% солянокислого цистекна в качестве редуцента п 0,004% нейтральрота для индикации развития облнгатных анаэробов (Kaufman, Weaver, 1960).

Общую численность аэробов определяли на сусло-агаре, : молочнокислых, бактерий.— на сусло-агаре смелом н спир--том, гнилостных бактерий — на пептонном агаре, кишечной

палочки — на среде Кесслерз. Численность всех видов бак; терий пересчитывали на 1 г сухого вещества,, ' • Антибиотические свойства силосного сока ио< отношению к CI. buturicum, CI. sporogenes и Ps. hcrbicola изучали методами разведении.'и перпендикулярных штрихов (Егоров, 1965). В гнотобнотнческих снлосах для изучения характера микрофлоры применили'метод стекол обрастания в модификации Рыбалкпной и Кононенко (1953).'

Методы получения чистых культур Clostridium; Выделе* ние клостриднй проводили методами Rosenberger(1959) ,,Ска-лона (I960), в трубках Вейоиа (Бычковская, , 1966) и в аиа-эростатях на средах ССПА, СДЛ, ЛЛСЛ и кукурузном заторе .при 37°С. Отбор изолированных колоний — 10—12-кратный.

Идентификация*; культур- Clostridium; ' Видовую принадлежность выделенных бактерий определяли но руководству Берге (1974).

. Методы изучения морфологических, культуральных и физиологических особенностей Clostridium. 'Морфологические особенности культур изучали в среде СПА, применяя микроскоп МБИ-1 с фазово-контрастиой насадкой. В электронном ^микроскопе JEM-7 (Япония) проводили изучение негативно окрашенных препаратов,целых клеток и спор, а также их уль-(-тратоикнх срезов,- , *. ;

Культуральные и физиологические свойства Clostridium изучали в средах СПА, СДЛ, СПЛ-агаре, Кйтт-Тарошш, кровяном агаре, молоке с лакмусом, желатиновой среде и в пектиновом геле (Clarke, 1955; Beerens ct al., 1962; Емцев, Львов,

1965 ;Лабниская, 1978). ■ ..........: .-

Пpoтeoл|пичecкyю активность культур определяли при-рН = 7,0 и 5(7 модифицированным методом! Ансоиа, выражая ее в протсолнтических единицах (п. сд.) в 1 мл супериатанта. • Гп. ел. соответствует количеству фермента, катализирующему отщепление от молекулы казенна Г микромоля* тирозина за' 60 минут при 37?С (Горова, 1979). Трансформацию белков молока клоегридиямиоценивали но убыли в среде белков, нарастанию количества-пептидов и свободных аминокислот после 4-х суток культивирования (Клнмовский.и.'др., 1968).-

Изучали накопление'биомассы культур методом нефелометрии при 20, 28, 37 и 43°С, а также при рН = 4,7, 5,0, 5,3, 5.5 6,0-и 7,0 при ЗГС. Влияние различных концентраций кислорода :ц перекиси водорода на-рост Clostridium < изучали также нефелометр и чески при инкубировании культур в СПА и СДЛ-с различным содержанием Оа н Н2О2, которое определяли на. полярографе LP-60 (ЧССР). Влияние температуры, рН и.ак-, тпвности воды в среде на количество и состав продуктов брожения глюкозы у,Clostridium изучали методами ГЖХ летучих кислот и спиртов. При исследовании . реакции Стикленда у

анаэробов определяли летучие кислоты — газохроматографн-ческн, аммиак — методом Кон пел.

Изучение влияния молочнокислых и гнилостных бактерий на рост, протеолитическую активность и продукты брожения у выделенных клострндий проводили при совместном культивировании ид в специальных стеклянных сосудах с полупроницаемо?! мембраной в молоке и СДЛ с буфером.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ, .

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

РАСПРОСТРАНЕНИЕ CLOSTRIDIUM В СИЛ ОСАХ, ■ ПРИГОТОВЛЕННЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ и ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

Протеолитические анаэробы, в отличие от л акт ат ферм оптирующих, были обнаружены во всех изучавшихся производственных сил ос ах, несмотря на низкий уровень рН (табл. 1).

Таблица 1

Численность анаэробов и их спор в производственных снлосах

в Вид сырья Возраст, су т. РН Количество клеток бактерий на 1 г сух. вещества Общее количество спор ita 1 г сух. ле-щестоа

про reo • лнтичс-• скнх лактат--ферментирующих '

Горох 4-овес...... Разнотравье . . . . „ . , Клевер......... Тимофеевка....... Клевер+тимофеевка .... 15 ■15 45 90 1 4,23 3.95 3,97 4.05 3,94 6,2.102 9,3.102 2,4.102 7,2.102 5,4.10s 6,2.10« 0 -0' 0 0 4,5.10' 2,3,10* •1,4.10» 4,2.10* 2,2.102

Численность спор снижалась с возрастом силосов. В 3-месячном силосе численность анаэробов возрастала.

Микробиологический анализ силосов, приготовленных в лаборатории, вскрывает ход процессов в начале силосования (табл. 2). В клеверной массе молочнокислое брожение развивалось медленнее и она была более благоприятной средой для развития клострндий, чем кукурузная: численность анаэробов в ней возрастала к 45-м суткам, а в кукурузной, наоборот, снижалась до 2;8-10г, и споры в ней-были найдены только на 30-е сутки. Начальное количество анаэробов в клеверной массе не влияло на ход их дальнейшего развития в силосе. Таким образом, в клеверном1 силосе протеолитические Clostridium развиваются длительно, а не'только-в фазе раз-6

вития смешанной микрофлоры, как принято считать (Шмидт, Веттерау, 1075).

Т а б л н ц а 2

Численность микроорганизмов в клеверных сил осах (приготовленных в лабораторных условиях) на разных этапах силосования

Количество клеток бактерий на 1 г сухого вещества

Воз- РН анаэробных аэробных

раст, сут. гротеоли-1 тическнх| ,10увых сахароли ти-чески х лактат-ферментирующих с ГНИЛОСТНЫХ молочнокислых

Опыт .V? 1

0 5.95 0 0 0 0 6.6-10' 2.0-

1 5,10 6,2-№ 1,2-10' 2,8-10" 0 1,0.10» 7,9 -10»

5 5,03 0 6,6- 10е 0 0 9,1-10* 1.1-103

7 5,25 3,0.10® 3,0-10' 0 0 1,0-10' 8,5-10*

(2,9-10»)* 7,7 -103

15 5,56 3,1 IV 3,1-10* 0 1,3- 102 1,5-10»

(1,3-Ю3) (З.М02) 1,4.105

30 5,50 2,8-101 6,2-юг 0 0 1,2-10»

45 5,68 1,5-106 1,5-10* 0 1,5 102 2,0-106 5,7-10'

Опыт Л« 2

0 6,32 4.5-№ 2.0-Ю5 _ * • 5,5-10» 4,3-№

1 5,65 7,7-10" 2,1 • 10е — / 7,0. Ю' 4,7.10»

5 5,18 0 1,1-104 — 1,7-10* 5,8-10»

(1.Ы01) 1.1-10*

7 4,85 0 0 — — 2,2-10«

15 4,75 0 2,5-10« _ _ 2,6* 10* 8,0-10»

30 4,80 1.0- юг 2,9-10= (1.2.102) — — 4,8-10« 1,2-10'

45 4,65 2,8-10' 6.9-10« — — 3.9- 10е 6,9-10«

(З.ОИО4)

* — число спор. ** —не определялось.

Внесение молочнокислой закваски способствовало активизации молочнокислого брожения в клеверной массе (табл. 3).

Споровые анаэробы были подавлены к 5-м суткам, но они вновь появлялись на 7—15-е сутки при рН = 4,74—1,50, а аце-тонобутиловые бактерии спорулировалн. Применения закваски недостаточно для получения стабильного силоса, но оно позволило получить корм 3-го класса. Изучение антибиотических свойств силосного сока при внесении закваски показало, что в 1 неделю силосования проявлялась слабая (в 1—2-м разведениях) активность против, главным образом, С1. Ьи^гЬ

Таблица 3

Численность микроорганизмов в силосе с молочнокислой закваской.

Возраст, сут.

pH

Количество клеток бактерий из 1 гсудого вешсстдд

протео-л] ничеен! ix

анаэробных

ацетоно- са.чэро-

буinле- лити-

вых ческих

лактат-ферментирующих

аэробных

гнилостных

молочнокислых

Опыт .Vi

0 5.95 0 0 0 0 6,6- 10> 2,0-10«

1 4,65 1.2.10* 2,8-10« 1,2.10« 0 1,7-10» 3,7-103

3 4,48 2,9-101 0 0 0 3,4-105 1,0-

5 4,43 0 0 0 0 2,9-10« 5.1*10е

7 4,74 0 1.2-103 0 0 5,1* 10* 3,8-10"

(UO-IO*)*

15 4,76 . 0 1.3-10' 3,0-102 О 4.3 -10* 1,9-10»

30 4.70 0 6,0-102 0 0 U3-103 4.5-107

45 4.72 3,0-101 2.4-10« 1,2-W 3,0-102 3.2-103 7,5* 10?

Опыт .V» 2

0 6.32 4,5-10а 2.0-10* _ »♦ 0 5,5-10» 4.3-10°

1 5.28 0 Э,6*10' — 0 2,5- 10е 6,5-10«

5 4,78 0 0 — 0 1,6-10* 1,9-10«

7 4.77 0 0 — 0 1,7* 10е 7,4.10й

15 4.50 0 М-102 — о 9,0-102 7,5-10"

30 4,70 1,2.10' 1,2- — 0 8,3- № 1,0-10«

45 4,40 0 2,3-10» 0 7,8-10« 9,9-10*

* — число спор.

** —не определялось.

cum. Специфическое пнгибпрованис Cl. sporogenes при изучении методом перпенднкулярных штрихов было статистически недостоверно (Р=-0,95). Следовательно, молочнокислая закваска тормозит развитие клострлдий в силосе и основном за счет подкнеления массы.

Эти данные обусловили изучение внесення сульфата меди для подавления клостридий в силосе. Полученные результаты свидетельствовали о слабом влиянии этой соли на развитие и споруляцню анаэробов в клеверном силосе, что позволяет сделать вывод о нецелесообразности применения сульфата меди при силосовании.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА CLOSTRIDIUM, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СИЛОСОВ.

Получение и идентификация чистых культур Clostridium.

Из производственных силосов было выделено 6 культур про-8

теолитических анаэробов, из лабораторных — 6 (в динамике). Они отнесены к следующим видам рода Clostridium: С1. sporogenes—10 штаммов, CI, acetobutylicum — I штамм, С1. subtermmale— I штамм. Последний из силоса выделен впервые. Установлено, что в кукурузном силосе в начале ферментации развиваются С1, sporogenes, в конце — CI acetobutylicum, а и клеверном силосе активны штаммы C!. sporogenes.

Морфологические и культуральные особенности Clostridium, По морфологическим, культура льным свойствам и динамике развития выделенные культуры не отличались от описанных в литературе почвенных и патогенных бактерий (Лва-кян и др.. 1972; Тарков, 1961; Joulton et al., 1968; Smith, Hobbs, 1974).

Физиологические свойства Clostridium. Все изучавшиеся культуры необратнмо разжижали желатин, выделяли аммиак, сероводород; экзолипазу — кроме CI. acetobutylicum. Один из штаммов CI. sporogenes был способен к редукции нитрата до нитрита. Все культуры были непатогенны для белых мышей. Протеолнтическне Clostridium, выделенные из амосов, способны к ассимиляции большего набора углеводов, чем выделенные из почвы и молочных продуктов (Горова, 1979; Перфильев, 1979), вследствие чего участвуют в накоплении кислот в силосе.

Все культуры обладали протеолнтической активностью от 23,9 до 38,2 п, ед./мл при рН = 7Д При развитии в молоке убыль белков составила до 98,2%, прирост содержания пептидов — в 11,3—17,1 раза, что больше, чем у почвенных кло-стрндий (Горова, 1979); содержание аминокислот в культу-ральной жидкости возросло в 2,5—5,6 раза. Изучавшиеся культуры были более устойчивы к действию кислорода и перекиси водорода, чем маслянокислые бактерии {Перфильев, 1979).

Влияние уровней рН, температуры и активности воды на рост и метаболизм Clostridium, выделенных из силосов. Уровень рН, Установлено, что в силосе могут развиваться относительно кислотоустойчивые варианты протеолитнческнх к л ост -рндий, способные начать рост н забуферепной среде при начальном рН = 5,3 после периода нодщелачивания. При рН = 5,7 общее количество летучих кислот у Clostridium снижалось, в составе их возрастало содержание ацетата, как отмечалось ранее у маслянокислых бактерий (Перфильев, 1979), а также продолжалось слабое образование бутнрата (табл. 4). ¿

Протеолнтическне клостридии продуцировали также спирты, в основном этанол, количество которых в кислой среде снижалось на 0,2—10,0%.

Протголнтическая активность CI, sporogenes н CI. subter-mínale при рН = 5,7 снижалась на 3,4—14,2%, а у CI. acetobu-

Т а б л и ц а 4

Влияние уровня pH на количество и состав летучих кислот * у Cl. sporogenes

Показатели ' рН=7,0 1 рН=6,0 рН=5 ,7

' • . штаммы

502 602 707 502 602 707 502 602 707

Сумма кислот, мг% 57^42 10,55 57,56 45,69 16.11 21,19 14,42 4.0 0,96

% суммы от макси-

мума 100,0 100,0 100,0 79,е 39,7 36,8 25,1 9,9 1,7

Соотношение кис-

■ лот,%: t -

формиат 42.6 31,0 27,3 37,6 17,1 19.5 14,2 27,0 42,7

аиетат. 1 23,6 61,2 60,0 49,0 66,9 64,3 82.0 68,8 57,3

пропионат 23,1 0,0 6.6 6,5 7,2 3,4- 0,9 1,2 0,0

бутлрат 10,7 7,8 6.1 6,9 8,8 12,8 2,9 3,0 0,0

tylicum, наоборот, "возрастала на.5,0%. Продуктами реакции Стиклеида.при pH —7,0 у CI. sporogenes 502, кроме аммиака, был ацетат, у С1. subterminale — ацетат й формиат, у С1. асе-tobutylicum— ацетат, и пропионат. При рН=5,7 ход реакции Стиклеида изменялся в сторону преимущественного синтеза ацетата.

■Температура. Протеолитические клостридии, выделенные из силосов, относились к мезофильным бактериям. Максимум летучих кислот у них отмечен при 30°С: При снижении температуры до 20 и повышении до 40° количество и состав кислот значительно варьировали у разных штаммов. Очевидно, что в силосе возможно образование клостридиями кислот при разных температурах.:

• ■ Активность воды (А „); .-Пониженный уровень А8 в силосуемой массе подвяленных растений является одним из факторов подавления, нежелательной , микрофлоры. В питательных средах изучавшиеся клостридии продуцировали максимум кислот при А „ ==0,970, а не 0,995, оптимальном для Clostridium (Scott, 1957). При снижении А „ в составе мета, болнтов клостриднй возрастало содержание ацетата и снижалось количество бутирата. При предельном значении Лв = 0,955(наблюдалсн рост CI. sporogenes 502,.остальные штаммы были подавлены. Таким образом, понижение А, среды до уровня ниже 0,955 может быть фактором подавления протео-литических клостридии в силосе. " • 10

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ CLOSTRIDIUM С СИЛОСНОП МИКРОФЛОРОИ В ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ И ГНОТОБИОТИЧЕСКИХ

СИЛОСАХ

Рост, протсолнтнческая активность и продукты брожения глюкозы у Clostridium при совместном культивировании их с молочнокислыми и гнилостными бактериями. При совместном культивировании Clostridium с молочнокислыми палочками в среде СДЛ без буфера рост клостридий был подавлен вследствие падения pH до 4,2—4,3. В среде с буфером при начальном рМ*= 7,0 к 7-м суткам численность клостридий возрастала и 4—10 раз, а рИ снижался до 5,8—6,0. Протеолптические клостридии росли при повышенной концентрации перекиси водорода ' » среде, выдел ном ой Lb. plantarum, — 15,3 мг/л; распад белков в совместных культурах усиливался в 1,1—3,1 раза по,сравнению с таковым в монокультурах.

Установлено, что сущ ест нует значительная видовая и штпммопая вариабельность, определяющая характер взаимодействия клостридий с молочнокислой и гнилостной микрофлорой при совместном культнвнрованпи в буферной среде; Lb. plantarum, Ps. herbicola и E. coli стимулировали накопле: нне биомассы у CI. sporofjencs 502 п CI. acetobutylicum; В. ту-coides и Ps. herbicola угнетали развитие CI. sporogenes 707. В присутствии молочнокислых палочек и В. mycoides п составе метаболитов клостридий возрастало содержание ацетата, Ps. herbicola — формиата, Е. coli — бутирата, аналогично усилению синтеза бутирата у маелннокнелих бактерий в присутствии гнилостных (Чижик, 1952). При тройном культивировании Clostridium, Е. coli и Lb. plantarum суммарное количество кислот возрастало, в варианте с С1. acetobutylicum — снижалось, но везде повышалось относительное содержание ацетата, а в вариантах Clostridium + Lb. plantarum + B,' mycoides и Clostridium + Lb. plantarum + Ps. herbicola отмечалось увеличение содержания бутирата в культуральиой жидкости. Выявлено двоякое влияние молочнокислых бактерий на протеолптические Clostridium: ннгнбнрующее в обычных условиях и стимулирующее — в буферной среде, какой является силос из бобопых.' Усиление продукции кислот при совместном развитии клостридий с гнилостными аэробами способствует повышению буферностн силоса (Ohshima et al., 1979),чтообу-словлнвает стимулирующее влияние Lb. plantarum на клост* ридии, в результате чего процессы брожения в силосе приобретают'характер гнилостных. Видовая и штаммовая вариабельность иротеолнтнческнх Clostridium приводит к образованию в силосе разнообразных кислот из Сахаров, тогда как

п

хороший силос должен/содержать только-аиетат,- кроме лак-тата (Kemptofi, San demente, 1959; Kemenez, Czentmyhalyi, . 1977). Для изучения роли Clostridium в изменении биохимического состава снлосов проведена серия опытов по лабораторному силосованию клевера и кукурузы.

Биох и м нч ее к и Bi со ста вс и л о со вив л и я и и е на него молочнокислой закваски. Клеверный, силос отличался пониженным качеством ,по сравнению с кукурузным'вследствие меньшей интенсивности в нем молочнокислого брожения.' Этому способствовала высокая буферность исходной-клеверной массы {в 2, 3 раза выше^ чем у «кукурузной), содержание Сахаров, в 2 раза'меньшее сахарного минимума. К 45-м суткам силосования наблюдался интенсивный протеолизш катаболизм аминокислот до аммиака. (11,0% от общего азота), . буферность возросла в,1,3 раза (до 71,1 мэкв/г); В готовом силосе из клевера найдены; бутират,- пропнонат, неидентифицированный азот,1 характерный для некачественного корма (Hughes, 1970).' Полученный силос отнесен к неклассному. Внесение молочнокислой закваски способствовало лучшему, сохранению саха, ров>н азотистых веществ корма: количество бутирата было снижено в4 раза, аммиака.— в 1,2 раза,.больше'содержание отдельных аминокислот, в том числе треонина и аргинина. В' результате силос отнесен к 3-му классу. Молочнокислая закваска не обеспечивала стабильности силоса1, что побудило нас к детальному изучению процессов силосования. .

Роль Сактерийфазличных групп ' в/ гнотобнотнческих- си-лосах. В силосах, приготовленных из облученной массы, внесенные культуры развивались слабо. В-силосе с протеолнти-ческнми Clostridium найдено максимальное количество-летучих кислот, в основном!ацетата. В клеверной массе, иростери-лнзованной дробно, наблюдалось более интенсивное развитие культур. Численность клострнднй возрастала к 45-м суткам в присутствии молочнокислых и особенно гнилостных бактерий. Изучение микробных пейзажей на стеклах обрастания показало :отсутствие лизиса клеток бактерий к концу опыта, что свидетельствует о длительной активности микрофлоры в клеверных силосах.

•Согласно данным биохимического анализа (табл. 5), максимальное количество летучих кислот найдено в силосах с протеолитнческимн клострнднямн и Clostridium с гнилостными аэробами, причем в составе кислот преобладал ацетат, в отличие от данных Taylor и Philips (1970). Ацетат в силосо более желателен, чем бутират, вследствие своих консервирующих свойств и большей питательности для животных, но,.с другой стороны, ацетат участвует в повышении " буферности силосуемой массы и может снизить , потребление - корма животными. Наиболее интенсивно синтез бутирата происходил в

Таблица 5

Биохимический состав гмогобнщических снлосов in клеверной массы

Варианты - - '

• 4«л ПЛИЛтгrirt 4 1 *л молочнокислые молочгюкнслие+ Clostridium*

МОЛОЧ II OKI) СЛ Ц(? п Q t'T/l №11J бактерии+■ Clostridium +гнидостние+ +пшостние

Показатели ияктернн Clostridium -(-Clostridium азроби

ДНИ АНАЛИЗА

7 45 7 45 7 45 7 45 7 • 45

Летучие кислоты:

мг% 203,1 301,3 310,3 311,0 737,3 С82.3 214,5 682,2 11624! 1160,0

в том числи, %!

формнаг 5,2 ö,0 9.0 7,1 11,3 4.4 5.0 4,6 4,5 4,5

ацетат 92,7 90,7 72,0 92,4 80,1 01,3 92,7 94,3 90,5 80,5

прошшнат 2,1 4.3 W 0,0 5.0 ад 1,8 1,1 2,С 1,2

бутнрат 0,0 0,0 10,2 0,5 2,4 и 0,5 0,0 2,4 13,8

Общий азот, % от 3,0 3,7

. сухого вещества 4,6 - 5,4 -и 3,7 2,9 3,1 3,4 W ,

Белковин азот, % от

общего 51,1 52,0 53,0 52,5 50,1 49,8 49,9 50,0 51,8 50Д

Ашмныа аэог, мг.% 115,7 127.0 189,8 190,0 308,8 211,7 294,2 207,3 199,7 232.0

Азот аммиака, мг% 150,7 180,0 162,5 188,8 177,7 300,0 170,5 195,7 175,0 301,1

и

течение 1-й недели силосования у протеолнтическнх. Clostridium в присутствии молочнокислых бактерий, а в конце опыта— у клостридий в сочетании с гнилостными бактериями,-•Распад белков в силосе с Clostridium снижался в присутствии молочнокислых бактерий, но вновь усиливался при развитии гнилостных аэробов. Основную роль в катаболизме аминокислот и накоплении аммиака в силосе играют протеолитические клостридии, Развитие пхлриводнло к снижению содержания в силосе аспартата, трееннна, метношша и аргинина, а также глутамата, потери которого • связывали с активностью растительных ферментов {Hughes, 1970). ; .

Таким образом, выявлено-участие протеолнтическнх Clostridium в катаболизме как азотистых, так и сахаристых веществ в силосуемой массе бобовых. Данные.' бактерии участвуют в накоплении в силосе летучих кислот и спиртов. Видовая и штаммовая-варнабельность хода брожения Clostridium в разных условиях-и-,влияние на него ¡молочнокислых и гнилостных бактерий усложняют процесс распада Сахаров; в силосе, что расширяет понятие* сахарного.мпинмума при силосовании бобовых. Для подавления споровых анаэробов и клеверном силосе применения молочпо-кнелой закваски недостаточно. Дополнительно следует подвяливать зеленую массу для понижения активности вольт в сырье и применять химические консерванты. ■ " (

ВЫВОДЫ :

Результаты экспериментальных исследований биологических особенностей споровых анаэробов.рода Clostridium и их роли в процессах, силосования клевера позволили сделать следующие выводы: *

1. Протеолитические анаэробы, "рода. Clostridium обнару-' жены во всех изучавшихся производственных и лабораторных силосах в количестве до 5.105 клеток на 1 г сухого вещества; количество спор колебалось от 0 до 4.105. Численность протеолнтическнх Clostridium в силосе-не зависела or обсеменения ими исходного сырья. , ■ ..

2. Впервые из силоса на разных этапах силосования выделены протеолитические Clostridium, способные к активной трансформации белковых веществ: и идентифицированные как С1. sporogenes, Ol. subterminale (развивающиеся в начале процесса) и CI. acetobutylicum {развивающийся в конце силосования). 01. subtcrminalc из силоса выделен впервые.

3. Изучены физиологические • особенности • выделенных культур Clostridium. . Установлено,; что по протсолнтической активности клостридии из силоса практически равноценны аналогичным почвенным бактериям, но силосные клостридии отличались от.выделенных из других субстратов следующими

особенностямн: большей кнслотоустойчнвостью, способностью к усвоению более широкого спектра углеводов, более высоким содержанием ацетата и формната в составе летучих кислот — метаболитов глюкозы и меньшим образованием бутнрата, большей устойчивостью к содержанию в среде кислорода и перекиси водорода, выделяемой Lb, plantarum.

4. Изучено влияние рН, температуры и активности воды в среде на количество и состав продуктов брожения глюкозы у лротеолнтнческнх Clostridium, выделенных из снлосов. Установлено, что: при снижении уровня рН и активности воды общее количество летучих кислот снижается и в составе их возрастает содержание ацетата, количество н состав летучих кислот у данных бактерий при разных температурах культивирования определяется штаммовыми особенностями культур, Изучавшиеся клострнднп продуцировали спирты, в основном этанол, количество которых снижалось при подкисленин среды на 0,2—10%.

5. Протеолитнческая активность Clostridium варьировала от 23,9 иротеолнтических единиц (п. ед.) у CI. acetobutylicum до 27,8—38,2 п. ед. у CI. sporogenes и 36,6 п. ед. у CI. subterminale. При снижении рН среды опа понижалась на 3,4—14,2%. Clostridium, выделенные из снлоса, были способны к реакции Стикленда, продуктом которой у CI. sporogeties н CI. subterminale, кроме аммиака и ацетата, был формнат, а у CI. acetobutylicum — пропионат. При подкисленин среды ход реакции изменялся в сторону преимущественного образования ацетата.

6. Выявлена значительная видовая и штаммовая вариабельность Clostridium, определяющая характер взаимоотношений их с силосными бактериями в условиях совместного культивирования. Существенную роль для проявления этих особенностей играет буферность среды. В забуференной среде Lb. plantarum является комменсалом для некоторых штаммов CI. sporofienes и CI. acetobutylicum. В присутствии гнилостных аэробов возрастала обшая продукция кислот, в том числе ацетата и бутнрата.

7. Выявлено длительное развитие протеолитнческнх кло-стрндий в клеверных снлосах, сопровождающееся активным сбраживанием углеводов до летучих кислот, в основном ацетата, и разложением белков и аминокислот до аммиака и неи-дентифнцированных форм азота. Внесение молочнокислой закваски не предотвращало появления анаэробов и их спор, хотя и способствовало некоторому повышению качества корма.

8. Изучение развития протеолитнческнх клостридий и других бактерий в гнотобиотическнх снлосах показало, что в ходе силосования изменяются отношения бактерий внутри разных ассоциаций: в начале силосования максимум бутнрата иакап-

лиьали клостридии в сочетании с молочнокислыми бактериями, а в конце — клостридии в присутствии гнилостных аэро-"бов. Повышение буферности силосуемой массы клевера вследствие усиленного синтеза летучих кислот у гнилостных 'аэробов и анаэробов способствует стимуляции клостридий молочнокислыми бактериями н 'повороту процессов силосования в сторону гнилостных. : ■" '

" '9; Из результатов проведенных исследований следует, что ;внесение молочнокислой закваски в клеверную массу следует 'сочетать с подвяливанием сырья для снижения активности водьгв нем до уровня ниже А„ =0,955 н е применением известных химических- консервантов с целью подавления анаэробной микрофлоры. ■ , ■

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

На основании изучения физиологических особенностей культур протсолитических клостридий и развития их в обычных'и:гнотобиотическнх снлосах для сохранения зеленой мас-сы-высокобелковых бобовых культур целесообразно сочетать внесение, молочнокислой закваски с подвяливанием и химическим консёрвированнем силосуемой массы.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

-1:'Алешина Е. А., Гудков А. В., Перфильев Г. Д. Количественный учет споровых анаэробов рода С1оэи(1шгп в чистых культурах и в силосе. В сб.-Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии'и сыроделии. 1978, Ярославль, 102—103.

■ 2; Переверзева Г. И„ Алешина Е. А. Влияние молочнокислой закваски на развитие споровых анаэробов в клеверном силосе. VI съезд Всесоюзного микробиологического общества, Микроорганизмы и.продуктивность сельского хозяйства, т. 5, <1980, 90.; •

- -ч 3; Алешина Е. А. Анаэробная-протеолнтическая мнкрофло-•ра'силосов, Известия ТСХА, вып. 3, 1980, 181—184.

4: Перфильев Г. Д., Алешина Е. А. О взаимоотношениях споровых анаэробов с микрофлорой силоса в условиях совместного культивирования. ВИНИТИ, Депонированные рукописи, Естественные нточные науки, техника. 1980, № 9, (107). Справка № 8—19—3221.

Л 100888 18/11—82 г.

Объем 1 п. л.

Заказ 272, Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. Л. Тимирязева 127550,'Москва 11-550, Тимирязевская ул., 44