Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Математическое моделирование ферментативных реакций и основных энергетических процессов в мозге в норме и в условиях гипоксии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Математическое моделирование ферментативных реакций и основных энергетических процессов в мозге в норме и в условиях гипоксии"

СЛаТ-ИЗЕЕЕБУРТСШй ГССЭДА?СТВЕННШ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Мошкова Альбина Николаевна

Математическое моделирование ферментативных реакций и основных энергетических процессов в мозге в норме и в условиях гипоксии

03. 00. 04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкг-Летербург 1933

Работа выполнена на кафедре биохимии Нижегородского медицине кого института им. С. М. Кирова и на кафедре прикладной математики Нижегородского технического университета.

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор Хватова Е. М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

Маслова М. Н.

кандидат биологических наук, доцент Стефанов В. Е.

Ведущее учреждение; Институт Физиологии им. И. П. Павл ова РАН. Зашита состоится " ф/ " 1993 года в Р часов на

заседании Специализированного совета К 063.57.09 по присуждении ученой степени кандидата биологических наук в С. Петербургском государственном университете по адресу: 199034, С.Петербург, Университетская набережная, 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А. Ы. Горького С. Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " ^ " года

Ученый секретарь Специализированного совета А»Т- Малков

Среди общебиологических проблем кислородное голодание занимает особое положение, как универсальный фактор опасности для жизнедеятельности животного организма. При этом головной мозг является тем органом, который в первую очередь и в большей степени страдает от недостатка кислорода. Это связано с особенностями его окислительного метаболизма, высокой функциональной активностью и большими энергетическими потребностями. Несмотря на значительный феноменологический материал, описывавший функционально-метаболические нарушения, возникающие в мозге в условиях дефицита кислорода (Бар-бошова, 1969; Палладии, 1965; Дудченко, 1976; Лукьянова, 19781984; Хватова, 1975-1987; Benzi et al, 1978,1980; sisjo B.R. et al, 1971, 1972,1977,1980,1985; Ljunggren B. et al, 1974; Mela L.,

1979 и т.д.), остаются нерешенными вопросы оценки функциональной зависимости и прогнозирования разных показателей организма. Решению этих вопросов поможет математическое моделирование, которое даст возможность расчетным способом получить информацию об энергетическом состоянии мозга при минимальной экспериментальной работе в условиях, создающих экстремальную ситуацию для жизнедеятельности организма.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящего исследования является установление зависимостей между показателями энергетической характеристики мозга и прогнозирование его изменений при. нарушении кислородного режима. С этой целью в работе были выполнены следующие задачи:

1) дать количественную оценку функциональной зависимости между окислительными ферментами дыхательной цепи митохондрий при остро нарастающей барометрической гипоксии разной степени тяжести;

2) исследовать зависимость между скоростью фосфорилирования АДФ и концентрацией экзогенного АДФ при гипоксии разной тяжести и продолжительности и дать ей количественную оценку;

3) исследовать количественную зависимость между скоростью окислительного фосфорилирования митохондрий головного мозга и конечной концентрацией АТФ в состоянии гипоксии с разной экспозицией.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В ходе решения поставленных задач разработаны способы определения активности сукцинатдегндрогеназы в биологических объектах, активности цитохромоксидазы, содержание аденозинмонофосфата в ткани мозга, концентрации аденозинтрифосфата в мозге экспериментальных животных. Государственным комитетом по делам изобретений и ^открытий эти способы признаны изобретениями (заявка на ИЗО

н 3227638/28-13: полон, реш. от 12.12,80 г.; заявка на ИЗО N 3668824/28-14, полож. реш. от 01.12.83 г.; заявка на ИЗО N 3951427/28-14, полож. реш. от 02.09.85 г.; заявка на ИЗО N 4263142/28-146 полож. реш. от 15.06.87. Заявка N 4090540/14 от 14.07.87 г. "Способ определения эффективного количества тренировок к гипоксии" находится на рассмотрении в НИИГПЭ. Оформлено ходатайство на выдачу патента на разработанный способ.

Впервые подобраны функции, наилучшим образом приближающиеся к совокупности имеющихся эмпирических данных, характеризующих работу дыхательной цепи митохондрий, реакции окислительного форфорнлиро-вания и энергетическое состояние мозга животных при нарушении кислородного режима.

Функция, аппроксимирующая зависимость между активностями начального и конечного участков дыхательной цепи митохондрий мозга животных, позволяет прогнозировать сукцинатдегидрогеназную и цито-хромоксидазную активности по экспериментальной активности НАДН-дегидрогенази, а также определить вид зависимости (линейный, параболический, кубический) между ферментами дыхательной цепи митохондрий мозга животных с разной температурой тела, и влияние гипоксии на характер его изменений.

Впервые установлено, что вид зависимости скорости фосфорили-рования АДФ (АДФ/и от концентрации экзогенного АДФ, имеет классический гиперболический тип. Эта форма зависимости•не меняется от физиологического состояния организма.

Установлено, что зависимость между скоростью фосфорилирования АДФ (АДФ/с) и конечной концентрацией АТФ в ткани мозга имеет также гиперболический вид. Разные результаты экспериментальных данных АДФ/с и [АТФ] в зависимости от тяжести гипоксии и ее продолжительности объединены одной математической формулой. Этой функцией можно пользоваться для прогнозирования конечной концентрации АТФ в мозге животных в состоянии гипоксического воздействия разной продолжительности.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Установление математической зависимости между выбранными показателями дает возможность прогнозировать энергетическое состояние мозга в условиях гипоксического воздействия разной тяжести и продолжительности. Разработанные в ходе исследования способы определения ферментативной активности митохондриальной дыхательной цепи, а также концентрации АИФ и АТФ в мозге животных предназначены для экспериментальных лабораторий, изучающих проблему гипоксии мозга. Они позволяют получать информацию о метаболическом и энер-

гетическом состоянии мозга при экстремальных для жизнедеятельности организма физиологических состояниях, экономя время, животных н дорогостоящие реактивы.

АППРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Полученные результаты были представлены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции" (Пущино, 1981 г. >: на Всесоюзной конференции "Применение математических методов и ЭВМ в медико-биологических исследованиях" (Ленинград, 1982 г.); на Всесоюзной конференции 6-Я Межреспубликанской школы-семинара "Интерактивные системы" (Тбилиси, 1984); на Симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1986 г. ); на 10-й Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы "Фундаментальные достижения неПрохимни - медицине" (Горький, 1987 г.); на Всесоюзном симпозиуме "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино, 1990 г. ): на заседании Нижегородского отделения Российского биохимического общества (1992).

ПУБЛИКАЦИИ: По материалам исследования опубликовано 6 работ и получено 4 авторских свидетельства.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, заключения и выводов, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 240 машинописных страницах и иллюстрирована 40 рисунками и 79 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Методы исследования экспериментальных показателей

1) Определение фосфорилирующей активности митохондрий мозга полярографических методом.

Потребление кислорода митохондриальной суспензией регистрировали полярографическим методом. В качестве рабочего электрода применяли открытый платиновый электрод сферической формы, в качестве электрода сравнения - хлорсеребристый электрод. Объем полярографической ячейки - 1 мл. Среда инкубацпн имела состав: сахароза - 250 мкдоль; КН,Р0, - 20 мкцоль; ЭДТА -0,5 мкдоль; pH -7,4. В качест-

2 4 1

ве субстрата окисления использовали глутамат калия (15 мкцоль). Суспензия содержала 22,0 - 23,0 мг белка. Добавка АДФ осуществлялась до конечной концентрации 40,60,90,150,300 мкдоль. Регистрировался переход в состояние 3 - "активное состояние" и последующий переход в 4-е состояние - "состояние покоя". В качестве показателя скорости фосфорилирования АДФ использовался коэффициент АДФ/t -фосфорилирование АДФ в единицу времени. Скорость утилизации АДФ рассчитывалась в мкдолях АДФ /мг. б/сек. или нцолях АДФ/мг. б/мин.

2) Определение НАДН-дегидрогеназной активности.

НАДН: цитохром С оксиредуктазная активность определялась спектро-фотометрически по степени восстановления цитохрома С за счет окисления НАДН (Machler, 1955). Активность фермента выражали в мкдолях восстановленного цитохрома С на мг белка в минуту.

3) Определение сукцинатдегидрогеназной активности. Сукцннатдегидрогеназная активность (сукцинат: цитохромоксидоредук-таза) определялась спектрофотометрически по степени восстановления цитохрома С за счет окисления сукцината (Potter, 1942; Гулидова Г. Н. , Сорокина И. Н. , 1967). Активность фермента выражали в мкдолях восстановленного цитохрома С на мг белка в минуту.

4) Определение цитохромоксидазной активности. Цитохромоксидазную активность (цитохрои С: О2оксиредуктаза) определяли по скорости восстановленного цитохрома С (Hess et al., 1953; Гулидова Г. П. , Сорокина И. Н. , 1967). Активность фермента выражали в мкдолях окисленного цитохрома С на мг белка в минуту.

5) Определение содержания аденозинтрифосфата.

Содержание АТФ определяли методом колоночной хроматографии на эк-теола-целлвлозе в el - форме (Иванова Т. В., Рубель Д. Н. - Ж. эво-люц. биохимия и физиология, 1969, т. 5, с. 279-287). С колонки АТФ элвировалп 0,05 и раствором HCl. Затем колоночную концентрацию HCl доводили до 1,0 М. Оптическая плотность измерялась на спектрофотометре при длине волны 260 - 290 нм. Содержание АТФ выражалось в мкдолях на 1 г сырой ткани.

6) Выбор аппроксимирующей функции и методы подбора параметров. В качестве функций у = fix-, I), аппроксимирующих зависимость между выбранными показателями метаболических процессов в мозге, использовалась линейная у = а^х * а^ дробно-линейная у = - и

0 1

полином третьей степени (а) у = + Ь^х- " ,) + с (х - j)2 + d^x - j^.j)3 или (б) у = а0*3 + + + аз. Параметры

aQ, а[ функции у = aQx + at находились методом наименьших квадратов. Коэффициенты функции aQ, ai у - находились методом

О 1

последовательных приближений. Коэффициенты а , Ь , с , d полинома (а) рассчитывались методом интерполяции сплайнами. Коэффициенты полинома (б) находились методом наименьших квадратов.

7) Аппроксимация зависимости между изучаемыми параметрами системы с учетом изменения внешней среды.

При анализе числовых значений параметров функции у =

£(х,а^,а^.....а ) установлена их зависимость от условий внешней

среды, в которой находится изучаемая система. В свою очередь а- а.....а принимались за функции нового аргумента, характеризу-I

ющего состояние биологической системы. Рассматривались состояния системы, хараатеризующие условие эксперимента, как-то: степень разрежения атмосферного давления, время пребывания животного в условиях дефицита кислорода. Зависимость между ферментативной активность» дыхательной цепи митохондрий (НАДН-дг и СДГ; НАДН-дг и ЦО; СДГ и ЦО) в условиях разрежения атмосферного давления "Ь" разной степени тяжести аппроксимировалась функцией (1)

= Р0(Ь)*3 + р,(Ь)х2 + <р2тх + <р3(Ь), где а 1 = <р{1М (1 = 0,1,2,3) имели форму:

(Л1),

(ь) ^(Л) = (Л2)1 + (ЛО^-СОЭ —или (Ь') ^(Ь) = (Л2)1 + (ЛО^-соз /1.(д1) •

Зависимость между скоростью фосфорилирования АДФ и конечной концентрацией АТФ в условиях гипоксии разной экспозиции с принимала вид:

(2) у(х,с)

( Ох- + р ( с) и (2') у(г, с) = 1ро(с)х + (р (О,

(Л1 )

где а1 = »»(с) = (л2)( + (дО)|-сог—^-А С-лО> 1. (Л),, (л2)( находились из системы трансцендентных уравнений, которая решалась итерационными методами (Калиткин Н. Н. -Численные методы, 1973, гл.6).

Зависимость между скоростью окислительного фосфорилирования (АДФ/с) и концентрацией добавленного АДФ аппроксимировалась функцией у = —- (3). Соответствие выбранных функций

О 1

(1),(2), (2'), (3) поставленным в работе задачам доказывалось сравнением аналитически рассчитанного значения (у), характеризующего признак выходного объекта системы с экспериментально установленным. Рассматривалась относительная ошибка формулы. В тех экспериментальных ситуациях, где относительная ошибка формулы не превышала 20%, мы считали, что выбранные функции хорошо описывают зависимость между входными и выходными параметрами исследуемой системы. Прогностическая способность подобранной функции проверялась сравнением аналитического расчета с литературными данными или дополнительно поставленным экспериментом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУЖДЕНИЕ.

мнтохсжлрчэльноП дыхательно!! иапл а физиологического состояния организма. Изучалась зависимость между ферментативной активностью дыхательной цепи

митохондрий начального и конечного ее участков у животных в нормальной температурой тела и охлажденных до Н0°С в условиях нарастающего дефицита кислорода (t = 37°С, атм. давл. 760,310,270,230 мм рт. ст. ; t = 20°С, атм. давл. 760,310,230,217,170,8 143,5 мм рт. ст. ).

1.1. Зависимость между НАДН-дегидрогеназноЯ и сукцинатдегид-рогеназной активностью митохондрий мозга у исследуемых животных.

Функции (а) у = а( + Ъ((х - х ) + - хt j)2 + c^tx -~ или (б) у = aQx2 + а^хг + агх + аз использовались при описании зависимых изменений активности ферментов начального участка дыхательной цепи митохондрий НАДН-дг (х) и СДГ (у). Это дало возможность сравнить результаты вычислений и показать, какой вид аппроксимирующей функции лучше применим для разработки поставленной задачи. Коэффициенты функции (а) для каждой группы животных находили с точностью до 10~2 в каждом интервале экспериментальных данных х > интерполяцией сплайнами. Установлено, что функция (а) хорошо работает в условиях приведенных экспериментов, так как относительная погрешность расчетного значения активности сукцинат-дегидрогеназы была меньше 20'Л. Применение формулы (а) с целью прогнозирования активности сукцинатдегидрогеназы при атмосферном давлении, выходящем за пределы экспериментальных, сопряжено с трудностями. Практически желательно иметь приближенную формулу у = = fix, а), пригодную для большего отрезка a s х s ь и различных экспериментальных условий. С этой целью использовали для аппроксимации зависимости НАДН-дг U) - СДГ (у) многочлен вида (б). Учитывая, что ао, а^. ¿^ меняются от величины атмосферного давления, их считали функциями нового аргумента "h" - степени разрежения атмосферы: ac=f>Q(h); a^^th); aa=^2(h); a^pjh). Графическая иллюстрация а=<р^Ь) (i = 0,1,2,3) показала, что tp^h) имеют достаточно сложное аналитическое выражение, содержащее тригонометрическое действие. В качестве <р lh) взяли выражение (в)

(Л1) '

<р til) = (А2) + (JO) -cos—г— для животных с t = 37°С и (в')

• 1 I 11 ^ га

v^h) = (J2)i + (Jo) (- cos ^ - для охлажденных животных (i =

0,1,2.3), где (JO)^ (Jllj, (л2)( - коэффициенты функций #>0(h), ip,(h), i>2('i). "Л" - атмосферное давление, выраженное в мм

рт. ст. Коэффициенты (л0)(, () ^ (J2) (i = 0,1,2,3) для (в) находились методом последовательных приближений, для (в') - методом Ньютона, тт = 3.14.

Таким образец, функция, аппроксимирующая зависимость между активностью ферментов НАДН-дг и СДГ дыхательной цепи митохондрий мозга животных с разной температурой тела при любом допустимом для

жизнедеятельности организма атмосферном давлении преобразовывалась в формулу (1) y(x,h) = v>o(Л)х-3 + f>x{h)x2 + р2(h)x + í>3(íi). Адекватность модели (1) поставленной задаче доказывалась расчетом сук-цинатдегидрогеназной активности по формуле (1) и сравнением результата с экспериментальной активностью СДГ. Аналитически рассчитанные активности СДГ для животных с t = =37°С и t=20°C отличались

п т

от экспериментальных меньше, чем на 20У.. Использование функции (1) для расчета сукцинатдегидрогеназной активности в условиях разрежения атмосферы, допустимой для жизнедеятельности организма, выходящих за пределы рассмотренной, проверялось дополнительным экспериментом для животных с t = 37°С в условиях атмосферного давления 230 мм рт. ст., для охлажденных (сд20°С) - в условиях атмосферного давления 143,5 мм рт. ст. Аналитические значения активности СДГ оказались'В этих случаях сравнимы с экспериментальными, и относительная ошибка формулы была меньше 20%.

Таким образом, функции (1) y(x,h) = í>o(íj)x3 + ^(Л)*2 +

tpz(h)x + tp^(h), полученная преобразованием многочлена (б) у = аох3

+ а(х2 + а2* + аз, и используемая для описания зависимости НАДН-дг

(х) и СДГ (у) в мозге животных с нормальной температурой тела и

охлажденных до 20°С в условиях гнпобарической гипоксии, наилучшим

образом связывала х и у. По сравнению с многочленом (а) у = +

Ь (х - х- ) + с (х - х )2,+ d (х - - лт )3 она не ограничена i i-! i 1-1 j - i 1-1 г

по своему действию.

1.2. Зависимость между НАДН-дегидрогеназной и. цитохромокси-дазной активностью митохондрий мозга у исследуемых животных.

Зависимость между активностью НАДН-дг (х) и Ц0 (у) в мозге животных с нормальной температурой тела и охлажденных до 20°С рассматривалась в виде у = aQx3 + а^хг + а2х + аз с учетом предыдущих исследований. Изменение значений ао, a¡t а аз от условий опыта в 2-х группах животных дало возможность рассматривать их как функции нового аргумента, характеризующего физиологическое состояние животного с разной температурой тела, которое зависело от степени разрежения атмосферы "h", т.е. а о=ро(Ы; а^^Ш; a2=v> (h): a =p3(h), где "h" выражено в мм рт. ст. Графическая иллюстрация зависимости р((Ы (i = 0,1,2,3) подтвердила правильность использования тригонометрического выражения при записи (в) р íh) = (^2) +

(л1) 1 1

(лО) ('cos—jj—. Значения коэффициентов (лО)^ (Л)^ (A2)t найдены

методом итерации Функция (II y(.x,h) = <Po(h)x3 + ц> (Ji)x2 + р (h)x + <P3(fi) , аппроксимирующая зависимость между НАДН-дегидрогеназной и цитохромоксидазной активностью в мозге животных в условиях разрежения атмосферы, соответствовала пocтaвлeннoü задаче. Аналитически

рассчитанная активность Ц0 в условиях экспериментального давления отличалась от опытных показателей меньше, чем на 20%. Была проведена попытка рассчитать цитохромоксидазную активность в мозге животных с разной температурой тела в условиях атмосферного давления 230 мм рт. ст. и=37°С) и 143,5 мм рт. ст. и=20°С), выходящего за пределы уже рассмотренных гипоксических воздействии. Для подтверждения расчета находили активность ЦО экспериментально. Активность Ц0, в этом случае рассчитанная по формуле (1), сравнима с экспериментальной. Максимальная относительная ошибка формулы для животных с с^ = 37°С в условиях атмосферного давления 230 мм рт. ст. составляла 9, 737., для охлажденных до 20°С в условиях атмосферного давления 143,5 мм рт. ст. - 11,4%. В таблице представлены результаты расчета активности цитохромоксидазы в мозге животных с с =37 С в условиях атмосферного давления 230 мм рт. ст.

Таблица

Активность ЦО в мозге животных с ^37°С экспериментально установленная и рассчитанная по формуле (1) в условиях

атмосферного давления 230 мм рт. ст.

Эксперимент, активность НАДН-дг мкдоль. цит. с/мг б/мин. Цнтохромоксидазная активность мкцоль цит. с/мг б/мин Относительная ошибка формулы

эксперимент расчет

13,7 36, 4 36,6 0, 05%

39, 8 8, 04%

19,5 36, 4 37, 95 4, 3%

39,8 4. 65%

15,7 31,2 ' 31,27 0. 24%

28,5 9, 73%

20. 8 40,3 40, 42 0, 3%

39,4 2, 84%

Из представленных материалов следует, что функция (1) достаточно точно аппроксимирует зависимость цитохромоксидазной активности от НАДН-дегидрогеназной в мозге животных с разной температурой тела при нарастающем дефиците кислорода.

1.3. Зависимость между сукиинатпегидрогеназной ц цитохромок-сидазной активностью нитокондриП мозга у исследуемых животных,

В условиях кислородной недостаточности для поддержания элект-роннотранспортной функции дыхательной цепи митохондрий мозга возможно использование других метаболических потоков для снабжения дыхательной цепи восстановительными эквивалентами. Одним из них может быть сукцинатдегидрогеназный путь окисления.

Проведена попытка использовать кубический, многочлен у = а х-3+

+ а+ а^х + аз для описания зависимости между сукцинатдегидро-геназной и цитохромоксидазной активностями дыхательной митохондри-альной цепи мозга тех же групп животных в состоянии гипоксии. Согласно поставленной математической задаче за независимую переменную х принималась активность СДГ, а функцией у являлась активность цитохромоксидазы. Найденные методом наименьших квадратов коэффициенты ао, а , аг, аз принимали определенные чисповые значения для групп животных с нормальной температурой тела (с=37°С) и охлажден, ных до 20°С в условиях разрежения атмосферного давления. Поскольку ао, а , а2, меняли свое значение в зависимости от кислородного режима, в условиях которого находились животные, их стали считать функциями аргумента Л - атмосферного давления и обозначать так же, как и в разделе 1.2 (Р (Л), т.е. ад=рд(Л); а^^Сй); а2=р2(Ы; а=р(М. Графическое изображение зависимостей ^(Ь) (1 = 0,1,2,3) в прямоугольной системе координат ХОУ для групп животных с разной температрой тела подсказала несколько иной вид <р Ш, отличный от функции' (в) в разделе 1.2, а именно, (в') р (й) = (Л2) +■ (до)1-соэ ¡^^ , где (ДО),, (Д1),, (Л2)( по-прежнему коэффициенты функций р (Ы, гт - постоянная величина, равная 3,14. Для нахождения коэффициентов (ДО) , (А),, (Л2)) составлялась система трансцендентных уравнений, которая решалась на ЭВМ типа ЕС-1020, ЕС-1022 с точностью до 10"г 10"6 методом деления отрезка пополам.

Таким образом, функция, аппроксимирующая зависимость цитохро-моксидазной активности от сукцинатдегидрогеназной в мозге животных с разной температурой тела в условиях нарастающего дефицита кислорода принимала вид:

(1) ус*,Л) = р0(Л)*3 + <р,(Л)*г + <Рг{Ь)Х + 9з(Ь)

Сравнения аналитически рассчитанной активности ЦО с экспериментальным значением в интервале атмосферного давления 760-270 мм рт. ст. для животных с с=37°С и 760-170,8 мм рт. ст. для охлажденных животных показали, что функция (1) хорошо аппроксимирует зависимость между выбранными ферментами. Относительная ошибка формулы в этих условиях была меньше 20%.

Прогностическую способность фукнцпи (1) проверяли в условиях атмосферного давления, выходящих за пределы уже рассмотренных. С этой целью сравнивали расчет цитохромоксидазной активности с дополнительно поставленным экспериментом', для животных с с=37°С в условиях атмосферного давления 230 мм рт.ст. ; для охлажденных до 20°С - 143,5 мм рт. ст. Результаты сравнения отражались в величине относительной ошибки формулы (1) (максимальная 20°<), которая пока-

зывала, что функция (1) хорошо объединяет экспериментальные активности изучаемых ферментов в этих условиях.

Таким образом, зависимость между активностями ферментов начального участка дыхательной цепи митохондрий и ферментов, занимающих разную позиции в ДЦ, аппроксимируется единой функцией вида (1). Она дает небольшую относительную ошибку аналитически рассчитанной активности соответствующих ферментов по сравнению с экспериментально установленной в разных условиях кислородного голодания. следовательно, установление математической зависимости между активностями НАДН-дг, СДГ, ЦО позволяет расчетным способом получить более полную информацию о работе дыхательной митохондриальной цепи в условиях нарушения кислородного режима допустимого для жизнедеятельности организма при минимальной экспериментальной работе.

2. Исследование зависимости между показателями окислительного фосфорилирования и концентрацией нуклеотидов а мозге, животных.

2.1. Анализ зависимости скорости-фосфорилирования АДФ от концентрации добавленного АДФ.

Зависимость между выбранными показателями изучалась в группе интактных и в группе животных в условиях гипоксического воздействия разной тяжести и продолжительности (атм. давл. 217 мм рт. ст. эксп. 10 и 60 минут; атм. давл. 170, 8 мм рт. ст. эксп. до 10 минут).

Согласно поставленной математической задаче за независимую переменную х принималась концентрация добавленного АДФ; функцией у являлся показатель АДФ/с. Построенные точки экспериментальных данных {*, у(> в прямоугольной системе координат хорошо объединялись гиперболой, свидетельствующей о классическом типе кинетики реакции, характеризующей зависимость [АДФ] (х) —> АДФ/с (у). В качестве аппроксимирующей функции в этом случае рассматривалась дробно-линейная у = а хх + а (3). Коэффициенты а[ функции рассчиты-о 1

вались методом наименьших квадратов и для каждого эксперимента принимали разные числовые значения. Чтобы доказать соответствии функции (3) поставленной задаче, был выполнен расчет АДФ/с для разной экспериментальной концентрации АДФ и сравнение результатов с экспериментально полученными показателями АДФ/«:. Максимальная ошибка формулы оказалась равной 5,5%. Проверяя прогностическую способность функции (3), был выполнен расчет скорости окислительного фосфорилирования, когда концентрация добавленного АДФ выходит за пределы экспериментальной и меняется в интервале 400-1 ООО мкдоль с шагом 100 мкмоль. Установлено, что расчетные величины показателя АДФ/с при больших концентрациях АДФ мало меняются и стремятся к некоторой постоянной величине. По .определению какси-

мальной скорости реакции, известной из теории ферментативной кинетики, эту постоянную величину, к которой стремится АДФ/с при насыщавших концентрациях АДФ /[АДФ] —» »/, можно считать максимальной скоростью окислительного фосфорилирования. Пользуясь формулой (3) можно найти максимальную скорость фосфорилирования АДФ//ддф следующим образом:

АДФ/г = г. С АДФ 1 = х; Ут = У..х = 11» ^ПГ^ -Ь КДДф = -1-.

и ту концентрацию добавленного АДФ (х), при которой показатель

АДФ/с (у) равен половине максимальной скорости фосфорилирования

у

АДФ. Для этого надо найти х из уравнения: = а хх+ ■ Отсюда

О 1

а

х = ^ . Из теории ферментативной кинетики известно, что величина

о

Михаэлиса-Ментен численно будет соответствовать той концентрации субстрата, при которой скорость реакций составляет половину максимальной величины, если зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата имеет гиперболический характер. Следова-а.

тельно, равенство = — , определяющее концентрацию добавленного

о

АДФ, при которой показатель АДФ/с составляет половину максимальной

скорости фосфорилирования АДФ, будет соответствовать к , и его

. - * а

можно использовать для определения кш следующим образом: кл = .

о

Таким образом, применение математических методов обработки экспериментальных^показателей процесса окислительного фосфорилирования показало, что зависимость АДФ/с от концентрации добавленного. АДФ имеет классический гиперболический тип, и дробно-линейная функция вида у = хорошо аппроксимирует эту зависимость. Ги-0 1

перболический характер зависимости АДФ/с от [АДФ] сохраняется при действии гипоксии разной тяжести и продолжительности. Функцией (3) можно пользоваться при нахождении максимальной скорости фосфорилирования (Уддф) и коэффициента Михаэлиса-Ментен к^ при разных физиологических состояниях организма животного.

2.2. Зависимость концентрации АТФ в ткани мозга от скорости фосфорилирования АДФ.

Для построения этой зависимости использовались экспериментальные данные АДФ/с и [АТФ] интактных животных и в условиях разрежения атмосферного давления 310 и 270 ми рт. ст. с разной экспозицией (атм. давл. 310 мм рт. ст. эксп. 30, 60, 240, 480мин. ; атм. давл. 270 мм рт. ст. эксп. 15. 30, 60, 240 мин. ). За независимую переменную * .принимались значения показателей АДФ/с, а функцией у являлась кон-

центрация АТФ. Геометрически выраженная зависимость между х и у рассматривалась в 2-х формах: простой (прямая) и в более сложной (гипербола). Исходя из этого, для описания зависимости АДФ/t (х)

— [АТФ] (у) использовалась линейная у = аох + и дробно линейная у = а х + а ФУНКЧИИ- Анализируя работу линейной функции, было

О 1

установлено, что приведенная к виду (2') + Р^'» r*e с

- время пребывания животных в состоянии Гипоксии, она не может быть использована с целью прогнозирования содержания АТФ в мозге животных в условиях гипоксического воздействия разной экспозицией, т.к. расчетное значение (АТФ) не всегда сопоставимо с экспериментальными, и ошибка расчета превышает 20%. Была проанализирована работа дробно-линейной функции у = ^ а , используемой для

О 1

аппроксимации зависимости между АДФ/t (х) и [АТФ] (у) в этих условиях. Коэффициенты дробно-линейной функции aQ, at находили методом итерации для каждой экспозиции отдельно. Установлено, что они меняли свои значения в зависимости от экспозиции и являлись функциями времени t пребывания животных в состоянии гипоксии, т.е. p,(t)

(i = 0,1), аналитическое выражение которых рассматривалось в.виде

(л1)

р (t) = (л2) t + UOJj-cos—. Коэффициенты (лО)^ (л1)(, (л2)1( функций p(t) находились методом последовательных приближений. Таким образом, дробно-линейная функция принимала вид (2) Ч> (t)x + р (t) ' Соответствие формулы (2) поставленной задаче проверялось расчетом конечной концентрации-АТФ при атмосферном давлении 310 и 270 мм рт. ст. в пределах экспериментальной экспозиции. При этом интервал изменения скорости фосфорилирования АДФ задавался теоретически несколько шире экспериментального. Расчетные значения [АТФ] были сопоставимы с экспериментальными, и максимальная ошибка формулы была меньше 20'/,. С цельо проверки прогностической способности функции (2) был выполнен аналитический расчет концентрации АТФ при атмосферном'давлении 270 мм рт. ст. при экспозиции 240 минут, а достоверность результата проверена дополнительно поставленным экспериментом. Рассчитанные по формуле (2) концентрации АТФ оказались сопоставимы с экспериментальными, и относительная ошибка составляла 0, 5-7, 97.. Был выполнен расчет концентрации АТФ в условиях атмосферного давления 310 мм рт. ст. при экспозиции 90, 120,150 минут, когда скорость фосфорилирования задавалась теоретически. Достоверность представленных результатов доказывалась экспериментальными данными других авторов. Получилось, что расчетные значения [АТФ] сопоставимы со средними данными Баева и Друниной 1931 г. при экспозиции 1,5-2,0 часа при "высоте" 7000 метров.

Таким образом, анализ зависимости между показателем АДФ/г и конечной концентрацией АТФ показал, что аппроксимация зависимости в более сложном виде (2) точнее по сравнение с функцией (2') у(х, О = р0(с)х * р (с). При расчете и прогнозировании концентрации АТФ в мозге животных при атмосферном давлении 310 и 270 мм рт. ст. с разной экспозицией относительная ошибка формулы (2) меньше по сравнению с (2').

вышы

1) Подобраны функции, наилучшим образом приближающиеся к совокупности эмпирических данных, характеризующих работу дыхательной цепи митохондрий мозга, реакци» окислительного фосфорилирования и энергетическое состояние мозга животных при нарушении кислородного режима.

2) Зависимость между ферментами начального и конечного участков дыхательной митоондриальной цепи мозга животных аппроксимируется функцией у(х,Ь) = (ро(Л)х3 + ч>1(Ь)х2 + /р2Ф)х + к> (Л), вид которой не менялся ни от степени тяжести разрежения атмосферы Л. ни от температуры тела экспериментальных животных. Функция позволяет прогнозировать сукцинатдегидрогеназную и цитохромоксидазную активность по экспериментальной активности НАДН-дегидрогеназы, а также определить вид зависимости (линейный, параболический, кубический) между ферментами дыхательной" цепи митохондрий мозга животных с разной температурой тела, и влияние гипоксии разной степени тяжести на характер его изменений.

3) Установлейо, что связь между парами ферментов параболическая или кубическая. С усилением тяжести гипоксического воздействия вид зависимости между ферментами начального и конечного участка дыхательной цепи одинаковый. У животных с нормальной температурой тела он - кубический, в группе охлажденных до 20°С - более простой -параболический.

4) Определен вид зависимости скорости фосфорилирования АДФ(АДФ/с)от концентрации экзогенного АДФ, имевший классический гиперболический тип, который аппроксимируется дробно-линейной функцией вида у = а х + а • Эта форма зависимости не меняется от физиологического

О 1

состояния организма.

5) Функция у = дает возможность установить максимальную

О 1

скорость фосфорилирования АДФ /^ддф/ и значения коэффициента Миха-элиса-Ыентен к .

6) Зависимость между скоростью фосфорилирования АЛФ/АДФА/ и конечной концентрацией АТФ в ткани мозга имеет гиперболический вид. Разные результаты экспериментальных данных АДФ/с (х) и [АТФ] (у) в

зависимости от тяжести гипоксии и ее продолжительности объединены

одной математической формулой у(х, t) = (с)х*+ v (С) •

0 1

7) Функцией у(x-, t) = у (с)х + р 1с) ммно пользоваться для прогнозирования конечной концентрации АТФ в мозге животных в состоянии

гипоксического воздействия разной продолжительности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мошкова А. Н., Хватова Е. М., Семенова Т. С. Математическая оценка ферментативных взаимоотношений в митохондриях ( мозга. Укр. биохим. к,, 1982, т. 54, N5, с. 574-577.

2. Крылова Т. В.. Ношкова А. Н. Разработка пакета прикладных программ с интерактивным доступом для системно-функциональных исследований в биохимии. - В сб. Межреспубл. школы-семинара "Интерактивные системы" "Мецниереба". - Тбилиси, 1984, - 183 с.

3. Мошкова А. Н. , Галкин В. М., Семенова Т. С. Способ определения активности сукцннатдегидрогеназы. - Аннотир. прогр. межинст. конф. изобретателей и рационализаторов 6 области медицины. ГИТО, Горький. 1985, - 15 с.

4. Миронова Г. В., Сндоркина А. Н. , Мошкова А. Н. Роль аденозинтри-фосфата в оценке повышения устойчивости мозга к экспериментальным условиям кислородного голодания. - Тезисы докл. 10-й Всесо-юзн.конф. "Фундаментальные достижения нейрохимии - медицине", Горький, 1987, с. 196-197.

5. Самарцев В. Н., Загоскин П. П., Мошкова А. Н. Влияние гипобаричес-кой гипоксии на характер регуляции АДФ и малатом скорости

. окислительного фосфорилирования митохондрий мозга. - Тезисы Всесоюзн. симп. "Физиология и биоэнергетика гипоксии", - Пушино, 1990, -19 с.

6. Мошкова А. Н. Исследование зависимости скорости фосфорилирования АДФ от концентрации экзогенного АДФ при гипоксии разной тяжести и продолжительности. - В сб.: Гипоксия и окислительные процессы. - Н.Новгород, 1992, с. 83-92.

7. А. С. СССР N 983542 МНИ С01 К 33/50. Способ определения активности сукцннатдегидрогеназы в биологических объектах. Нижегород. .мед. нн-т; авт. изобр. В.М.Галкин. . Е. М. Хватова, А. Н. Мошкова, Т.С. Семенова - 12.12. 80, N 3227638/28-13; Опубл. в Б. И., 1982, N 47.

8. A.C. СССР N 1250950 МКИ COI N 33/48. Способ определения активности цитохромоксидазы. Нижегород. мед. ин-т; авт. изобр. E.H. Хватова, В.М.Галкин, А. Н. Мошкова, Т.С.Семенова - 01.12.83.

. N 3668324/23-14; Опубл. в Б. И., 1986, N 30. -

9. А. С. СССР П 1302198 МКИ COI Н 33/48. Способ определения адезшшонофосфата а ткани мозга. Нижегород. мед. ин-т; авт. изобр. Е. Н. Хватова, В.М.Галкин, А. Н. Мошкова, Г.В.Миронова. А. Н. Сидор-кина - 02.09.85. м 3951427/28-14; Опубл. в Б. И., 1987, м 13.

10. А. С. СССР N 1549924МКИ COI N 33/48. Способ определения адезнн-трифосфата в мозге экспериментальных животных. Нижегород. мед.ин-т; Нижегород. технический университет; авт. изобр. Е. М. Хватова, В. М. Галкин, А. Н. Мошкова, Е. Н. Шуматова, Г. В. Миронова, А. Н. Сидоркина -15.06.87, N 4263142/28-14; Опубл. в Б. И. , 1990, М 10.