Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гипоксического прекондиционирования и нанокомпозитных препаратов на развитие адаптивной реакции у животных

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипоксического прекондиционирования и нанокомпозитных препаратов на развитие адаптивной реакции у животных"

На правах рукописи

МУРАЧ ЕЛЕНА ИВАНОВНА

ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ И НАНОКОМПОЗИТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА РАЗВИТИЕ АДАПТИВНОЙ РЕАКЦИИ У ЖИВОТНЫХ

03.03.01- физиология

005535752

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 4 ОКТ 2013

Нижний Новгород - 2013

005535752

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России на кафедре биохимии им. Г.Я. Городисской.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ерлыкина Елена Ивановна

Официальные оппоненты: Пахмутов Игорь Аркадьевич

Доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, профессор кафедры анатомии, фармакологии и патофизиологии сельскохозяйственных животных

Самарцев Виктор Николаевич

Доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Марийский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, профессор кафедры биохимии и физиологии

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный педагогический университет имени Козьмы Минина» Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Н. Новгород

Защита состоится: «12 ноября» 2013г в 12°° часов на заседании диссертационного совета Д 220.047.01 при ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 603107, Н.Новгород, пр-т Гагарина, 97.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия».

Автореферат разослан «11» октября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета п ~ Иващенко М.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Изучение молекулярных механизмов адаптации к гипоксии является важным условием для разработки эффективных методов предупреждения и коррекции гипоксических изменений (Болдырев А.А., 2003; Лукьянова Л.Д., 2011). Адаптация к гипоксии — это системная ответная реакция организма, направленная на формирование механизмов, способствующих поддержанию и сохранению кислородного гомеостаза в условиях дефицита кислорода (Меерсон Ф.З., 1993). При этом происходит мобилизация регуляторных центров дыхательной, сердечнососудистой систем, транспорта кислорода, а так же внутриклеточных механизмов, связанных с синтезом энергии (Агаджанян Н.А. и др., 1970; Гаркави Л.Х. и др., 1998,2003).

Повысить резистентность организма к дефициту кислорода в настоящее время можно разными путями, в том числе применением методов прекондиционирования, либо с помощью использования препаратов адаптогенного действия.

Установлено, что даже короткий период слабого, неповреждающего гипоксического воздействия приводит к увеличению переносимости последующего отсроченного, более тяжелого воздействия гипоксии - эффект прекондиционирования (Коваленко Е.А., 1993; Xi L. et al., 2009). В данной работе использовался метод интервального гипоксического прекондиционирования, который зарекомендовал себя как наиболее устойчивый и дающий положительные результаты (Якобсон Л.И. и др., 1992; Хватова Е.М. и др., 2005; Самойленкова Н.С. и др., 2008; Лукьянова Л.Д. и др., 2009; Durukan A. et al., 2010).

Применение гипоксии в качестве адаптирующего фактора поднимает ряд вопросов, наиболее актуальными из которых являются: особенности механизмов положительного и отрицательного действия гипоксии, сроки формирования адаптационных признаков и тканеспецифические особенности устойчивости к действию гипоксии. Механизмы формирования срочной и долговременной адаптации к гипоксии различны и зависят от степени гипоксического воздействия на организм (Pucar D. et al., 2001; Vlasov T.D. et al., 2005; Лукьянова Л.Д. и др., 2009; Мошкова А.Н. и др., 2010). Экспериментальное определение критерия режима тренировки следует рассматривать как необходимый этап для использования адаптации в сельскохозяйственной практике и практической медицине.

Увеличить резистентность организма к дефициту кислорода можно не только за счет тренировок, но и путем введения адаптогенов. Адаптогены - вещества, способные переводить организм в состояние неспецифически повышенной сопротивляемости (Яременко К.В., 2007). Известно, что классические химически синтезируемые антигипоксанты имеют кратковременное действие и различные побочные эффекты (Копцов C.B. и др., 2002; Оковитый C.B. и др., 2005). В связи с этим актуальным является разработка натуральных адаптогенов с полифункциональными свойствами.

Несомненный интерес в этом направлении представляет многокомпонентной наноструктурированный комплекс «хитозан-золото-пчелиный яд», разработанный на кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского. В настоящее время имеются лишь

немногочисленные исследования, посвященные изучению адаптогенных эффектов многокомпонентной наноструктурированной системы «хитозан-золото-пчелиный яд» в условиях ионизирующей радиации и гипобарической гипоксии (Esumi К. et al., 2003; Корягин А.С. и др., 2006; Коновалова О.И., 2007; Таламанова М.Н., и др., 2010; Ешкова О.Ю. и др., 2012). Изучения влияния данного препарата на окислительные реакции организма в целом и его антигипоксического действия на наиболее чувствительный к дефициту кислорода орган - головной мозг не проводилось, что также предполагает актуальность исследований.

Большой научный интерес вызывают также антиоксиданты природного происхождения и возможность их использования в качестве антигипоксантов. Дигидрокверцетин (ДГК, таксифолин) - природный биофлаваноид растительного происхождения считают одним из наиболее значимых антиоксидантов, превосходящих по фармакобиологической активности многие другие биополимеры (Теселкин Ю.О. и др., 1996; Areias F.M. et al., 2001; Накусов Т.Т. и др., 2005; Kostyuk V.A. et al., 2007). Однако применимость ДГК ограничивается его низкой растворимостью в водных средах и связанной с этим пониженной способностью проникать в кровь и клетки (Pozharitskaya O.N. et al., 2009). На кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского для улучшения проникающей способности ДГК разработали соединение дигидрокверцетина с хитозаном - биополимером, обладающим биосовместимостью и биоразлагаемостью (Скрябин К.Г., 2002; Dash М. et al., 2011). Исследований адаптогенного действия гидрогелей хитозана с дигидрокверцетином не проводилось, что также определяет актуальность данной проблемы.

Цель и задачи исследования

Цель работы - изучение влияния интервального гипоксического прекондиционирования и наноструктурированных адаптогенов на развитие адаптивной реакции у животных. Основные задачи исследования

1. Изучить развитие адаптивных реакций у крыс при использовании различных сроков прекондиционирования по состоянию свободнорадикального окисления (СРО) и окислительной модификации белков (ОМБ), а также по некоторым показателям окисления глюкозы в мозге и крови крыс.

2. Установить возникновение резистентности к тяжелой птобаркческон гипоксии у животных с разными сроками прекондиционирования.

3. Изучить влияние на окислительные процессы головного мозга и крови адаптогенов в составе золотосодержащих нанокомпозитов при предварительном курсовом пероральном применении в условиях острой гипоксии.

4. Исследовать действие гидрогелей хитозана с дигидрокверцетином на энергетический обмен и их антиоксидантные свойства в условиях моделирования тяжелой формы гипоксии.

Научная новизна исследования

Выявлены особенности течения окислительных процессов в мозге и крови в динамике развития адаптивных реакций у крыс при использовании различных сроков прекондиционирования.

Впервые установлено поэтапное изменение активности свободнорадикальных реакций при повышении устойчивости к гипоксии. Дана субстратная и ферментативная характеристика окислительного метаболизма глюкозы на разных сроках прекондиционирования.

Выработаны критерии повышения устойчивости организма к недостатку кислорода. Показано перераспределение интенсивности процессов окисления при развитии адаптогенного эффекта в зависимости от продолжительности тренировочного режима.

Показано, что нейронспецифическая енолаза (НСЕ) может служить прогностическим критерием развития устойчивости головного мозга к дефициту кислорода.

Впервые выявлено, что предварительное пероральное курсовое введение животным нанокомплекса «Хитозан-золото-пчелиный яд» в условиях гипобарической гипоксии сопровождается снижением интенсивности свободнорадикальных процессов как в крови, так и в головном мозге. Установлено что пероральное применение нанокомплекса «Хитозан-золото-пчелиный яд» нормализует процессы окисления глюкозы в условиях гипоксии.

Впервые установлено, что профилактическое применение комплексного препарата «Хитозан-дегидрокверцетин» приводит к развитию адаптации организма в условиях кислородной недостаточности. Данный препарат проявляет как антиоксидантное, так и ярко выраженное антигипоксическое действие, нормализуя процессы энергетического обмена. Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание молекулярных и физиологических механизмов развития адаптации и поддержания постоянства внутренней среды организма в условиях дефицита кислорода. Совокупность полученных экспериментальных данных выявляет физиолого-биохимические особенности протекания окислительных процессов в мозге и крови на различных этапах развития устойчивости к гипоксии.

Полученные данные позволяют оценить роль свободнорадикальных процессов, окислительной модификации белков, субстратных и ферментативных характеристик в отношении механизмов развития адаптации наиболее чувствительного к гипоксии органа - головного мозга и организма в целом.

Выявленные адаптогенные свойства нанокомплекса «Хитозан-золото-пчелиный яд» и комплексного препарата «Хитозан-дегидрокверцетин» в условиях гипобарической гипоксии дополняют и расширяют знания о молекулярных механизмах реагирования организма на дефицит кислорода и позволяют рекомендовать данные препараты в качестве перспективных антигипоксантов.

Экспериментальные данные, полученные в настоящей работе, могут быть использованы при разработке подходов и методов профилактики гипоксических состояний. Нейронспецифичную енолазу в сыворотки крови можно использовать в качестве прогностического критерия развития устойчивости головного мозга к острому дефициту кислорода. Основные положения, выносимые в защиту

1. Факторами регуляции развития адаптивного процесса при умеренной гипоксии являются торможение активности СРО, стабилизация показателей обмена глюкозы в мозге и крови. Выраженность и устойчивость метаболических изменений зависят от сроков тренировочного режима.

2. Интервальное гипоксическое прекондиционирование вызывает изменение и формирование нового метаболического состояния организма, устойчивость которого зависит от продолжительности адаптационного периода. При последующем моделировании тяжелой гипобарической гипоксии максимальный адаптогенный эффект достигался после 28-кратной тренировки животных.

3. Применение наноструктурированных композитов, содержащих в своем составе различные адаптогены: пчелиный яд и дигидрокверцетин, приводят к повышению устойчивости крыс к дефициту кислорода, снижая интенсивность СРО в плазме крови и головном мозге, приводя показатели окисления глюкозы и НСЕ в крови к исходному уровню.

Апробация работы

Результаты работы были доложены и обсуждены на IX юбилейной научной сессии молодых ученых и студентов, посвященной 90-летию Нижегородской государственной медицинской академии «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Н.Новгород, 2010); на конференции молодых ученых, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2010); на VI Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); на X Всероссийском съезде неврологов с международным участием (Нижний Новгород, 2012); IV съезде биофизиков России «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток» и «Физика — медицине и экологии» (Нижний Новгород, 2012); II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); на V Российский научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 публикации в журналах, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на /¿6 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов. Список цитируемой литературы включает ¿0?- источников (/¿7з отечественных и зарубежных). Работа содержит /£ рисунков и д таблиц.

Материалы н методы исследования

Работа выполнена на кафедре биохимии им. Г.Я. Городисской, ГБОУ В ПО НижГМА Минздрава России.

Работа была проведена на 460 беспородных крысах-самцах массой 180-200 г., выращенных в условиях вивария при свободном доступе к корму и воде, а также естественном чередовании суточной освещенности. На протяжении всей экспериментальной работы исследование интактных животных проводилось одновременно с опытными. В качестве материалов исследования использовали гомогенат и цитоплазматическую фракцию ткани головного мозга, плазму и сыворотку крови.

В ходе эксперимента можно выделить 2 этапа исследований.

1 этап - исследование механизмов развития адаптации к дефициту кислорода при использовании различных сроков гипоксического интервального прекондиционирования. В ходе данного эксперимента было проведено 2 серии исследований. Распределение по сериям, общее количество животных, условия эксперимента и численность групп представлены в таблице 1.

Таблица 1

Общее количество животных, условия эксперимента и распределение по сериям

Серии исследований Группы Условия эксперимента Количество животных в группе Количество выживших животных в группе

Исследование состояния окислительных процессов в головном мозге и крови крыс при применении различных сроков гипоксического прекондиционирован ия. Интактные 45 45

1-кратное прекондиционирование 1 сутки * 60 мин. 310 мм рт. ст. 20 20

4-кратное прекондиционирование 4 суток * 60 мин. 310 мм рт. ст. 20 20

7-кратное прекондиционирование 7 суток * 60 мин. 310 мм рт. ст. 15 15

14-кратное прекондиционирование 14 суток * 60 мин. 310 мм рт. ст. 15 15

28-кратное прекондиционирование 28 сутки * 60 мин. 310 мм рт. ст. 25 25

Изучение возникновения резистентности крыс к тяжелой гипобарической гипоксии у животных на разных сроках прекондиционирован ия. Интактные 45 45

Контроль на гипоксию 30 мин. * 143 мм рт. ст. 30 16

I-кратное прекондиционирование 1 сутки * 60 мин. 310 мм рт. ст. + 30 мин. 143 мм рт. ст. 25 16

4-кратное прекондиционирование 4 суток * 60 мин. 310 мм рт. ст. + 30 мин. 143 мм рт. ст. 20 18

7-кратное прекондиционирование 7 суток * 60 мин. 310 мм рт. ст. + 30 мин. 143 мм рт. ст. 20 17

14-кратное прекондиционирование 14 суток * 60 мин. 310 мм рт. ст. + 30 мин. 143 мм рт. ст. 20 14

28-кратное прекондиционирование 28 суток * 60 мин. 310 мм рт. ст. + 30 мин. 143 мм рт. ст. 25 24

Общее количество животных 280

Интервальное гипоксическое прекондиционирование (разрежение атмосферы 310 мм рт. ст., соответствующее высоте 7000 м., 60 минут) и моделирование тяжелой гипобарической гипоксии (разрежение атмосферы 143 мм рт. ст.,

соответствующее высоте 12000 м., 30 минут) проводили с помощью барокамеры проточного типа. Оценивали физиологическое состояние, а также количество выживших животных в группах.

На следующий день после окончания прекондиционирования или сразу после окончания моделирования гипоксии в головном мозге и крови исследуемых животных определяли показатели интенсивности СРО, содержание глюкозы и продуктов ее окисления, а так же активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ). В сыворотке крови определяли степень ОМБ и содержание нейрон-специфической енолазы (НСЕ). Данные показатели определяли во всех сериях эксперимента.

2 этап - исследование молекулярных механизмов развития адаптации к гипоксии при использовании различных натуральных адаптогенов. В ходе данного эксперимента было проведено 2 серии исследований. Распределение по сериям, общее количество животных, условия эксперимента и численность групп представлено в таблице 2.

Таблица 2

Общее количество животных, условия эксперимента и распределение по сериям

Серии исследований Группы Условия эксперимента Количество животных в группе Количество ВЫЖИВШИХ животных в группе

Изучение влияния на окислительные процессы головного мозга и крови наноструктурированног о препарата «Хитозан-золото-пчелиный яд» при предварительном курсовом пероральном применении в условиях моделирования острой гипоксии. Интактные 35 35

Контроль на гипоксию введение физ. раствора + 277 мм рт. ст.*60 мин. 15 15

Контрольная группа «Хитозан» введение хитозана (хитозан с молекулярной массой = 120000 Да в дозе = 100 мг/кг, степень деацетилирования хитозана 0,82). + 277 мм рт. ст.*60 мин. 10 10

Контрольная группа «Хитозан+Аи» введение золотосодержащего нанокомпозита (золото в дозе = 0,5 мг/кг; хитозан с молекулярной массой = 120000 Да в дозе = 100 мг/кг, степень деацетилирования хитозана 0,82). + 277 мм рт. ст.*60 мин. 10 10

Опытная группа «Хитозан+Аи+Пчел. Яд» введение золотосодержащего нанокомпозита с пчел, ядом (доза ПЯ = 0,5 мг/кг) + 277 мм рт. ст.+60 мин. 15 15

Исследование действия гидрогелей хитозана с дигидрокверцетаном на энергетический обмен и их антиоксидантные свойства в условиях моделирования тяжелой формы гипоксии. Интактные 30 30

Контроль на гипоксию введение физ. раствора+ 143 мм рт. ст.* 30мин. 20 8

Контрольная группа «Хитозан» Введение хитозана (60 мг/кг хитозана,40 мг/кг янтарной кислоты) +143 мм рт. ст.* 30 мин. 15 8

Контрольная группа «ДГК» Введение ДГК (10 мг/кг ДГК) + 143 мм рт. ст.* 30 мин. 15 И

Опытная группа «Хитозан +ДГК» Введение композиции — гидрогель хитозана с ДГК (60 мг/кг хитозана, 40 мг/кг янтарной кислоты, 10 мг/кг ДГК) + 143 мм рт. ст.* 30 мин. 15 13

Общее количество животных 180

В 1 серии экспериментов второго этапа исследований препараты вводили в течение 7 дней перорально (с помощью зонда) в объеме 1 мл на животное 1 раз в сутки.

После окончания введения препаратов через 7 суток крыс подвергали действию острой гипобарической гипоксии (разрежение атмосферы 277 мм рт. ст., соответствующее высоте 8000 м., 60 минут). Сразу после моделирования состояния гипоксии определяли интегральные показатели в плазме крови и головном мозге исследуемых животных. Оценивали физиологическое состояние, а также количество выживших животных в группах.

Во 2 серии экспериментов второго этапа исследований препараты вводили перорально в течение 5 дней объемом 0,5 мл на животное 1 раз в сутки. На следующий день после окончания введения препаратов животных подвергали действию тяжелой гипобарической гипоксии (разрежение атмосферы 143 мм рт. ст., соответствующее высоте 12000 м., 30 минут). Оценивали физиологическое состояние, а также количество выживших животных в группах. Сразу после моделирования состояния гипоксии определяли выше перечисленные показатели в головном мозге и плазме крови исследуемых животных.

Выделение цитоплазматической фракции мозга проводилось общепринятым методом дифференциального центрифугирования (Fonio, 1960; Диже, 2003). Общую активность ЛДГ в цитоплазме клеток головного мозга определяли по Кочетову Г.А. (1980) с использованием в качестве субстрата пировиноградной кислоты. Активность ЛДГ в плазме крови определяли оптимизированным кинетическим методом с использованием набора фирмы «Vital» (Россия).

Интенсивность СРО и антиоксидантную активность в ткани мозга и плазме крови определяли методом индуцированной биохемилюминесценции (БХЛ) (Кузьмина, 1982). ОМБ в сыворотке крови определяли спектрофотометрически по уровню карбонильных производных, используя метод Levin в модификации Дубининой Е.Е (1995). Уровень НСЕ в сыворотке крови определялся методом иммуноферментного анализа с помощью набора фирмы DRG Diagnostics на анализаторе Тесап (Швеция).

Определение глюкозы в головном мозге проводили энзиматическим методом по Кочетову Г.А. (1980). Определение глюкозы в цельной крови проводили энзиматическим колориметрическим методом с депротеинизацией с использованием диагностических наборов фирмы «Vital» (Россия). Количественное определение пирувата и лактата в головном мозге проводили энзиматическим методом Хохорста (Асатиани, 1965; Bergmeyer, 1974). Определение пирувата в цельной крови проводили энзиматическим UV-методом с депротеинизацией с использованием диагностических наборов фирмы «АБРИС+» (Россия). Определение лактата в цельной крови проводили энзиматическим колориметрическим методом с депротеинизацией с использованием диагностических наборов фирмы «Vital» (страна производитель - Россия).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием Microsoft Exel и Statistica 6.0. Достоверность различий определяли по критерию Крускала-Уоллиса. Две выборки считались принадлежащими к разным генеральным совокупностям при р < 0.05.

Результаты исследования и их обсуждение 1. Оценка развития адаптивных реакций в мозге и крови у крыс при использовании различных сроков прекондиционирования

Для развития неспецифической резистентности организма к дефициту кислорода в последнее время часто используют различные методы гипоксического прекондиционирования, проводимого в разных режимах и широко применяемого как в профилактической, так и в лечебной медицине (Коваленко Е.А., 1993; Колчинская А.З. и др., 2003; Рыбникова Е.А. и др., 2006; Барышников С.Н. и др., 2008; Лукьянова Л.Д., 2009; Оишкап А., ТаНЬшпак Т., 2010). Эффект прекондиционирования достигается за счет периодического действия раздражения меньшей величины, чем стрессорные, на организм. Ответная реакция организма при этом на начальном этапе тренировок аналогична действию тяжелой гипоксии, но в меньшей степени, не вызывая деструкцию и нарушение обменных процессов, и направлена на увеличение мощности стресс-лимитирующих систем.

При изучении зависимости развития адаптации от сроков интервального гипоксического прекондиционирования количество выживших животных во всех группах составило 100%.

При 1-кратном воздействии прекондиционирования концентрация глюкозы в нервной ткани и крови у животных существенно повышалась на 47% и 42% соответственно (р<0.05) (табл.3).

Таблица 3

Концентрация глюкозы, отношение содержания лактат/пируват и общая активность

Показатели Ткань Интактные 1 сутки 4 суток 7 суток 14 суток 28 суток

Глюкоза мозг (ммольУг) 1.19±0.03 1.75±0.05* 1.25±0.07 1.31±0.04 1.54±0.05* 1.37±0.02*

кровь (ммоль/л) 4.12±0.14 5.82±0.36* 4.04±0.24 4.47±0.28 4.28±0.22 4.58±0.34

Лактат/ Пируват мозг 17.4±1.3 24.8±0.74* 19.1±0.8 19.6±0.47 21,9±0.56* 17.6±0.45

кровь 4.7±0.2 7.2±0.31* 5.3±0.11 5.7±0.24* 6.99±0.18* 4.81 ±0.19

ЛДГ (ммоль пируват/ мин*мкг белка) мозг 401. 1±36.1 601±23.2* 421 2±11.4 460.6±38.3 508±11.5* 429.3±26.5

кровь 1281±108 1872±83* 1310±67 1523±75* 1694±58* 1294±101

Статистически значимые отличия: *- р<0.05 по отношению к интактной группе;

Соотношение продуктов лактат/пируват и общая активность ЛДГ при этом также значительно увеличивались (р<0.05) по сравнению с интактными животными. Повышение активности гликолитических процессов у данной группы животных вероятнее всего связано со стрессом и выбросом адреналина в кровь, так как однократный подъем на высоту 7000 м является достаточным фактором для развития стрессовой реакции организма.

При увеличении срока тренировок до 4-х суток данные показатели возвращались к уровню интактных значений (табл.3). То есть с увеличением количества тренировок организм адаптируется к стрессу и уже не реагирует на эпизоды кратковременной гипоксии.

Дальнейшее увеличение срока тренировки до 7 суток приводило к небольшому повышению в соотношении продуктов окисления глюкозы лактат/пируват в крови у данной группы на 20% (р<0.05). Концентрация глюкозы при этом оставалась в пределах верхней границы интактных значений. Общая активность ЛДГ в крови также повышалась на 19% относительно интактных животных (р<0.05). В головном мозге данные показатели 7-кратно прекондиционированных животных находились в пределах интактных значений.

При повышении времени тренировок до 14 суток наблюдалось статистически значимое увеличение в головном мозге концентрации глюкозы на 30% (р<0.05) по сравнению с интактными животными. Увеличение субстрата энергетического обмена в нервной ткани вероятно связано с переходом уровня адаптации на 14 сутки прекондиционирования от фазы индукционного срочного ответа организма на действие стресс-фактора к фазе формирования геном-зависимых реакций долгосрочной адаптации, что требует высокого энергетического обеспечения синтетических процессов. Соотношение лактата к пиру вату и общая активность ЛДГ в мозге и крови данной группы также увеличивались (р<0.05) по сравнению с интактными животными (табл.3).

Увеличение срока тренировок до 28 суток приводило к восстановлению индикаторных показателей начального этапа окисления глюкозы на уровень интактных значений. Только концентрация глюкозы в мозге у животных данной группы была несколько повышена (р<0.05), что имеет положительное значение, так как повышенное содержание глюкозы поддерживает необходимый защитный уровень окислительных процессов в мозге.

Для оценки состояния окислительных процессов после применения различных сроков тренировок было проведено исследование интенсивности процессов СРО, а также изучен антиоксидантный потенциал ткани мозга и крови тренированных животных. При изучении интенсивности свободнорадикапьных процессов установили, что 1-кратный режим прекондиционирования приводит к небольшой активации (р<0.05) свободнорадикального окисления в ткани мозга и крови (табл.4). Та же динамика наблюдается в изменении антиоксидантного потенциала ткани мозга и крови: после однократного пребывания в барокамере происходило достоверное снижение коэффициента К в головном мозге на 23%, а в плазме крови на21%(р<0.05).

Таблица 4

Показатели активности свободнорадикального окисления и степени антиоксидантной зашиты в гомогенате мозга и в крови крыс при разных сроках прекондиционирования._

Группы Гомогенат головного мозга Плазма крови

1тах, в, за 30 сек. К. 1тах, Б, за 30 сек. к,

имп/сек отн. ед. имп/сек отн. ед.

Интактные I82±11 1252±47 8.01 ±0.36 569.3±21.4 4007± 194.4 2.58±0.1

1 СУТКИ 236±19* 1590±30* 6.19±0.3* 654±17.2* 4885±111.8* 2.04±0.12*

4 суток 201±23.04 1333±41.3 7.6±0.45 568±31.2 4194±114.3 2.41±0.13

7 суток 198±16.5 1294±63 7.64±0.48 572±31.5 4298±89.2 2.34±0.05

14 суток 214±18.51 * 1429±46* 6.99±0.34* 58 [±18.2 4725±191.1* 2.12±0.06*

28 суток 190±23.04 1123±54.13 8.9±0.35* 558±39.8 3906±98.3 2.65±0.03

Статистически значимые отличия: *- р<0.05 по отношению к интактной группе;

Значимых изменений в интенсивности СЮ (коэффициенты 5 и 1тах) в группах 4-х и 7-и кратно тренированных животных, не выявлено. Антиоксидантная активность также находилась в пределах интактных значений.

На 14 сутки прекондмцнонирования в мозге и крови повышались потенциальная способность к СРО и содержание свободных радикалов (р<0.05). Антиоксидантный потенциал в мозге и крови у данной группы животных был статистически значимо снижен (р<0.05).

У животных после 28 суток прекондиционирования показатели суммарной активности и максимальной интенсивности СРО в гомогенате мозга и крови регистрировались на уровне интактных животных, в то время как антиоксидантный потенциал в мозге длительно тренированных животных несколько увеличивался по сравнению с группой интактных животных на 12% (р<0.05).

Прн исследовании ОМБ в крови I-кратно тренированных животных наблюдалось существенное увеличение на 45% (р<0.05) альдегидфеннлгидразонов, свидетельствующих о начальном этапе повреждений белковых молекул (рис. 1а). Концентрация кетонфенилгидразонов. рассматривающихся как поздние маркеры окислительной деструкции белка, также была повышена, но в меньшей степени - на 22% (р<0.05) (рис. 16).

а) б)

1 4 Г М Я Мим 1 4 » « ■

Рпс.1. Содержание карбонильных производных белков в плазме кропи крыс при рашых сроках прекондиционирования. а) альдс! идфенилгилраюкы. б) кстонфснклгидрачоны. Статистически значимые отличия: *• р<0.05 1ю отношению к иитактной группе:

Повьш1ение кетонфенилгидразонов наблюдаюсь так же на 14 сутки тренировок (рис. 16). причем более существенно, чем на первые сутки тренировок -на 33% (р<0.05). Альдегндфенилгидразоны прн этом регистрировались на уровне интактных значений (рис.1а). На остальных сроках тренировок (4.7,28 суток) не наблюдалось достоверных изменений в содержании карбонильных производных.

Концентрация НСЕ - маркера повреждения клеток нервной ткани, на всех сроках прекондиционирования находилась в пределах нормальных значений.

Таким образом, формирование адаптации начинается уже на ранних сроках прекондиционирования. Однако после 14-дневного прекондиционирования происходит ремоделирование обменных процессов, направленное на увеличение, прежде всего, доступности глюкозы для головною мозга. Увеличение количества тренировок до 28 суток сопровождается изменением активности окислительных процессов в организме, связанное с повышением аитиоксидантного потенциала, накоплением основного субстрата энергетического обмена и более полным

28 сутки тренировок и характеризуется стабилизацией окислительных процессов на новом уровне и увеличением антиокендантиой активности организма. Выживаемость животных в данной группе составила 96%, что является наиболее высоким показателем по сравнению с остальными опытными группами.

Т.е. характер метаболических изменений при повышении устойчивости организма к гипоксии за счет прскоидииионнрования направлен на восстановление окнслительно-восгановительного баланса. Таким образом, метаболическая адаптация яазяется управляемым процессом, направленным на поддержание гомеостаза организма в условиях кислородного голодания.

3. Влияние на окислительные процессы головного мола и крови няноетрукту рнрованного адяптогена «хитозан-золото-пчелиный ял» в условиях острой гипоксии.

При исследовании атаптогенного влияния наноструктурнрованного препарата «Хитозан-Аи+ПЯ» на окислительные процессы в условиях моделирования острой гипоксии было выявлено существенное снижение (р<0.05) концентрации глюкозы в крови опытной группы по сравнению с группой контроля и ее значение совпадало с уровнем интактных животных (рис.5).

I

«Юм

Рис.5. Кож юп рани» гшшиы н кропи крыс после гнпобарнческой гипоксии при предварительном пероралмюм введении препаратов. Сташстичсскн шамимыс отличи*: *- р<0.05 по отношению к ингльлпоП I руине: + - р-;0.05 но отношению к контрольной группе «Гипоксия. 8000м»;

У контрольной группы «Хнтозан-Аи» уровень глюкозы в крови был значимо снижен (р<0.05) относительно группы «Гипоксия», однако превышал значения (р<0.05) интактных животных, что характеризует незавершенность формирования резистентности организма к дефициту кислорода.

При изучении соотношения лактат/пнруват и общей активности ЛДГ крови групп «Хитозан Аи» и «Хитозан-Аи+ПЯ» выявлено значительное снижение (р<0.05) данных показателей по отношению к контролю на гипоксию, причем у опытной группы «Хитозан+Аи-ПЯ» адаптационная реакция более выражена так как показатель лактат/пируват совпадал со значениями интактной группы животных (рис.6а).

eras-о-к

Рис. I I.I loKaiarc.m функционального состояния сиоболнораднка дынч о окисления и степени ангжжсилантноЙ taminu к а) гомогенатс мозга и б) кронн крыс после пиндарической гипоксии, при предварительном нероральном введении препаратов. Статистически тнячимые отличия: *-р<0.05 1ю отошенню к шпактноП группе; + - р<0.05 по отношению к контрольной группе «Гипоксия. 12000 м»; р<0.05 по отношению к кошрольиои группе «ДГКн

Следует отметить, что оба препарата в отличие от хитозана оказывают существенное антиоксидантное действие при гипоксии. В головном мозге антиоксидантное действие было более выражено у группы «ДГК» (рис. II а), что может указывать на то, что ДГК лучше проникает через гематоэнцефалнческнй барьер, чем комплекс «Хитозан* ДГК». нейтрализуя радикалы активных форм кислорода, в результате снижая их негативное действие на мембраны нервных клеток.

Это подтверждается показателем НСЕ в сыворотке крови: ее концентрация в фуппе «ДГК» была значимо ниже уровня контроля на гипоксию и приближалась ннтактным значениям (рис. 12).

Ияг««тм»« Пмчмси* Х«*№М» ОГК Хи<*м**агк

1ММм

Рис. 12.Können (рання 11С Ii н сыворотке кронн крыс после гинобаричсской гипоксии при предварительном нерор.иыюм введении препаратов, Стагистнчески шачнмыс отличия: *• р-0.05 но отношению к интактной rpvnne; + - р- 0.05 по отношению к шмпролыюЛ ipynnc «Гипоксия. 12000 м»;

В группе животных, полу чавших препарат «Хитозаи+ДГК», содержание этого индикаторного фермента, хотя и было существенно ниже, чем у группы контроль на гипоксию, но несколько превышало значение контрольной группы «ДГК».

Таким образом, комплексный препарат «хитозан-дигидрсквериетин» при профилактическом применении в условиях моделирования тяжелой формы гипоксии оказывает как антиоксидантное, так и ярко выраженное антигипоксическое действие.

Заключение

Полученные данные показывают, что долгосрочное интервальное гипоксическое прекондиционирование (28 суток) стабилизирует обменные процессы на новом уровне, что, по-видимому, связано с включением долговременных механизмов адаптации, активацией гипофизарно-надпочечниковой системы, синтезом защитных белков, изменением кинетических свойств ферментов окислительного метаболизма, которые способствуют увеличению эффективности гликолиза и транспорта глюкозы через гематоэнцефалический барьер. За счет изменения данных процессов происходит образование комплекса устойчивых адаптивных признаков, ответственных за длительно сохраняющееся увеличение резистентности организма к гипоксии.

Профилактическое пероральное применение нанокомплекса «хитозан-золото-пчелиный яд» вызывает формирование реакции устойчивой активации, сопровождающейся усилением защитных систем организма, и оказывает антигипоксическое действие на головной мозг. Тот факт, что хроническое введение нанокомпозита сопровождается возникновением устойчивой активации, по-видимому, можно объяснить тем, что при многократном введении препарата в малых дозах происходит «аккумулирование эффектов». Полученные результаты указывают на перспективность использования данного препарата в качестве адаптогена к экологически неблагоприятным условиям, в частности, гипоксии.

При предварительном пероральном применении препарат «хитозан-дигидрокверцетин» в условиях тяжелой гипобарической гипоксии оказывал как антиоксидантный, так и антигипоксический эффект. Подобные свойства препарата, вероятно, связаны с тем, что ДГК, благодаря гидрофобному характеру строения, способен проникать в гидрофобную область мембран и тем самым значительно снижать подвижность липидов. Таким образом, данный препарат стабилизирует мембраны в условиях окислительного стресса и выступает в качестве структурного антиоксиданта. Кроме того, известно, что флавоноиды способны шунтировать работу НАДН-дегидрогеназы, принимая электроны с НАДН и передавая их на следующий — третий комплекс цепи митохондрий, нормализуя процессы окислительного фосфорилирования (Лукьянова Л.Д., 2011). Исходя из полученных результатов, можно предположить, что препарат «хитозан-дигидрокверцетин» способен как защищать клетки от свободных радикалов, так и увеличивать эффективность использования кислорода за счет повышения эффективности тканевого дыхания.

ВЫВОДЫ

1. Ограничение активности свободнорадикальных процессов, стабилизация показателей обмена глюкозы: пирувата, лактата и активности лактатдегидрогеназы в мозге и крови являются позитивными факторами развития адаптивного процесса при умеренной гипоксии. Выраженность и стабильность метаболических изменений зависят от сроков тренировочного режима.

2. Интервальное гипоксическое прекондиционирование приводит к формированию нового метаболического состояния организма, устойчивость которого зависит от продолжительности адаптационного периода. При последующем моделировании

тяжелой гипобарической гипоксии максимальный адаптогенный эффект достигался после 28-кратной тренировки животных.

3. Показано, что критерием устойчивости крыс к гипоксии является поддержание высокого уровня глюкозы в мозге при нормальном соотношении лактата/пирувата, сохранение концентрации нейронспецифической енолазы в крови на уровне значений, приближенных к интактным животным, и выравнивание про- и антиоксидантного баланса.

4. Применение нанокомпозита «хитозан-золото-пчелиный яд» вызывает повышение устойчивости крыс к гипобарической гипоксии, приводя индикаторные показатели крови к параметрам нормы, снижая интенсивность свободнорадикальных процессов в плазме крови и головном мозге, нормализуя активность лактатдегидрогеназы и концентрацию нейронспецифической енолазы в крови.

5. Курсовое пероральное применение препарата «хитозан-дигидрокверцетин» при гипоксии оказывает корригирующее действие на окислительные процессы организма, снижая показатели окисления глюкозы в мозге и крови, активность свободнорадикального окисления и концентрацию нейронспецифической енолазы в сыворотке крови животных.

Практические рекомендации

1. Новые данные о молекулярных и физиологических механизмах развития адаптации и поддержания постоянства внутренней среды организма в условиях дефицита кислорода могут быть использованы при разработке подходов и методов профилактики гипоксических состояний в сфере ветеринарии и медицины, а также включены в программы по физиологии и биохимии при подготовке специалистов ветеринарного и медико-биологического профиля.

2. Наноструктурированные препараты «Хитозан-золото-пчелиный яд» и «Хитозан-дегидрокверцетин» оказывают выраженное адаптогенное действие в условиях дефицита кислорода, что позволяет рекомендовать их в качестве перспективных антигипоксантов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Ерлыкина Е.И. Состояние про- и антиоксидантных систем в ткани мозга и крови при краткосрочном гипоксическом прекондиционировании / Е.И. Ерлыкина, Т.Ф. Сергеева, Е.И. Демина (Е.И. Мурач) // Омский Научный Вестник. - 2011. - № 1 (104). - С. 95-97.

2. Ерлыкина Е.И. Активность окислительных процессов и состояние комплекса гексокиназа-креатинкиназа при адаптации к дефициту кислорода / Е.И. Ерлыкина, Т.Ф. Сергеева, Е.И. Демина (Е.И. Мурач) // Астраханский медицинский журнал. - 2012. - № 2 (7). - С. 182-184.

3. Мурач Е.И. Молекулярные основы формирования защитных эффектов при использовании различных режимов гипоксического прекондиционирования / Е.И. Мурач, Е.И. Ерлыкина // Современные технологии в медицине. - 2013. -№ 1 (5).-С. 21-26.

4. Мурач Е.И. Адаптогенные эффекты композиции дигидрокверцетин-хитозан в условиях моделирования острой гипоксии / Е.И. Мурач, И.А. Баранов, А.Е. Мочалова, JI.A. Смирнова, A.C. Корягин, Е.И. Ерлыкина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2013. - №9 (156). - С. 280-283.

Публикации в научных журналах, сборниках научных статей, материалах конференций:

1. Сергеева Т.Ф. К вопросу о фармакологической коррекции свободно-радикальных процессов в мозге при адаптации к гипоксии / Т.Ф. Сергеева, Е.И. Демина (Е.И. Мурач), О.И., Коновалова // Материалы конференции молодых ученых, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды». - СПб-Колтуши. - 2010. - С. 93-94.

2. Демина Е.И. (Мурач Е.И.) Антигипоксический эффект нанокомплекса «хитозан-золото» / Е.И. Демина, О.Ю. Ешкова, A.C. Корягин // Материалы VI Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». - Москва. - 201. - С. 29.

3. Сергеева Т.Ф. Характер активации свободнорадикальных процессов при действии умеренной гипобарической гипоксии в режиме прекондиционирования / Т.Ф. Сергеева, Е.И. Демина (Е.И. Мурач), Е.И. Ерлыкина // Материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований». - Омск. - 2011. — С. 266-271.

4. Мурач Е.И. Стратегия метаболической адаптации мозга к дефициту кислорода / Е.И. Мурач, Т.Ф. Сергеева, Е.И. Ерлыкина // X Всероссийский съезд неврологов с международным участием. - Н.Новгород. - 2012. - С. 674.

5. Мурач Е.И. Влияние долгосрочного гипоксического прекондиционирования на некоторые показатели энергетического обмена / Е.И. Мурач // IV съезд

биофизиков России «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток». — Н.Новгород. -2012. — С. 207.

6. Баранов И.А. Антиоксидантные и адаптогенные свойства композиции хитозан-дигидрокверцетин в условиях тяжелой гипобарической гипоксии / И.А. Баранов, Е.И. Мурач, А.Е. Мочалова, J1.A. Смирнова, A.C. Корягин // IV съезд биофизиков России «Физика - медицине и экологии». - Н.Новгород. -2012.-С. 24.

7. Мурач Е.И. Влияние композиции дигидрокверцетин-хитозан на некоторые показатели энергетического обмена в условиях моделирования острой гипоксии / Е.И. Мурач, И.А. Баранов // Медицинский академический журнал (приложение) II Всероссийская научная конференция молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». - СПб. - 2012. - С. 280-281.

8. Мурач Е.И. Эффективность использования наноструктурированного препарата пчелиного яда при коррекции острого гипоксического состояния / Е.И. Мурач, Е.И. Ерлыкина, A.C. Корягин // Сборник научных статей V Российский научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке». - Казань. -2013. - С. 345-350.

Список сокращений

ДГК — дигидрокверцетин

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НСЕ - нейронспецифическая енолаза

ОМБ — окислительная модификация белков

ПЯ - пчелиный яд

СРО - свободнорадикальное окисление

Подписано в печать 10.10.2013 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л.1,1. Заказ № 391. Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6 Тел.:436-86-40

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мурач, Елена Ивановна, Нижний Новгород

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ»

На правах рукописи

МУРАЧ Елена Ивановна

ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ И НАНОКОМПОЗИТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА РАЗВИТИЕ АДАПТИВНОЙ РЕАКЦИИ У ЖИВОТНЫХ

03.03.01 - физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор Ерлыкина Е.И.

Нижний Новгород - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И АББРЕВИАТУР, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ

АТФ - Аденозинтрифосфат

АДФ - Аденозиндифосфат

АМФ - Аденозинмонофосфат

АФК - Активные формы кислорода

ГЭБ - Гематоэнцефалический барьер

ДГК - Дигидрокверцетин

ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота

КП - Карбонильные производные

ЛДГ - Лактатдегидрогеназа

МДА - Малоновый диальдегид

НСЕ - Нейронспецифичная енолаза

ОМБ - Окислительная модификация белка

ПОЛ - Перекисное окисление липидов

РНК - Рибонуклеиновая кислота

СРО - Свободнорадикальное окисление

N0 - Оксид азота

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................12

1.1 Молекулярные основы развития гипоксического ответа организма.... 12

1.1.1 Дезорганизация процессов энергообразования при гипоксии.......13

1.1.2 Изменение электролитного баланса в условиях дефицита кислорода.......................................................................16

1.1.3 Особенности протекания свободнорадикального окисления в условиях дефицита кислорода.............................................17

1.2 Особенности молекулярных перестроек при повышении устойчивости

к кислородному голоданию...................................................25

1.2.1 Адаптационный эффект прекондиционирования.....................26

1.2.2 Золотосодержащие нанокомпозиты с пчелиным ядом и их антигипоксическое действие..............................................33

1.2.3 Антиоксидантные свойства биофлавоноидов..........................40

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................46

2.1 Объект исследования...............................................................46

2.2 Постановка эксперимента...........................................................46

2.3 Методы исследования............................................................50

2.3.1 Оценка процессов свободнорадикального окисления методом индуцированной Н202 и Fe -хемилюминесценции......................50

2.3.2 Метод определения окислительной модификации белков по уровню карбонильных производных.....................................51

2.3.3 Определение общего белка биуретовым методом.....................53

2.3.4 Определение концентрации белка методом М.М. Bradford.........53

2.3.5 Определение содержания нейронспецифичной енолазы............53

2.3.6 Приготовление ткани головного мозга для определения субстратов.....................................................................54

2.3.7 Количественное определение глюкозы..................................55

2.3.8 Определение концентрации пировиноградной кислоты.............56

2.3.9 Определение концентрации лактата.....................................58

2.3.10 Выделение цитоплазматической фракции мозга.....................59

2.3.11 Определение активности лактатдегидрогеназы.......................60

2.4 Статистическая обработка данных.............................................61

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................62

3.1 Активность окислительных реакций в мозге и крови крыс при тяжелой

гипобарической гипоксии.....................................................62

3.2 Оценка развития адаптивных реакций в мозге и крови у крыс при

использовании различных сроков прекондиционирования.............68

3.3 Оценка обменных процессов при проверке устойчивости организма

тренированных животных к гипоксии......................................75

3.4Влияние на окислительные процессы головного мозга и крови наноструктурированного адаптогена «хитозан-золото-пчелиный яд» в условиях острой гипоксии...................................................86

3.5 Исследование антигипоксического действия гидрогелей хитозана с

дигидрокверцетином в условиях тяжелой гипоксии.......................92

Заключение.................................................................................100

ВЫВОДЫ..................................................................................102

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА...................................................104

ПРИЛОЖЕНИЕ..........................................................................127

ВВЕДЕНИЕ

Экология современного общества оказывает негативное действие на функциональное состояние человека, провоцируя развитие вторичных патологических дефицитных состояний. Так, дефицит кислорода затрагивает все виды обмена, что приводит к нарушению функционального состояния органов и систем, выраженность которых неодинакова (Пшенникова, 2003). Головной мозг при гипоксии страдает в первую очередь вследствие повышенной потребности в кислороде, которая связана с аэробным типом окисления и высокой интенсивностью обменных процессов. Гипоксия мозга влияет на организм в целом, сопротивляемость которого к кислородной недостаточности определяется состоянием его физиологических и биохимических систем (Болдырев, 2001, 2003; Долгих, 2002; Лукьянова, 2011; Patt et al., 1997; Schettler et al., 1999; Thykadavil et al., 2002).

Изучение молекулярных механизмов адаптации к гипоксии является важным условием для разработки эффективных методов предупреждения и коррекции возникающих изменений. Адаптация к гипоксии - это системная ответная реакция организма, направленная на формирование механизмов, способствующих поддержанию и сохранению кислородного гомеостаза в условиях его дефицита (Меерсон, 1993). При этом происходит мобилизация регуляторных центров дыхательной, сердечно-сосудистой систем, транспорта кислорода, а так же внутриклеточных механизмов, связанных с синтезом энергии (Гаркави и др., 1998, 2006; Агаджанян и др., 2003; Dos Santos et al., 2004; Stelmashook et al., 2010).

Повысить резистентность организма к дефициту кислорода можно разными путями, в том числе: применением методов прекондиционирования, либо с помощью использования препаратов адаптогенного действия.

Установлено, что даже короткий период слабого, неповреждающего гипоксического воздействия приводит к увеличению переносимости последующего отсроченного, более тяжелого воздействия гипоксии - эффект прекондиционирования (Агаджанян и др., 1970; Коваленко, 1993; Гаркави,

2006; XI е1 а1., 2002; Ме^епШакг е1 а1., 2011). В данной работе использовался метод интервального гипоксического прекондиционирования, который зарекомендовал себя как наиболее устойчивый и дающий положительные результаты (Березовский и др., 1990; Якобсон и др., 1992; Хватова и др., 2005; Самойленкова и др., 2008; Лукьянова и др., 2009; Випа§1 е1 а1., 2009; Бигакап е1 а1., 2010).

Применение гипоксии в качестве адаптирующего фактора поднимает ряд вопросов, наиболее актуальными из которых являются: особенности механизмов положительного и отрицательного действия гипоксии, сроки формирования адаптационных признаков и тканеспецифические особенности устойчивости к недостатку кислорода. Механизмы формирования срочной и долговременной адаптации к гипоксии различны и зависят от степени гипоксического воздействия на организм (Бельченко, 2001; Прокофьев и др., 2005; Лукьянова и др., 2009; Мошкова и др., 2010; ЬаМаппа е1 а1., 1992; Рисаг е1 а1., 2001; У1аБОУ е1 а1., 2005). Экспериментальное определение критерия режима тренировки следует рассматривать как необходимый этап для использования адаптации в практической медицине.

Увеличить резистентность организма к дефициту кислорода можно не только за счет тренировок, но и путем введения адаптогенов. Адаптогены -вещества, способные переводить организм в состояние неспецифически повышенной сопротивляемости (Яременко, 2007). Известно, что классические химически синтезируемые антигипоксанты имеют кратковременное действие и различные побочные эффекты (Копцов и др., 2002; Зарубина, 2005; Оковитый и др., 2005). В связи с этим актуальным является разработка и изучение натуральных адаптогенов с полифункциональными свойствами.

Несомненный интерес в этом направлении представляет многокомпонентный наноструктурированный комплекс «хитозан-золото-пчелиный яд», разработанный на кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

В настоящее время имеются лишь немногочисленные исследования, посвященные изучению адаптогенных эффектов многокомпонентной наноструктурированной системы «хитозан-золото-пчелиный яд» в условиях ионизирующей радиации и гипобарической гипоксии (Корягин и др., 2006; Александрова, 2008; Таламанова и др., 2010; Ешкова и др., 2011; Esumi et al., 2003). Изучение влияния данного препарата на окислительные реакции организма в целом и его антигипоксического действия на наиболее чувствительный к дефициту кислорода орган - головной мозг не проводилось, что предполагает актуальность исследований.

Большой интерес вызывают также антиоксиданты природного происхождения и возможность их использовать в качестве антигипоксантов. Дигидрокверцетин (ДГК, таксифолин) - природный биофлавоноид растительного происхождения считают одним из наиболее значимых антиоксидантов, превосходящих по фармакобиологической активности многие другие биополимеры (Теселкин и др., 1996; Накусов и др., 2005; Areias et al., 2001; Kostyuk et al., 2007). Однако применимость ДГК ограничивается его низкой растворимостью в водных средах и связанной с этим пониженной способностью проникать в кровь и клетки (Pozharitskaya et al., 2009). На кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидной химии химического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского для улучшения проникающей способности ДГК разработали соединение дигидрокверцетина с хитозаном - биополимером, обладающим биосовместимостью и биоразлагаемостью (Скрябин, 2002; Dash et al., 2011),. Исследований адаптогенного действия гидрогелей хитозана с дигидрокверцетином не проводилось.

Цель работы - изучение влияния интервального гипоксического прекондиционирования и наноструктурированных адаптогенов на развитие адаптивной реакции у животных.

Задачи исследования

1. Изучить развитие адаптивных реакций у крыс при использовании различных сроков прекондиционирования по состоянию свободнорадикального окисления (СРО) и окислительной модификации белков (ОМБ), а также по некоторым показателям окисления глюкозы в мозге и крови крыс.

2. Установить возникновение резистентности к тяжелой гипобарической гипоксии у животных с разными сроками прекондиционирования.

3. Изучить влияние на окислительные процессы головного мозга и крови адаптогенов в составе золотосодержащих нанокомпозитов при предварительном курсовом пероральном применении в условиях острой гипоксии.

4. Исследовать действие гидрогелей хитозана с дигидрокверцетином на энергетический обмен и их антиоксидантные свойства в условиях моделирования тяжелой формы гипоксии.

Научная новизна исследования

Выявлены особенности течения окислительных процессов в мозге и крови в динамике развития адаптивных реакций у крыс при использовании различных сроков прекондиционирования.

Впервые установлено поэтапное изменение активности свободнорадикальных реакций при повышении устойчивости к гипоксии. Дана субстратная и ферментативная характеристика окислительного метаболизма глюкозы на разных сроках прекондиционирования.

Выработаны критерии повышения устойчивости организма к недостатку кислорода. Показано перераспределение интенсивности процессов окисления при развитии адаптогенного эффекта в зависимости от продолжительности тренировочного режима.

Показано, что нейронспецифическая енолаза (НСЕ) может служить прогностическим критерием развития устойчивости головного мозга к дефициту кислорода.

Впервые выявлено, что предварительное пероральное курсовое введение животным нанокомплекса «Хитозан-золото-пчелиный яд» в условиях гипобарической гипоксии сопровождается снижением интенсивности свободнорадикальных процессов как в крови, так и в головном мозге. Установлено что пероральное применение нанокомплекса «Хитозан-золото-пчелиный яд» нормализует процессы окисления глюкозы в условиях гипоксии.

Впервые установлено, что профилактическое применение комплексного препарата «Хитозан-дигидрокверцетин» приводит к развитию адаптации организма в условиях кислородной недостаточности. Данный препарат проявляет как антиоксидантное, так и ярко выраженное антигипоксическое действие, нормализуя процессы энергетического обмена.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание молекулярных и физиологических механизмов развития адаптации и поддержания постоянства внутренней среды организма в условиях дефицита кислорода. Совокупность полученных экспериментальных данных выявляет физиолого-биохимические особенности протекания окислительных процессов в мозге и крови на различных этапах развития устойчивости к гипоксии.

Полученные данные позволяют оценить роль свободнорадикальных процессов, окислительной модификации белков, субстратных и ферментативных характеристик в отношении механизмов развития адаптации наиболее чувствительного к гипоксии органа - головного мозга и организма в целом.

Выявленные адаптогенные свойства нанокомплекса «Хитозан-золото-пчелиный яд» и комплексного препарата «Хитозан-дигидрокверцетин» в условиях гипобарической гипоксии дополняют и расширяют знания о молекулярных механизмах реагирования организма на дефицит кислорода и

позволяют рекомендовать данные препараты в качестве перспективных антигипоксантов.

Экспериментальные данные, полученные в настоящей работе, могут быть использованы при разработке подходов и методов профилактики гипоксических состояний. Нейронспецифичную енолазу в сыворотки крови можно использовать в качестве прогностического критерия развития устойчивости головного мозга к острому дефициту кислорода.

Основные положения, выносимые в защиту

1. Факторами регуляции развития адаптивного процесса при умеренной гипоксии являются торможение активности СРО, стабилизация показателей обмена глюкозы в мозге и крови. Выраженность и устойчивость метаболических изменений зависят от сроков тренировочного режима.

2. Интервальное гипоксическое прекондиционирование вызывает изменение и формирование нового метаболического состояния организма, устойчивость которого зависит от продолжительности адаптационного периода. При последующем моделировании тяжелой гипобарической гипоксии максимальный адаптогенный эффект достигался после 28-кратной тренировки животных.

3. Применение наноструктурированных композитов, содержащих в своем составе различные адаптогены: пчелиный яд и дигидрокверцетин, приводят к повышению устойчивости крыс к дефициту кислорода, снижая интенсивность СРО в плазме крови и головном мозге, приводя показатели окисления глюкозы и НСЕ в крови к исходному уровню.

Апробация работы

Результаты работы были доложены и обсуждены на IX юбилейной научной сессии молодых ученых и студентов, посвященной 90-летию Нижегородской государственной медицинской академии «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Н.Новгород, 2010); на

конференции молодых ученых, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2010); на VI Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); на X Всероссийском съезде неврологов с международным участием (Нижний Новгород, 2012); IV съезде биофизиков России «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток» и «Физика - медицине и экологии» (Нижний Новгород, 2012); II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); на V Российский научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2013).

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов. Список цитируемой литературы включает 207 источников (109 отечественных и 98 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 9 таблицами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Молекулярные основы развития гипоксического ответа организма

Проблема гипоксических воздействий на организм человека и животных привлекает внимание широкого круга исследователей, работающих в различных областях биологических знаний, поскольку в процессе жизнедеятельности организм сталкивается и вынужден приспосабливаться к гипоксии различного генеза (Колчинс