Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия транскрипционных факторов в мозге крыс при формировании тревожно-депрессивных состояний и реализации антидепрессивных эффектов гипоксического прекондиционирования

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия транскрипционных факторов в мозге крыс при формировании тревожно-депрессивных состояний и реализации антидепрессивных эффектов гипоксического прекондиционирования"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И.П. ПАВЛОВА

На правах рукописи

БАРАНОВА КСЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ТРЕВОЖНО-ДЕПРЕССИВНЫХ СОСТОЯНИЙ И РЕАЛИЗАЦИИ АНТИДЕПРЕССИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ГИПОКСИЧЕСКОГОПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ

Специальность 03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013

005059017

Работа выполнена в лаборатории регуляции функций нейронов мозга ФГБУН Института физиологии им. И.ГТ. Павлова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Рыбникова Елена Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Журавин Игорь Александрович

ФГБУН Институт эволюционной физиологии и

биохимии им. И.М. Сеченова РАН

доктор медицинских наук, профессор

Клименко Виктор Матвеевич

ФГБУ НИИ экспериментальной медицины СЗО

РАМН

Ведущая организация:

ФГБУН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва

Защита диссертации состоится « 3 » июня 2013 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при ФГБУН Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова

РАН.

Автореферат разослан « £,<5 »

Учёный секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

Н.Э. Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Одной из фундаментальных проблем нейробиологии и медицины является исследование адаптивных и патологических реакций нейронов мозга на влияния внешней среды, особенно при действии повреждающих факторов. Выяснение молекулярно-клеточных механизмов таких реакций необходимо для разработки новых эффективных способов повышения резистентности мозга к повреждающим воздействиям.

Резко возросшее в последние десятилетия количество жертв чрезвычайных ситуаций, боевых и противоправных действий, серьёзных конфликтов в обществе и микросоциуме привело к увеличению распространённости тревожно-депрессивных расстройств, представляющих собой большую группу заболеваний, включающую различные формы депрессий и другие постстрессовые патологии. Согласно данным ВОЗ, эта группа заболеваний занимает первое место в мире среди психических расстройств. Но, несмотря на широкую распространенность, и высокий интерес исследователей к этой проблеме, механизмы патогенеза постстрессовых тревожно-депрессивных состояний остаются во многом непознанными и, как следствие, относительно неэффективной оказывается современная фармакотерапия таких расстройств. Литературные данные свидетельствуют о том, что развитие тревожно-депрессивных состояний сопровождается нарушениями молекулярно-клеточных и гормон-зависимых механизмов регуляции адаптивных функций организма. Весьма вероятно, что в основе патогенеза данных расстройств лежит дисрегуляция активации транскрипционных факторов, приводящая к нарушениям индукции контролируемых ими ранних генов и, далее, продуктов поздних генов, в частности кодирующих медиаторы, нейрогормоны, гормоны и их рецепторы (Уа!<1уа, Питан, 2001; ОоиНеу ^ а1., 2008). Изучение механизмов патогенеза этих состояний и разработка новых технологий лечения невозможны без преклинических исследований, проводимых в экспериментальных моделях на лабораторных животных.

В настоящее время эффективным способом повышения резистентности мозга к повреждающим воздействиям является применение гипоксического прекондиционирования — предъявление умеренных экстремальных воздействий, направленное на мобилизацию эндогенных эволюционно приобретенных генетически-детерминированных защитных механизмов (Самойлов, 1999; Самойлов и др., 2004; 2012; Самойлов, Рыбникова, 2012). Наиболее распространенный вид прекондиционирования — гипоксическое/ишемическое было впервые использовано на сердце в 1986 году (Миггу е( а1., 1986). На современном этапе в значительной мере раскрыты механизмы кардиопротективных эффектов ишемического прекондиционирования миокарда, что способствовало внедрению данного способа в медицинскую практику (ЯегкаНа, Юопег, 2007; Ратманова, 2008). Эндогенные механизмы толерантности мозга, индуцируемые ишемическим и, в особенности, гипоксическим

прекондиционированием (ГП), исследованы в меньшей степени. Показано вовлечение внутриклеточных сигнальных каскадов, глутаматных рецепторов, антиапоптотических белков и пептидных антиоксидантов в механизмы повышения резистентности нейронов мозга к гипоксии, индуцируемого ишемическим/гипоксическим прекондиционированием (Самойлов и др., 2001-2012; Rybnikova et al., 2002-2012; Semenov et al., 2002; Sharp et al., 2004; Строев, Самойлов, 2004; Obrenoviteh, 2008). Установлено, что ключевая роль в индукции нейропротективных процессов при применении ГП принадлежит кооперативной активации транскрипционных факторов (Самойлов, Рыбникова, 2012).

Недавно было обнаружено, что ГП повышает устойчивость мозга и организма в целом не только к повреждающим воздействиям гипоксической природы, но и психоэмоциональным стрессам, предотвращая формирование постстрессовых тревожно-депрессивных расстройств (Рыбникова и др., 2006; 2007; 2008; Rybnikova et al., 2007). Однако, несмотря на описанное мощное антидепрессивное и анксиолитическое действие ГП, внедрение этого метода в медицинскую практику в качестве способа профилактики и коррекции постстрессовых патологий невозможно без достаточных сведений о механизмах его действия, среди которых очевидно важнейшую роль играют модификации активности генома (Рыбникова, 2010). Требуется последовательное и комплексное изучение геном-зависимых механизмов антидепрессивных эффектов ГП на различных уровнях, начиная от активности транскрипционных факторов и до экспрессии регулируемых ими генов и их продуктов. В этом отношении ГП представляет собой не только перспективный с практической точки зрения немедикаментозный способ, но и удобную экспериментальную модель для фундаментальных исследований эндогенных нейропротективных процессов и механизмов их индукции.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей экспрессии активационных, индуцибельных и лиганд-зависимых транскрипционных факторов в образованиях мозга, вовлекаемых в патогенез постстрессовых расстройств, при формировании экспериментальных тревожно-депрессивных состояний и их коррекции гнпоксическим прекондиционированием у крыс. Основные задачи исследования:

1. Изучить экспрессию активационных транскрипционных факторов pCREB и NF-кВ(р65) в гиппокампе, неокортексе, гипоталамусе крыс при развитии депрессивноподобного состояния «выученной беспомощности» (модель эндогенной депрессии) и тревожного состояния (модель посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) «стресс-рестресс»),

2. Выявить особенности постстрессовой активации CREB и NF-KB(p65) у прекондиционированных умеренной гипобарической гипоксией животных, у которых тревожно-депрессивные состояния не формируются.

3. Оценить динамику экспрессии индуцибельных транскрипционных факторов c-Fos, HIF-la и NGFI-A в гиппокампе, неокортексе, гипоталамусе крыс в ответ на воздействие

патогенным стрессом в моделях депрессии и ПТСР. Провести сравнительное исследование паттернов индукции этих факторов у непрекондицнонированных и прекондиционированных животных.

4. Охарактеризовать участие лиганд-зависимых транскрипционных факторов - глюко-(СЖ) и минералокортнкоидных (МЯ) рецепторов гиппокампа, неокортекса и гипоталамуса крыс в механизмах развития модельной депрессии и ПТСР, а также их коррекции гипоксическим прекондиционированием.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Пространственный паттерн нарушений экспрессии транскрипционных факторов в мозге специфичен для различных форм тревожно-депрессивной патологии у крыс. При формировании депрессивноподобного состояния, наиболее выраженные модификации экспрессии исследуемых транскрипционных факторов наблюдаются в гиппокампе, в то время как при развитии тревожного расстройства-аналога ПТСР наибольшие изменения локализуются в неокортексе и паравентрикулярном ядре гипоталамуса.

2. Недостаточная активация факторов СКГ:В и ОТ-кВ(р65), отсроченная сверхэкспрессия с-Ров и НПМа и снижение уровня в исследованных образованиях мозга в условиях патогенного стресса является общим компонентом развития постстрессовых тревожно-депрессивных расстройств.

3. Механизмы антидепрессивного и анксиолитического эффектов гипоксического прекондиционирования в моделях тревожпо-депрессивных расстройств включают активацию СКЕВ и N Р-кВ (р65), повышение уровня О К, нивелирование отсроченной сверхэкспрессии с-Ров и Н1Р-1а и усиление стресс-индуцированной экспрессии ЫСП-Л в исследованных образованиях мозга.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе впервые установлено наличие общих и специфических молекулярно-клеточных механизмов эндогенной депрессии и реактивного тревожно-депрессивного состояния (ПТСР). В экспериментальных моделях «выученная беспомощность» и «стресс-рестресс» впервые выявлены как аналогичные, так и индивидуальные для каждой патологии нарушения экспрессии транскрипционных факторов СЯЕВ, ЫР-кВ. с-Ро5, ЫОР1-А, Н1Р-1а, О К и МЯ. Показано, что к общим закономерностям при депрессии и ПТСР относится недостаточная активация СЯЕВ и ЫР-кВ, отсроченная сверхэкспрессия факторов с-Ров и Н1Р-1а и редукция содержания СИ в ответ на стрессорные воздействия.

Впервые получены данные о различном вкладе гипоталамуса, неокортекса и гиппокампа в генез постстрессовых тревожных и депрессивных состояний. Показано преимущественное вовлечение модификаций активности транскрипционных факторов дорзального гиппокампа в формирование депрессивноподобного состояния у крыс в модели «выученная беспомощность»,

в то время как в модели ПТСР наиболее выраженные изменения выявлены во II слое неокортекса и паравентрикулярном ядре гипоталамуса.

Впервые проведен сравнительный анализ стероид-рецептор-опосредованных механизмов формирования различных постстрессовых состояний, продемонстрировавший наличие особенностей в нарушениях стероид-рецептирующих функций отделов мозга крыс при индукции модельной депрессии и ПТСР. При развитии депрессивноподобного состояния у животных обнаружено значительное и устойчивое снижение содержания глюкокортикоидных рецепторов во всех исследованных областях мозга. При индукции экспериментального ПТСР у крыс не выявлено существенных изменений рецепторного пула на экстрагипоталамическом уровне, однако в паравентрикулярном ядре гипоталамуса происходило снижение уровня ОК.

Впервые в значительной мере раскрыты нейрональные молекулярные механизмы, лежащие в основе антидепрессивного и анксиолитического эффектов ГП у крыс. Установлено, что индуцируемые ГП протективные процессы в моделях тревожно-депрессивных расстройств связаны с вовлечением транскрипционных факторов различных семейств. В частности, прекондиционирующее воздействие способствует активации транскрипционных факторов СКЕВ и Ы1'-кВ, и нивелирует патологическую отсроченную экспрессию индуцибельных факторов с-Роэ и НИМ а вслед за патогенным стрессом. Кроме того, прекондиционирование предотвращает нарушения гормон-зависимых механизмов регуляции адаптивных функций организма путем стимуляции экспрессии СЖ в гиппокампе в ответ на тяжелый психоэмоциональный стресс, и в паравентрикулярном ядре гипоталамуса - в ответ на травматический стресс, а также модифицикации соотношения ОЯ и МЯ.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ II ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Работа посвящена исследованию фундаментальной проблемы нейробиологии, связанной с расшифровкой молекулярных механизмов адаптивных и патологических реакций нейронов мозга. Полученные результаты расширяют современные представления о роли транскрипционных факторов в патогенезе эндогенного и реактивного постстрессового тревожно-депрессивного расстройства. Важное теоретическое значение для понимания механизмов патогенеза тревожно-депрессивных состояний имеет основной вывод работы, сформулированный на основании полученных экспериментальных сведений и постулирующий наличие как общих, так и специфических для разных форм тревожно-депрессивных расстройств нарушений экспрессии транскрипционных факторов, а следовательно, и механизмов формирования этих патологий.

Большая теоретическая значимость проведенного исследования также заключается в том, что удалось выявить особенности механизмов регуляции активности генома нервных клеток, посредством которых реализуется антидепрессивное и анксиолитическое действие ГП. Эти

сведения вносят существенный вклад в понимание нейрональных механизмов повышения адаптивных возможностей организма в условиях интенсивных стрессорных воздействий.

Практическая значимость работы определяется насущной необходимостью разработки эффективных способов профилактики и лечения стресс-индуцируемых патологий. Установленные в проведенном исследовании факты в значительной мере раскрывают механизмы антидепрессивного и анксиолитического действия ГП, что может способствовать внедрению этой новой эффективной немедикаментозной технологии в медицинскую практику с целью профилактики и лечения постстрессовых депрессивных и тревожных расстройств. С учетом выявленных в данной работе особенностей индуцируемых ГП эндогенных механизмов адаптации мозга и организма в целом к патогенным стрессам становится возможным в перспективе создание нового поколения фармакологических препаратов, оказывающих направленное действие не на общие, а на определенные выявленные нейрохимические механизмы патогенеза различных форм тревожно-депрессивных расстройств.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы были представлены и обсуждены на Межииститутской конференции молодых ученых «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды», посвященной 100-летию академика В.Н. Черниговского (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); Российско-Польском рабочем симпозиуме «Гипоксическое, ишемическое прекопдиционирование мозга», посвященном 50-летнему юбилею сотрудничества Польской и Российской Академии Наук в рамках Дней Польской науки в России (Санкт-Петербург, 2008); Двенадцатой Всероссийской медико-биологической конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); Конференции молодых ученых «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды», посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2010); I и II Всероссийских научных конференциях молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, 2010 и 2012); VII и VIII Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 2011 и 2012); XIV Международном совещании и VII школе по эволюционной физиологии, посвященным памяти академика JI.A. Орбели (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга», посвященной 120-летию создания Физиологического отдела под руководством И.П. Павлова в Императорском институте экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 2011); 111 Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012); Междисциплинарной конференции "Адаптационные стратегии живых

систем" (Новый Свет, Крым, Украина, 2012), а также на заседаниях Лаборатории регуляции функций нейронов мозга и Отдела физиологии и патологии высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (2007-2012).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 172 страницах, иллюстрирована 44 рисунками и 4 таблицами. Список цитируемой литературы включает 439 источников. Основное содержание диссертации отражено в 19 публикациях (из них 7 научных статей в рецензируемых российских и зарубежных журналах и 12 тезисов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 350 взрослых самцах крыс линии Вистар весом 200-250 г. Для выработки депрессивноподобного состояния в классической парадигме «выученной беспомощности» (ВБ) (БеН^ап, Веа§1еу, 1975) крыс стимулировали асинхронными ударами электрическим током в замкнутом пространстве клетки в течение часа так, чтобы каждая крыса получила по 60 ударов током (1мА, 50 Гц) каждый длительностью 15 с. В результате у животных значительно редуцировалась двигательная и исследовательская активность в тесте «открытого поля», повышался уровень тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте и уровень кортикостерона в крови, уменьшалось предпочтение сахарина (агедоиия), и происходило нарушение глюкокортикоидного торможения в дексаметазоновом тесте. Для индукции экспериментального аналога посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) у экспериментальных животных использовали модель «стресс - рестресс» (ЫЬегсоп е1:. а1., 1997), которая включала тяжелый патогенный травматический стресс (2 часа иммобилизациии, 20 минут вынужденного плавания, и, после 15-минутного перерыва, воздействие эфиром до потери сознания) и напоминающий рестресс (30-минутную иммобилизацию), являющийся триггером для развития тревожного патологического состояния. В результате у животных резко возрастал уровень тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте, и наблюдались характерные для данного расстройства гормональные нарушения (повышение уровня кортикостерона в крови и включение «быстрой» глюкокортикоидной обратной связи).

С целью предотвращения формирования тревожно-депрессивных состояний у крыс использовали эффективный немедикаментозный способ - гипоксическое прекондиционирование (ГП) с применением сеансов умеренной гипобарической гипоксии (Рыбникова и др., 2010). ГП осуществляли в декомпрессионной барокамере проточного типа путем воздействия на крыс умеренной гипобарической гипоксией (давление - 360 мм рт. ст., содержание Ог - 10%) трехкратно по 2 часа, с интервалом 24 часа. Через сутки после третьего сеанса гипоксии животные подвергались воздействию психоэмоционального или травматического стресса в

моделях депрессии и ПТСР. В этих условиях тревожно-депрессивные состояния у них не развивались.

Для Вестерн-блот анализа крыс контрольной и опытных групп декапитировали, выделяли участки ткани мозга из областей дорзального и вентрального гиппокампа, верхних и нижних слоев неокортекса, паравентрикулярный гипоталамус и по отдельности гомогенизировали в лизирующем буфере для экстракции ядерных белков. Надосадочную жидкость отбирали после центрифугирования в течение 25 мин при 15000g. Концентрацию белка в экстрактах определяли спектрофотометрически по методу Брэдфорда-Лоури (Bradford, 1976), после чего экстракты нервной ткани, содержащие искомые транскрипционные факторы (ТФ), разделяли электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле (Laemmly, 1970), на трис-глициновом буфере (рП 8.3) в присутствии 0.1% SDS. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя, как и для фореза, аппарат Mini-PROTEAN Cell (Bio-Rad, USA), но в модификации для блоттиига. Мембраны последовательно инкубировали с поликлональными первичными антителами к ТФ pCREB, NF-icB(p65), NGFI-A, HIF-la, c-Fos, глюко- и минералокортикоидным рецепторам (GR и MR) (разведение 1:500 - 1:1000) фирм Santa Cruz Biotechnology, USA; Abeam, UK; Calbiochem, Germany; Vector Laboratories, USA и вторичными (1:2000 - 1:10000), конъюгированными с пероксидазой хрена, антителами фирмы Dako, Germany. Визуализацию связавшихся антител на нитроцеллюлозе проводили хемилюминесцентным методом с использованием наборов ECL фирм MP, USA и Thermo, USA. Для детекции свечения экспонировали блот с рентгеновской пленкой Kodak, проявленные пленки сканировали, интенсивность окрашивания полос преципитации оценивали по оптической плотности.

Для получения гистологических препаратов животных декапитировали на 1-й, 5-й и 10-й дни после стрессирующей процедуры (ранний, промежуточный и отсроченный постстрессовый период, соответственно), извлекали мозг, выделяли области гиппокампа с прилежащим фронтоиариетальным неокортексом и область гипоталамуса, фиксировали в молекулярном фиксаторе FineFix (Milestone, Italy) в течение 24-48 часов. Далее после стандартных процедур обезвоживания и заливки в парафиновую среду изготавливали срезы во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм на уровне -2.80 мм от Bregma для изучения областей гиппокампа и неокортекса, и -1.80 мм от Bregma для областей гипоталамуса (Paxinos, Watson, 1986). Для морфологического анализа препараты окрашивали по методу Ниссля в водном 0.1% -растворе толуидинового синего. Для иммуногистохимнческой оценки содержания белков-'ГФ в клетках различных областей мозга стрессированных (ВБ, ПТСР) и прекондициоиированных перед стрессированием (ГПВБ, ГП ПТСР) крыс депарафннизированные срезы подвергали демаскировке в цитратном буфере, после чего инкубировали с первичными поликлональными антителами к NGFI-A, HIF-la, pCREB, MR (Santa Cruz), к NF-kb(p65) и GR (Santa Cruz;

Calbiochem), к c-Fos (Abeam; Vector) в разведении 1:100 при +4°C в течение ночи. Далее срезы обрабатывали с использованием наборов для детекции фирмы Vector Labs, USA - авидин-биотиновой системы детекции Vectastain ABC Kit (включающей вторичные биотинилированные антитела, 1:200) и диаминобензидинового набора DAB Substrate Kit. Затем проводили количественную оценку содержания искомого белка на основании анализа иммунореактивности нейронов в гипоталамусе (крупноклеточное и мелкоклеточное паравентрикулярное ядро -кПВЯ, мПВЯ), неокортексе (II и V слои), дорзальном (область CAI) и вентральном (зубчатая извилина) гипиокампе крыс.

Используя световой микроскоп, цифровую камеру и компьютер с программным обеспечением ВидеоТест Мастер Морфология (ООО "Видео Тест", Санкт-Петербург), производили подсчет числа иммунопозитивных клеток на основании оценки оптической плотности, вычитая оптическую плотность фона при каждом измерении, и разделяли иммунопозитивные клетки на слабо- и интенсивно-иммунопозитивные. Данные обрабатывали, вычисляя среднюю арифметическую величину и стандартную ошибку среднего в исследуемых группах животных, сравнивали средние значения выборок. Статистическую обработку проводили средствами однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (Statistica 7.0, Statsoft Inc., USA), с достоверностью различий при р<0.05. Все результаты и стандартные ошибки среднего выражены в процентах от среднего значения соответствующей контрольной группы, принятой за 100%. Результаты представлены в виде среднего арифметического значения, выраженного в процентах ± стандартная ошибка среднего, выраженная в процентах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологический анализ не выявил структурных повреждений или гибели нейронов ни в областях гиппокампа, ни в неокортексе через 1, 5 и 10 суток после предъявления стрессирующих воздействий.

Изменении активности ТФ CREB н NF-KB(p65) в мозге крыс после стрессорного воздействия. Эффекты ГП. У особей, подвергшихся стрессированию, как в парадигме ВБ, так и в модели «стресс-рестресс», иммунореактивность к pCREB изменялась слабо, а уровни pCREB оставались сравнимыми с базальными показателями в контроле, либо редуцировались. ВБ стресс вызывал достоверное подавление активности CREB в зубчатой извилине гиппокампа (рис. 1.А), в неокортексе (рис. 1.Б) также выявлено снижение pCREB иммунореактивности у непрекондиционированных (неГП) крыс, особенно в отсроченный период (5-10 сутки). Индукция ПТСР сопровождается двукратным от контрольных показателей снижением интенсивность экспрессии pCREB на 5-10 сутки в V слое неокортекса (рис. 1.В). У прекондиционированных (ГП-) животных, у которых после стрессирования в парадигмах ВБ

или «стресс-рестресс» тревожно-депрессивные патологии не развивались, происходила мощная и устойчивая активация данного ТФ после стресса во всех исследованных образованиях мозга.

На предъявление стресса в парадигме ВБ крысы реагировали быстрым увеличением кВ-иммунореактивности только в ядрах гипоталамуса (рис. 1.Д), активация имела двухволновый профиль - с максимумами на 1-е (до 1928%) и 10-е сутки. ГП выраженно подавляло сверхактивацию №-кВ в ответ на ВБ стресс, однако уровень иммунореактивного кВ у ГП-животных оставался достоверно выше базального. В зубчатой извилине ГП-крыс, в отличие от неГП, ВБ индуцировала увеличение количества интенсивно иммунореактивных клеток уже на 1 сутки (в 3,5 раза), к 10 суткам количество иммунореактивных клеток возрастало до 600% (рис. 1.Г). В ответ на непрекондиционированный травматический стресс экспрессия ОТ-кВ устойчиво редуцировалась в гиппокампе. ГП способствовало отчетливой ап-регуляции экспрессии данного фактора после рестресса в зубчатой извилине гиппокампа (240% -I день, и 345% - 10 день относительно контроля, уб 33% и 70%, соответственно, у неГП животных) (рис. 1.Е).

в

ы 400%

и

01 200%

120% 80% 40%

В

———!

*

І

5 сутки 10 сутки 1 сутки 5 сутки

□ Контроль Ц ВБ □ ГПВБ

д

10 сутки

1 сутки

Пкш

оэ

(¡а

г

* #

■А

" і

і- ІНі г

400% 300% 200% 100%

5 сутки 10 сутки

птсрПгп птср

Е

* #

Йь

1 сутки

5 сутки

Рис. 1. Интенсивность экспрессии рСЯЕВ (А, Б, В) и №-кВ(р65) (Г, Д, Е) в мозге крыс в разные сроки после стрессирующего воздействия в парадигме ВБ (А, Б, Г, Д) и ПТСР (В, Е). А, Г и Е - зубчатая извилина гиппокампа; Б -II слой неокортекса; В - V слой неокортекса; Д — кПВЯ гипоталамуса. Здесь и далее: по оси абсцисс - дни после стресса; по оси ординат -количество интенсивно-иммунопозитивных клеток в % от значений контрольной группы. Серые столбики - контроль, 100% (п=8-12); черные столбики — непрекондиционированные крысы после стрессирования (п=6): белые столбики — прекондиционированные перед стрессированием животные (п=6). * - различия достоверны по отношению к контролю, # - достоверные различия относительно непрекондиционированной группы, р<0.05.

В целом, базальные или сниженные уровни содержания активационных ТФ рСЯЕВ и кВ при развитии патологий в рассмотренных моделях могут свидетельствовать о том, что недостаточная их активация может являться неспецифическим компонентом патогенеза как

эффект был значительно более сильным чем в модели депрессивной патологии. При этом общее число с-Роэ- и Н1Р-1 «-позитивных клеток изменялось относительно незначительно, однако интенсивность экспрессии возрастала достоверно и устойчиво, особенно в отсроченный период. Так в нейронах зубчатой извилины гиппокампа почти 5-кратное повышение экспрессии с-Роэ выявлялось уже в ранний период (1 сутки) после ВБ или ПТСР стресса и сохранялось в течение 10 дней (рис. 2.А, Г). Пролонгированная сверхэкспрессия была отмечена и в неокортексе, однако в парадигме ВБ с меньшей, чем в гиппокампе амплитудой реакции (рис. 2.Б), а в парадигме ПТСР интенсивность экспрессии с-Ров более чем в 20 раз превышала контрольный уровень (рис. 2.Б, Д). Отсроченная оверэкспрессия с-Ров в ответ на стрессирование характерна и для гипоталамуса, в частности, в мПВЯ ВБ сгресс приводил к росту числа интенсивно-иммунопозитивных клеток на 1400% от контроля на отдаленном сроке (рис. 2.В), а ПТСР стресс — на 2725% (рис. 2.Е). Аналогичная индукция отсроченной экспрессии в ответ на воздействие патогенного стресса выявлена для фактора Н1Р-1а.

Б

1200% 800% 400% 0%

А

-т

* 1

Й'

900% 600% 300%

Г

4,_I

гй

Ид

1200% 800% 400%

I

11ь

1 сутки 5 сутки 10 сутки

□ Контроль И ВБ □ ГПВБ

10 сутки

2500% П 1 1 п *

А I 3000% Т Е Т

2000% - »1 I ■

^ Н Н ^

"1:1" I'' .IX I" I

5 сутки

10 сутки

1 сутки 5 сутки 10 сутки

□ Контроль■ ПТСР □ ГП ПТСР

1 сутки

5 сутки

10 сутки

Рис. 2. Динамика экспрессии с-Роэ в мозге не- и прекондиционированных крыс на разных сроках после стрессирующег о воздействия в парадигме ВБ (А, Б, В) и ПТСР (Г, Д, Е). А, Г - зубчатая извилина гиппокампа; Б — V слой неокортекса; Д — II слой неокортекса; В, Е -мПВЯ гипоталамуса. Обозначения как на рис. I.

Антидепрессивный эффект прекондиционирования умеренной гипоксией сопровождался значительной модификацией паттерна экспрессии с-Роя и Н1Р-1а в мозге крыс. ГП нивелировало или в значительной степени предотвращало патологическую отсроченную стресс-индуцированную оверэкспрессию этих факторов в исследованных образованиях мозга вслед за ВБ и ПТСР стрессом. Очевидно, это является общим для обеих патологий протективным механизмом, активируемым ГП. В ранние периоды (1-5 дней) в гиппокампе, неокортексе и гипоталамусе ГП-животных после неизбегаемой электростимуляции в парадигме ВБ

нарушениях в работе всех уровней регуляции ГГАС (как короткой, так и длинной петель ООС) и может являться одним из ключевых моментов патогенеза депрессий. Вероятно, с обнаруженным при ВБ значительным снижением GR в ГГАС-регулирующих структурах и связана гиперсекреция гормона кортизола и нарушения ООС ГГАС, характерные для данной патологии. Кортизол, в свою очередь, вызывает резкое снижение активности серотонинергической системы, редукцию 5НТ1 рецепторов, оказывает влияние на ферменты деградации моноаминов, возбуждает дофамин- и глутаматергическую системы. Показано влияние его высокого уровня на норадренергическую систему, при длительном воздействии он может вызывать нейродегенеративные процессы в гиппокампе, снижение адаптационных способностей нейронов (Reul et al., 1991; Dinan, 1994; Sapolsky, 2000). При формировании депрессивной патологии на фоне значительного снижения числа GR обнаружена тенденция к незначительному усилению экспрессии MR, в этом случае в условном соотношении GR/MR преобладающими оказываются MR. Дисбаланс в сторону MR особенно выражен в зубчатой извилине гиппокампа. Как известно, MR, помимо тонического ингибирования ГГАС, участвуют в первичных стрессорных реакциях (Haller et al., 2000; Karst, Joels, 2003; Joels et al., 2012).

У ГПВБ крыс обнаруживалось резкое и устойчивое повышение GR-иммунореактивности в гиппокампе (особенно в зубчатой извилине), и при этом наблюдалась ядерная локализация GR. Таким образом, ГП, вероятно, запускает синтез необходимых для включения ООС и связывания избыточного при ВБ гормона GR. Очевидно, что в данном случае GR является активным ТФ, регулирующим транскрипцию генов-мишеней, в том числе ТФ (HIF-la), нейрогормонов КЛ и вазопрессина, антиоксидантов (Kodama et al., 2003). GR также взаимодействует с ТФ HIF-1, NF-кВ и АР-1, регулируя их активность (Leonard et al., 2005; Derijk, de Kloet, 2008). Очевидно, что существенное усиление экспрессии GR в зубчатой извилине имеет принципиальное значение для нормализации функций ГГАС, нарушенных именно при данной патологии. Длительность выявленных изменений (сверхэкспрессия GR в зубчатой извилине), вероятно, связана с хорошо изученными медленными эффектами глюкокортикоидов — они сводятся к подавлению первичного стрессорного ответа, предотвращая его сверхактивацию (Munck et al., 1984). Важность выявленных модификаций содержания рецепторов вентрального гиппокампа для предотвращения эффектов ВБ косвенно подтверждается тем, что в дорзальном гиппокампе, напротив, изменения гораздо менее выражены и весьма сходны с таковыми при ГП ПТСР. Это в свою очередь, позволяет предположить, что в области CAI ГП-индуцированное возрастание интенсивности экспрессии обоих типов (GR и MR) рецепторов в 1,5-2 раза и поддержание соотношения GR:MR на уровне 1:1— является универсальным для ВБ и ПТСР иротективным механизмом.

Специфической характеристикой ПТСР является сочетание повышенной стрессореактивности с включением быстрого глюкокортикоидного торможения ГГАС

(патологическая сенситизация ООС) (Yehuda, Antelman, 1993; Рыбникова и др., 2010). Обнаруженное при ПТСР снижение содержания GR в ПВЯ гипоталамуса, возможно, свидетельствует об ослаблении гипоталамической ультракороткой петли обратной связи. Можно предположить, что быстрая ООС реализуется за счет негеномного действия глкжокортикоидов, связанного с их взаимодействиями на уровне мембран (Stahn, Buttgereit, 2008). В последнем случае сенситизация этих механизмов, вероятно, достигается путем патологического увеличения пула мембранных GR.

ГП способствует повышению экспрессии GR в экстрагипоталамических структурах в модели ПТСР, однако, в меньшей степени, чем при ГПВБ. При этом не выявлено различий в содержании GR между дорзальным и вентральным гиппокампом. Очевидно, это свидетельствует о том, что роль гиппокампальных GR в специфической компенсации нейроэндокринной дисрегуляции ITAC при данной патологии несущественная. Значительное усиление экспрессии GR после применения ГП выявлено лишь в ПВЯ гипоталамуса, причем как в мелко- так и в крупноклеточном ядре, что, возможно, связано с нормализацией ООС ГГАС, а также с другими аспектами геномного действия глкжокортикоидов.

В заключение следует отметить, что в рамках настоящей работы впервые проведено детальное изучение процессов, происходящих на первом регуляторном уровне геном-зависимых механизмов антидепрессивных и анксиолитических эффектов гипоксического прекондиционирования — уровне, связанном с активностью транскрипционных факторов, контролирующих функционирование генома нервных клеток. Проведенные исследования доказывают важную роль транскрипционных факторов в реализации антидепрессивного и анксиолитического действия гипоксического прекондиционирования, а полученные сведения вносят существенный вклад в понимание этих процессов. Наличие описанных выше общих и специфических особенностей активации CREB, NF-kB (р65), c-Fos, HIF-la, NGFI-A, GR, и MR при развитии разных форм психопатологий и их коррекции прекондиционированием свидетельствуют о том, что в основе как патогенных, так и компенсаторных процессов лежат изменения активности генетического аппарата нейронов мозга, реализуемые специфическими факторами транскрипции.

ВЫВОДЫ

1. При формировании депрессивноподобного состояния в модели эндогенной депрессии и тревожного состояния в модели посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) у крыс обнаружены как схожие, так и специфические для каждого патологического состояния модификации экспрессии транскрипционных факторов CREB, NF-KB(p65), c-Fos, NGFI-A, HIF-la, а также глюкокортикоидных рецепторов (GR) в гиппокампе, неокортексе и гипоталамусе.

2. Баранова К.А., Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Самойлов М.О. Эффект гипокеичеекого прекондиционирования на экспрессию транскрипционного фактора NGFI - А в мозге крыс после неизбегаемого стресса в модели «выученная беспомощность» // Росс, физиол. журн. нм. И.М. Сеченова. - 2009. - Т.95, №4. - С.405-416. [Переведена: Baranova К.А., Rybnikova Е.А, Mironova V.I., Samoilov М.О. Effects of Hypoxic Preconditioning on Expression of Transcription Factor NGFI-A in the Rat Brain after Unavoidable Stress in the "Learned Helplessness" Model // Neuroscience and Behavioral Physiology. -2010. - V.40, №6. - P.693-700.]

3. Rybnikova E., Gluschenko T., Tulkova E., Baranova K.. Samoilov M. Mild hypobaric hypoxia preconditioning up-regulates expression of transcription factors c-Fos and NGFI-A in rat neocortex and hippocampus // Neurosci. Res. - 2009. - V.65, №4. - P.360-366.

4. Баранова K.A.. Миронова В.И., Рыбникова E.A., Самойлов М.О. Особенности экспрессии транскрипционного фактора HlF-la в мозге крыс при формировании депрессивноподобного состояния и антидепрессивных эффектов гипокеичеекого прекондиционирования // Нейрохимия. - 2010. - Т.27, №1. - С.40-46. [Переведена: Baranova К.А.. Mironova V.I.. Rybnikova Е.А., Samoilov М.О. Characteristics of the Transcription Factor HlF-la Expression in the Rat Brain during the Development of a Depressive State and the Antidepressive Effects of Hypoxic Preconditioning // Neurochem. J. - 2010. - V.4, №1. - P.35^10.]

5. Баранова K.A., Рыбникова E.A., Самойлов М.О. Участие транскрипционного фактора c-Fos в формировании протективного эффекта гипокеичеекого прекондиционирования в модели посттравматического стрессового расстройства // Нейрохимия. - 2011. — Т.28, №4. - С.294-299. [Переведена: Baranova К.А., Rybnikova Е.А., Samoilov М.О. Involvement of the Transcription Factor c-Fos in the Protective Effect of Hypoxic Preconditioning in a Model of Post- Traumatic Stress Disorder in Rats // Neurochem. J. - 2011. - V.5, №4. - P.257-262.]

6. Баранова K.A., Рыбникова E.A., Самойлов М.О. Антидепрессивный эффект гипокеичеекого прекондиционирования сопровождается модификацией экспрессии транскрипционного фактора c-fos в мозге крыс в ответ на неизбегаемый стресс // Бюлл. эксперим. биол. мед. -2011. -Т.152, №11. -С.495-498. [Переведена: Baranova К.А., Rybnikova Е.А., Samoilov М.О. Antidepressant effect of hypoxic preconditioning is associated with modification of expression of transcription factor c-Fos in rat brain in response to unavoidable stress. // Bull. Exp. Biol. Med. - 2012. - M.152. №5. - P.564-567.]

7. Баранова K.A. Общие и специфические механизмы патогенеза тревожных и депрессивных расстройств в моделях на животных: роль транскрипционных факторов // Медицинский академический журнал. - 2012. - "Г.12, №3. - С.35-37.

Тезисы докладов

8. Баранова К.А.. Рыбникова Е.А., Миронова В.И. Гипоксическое прекондиционирование модифицирует экспрессию HIF-la в мозге крыс после неизбегаемого стресса // Материалы межинститутской конференции молодых ученых «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды», поев. 100-летию акад. В.Н. Черниговского. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 14.

9. Баранова К.А., Миронова В.И., Рыбникова Е.А. Роль ранних генов в антидепрессивных эффектах гипокеичеекого прекондиционирования у крыс // Материалы

конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» - Санкт-Петербург, 2008. - С. 15.

10. Баранова К.А.. Миронова В.И., Рыбникова Е.А. Исследование вовлечения ранних генов ИОРІ-А и с-Роэ в антидепрессивные эффекты гипоксического прекондиционирования у крыс // Материалы Российско-Польского рабочего симпозиума «Гипоксическое, ишемическое прекондиционирование мозга». - Санкт-Петербург, 2008. - С.110-114.

11. Баранова К.А.. Миронова В.И., Рыбникова Е.А. Гипоксичское прекондиционирование модифицирует экспрессию транскрипционых факторов в мозге крыс в ответ на неизбегаемый стресс // Материалы двенадцатой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина». -Санкт-Петербург, 2009. - С.37.

12. Баранова К.А. Вовлечение индуцибельных транскрипционных факторов в формирование депрессивных патологий и антидепрессант-подобных эффектов гипоксического прекондиционирования // Материалы конференции молодых ученых «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды», поевю 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. - Санкт-Петербург, 2010. - С.9-10.

13. Баранова К.А. Транскрипционный фактор СЯЕВ участвует в формировании постстрессовых патологий и антидепрессант-подобных эффектов гипоксического прекондиционирования // Материалы всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». - Санкт-Петербург, 2010. -Медицинский академический журнал. - 2010. - Т.10, №5. - С.6.

14. Баранова К.А. Участие транскрипционных факторов в антидепрессивных эффектах гипоксического прекондиционирования // Материалы седьмого международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». - Судак, Крым, Украина, 2011.- С.80-8І.

15. Баранова К.А- Рыбникова Е.А. Кортикостероидные рецепторы мозга вовлекаются в формирование постстрессовых патологий и протективных эффектов гипоксического прекондиционирования // Материалы XIV международнго совещания по эволюционной физиологии, поев, памяти акад. Л.А. Орбели. - Санкт-Петербург, 2011.- С.25.

16. Баранова К.А. Экспрессия транскрипционных факторов в мозге крыс при развитии и предотвращении тревожно-депрессивных состояний // Материалы всероссийской молодежной конференции — школы «Нейробиология интегративных функций мозга», поев. 120-летию создания Физиологического отдела под руководством И.П. Павлова в Императорском институте экспериментальной медицины. - Санкт-Петербург, 2011. - Медицинский академический журнал. - 2011. - Т. 11, Спецвыпуск. - С. 11 -12.

17. Баранова К.А. Транскрипционные факторы р-СЯЕВ, с-Гок и 1ІІР-1 в мозге крыс участвуют в формировании тревожно-депрессивных состояний, а также в их предотвращении с помощью гипоксического прекондиционирования // Материалы конференции молодых ученых Института цитологии РАН. - Санкт-Петербург, 2012. - Цитология. - 2012. - Т.54, №4. - С.335-336.

18. Баранова К.А. Исследование роли активационных, индуцибельных и лиганд-зависимых транскрипционных факторов мозга в развитии и предотвращении тревожно-

депрессивных состояний ZZ Материалы VIII международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». - Судак, Крым, Украина, 2012. — С.75-76.

19. Баранова К.А. Гипоксическое прекондиционирование предотвращает тревожно-депрессивное состояние в модели на крысах: роль транскрипционных факторов мозга ZZ Материалы междисциплинарной конференции «Адаптационные стратегии живых систем». -Новый Свет, Крым, Украина, 2012. - С.9-10.

Подписано в печать 22.04.2013г. Формат 60x84/16 П.л. 1,43 Уч.-изд.л 1,43. Тир.ЮО экз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. Іогоиз5е1@таі1.і Зак. № 13447 от 22.04.2013г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баранова, Ксения Александровна, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И.П. ПАВЛОВА

На правах рукописи

БАРАНОВА КСЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ТРЕВОЖНО-ДЕПРЕССИВНЫХ СОСТОЯНИЙ И РЕАЛИЗАЦИИ АНТИДЕПРЕССИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ

Специальность 03.03.01 - физиология

00

00 ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

1Л 00

ТГ кандидата биологических наук

со я

^ со

5 ^ Научный руководитель

04 ^

^ доктор биологических

^^ наук Рыбникова Е. А.

Санкт-Петербург 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................12

1.1. молекулярно-клеточные основы патологических и адаптивных реакций нейронов, внутриклеточные сигнальные пути...............................................................12

1.2. транскрипционные факторы (ТФ)...........................................................................14

1.2.1. Классификация..................................................................................................15

1.2.2. Активационные ТФ, активируемые протеинкиназами................................16

1.2.2.1. Протеинкиназы...........................................................................................16

1.2.2.2. С11ЕВ...........................................................................................................18

1.2.2.2. Ж-кВ...........................................................................................................23

1.2.3. Индуцибелъные ТФ - продукты ранних генов................................................30

1.2.3.1. Гены раннего и позднего действия...........................................................30

1.2.3.2. С-Ров............................................................................................................31

1.2.3.3. ШИ-А........................................................................................................35

1.2.3.4. НИМ............................................................................................................40

1.2.4. ТФ-рецепторы гормонов...............................................................................45

1.2.4.1. Гормон-зависимые механизмы и нейроэндокринная регуляция адаптивных процессов...............................................................................................45

1.2.4.2. СИ. и МЯ......................................................................................................49

1.3. тревожно-депрессивные состояния.......................................................................54

1.3.1. Биохимические/нейроэндокринные нарушения при тревожно-депрессивных состояниях......................................................................................................................55

1.3.2. «Выученная беспомощность» как экспериментальная модель депрессии 59

1.3.3. Экспериментальные модели ПТСР. Модель «стресс -рестресс».............60

1.4. гипоксическое прекондиционирование - способ повышения адаптивных возможностей мозга............................................................................................................62

1.4.1. Нейропротективные эффекты гипоксического прекондиционирования и их молекулярные и нейрохимические механизмы.............................................................63

1.4.2. Протективные эффекты гипоксического прекондиционирования в моделях «выученная беспомощность» и «стресс - рестресс»................................................65

1.5. экспрессия ТФ в мозге при тревожно-депрессивных состояниях и гипоксическом прекондиционировании.........................................................................67

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................................72

2.1. Модели психоэмоциональных стрессов...............................................................72

2.1.1. «Выученная беспомощность» - экспериментальная модель эндогенной депрессии.........................................................................................................................72

2.1.2. Парадигма «стресс-рестресс» - модель посттравматического стрессового расстройства...........................................................................................73

2.2. гипоксическое прекондиционирова1ше.................................................................74

2.3. Гистологические методы...........................................................................................76

2.3.1. Гистологическая обработка ткани мозга.....................................................76

2.3.2. Окрашивание по методу Ниссля......................................................................77

2.4. иммуноферментные методы......................................................................................78

2.4.1. Иммуноцитохимический метод........................................................................79

2.4.2. Вестерп-блот анализ...........................................................................................81

2.4.2.1. Пробоподготовка...........................................................................................82

2.4.2.2. Электрофорез белков в ПААГ по методу Лэммли.................................83

2.4.2.3. Электроблоттинг - перенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану.....................................................................................................................83

2.4.2.4. Иммуноокрашивание белков на мембране..............................................84

2.4.2.5. Определение концентрации белка по методу Бредфорда......................86

2.5. Компьютерный анализ изображений......................................................................87

2.6. Статистическая обработка результатов.................................................................88

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................89

3.1. Морфологическая оценка повреждающего действия острых психоэмоциональных стрессов на нейроны гиппокампа и неокортекса...............89

3.2. Изменения активности ТФ С11ЕВ и ОТ-кВ в мозге крыс после стрессорного воздействия. Эффекты ГП...................................................................................................91

3.2.1. ВБ стресс влияет на активность СЯЕВ незначительно, в то время как гипоксическое прекондиционирование способствует активации данного ТФ в ответ на патогенный стресс.......................................................................................91

3.2.2. Динамика экспрессии рСКЕВ в образованиях мозга крыс после стресса-рестресса. Сравнительный анализ прекондиционированных и

непрекондиционированных животных........................................................................95

3.2.3 Экспрессия МГ-кВ в мозге непрекондиционированных и

прекондиционированных крыс после неизбегаемого стресса в модели ВБ..............98

3.2.4. Экспрессия АГ-кВ в мозге крыс при формировании экспериментального ПТСР и его коррекции гипоксическим прекондиционированием.............................101

3.3. Экспрессия ранних генов в мозге крыс при развитии тревожно-депрессивных состояний: эффект гипоксического прекондиционирования..................................103

3.3.1. ГП модифицирует динамику c-Fos-иммунореактивности в мозге крыс в ответ на неизбегаемый стресс в модели «выученной беспомощности»..............103

3.3.2. Паттерн экспрессии c-Fos в модели посттравматического стрессового расстройства. Эффект гипоксического прекондиционирования...........................107

3.3.3. Профиль экспрессии NGFI-A в мозге крыс в парадигме ВБ. Влияние ГП... 110

3.3.4. Особенности экспрессии транскрипционного фактора NGFI -А в модели ПТСР у непрекондиционированных и прекондиционированных животных...........114

3.3.5. Изменения содержания иммунореактивного HIF-la в нейронах мозга при развитии депрессивноподобного состояния в модели "выученной беспомощности"

у крыс; влияние гипоксического прекондиционирования.........................................117

3.3. б. Влияние ГП на экспрессию индуцибельной субъединицы HIF-la в парадигме «стресс -рестресс»....................................................................................................120

3.4. Нейроэндокринные механизмы анксиолитического эффекта ГП в моделях ПТСР и ВБ: экспрессия кортикостероидных рецепторов...........................................123

3.4.1. Гипоксическое прекондиционирование предотвращает редукцию GR в нейронах мозга после ВБ стресса...............................................................................123

3.4.2. Экспрессия GR в образованиях мозга крыс при формировании ПТСР патологии и ее предотвращении гипоксическим прекондиционированием...........127

3.4.3. Особенности экспрессии MR в мозге крыс при формировании депрессивноподобного состояния и антидепрессивных эффектов ГП.................129

3.4.4. MR мозга вовлекаются в формирование протективных эффектов ГП в модели ПТСР.................................................................................................................132

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................................135

4.1. Вовлечение ТФ в формирование тревожно-депрессивных состояний ВБ и ПТСР......................................................................................................................................135

4.1.1. Активационные ТФ...........................................................................................138

4.1.2. Индуцибельные ТФ............................................................................................140

4.1.3. ТФ — кортикостероидные рецепторы............................................................148

4.2. Вовлечение ТФ в антидепрессив! юе и анксиолитическое действие ГП.........153

4.2.1. Активационные ТФ после ГПВБ и ГП ПТСР стресса..................................155

4.2.2. Индуцибельные ТФ после прекондиционированного стресса......................158

4.2.3. Стероидные рецепторы после применения ГП............................................164

ВЫВОДЫ.............................................................................................................................171

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................173

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропый гормон

ВБ - «выученная беспомощность»

ВРС - внутриклеточные регуляторные системы

ГГАС - гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система

ГП - «гипоксическое прекондиционирование»

КЛ - кортиколиберин, corticotropin-releasing hormone

ООС - отрицательная обратная связь

ПТСР - посттравматическое стрессовое расстройство

ТФ - транскрипционный фактор

цАМФ и цГМФ - циклические аденозин- и гуанозинмонофосфаты

BDNF - brain-derived neurotrophic factor, фактора роста нервных клеток

c-Fos - FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog

CRE - cAMP regulatory elements, участки ДНК, регулируемые цАМФ

CREB - cAMP response element binding protein, белок, присоединяющийся к цАМФ-

регулируемому участку

DG - зубчатая извилина

ЕРО- эритропоэтин

ERK - extracellular signal-regulated kinase, протеинкиназы, регулируемые внеклеточными сигналами

GR - glucocorticoid receptor, глюкокортикоидные рецепторы HIF-1 - hypoxia-inducible factor-1, гипоксия-индуцибельный фактор INK - NH2-terminal Jun kinase, киназа N-концевого фрагмента Jun LTP - долговременная потенциация

МАРК - mitogen activated protein kinases, митоген-активируемые протеинкиназы

mPVN - крупноклеточная часть паравентрикулярного ядра

MR - mineralocorticoid receptor, минералокортикоидные рецепторы

NF-kB - nucler factor kappa В, ядерный фактор

NGFI-A - nerve growth factor-inducible gene А, ген индуцируемый фактором роста нейронов

NMDA - N-метил-О-аспартат

РКА, РКС - protein kinases, протеинкиназы А, С

pPVN - мелкоклеточная часть паравентрикулярного ядра

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Одной из фундаментальных проблем нейробиологии и медицины является исследование адаптивных и патологических реакций нейронов мозга на влияния внешней среды, особенно при действии повреждающих факторов. Выяснение молекулярно-клеточных механизмов таких реакций необходимо для разработки новых эффективных способов повышения резистентности мозга к повреждающим воздействиям.

Резко возросшее в последние десятилетия количество жертв чрезвычайных ситуаций, боевых и противоправных действий, серьёзных конфликтов в обществе и микросоциуме привело к увеличению распространённости тревожно-депрессивных расстройств, представляющих собой большую группу заболеваний, включающую различные формы депрессий и другие постстрессовые патологии. Согласно данным ВОЗ, эта группа заболеваний занимает первое место в мире среди психических расстройств. Но, несмотря на широкую распространенность, и высокий интерес исследователей к этой проблеме, механизмы патогенеза постстрессовых тревожно-депрессивных состояний остаются во многом непознанными и, как следствие, относительно неэффективной оказывается современная фармакотерапия таких расстройств. Литературные данные свидетельствуют о том, что развитие тревожно-депрессивных состояний сопровождается нарушениями молекулярно-клеточных и гормон-зависимых механизмов регуляции адаптивных функций организма. Весьма вероятно, что в основе патогенеза данных расстройств лежит диерегуляция активации транскрипционных факторов, приводящая к нарушениям индукции контролируемых ими ранних генов и, далее, продуктов поздних генов, в частности кодирующих медиаторы, нейрогормоны, гормоны и их рецепторы (Уа1с1уа, Бишап, 2001; Соиг1еу е1 а1., 2008). Изучение механизмов патогенеза этих состояний и разработка новых технологий лечения невозможны без преклинических исследований, проводимых в экспериментальных моделях на лабораторных животных.

В настоящее время эффективным способом повышения резистентности мозга к повреждающим воздействиям является применение гипоксического прекондиционирования - предъявление умеренных экстремальных воздействий, направленное на мобилизацию эндогенных эволюционно приобретенных генетически-детерминированных защитных механизмов (Самойлов, 1999; Самойлов и др., 2004; 2012; Самойлов, Рыбникова, 2012). Наиболее распространенный вид прекондиционирования - гипоксическое/ишемическое было впервые использовано на сердце в 1986 году (Миггу е1 а1., 1986). На современном этапе в значительной мере раскрыты механизмы кардиопротективных эффектов ишемического

прекондиционирования миокарда, что способствовало внедрению данного способа в медицинскую практику (ЯегкаПа, К1опег, 2007; Ратманова, 2008). Эндогенные механизмы толерантности мозга, индуцируемые ишемическим и, в особенности, гипоксическим прекондиционированием (ГП), исследованы в меньшей степени. Показано вовлечение внутриклеточных сигнальных каскадов, глутаматных рецепторов, антиапоптотических белков и пептидных антиоксидантов в механизмы повышения резистентности нейронов мозга к гипоксии, индуцируемого ишемическим/гипоксическим прекондиционированием (Самойлов и др., 2001-2012; ЯуЬшкоуа с1 а1., 2002-2012; Бешепоу е1 а1., 2002; БЬагр & а1., 2004; Строев, Самойлов, 2004; ОЬгепоуисИ, 2008). Установлено, что ключевая роль в индукции нейропротективных процессов при применении ГП принадлежит кооперативной активации транскрипционных факторов (Самойлов, Рыбникова, 2012).

Недавно было обнаружено, что ГП повышает устойчивость мозга и организма в целом не только к повреждающим воздействиям гипоксической природы, но и психоэмоциональным стрессам, предотвращая формирование постстрессовых тревожно-депрессивных расстройств (Рыбникова и др., 2006; 2007; 2008; 11уЬшкоуа е1 а1., 2007). Однако, несмотря на описанное мощное антидепрессивное и анксиолитическое действие ГП, внедрение этого метода в медицинскую практику в качестве способа профилактики и коррекции постстрессовых патологий невозможно без достаточных сведений о механизмах его действия, среди которых очевидно важнейшую роль играют модификации активности генома (Рыбникова, 2010). Требуется последовательное и комплексное изучение геном-зависимых механизмов антидепрессивных эффектов ГП на различных уровнях, начиная от активности транскрипционных факторов и до экспрессии регулируемых ими генов и их продуктов. В этом отношении ГП представляет собой не только перспективный с практической точки зрения немедикаментозный способ, но и удобную экспериментальную модель для фундаментальных исследований эндогенных нейропротективных процессов и механизмов их индукции.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей экспрессии активационных, индуцибельных и лиганд-зависимых транскрипционных факторов в образованиях мозга, вовлекаемых в патогенез постстрессовых расстройств, при формировании экспериментальных тревожно-депрессивных состояний и их коррекции гипоксическим прекондиционированием у крыс. Основные задачи исследования:

1. Изучить экспрессию активационных транскрипционных факторов pCREB и NF-KB(p65) в гиппокампе, неокортексе, гипоталамусе крыс при развитии депрессивноподобного состояния «выученной беспомощности» (модель эндогенной депрессии) и тревожного состояния (модель посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) «стресс-рестресс»).

2. Выявить особенности постстрессовой активации CREB и NF-icB(p65) у прекондиционированных умеренной гипобарической гипоксией животных, у которых тревожно-депрессивные состояния не формируются.

3. Оценить динамику экспрессии индуцибельных транскрипционных факторов c-Fos, HIF-la и NGFI-A в гиппокампе, неокортексе, гипоталамусе крыс в ответ на воздействие патогенным стрессом в моделях депрессии и ПТСР. Провести сравнительное исследование паттернов индукции этих факторов у непрекондиционированных и прекондиционированных животных.

4. Охарактеризовать участие лиганд-зависимых транскрипционных факторов -глюко- (GR) и минералокортикоидных (MR) рецепторов гиппокампа, неокортекса и гипоталамуса крыс в механизмах развития модельной депрессии и ПТСР, а также их коррекции гипоксическим прекондиционированием.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Пространственный паттерн нарушений экспрессии транскрипционных факторов в мозге специфичен для различных форм тревожно-депрессивной патологии у крыс. При формировании депрессивноподобного состояния, наиболее выраженные модификации экспрессии исследуемых транскрипционных факторов наблюдаются в гиппокампе, в то время как при развитии тревожного расстройства-аналога Г1ТСР наибольшие изменения локализуются в неокортексе и паравентрикулярном ядре гипоталамуса.

2. Недостаточная активация факторов CREB и NF-idB(p65), отсроченная сверхэкспрессия c-Fos и HIF-la и снижение уровня GR в исследованных образованиях мозга в условиях патогенного стресса является общим компонентом развития постстрессовых тревожно-депрессивных расстройств.

3. Механизмы антидепрессивного и а�