Оценка и прогнозирование влияние гипоксии на энергетические процессы мозга с применением математических моделей.

Мошкова, Альбина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка и прогнозирование влияние гипоксии на энергетические процессы мозга с применением математических моделей.
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Оценка и прогнозирование влияние гипоксии на энергетические процессы мозга с применением математических моделей."

На правах рукопип:

Мошкова Альбина Николаевна

Опенка и прогнозирование влияния гипоксии на энергетические процессы мозга с применением математических моделей

Специальность 03.01.04 - биохимия

4847153

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Нижний Новгород 2011

4847153

Работ,'; выполнена з Г'ОУ ВГТО «Нижегородская государсгьсаная мелпдавская 'академия» к Нижегородском. государственном техническом, униьерскгете мм: Р.Е Алексеева

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

' заслуженный деятель'науки. • доктор медицинских наук, профессор Хватова Елена Михайловна

доктор биологических наук, профессор Весслов Александр Павлович

доктор биологических наул, профессор • Самарцсв Вкктор Николаевич

Марзшсьик государственный улверсг-пет.

• доктор медицинских наук, Лавровский Сергей Николаевич

Арзамасский медицинский колледж,

Ведущая организация:

Сайта-Петербургский государственный-университет, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «Дя? 2011г. в ^ _ чгсои на заседанук

дис; гртаци о иного совета Д212.166.15 при Нижегородском Ьсударствешюм университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950,г. Нижний Новгород, пр. Гагарина.23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГО У ВГ10 «Нижегородский государственный университет» по адресу: 603950,г. Нижний Новгород, пр., Гагарина/23.

Автореферат разослан « >, 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук,

доцент

Копылова Светлана Вячеславовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гипоксия и ишемия оказывают существенное повреждающее воздействие на состояние мозга, поэтому защита от гипоксии и ее последствий приобретает социальную значимость. Повышение устойчивости мозга к повреждающим факторам является крайне актуальной задачей и привлекает специалистов различных профилей клинической и экспериментальной биологии и медицины. (Цветкова, 2005; У1аБ0У, 2005).

Одним из наиболее эффективных немедикаментозных способов, направленных на мобилизацию защитных механизмов мозга, является гипоксическое прекондиционирование. Оценка характера протективного действия гипоксического прекондиционирования на структурно-функциональные повреждения мозга имеет важное значение для определения возможного спектра применения этого вида прекондиционирования в клинической практике (Хватова и др., 1987-2009г., Рыбникова, 2006-2010, Самойлов, Строев, 2003-2010, Лукьянова, 2002-2010 и др.). Для разработки способов защиты от гипоксии и ее последствий требуется создание алгоритма оценки и прогнозирования энергетического состояния мозга в экстремальных условиях, а также прогнозирование эффективных режимов тренировки, формирующих устойчивую адаптацию мозга к повреждающим воздействиям дефицита кислорода. Привлечение методов математического моделирования в решении биологических задач дает возможность получать информацию о состоянии изучаемых процессов и систем, сокращая время экспериментальной работы, экономя дорогостоящие реактивы и ■ сохраняя жизнь животным. При этом возможно установление количественных отношений между отдельными элементами систем, что позволяет описать поведение исследуемых систем как единого целого (Дромашко, 1999).

В случае больших, сложно организованных систем, формализованный подход может оказаться в начале исследования единственным средством получить информацию о существующих в системе взаимодействиях и сделать первый шаг к проникновению в механизмы изучаемого явления. Использование моделей множественной регрессий, объединяющих различные характеристики метаболических процессов мозга при гипоксических и ишемических повреждениях, позволяет получать достоверную информацию об энергетическом балансе мозга и прогнозировать функциональное состояние мозга в экстремальных условиях жизнедеятельности и адаптации к неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Целью настоящего исследования является оценка влияния гипоксического воздействия на энергетический обмен мозга экспериментальных животных и применение методов математического анализа для прогнозирования возникающих изменений в условиях гипоксии и адаптации к дефициту кислорода.

Для достижения поставленной цели * в диссертационной работе решаются следующие задачи:

1. исследование зависимых отношений между показателями ферментативной системы митохондрий и концентрацией АТФ и прогнозирование энергетического потенциала мозга при дисфункции ферментативной системы в условиях дефицита кислорода;

2. анализ зависимости между показателями окислительного фосфорилирования в условиях гипоксии и прогнозирование концентрации АТФ мозга при нарушении скорости фосфорилирования АДФ;

3. изучение зависимости между концентрациями адениновых нуклеотидов нервной ткани и прогнозирование содержания АМФ при Нарастании тяжести гипоксического воздействия;

4. исследование количественной зависимости между уровнями/ адениновых нуклеотидов в ткани мозга в условиях гипоксического прекондиционирования с целью прогнозирования пределов устойчивости организма к гипоксии.

Научная новизна исследования:

1. Впервые установлено, что количественная зависимость между активностью окислительных ферментов .дыхательной цепи митохондрий, миКК и конечной концентрацией АТФ в мозге животных характеризуется линейной функцией у = а0х + ах, структура которой не меняется в условиях дефицита кислорода;.

2. Впервые показано, что зависимость конечной концентрации АТФ в мозге животных от скорости фосфорилирования АДФ изменяется под воздействием гипоксии от линейной у интактных животных до более

сложной дробно-линейной у - —-—;

асх ' а:

3. Впервые установлено изменение вида количественной зависимости между содержанием АМФ и АТФ от простого линейного при гипобарической гипоксии в более сложный - кубический у = а0х3 + + а2х+ аъ в условиях ишемии и гипоксического

■ прекондиционирования;

4. средствами математического моделирования зависимости между уровнями АТФ и АМФ в условиях гипоксического прекондиционирования впервые показана возможность прогнозирования характера развития процесса адаптации мозга к недостатку кислорода;

5. применение технологии моделирования на уровне формального математического аппарата впервые показало, что изменение вида моделей, объединяющих зависимые показатели энергоаккумулирующего процесса, интегрально отражает функциональное состояние мозга в условиях кислородного голодания.

Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе исследования разработаны расчетные способы определения ферментативной активности митохондриальной дыхательной цепи, а также концентрации высокоэнергетических фосфатов в мозге животных в условиях гипоксического воздействия, защищенные авторскими свидетельствами и патентами Российской Федерации. Эти способы могут быть использованы в экспериментальных лабораториях, изучающих проблему гипоксии и ишемии мозга для получения информации о состоянии биологического процесса под влиянием гипоксического воздействия, экономя дорогостоящие реактивы, животных и время.

прекондиционирования, которые могут быть использованы при разработке эффективных методов гипокситерапии.

Составлена программа, позволяющая изучать вид количественной зависимости между показателями биологической системы или процесса, строить математические модели, объединяющие экспериментальные данные в различных условиях внешней среды. Программа может быть использована биологами в исследовательской работе.

Математическое моделирование зависимости между показателями энергетического обмена мозга позволяет разрабатывать новые способы оценки, прогнозирования и коррекции гипоксических состояний мозга, основанные на адаптации к различным формам нарушения кислородного режима.

Положения, выносимые на защиту:

1. Количественная зависимость уровня АТФ от активности ферментативной системы митохондрий имеет линейный вид, не зависящий от тяжести гипоксического воздействия. Предлагается расчетный способ прогнозирования энергетического потенциала мозга при дисфункции ферментативной системы.

2. Вид количественной зависимости между показателями окислительного фосфорилирования и нуклеотидного фонда мозга изменяется от линейной формы в более сложную (дробно-линейную и кубическую) и характеризует состояние этих процессов при нарушении кислородного режима.

3. 4-х кратное гипоксическое прекондиционирование является наиболее эффективным для формирования устойчивого состояния мозга к дефициту кислорода. Описание количественной зависимости уровней адениновых нуклеотидов элементарными функциями позволило установить колебательный характер развития процесса адаптации к гипоксии и прогнозировать изменение этого процесса при долгосрочных тренировках.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были представлены на: Всероссийской конференции «Организация и пластичность коры больших полушарий головного мозга» (Москва, 2001); Всероссийской

конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» (Москва, 2003); IV Всероссийской конференции с международным участием «Гипоксия. Механизмы. Адаптация. Коррекция» (Москва, 2005); Всероссийской конференции «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004); Всероссийской конференции «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2000); Всероссийской конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности центральной нервной системы» (Пенза, 2006); Всероссийской конференции «Новое в изучении пластичности мозга» (Москва, 2000); III Международной конференции «Hypoxia Medical» (Санкт-Петербург, 1998); Всероссийской конференции «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии я пластичности мозга» (Москва, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); IV съезде биохимиков (Новосибирск, 2008); III Всероссийской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002); Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды» (Санкт-Петербург, 2010) и т.д.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографии и 4-х приложений. Общий объем работы 233 страницы, в ней содержится 15 рисунков, 39 таблиц. Список литературы включает 350 наименований, приложения к работе содержат 30 страниц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проведена совместно с сотрудниками кафедры биохимии НГМА зав. кафедрой д.б.н. Ерлыкиной Е.И., к.б.н. Семеновой Т.С., к.б.н. Мироновой Г .В., к.м.н. Сидоркиной JI.H., к.м.н. Колчиной Н.С., к.м.н. Шуматовой E.H. Научный консультант работы - заслуженный деятель науки РФ, профессор, д.м.н. Хватова Е.М.

НаучнЬши консультантами обработки экспериментальных результатов являлись зав кафедрой «Прикладная математика» НГТУ профессор, д.ф.-м.н. Митяков С.Н. и профессор кафедры д.ф.-м.н. Рязанцева И.П.

В экспериментах использовали белых беспородных крыс, весом 120 — 150г, содержащихся на общевиварном режиме, также кроликов-самцов породы «русский великан» весом 2,5 - 3,0кг. Общее количество экспериментальных животных (260 крыс, 260 кроликов) было поделено на контрольную и опытную группы. Контрольную группу составляли интактные животные. Исследование интактных животных проводилось одновременно с опытными на протяжении всей экспериментальной работа.

Экспериментальной моделью служила гипобарическая гипоксия, создаваемая разрежением атмосферного давления в барокамере проточного типа и острая неполная ишемия. В опытную группу входили животные с нормальной температурой тела, которые находились в атмосфере с разной степенью дефицита кислорода и разной экспозицией: 310 мм рт.ст. («высота 7000 м) продолжительностью 30, 60, 240, 480 минут; 270 мм рт.ст. («высота 8000 м) продолжительностью 15, 30, 60, 240 минут; 230 мм рт.ст. («высота 9000 м) продолжительностью 30, 60 минут.

Моделирование острой неполной ишемии головного мозга создавалось путем билатерального лигирования общих сонных артерий. Операция проводилась под наркозом: нембутал внутривенно в дозе 30 мг/кг веса животного. Продолжительность операции 7-10 минут. Ткань мозга исследовали через 30 минут, 1,5 и 18 часов после оперативного нарушения мозгового кровообращения.

Гипоксическое прекондиционирование создавали с помощью 2-, 4-х, 8-и кратных гипоксических тренировок экспериментальных животных по 1 часу в барокамере проточного типа при разрежении атмосферного давления до 310мм рт.ст., соответствующего «высоте» 7000м над уровнем моря. Проверку устойчивости к кислородному голоданию проводили моделированием острой неполной ишемии головного мозга прекондиционированных животных путем билатеральной двойной перевязки общих сонных артерий с экспозицией 30 минут, а также острой гипоксической гипоксией при атмосферном давлении 230мм рт.ст. с экспозицией 30 минут («высота» 9000м). Оценка степени тяжести изменений физиологического состояния проводилась по поведению экспериментальных животных, частоте и ритму дыхания, выживаемости. Выделение митохондриальной фракции головного мозга проводилось методом дифференциального центрифугирования (Fonio, 1960; Диже, 2003). Полученная фракция (митохондриальная фракция) служила объектом в независимых экспериментах по определению активности окислительных ферментов ДЦ, креатинкиназы, содержаний адениновых нуклеотидов.

. Активность митохондриальных окислительных ферментов определялась спектрофотометрическими методами: сукцинат: цитохром С-оксидоредуктаза (сукцинатдегидрогеназа) - Potter (1942), Гулидова, Сорокина (1967); НАД: цитохром С-оксидоредуктаза (НАДН-дегидрогеназа) - Machler (1955); цитохром С: Ог-оксидоредуктаза (цитохромоксидаза) - Hess Pope (1953), Гулидова, Сорокина (1967). Активность сукцинатдегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы определяли по скорости восстановления окисленного цитохрома-С, а цитохромоксидазы - по скорости его окисления.

Активность митохондриальной креатинкиназы определяли потенциометрическим методом JI.B. Белоусовой в модификации (1987).

Фосфорилирующую активность митохондрий мозга определяли полярографическим методом. В качестве рабочего электрода применяли открытый платиновый электрод сферической формы, в качестве электрода сравнения - хлорсеребряный электрод. Объем полярографической ячейки -

1мл. В ячейке осуществлялось постоянное перемешивание митохондриальной суспензии с помощью магнитной мешалки. Все эксперименты проводили при комнатной температуре (20°С).

Среда инкубации митохондрий имела следующий состав: сахароза -250мкМоль; КН2Р04 - 20мкМоль; ЭДТА - 0,5мкМоль; рН - 7,4. В качестве субстрата окисления использовался глутамат калия (15мкМоль). Измерительная система была сконструирована на основе общих принципов работы устройств, применяемых для регистрации тканевого дыхания (Кондрашова с соавт. 1973). Объем добавленной митохондриальной суспензии в каждую пробу составлял 0,06мл и содержал 22,0-23,0мг белка. Конечный объем пробы 1мл. Добавка в инкубационную среду митохондриальной фракции проводилась сразу же после ее выделения. Регистрация дыхания осуществлялась на полярографе LP-60A.

Содержание АМФ, АДФ, АТФ определяли методом колоночной хроматографии на эктеола-целлюлозе в С/ - форме (Иванова, Рубель, 1969).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ BIOSTAT согласно рекомендациям по проведению математической статистики (Гланц С., 1999).

Подбор аппроксимирующих функций производился при помощи MS Excel.

При обработке экспериментальных данных и расчете параметров аппроксимирующих функций применялся метод выравнивания экспериментальной зависимости. Проводилась проверка значимости (t-критерий Сгьюденга, F-критерий Фишера-Снедекора) уравнений регрессии. Учитывая условия экспериментального воздействия, зависимость между выбранными показателями обменных процессов мозга аппроксимировалась моделями множественной регрессии.

Соответствие выбранных функций поставленным в работе задачам доказывалось сравнением аналитически рассчитанного значения y(x,z), характеризующего признак выходного объекта системы с экспериментально установленным. Рассматривалась относительная ошибка формулы. В тех экспериментальных ситуациях, где относительная ошибка расчета не превышает 20%, считали, что выбранные функции хорошо объединяют входные и выходные параметры исследуемой системы (Джорж Марри, 1983). Прогностическая способность подобранных функций проверялась сравнением аналитического расчета с литературными данными или дополнительно поставленным экспериментом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Прогнозирование энергетической активности мозга животных в условиях гипоксии методами математического моделирования.

1.1 Оценка и прогнозирование функционального состояния ферментных комплексов дыхательной цепи в условиях нарушения кислородного режима.

. В данном разделе представлен экспериментальный материал по изучению функции митохондриальных ферментных комплексов I, II, IV в разных условиях разрежения атмосферного давления. Проведен анализ зависимых отношений ферментов дыхательной цепи (ДЦ) математическими методами эмпирических зависимостей, чтобы доказать или опровергнуть существование некоторой направленности в характере их изменений.

Экспериментальные активности окислительных ферментов в условиях гипоксии отражены на диаграммах изменений активностей МФК I, И, IV ДЦ от величины атмосферного давления (760, 310, 270,230мм рт.ст.) (рис.1).

На рисунке 1 показано, что с нарастанием тяжести гипоксического воздействия просматривается сонаправленный характер изменения активностей НАДН-дг, СДГ, ЦО по отношению к уровню интактных животных: при умеренной форме гипоксии (атмосферное давление 310мм рт.ст.) - возрастающий; при острой (атмосферное давление 270 - 230мм рт.ст.) убывающий.

120

а 5

11 100

0) ю

% >-« 1 80

•!з ■» ь 60

и X л 40

о С

% О Е | " 1 20

> ^109,4

* ч

< 3,7 \

35,8 . 1 .48 \ , 40,9

!• 'Г __ 18,Г • < 19.3

24,8 19,1 16,6

0 Атмосс ¡>ерное да£ >ление 5

' СДГ - НАДН-дг -» " ЦО

1 ~ 760ммрт.ст. ш, ♦ - генеральные средние .

2 ~ 31 Омм рт.ст. значения активностей ферментов

3 ~ 270мм рт.ст.

4 ~ 230мм рт.ст.

Рис.1 - Изменение активности окислительных ферментов дыхательной цепи в разных условиях атмосферного давления

Проведен анализ суммарной активности НАДН-дг, СДГ и активности ЦО в условиях разного атмосферного давления. В таблице 1 представлена

суммарная активность НАДН-дг и СДГ, активность ЦО и коэффициент

„ ДО

отношения С =-.

НАДН-дг + СДГ

Из таблицы 1 видно, что при атмосферном давлении 760, 310мм рт.ст. активность ЦО больше суммарной активности НАДН-дг и СДГ приблизительно в 1,3 раза (С = 1,23; 1,35 соответственно).

Таблица 1

Суммарная экспериментальная активность НАДН-дг и СДГ, активность

Атмосф. давление мм рт.ст. Кол-во опытов СДГ НАДН-дг НАДН-дг+ СДГ ЦО С

мкМоль цит. С/мг белка в минуту

760 22 24,8 ±1,28 35,0 ±1,81 59,8±7,91 73,7±5,98 1,23

310 6 32,9 + 3,77* 48,0 ±3,14* 80,9±7,17* 109,4±5,87* 1,35

270 6 19,1 + 2,03* 18,7 ±3,03* 37,8±5,0б* 40,9±6,87* 1,08

230 6 19,3 ±1,86* ! 6,6 ±1,67* 35,9± 3,32* 33,6± 2,53* 0,9

* - статистически значимое различие показателя по сравнению с интактными животными при р<0,05.

С усилением тяжести гипоксичского воздействия (атмосферное давление 270-23 0мм рт.ст.) активность ЦО сопоставима с суммарной активностью НАДН-дг и СДГ, и коэффициент С—>1 (С=1,08; 0,9 соответственно).

Таким образом, анализ активности ЦО от суммарной активности НАДН-дг с СДГ показал, что в характере их изменений также просматривается некоторая направленность.

Задачей следующего этапа исследования являлось определение точного вида зависимости между ферментными комплексами ДЦ, установление степени тесноты взаимодействия выбранных показателей при дисфункции МФК и возможности прогнозирования активности МФК в условиях, опасных для жизнедеятельности организма.

При решении задачи использованы методы эмпирических зависимостей для оценки регуляторной роли митохондриальных ферментных комплексов I и II на функцию МФК IV в условиях гипоксического воздействия. Рассматривалась зависимость между (НАДН-дг+СДГ)(х;) и ЦО(уО-Подбирались корреляционные тренды с помощью MS Excel, которые давали возможность установить регрессионную модель, наилучшим образом объединяющую экспериментальные показатели х, и у, (i=l,2...n) выбранных ферментов.

Согласно проведенной проверке из всех рабочих моделей была выбрана линейная функция у = а„х + а,, объединяющая эмпирические показатели

митохондриальных ферментных комплексов начального и конечного участков дыхательной цепи в разных условиях гипоксического воздействия (рис.2).

В таблице 2 указана мера подгонки линейной функции к экспериментальным показателям: коэффициенты корреляции г, детерминации Я2 и критерии их значимости. Ошибка коэффициента корреляции,

1 -г2

вычисляемая по формуле =—колебалась в пределах 0,8 - 6,3%.

л/п

Таблица 2

Линейная аппроксимация у = а0х + а1 зависимости между активностями

окислительных ферментов дыхательной цепи, оценка значимости _коэффициента корреляции г и коэффициента детерминации II2_

и н" о. г ч а се и 2 % Зависимость (НАДНаг +СДГ)(дг)^ЦО(у) Коэф-т корреляции г Значимость "г" по 1-критерию Стьюдента г2 Коэфф-т детерминации И1 Значимость "И2" по Р-крит. Фишера-Снедекора

760 у = 0,6133х + 35,8886 0,986419 Г=0,99 к=П 0,9730225 0,973035 а=0,01 т=2 к!=1 к2=11

310 у = 0,7670л + 48,4923 0,963683 7=0,99 к=5 0,9286866 0,928787 а=0,01 т=2 . к,=1 к2=5

270 ¿ = 1,4519*+ 11,9286 0,92009848 у=0,98 к=4 0,8465812 0,861001 а=0,01 т=2 к!=1 к2=4

230 у = 0,9468х + 0,45 0,9433086 у=0,99 к=4 0,8896444 0,889106 а=0,01 т=2 к,=1 к2=4

По результатам таблицы 2 можно заключить, что существует очень тесная связь между суммарной активностью окислительных ферментов начального участка ДЦ и конечным ее участком, который не меняется от степени разрежения атмосферного давления (величина 0,9<г<1 и имеет высокую оценку значимости у=0,99 по ^критерию Стьюдента). Линейная функция адекватна экспериментальным значениям выбранных ферментов и не меняет своей структуры от тяжести гипоксического воздействия (г2 = Я2 и К2 имеет высокую значимость по Р-критерию Фишера-Снедекора).

270мм рт.ст.

60 70

НАДН-ДГ+СДГ

у= 1,4519х - 11,9286 Р2 = 0,8610

310мм рт.ст.

у = 0,7670х + 48,4923 Р)2 = 0,9287

70 80 90 100

НАДН-дг+СДГ

110

у = 0,9468х + 0,4500 # = 0,8898

33 38

, НАДН-дг+СДГ

Рис.2 Корреляционные тренды зависимости между окислительными ферментами дыхательной цепи митохондрий мозга животных в

разных условиях атмосферного давления

Для разработки способа прогнозирования активности ЦО при гипоксии любой степени тяжести проведена реконструкция линейной регрессионной модели у = аах + а] введением второй факторной переменной "Л" - величины

атмосферного давления, считая (» = 0,1), т.к. <z0>ai меняются от

степени тяжести гипоксического воздействия (таблица 2).

, . {A\)j

Вид <Р\(/г) = (Л2+ (Л0• cos —-— (г,у = 0,1) основывался на

графической иллюстрации зависимости Д; -(PiQ1) (рис.6).

Таким образом, регрессионная модель, аппроксимирующая зависимость между суммарной активностью МФК 1,11 и активностью МФК1У при любой допустимой для жизнедеятельности организма гипоксии принимала вид функции 2-х переменных:

y{x,h) = (p0{h)x + q>l(h), где х- суммарная активность НАДН-дг и СДГ, выраженная в мкМолях цит. С/мг белка в минуту; h -атмосферное давление,

выраженное в мм рт.ст.; 0>,(й) = функции

переменного атмосферного давления 'A"; y{x,h) - активность ЦО, выраженная в мкМолях/г цит. С/мг белка в минуту, соотнесенная к мм рт.ст. (40)найденные методом итерации, использовались для расчета -активности цитохромоксидазы (ЦО).

Таблица 3

Рассчитанные активности ЦО при тяжелой форме гипоксического _воздействия___

Атм.. давл. мм рт.ст. Экспср. НАДН-дг Экспер. СДГ Суммарная активность НАДН-дг+СДГ Экспер. ЦО Рассчит. ЦО Ошибка расчета ср. зн. ЦО, %

270 18,7±3,03 19,1±2,03 37,8±11,16 40,9±6,87 39,90534 40,08299 40,26064 40,3317 40.50935 40,687 Среднее 40,296 1,48 ■

196 0,51 0,23 0,74 6,55 6,139595 6,27% Панченко Дудченко (1975)

Эксперим. НАДН-дг Эксперим. СДГ Суммарная активность НАДН-дг+СДГ Эксперим. ЦО Рассчит. суммарн НАДН-дг+СДГ

230 16,6±1,67 19,3±1,86 35,9±3,32 33,6±2,53 ■ 30,557871 33,321344 I 34,316195 | 14,8 7,18 4,4

Соответствие функции y(x,h) = <p0(h)x + tp^h) поставленной задаче исследования и ее прогностическая способность доказывались сравнением аналитически рассчитанной активности ЦО в мозге животных с результатами проведенных собственных экспериментов и выходящих за их пределы (Панченко, Дудченко. 1975).

В таблице 3 представлены некоторые результаты расчетных активностей МФК ДЦ, которые сопоставимы с экспериментальными или данными литературных источников.

Относительная ошибка расчета в этом случае соответствует допустимому интервалу погрешности регрессионной модели.

Таким образом, представленная модель множественной регрессии у(х, h) = <р0 (h)x + (рх {И) отвечает условиям поставленной задачи и наилучшим образом аппроксимирует зависимость МФК ДЦ при любых допустимых для жизнедеятельности организма условиях гипоксии.

Предлагаемая модель у{х,К)-(р0{И)х^(р^{К) позволяет:

1. оценить вид зависимости, тесноту связи и проследить влияние гипоксии на структуру количественной зависимости между МФК 1,11,IV;

2. расчетным способом прогнозировать активность ЦО у интактных животных и при митохондриальной дисфункции I и II комплексов ДЦ, а также проводить оценку активности МФК I и II по функции МФК IV в экстремальных гипоксических состояниях мозга.

В результате проведенных исследований разработаны: «Способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологический объектах» A.C. СССР №983542 МКИ COI №33/50 и «Способ определения активности цитохромоксидазы» A.C. СССР №1250950 МКИ COI №33/48, которые позволяют экономить 50% дорогостоящих реактивов и количества животных.

1.2. Содержание аденозинтрифосфата в зависимости от активности окислительно-восстановительных ферментов дыхательной цепи при недостатке кислорода

Характеристика концентрации АТФ в ткани мозга в условиях гипоксии лежит в основе анализа адаптивных механизмов и оценки критериев их эффективности. В данном разделе представлен экспериментальный материал, характеризующий влияние атмосферного давления на активность МФК ДЦ и уровень АТФ в ткани мозга животных. Проводится анализ зависимости-содержания АТФ от суммарной активности НАДН-дг, СДГ и ЦО при дисфункции МФК I, II, IV в разных условиях гипоксии методами математического анализа.

Построены диаграммы зависимости генеральной средней суммарной активности НАДН-дг, СДГ, ЦО и генеральной средней концентрации АТФ в ткани мозга от степени тяжести гипоксии (рис.2), на которых просматривается одинаковый характер изменения этих показателей по

отношению к уровню интактных животных: при умеренной гипоксии (атм.давл. 310мм рт.ст.) - возрастающий; при тяжелой (атм.давл. 270мм рт.ст.) — убывающий.

2 1,8 1,6 1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

^1,85

"1,76

> 1,49

I 2 3

Атмосферное давление

1 ~ 760мм рт.ст. + . генеральные средние значения

2-310мм рт.ст. выбранных показателей

3 ~ 270мм рт.ст.

Рис.3 Изменение суммарной активности окислительных ферментов ДЦ и концентрации АТФ в ткани мозга в разных условиях гипоксии

Установлено, что линейная функция у = а0х + а, (рис.4) точно аппроксимирует количественную зависимость концентрации АТФ (у) от суммарной активности окислительных ферментов ДЦ - (НАДН-дг+СДГ+ЦО)(х), не меняет своей структуры от величины атмосферного давления, показывает существование очень тесной корреляционной связи между выбранными показателями (г >0,9) и имеет высокую'вероятностную значимость по соответствующим статистическим критериям (таблица 4). Ошибка коэффициента корреляции соответствовала 0,5 - 7,7%.

760мм рт.ст

100

у = 0,0102х +0,7041 Я2 = 0,9569

120

140

НАДН-дг+СДГ+ЦО

160

180

310мм рт.ст

в 1>5 н < 1

0,5

у = 0,0046х +0,9565 Кг = 0,7963

140 160 180 200 220 240

НАДН-дг+СДГ+ЦО

270мм рт.ст

2 1,5

0,5

у = 0,0156х +0,4163 1^ = 0,9869

70 75 80 85 НАДН-дг+СДГ+ЦО

Рис.4 Корреляционные тренды зависимости конечной концентрации АТФ от суммарной активности окислительных ферментов дыхательной цепи митохондрий мозга животных в разных условиях атмосферного давления

Таблица 4

Линейная аппроксимация у = а0х + а, зависимости между (НАДН-дг+СДГ+ЦО)(х)—>АТФ(у), оценка значимости коэффициента

Атм. давл. мм рт.ст Зависимость (НАДН-дг+СДГ)(х)—»ЦО(у) Коэф-т корреляции г Значимость "г" по N критерию Стьюден-та 1 г" Коэфф-т детерминации И2 Значимость "И2" по Р-крит. Фншера-Снедекора

760 у = 0,0101х + 0,7104 0,978344 7=0,99 к=20 0,957157 0,9571 а=0,01 ш=2 к[=1 к2=11

310 у = 0,0046*+ 0.956. 0,892343 у=0,98 к=4 0,796277 0,7963 а=0,01 ш=2 к.1=1 к3=5

270 у = 0,0156* + 0,4161 0,993437 у=0,99 к=4 0,986918 0,9869 а=0,01 ш=2 к|=1 к2=4

Для прогнозирования энергетического потенциала мозга по активности МФК ДЦ в условиях кислородного голодания использовалась функция у(х, И) = <р0 (И)х + (рх {И), которая хорошо аппроксимировала зависимость между выбранными показателями при гипоксии разной степени тяжести - (И),

где <р,(П) = (А2)}+{Щ -соз^ (= 0,1) (рис.5) и (А0)^А%(А2)„

найденные методом последовательных приближений, использовались для вычисления содержания АТФ.

По функции у{х,И) =(р0{Н)х + <р](И) выполнен расчет уровня АТФ в условиях экспериментального атмосферного давления (760, 310, 270мм рт.ст.) и определена относительная ошибка формулы, которая укладывалась в интервал допустимых погрешностей построенной модели (<20%).

Прогностическая способность функции у(х, И) = срй (И)х + ср1 (И) проверялась расчетом уровня АТФ в условиях гипоксии, выходящих за пределы экспериментальных (атм. давление 230мм рт.ст. с экспозицией бОмин.) и расчетом суммарной активности МФК I, II, IV в условиях атм. давления 270мм рт.ст. с увеличением экспозиции до 4-х часов. Результаты аналитического прогноза выбранных показателей представлены в таблице 5 и соответствуют экспериментально полученным.

300 400 500 600 700 Атмосферное давление

АТФ -> (НАДН-дг+СДГ+ЦО)(х)

400 500 600 Атмосферное давление

—у

з;:

200 300 400 500 600 700 Атмосферное давление

аоо

АТФ -> (НАДН-дг+СДГ+ЦО)(х)

1.2 1

0.8 0.6 0,4 0,2

300 400 500 600 700 Атмосферное давление

800

оо

Рис.5 Графики функций <р, (И)(г = 0,1) регрессионных моделей у{х,К) = <р0(п)х + ^¡(й)зависимостей окислительных ферментов дыхательной цепи и уровней АТФ в мозге животных в разных условиях атмосферного давления «А»

Таблица 5

Расчетные значения показателей процессов окисления и

Атмосферное давление мм рт.ст. Экспериментальная активность мкМоль цит. С/мг белка в минуту Расчетная АТФ

СДГ НАДН-дг ЦО НАДН-дг+ +СДГ+ЦО

230 19,3±1,86 16,6±1,67 33,6±2,53 69,5±6,06 1,393 1,457 1,521

Среднее 1,45

270 4 часа Теоретически заданная концентрация АТФ Расчетная активность НАДН-дг+СДГ+ЦО

1,65 . 1,7 1,75 109,85 116,34 122,83

1,70±0,066 Среднее 116,34

Таким образом, применение математического моделирования зависимости экспериментальных показателей процессов окисления и фосфорилирования в мозге дало возможность установить сонаправленный характер изменения активности МФК ДЦ и уровня АТФ под влиянием гипоксии. Построенная модель множественной регрессии, аппроксимирующая зависимость конечной концентрации АТФ от суммарной активности НАДН-дг, СДГ и ЦО в условиях разного атмосферного давления позволяет:

1. оценить форму и тесноту связи зависимых показателей активности митохондриальной дыхательной цепи и процесса фосфорилирования в . мозге животных в условиях нарушения кислородного режима;

2.. проследить влияние степени тяжести гипоксии на устойчивость зависимых отношений характеристик энергоаккумулирующих процессов;

3. прогнозировать расчетным способом уровень АТФ по известной или заданной активности окислительных ферментов ДЦ в условиях дефицита кислорода;

4, проводить оценку расчетным способом активности МФК ДЦ по экспериментально полученной концентрации АТФ в ткани мозга в экстремальных гипоксических состояниях организма.

1.3 Активность митохондриальной креатинкиназы и концентрация АТФ в ткани мозга при ишемии разной продолжительности

"Молекулярные механизмы развития острой ишемии дают представление о фундаментальных основах регуляции хода важнейших метаболических реакций, позволяющих поддерживать жизнедеятельность

клеток при снижении кровообращения. Решающее значение при церебральной ишемии имеет состояние энергетического метаболизма.

Одним, из возможных путей стабилизации уровня макроэргических соединений аденинового пула является креатинкиназная система.

В данном разделе представлен материал по изучению активности креатинкиназы в общей митохондриальной фракции и содержания АТФ в условиях ишемии методами математического анализа с целью выявления направленности их изменений и возможности описания количественной зависимости между выбранными показателями элементарными функциями. Изменения экспериментальной активности миКК и содержания АТФ при ишемии с разным интервалом времени после операции представлены на диаграммах (рис.6).

* » К *

§ I:

=Т * * 2

2.5 2 1,5, 1

0,5

0; 2,08

\ / 90:2 08 --

¥30.1.4 1 180; 1,52

400 600 800

Время в минутах

. 2,5 х

а: л 5 2

2 Ю"

в-з 1'5 1

О СП

3 £

ь 2 0,5 < а: 2 О

I у !

\/ 90 2 09 1С в0;2

------- !

200 400 600 800

Время в минутах

♦ - генеральные средние значения выбранных показателей Рис. 6 - Диаграммы изменений концентрации АТФ и активности миКК при ишемии разной продолжительности.

Представленные графики показывают, что показатели креатинкиназной реакции имеют сонаправленный характер изменения относительно нормы с увеличением интервала времени после операции.

Задачей данного исследования является описание количественной зависимости между активностью миКК и уровнем АТФ в ткани мозга в условиях ишемии, изучение влияния продолжительности ишемического воздействия на тесноту связи между выбранными показателями, оценка и прогнозирование расчетным способом энергетического состояния мозга при нарушении гемодинамики.

При аппроксимации эмпирической зависимости активности миКК от концентрации АТФ в ткани мозга интактных животных и в условиях ишемии разной продолжительности в качестве объясняющей переменной «х» рассматривалось содержание АТФ, а зависимой (результативной) переменной «у» являлась общая активность КК в митохондриальной фракции. С помощью MS Excel подбирались функции регрессии, сглаживающие значения x^y^i = 1,2,3...«)) в каждом рассматриваемом опыте. Из множества регрессионных функций предпочтительнее оказалась линейная у = а0х + а1, которая давала меньшую ошибку прогноза.

Значимость линейной очень тесной связи между концентрацией АТФ и активностью миКК подтверждалась соответствующими статистическими критериями (таблица 6).

Анализ коэффициентов ай,ах (таблица 6) функции у = а0х+а1 показал, что они меняются от периода времени после операции.

Для разработки способа прогнозирования активности миКК в условиях ишемии с любым периодом времени после операции линейная функция у = а0х + а, была реконструирована в модель множественной регрессии введением второй факторной переменной "t" - продолжительности нарушения гемодинамики мозга.

Таким образом, регрессионная модель, аппроксимирующая зависимость активности миКК (у) от содержания АТФ (х) у интактных животных имела вид у-1,3221*-0,203 8, а в условиях ишемии любой экспозиции y(x,t) = cp0(t)x + <pl(t).

< \ / \ (AX)i

Вид 9¡if)-+ НО), ■cos —-— > (j = 0,1)определялся графической

иллюстрацией зависимости а/=р/(0 при 30-минутной и 1,5-18часовой ишемии. Коэффициенты (A0)J,(A1)J,(A2)J, найденные итерацией, использовались для определения активности миКК.

По формулам выполнен ■ расчет активности миКК по экспериментальному содержанию АТФ, а также, после некоторой модификации функций, уровня АТФ по активности миКК в группе интактных животных и в условиях 30-минутной и 1,5-18-часовой ишемии.

Относительная ошибка расчета колебалась от 1,9 до 13,2% и укладывалась в интервал допустимой погрешности (меньше 20%) аппроксимирующей модели. Это показывало, что регрессионные модели хорошо объединяли зависимые показатели креатинкиназной реакции.

Прогностическая способность предлагаемых моделей проверялась расчетом выбранных показателей АТФ и миКК в других экспериментах, некоторые из которых представлены в таблице 7. Расчетные значения выбранных показателей креатинкиназной системы отражали реальные состояния жизнедеятельности животных в экстремальных условиях.

Таблица 6

Линейная аппроксимация у = а0х + а, зависимости между АТФ(х)—>ми!Ж(у), оценка значимости коэффициента корреляции г и коэффициента детерминации Я'

Условия 1 эксперимента Зависимость АТФ(х)—>миКК(у) Коэф-т корреляции г Значимость критерию Стьюден-та г2 Коэфф-т детерминации Я2 Значимость "К2" по Р-крнт. Фишера-Снедекора

Интактные животные у = 1,3991*-0,2018 0,9909604 7=0,99 к=8 0,9820025 0,982 а=0,01 т=2 к,=1 к2=8

Ишемия 30 мин. >> = 0,6667*+ 0,5133 1,0 7=0,99 к=8 1,0 1,0 - а=0,01 т=2 к,=1 к2=8

Ишемия 90 мин. у = 0,7621* + 0,4934 0,9953623 у=0,99 к=9 0,9907461 0,9907 а=0,01 т=2 к]=1 к2=9

Ишемия 18 час. у = 0,5* + 1,24 0,9999999 7=0,99 к=11 0,9999992 1,0 а=0,01 т=2 к,=1 к2=11

Таким образом, использование математического моделирования количественной зависимости экспериментальных показателей креатинкиназной реакции позволило установить сонаправленный характер изменения активности миКК и уровня АТФ с удлинением сроков нарушения мозгового кровообращения, линейный по форме независимо от продолжительности ишемического воздействия.

Таблица 7

Активность мнКК и концентрации АТФ в мозге животных в _экстремальных условиях_

Условия эксперим. АТФ мкМоль/г ткани миКК мкг-экв.Н+ /мг б./мин. АТФ расчетная (1) миКК расчетная (2) относит, ошибка формулы

Интактные животные 2,08±0,07 (21) 2,79±0,13 (23) 2,139804 2,706328 (1)2,88 (2) 2,98

Ишемня 30 минут 1,4 ±0,25* р <0,05 (8) 1,50 + 0,14* р< 0,05 (12) 1,470974 1,452681 1,94 3,15

Ишемия 4 часа 2,13±0,09 (9) 2,217784903

Ишемия 18 часов (удовл.) 1,52 ±0,1* ¿><0,001 (9) 2,0 ±0,06* р < 0,002 (И) 1,721237 1,884483 13,2 5,78

Ишемия 18 часов (неудовл.) 0,06±0,01 1,077-1,279

* - статистически значимые изменения по сравнению с интактными животными.

Количественную зависимость активности миКК от концентрации АТФ при ишемии разной продолжительности удалось аппроксимировать функцией 2-х переменных, которая дает возможность:

1. расчетным способом прогнозировать активность миКК по заданной или экспериментально полученной концентрации АТФ в условиях нарушения гемодинамики мозга;

2. контролировать расчетным способом уровень АТФ по активности миКК.

1.4 Сравнительная оценка вида математических моделей в разных условиях жизнедеятельности организма

В данном разделе показано, что вид моделей, аппроксимирующих зависимость между разными показателями энергоаккумулирующего процесса мозга, интегрально отражает функциональное состояние биологической системы при воздействии внешней среды.

Концентрация АТФ в ткани мозга зависит от соотношения скоростей его синтеза и распада. Это приобретает особое значение в условиях гипоксии, когда существенно меняется скорость обоих процессов.

Проведены исследования и опубликованы результаты работы по изучению формы количественной зависимости между уровнем АТФ и скоростью фосфорилирования АДФ в условиях гипоксии разной степени тяжести и продолжительности, анализа неблагоприятных воздействий на вид этой зависимости, а также возможности применения модели аппроксимации для прогнозирования энергетического потенциала мозга при нарушении

способности митохондрий синтезировать АТФ (Мошкова А.Н., Хватова Е.М., 1997, 2006). Анализ экспериментальных показателей окислительного фосфорилирования не установил определенной направленности их изменений относительно нормы в условиях гипоксии разной степени тяжести и продолжительности (таблица 8).

Таблица 8

Значения скорости фосфорилирования ADP и конечной концентрации АТР в условиях гипоксии разной тяжести и продолжительности

Атмосферное давление Экспозиция в минутах Кол-во опытов. Эксперимент, значения ADP/t мкМоль/мг б/сек. Концентрация АТР мкМоль/г ткани.

Интактные животные 22 3,0±0,2 1,76±0,06

Атмосферное давление 310мм рт.ст 30 мин. 10 3,56±0,17 1,71±0,056

60 мин. 9 2,94±0,17 1,85±0,08

240 мин. 6 2,50±0,12 1,94±0,05

Атмосферное давление 270мм рт.ст 15 мин. 8 3,02±0,18 1,45±0,08 * р<0,001

30 мин. 8 2,73±0,18 1,63±0,08

60 мин. 8 3,74±0,23 * р<0,05 1,49±0,09 * р<0,001

* - статистически значимые изменения в сравнении с контролем

Описание количественной зависимости между концентрацией АТФ, обозначенной как "у", и показателем АДФЛ, обозначенным за "х", рассматривалось в двух формах: простой - линейной у = а0х+ах и более

сложной - дробно-линейной у =—-—. Оценивалось влияние

а0х + а,

гипоксического воздействия (атм. давление 310, 270мм рт.ст.) на вид математической зависимости между характеристиками процесса окислительного фосфорилирования. Было установлено, что линейная аппроксимация у = аах + а, между АДФЛ(х) и АТФ(у) у интактных

животных переходит в дробно-линейную >> = ——— под влиянием гипоксии

разной степени тяжести, коэффициенты которой ай, а, меняются от длительности нарушения кислородного режима. В таблице 9 указаны

коэффициенты функций у = а0х + а1г у = —-— и отклонения

а„х + а,

ЬУ-У,У _ ±У>

8-——=- (у = ~— п" число экспериментов), которые не превышали 0,1

у п

(б < 0,1) и соответствовали поставленной задаче.

Таблица 9

Значения а0,а1 и показателя 8 функций у = а0х + а^ у = —-—,

а^х + а,

аппроксимирующих зависимость между АД<М(х) и АТФ(у) при __ гипоксии разной экспозиции_

Атм. давление ми рт.ст. Функции Экспозиция в мин. Число опытов а0 а1 Значение 6 в каждом опыте

Интактны е животные У = а0х+а1 - 15 0,5336053 0,1125068 -

310 X У а0х + а, 30' 5 0,6087371 -0,1090939 ¿,=0,0023951 ¿2 =0,054294933 ¿3=0,000008 =0,0 ¿5=0,065902682

310 X У = а0х + а, 60' 5 0.5687078 0.0680500 ¿, =0,000134943 ¿2 =0,003725093 ¿3=0,00039977 ¿4 =0,024517974 ¿5=0,25453813

270 X У- а„х + а, 30 6 -0,0155877 0,8572712 ¿, =0,043850078 ¿2=0,015609775 ¿3=0,001346573 ¿4=0,001524396 ¿5 =0,03736743 ¿6 =0,08770915

270 X У = а0х + а, 60 5 0,2833276 1,29217726 ¿,=0,009798610 ¿2 =0,038496602 ¿3=0,0088079 ¿4=0,00000641 ¿, =0,000006965

Введение второй факторной переменной "t" - времени пребывания животных в состоянии гипоксии - трансформировало дробно-линейную

функцию в модель множественной регрессии y{x,t) = —————, где вид

Ро (')* + «( О

U1),

О; = <Р,(() ~ (Л2); +(A0)j cos—-—, (/ = 0,1);(j = 0,1) был подсказан графической

иллюстрацией зависимости а, = (г) Параметры (Л0)у,(Л1)у,(Л2)у находились

интерполяцией и использовались при расчете концентрации. АТФ. Исследована прогностическая способность этой модели аппроксимации.

Рассчитаны по формуле y(x,t) =——-— содержания АТФ в условиях

<p0(t)x + p,(t)

атмосферного давления 310, 270мм рт.ст. с 1-часовой экспозицией при теоретически заданных показателях АДФ/t от 2,3 до 5,0 мкМоль /мг б./сек. с шагом изменения 0,3-0,2 мкМоль /мг б./сек.

Установлено, что рассчитанные по формуле y(x,t)~—---

<р0(1)х+(р, (t)

концентрации АТФ сопоставимы с экспериментально полученными, и математическая модель адекватно отражает изменения выбранных показателей окислительного фосфорилирования. Относительная ошибка расчета в этом случае (ср. 5,87 - 6,71%) соответствовала интервалу допустимых погрешностей математических моделей.

• Проведена проверка использования модели множественной регрессии

y(x,t) =- с целью прогнозирования содержания АТФ, когда

%(t)x + <px(t)

интервал экспозиции был расширен от 15 до 480 минут. Расчетные уровни АТФ в этом случае были подтверждены дополнительно поставленным экспериментом либо литературными данными.

Результаты проверки показали, что расчетные содержания АТФ сопоставимы с экспериментальными данными при гипоксии разной степени

тяжести и разной продолжительности, и функция y(x,t) =——-—

<p0{t)x + <p>{t)

отвечает требованиям поставленной задачи. Она достаточно точно аппроксимирует зависимость между исследуемыми показателями АДФ/t и АТФ и может быть использована с целью прогнозирования развития процесса синтеза АТФ в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. Один из вариантов расчета концентрации АТФ в перечисленных условиях гипоксического воздействия представлен в таблицах 10 и 11.

Таким образом, проведенные исследования показали, что гипоксия существенно меняет скорость синтеза и распада АТФ. Это проявляется в изменении формы зависимости между показателем АДФ/t. и конечной концентрацией АТФ от простой - линейной у = а0х + at в группе

интактных животных к более сложной - дробно-линейной у = —-— при

а0х + о,

умеренной гипоксии (атм. давление 310мм рт.ст.) и при тяжелой форме гипоксического воздействия (атм. давление 270мм рт.ст.)

Таблица 10

Рассчитанные по формуле y(x,t)=--- и экспериментально

установленные концентрации АТР при атмосферном давлении 310мм

рт.ст. с экспозицией 90-150 минут

ADP/t (теор.) ^^^^ ^^-"""Время в мин. Концентрация АТР мкМоль/г ткани

90' 120' 150'

2,3 1,76 1,81 1,84

2,6 1,83 1,92 1,97

2,9 1,89 2,02 2,09

3,2 1,95 2,104 2,19

3,5 2,0 2,18 2,29

3,8 - 2,04 2,25* 2,38*

4,1 2,08 2,32* 2,47*

4,4 2,11 2,38* 2,54*

4,7 2,14 2,43* 2,61*

5,0 2,15 2,48* 2,68*

* - отмечены значения АТР, сопоставимые с экспериментально установленными (Баев и Друкина, 1981, 2,65±0,1мкМоль/г ткани, высота 7000м, экспозиция 2-2,5 часа).

Таблица 11

Рассчитанные по формуле y(x,t) =---и экспериментально

0>о(О* + <9|(О

установленные концентрации АТФ при атмосферном давлении 310мм __рт.ст. с экспозицией 60 минут _

АДФ/t АТФ АТФ АДФ/t Ошибка

эксперимент. эксперимент. рассчитан. теоретическое расчета

2,46 ■ 1,90 1,67 2,3 1,21%

2,68 1,71 1,68 2,6 1,8%

2,97 1,71 1,69 2,9 1,2%

3,14 1,90 1,69 3,2 3,9%

3,23 1,68 1,70 3,5

С учетом продолжительности нарушения кислородного режима меняется и форма модели множественной регрессии, аппроксимирующей зависимость уровня АТФ(у) в ткани мозга животных от показателя АДФЛ(х) и продолжительности гипоксического воздействия 'Ч". Она принимает

/ ч *

достаточно сложную конструкцию у(х,1) =-.

Следовательно, для показателей окислительного фосфорилирования происходит изменение вида количественной зависимости от простой (линейной) до более сложной (дробно-линейной) при воздействии гипоксии даже при' умеренной ее форме, что позволяет говорить об объективной характеристике функционального состояния мозга.

Проведенные в данном разделе исследования дают основание предположить, что изменение вида математических моделей аппроксимации между МФК ДЦ, миКК, скоростью фосфорилирования АДФ и уровнем АТФ в мозге животных интегрально отражает функциональное состояние биологической системы в условиях воздействия окружающей среды.

2. Прогнозирование пределов устойчивости организма к гипоксии по уровню адениновых нуклеотидов методами математического моделирования

2.1. Исходные характеристики содержания АТФ, АМФ и их

АТФ

отношений д^ф в условиях острого кислородного голодания

Адениновые нуклеотиды АТФ, АДФ, АМФ обеспечивают сопряжение между процессами, генерирующими и использующими энергию, являясь важным звеном в метаболической регуляции. Большое научное значение имеет одновременное определение содержания АТФ и АМФ, что позволяет получать информацию о направленности обменных процессов в ткани мозга. В данном разделе представлен материал по оценке концентраций АМФ, АТФ

АТФ и коэффициента д^ф в ткани мозга интактных животных и в условиях

нарушения кислородного режима методами математического анализа с целью выявления направленности в характере их изменений под влиянием гипоксического воздействия.

Задачей данного раздела исследования является определение вида зависимости между уровнем АТФ, АМФ и их интегральным показателем АТФ

д^ф в условиях гипоксического воздействия, установление тесноты связи,

и влияния гипоксии на ее коррекцию, а также разработка регрессионной модели аппроксимации с целью возможной оценки и прогнозирования соотношения адениновых нуклеотидов мозга в экстремальных условиях.

Анализируя направленность изменения уровней АТФ и АМФ под влиянием гипобарической гипоксии (таблица 12), можно сказать, что в целом

просматривается противоположнонаправленный характер изменения выбранных нуклеотидов, проявляющийся с усилением тяжести гипоксического воздействия.

При нарушении гемодинамики мозга определенной направленности в изменении АТФ и АМФ относительно нормы не наблюдается.

Таблица 12

Содержание адениновых нуклеотидов и отношений их молярных концентраций в мозге животных в разных условиях гипоксии.

Условия эксперимента Экспозиция Концентрация АТФ мкМоль/г. Концентрация АМФ мкМоль/г. Коэффициент к - АТФ АМФ

ткани ткани

Интактные кролики - 1,76 ±0,060 0,22 ±0,019 8,0

Атм. давл. 310мм рт.ст. 30 мин 1,71 ±0,056 0,22 ±0,009 ' 7,77

1 час 1,85 ±0,080 0,19 ±0,027 9,74

4 часа 1,94 ±0,050 0,17 ±0,029 11,4

30 мин 1,63 ±0,080 0,25 ±0,020 6,52

Атм. авленн 270мм рт.ст. 1 час 1,49 ±0,090 * р < 0,001 0,28 ±0,050 5,32

ч 4 часа 1,70 ±0,066 0,21 ±0,040 8,09

Интактные крысы - 2,08 + 0,070 0,27 ±0,020 7,7

в 30 мин 1,40 ±0,130 * р < 0,001 0,26 ±0,040 5,38

1,5 часа 2,08 ±0,070 0,27 ±0,030 7,7

3 4 часа 2,13 ±0,090 0,25 ±0,040 8,52

Я 18 часов 0,79 + 0,100 * р < 0,001 0,55 ±0,050 * р < 0,001 1,44

* - статистически значимые отличия в сравнении с контролем.

Изменения молярных концентраций АТФ и АМФ естественно отражаются на величине коэффициента "К" (введем для сокращения записи АТФ _ АТФ

д^ф обозначение К- - д^ф). Проведен анализ влияния содержаний АТФ и

АМФ на направленность изменения коэффициента «К» при нарушении кислородного режима. С этой целью использовались параметры О _ [АТФ]э ; _[АМФ]Э Кэ

"л ~~ ^ -^ф^ '■> 2 ~ ^д/ф] ' К ' пРедставляЮ1Цие с°бои отношения

экспериментальных уровней выбранных нуклеотидов и коэффициентов «К» к значениям этих показателей у контрольных животных: [АТФ]Э, [АМФ]Э, Кэ -экспериментальные значения; [АТФ]№ [АМФ]№ Кы - норма.

Колебания Я,,Я2,Я3 относительно 1.0 (меньше 1.0 или больше 1.0) отражали изменение экспериментальных характеристик энергетических процессов в мозге по сравнению с нормой, и степень влияния концентраций выбранных нуклеотидов на величину коэффициента " К ".

Исследование величин параметров Я,, Я2, Я3 показали, что при

АТФ

гипоксии разной тяжести и продолжительности отношение д^ф в большей

степени изменяется от содержания АМФ и связано с ним противоположно-направленной зависимостью.

При нарушении гемодинамики мозга с разным интервалом времени после операции не наблюдается четкой корреляции изменения коэффициента "К" от концентрации какого-то одного нуклеотида. Следовательно, при

АТФ

ишемии разной продолжительности характер изменения отношения д^ф от

уровней АТФ и АМФ более сложный.

Таким образом, математический анализ характеристик нуклеотидного фонда мозга животных в разных условиях гипоксического воздействия показал существование некоторой направленности изменений АТФ, АМФ, АТФ

-, которая зависит от вида и степени тяжести гипоксии, а поэтому может

АМФ

иметь количественное описание.

■ Причинно-следственную связь между концентрациями АТФ и АМФ моделировали математически элементарными гладкими функциями. В качестве независимой (объясняющей, факторной) переменной "х" рассматривались показатели АТФ(х(),(1 = 1,2... л), зависимой

(результирующей) переменной "у" являлись значения АМФ (у,) ,(i =1,2...и). По программе MS Excel подбирались корреляционные тренды для каждого массива экспериментальных данных х,- -> yi (i = 1,2,...,и).

Мерой приближения регрессионной модели к экспериментальным показателям служил коэффициент детерминации R2 или корреляционное отношение R. Из всех рассматриваемых функций была выбрана полиномиальная у = а0х" + а¡х"'1 + ... + ая (и = 1,2,3,4).

Показано, что гипобарическая гипоксия и ишемия оказывают разное влияние на вид корреляционной зависимости между АТФ(х)—>АМФ(у) в мозге животных: при гипобарической гипоксии (атм. давление 310 - 270мм рт.ст.) наилучшим образом объединяет экспериментальные показатели полином 1-й степени (линейная функция у = а0х + ах), при ишемии - полином 3-й степени (кубический многочлен у = а0х3 + а,х2 + а2х + аъ).

Таким образом, два разных приема нарушения кислородного режима вызывают существенно разные состояния организма, проявляющиеся в

изменении характера (от простого к сложному) зависимых отношений показателей энергетического потенциала мозга.

Значимость, достоверность, адекватность экспериментальным показателям однофакторных регрессионных моделей у = а0х + а1 и

3 2

у = а0х +atx + агх + а3 доказана по соответствующим статистическим критериям (t-критерий Стьюдента, F-критерий Фишера-Снедекора, критерий равенства квадрата коэффициента корреляции и коэффициента детерминации г2 =R2). Ошибка коэффициента корреляции составляла 1,5 - 2%. В таблице 13 представлены функции, аппроксимирующие зависимость АТФ(х)—>АМФ(у), коэффициент корреляции г, коэффициент детерминации R2 и их значимость для некоторых экспериментов, которые подтверждают соответствие аппроксимирующих функций поставленной задаче.

Построена модель множественной регрессии аппроксимирующей зависимость АТФ(х)—>АМФ(у), где к объясняющей переменной "х" -содержанию АТФ добавлена переменная "г" - время пребывания животных в состоянии дефицита кислорода (барометрической гипоксии и ишемии). В этом случае коэффициенты я, линейной функции у = а0х + а, (г = 0,1) и кубического многочлена у = а0х3 + аххг + а2х + а3 (г = 0,1,2,3) считали функциями переменной "t" - времени пребывания животных в условиях

'_/ \ i \ (Al)j шпоксического воздействия Вид ^¿(0~-cos-— .

определялся расположением экспериментальных показателей (Х;,У,), влияющих на изменение а, в разных условиях нарушения кислородного режима (рис.7).

Таким образом, модель множественной регрессии, аппроксимирующей зависимость между АТФ(х)—>АМФ(у) в мозге животных в условиях гипоксии разной экспозиции имела вид:

у(х, t) = (р0 (t)x + (рх (t) - при гипобарической гипоксии; у(х,0 = (рй(i)x3 +(pl{t)x2 + (рг{t)x + (ръ(t) - при ишемии Найденные методом итерации коэффициенты (A0)j,(Al)J,(A2)j использовались при вычислении концентрации АМФ. Прогностическая способность предлагаемых математических моделей проверялась расчетом концентрации АМФ с последующей оценкой результата и подтверждением его достоверности дополнительным экспериментом либо литературными данными.

Относительная ошибка формул в этом случае укладывалась в допустимый интервал погрешности математической модели (0,2-11,1%), что подтверждало соответствие предлагаемой модели объекту исследования.

Рис.7 Графики функций <рг (Г)(г = 0,1,2,3) регрессионной модели у(х,I) = <р0 (/)х3 + ср^ (г)х2 + <р2 (/)х + (?) зависимости уровней АТФ и АМФ в мозге животных в условиях ишемии разной продолжительности «/»

Таблица 13

Аппроксимация зависимости между АТФ(л;)—>АМФ(у) в условиях гипоксии разной продолжительности

Атм. давл. мм рт.ст Линейная у - а0х + а, Коэф-т корреляции г Значимость "г" по X-критерию Стьюдеи-та г2 Коэфф-т детерминации Я2 Значимость "И2" по Р-крит. Фишера-Снедекора

760 у = 0,444* + 0,5553 0,98971823 у=0,99 к=20 0,9795421 0,9794740 -

310 30' у = -1,691* + 3,1184 -0,9821602 у=0,99 к=4 0,9646387 0,9645946 -

270 60' 7 = -0,534*+ 1,0452 -0.9960784 у=0,99 к=4 0.9921722 0,9920122 -

Кубическая у = а0хъ + а1х2 + а2х + аъ К2 Значимость И2

| Ишемия о у = -0,62458229*3 + 2,287104607*2 -3,91868019* +1,789307 0,8906859 а=0,01 кг1 к2=4

240' у = 0,07604289*' - 0,63383484*2 + 2,10315704* - 2,078924 0,9460416 а=0$1 к,=1 к2=4

18 час. у = 0,09874069х3 + 0,08352399*2 - 0,12081819* + 0,119724 0,9763259 а=0,01 к,=1 к2=4

В таблице 14 представлены некоторые значения расчетных уровней АМФ в мозге интактных животных и в условиях гипоксического воздействия, когда интервал экспозиции выходил за пределы уже проведенных экспериментов. Расчетные значения АМФ были подтверждены либо литературными данными, либо дополнительно поставленным экспериментом.

Таким образом, использование методов эмпирических зависимостей позволило построить регрессионные модели, достаточно точно объединяющие экспериментальные показатели АТФ и АМФ в условиях гипобарической гипоксии и ишемии с разной экспозицией.

Таблица 14

Рассчитанные значения АМФ, подтвержденные экспериментальными _результатами__

Интактные животные

Экспериментальное АТР, мкМоль/г сырой ткани Экспериментальное AMP, мкМоль/г сырой ткани Метод определения Виды животных Расчетное AMP Ошибка расчета Литературный источник

1,76+0,06 0,22 ±0,019 Хромато-графический на целлюлозе Кролики 0,226140 2,79% Хватова Е.М. и др. (1987)

1,83 ±0,19 0,16 + 0,10 Хромато-графический на серафлексе Кошки 0,1712537 7,03% Kleichues P. et al. (1974)

1,89 ±0,19 0,22 + 0,03 Хромато-графический на бумаге Крысы 0,195559 2,22% Гастева C.B. и др. (1979)

2,01 ±0,15 0,34 ±0,04 Ферментативный (люцифе-разный) Крысы 1,33714 0,84% Ridge J.M. (1972)

Условия гипоксического воздействия

Условия эксперимента Экспериментальное АТФ, мкМоль/г сырой ткаии Экспериментальное АМФ, мкМоль/г сырой ткани Расчетное АМФ Относительная ошибка расчета, %

Атмосферное давление 270мм рт.ст. 240-285 мин 1,70 ±0,006 0,21 ±0,04 0,203456 0,223563 0,243760 ср. 6,02

Ишемия 240 мин 2,13 ±0,09 0,25 + 0,04 0,2629956 4,9

Анализируя форму зависимости, тесноту и устойчивость связи между адениновыми нуклеотидами, характеризующими сопряженность процессов, генерирующих и использующих энергию, можно сказать следующее:

1. форма гипоксического воздействия влияет на вид аппроксимирующей функции, которая от линейной при гипобарической гипоксии трансформируется в полиномиальную 3-й степени под влиянием ишемии разной продолжительности;

2. усложняется модель множественной регрессии под влиянием разного вида гипоксического воздействия: от простой - при разрежении атмосферного давления, к более сложной - при нарушении гемодинамики мозга;

3. аппроксимация зависимости между показателями нуклеотидного фонда мозга позволяет прогнозировать направленность обменных процессов в экстремальных условиях жизнедеятельности организма;

4. предлагаемые регрессионные модели можно использовать для прогнозирования концентрации АМФ и АТФ в условиях нарушения кислородного режима в короткие и более длительные сроки, а также

получать информацию об изменении показателя К - д^ф в

зависимости от гипоксического состояния мозга.

В результате проведенных исследований разработаны способы определения концентраций нуклеотидов и получены патенты на изобретения: «Способ определения аденозинмонофосфата в ткани мозга» A.C. СССР №1302198 МКИ С01 №33/48; «Способ определения аденозинтрифосфата в мозге экспериментальных животных A.C. СССР №1250950 МКИ С01 №33/98; «Способ определения креатинфосфата в ткани мозга» патент России №2340903. Предлагаемые способы дают 50% экономию времени, дорогостоящих реактивов и количества животных.

2.2. Прогнозирование эффективных режимов гипоксического прекондиционирования по концентрации адениновых нуклеотидов

Адаптация - необходимый способ существования организма в изменяющихся условиях окружающей среды. Гипоксическое прекондиционирование повышает толерантность мозга к недостатку кислорода и используется для разработки способов защиты от гипоксии и ее последствий.

В данном разделе представлен экспериментальный материал,

АТФ

отражающий содержание АТФ, АМФ и величину коэффициента в

АД4Ф

условиях интервального гипоксического прекондицинирования, создаваемого в барокамере на «высоте» 7000м (атм.давл. 310мм рт.ст.) с экспозицией 1 час в 2-х, 4-х, 8-и кратных режимах. Задачей исследования является построение математической модели, аппроксимирующей количественную зависимость концентрации АТФ и АМФ от числа тренировочных подъемов при гипоксическом прекондиционировании и прогнозирование пределов устойчивости организма к недостатку кислорода по уровню АМФ.

Анализ экспериментальных значений АТФ и АМФ показал, что из серии краткосрочных тренировок 4-х кратный режим гипоксического прекондиционирования наиболее эффективен в повышении резистентности животных к нарушению кислородного режима.

В процессе анализа экспериментальных значений адениновых нуклеотидов установлено, что повышение устойчивости мозга к недостатку кислорода сопровождается уменьшением концентрации АМФ по отношению к уровню таковой у интактных животных.

Предлагается в качестве критерия адаптации организма к нарушению кислородного режима рассматривать характер изменения уровня АМФ в мозге животных относительно контроля.

Вызывает интерес разработка способа прогнозирования эффективного режима гипоксического прекондиционирования по содержанию адениновых нуклеотидов. Использованы методы математического моделирования для аппроксимации зависимости изменения концентрации АМФ от содержания

АТФ и числа тренировочных подъемов на «высоту» 7000м (атмосферное давление 310мм рт.ст.) с экспозицией 1 час с целью прогнозирования расчетным способом эффективного режима гипоксического прекондиционирования.

Изменение концентрации АМФ в зависимости от содержания АТФ и количества тренировочных подъемов аппроксимировалось моделью множественной регрессии вида:

4891449

у{х, п) = (2542,8333 + 5886,4041 ■ cos - ) • х3 +

489 14

+ (1420,6595 + 2837,5352 • cos-'—) ■ х2 -

16 4

- (37,988152 + 70,45783 • cos—Ч • х -

-(188,38578+ 379,80187-cos—),

где у(х,п) - концентрация АМФ в мозге животных, п - число тренировочных дней, х - концентрация АТФ.

Принимая во внимание тот факт, что критерием устойчивости мозга к гипоксии может служить повышение или уменьшение содержания АМФ относительно его уровня у интактных животных, был проведен анализ поведения функции у(х,п) (ее убывание или возрастание) относительно значений у -Nсоответствующего величине АМФ у контрольных животных, когда число тренировочных подъемов увеличивалось, до 90 дней.

По поведению у{х,п) установлено, что изменение содержания АМФ в разные периоды гипоксического прекондиционирования имеет колебательный характер, что, возможно, определяет устойчивое или неустойчивое состояние организма к гипоксии.

Построена диаграмма колебаний устойчивого и неустойчивого состояния мозга, когда интервал гипоксического прекондиционирования соответствовал 90 дням (п=1,2,3,...,90) (рис. 8).

На представленной диаграмме показано, что в течение первых трех недель 1-2 дня устойчивого состояния сменяются 2-3 днями неустойчивого. Затем периоды чередования устойчивых и неустойчивых дней удлиняются (512 дней). Начиная с 57-го и до 90-го дня тренировки, устойчивость к гипоксии падает (рисунок 8).

Для проверки аналитического прогноза адаптации к гипоксии были использованы результаты собственных экспериментов и данные других исследователей (Ватаева и др.; Рыбникова и др., 2004, 2005; Балыкина с соавт.,2006; Строев и Самойлов, 2006; Лукьянова с соавт.,2008; и др.).

Дни тренировок

Рис.8 Ритмические колебания устойчивого и неустойчивого состояния при адаптации к гипоксии

Анализ представленных результатов показал, что предлагаемая математическая модель отражает колебательный характер развития процесса адаптации и дает возможность прогнозировать ход этого процесса в организме животного. На основе представленной диаграммы можно предложить как лучший режим для краткосрочной тренировки 4-х и 6-и дневную тренировку. При долгосрочной тренировке к гипоксии можно использовать гипоксическое прекондиционирование в течение 1 месяца, т.к. в этом случае устойчивое состояние сохраняется до 5 дней (с 28-го по 32-й день). Однако лучше всего проводить тренировку продолжительностью до 2-х месяцев. В этом случае устойчивое состояние носит стабильный характер на протяжении 2 недель (12 дней) с 44-го по 56-й день. Тренировка продолжительностью более 2-х месяцев, согласно диаграмме, нецелесообразна, т.к. может привести к нежелательным результатам - срыву адаптации, истощению энергетических ресурсов организма.

Таким образом, использование методов эмпирических зависимостей для оценки функциональных отношений между концентрациями адениновых нуклеотидов АТФ и АМФ в мозге животных в условиях гипоксического прекондиционирования позволяет:

1. аппроксимировать зависимость между выбранными показателями моделью множественной регрессии;

2. анализировать характер развития адаптивного процесса мозга под влиянием гипоксического прекондиционирования;

3. прогнозировать эффективность выбранных режимов гипоксических тренировок;

4. контролировать возможность оптимизации гипоксического прекондиционирования при разработке способов гипокситерапии мозга.

В результате проведенных исследований получен патент России на «Способ оценки устойчивости животных к гипоксии» №2022526, позволяющий экономить 50% количества животных и дорогостоящих реактивов.

Выводы

1. Между активностью окислительных ферментов дыхательной цепи, миКК и уровнем АТФ в ткани мозга животных установлен линейный вид зависимости, соответствующий линейной аппроксимации у = а0х + а,, который не меняет своей структуры от характера гипоксического воздействия.

2. Установлено, что форма зависимости между показателями окислительного фосфорилирования (концентрацией АТФ и скоростью фосфорилирования АДФ) изменяется от линейной у интактных

животных до дробно-линейной у = —-— при кислородном

а0х + а,

голодании. _

3. Показана возможность прогнозирования по модели множественной регрессии уровня АТФ в мозге животных от состояния ферментативной системы митохондрий и скорости фосфорилирования АДФ в разных условиях нарушения кислородного режима.

4. Характер гипоксического воздействия влияет на вид количественной зависимости между показателями адениновых нуклеотидов в нервной ткани. Форма функции, аппроксимирующей зависимость между АМФ и АТФ, изменяется от линейной при гипобарической гипоксии до кубической у = а0х1 + й,х2 + а2х + а3 при ■ гипоксическом прекондиционировании и ишемическом воздействии.

5. Сформулированы модели множественной регрессии, позволяющие прогнозировать содержание нуклеотидного фонда мозга в разных условиях дефицита кислорода.

6. Доказана возможность прогнозирования колебательного характера развития процесса адаптации при гипоксическом прекондиционировании по модели множественной регрессии, объединяющей зависимость уровней адениновых нуклеотидов от числа тренировочных подъемов.

7. Изменение структуры математических моделей, аппроксимирующих количественную зависимость между показателями энергоаккумулирующего процесса мозга, интегрально отражает

функциональное состояние мозга при нарушении кислородного режима.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Хватова Е.М., Мошкова А.Н. "Использование методов эмпирических зависимостей для прогнозирования энергетического состояния мозга в условиях гипоксии разной продолжительности - //Ж. "Нейрохимия", Москва.

- «Наука, №2 - 1997. - Т. 14. - С.211-214.

2. Мошкова А.Н., Стефанов В.Е., Хватова Е.М., Лызлова С.Н. Подходы к прогнозированию пределов устойчивости организма к гипоксии, основанные на оценке системы адениновых нуклеотидов - //Ж. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». - Москва. - "Наука". - №4. Т. 125.

- 1998. - С.391-394. (Перевод: Bulletin of Experimental Biology and Medicine. — 1998. - Vol. 125, no.4. - P. 345 - 347).

3. Мошкова A.H., Хватова E.M. Использование эмпирических зависимостей в системе адениновых нуклеотидов для прогнозирования содержания АМФ в мозге при гипоксии - //Ж. "Вопросы медицинской химии". - №6. - 2001. -Т 47. - С.605-608.

4. Мошкова А.Н., Хватова Е.М., Русакова И.А. Оценка и прогнозирование активности ферментов в экстремальных условиях жизнедеятельности организма: применение математических методов анализа. //Ж. Нейрохимия. — Москва. - «Наука». - №4. - 2002. - Т.19. - С.293-296.

5. Мошкова А.Н., Хватова Е.М., Русакова И.А. Исследование зависимости цитохромоксидазной активности от NADN-дегидрогеназной активности в дыхательной цепи митохондрий мозга кролика в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. //Ж. Нейрохимия. — Москва. - «Наука». - №2. — 2004.-Т. 21.-С. 121-124.

6. Мошкова А.Н., Хватова Е.М., Русакова И.А. Оценка и прогнозирование скорости фосфорилирования в мозге животных в условиях гипоксии. //Ж. Нейрохимия. - Москва. - 2006. - Т.23, №4. - С.342-345.

7. Мошкова А.Н., Хватова Е.М., Русакова И.А.. «Использование математического анализа для оценки кинетических характеристик окислительного фосфорилирования в мозге животных в условиях гипоксии». //Ж. Нейрохимия. - 2007. - Т.24, - №1. - С.65-68 (Перевод: Nourochemical Journal. - 2007. - V.3, No.3. - Р.240-243).

8. Хватова Е.М., Мошкова А.Н. Прогнозирование пределов устойчивости головного Мозга к гипоксии по характеристике адениновых нуклеотидов. //Патогенез. - 2008. - Т.6,- №3. - С.92.

9. Мошкова А.Н., Хватова Е.М., Русакова И.А.. Анализ и прогнозирование концентрации АТФ в мозге животных в условиях гипоксии. //Ж. Нейрохимия. - Москва. - 2009. - Т.26, №1. - С.51-55 (Перевод: Neurochemical Journal. - 2009. - V.3, No. 1. - P.44-48).

Ю.Мошкова A.H., Ерлыкина Е.И., Хватова E.M... Использование методов математического анализа для прогнозирования активности

митохондриальной креатинкиназы по уровню АТФ в условиях ишемии мозга. - //Ж. Нейрохимия. - Москва. - 2009. - Т.55. - №6. - С.759-765. П.Мошкова А.Н., Ерлыкина Е.И, Сергеева Т.Ф., Хватова Е.М. Подходы к прогнозированию адаптивного состояния энергетической системы мозга в условиях гипоксии. - //Москва. - Бюллетень экспериментальной биологической медицины. - 2010. - Т.148, №3. - С.282-285. (Перевод: Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2010. -Vol.149, no.3. -P.308 - 310).

Изобретения

12.Мошкова A.H., Миронова Г.В., Хватова Е.М. Русакова И.А. - Роспатент Российской Федерации. - «Способ определения креатинфосфата в ткани мозга». - №2340903. - 2008. - Приоритет изобретения 30.09.2006г. - Бюлл. изобретений-2008. - №34. - С.1-2.

13.Хватова Е.М., Галкин В.М., Мошкова А.Н., Миронова Г.В., Сидоркина А.Н. - Роспатент Российской Федерации. - «Способ оценки устойчивости животных к гипоксии». - №2022526. - 1994. Приоритет изобретения 15.06.1987г.- Бюлл. изобретений - 1994. - №10. - С.1-10.

14.А,С. СССР №983542 МКИ С01 №33/50 «Способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологических объектах». Нижегородский медицинский институт: Авторы изобретения Галкин В.М., Хватова Е.М., Мошкова А.Н., Семенова Т.С. - 12.12.80 №3227638/28-13. -Бюллетень изобретений. - 1982. - №47. - С. 1-6.

15.А:С. СССР №1250950 МКИ С01 №33/48 «Способ определения активности цитохромоксидазы».. Нижегородский медицинский институт: Авторы изобретения Хватова Е.М., Галкин В.М., Мошкова А.Н., Семенова Т.С. -01.12.83 №3668824/28-14. -Бюллетень изобретений. - 1986. - №30. - С.1-2.

16.A.C. СССР №1302198 МКИ С01 №33/48 «Способ определения аденозинмонофосфата в ткани мозга». Нижегородский медицинский институт: авторы изобретения Хватова Е.М., Галкин В.М., Мошкова А.Н., Миронова Г.В., Сидоркина А.Н. - 02.09.85 №3951427/28-14. - Бюллетень изобретений. - 1987. - №13. - С.1-8.

17.A.C. СССР №1250950 МКИ С01 №33/48 «Способ определения аденозинтрифосфата в мозге экспериментальных животных». Нижегородский медицинский институт, Нижегородский технический университет: авторы изобретения Хватова Е.М., Галкин В.М., Мошкова А.Н., Шуматова E.H., Миронова Г.В., Сидоркина А.Н. - 15.06.87 №42631142/28-14. - Бюллетень изобретений. - 1990. - №10. - С.1-10.

Статьи в региональных изданиях и материалы конференций

18.Мошкова А.Н. Исследование зависимости скорости фосфорилирования АДФ от концентрации экзогенного АДФ при гипоксии разной степени продолжительности. //Сборник «Гипоксия и окислительные процессы». -Н.Новгород. - 1992. - С. 83-92.

19.Мошкова А.Н. Макроэргические фосфаты мозга, математическое моделирование и прогнозирование их содержания при гипоксии.//Материалы

Всероссийской конференции «Кардиология, Фармакология». - Н.Новгород, -1995.-С. 115.

20.Мошкова А.Н. Математическое описание зависимости между содержанием адениновых нуклеотидов - функция прогнозирования пределов устойчивости организма к состоянию гипоксии //Материалы 1-й региональной конференции «Теория и практика устойчивости развития социальных систем». - Н.Новгород, - 1995. - С.72-74.

21.Мошкова А.Н. Использование методов математического анализа для прогнозирования активности ферментов дыхательной цепи Митохондрий в условиях разной степени разрежения атмосферы. // Материалы Всероссийской конференции «Гипоксия». - Москва. - 1997. - С.83-84.

22.Мошкова A.M., Лызлова С.Н., Стефанов В.Е., Хватова Е.М. Использование методов эмпирических зависимостей для прогнозирования пределов устойчивости организма к гипоксии на примере оценки системы адениновых нуклеотидов. - //Сб. «Hypoxia Medical». - Материалы 3-ей международной конференции. - С.Петербург, - 1998. - С.52.

23.Мошкова А.Н., Гайнулин М.Р., Хватова Е.М. "Математическое моделирование как метод интегральной оценки ферментативных процессов в мозге". - //Сб. докл. конференции "Механизмы структурной, ферментативной и нейрохимической пластичности мозга". - М. - 1999. - С.64.

24.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Оценка и прогнозирование содержания АМФ в мозге при изменении его функционального состояния. - //Сб. докладов конференции "Новое в изучении пластичности мозга". - Москва. - 2000. -С.54. ; '.;■'.

25.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Использование методов эмпирических зависимостей для прогнозирования энергетического состояния мозга при изменении условий окружающей среды. //Сб. тезисов докладов конференции «Организация и пластичность коры больших полушарий головного мозга. -Москва.-2001.-С.55.

26.Мошкова А.Н., Русакова И.А., Хватова Е.М. Использование методов математического анализа для оценки зависимых изменений активности ферментов в дыхательной цепи митохондрий в экстремальных условиях гипоксии. - //Сб. тезисов докладов 3-й Всероссийской конференции с международным участием: "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция". -Москва. - 2002. - С.86.

27.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Русакова И.А. Прогнозирование активности цитохромоксидазы в мозге животных расчетным способом. // Материалы Всероссийской конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга». Москва. - 2003. - С.61.

28.Мошкова А.Н., Хватова Е.М., Русакова И.А. Оценка системы адениновых нуклеотидов как один из подходов адаптивной реакции мозга к гипоксии. Сборник Гипоксия. Механизмы. Адаптация. Коррекция. «Материалы 4-й российской конференции (с международным участием). Москва, 2005г.- С.79.

29.Мошкова А.Н., Хватова Е.М., Русакова «Влияние температуры тела животных на вид зависимости между активностями СДГ и ЦО в дыхательной

цепи митохондрий мозга при гипоксии средней тяжести». //Москва. -Материалы 4-й российской конференции (с международным участием). -2005г.-С.61.

30.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Русакова И.А. Анализ зависимости скорости фосфорилирования АДФ от концентрации экзогенного АДФ при гипоксии разной тяжести и продолжительности //Материалы Всероссийской конференции «Нейроспецифические метаболиты и этимологические основы деятельности центральной нервной системы». Пенза. - 2006. - С.130-131.

31.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Русакова И.А. Оценка и прогнозирование энергетического состояния мозга при гипоксии разной продолжительности на примере математического анализа эмпирической зависимости между конечной концентрацией АТФ и скоростью фосфорилирования АДФ. //Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга». Москва. - 2006. - С.183-185. |

32.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Русакова И.А. Прогнозирование уровня конечной концентрации АТФ в ткани мозга при митохондриальной дисфункции, вызванной гипоксией разной степени тяжести. //Материалы Всероссийской конференции «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга». Москва.-2007.-С. 413-418. .

33.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Оценка и прогнозирование содержания высокоэнергетических фосфатов в мозге животных в разных условиях гипоксии. //Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы адаптивных и патологических состояний мозга». С.Петербург. - 2008. - С.93-94.

34.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Прогнозирование энергетических показателей мозга в экспериментальных условиях его жизнедеятельности. //Материалы IV съезда биохимиков. - Новосибирск. - 2008. - С. 90-91.

35.Мошкова А.Н., Хватова Е.М. Прогнозирование эффективного режима гипоксического прекондиционирования по уровню адениновыхэ нуклеотидов. //Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды». С.Петербург. - 2010. - С.200-201.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДЦ - дыхательная цепь

МФК мшохондриальные ферментные кэлшлексы

НАДН-дг--НАДН-дегадрогеназа

СДГ- сущинатдегадрогеназа ,

ЦО - цитохромокидаьа

mí:KK -'- митохондриальная креатинКинай

АТФ - аденозиктрифосфат

АДФ -- адснозиндифосфат

АМФ-аденозинмонофосфат

Подписано к печати'29.03.Ц, Формат 60/85. Объем 2,0 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Бумага писчая. Печать офсетная.

НГТУ им. P.E. Алексеева 603950, г. Н.Новгород, ул. Минина, 24.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Мошкова, Альбина Николаевна, Нижний Новгород

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

На правах пукописи #

Мошкова Альбина Николаевна

05201151959

Оценка и прогнозирование влияния гипоксии на энергетические процессы мозга с применением

математических моделей

Специальность 03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант Засл. деятель науки РФ профессор, д.м.н. Хватова Е.М.

Нижний Новгород 2011

Оглавление

Введение................................................................................ 4

Общая характеристика......................................................... 4

Актуальность темы и востребовательность результатов................ 4

Цель и задачи исследования».................................................. 5

Научная новизна.................................................................. 6

Достоверность полученных результатов.................................... 7

Теоретическая и практическая значимость................................. 7

Методология исследования.................................................... 8

Положения, выносимые на защиту........................................... 8

Публикации........................................................................ 9

Глава 1 Характеристика энергетического метаболизма мозга

при нарушении кислородного режима.................................. 18

1.1 Митохондриальная система - основной путь организации энергоаккумулирующего процесса в ткани мозга..................... 18

1.2 Формирование адаптивного состояния организма под влиянием гипоксического прекондиционирования................................ 27 „

' Глава 2 Моделирование биологических явлений и роль

математических методов в прогнозировании состояния

биологических систем...................................................... 31

2.1 Моделирование - один из методов научного познания.............. 31

2.2. Математическое моделирование в биологии.......................... 33

2.3 Функциональная зависимость - средство математического моделирования............................................................... 37

Глава 3 Материалы и методы исследования.................................... 40

3.1 Постановка эксперимента.................................................. 40

3.2 Методы исследования...................................................... 43

3.2.1 Выделение митохондриальной фракции головного мозга ... 43

3.2.2 Определение активности окислительно-восстановительных ферментов митохондриальной дыхательной цепи.............. 44

3.2.3 Определение активности креатинкиназы в общей митохондриальной фракции ......................................... 45

3.2.4 Определение концентрации адеиновых нуклеотидов......... 45

3.2.5 Определение фосфорилирующей активности митохондрий мозга полярографическим методом................................ 46

3.2.6 Методы статистической обработки экспериментальных результатов.............................................................. 47

3.3 Выбор математических методов для исследования зависимости между экспериментальными данными................................... 49

3.3.1. Классы задач, используемые для изучения зависимости между количественными показателями, характеризующими работу системы......................................................... 49

3.3.2 Подбор кривой......................................................... 51

3.3.3 Расчет параметров аппроксимирующих функций.............. 54

3.3.4 Оценка значимости регрессионной модели..................... 62

Глава 4 Результаты исследования................................................. 65

4.1 Прогнозирование энергетической активности мозга животных в

условиях гипоксии методами математического моделирования ... 65

4.1.1 Оценка и прогнозирование функционального состояния ферментных комплексов дыхательной цепи в условиях нарушения кислородного режима.................................. 65

4.1.2 Содержание аденозинтрифосфата в зависимости от активности окислитено-восстановительных ферментов

ДЦ при недостатке кислорода...................................... 84

4.1.3 Активность митохондриальной креатинкиназы и концентрация АТФ в ткани мозга при ишемии разной продолжительности................................................... 95

4.1.4. Зависимость концентрации АТФ в ткани мозга от скорости фосфорилирования ADP под влиянием гипоксического воздействия............................................................. 110

4.1.5 Резюме по разделу 4.1 ................................................ 126

4.2 Прогнозирование пределов устойчивости организма к гипоксии

по уровню адениновых нуклеотидов методами математического

моделирования............................................................... 132

4.2.1 Исходные характеристики содержания АТФ, АМФ и их отношений (АТР/АМР) в условиях острого кислородного голодания................................................................ 132

4.2.2 Прогнозирование эффективных режимов гипоксического прекондиционирования по концентрации адениновых нуклеотидов............................................................ 150

4.2.3 Резюме по разделу 4.2................................................ 164

Заключение......................................................................................................................................167

Список литературы................................................................... 174

Приложения............................................................................ 210

ВВЕДЕНИЕ

Общая характеристика

Работа посвящена исследованию энергетических процессов в мозге животных при нарушении кислородного режима методами 'математического анализа. Подобные исследования могут быть использованы для разработки способов прогнозирования энергетического состояния мозга в экстремальных условиях жизнедеятельности организма и адаптации к дефициту кислорода.

Актуальность темы и востребовательность результатов

Гипоксия и ишемия! оказывают существенное повреждающее воздействие на состояние мозга, поэтому защита от гипоксии и ее последствий приобретает социальную ^значимость. Повышение устойчивости мозга к повреждающим факторам является крайне актуальной задачей и привлекает специалистов различных профилей клинической и экспериментальной биологии и медицины. (Цветкова, 2005; У1азоу, 2005).

Одним из наиболее эффективных немедикаментозных способов, направленных на мобилизацию защитных механизмов мозга, является гипокси-ческое прекондиционирование. Оценка характера протективного действия гипоксического прекондиционирования на структурно-функциональные повреждения мозга имеет важное значение для определения возможного спектра применения этого вида прекондиционирования в клинической» практике (Хватова и др., 1987-2009 г., Рыбникова, 2006-2010, Самойлов, Строев, 2003-2010, Лукьянова, 2002-2010 и др.). Для разработки способов защиты от гипоксии и ее последствий требуется создание алгоритма оценки и прогнозирования энергетического состояния мозга в экстремальных условиях, а также прогнозирование эффективных режимов тренировки, формирующих устойчивую адаптацию мозга к повреждающим воздействиям дефицита кислорода. Привлечение методов математического моделирования в решении биологических задач дает возможность получать информацию о состоянии изучае-

мых процессов и систем, сокращая время экспериментальной работы, экономя дорогостоящие реактивы и сохраняя жизнь животным. При этом возможно установление количественных отношений между отдельными элементами систем, что позволяет описать поведение исследуемых систем как единого целого (Дромашко, 1999).

В случае больших, сложно1 организованных систем, формализованный подход может оказаться* в начале исследования единственным средством получить информацию о существующих в системе взаимодействиях и сделать первый шаг к проникновению в механизмы изучаемого явления. Использование моделей множественной регрессии, объединяющих различные характеристики метаболических процессов мозга при гипоксических и ишемиче-ских повреждениях, позволяет получать достоверную информацию об энергетическом балансе мозга и прогнозировать функциональное состояние мозга в экстремальных условиях жизнедеятельности и адаптации к неблагоприятным воздействиям окружающей среды. Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является оценка влияния гипоксиче-ского воздействия на энергетический обмен мозга экспериментальных животных и применение методов математического анализа для прогнозирования возникающих изменений в условиях гипоксии и адаптации к дефициту кислорода.

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе решаются следующие задачи:

2. анализ зависимости между показателями окислительного фосфорили-рования в условиях гипоксии и прогнозирование концентрации АТФ мозга при нарушении скорости фосфорилирования АДФ;

3. изучение зависимости между концентрациями адениновых нуклеоти-дов нервной ткани и прогнозирование содержания АМФ при нарастании тяжести гипоксического воздействия;

4. исследование количественной зависимости между уровнями адениновых нуклеотидов в ткани мозга в условиях гипоксического преконди-ционирования с целью прогнозирования пределов устойчивости организма к гипоксии.

Научная новизна

1. Впервые установлено, что количественная зависимость между активностью окислительных ферментов дыхательной цепи митохондрий, миКК и конечной концентрацией АТФ в мозге животных характеризуется линейной функцией у = а0х + о,, структура которой не меняется в условиях дефицита кислорода;

сложной дробно-линейной у =-;

3. Впервые установлено изменение вида количественной зависимости между содержанием АМФ и АТФ от простого линейного при гипоба-рической гипоксии в более сложный - кубический

3 2

у = а()х + ахх + а2х + а3 в условиях ишемии и гипоксического пре-кондиционирования;

5. применение технологии моделирования на уровне формального математического аппарата впервые показало, что изменение вида моделей,

объединяющих зависимые показатели энергоаккумулирующего процесса, интегрально отражает функциональное состояние мозга в условиях кислородного голодания.

Достоверность полученных результатов

Значимость предлагаемых« моделей, доказана по критериям Фишера-Снедекера. и Стьюдента. Показана их высокая вероятностная достоверность (р=0,95-Ю, 99): Адекватность.мод елей* объекту исследования, их прогностическая способность в экстремальных,условиях жизнедеятельности организма и адаптации к- гипоксии- проверялись расчетом выбранных показателей энергоаккумулирующего процесса. Аналитический .расчет был подтвержден дополнительно поставленными экспериментами в нашей лаборатории либо литературными данными.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе исследования разработаны расчетные способы определения ферментативной активности митохондриальной дыхательной цепи, а также-концентрации высокоэнергетических фосфатов в мозге животных в условиях гипоксического воздействия, защищенные авторскими свидетельствами и патентами Российской Федерации. Эти способы могут быть использованы в экспериментальных лабораториях, изучающих проблему гипоксии и ишемии мозга для получения информации о состоянии биологического- процесса под влиянием гипоксического- воздействия, экономя дорогостоящие реактивы, животных и время.

Полученные математические модели позволяют расчетным способом прогнозировать пределы устойчивости организма к гипоксии и рекомендовать эффективные режимы гипоксического прекондиционирования, которые могут быть использованы при разработке эффективных методов гипоксите-рапии.

различных условиях внешней среды. Программа может быть использована биологами в исследовательской работе.

Методология исследования

Исследование зависимости между характеристиками энергоаккуму-лирующего процесса в мозге животных в экстремальных условиях жизнедеятельности организма и в условиях адаптации к дефициту кислорода проведено на основе сочетания экспериментальных и теоретических данных и опирается на современные информационные технологии, предусматривающие использование:

• стандартных вычислительных комплексов статистической обработки экспериментальных показателей;

• математических методов и моделей корреляционно-регрессивного анализа;

• итерационных и интерполяционных методов;

• статистических критериев значимости и достоверности результатов моделирования;

• качественных методов исследования сходимости моделей.

Положения, выносимые на защиту

2. Вид количественной зависимости между показателями окислительного фосфорилирования и нуклеотидного фонда мозга изменяется от линей-

ной формы в более сложную (дробно-линейную и кубическую) и характеризует состояние этих процессов при нарушении кислородного режима.

3. 4-х кратное гипоксическое прекондиционирование является наиболее эффективным для формирования устойчивого состояния мозга к дефициту кислорода. Описание количественной зависимости уровней адениновых нуклеотидов элементарными функциями позволило установить колебательный характер развития процесса адаптации к гипоксии, и прогнозировать изменение этого процесса при долгосрочных тренировках.

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 35 работах, из них

13 работ из общего списка рекомендованного ВАК России и 4 авторских свидетельства на способы определения показателей энергоаккумулирующего процесса в мозге животных.

Личный вклад автора в проведенные исследования

Все результаты совместных работ, включенные в диссертацию, получены лично автором.

Апробация работы

Результаты проведенных исследований были представлены на: Всероссийской конференции «Организация и пластичность коры.больших полушарий головного мозга» (Москва, 2003); IV Всероссийской конференции с международным участием «Гипоксия. Механизмы. Адаптация. Коррекция.» (Москва, 2005); Всероссийской конференции «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности» (Москва, 2006); Всероссийской конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности центральной нервной системы» (Пенза, 2006); Всероссийской конференции «Новое в изучении пластичности мозга» (Москва, 2000); III Международной конференции «Hypoxia Medical» (Санкт-Петербург, 1998); Всероссийской

конференции «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохи-мические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); IV Съезде биохимиков (Новосибирск, 2008); III Всероссийской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва,2002); Всероссийской-конференции с международным участием «Механизмы регуляции, физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям» среды» (Санкт-Петербург, 2010) и т.д.

Структура и объем «работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографии и 4-х приложений. Общий объем работы 271 страницы, в ней содержится 50 рисунков, 54 таблицы. Список литературы включает 354 наименования, приложение к работе содержит 63 страницы.

Содержание работы

Во введении обосновывается актуальность темы исследования, формируется цель и ставятся основные- задачи работы, раскрывается научная новизна и практическая значимость.

В главе 1 представлен обзор литературы о влиянии гипоксических воздействий на развитие энергоаккумулирующего процесса и формирование адаптации к недостатку кислорода в условиях гипоксического прекондицио-нирования.

Параграф 1.1 посвящен изложению экспе

Информация о работе

Мошкова, Альбина Николаевна
доктора биологических наук
Нижний Новгород, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Оценка и прогнозирование влияние гипоксии на энергетические процессы мозга с применением математических моделей. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы