Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

NAD-зависимая малатдегидрогеназа мозга: внутримитохондриальная локализация и регуляция в норме, при гипоксическом стрессе и введении пептида, индуцирующего дельта-сон

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "NAD-зависимая малатдегидрогеназа мозга: внутримитохондриальная локализация и регуляция в норме, при гипоксическом стрессе и введении пептида, индуцирующего дельта-сон"

РГ6 им

СМОЛЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

ГАЙНУЛЛИН Мурат Рушанович

^НЕЗАВИСИМАЯ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗА МОЗГА: ВНУТРИМИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ В НОРМЕ, ПРИ ГИПОКСИЧЕСКОМ СТРЕССЕ И ВВВДЕНИИ ПЕПТИДА, ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЛЬТА-СОН

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Смоленск -1997

Работа выполнена на кафедре биохимии Нижегородской государственной медицинской академии.

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки России, доктор медицинских наук профессор Е. М. Хватова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В. В. Алабовский кандидат биологических наук Т. Г. Макаренко

Ведущая организация - Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится "_"_ 199_г. в _ часов на заседании

диссертационного совета К 084 . 34 . 01 в Смоленской государственной медицинской академии (214019, Смоленск, ул. Крупской, 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Смоленской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан "_"_199__г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Н. Ф. Фаращук

Актуальность темы. Проблема адаптации к изменяющимся условиям внешней среды - одна из центральных в биологии и медицине. Внутриклеточные ферменты не только катализируют превращение эндогенных субстратов, но также служат основными регуляторами обмена веществ (Хочачка, Сомеро, 19Э8). Каталитические свойства ферментов, в свою очередь, эффективно контролируются концентрацией клеточных метаболитов. Информативным методом исследования каталитической и регуляторной функции ферментов является изучение кинетики ферментативных реакций.

Среди других тканей организма головной мозг характеризуется высоким уровнем энергетического обмена. Интенсивный окислительный синтез АТР обеспечивает энергией специфические функции нервной ткани. С этим связана характерная для мозга функция ЦТК как, в первую очередь, энергетического механизма (Siesjo, 1978). Для нервной ткани особое значение имеет также реутилизация гликолитического NADH, образующегося в цитоплазме. Перенос Н+-эквивалентов внутрь митохондрий обеспечивается щунтовыми транспортными системами, самой мощной среда которых в ткани мозга является малат-аспартатная челночная система (Рэкер, 1967; Скулачев, 1969). В этой связи большой интерес для изучения представляет митохондриальная NAD-зависимая малатдегидрогеназа (NAD-МДГ), участвующая одновременно в работе ЦТК и малат-аспартатного шунта. Изменение каталитических свойств NAD-МДГ может иметь большое значение в регуляции ЦТК как единой метаболической системы.

Гипоксия является одним из распространенных патогенетических факторов в развитии многих заболеваний. Головной мозг характеризуется высокой чувствительностью к недостатку кислорода. Уже на ранних стадиях гипоксии в нервной ткани определяются специфические биохимические сдвиги, затрагивающие активность ферментов энергетического обмена и стационарные концентрации важнейших метаболитов. в частности, изменяется отношение NAD+/NADH - фактор, контролирующий активность ряда важнейших митохондриальных ферментов (Ещенко, 1982). В этой связи представляет интерес изучение каталитических свойств NAD-зависимой МДГ при переменных концентрациях оксалоацетата и NADH в различных функциональных состояниях организма.

Исследование механизмов регуляции энергетического метаболизма при гипоксии является важным условием для разработки эффективных методов предупреждения и коррекции гипоксических изменений. Для предупреждения метаболических нарушений при гипоксическом стрессе применялось предварительное введение пептида, индуцирующего дельта-сон (ДСИП), как антистрессорного фактора, обладающего адаптогенным действием. Однако влияние ДСИП на обменные процессы в мозге изучено крайне слабо.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение зависимости каталитических свойств митохондриального изофермента ИАО-зависимой малатдегидрогеназы мозга от взаимодействия со структурными элементами митохондрий и определение особенностей регуляции при различных функциональных состояниях нервной клетки: в норме, в условиях гипоксического стресса и при введении пептида, индуцирующего дельта-сон, до гипоксии.

В работе бьши поставлены следующие задачи:

1. На основании изучения распределения активности КАБ-ВДГ в митохондриях и субмитохондриальных фракциях мозга установить внутримитохондриальную локализацию фермента и дать характеристику взаимодействия фермента с внутренней мембраной митохондрий.

2. Используя методы стационарной кинетики изучить каталитические свойства №Ш-МДГ в митохондриях и субмитохондриальных фракциях мозга. Дать характеристику зависимости каталитических свойств от взаимодействия со структурными элементами митохондрий.

3. Изучить зависимость каталитических свойств ЫАВ-МДГ мозга в митохондриях, митохондриальном матриксе и на мембранах от функционального состояния организма.

4. Исследовать особенности регуляции ЮШ-МДГ в митохондриях и суОмитохондриальных фракциях под влиянием пептида, индуцирующего дельта-сон, в условиях гипоксического воздействия.

Научная новизна. Дана количественная характеристика распределения малатдегидрогеназной активности между матриксом и мембранами митохондрий мозга. Обнаружено, что соотношение активности мембраносвязанного и "растворимого" фермента в норме составляет 3:1.

Охарактеризована "растворимая" форма ИМ-ЩТ, локализованная в митохондриальном матриксе. Установлено, что данная форма фермента близка по свойствам очищенной КМ-МДГ мозга.

Показана гетерогенность мембранной фракции ЫАВ-МДГ, которая содержит адсорбированный и прочно связанный с мембраной фермент. Активность последнего составляет 15% общей активности №Ш-ВДГ.

Установлена зависимость каталитических свойств NAD-MДГ от взаимодействия со структурными элементами митохондрий. Показано, что адсорбционные взаимодействия фермента с нативно организованной мембраной ведут к развитию аномального типа кинетики реакции окисления {ИДИ. Выявлена роль ассоциативных (предположительно, белок-белковых) взаимодействий в модификации каталитических свойств ШШ-МДГ.

Определены особенности регуляции митохондриальной ЫАО-МДГ при изменении концентрации НАШ. Установлено, что объектом регулирующего воздействия восстановленного кофактора является №Ш-МДГ, адсорбированная на митохондриальной мембране.

Дана расширенная характеристика изменений каталитических свойств ЫМ)~ВДГ при гипоксическом стрессе, затрагивающих кинетику малатдегидрогеназной реакции в общей митохондриальной и мембранной фракциях. Показана модификация регуляторного влияния ЮШН в условиях гипоксического стресса.

Изучен механизм антистрессорного действия пептида, индуцирующего дельта-сон. Установлено, что предварительное введение ДСИП предупреждает развитие стресс-индуцированных изменений каталитических свойств №Ш-МДГ. При этом кинетические константы малатдегидрогеназной реакции не возвращаются к нормальным величинам, а стабилизируются на промежуточном уровне.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят существенный вклад в фундаментальные представления о внутриклеточных механизмах регуляции ферментов на примере митохондриального изофермента №Ш-МДГ. Выявленный механизм модификации каталитических свойств ИАО-МДГ может служить для понимания роли субклеточных структур в регуляции ферментов.

Изучение изменений каталитических свойств ЫАО-НДГ в условиях кратковременной гипобэрической гипоксии представляет практический

интерес для понимания механизмов развития метаболических нарушений при данной патологии.

Полученные данные показали результативность ДСИП по отношению к реакциям энергетического обмена в мозге и позволили дать характеристику метаболического эффекта нейропептида при острой гипобарической гипоксии как протекторного, а сам препарат отнести к группе адаптогенов метаболического действия. Данное исследование проводилось в рамках доклинического испытания пептида, индуцирующего дельта-сон, как лекарственного препарата, что приобретает прямое практического значение.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзном совещании "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино, 1990 г.), 2-й Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипокеических состояний" (Гродно, 1991 г.), Симпозиуме стран СНГ "Макро- и микроуровни организации мозга" (Москва, 1992 г.), Российской научной конференции "Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы" (С-Петербург, 1994), III International Symposium on Hypoxia (Berlin, 1994), Международной зимней школе молодых ученых по нейрохимии "Новые направления в изучении метаболизма мозга (С-Петербург, 1995 г.) и т.д.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (1-я - обзор литературы), выводов и списка литературы. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста (исключая список литературы), содержит 27 таблиц и 48 рисунков. Библиография представлена 235 источниками, из них 55 отечественные.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились на белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой 150-200 г. Для выделения митохондриальной фракции мозга применялся метод дифференциального центрифугирования (Fonyo, Somogy, 1960). Митохондрии разрушали гипотонической обработкой. Митохондриальную фракцию подвергали ультрацентрифугированига при 100000 g в течение 1 часа. Осадок, содержащий мембраны митохондрий, служил для характеристики

свойств мембраносвязанной формы NñD-МДГ. Для установления характера взаимодействия фермента с мембраной использовали обработку митохондриальных мембран растворами с различной ионной силой (вода и 0,1 М фосфатный буфер) и неионным детергентом Тритон Х-100 в концентрации 0,03% и 0,5% (в/о).

Активность и каталитические свойства NAD-ВДГ во всех экспериментах исследовали по развитию обратной

малатдегидрогеназной реакции (OñA + NADH —> малат + NAD+) в системе, предложенной Foster, Harrison (1974). На основании расчетных значений начальных скоростей реакции проводили анализ зависимости V0 от концентрации OAñ. отдельно для каждой фиксированной концентрации NADH. Обработка кинетических данных проводилась методом нелинейной регрессии по алгоритму Marquart (1963) на персональном компьютере IBM PC с помощью программы "Grafit" в соответствии с рекомендациями Курганова (1978).

Острая гипобарическая гипоксия моделировалась в барокамере проточного типа. Разрежение атмосферы составляло 196 мм рт. ст., что соответствует высоте 10000 м над уровнем моря. Скорость "подъема" во всех экспериментах была постоянной, строго контролировалась и равнялась 1200 м/мин. Экспозиция на максимальной "высоте" составляла 15 мин.

Пептид, индуцирующий дельта-сон, растворяли в физиологическом растворе из расчета 24 мкг/мл и вводили внутрибркшинно в дозе 120 мкг/кг за 20 мин. до взятия животного в опыт.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ

1. Изучение свойств NAD-зависимой малатдегидрогеназы митохондрий головного мозга интактных крыс.

Установлено, что малатдегидрогеназная активность неравномерно распределяется между мембранами и жидкой частью митохондрий. Активность NAD-МДГ, связанная с мембранами, составляет 147% активности митохондриальной фракции. На долю матричного ("растворимого") фермента приходится лишь 46,5% активности NñD-МДГ митохондрий (таб. 1) .

Изучение способности ферментного белка к солюбилизации выявило значительные различия в действии воды, фосфатного буфера и различных концентраций Тритона Х-100 на активность ШО-ВДГ фракции митохондриальных мембран и распределения

мапатдегидрогеназной активности между субмитохондриальными фракциями, полученными при отделении мембран от солюбилизата после соответствующего воздействия. Повторная обработка митохондриальных мембран водой не ведет к дополнительной солюбилизации №Ш-МДГ в раствор. При этом осадок, полученный после разделения, сохраняет такую же малатдегидрогеназную активность, как и исходная фракция митохондриальных мембран. Обработка митохондриальных мембран 0,1 М фосфатным буфером вызывает десорбцию с мембран большей части фермента. Фосфатный солюбилизат характеризуется высокой активностью МАБ-МДГ, которая составляет 94% от активности митохондриальных мембран, ресуспендированных в фосфатном буфере. Незначительная часть ЫАВ-МДГ (14% от исходной активности фермента) сохраняет связь с мембранными структурами и после обработки фосфатным буфером.

Таблица 1

Влияние пептида, индуцирующего дельта-сон (ДСИЛ), на активность малагдегидрогеназы (мкмоль*мин.~1 * г ткани-!-) при предварительном введении в условиях острой гипоксии.

Фракция Интактные Острая Введение ДСИП

гипоксия перед гипоксией

Митохондрии М 268.07 375.80* 344.31

т 17.02 13.35 19.91

п 18 6 8

Митопласт М 124.65 173.11* 138.031"

т 9.11 5.16 6.98

п 10 7 5

Митохондриаль- М 394.04 579.12* 570.41

ные мембраны ш 26.93 20.79 64.57

п 16 6 5

Примечание: *-отличия достоверны при р < 0,05 относительно интактной группы, + - различия достоверны при р<0,05 относит-адьно острой гипоксии

[ОАА], ммоль/л [ОАА], ммоль/л

Рис. 1. Кинетика обратной малатдегидрогеназной реакции в субмитохондриальных фракциях мозга, а - митолласт, б - митохондриальные мембраны.

Тритон Х-100 в концентрации 0,03% солюбилизирует 37% малатдегидрогеназной активности; практически 64% фермента сохраняют связь с мембранными структурами. По данным Доведовой и соавт. (1971) эта концентрация Тритона Х-100 не вызывает выраженных изменений ультраструктуры митохондрий мозга. Полная деструкция органелл под влиянием 0,5% раствора Тритона Х-100 вызывает десорбцию 72% ЫАО-МДГ. 27% от исходной активности митохондриальных мембран, ресуспендированных в растворе с высокой концентрацией Тритона Х-100, регистрируется во фракции осадка, полученного после высокоскоростного центрифугирования.

Изучение кинетики малатдегидрогеназной реакции в общей митохондриальной фракции показало, что фермент характеризуется аномальной формой кривой зависимости У0 от концентрации ОАА.. Б-образное отклонение от классической гиперболы выявляется при всех изученных фиксированных концентрациях КАШ. Восстановленный кофактор оказывает выраженное регуляторное влияние на каталитические свойства КАБ-МДГ в данной фракции. Существенная модификация кинетических параметров реакции происходит при переходе от низких (25-50 мкмоль/л) к высоким (100-200 мкмоль/л) концентрациям ЫАОН. При этом установлено появление эффекта,

*10001

О 50 100 150 200

[НАШ], мкмоль/л

0

О

50 100 150 200

[ЫАОН], мкмоль/л

Рис. 2. Влияние НАШ на кинетические константы обратной малатдегидрогеназной реакции в общей митохондриальной фракции а - зависимость максимальной скорости реакции от

концентрации ИАМ, б - зависимость величины кажущейся константы полунасыщения от концентрации ЫАБН.

-¿у- Интактные -«- Гипоксический стресс

-Д- ДСИП +• гипоксический стресс

подобного субстратному торможению, и значительное (в 3 раза) снижение сродства фермента к субстрату. Значение 'Утах линейно повышается в интервале концентраций НАШ 25-100 мкмоль/л, достигая плато насыщения (рис. 2).

Для МАО-ВДГ, ассоциированной с мембранами митохондрий, установлен Э-образный тип зависимости У0 от концентрации ОАА (рис. 1В). Особенностью кинетического поведения фермента является также эффект, подобный субстратному торможению. Эти кинетические аномалии проявляются во всех условиях эксперимента, независимо от концентрации ИАОН. Прослеживается зависимость кинетических характеристик малатдегидрогеназной реакции от концентрации КАВН. С повышением концентрации восстановленного кофактора от 25 до 50 мкмоль/л происходит выраженная активация фермента, о чем свидетельствует прирост \^тах в 2,5 раза (рис. ЗА). Одновременно установлено почти 4-х кратное повышение значения Ко,5, т.е. резкое снижение сродства ЫАО-МДГ к субстрату (рис. ЗВ) . Дальнейшее повышение концентрации ЫАШ не ведет к существенной модификации параметров "Утах и Ко 5. При всех концентрациях восстановленного кофактора начальные скорости в 2-3 раза ниже

(

и О

О 50 100 150 200

№АОН], мкмоль/л

(О

О 50 100 150 200

[ЫМ)Н], мкмоль/л

I

Рис. 3. Влияние ЫАБН на кинетические константы обратной малатдегидрогеназной реакции во фракции митохондриальных мембран в условиях измененного функционального состояния, а - зависимость максимальной скорости реакции от

концентрации N7^)11, б - зависимость величины кажущейся константы полунасыщения от концентрации ЫАВН.

-л- Интактные -0-- Гипоксический стресс ДСИП + гипоксический стресс

^тах- Этот эффект можно охарактеризовать как сходный с субстратным ингибированием. Регуляторный эффект восстановленного кофактора наиболее выражен в интервале концентраций последнего 25-50 мкмоль/л, что проявляется увеличением максимальной скорости реакции и снижением сродства фермента к субстрату.

Во фракции митопласта определяется классический гиперболический характер развития малатдегидрогеназной реакции (рис. 1А) . Фермент растворимой части матрикса характеризуется низким значением Утах, которое в 3,5 раза ниже, чем максимальные скорости реакции во фракциях митохондрии и митохондриальных мембран. Это может быть связано с небольшим количеством матричной ЫАЛ-МДГ и/или ее низкой активностью. С другой стороны, растворимая форма ЫАБ-МДГ характеризуется высоким сродством к субстрату - ОАА, которое примерно в 4 раза выше, чем определяемое в общей митохондриальной фракции, и в 20 раз выше, чем у фермента, связанного с мембранами.

Полученные результаты свидетельствуют о неоднородности ЫАО-МДГ внутри митохондрий. Установлено, что фермент, локализованный

на мембранах, существенно отличается по каталитическим свойствам от ШЛ-ИДТ, присутствующей в растворенном виде в матриксе. Мембранная форма №Ш-ЩГ характеризуется аномальным типом кинетики с в-образным отклонением от гиперболы, высокой максимальной скоростью реакции и низким сродством к субстрату. В отличие от мембранной, матричная форма ЫАО-МДГ обладает классическим гиперболическим типом кинетики, низким значением максимальной скорости и высоким сродством к субстрату.

Изучали каталитические свойства малатдегидрогеназы в субмитохондриальных фракциях, полученных после обработки митохондриальных мембран 0,1 М фосфатным буфером и разделения мембран и солюбилизата.

Результаты изучения каталитических свойств НАО-ВДГ во фракции митохондриальных мембран, обработанных 0,1 М фосфатным буфером, позволяют сделать следующее заключение. Фермент, сохранивший связь с мембраной, характеризуется классической кинетикой, подчиняющейся уравнению Михаэлиса-Ментен, низкими значениями Утах и высоким сродством к субстрату. Восстановленный кофактор не оказывает регуляторного влияния на эту форму ШВ-ЫДГ: 8-кратное увеличение концентрации ШШН не вызывает ни модификации типа кинетики, ни повышения (или понижения) максимальной скорости реакции, ни изменения сродства фермента к субстрату. Отсутствует также эффект ингибирования высокими концентрациями субстрата (максимальная использованная концентрация ОАА. в данных условиях составляет 30 Кт).

Результаты анализа кинетики ЫАО-МДГ во фракции фосфатного солюбилизата свидетельствуют о ее аномальном характере. Б-образная форма зависимости У0 от концентрации ОДА установлена при всех концентрациях ШОН. Фермент в данных условиях способен регулироваться восстановленным кофактором. Модификация каталитических свойств КАО-МДГ характеризуется увеличением значений Vтах, снижением сродства к субстрату и появлением эффекта по типу ингибирования субстратом. Наиболее выраженное (в 2,5 раза) повышение значения и возникновение субстратного

торможения установлено в интервале концентраций восстановленного кофактора 50-100 мкмоль/л.

Процедура замораживания-оттаивания, основанная на совместном действии изменения pH, ионной силы и температуры растворов солей при эвтектическом составе раствора (Van den Berg and Rose, 1959; Chilson et al., 1965), ведет к значительным изменениям каталитических свойств NAD-МДГ, солюбилизированной с митохондриальных мембран 0,1 М фосфатным буфером. Это проявляется в развитии кинетики ферментативной реакции, строго подчиняющейся уравнению Михаэлиса-Ментен при низких концентрациях восстановленного кофактора 25 и 50 мкмоль/л. Данная трансформация сопровождается снижением Vmax в 1,5 раза, по сравнению с нативным состоянием, и 3-6ТИ кратным увеличением сродства фермента к субстрату. После замораживания-оттаивания установлена потеря S-образной аномалии кинетики и снижение в 2 раза максимальной скорости малатдегидрогеназной реакции при концентрации NADH 100 мкмоль/л, однако сохраняется эффект субстратного торможения, характерный в данных условиях для нативного солюбилизированного фермента. При максимальной фиксированной концентрации восстановленного кофактора свойства NAD-МДГ после замораживания-оттаивания практически не меняются, за исключением более высокого сродства к субстрату.

Во фракции фосфатного солюбилизата после процедуры замораживания-оттаивания показан регуляторный эффект NADH, который проявляется в модификации кинетики ферментативной реакции. При увеличении концентрации восстановленного кофактора от 50 до 100 мкмоль происходит трансформация классической кинетики в аномальную, характеризующуюся на графике зависимости VD от концентрации ОАА отсутствием точек перегиба и более резким выходом на плато насыщения. Это сопровождается увеличением максимальной скорости реакции, значительным снижением сродства фермента к субстрату и возникновением эффекта субстратного торможения.

Изучали каталитические свойства малатдегидрогеназы при фиксированной концентрации NADH 200 мкмоль/л и нарастающих концентрациях ОАА после деструкции митохондриальных мембран 0,5% раствором Тритона Х-100 и разделения супернатанта и плотного осадка. В обеих фракциях определяется аномальный тип кинетики, для которого характерно отсутствие точек перегиба на графике

зависимости от концентрации ОАА. и более резкий, по сравнению с гиперболой, выход на плато насыщения. При этом определяется эффект по типу субстратного ингибирования. Обе изученные фракции характеризуются одинаковым сродством к субстрату, т.е. показано их принципиальное сходство. Выявленные различия в максимальных скоростях реакции носят количественный характер и могут быть связаны с неравномерным распределением фермента между фракциями.

2. Каталитические свойства ЫАО-зависимой малатдегидрогеназы в митохондриях и суОмитохондриальных фракциях мозга крыс, перенесших острое гипоксическое воздействие

В соответствии с задачей исследования влияния острой гипоксии на внутримитохондриальное распределение и каталитические свойства малатдегидрогеназы мозга изучали активность и кинетику ЫАО-ВДГ в общей митохондриальной фракции, во фракции митохондриальных мембран и фракции митопласта. Установлен достоверный прирост активности ЫАБ-МДГ во всех изученных фракциях по сравнению с интактными животными. При гипоксии активность фермента выше: в общей митохондриальной фракции на 40%, в митопласте на 39%, на митохондриальных мембранах на 47%, чем в соответствующей фракции в норме (таб. 1) . Вместе с тем, острое гипоксическое воздействие не влияет на распределение малатдегидрогеназной активности между мембранами и жидкой частью митохондрий.

Таким образом, эффект острой гипоксии проявляется равномерным повышением активности МАБ-МДГ в митохондриях и обеих субмитохондриальных фракциях, при сохранении исходного внутримитохондриального распределения фермента.

Изучение кинетики малатдегидрогеназной реакции в общей митохондриальной фракции при гипоксии показало, что фермент характеризуется Б-образной формой зависимости У0 от концентрации ОАА. Кинетическая аномалия проявляется во всех условиях эксперимента, независимо от концентрации восстановленного кофактора. Установлен также эффект по типу субстратного торможения: при всех изученных концентрациях ЫАОН определяется превышение рассчитанных значений Угаах над регистрируемыми в эксперименте ' У0 при насыщении в 1,5-3,5 раза. Увеличение

фиксированной концентрации №ШН от 25 до 100 мкмоль/л не оказывает существенного влияния на кинетику малатдегидрогеназной реакции: изменения параметров и не являются значимыми

(рис. 2). Регуляторный эффект восстановленного кофактора наиболее выражен при повышении концентраций последнего до 200 мкмоль/л и проявляется увеличением максимальной скорости реакции в 1,7-2,2 раза и 2-3х кратным снижением сродства фермента к субстрату.

Изучение кинетики малатдегидрогеназной реакции во фракции митохондриальных мембран показало, что фермент характеризуется аномальной формой кривой зависимости от концентрации ОАА. Б-образное отклонение от классической гиперболы и эффект, подобный субстратному торможению выявляется при всех изученных фиксированных концентрациях КАИН. Установлено, что регуляторное влияние восстановленного кофактора на каталитические свойства №Ш-МДГ в данной фракции проявляется в линейном повышении значения ¥тах во всем интервале изученных концентраций МАВН (рис. ЗА) . Одновременно происходит также выраженное снижение сродства фермента к оксалоацетату, наиболее выраженное при повышении концентрации восстановленного кофактора от 25 до 50 мкмоль/л (значение увеличивается более чем в 4 раза).

Для матричной формы ЫАО-ИДГ в условиях гипоксии характерны: гиперболический тип кинетики, низкое значение Ушах, высокое сродство к субстрату и отсутствие способности ингибироваться высокими концентрациями ОАА.

3. Каталитические свойства малатдегидрогеназы в условиях острого гипоксического воздействия на фоне предварительного введения ДСИГГ

Активность и каталитические свойства малатдегидрогеназы в митохондриях и субмитохондриальных фракциях мозга крыс изучали при предварительном введении в условиях острой гипоксии пептида, индуцирующего дельта-сон. Как видно из таблицы 1, в общей митохондриальной фракции выявлено повышение активности НАО-МДГ по сравнению с интактными животными, что характерно также для условий гипоксического стресса. Во фракции митопласта предварительное введение ДСИП перед гипоксией удерживает активность фермента на нормальном уровне, предупреяздая развитие

гипоксических нарушений. Для ЫАО-МДГ, сохраняющей связь с митохондриальными мембранами после деструкции органелл гипотоническим воздействием, в данных экспериментальных условиях показано нарастание активности до значений, соответствующих активности фермента в условиях гипоксии.

Т.о. ДСИП, введенный перед гипоксией, оказывает неравнозначное действие на активность фермента в различных фракциях. Эффект пептида характеризуется протективным действием по отношению к растворимой форме ЫАБ-МДГ и отсутствием влияния на активность мембраносвязанного фермента. Увеличение

малатдегйдрогеназной активности в общей митохондриальной фракции может быть связано с повышением активности фермента во фракции митохондриальных мембран, которая, как было показано выше, вносит решающий вклад в общую активность митохондриальной ШШ-МДГ.

Результаты исследования особенностей кинетического поведения №Ш-МДГ в общей митохондриальной фракции в условиях предгипоксического введения ДСИП свидетельствуют об аномальном характере развития реакции окисления НАВН. Э-образная форма -зависимости У0 от концентрации ОАА установлена при всех концентрациях ЫАОН. Фермент в данных условиях способен эффективно регулироваться восстановленным кофактором (рис. 2) . Максимальная скорость реакции линейно нарастает во всем диапазоне концентраций восстановленного кофактора от 25 до 200 мкмоль/л. Существенные изменения затрагивают величину константы полунасыщения: удвоение концентрации ЫАИН в интервале 25-100 мкмоль/л ведет к 3-3,5 кратному снижению сродства фермента к субстрату - ОАА. При использовании высоких концентраций кофактора 100 и 200 мкмоль/л в данных экспериментальных условиях развивается эффект, подобный ингибированию ЫАО-МДГ высокими концентрациями оксалоацетата.

Математическое моделирование кинетики ферментативного действия позволяет дать характеристику каталитических свойств ЫАО-МДГ во фракции митохондриальных мембран при предварительным введением ДСИП перед гипоксическим воздействием. При всех концентрациях восстановленного кофактора установлена З-образная кинетическая аномалия на графике в прямых величинах и эффект по типу ингибирования №Ш-МДГ избытком субстрата - ОАА. Отмечается 4х кратное снижение сродства фермента к ОАА при увеличении

концентрации восстановленного кофактора от 25 до 50 мкмоль/л (рис. 3) . Значения максимальных скоростей реакции меняются незначительно.

При введении ДСИП на фоне острой гипоксии были изучены кинетические характеристики малатдегидрогеназной реакции во фракции митопласта при фиксированной концентрации НАШ 200 мкмоль/л. МАБ-МДГ митохондриального матрикса животных, получавших инъекцию ДСИП перед воздействием острой гипоксии, характеризуется классической кинетикой реакции окисления Ш1Ш, высоким сродством к оксалоацетату, низким значением максимальной скорости и отсутствием эффекта субстратного ингибирования.

4. Сравнительная характеристика каталитических свойств малатдегидрогеназы при изменении функционального состояния организма

Полученные результаты свидетельствуют об изменении в зависимости от функционального состояния характера регуляции восстановленным кофактором каталитических свойств ЫАВ-МДГ в общей митохондриальной фракции. Как видно на рис. 2, выявляется выраженная гипоксическая модификация зависимости величин кинетических констант малатдегидрогеназной реакции от концентрации 1Ш5Н. Это проявляется в увеличении максимальной скорости реакции, снижении сродства к субстрату и развитии при концентрациях КАБН 25 и 50 мкмоль/л эффекта, подобного субстратному торможению, что в норме отсутствует. Введение ДСИП до гипоксического стресса частично предупреждает развитие этих изменений: при низких концентрациях восстановленного кофактора кинетические константы и сохраняют нормальную величину,

а при максимальной фиксированной концентрации НАШ стабилизируются на промежуточном уровне. Элиминируется эффект, подобный субстратному торможению, при низких концентрациях ЫАШ.

На основании проведенного анализа можно сделать заключение о модификации регуляторного эффекта ЫАШ в результате изменения функционального состояния также по отношению к мембраносвязанной ЫАЛ-МДГ (рис. 3). Данная модификация затрагивает в основном зависимость максимальной скорости реакции от концентрации восстановленного кофактора. У интактных животных ЩС-МДГ величина

Ушах достигает предельных значений при концентрации ЫАБН 50 мкмоль/л. Такая же зависимость, но на более высоком уровне, установлена в экспериментах с предварительным введение ДСИП перед гипоксией. Острая гипоксия ведет к трансформации зависимости Ушах от концентрации ЛАБН в линейную, когда даже переход к максимальной фиксированной концентрации ШШН 200 мкмоль/л сопровождается значительным приростом максимальной скорости ферментагивной реакции.

Во фракции митохондриального матрикса, содержащей растворимую форму ИАО-ЩГ, значения кинетических констант в норме, при гипоксии и при введении ДСИП до гипоксического воздействия не изменяются.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о модификации каталитических свойств митохондриального изофермента НМ-МДГ при различных функциональных состояниях организма. Фермент общей митохондриальной фракции и фракции митохондриальных мембран значительно изменяет свои каталитические и регуляторные свойства под влиянием острой гипоксии. Предгипоксическое введение животным пептида, индуцирующего дельта-сон, в дозе 120 мкг/кг частично предупреждает развитие гипоксических изменений. Каталитические свойства ЛМЬЩГ при этом стабилизируются на ином, отличном от нормального, уровне.

Особенностью механизма регуляции КАБ-МДГ в митохондриях является зависимость свойств фермента от концентрации восстановленного кофактора, который является не только вторым субстратом, но также несет регуляторную функцию [Курганов, 1973] . Выявленная зависимость кинетических констант малатдегидрогеназной реакции от концентрации №ШН хорошо согласуется с данным положением. Острое изменение физиологических условий сопровождаются адаптивной перестройкой метаболизма. Адекватность метаболического ответа обеспечивается, в первую очередь, быстрыми механизмами регуляции ферментативной активности. Одним из таких механизмов может быть изменение каталитических свойств МАО-МДГ, контролируемое концентрацией ЫАШ.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что митохондрии мозга содержат растворимую, прочносвязанную с митохондриальной мембраной и адсорбированную на мембране формы ЫАО-зависимой малатдегидрогеназы. Соотношение активностей этих форм фермента в интактных митохондриях составляет 2:1:7.

2. При изучении каталитических свойств методами стационарной кинетики при нарастающих концентрациях ОАА и различных фиксированных концентрациях ШЭН установлены различия кинетических характеристик фермента в зависимости от внутримитохондриальной локализации. Для растворимой и прочносвязанной формы фермента установлен классический гиперболический тип кинетики, адсорбированная форма характеризуется аномальным типом кинетики.

3. Адсорбированная форма ЫА1)-МДГ, солюбилизируясь под действием фосфатного буфера, сохраняет Э-образную форму зависимости начальной скорости, реакции от концентрации ОАА и эффект по типу субстратного ингибирования. Продемонстрирована возможность утраты ферментом данных кинетических аномалий в результате замораживания-оттаивания фосфатного солюбилизата.

4. Для №Ш-МДГ в общей митохондриальной фракции, мембранной фракции и фосфатном солюбилизате установлена возможность модификации кинетических констант при изменении концентрации восстановленного кофактора. При изменении концентрации ЫАШ в интервале 25-200 мкмоль/л определены 3-5 кратное повышение Ушах и 3-8 кратное снижение сродства фермента к субстрату. В митохондриальной фракции и фосфатном солюбилизате повышение концентрации ИАОН до 100 мкмоль/л ведет к появлению эффекта субстратного ингибирования.

5. В условиях гипоксического стресса установлено повышение активности НАО-МДГ в митохондриях, митохондриальном матриксе и на мембранах. Происходит изменение характера зависимости каталитических свойств фермента от концентрации КАОН: снижается сродство фермента к ОАА в митохондриальной фракции, и трансформируется в линейную зависимость Ущах от концентрации ЫАОН

для NAD-МДГ, адсорбированной на мембране. Выявлено отсутствие изменений кинетических характеристик растворимой формы NAD-МДГ.

6. Предварительное введение пептида, индуцирующего дельта-сон, до гипоксического стресса удерживает активность растворимой формы NAD-МДГ на нормальном уровне, при сохранении повышенной активности адсорбированного фермента. Кинетические константы обратной малатдегидротеназной реакции во фракциях митохондрий и митохондриальных мембран стабилизируются на новом, промежуточном между нормой и условиями гипоксии, уровне. Характер регуляции каталитических свойств фермента восстановленным кофактором в митохондриях и на мембране сохраняет особенности, присущие интактным животным.

7. На основании полученных данных высказывается точка зрения, что реализация адсорбционных и ассоциативных взаимодействий определяет развитие аномальной кинетики обратной малатдегидрогеназной реакции и способность фермента к регуляции под действием NADH.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Гайнуллин М.Р., Фарафонов И.В., Гарсия А. Митохондриальная малатдегидрогеназа мозга при адаптации к кислородному голоданию // Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам среды: Тез. 6-й Ростовской обл. научно-практ. школы-семинара, г. Ростов-на-Дону, сентябрь 1990 г.Ростов-на-Дону, 1990.- т.2,- С. 4 - 5.

2.Гайнуллин М.Р., Фарафонов И.В., Гарсия А. Влияние гипоксической тренировки на регуляцию митохондриальной малатдегидрогеназы мозга II Физиология и биоэнергетика гипоксии: Тез. докл. Всесоюзн. совещан., г. Пущино, декабрь 1990 г.- Минск, 1990.- С. 44.

3.Khvatova Е.М., Garcia А., Semenova T.S., Zimin Y.V., Farafonov Y.V., Gaynullin M.R. Mitochondrial enzymes membrane regulation mechanism // Abstr. 15th Intern. Congr. of Biochemistry, Jerusalem, august 4-8, 1991.- Jerusalem, 1991,- P. 183.

4. Гарсия А., Хватова E.M., Гайнуллин М.Р., Фарафонов И.В. Механизм регуляции митохондриальной малатдегидрогеназы мозга

при ишемии / / Фармакологическая коррекция гипоксических состояний: Тез. в материалах 2-й Всесоюзн. конференции, г. Гродно, сентябрь 1991 г.- Гродно, 1991.- С. 49 - 50.

5. Гарсия А., Гайнуллин М.Р., Фарафонов И.В. Влияние нарушения гемодинамики мозга на каталитические свойства митохондриальной малатдегидрогеназы // Экспериментальные и клинические исследования молодых: Тез. докл. конференции молодых ученых НМИ им. С.М.Кирова / Под ред. Б.Е. Шахова, А.Г. Кочеткова.-Ншсний Новгород, 1991.- С. 16 - 17,

6. Гайнуллин М.Р., Фарафонов И.В. Изменение свойств ферментов энергетического обмена мозга при экспериментальном повышении устойчивости к гипоксии // Там же, С. 17 - 18.

7. Гарсия А., Хватова Е.М., Гайнуллин М.Р., Фарафонов И.В. Структурная организация ферментативной активности клеток мозга // Макро- и микроуровни организации мозга: Тез. в материалах симп., г. Москва, декабрь 1992.- М., 1992,- С. 44.

8. Гайнуллин М.Р., Ростов И.Л. Участие митохондриальной малатдегидрогеназы в регуляции метаболизма мозга в норме и при гипоксической патологии // Новые медицинские технологии: Тез. докл. первой сессии общего собрания ЕА АМН, г. Нижний Новгород, февраль 1994.- Нижний Новгород, 1994.- С. 45-46.

9. Гайнуллин М.Р., Ростов И.Л. Пептидная регуляция НАД-зависимой малатдегидрогеназы митохондрий мозга в норме и при гипоксическом стрессе // Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы: Тез. в материалах Российской научной конференции, г. Санкт-Петербург, март 1994 г.- СПб, 1994.- С. 28.

10. Хватова Е.М., Гайиуллин М.Р. Мембранный механизм регуляции митохондриальной малатдегидрогеназы пептидом, индуцирующим дельта-сон // Там же, С. 105.

11. Rubanova N.A., Yerlykina E.I., Gaynullin M.R. Neuropeptide regulation of the properties of the mitochondrial enzymes in the hypoxic stress condition // Physiological and biochemical basis of brain activity: Abstr. Intern. Symposium, St. Petersburg, june 22-24, 1994.- St. Petersburg, 1994.- P. 87.

12. Gaynullin M.R., Rostov I.L. Hypoxia-induced changes of rat brain mitochondrial malate dehydrogenase catalytic properties

// Abstr. 3rd Intern. Symposium on Hypoxia, Berlin, September 22-24, 1994.- Berlin, 1994,- P. 44a - 44b.

13. Khvatova E.M., Yerlykina E.I., Gaynullin M.R., Rostov I.L. The influence of structure-function relationship on the regulation of brain mitochondrial ezymes // J. Neurochem.-1994,- Vol. 63, suppl. 1.- P. S92.

14. Хватова E.M., Гайнуллин M.P., Михалева И.И. Влияние пептида, индуцирующего дельта-сон, на каталитические свойства митохондриальной малатдегидрогеназы мозга // Бклл. эксперим. биол. мед.- 1995.- т. CXIX, N'2.- С. 141-143.

15. Хватова Е.М., Ерлыкина Е.И., Гайнуллин М.Р. Адаптивный эффект пептида, индуцирующего дельта-сон, в регуляции мембранозависимых ферментов в мозге при стрессорном состоянии организма II Тез. симпозиума "Современные представления о структурно - функциональной организации мозга", г. Москва, март 1995 г.- М., 1995.- С. 119.

16. Хватова Е.М., Ерлыкина Е.И., Гайнуллин М.Р., Михалева И.И. Участие пептида дельта-сна в регуляции свойств митохондриальных ферментов при гипоксии мозга // Тез. докл. II Российск. национальн. конгресса "Человек и лекарство", г. Москва, апрель 1995 г.- М.: РЦ "Фармединфо", 1995.- С. 228.

17. Гайнуллин М.Р., Ростов И.Л. Свойства митохондриальной малатдегидрогеназы мозга в условиях введения пептида дельта-сна и кислородного голодания // Тез. X Всеросс. пленума правления общ-ва анестезиол. и реаниматол., г. Нижний Новгород, июнь 1995 г.- Нижний Новгород, 1995.- С. 91.

18. Gaynullin M.R., Rostov I.L. Delta-sleep inducing peptide (DSIP) regulates the submitochondrial localiEation and catalytic properties of brain malate dehydrogenase under hypoxia // Нейрохимия.- 1995,- т. 12, №2.- С. 64.

19. Khvatova E., Mikhaleva I., Gaynullin M. Brain metabolic adaptation to hypoxic stress / Abstracts, XI Meeting of the ESN, Groningen, The Netherlands, 15 - 20 June, 1996 // J. Neurochem.- 1996.- Vol. 66, suppl. 2,- P. S84.