Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитические процессы в мозге крыс при стрессе и адаптивном влиянии дельта-сон индуцирующего пептида

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолитические процессы в мозге крыс при стрессе и адаптивном влиянии дельта-сон индуцирующего пептида"

РГ6 од

] /5 1ц01кщййьрство науки. ВЫСШЕЙ. ШКОДН а технической политики российской федерации

ростовский ордена трудового красного знания!

' государственный университет

Специализированный! совет К 063.52.09 по биологических наукам

31а праВах рукописи

.ЛЫСЕНКО Алла Викторовна

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ СТРЕССЕ И

адоптивном влиянии ДЕЛьта-сон

ИНДИЦИРЫЮЩЕГО ПЕПТИДА

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наци

Ростов-на-Дону 1993

Работа шпсшюнв и лаборатории Физиологии и биохимии нейропептидов НИИ НЕЯРОКИБЕРНБШШ РГУ им. А.Б.Когана.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор

Менджерицкий A.M. (г. Ростов-на-Дону)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор

Т.Н.Погорелова (г. Ростов-на-Лону, НИИ акушерства и педиатрии);

доктор медицинских наук, профессор

Р.А.Грапезонцэва (г. Ростов-на-Лону, Ростовский медицинский институт)

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Институт мозга Российской АМН (г.Москва)

Защита состоится Л b июня 1993 года в чвоив нв заседании специализированного совета К 063.Б2.09 по биологическим наукам в Ростовском университете (344006, г. Ростов- на-Дону, ул. Большая Садовая, 105, РГУ, биолого-почвенный факультет, ауд. 304).

О диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГУ (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан мая 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

к

В.Н. КИРОЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность исследования.

Для понимания процессов формирования устойчивости организма к экстремальным воздействиям и развития адаптации к стрессорным раздражителям большое значение имеет изучение молекулярных механизмов действия эндогенных регуляторных пептидов. Эти соединения участвуют в регуляции практически всех функций организма, что объясняет существенный теоретический и практический интерес к этой проблеме. Эндогенная природа регуляторных пептидов открывает широкие возможности их практического применения в медицине для коррекции функциональных сдвигов в центральной нервной системе при действии экстремальных факторов среды и некоторых патологических состоящих (Ашмарив И.П., 1984).

Дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП) известен как достаточно мощный адаптоган, антистрессорный эффект которого установлен при эмоционально-болевых воздействиях., холодовом стрессе, гипокинезии, гипер- и гипоксии (Коплик Е.В. и др., 1982; Бонда-ренко Т.Н. и др., 1985; Мендаерицкий A.M. и др., 1988; 1992).

Кроме антистрессорных и адаптоганных свойств для ДСИП, как и дла других регуляторных пептидов, характерна полифункциональность и длительное по времени воздействие на организм (Graf U.V., Kastln А., 1969; Бондаренко Т.И. и др., 1986; Менджерицкий A.M. и др., 1990; Кураев Г.А. и др., 1991). Однако, механизмы проявления указанных эффектов являются предметом дискуссий. По современным представлениям эти особенности ДСИП связывают с его нейромодулирующим воздействием на синоптическую передачу. Проявление нейромодуляторных свойств ДСИП, наиболее эффективно реализующихся на фоне стрессорных состояний (Меерсон Ф.З., 1986), может быть связано со способностью образовывать рагуля-торные цепи и каскады, инициируя процессинг одних и деградацию других регуляторных пептидов путем активации ферментов, участвующих в реакциях ограниченного протеолиза (Ашмарин И.П., Каменская М.А., 1980).

В нашей работе в качестве экспериментального воздействия использована модель гипокинетического стресса. В последние года интенсивное изучение гипоютозии связано со снижением мылечной

активности человека в условиях автоматизации и механизации многих производственных процессов, с необходимостью при ряде заболеваний введения длительного постельного режима (Коваленко Е.А., Туровский H.H., 1980). Извэотно, что протеолитические ферменты принимают участие не только в реализации адаптационных реакций организма, но и в развитии стресс-индуцированных патологий (Панин Л.Е., Маянская H.H., 1987). Поэтому существенное значение приобретает поиск веществ, способных корректировать сдвиги в системах регуляции протеолитических процессов, возникающие при действии на организм экстремальных факторов.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение роли отдельных груш протеолитических ферментов в механизме действия ДСИП в норме и в условиях гипокинезии разной продолжительности у экспериментальных животных.

Для осуществления намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние ДСИП на интенсивность протеолитических процессов в -мозге через -различные сроки после его однократного внутрибршшнного введения в дозе 12 мкг/ 100 г. массы интактным кивотным и за I час до помещения крыс в гипокинетическую камеру.

2. Исследовать состояние синаптосомальных мембран и лизосом через различные сроки после однократной инъекции ДСИП, при гипокинезии и при гипокинезии . на фоне предварительного введения пептида, оценивая его го активности Сал+- зависимой нейтральной протеиназы типа I (КФ 3.4.22.17) и катепсина Д (КФ 3.4.23.5) соответственно.

3. В опытах In vitro определить влияние ДСИП на устойчивость лизосомалышх мембран к повреждающему воздействию возрастаниях концентраций водородных ионов в среде инкубации.

4. Изучить интенсивность протеолитических процессов, в том числе активность калликреина (НФ 3.4.4.21) и общую антитрипти-часкую активность сыворотки крови через различные сроки после введения ДСИП, при гипокинезии и при гипокинезии на фоне .предварительной инъекции пептида.

Научная новизна работы.

Впервые установлено, что однократная инъекция ДСИП

- Б -

интактным крысам приводит к длительному изменению активности протеолитических ферментов в широком диапазоне рН - от кислых до слабощелочных, что свидетельствует о хронобиологическом эффекте ДСИП. На примере Са2± независимых нейтральных эндопоптидаа ои-нвптосомалъной фракции головного мозга и квлликреина сыворотки крови продемонстрировано, что введение ДСИП активирует процессы ограниченного протеолиза, что может вносить свой вклад путем изменения нвОора и "активной" концентрации регуляторных пептидов и пептидных гормонов в созданиэ состояния првадаптации.

В работе впервые показано, что введение ДСИП приводит к перераспределению активности мевду Са3+-зависимыми и Са -независимыми нейтральными вндопептидазами , ассоциированными с мембранами синаптосом, что особенно выракено при гипокинезии. Существенное снижение активности Са2+- активируемой нейтральной протеиназы I может быть одним из механизмов реализации модулирующего действия ДСИП , проявляющегося в регуляции количества рецепторов глутамата и ограничении эффекта этого возбун-дагацего нейромедаатора при стресса.

Показано, что предварительное введение ДСИП предотвращает нарушение проницаемости лизосомальных мембран, наблюдаемое при длительной 24-часовой гипокинезии. В опытах In vitro продемонстрирована способность ДСИП непосредственно воздействовать на мембраны лизосом, что ограничивает выход кислых протеинез в ци-тозоль, препятствуя развитию характерного для длительного и интенсивного стресса цепного цитолитического процесса, ведущего к повреждению тканей.

Полученные результаты свидетельствуют, что введение ДСИП перед гипокинезией корректирует развитие изменений активности протеолитических ферментов, характерных для данного стрессорного воздействия.

Ооновные положения,винооиные на защиту :

1. ДСИП проявляет хронобиологический эффект относительно интенсивности протеолитических процессов в мозге и сыворотке крови и является метаболическим модулятором, вызывая ускорение кругооборота белков без смещения обмена в сторону катаболизма.

2. Протеолитичвские фермента участвуют в модуляции

дельта-оон индуцирующим пептидом синапгической передачи:

- ДСИП вызывает кратковременную (2-7 часов) активацию -Са<,+-зависимой нейтральной протеиназы типа I, что сопровождается длительным изменением способности постсинаптпческой мембраны к передаче сигналов;

- существенное снижение активности Са^"1"- зависимой нейтральной протеиназы типа I, в наибольшей степени развивающееся при гипокинезии на фоне введения ДСИП может быть одним из механизмов реализации модуляторного действия изучаемого пептида, проявляющегося в регуляции количества рецепторов глутамата.

3.Введение ДСИП приводит к длительному и интенсивному увеличению активности Са - независимых нейтральных эндопептидаз синаптической фракции головного мозга, участвующих в процессинге и инактивации регуляторных пептидов, функционирующих как нейро-медааторы и нейромодуляторы;

4. Предварительное введение ДСИП ограничивает нарушение си-наптических структур и развитие сдвигов в активности протеолити-ческих ферментов при гипокинезии, способствует стабилизации ли-зосомальных мембран.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные в работе данные представляют существенный интерес для понимания механизмов модулирующего действия ДСИП на си-наптическую передачу и роли протеолитических ферментов в этом процессе. Результаты настоящего исследования указывают на то, что изменение активности протеолитических ферментов, наблюдаемое в определенные сроки после введения ДСИП способствует созданию состояния прэадаптации.

Выполненная работа расширяет представления о нейрохимических изменениях, происходящих в мозге животных при гипокинетическом стрессе различной продолжительности. Наибольшую практическую ценность представляют результаты, свидетельствующие о протекторном действии ДСИП при гипокинетическом стрессе, проявляющемся в ограничении развития сдвигов в активности протеолитических ферментов и проницаемости лизосомальных мембран , в стабилизации функционального состояния синаптосомальных структур.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на Рабочем совещании по

нейродаптидам (Ростов-на-Дону, 1991 г.). на X Меадународной конференции по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, 1992 г.), на Симпозиуме стран СНГ "Макро- и микроуровот организации мозга" (Москва, 1992 г.), на конференции молодых ученых РТУ (Ростов-на-Дону, 1993 г.), на заседании Ростовского отделения Российского биохимического общества (Ростов-на-Дону, 1993 г.).

Публикация результатов исследования.

По теме диссертации опубликовано Б работ, 3 работы находятся в печати.

Объеи работы.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания постановки эксперимента и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа содержит КЗ таблиц и J? рисунков. В списке литературы приведено источников, из них /Л?иностранных автров.

ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА И ИКТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Опыты проводили на половозрелых белых крысах обоэго пола массой 160-200 г. Исследовала 4 группы животных:

1. Иитактные животные.

2. Жичотные, которым внутрибршинш вводили ДСИП в дозе 12 мкг/ 100 г массы. Влияние ДСИП на интенсивность протеолитических процессов изучали через I, 2, 7, 24 часа, 3 и 14 суток посла инъекции пептида.

3. Животные, которых подвергали действию I-, 6- и 24-чаоовоЙ гипокинезии.

4. Животные, которым за I час до I-, 6- и 24-часовой гипокинезии внутрийршинно вводили ДСИП.

Был использован ДСИП, синтезированный в лаборатории Химии пептидов в.н.с. И.И.Михалевой в Институте биоорганической химии им. Шемякина М.М. РАН, г.Москва (зав. лаЗ., дир.ин-та акад. В.Т.Иванов).

В качестве модели стрессорного воздействия использовали гипокинезию, помещая животных в пластиковые камеры, резко огро-

- а -

ничивапцие подвижность (Федоров И.В., 1982).

Животных декелитировали в зависимости от постановки опыта сразу после воздействия гипокинезии или через указанные интервалы времени после инъекции ДСИП. Влияние описанных факторов изучалось в головном мозге крыс в опытах In vivo и In vitro, в субклеточных фракциях и сывортке крови.

Определяли суммарную активность нейтральных протеиназ в го-могенате мозга и сыворотке крови с протаминсульфатом в качестве субстрата (Велик Я.В. и др., 1968) по приросту аргинина спектро-фотометрическим методом после окраски по Оакагучи (Веремеенко К.И., Погорелова Л.М., 1973). Общую, Са2+- независимую вндо-пеотвдазную активность и активность Са2+-активируемой нейтральной протеиназы типа I определяли по методу Baudry M.et.al.(1981) в синаптосомальной фракции мозга крыс, полученной методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (по de Robert la, 19Т1).

Общую, в присутствии 0,1" Тритона Х-100, (А) и свободную (Б) активность катепсина D определяли соответственно во фракции мозга, обогащенной лизосомами и постлизосомальном супернатанте (субстрат-бычий гемоглобин) при рН=3,2 по приросту вминоазота (Barret A.J., 1972).

Наряду с суммарной активностью нейтральных протеиназ в сыворотке крови определяли активность калликреина (Пасхина Т.О., Крин-ская A.B., .1977) и общую антитриптическую активность (Нартико-ва В.Ф., Пасхина Т.О., 1977).

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Шовене (Кокунин, 197Б) и t-критерия Стыодента. (Владимирский Б.М., 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние ДСИП на интенсивность протеолитических процессов в мозге и сыворотке крови шггактных животных.

Полученные нами значения активности исследуемых ферментов для контрольной группы животных соответствуют данным литературы (Палладии A.B. и др., 1972; Веремеенко К.Н., 1985; Могильшщкая Л.В.и др., 1987).

Активность нейтральных протеиназ в мозге и сыворотке крови крыс через различные сроки пооле введения ДОИП.

Нами установлена способность ДСИП в течение длительного времени (3 суток пооле введении интактным кивогным ) изменять суммарную (вкзо- и андопептидвзную) активность нейтральных про-таминрасщеплятеих протеиназ (НПП) в мозге и сыворотке крови крыс. Так, суммарная активность ИЛИ через 7 часов посла введения ДСИП превышала контрольные величины на 38% (р<0,02) я 110% (р<0,05) в мозга и сыворотке крови соответственно. Через 3 суток после введения ДСИП активность НПП в целом мозге продолжала возрастать и становилась на 292% больше, чем у интактшх животных (р<0,001). Интересно, что наблюдаемое повышение активности НПП не сопровождалось изменением содержания общего белка (таблица I). Это .вероятно, отражает ускорение кругооборота белков без смещения обмена в сторону катаболизма.

Наш результаты соответствуют полученным рвнее при исследовании ультраструкгуры сенсомоторной коры данным об активации ядерного и белоксинтезирующего аппарата нейронов спустя 3, 4 и 24 часа после внутрибршинного введения ДСИП (Кураев Г.А. и др., 1991; Мендкерицкий A.M. и др., 1Э92).

Для изучения интенсивности протеолитичоских процессов в синаптосомальном компартменте мосга посла гогьекцни ДСИП исследовали активность нейтральных протеиназ, ассоциированных о фракцией синаптосом.

Показвно, что изменение общей (Са2+-зависимой й Са2+- независимой) активности в синаптосомах имели более выраженный характер и начинались на 5 часов раньше по сравнению о изменением суммарной активности нейтральных протеиназ в общем гомогенате мозга крыс (РисЛ).

Гак, в синаптосомальной фракции общая активпость нейтральных эндопептидаз через 2 и 24 часа превышала уровень контроля соответственно на 151% и 168%. Большая выракенность изменений в синаптосомальной фракции, по-видимому, свидетельствует об участии протеолитических процессов в реализации модулирующего влияния ДСИП не только на общую метаболическую активность мозга, а в первую очередь на специфические функции нейрона, связанные с си-наптической передачей.

Таблица I.

Влияние ДСИП на суммарную активность нейтральных протеиназ (НПП; Ы-m, мкмоль аргинина/ ТОО кг белка за I час) в содержание белка в общем гомогенате мозга (1Йп, мг балка/г скрой ткани) и сыворотке крови крыс (мг белка/мл сыворотки); п=7-15.

Содержание белка Активность нейтральных протеиназ

Условия ошта

мозг сыворотка крови мозг сыворотка крови

Контроль 110,0 £ 0,6 54,30 £ 0.55 13.02 - 0.48 5.94 - 0.78

ДСИП I час 90,0 ± 0.4 50.80 - 0.84 13.56 - 1.41 6.93 ~ 0.51

р>0.1 р>0.1 р>0.1 0,05<р<0,1

ДСИП 2 часа 116.3 ± 0.5 52.41 ± 0.69 13.51 - 1.67 8,37 - 1,24

р>0.1 р>0,1 р>0,1 0,05<р<0,1

ДСИП 7 часов 86.2 ± 0.4 49,70 ± 2.75 17,99 ± 1,66 12,48 - 1,7С!

0,05<р<0.1 р>0,1 р<0,2 р<0,001

ДСИП 24 часа 128.8 ± 0.5 54,15 ± 0,28 15,27 ± 0.68 18,47 - 1,68

р>0.1 р>0,1 0,05<р<0,1 р<0,001

ДСИП 72 часа 132,5 ± 0,6 63,65 ± 1,10 51,06 ± 1,53 15,47 - 1,29

0,05<р<0,1 р>0,1 р<0,001 р<0,001

п- количество навотных в опыте

Рис

М 1

В]

юз

I. Изменение активности нейтральных протеиназ в общем гомо-генате мозга и синаптосомальной фракции через различные сроки после введения ДСИП интактным животным, (в Ж к контролю)

lfii

ilüüL

"1 4

Ж

ЕЗ-

эз

[771- активность нейтралышх эндопептидаз, синаптосомы |—)- активность НПП, общий гомогенат

Л

а

1 час 2 часа 7 часов 24 часа 72 часа 14 суток

время после инъекции

Действительно, нами установлено, что однократное внутрибрю-шинное введение ДСИП приводит к длительному и интенсивному увеличению активности Са"1'1'- независимых нейтральных вндопептидаз синаптической фракции головного мозга (Рис.2), по данным литературы вносящих большой вклад в процессинг и инактивацию регуля-торных пептидов, функционирующих как нейромедиаторы и нейромоду-ляторы (Азарян A.B., 198Э). Более того, обнаруженное нами увеличение активности Са~ч- зависимой нейтральной протеиназы типа I через 2 и 7 часов после инъекции ДСИП может свидетельствовать о его' влиянии на распространение потенциала действия по электровозбудамой мембране. Такое предположение основано на имеющихся в литература сведениях о длительных изменениях способности постсинаптических мембран к передаче сигналов, опосредуемых необратимым расщеплением пептидных связей основного компонента синаптосомальшх мембран - фодрина при кратковременной ак-

Рис.2. Влияние ДСИП, гипокинезии и гипокинезии на фонэ введения ДСйП на активность Са2+- независимы! нейтральных эндопептидаз (¡77]) и активность зависимой нейтральной протеиназы типа I

(I—|) во фракции синаптосом головного мозга крыс.

мкМоль тирозина/100 мг белка за I час

Г

ЯЭ5

контроль 1 час ' 2 часа ? часов

24

часа

м

I

стресс 24 ч

Условия опыта

ДСИП+ стресс 24 часа

тиващш Са - зависимой нейтральной ггротеинозы типа I (Siman R. et. al., 1985).

Однако, через I и 3 суток нами обнаружена тенденция к сни-кению активности Со~ -зависимой нейтральной протеинвзы типа I в синаптосомах мозга интактннх животных на 22% и 28% соответственно. Сопоставляя полученные нами результаты с данными литературы об участии СаЛ+- зависимой протеиназы типа 3 в регуляции количества рецепторов глутамага, можно предположить способность ДСИП ограничивать "демаскировку" глутэмагных рецепторов и проявление эффектов глутаминовой кислоты как возбузвдающего нейроме-диатора. Наш результаты соответствуют полученным ранее данным о снижении содержания возбуждающих нейротрансмиттеров и преобладании тормозных процессов в головном мозге крыс после введения ДСИП (Мендкерицкий A.M. и др., 1988).

Влияние ДСИП на активность катепсина Д в мозге кгыс.

Установлено, что инъекция ДСШ интактным животным оказывает пролонгированное действие на активность катепсина Д во фракции, обогащенной лизосомами и постлизосомалыюм супорнатанте (Рис.3).

Рис.3. Общая и свободная активность катепсина Д в головном мозге крыс при введении ДСШ интактным животным.

Увеличение на 154% активности катепсина D во фракции, обогащенной лизосомами обнаружено через 2 часа, затем к 7 часам наблюдалась тенденция к снижению данного показателя до контрольных величин и сохранение его на этом уровне через 24 и 72 час^ после введения пептида. Влияние ДСИП на свободную активность катепсина Б проявлялось в более поздние сроки (через 7 часов +38Ж), но сохранялось длительное время (3 суток) и не было связано с нарушением проницаемости лизосомальной мембраны, поскольку в данный период времени соотношение А/Б не отличалось от. контрольных величин.

Полученные результаты свидетельствуют о вкладе лизосомаль-ных лротеиназ, в частности катепсина Д, в интенсификацию метаболизма белков и проявление полифункционального и долговременного влияния ДСИП на организм , поскольку все больше накапливается экспериментальных данных об участии этих ферментов- в образовании регуляторных пептидов и пептидных гормонов из проформ (Hales.С., 1978; Матка N. et.al., 1980).

Влияние ■ ДСШ1 на активность калликреина и общую антитриптическую активность сыворотки крови интактных крыс-

Обнаружено достоверное возрастание активности калликреина,

начинавшееся через 7 часов и сохраняющееся в течение 3 суток

после однократного введения ДСИП (Рис.4), что, наряду е актива-2+

цией Св -иевавиоимых нейтральных вндопептидаз ошшптической фракции головного мозга, является убедительным доказательством инициации процессов ограниченного протеолиза после однократного внутрибрюшинного введения ДСИП.

Следствием активации калликреина может быть образование в крови свободного Срадикшшна, что, в свою очередь приведет к изменению сосудистой и клеточной проницаемости-. Более того, существуют данные литературы, согласно которым возрастание активности калликреина считают одной из1 причи» увеличения проницаемости гемато-анцефалического барьера (ГЭБ) (Гомазков O.A., 1982), что может способствовать проникновению периферически введенного ДСИП через ГЭБ и проявлению его аффектов в головном мозге.

Известно, что ингибиторами калликреина сыворотки крови являются ctj- антитрипсин, а^-макроглобулин и антитромбин - основные компоненты антитриптичаской системы крови (Логинов A.C.,

1982).

Нами установлено, что общая антитриптическая активность сыворотки крови нэ изменялась во все исследовонпые сроки после однократной инъекции ДСИП интактннм животным. В связи с этим мокно предположить, что модулирующее влияние ДСИП на активность калликреина сыворотки крови осуществляется не через систему ингибиторов, а путем активации системы свертывания крови. Такое предположение основано на имеющихся в литература сведениях об образовании калликреина из профермента при активирующем влиянии фактора Хагемана (Веремеенко К.Н., 1977).

Рис.4, Общая антитриптическая активность и активность калликреина в сыворотке крови крыс после однократной инъекции ДСИП.

% к контролю

+100--

+ Б0--

%

■а

л

Ф

л»

№

& &

7 часов

7Л

н

- активность калликреина

¡77] - общая антитриптическая активность

24 часа 72 часа ЕР9МЯ поолэ инъекции

Влияние ДСИП на интенсивность протеолнтическнх процессов при гипокинетической стрессе.

Влияние гипокинезии разной продолжительности на ективность протеолитических ферментов мозга и сыворотки крови носило разнонаправленный, фазный характер, что, возможно отражает волнообразную перестройку организма на новый уровень функционирования и переход меаду способами срочной и долговременной адаптации.

Так, 1-часовая гипокинезия увеличивала активность нейтральных прэтеиназ в общем гомогзната мозга на 20% и активность катепсина Д во фракции, обогащенной лизосомвми на 40Ж. Известно, что рао-пад белка в течение определенного времени может служить дополнительным источником энергии, регулируя тканевой уровень свободных аминокислот, вовлекающихся в глюконеогенез, либо в реакции паре-амннирозания с после дущим включением в цикл трикарбонових кислот (Писаренко, 1987). Кроме того, активация катаболических процессов на стадии тревоги связана с элиминацией повревденша белков и цитоотруктур в результате увеличения концентрации проокси-дантов (Bannister J. et.al., 1982; Владимиров D.A., 1987). В связи о втим наблюдаемые изменения активности протеолитических ферментов можно считать проявлением включения механизмов срочной адаптации.

Увеличение времени страссорного воздействия до 6 часов приводит к незначительному, но достоверному снижению активности нейтральных протекназ в общем гомогенате мозга. В состав данной группы входит большое количество мембранносвязанных ферментов. Согласно денным литературы при стрессе накопление продуктов ПОЛ оказывает повреждающее воздействие на мембраны (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.I 1976), что существенно ингибирует мембраяносвязан-яые ферменты и может свидетельствовать об истощении их энергети-часкнх и метаболических компенсаторных возможностей.

Вторая волна активации нейтральных протеиназ в общем гомогенате мозга при 24-часовой гипокинезии (+133% по сравнению с контрольным уровнем), вероятно связана со сдвигом обмена белка в сторону катаболизма.

Анализируя динамику изменения активности катепсина Д (Рис.Б), необходимо отметить ее зависимость от длительности стрвссорного воздействия и парораспределение активности из фракции лизосом в цитоплазму, особенно выраженное при 24-часовой гипокинезии. Снижение соотношения общей к свободной активности катепсина Д указывает на нарушение проницаемости и повреждение ли-зосомальных мембран при данном воздействии. Согласно данным литератур!, выход протеолитических ферментов во внелизосомальное пространство может индуцировать цитолитический процесс и деструкцию тканей, поскольку эндогенных ингибиторов аспартильных протеиназ ае обнаружено (Tang J., Wong В.. 1967). Определенный

вклад в деструкцию цитоскелэта нейронов и нарушение отруктуры синаптических мембран вносит установленное нами увеличение активности Са2+- активируемой нейтральной протеиназы типа I во фракции синаптосом на 104% при 24-часовой гипокинезии.

Таким образом, выявленное в наших опытах изменение интенсивности протеолитичесюл процессов особенно при длительной 24-часовой гипокинезии наряду о тенденцией к достоверному уменьшению количества белка в общем гомогенате мозга свидетельствует о сдвиге белкового обмена в сторону катаболизма.

Рис.5. Влияние ДСИП на активность прогеолитнческих ферментов

в мозге крыс при гипокинезии.

[Щ-стреоо лизоссмн: Щ-стресо; 0 -ДСИП+отреоо

Щ-ДСШ+стресс супврнатаяг: В-стресс; И -ДСИП+отреоо

Предварительное за I час до стрессорного воздействия введение ДСИП в дозе 12 мкг/100 г массы влияло на развитие сдвигов в активности прогеолитичэских ферментов при гипокинезии.

Влияние ДСИП на суммарную активность нейтральных протеиназ в общем гомогенате мозга при гипокинезии различной продолжительности носило разнонаправленный характер. При 1-часовой гипокинезии ДСИП обеспечивал еще более выраженное (на 26%) по сравнению с чистым стрессом поЕшеняе активности данной группы ферментов, способствуя энергообеспечению адаптационных реакций. При 6- и

- ia -

24-часовой гипокинезии действие ДСИП было направлено на компенсацию вызванного стрессом изменения суммарной активности нейтральных протеиназ, что при 24-часовом воздействии имело защитный характер, способствуя восстановлению равновесия между анаболическими и катаболическими процессами.

Определенный вклад в реализацию антистрессорного эффекта вносит регуляция дельта-сон индуцирующим пептидом активности ка-тапсина D.

Наш установлено, что ДСИП влияет на распределение катепси-на D между лизосомальной и надосадочной фракциями в мозге подвергнутых воздействию гипокинезии кивотных. к нормализация отношения активности катепсина D во фракции лизосом к активности в постлизосомальном супернатанте по сравнению со сниженными значениями данного показателя при I- и 24- часовом стрессе свидетельствует о способности ДСИП предотвращать нарушение проницаемости лизосомалышх мембран, наблюдаемое при длительной гипокинезии. Ранее в нашей лаборатории показано предотвращение дельта-сон индуцирующим пептидом накопления конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) при стрессе (Чораян И.О., Ускова Н.И., 1988). Вероятно, именно через торможение ПОЛ ДСИП опосредованно влияет на проницаемость лизосомальных мембран.

Для выяснения возможности прямого влияния ДСИП на состояние мембран мы изучали распределение активности катепсина Д между лизосомальной и надосадочной фракциями при возрастающих концентрациях водородных ионов в среде инкубации In vitro. Показано, что добавленный в среду инкубвции с рН от 7,0 до 6,0 через 20 минут посла начала инкубации обогащенной лизосомами фракции ДСИП увеличивал соотношение А/Б по сравнению с резко сниженными значениями этого соотношения при инкубации без добавления пептида, как в опытах с лизосомами из мозга интактных, так и подвергнутых воздействию 24-часового стресса животных (Рис.6). Интересно, что защитное действие ДСИП In. vitro проявлялось наиболее эффективно при инкубации с лизосомами, которые были менее устойчивы к действию повреждающего фактора (при рН=6,4-6,0).

Адаптивный характер, по нашему мнению, носит наблюдаемое перераспределение активности между Са*"4- независимыми и Св2+-активируешми нейтральными протеиназами во фракции синаптосом при введении ДСИП за I час до гипокинетического воздействия.

Рис.6. Влияние ДСИП на устойчивость лизосомальных мембран по отношению к, иаменвшио рН среды

In vitro (изменение активности катепсяна D в % к контролю).

+120

лизосомы интактннх уивотшх J. 12 3 4

+20+ е

jsn

115

- 20'

- 40-- GO - -

- 80-100 4-

I

31

ТЕ

29

I

29

лизосомы после 24-часового стресса

100Ж

68

(контроль)

супернатант после инкубации лизосом интактных животных

240

1- рН=?,4

2- рН=7,О

3- рН=6,4

4- рН=6,0

+ 200

40--

перенесших 24-часовой стресс 214

170

106

109

74

127

О -инкубация без ДСИП

m-внесение ДСИП в среду через 20 после начала инкубации

100%

(контроль)

Iо

I

Преобладание активации Саг+- независимых протеиназ, регулирувдих "активную" концентрацию таких регуяторных пептидов как вещество Р, енкефалины, нейротензин, данорфин и др. может обеспечивать быстрый физиологический ответ организма нв меняющиеся условия при воздействии экстремальных факторов среда. Снижение активности Св2+- зависимой нейтральной протеиназы типа I при введении ДСИП на фоне гипокинезии, может носить адаптивный характер и быть одним из механизмов реализации модуляторного действия пептида . Такое предположение основывается на данных литературы о способности Са - активируемой нейтральной протеиназы I участвовать в регуляции количества рецепторов глутамата и ограничении эффекта этого возбуждающего нэйромедивтора при стрессе (Boudry М., Lynch G,, 1980).

Таким образом, нами показано, что введение ДСИП в норме и в условиях гшокиневии приводит к изменению активнооти двух тесно связанных мевду собой типов протеолитических ферментов, участвующих как в полной деградации белковых молекул, так и в процессах ограниченного протеолиза.

Изменение интенсивности протеолитических процессов при введении изучаемого пептида является неотъемлимой частью механизма ¿«алогического действия ДСИП и мокет объяснять разнообразие и длительное проявление его аффектов (Рис.7).

Рис.7.

Введение ДСИП в

изменение активности

суммарного катаболизма -

регуляция скорости кругооборота балка

I

элиминация дефектных и образующихся в результате развития отреоо-реакции белковЦ о поврежденной структурой

защита тканей от деструктивных изменений

но]эме и при стрессе

протеолитических ферментов i

-органиченного^протеолиза

активация квсквдных процессов

- образования регуляторных пептидов и пептидных гормонов;

- овертывания крови;

- управления кровяным давлением;

системы комплемента

J

участив в модуляции синапти-ческой передачи через регуляцию числа рецепторов глутаминовой кислоты_

ВЫВОДЫ

1. Введение ДСИП интактным крысам приводит к длительной (до 3 суток) активации в мозге протеолитических ферментов в широком диапазоне рН: от нейтральных и слабощелочных - протаминрасщеп-лящие .нейтральные протеинезы и Са2+-зависимые и Са2+- независимые нейтральные протеиназы, до кислых - катепсин Д, при отсутствии изменений в содержании белка в ткани мозга.

2. Направленность изменений активности нейтральных про-таминрасщепляющих протеиназ в мозге при гипокинезии зависит от продолжительности воздействия: наблюдается увеличение активности при I- и 24-часовой гипокинезии и снижение - при 6-часовой. Предварительное введение ДСИП приводит к более выраженной вкти-вации НПП при 1-чвсовой гипокинезии, а при 5- и 24- часовом воздействии носит компенсаторный характер.

3. Длительная гипокинезия (24 часа) сопровождается существенной активацией Са^- зависимой нейтральной протеиназы типа I при незначительных изменениях активности Са^+- независимых

нейтральных протеиназ. Введение ДСИП за I час до начала воздей-

2+

ствия способствует активации Са - независимых нейтральных

?+

протеиназ и ингийироввнию активности Са - зависимой нейтральной протеиназы типа I.

4. Развитие гипокинезии в те юние 6 часов сопровождается повышением, а к 24 часам ингибированием активности катепсина Д

в лизосомальной фракциях. При введении

ДСИП, предшествующем гипокинезии, наблюдается изменение соотношения связанной с лизосомами и свободной активности катепсина Д, свидетельствующее о стабилизации лизосомальных мембран.

5. 1п У1ги), внесенный в буфер с рН=7,0-6,0 через 20 минут после начала инкубации лизоссм, выделенных из мозга интактных и подвергнутых гипокинезии животных, ДСИП ограничивал выход катепсина Д в супернатант.

6. Модуляция дельта-сон индуцирующим пептидом интенсивности протеолитических процессов в мозге, особенно очевидная а условиях стрессорного воздействия, свидетельствует о возможном участии протеолитических ферментов в проявлении регуляторных и адаптивных свойств ДСИП.

7. На основании полученных результатов можно рекомендовать

ДСИП в качестве препарата, корректирующего сдвиги активности

протеолитических ферментов в мозге при стрессе, вызванном

гипокинезией.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Лысенко А.В., Мендаерицкий A.M. Регуляция протеолитических процессов дельта-сон индуцирующим пептидом при стрессе.// СО. Проблемы нейрокибериетики.- Ростов-на-Дону, 1992.- С.

2. Мендкарицкий A.M., Лысенко А.В., Михалева И.И. Влияние дельта-сон индуцирующего пептида на активнооть протеолитических процессов в мозге крыс при гипокинезии.//Укр. биохим. курн.- 1992.- Т.64. JS6.- С.37-42.

3. Менджэрицкий A.M., Лысенко А.В.,.Ускова Н.И., Михалева И.И. Дельта-сон индуцирующий пептид и регуляция нейромедиаторными аминокислотами интеноивнооти протеолитичеоких процессов при стрессе.// Сб."Макро- и микроуровни организации мозга в норме и при патологии".- Москва,1992.- С.98.

4. bysenko A.V., Mickhaleva I.I., Frudchenko I.A. The Influence of some DSIP analogues upon total activity of neutral peptidhydrolases In the rat brain and blood эегш> in normal end hypokinetic conditions//in the book "Delta-sleep Inducing peptide." Theoretical end applied aapecta,"- Roatov-on-Don-1992.- P.15.

6. Lyaenko A.V., Mendzheritsky A.M. Effects of deltsVsleep inducing peptide on activity of proteolytic processes In the rat brain under hypokinetic conditions//in the book "Delta-Bleep inducing peptide. Theoretical and applied aapecta." -Rostov-on-Don- 1992,- P.16.