Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Усовершенствование методов получения туберкулезного анатоксина и повышение эффективности канамицина

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование методов получения туберкулезного анатоксина и повышение эффективности канамицина"

На правах рукописи

005044241

СМИРНОВ ИГОРЬ ИВАНОВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ

ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА И ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ КАНАМИЦИНА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 7 МАЙ 2012

Курск-2012

005044241

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Евглевский Анатолий Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Мищенко Владимир Александрович зав. отд. болезней рогатого скота ФГУ «Федеральный центр охраны животных», г. Владимир

кандидат ветеринарных наук, Шевцов Илларион Андреевич руководитель ГБУ «Курская городская станция по борьбе с болезнями животных», г. Курск

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт патологии, фармакологии и терапии» РАСХН, г.Воронеж

Защита диссертации состоится «07» июня 2012 в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.220.040.03 при ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» по адресу: 305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70 КГСХА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова»

Автореферат разослан « » апреля 2012г.

Ученый секретарь ¿^Г?

диссертационного совета _ Г.Ф. Рыжкова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие эпизоотического процесса при туберкулезе у животных в определенной степени связано с эпидемическим процессом у человека и наоборот, так как не вакцинированные животные, не обладая достаточным иммунитетом, будут заражаться и создавать резервуар возбудителя (Биргер М.0.1982; Донченко A.C. 1997; Ридер Г.Л. 2001).

Наличие более 50 видов микобактерий, сложность строения, резкое повышение устойчивости к средствам химико- и антибиотикотерапии представляют серьезную медико-ветеринарную и социальную проблему (Беляков В.Д. 1998; Данилевская Н.В. 2005; Коротяев А.И. 1998).

Использование вакцины БЦЖ, туберкулезного аллергена (туберкулина токсино-аллергена), адьюванта Фрейнда экспериментальных ДНК -вакцин, анатоксинов и антибиотикотерапия не решили проблему эффективности профилактических, диагностических и лечебных мероприятий в борьбе с туберкулезом (Бектемиров Т.А. 2007; Леви Д.Т. 1999).

Актуальными проблемами остаются совершенствование средств и способов аллергодиагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота, повышения эффективности и снижения токсичности антибиотиков (Никитин A.B. 2009; Сорокин Г.В. 2008; Федоров Ю.Н. 2005).

Вышеизложенное определило выбор темы, цель и задачи исследований.

Цель работы: Целью работы явилось усовершенствование синтетической питательной среды для выращивания свежевыделенных микобактерий туберкулеза бычьего вида для получения нативного туберкулина и токсино-аллергенов, изыскание биологической модели аллергии и повышения эффективности туберкулезного анатоксина и канамицина.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

1. Усовершенствование жидкой и плотной синтетической питательной среды для выращивания, выделения микобактерий туберкулеза и получение токсино-аллергенов;

2. Создание способа безопасной биологической модели аллергии туберкулёза, путём сенсибилизации морских свинок и сельскохозяйственных животных убитыми микобактериями туберкулёза, для изучения процесса детоксикации и инактивации токсина аллергена и проявление аллергических реакций;

3. Усовершенствование средств и способа детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов и модификации канамицина;

4. Изучение протективных, иммуногенных свойств полученного туберкулезного анатоксина, а также лечебной и бактерицидной эффективности модифицированного канамицина.

Научная новизна. Детоксикации, полимеризация и инактивация туберкулезных молекулярных токсино-аллергенов позволило получить анатоксин, обладающий протективными и иммуногенными свойствами. Установлено, что иммунизация кроликов туберкулезным анатоксином вызывает образование в сыворотке крови аллергеннейтрализующие и преципи-тирующие антитела, которые могут быть использованы в качестве новых диагностических тестов.

Модификация канамицина по способу получения туберкулезного анатоксина повысило бактерицидную активность и лечебную эффективность препарата в отношении канамициноустойчивых микобактерий туберкулеза бычьего вида при утрате токсичности.

Полученные результаты при детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов, модификация канамицина по принципу получения анатоксинов, выявление в сыворотке крови кроликов иммунизированных туберкулезным анатоксином преципитирующих и аллерген-нейтрализующих антител, получение биологической модели аллергии к туберкулину являются приоритетными.

Теоретическая и практическая значимость работы. Иммуногенные протективные свойства туберкулезного анатоксина могут составить основу специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.

Разработанный и апробированный способ сенсибилизации морских свинок и сельскохозяйственных животных суспензией из автоклавиро-ванных микобактерий туберкулеза позволяет использование в качестве безопасной биологической модели аллергии для изучения аллергической реакции, динамики детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов при изготовлении туберкулезного анатоксина.

Установленное образование у вакцинированных кроликов туберкулезным анатоксином преципитирующих и аллергеннейтрализующих антител создают возможность использование новых диагностических проб при диагностике туберкулеза у животных.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Усовершенствование жидкой и плотной с агаром синтетической среды для выращивания и выделения микобактерий туберкулеза.

2. Сравнительная оценка разных методов деструкции микобактерий туберкулеза для получения растворимых токсино-аллергенов.

3. Результаты сенсибилизации морских свинок и температурного воздействия на проявление реакции кожи на токсино-аллергены.

4. Результаты редуцирующего и инактивирующего действия формальдегида на туберкулезные токсино-аллергены и получение анатоксина.

5. Результаты усовершенствования метода получения туберкулезного анатоксина.

6. Повышение эффективности модифицированного канамицина к ми-кобактериям туберкулеза.

7. Результаты определения бактерицидной и лечебной эффективности канамицина, модифицированного детоксикацией и полимеризацией.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы изложены и одобрены на всероссийских научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова и Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

По теме работы опубликовано восемь научных статей в т.ч. три в журналах рекомендованных ВАК РФ. Получен один патент РФ на изобретение и одно положительное решение о выдачи патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах компьютерного текста и включает общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и практические предложения. Работа иллюстрирована 10 рисунками, 5 фото и 11 таблицами. Список литературы включает в себя 196 источников, в том числе 71 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в условиях лаборатории кафедры эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, кафедры туберкулеза ГОУ ВПО "Курский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, ГУ «Жуковская районная станция по борьбе с болезнями животных» и ГУ «Жуковская районная ветлаборатория» Комитета ветеринарии при Правительстве Калужской области и животноводческого хозяйства ЗАО «За Мир» Жуковского района, Калужской области с 2008 года по 2011 год с использованием морских свинок кроликов, белых мышей, поросят и крупного рогатого скота.

Выделение чистой культуры микобактерий туберкулеза проводили после обработки суспензии пораженных органов (легких, селезенки, лимфоузлов) с использованием для подавления посторонней микрофлоры (стафилококков, сальмонелл и кишечной палочки) вначале 4-6% раствором лимонной кислоты и 3% раствором перекиси водорода в соотношении 1:1 к суспензии биоматериала и выдержки в течение 30-60 минут при комнатной температуре, с последующей обработкой раствором содержащим 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода в соотношении с суспензией 1:1 с последующей через 30-60 минут, нейтрализацией полученной суспензии 5-7% раствором аммиака до РН - 6,8 - 7,0.

Выращивание свежевыделенных микобактерий туберкулеза бычьего вида проводили в 2 -х литровых биобутылях с объемом среды равной 1 литру, путем нанесение пленки микроорганизмов, взятых с помощью шпателя или платиновой петли с картофельных клиньев с синтетической средой.

Для более безопасного способа аллергизации морских свинок и крупного рогатого скота использовали суспензию из автоклавированных микобактерий, сорбированных на 3-5 мг/мл гидроокиси алюминия.

Предложенный способ использовали для изучения динамики инактивации, редуцирования утраты аллергенных свойств туберкулезных токси-но-аллергенов при получении туберкулезного анатоксина.

Туберкулезный анатоксин использован для изучения на токсичность и иммуногенную, протективную и аллергизирующую активность.

Модификацию канамицина проводили путем детоксикации и полимеризации, по принципу получения анатоксинов: вначале отдельно 0,2% раствором формальдегида при 38-40°С в течение 3-5 суток, а затем в сочетании с 0,2 % раствора этония в том режиме.

Исследования проведены по следующей схеме, которая представлены на рис. 1

i ............„ч'-\ '-ирг-'/.:;!-: <. yi JUI шшхщрог*-.

етвование методов я туберкулезного

v....... .

Шк

>"<>.••£ ; - L 1 „ . 1< - V

Создание безопасной биологический модели аллержи

Исследование на безвредность

Определение бзэтерн" ] : циднои и бактсриоста-тической эффективности |

Изучение лечебной эф-фекттожоста

Рис. 1. Схема исследований.

Статистическую обработку данных производили на ПК с помощью программы Excel из пакета прикладных программ MS Office 2003. Результаты представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки. Достоверность различий между показателями установили с помощью критерия Крамере -Уэлча (Орлов А.И. 2002) при заданном уровне значимости.

Исследования и результаты подтверждены актами, с участием: научного сотрудника Курского НИИ АПП к.в.н. Евглевского Д.А; зав. кафедрой туберкулеза ГОУ ВПО "Курский государственный медицинский университет», д.м.н, профессора Коломиец В.М.; зав кафедрой эпизоотологии, паразитологии и вирусологии ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия им. проф. И.И. Иванова», д.в.н. профессора Евглевского Ан.А.; врача эпизоотолога ГУ «Жуковская районная станция по борьбе с болезнями животных» Смирнова И.И.; директора лаборатории ГУ «Жуковская районная ветлаборатория» Семёновой В.В.; главного ветврача животноводческого хозяйства ЗАО «За Мир» Колосовой Т.И. 6

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Усовершенствование жидкой и плотной с агаром синтетической среды для выращивания и выделения микобактерий туберкулеза.

В основу исследований по разработке состава синтетической питательной среды положено изучение энергетической и питательной функции ряда ди-, трикарбоновых кислот цикла Кребса, в частности с разным содержанием лимонной, янтарной, винной, пировиноградной, яблочной (изоянтарной) кислот отдельно, и в сочетании друг с другом, с аспараги-ном (амидом аспарогиновой кислоты), глицином, цитратом амония, сернокислым цинком и другими химическими компонентами.

Приготовленный раствор синтетической питательной среды разливали в 2-х литровые биобутыли с объемом жидкости равной 1 литру. Авто-клавирование проводили при 1,0 атм. в течение 30 минут.

Посев микобактерий туберкулеза проводили с картофельных клиньев с помощью платиновой петли на поверхность жидкой синтетической питательной среды для их выращивания в течение 55-60 дней в термостате при 37°±0,2°С.

По результатам изучения роста и накопления бактериальной массы определен следующий оптимальный состав синтетической среды, рисунок 2.

Сернокислое железо; ОД

Глицин; 1

Фосфорнокислый натрий 2-х замещенный; 1,5

кислота; 3

Фосфорнокислый калий 2-х замещенный; 6

Рис2. Состав жидкой синтетической питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза в г/л.

С учетом результатов получения максимального накопления микобактерий туберкулеза на предложенной жидкой синтетической среде, была предпринята попытка выяснить питательную ценность плотной минеральной среды - с 2,5 % содержанием агара. Ингредиенты питательной среды растворяли в дистиллированной воде, как при последовательном их растворении, так и после предварительного их смешивания в сухом виде с внесением 2,5% агара. Реакцию среды устанавливали аммиаком до 6,8-7,1 перед стерилизацией.

Визуально наблюдаемый рост микобактерий туберкулеза происходил в среднем через 10-13 дней - для свежевыделенных культур микобактерий, и через 5-7 дней для лабораторных штаммов микобактерий туберку-

леза бычьего вида на минеральной агаровой среде. В то же время заметный рост микобактерий туберкулеза при высеве на среду Левенштейна -Иенсена как известно происходит во всех случаях через 17-20 суток.

При посеве микобактерий туберкулеза с глицеринового картофеля или с жидкой питательной среды заметный рост микобактерий туберкулеза на минеральной агаровой среде отмечался на 3-5 сутки. Поверхность агара покрывается сплошным тонким налетом культуры в целом через 5-7 дней инкубирования, которые превращались в крошковатые наложение с образованием бугристого слоя до 0,3 см толщины.

Многократное успешное испытание указанного варианта минеральной агаровой среды по приготовлению и выращиванию микобактерий туберкулеза создает предпосылки для поддержания выделенной культуры и изучения лекарственной устойчивости микобактерий.

В ходе проведения опытов выяснено, что наиболее оптимальным средством позволяющим подавлять постороннюю микрофлору является состав смеси, состоящий из: 4-6% раствора лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, с последующем добавлением раствора содержащего 4-5%' янтарной кислоты и 3% перекиси водорода с последующей, через 30-60 минут, нейтрализацией полученной суспензии 5-7% раствором аммиака до РН - 6,8 - 7,0. представленной в таблице 1.

Таблица 1. Состав смеси для подавления микрофлоры при выделении чистой культуры МТ.__

№ п/п Состав ингибирующей смеси для подавления роста микроорганизмов Время обработки до нейтрализации аммиаком Исходный показатель рН среды Виды микроорганизмов и их рост

S. aureus Сальмонеллы Кишечная палочка н

1. 2% раствор лимонной кислоты с 2% раствором перекиси водорода 30-60 минут 6,8-7,0 + + + -

2. 3% раствор лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода 30-60 минут 6,8-7,0 + - - +

3. 4-6% раствор лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, а затем через 30-60 минут 4-5% раствор янтарной кислоты с 3% раствором перекиси водорода 30-60 минут 6,8-7,0 - - - +

Сравнительная оценка разных методов деструкции микобактерий туберкулеза для получения растворимых токсино-аллергенов.

С целью изыскания рациональных методов получения максимального количества туберкулопротеинов из бактериальной массы микобактерий туберкулеза проводили автоклавирование микроорганизмов при 1,0 и 1,5 атмосферах в течении от 30 минут до 3-х часов. Ввиду того, что при проведении химико- термического гидролиза бакмассы при давлении 1,5 атмосферы и выше происходило образование темно-коричневого гидроли-зата, в связи с этим в дальнейших исследованиях автоклавирование проводили при 1,0 атмосфере.

По полученным в ходе опытов данным, выяснено, что с увеличением экспозиции автоклавирования от 30 минут до 3-х часов обеспечивало выделение в жидкую часть питательной среды туберкулопротеинов от 0,70±0,04 до 1,34±0,04 мг/мл. При этом аллергенная активность туберкулезных токсино-аллергенов, установленная при введении сенсибилизированным морским свинкам, в разведений 1:100, 1:500 и 1:1000 основных растворов токсино-аллергенов и ППД-туберкулина производственной серии' Курской биофабрики препарата увеличилась с 52000±3000 ТЕ до 95000±5000 ТЕ в одном мл.

Результаты сенсибилизации морских свинок и температурного воздействия на проявление реакции кожи на токсино-аллергены.

При изучении аллергенных и протективных свойств разрабатываемого биопрепарата необходимо было использовать биологические модели по изучению аллергии в эксперименте. Однако имеющиеся в настоящее время модели для сенсибилизации (аллергизации) морских свинок рассчитаны на использование живых вирулентных микобактерий или вакцины БЦЖ, что требует соблюдения определенных мер безопасности и соответствующих затрат, а на введение суспензии автоклавированных микобактерий туберкулеза в минеральном масле и ланолине у морских свинок происходило образование стерильных гнойных абсцессов. В то же время при использовании в качестве депонента гидроокиси алюминия отдельно с убитыми микобактериями туберкулёза без минерального масла для вакцин, образование абсцессов не происходило. Поэтому для сенсибилизации морских свинок использовали суспензию из автоклавированных микобактерий туберкулёза с гидроокисью алюминия без минерального масла.

Окончательный состав суспензии микобактерий для сенсибилизации морских свинок включает: 5 г сухих автоклавированных микобактерий туберкулеза, 90 мл физраствора и 10 мл гидроокиси алюминия (300 -500мг) из расчета 3-5мг/мл гидроокиси алюминия.

Предложенная биологическая модель аллергии при туберкулезе была использована для изучения влияния термического фактора (охлаждение и перегревание животных) на реактивность сенсибилизированных морских свинок к туберкулину и определения редуцирующего действия формальдегида на туберкулёзный токсиноаллерген для получения туберкулёзного анатоксина. Первоначально изучено влияние температурного воздействия на реактивность кожи сенсибилизированных морских свинок путем внутрикожного введения туберкулина Результаты опытов предоставлены в таблице 2.

Таблица 2. Диаметры гиперемии кожи у сенсибилизированных морских свинок на туберкулин подвергнутых температурному воздействию._

№ групп животных Количество животных Температурное воздействие Реакция кожи в мм через:

24 часа После 10 дней

1. 8 голов Контроль 20-25°С 14,2±2 13,2±2

2. 12 голов 5°С В течение 24 часа 6,5±0,5 13,5±2

3. 12 голов 40-42°С 3-х кратно по 1 часу в день 6,7±0,5 13,5±2

Из данных, представленных в таблице 2 следует, что у аллергизиро-ванных морских свинок, после их переохлаждения или перегревания возникает анергия, сопровождаемая утратой реакции на туберкулин. Утраченная чувствительность кожи к туберкулину восстанавливается через 10 дней после перевода животных в нормальные температурные условия. Полученные результаты учитывались как противопоказания на введение туберкулина при изучении аллергии и редуцирующего действия формальдегида на аллергенные свойства туберкулезного анатоксина.

Результаты редуцирующего и инактивирующего действия формальдегида на туберкулезные токсино-аллергены.

Детоксикацию туберкулезных токсино-аллергенов проводили при концентрации раствора формальдегида от 0,4% до 1% при температуре 42±1 °С в течение 10-20 дней с ежедневным перемешиванием. Результаты редуцирующего действия формальдегида на инактивацию и детоксикацию туберкулезных токсино-аллергенов представлены в таблице 3.

Таблица 3 Динамика редуцирующего действия фсрмалдагвда на туберкулезные ток-синоаллергены. _________

№ п/п Аллергенная активность токси-ноаллергенаи рН раствора Исходная концентрация формальдегида Повторное внесение формальдегида через 10 дней Продолжительность детоксика-циипри 42°С Остаточная аллергенная активность токсино-аллергенов % потери активности

1. 100000 ТЕ/мл 2 мг/мл рН = 7,0 ±0,2 0,4% - 10 дней 25000±500 ТЕ/мл 75%

2. 100000 ТЕ/мл 2 мг/мл рН = 7,0 ±0,2 0,3% 0,3% 20 дней 5000±500 ТЕ/мл 95%

3. 100000 ТЕ/мл 2 мг/мл рН = 7,0 ±0,2 0,4% 0,4% 20 дней 2500±200 ТЕ/мл 96%

4. 100000 ТЕ/мл 2 мг/мл рН = 7,0 ±0,2 0,5% 0,5% 20 дней 1500±200 ТЕ/мл 98%

Результаты исследований указывают на способность формальдегида инактивировать аллергенные свойства молекулярного туберкулезного токсино-аллергена и одновременно вызывать детоксикацию его токсических свойств.

В последующем для инактивации и детоксикации туберкулезного токсино-аллергена было испытано сочетании формальдегида с раствором этония.

Сочетанное применение 0,4% раствора формальдегида с 0,2% раствором этония ускоряло детоксикацию и инактивацию туберкулезного ток-сино-аллергена. Предложенный способ детоксикации и полимеризации туберкулёзного токсино-аллергенов был положен за основу получения туберкулёзного анатоксина. Основные технологические этапы предоставлены на рисунке 3

1 Выращивание микобактернй туберкулеза в течение <50 дней в 2-х литровых биобутылях с обьемо*шштетнческойсреды 1 Ч"||и» н» 1\чснпч11ч-Ь'П 1.м*н- им.чычикрооргапнзмов

¡111

2. Авто клавнровашге туберкулезной Культуры при 1,0 атм в течение 3- х часов до содержания 1.32*0.02' МГ/мЛ ту»ве()кулоп|)отенна (токсино-аллергена)

............... " 1 =

3. Отделение культуральной жидкости от автоклавпрованных мнкобактермй туберкулеза фильтрацией через 3-5 слоев марли

£.....2........... .......¿2...................:...............■_________■

4. Детоксикадия и инактивация токсино-аллергенов при -42*0 в два этапа путем прибавления 5.0 мч (0.4%) и 1,92 ми (0,2%) формальдегида с интервалом ? дней к 1 л раствора токенно-аллергенов 1,32±0.02 мгж |9000М0?'о ТЕ^и)

Щ

5. Сорбция на гидроокиси алюминия. из расчета 3-5 мг окиси алюминия на 1 мч анатоксина в

течение 6-12 часов

Щ|1

......

б Декантация надоепдочиой жидкости (50Чог общего объема) для повышения концентрации препарата вдвое т.е. до 2.б4±0,02 мг/мл

'. Расфасовка препарата по флаконам, автбклавирование при 0,8 атм, в течение 30 минут,зтнкетированпе и упаковка.

• ■ • ч

8, В дальнейшем для полноты детоксикации туОеркулезныхтокстщо-алергенов проводили в начале 0.3-0 4% раствором формальдегида при 4042"С в течении 5-7 с\ток. а затем 0 2-0 З'о раствором ; этонняв том же режиме.

Рис. 3. Технология получения туберкулезного анатоксина

Предполагаемая оптимизированная технология изготовления туберкулезного анатоксина легко осуществима и основана на общем принципе детоксикации токсичных и инактивации аллергенных свойств туберкулезных токсинов и аллергенов и приобретением иммунопротективных свойств препарата. Приготовленные три серии (образца) туберкулезного анатоксина (8 литров) были подвергнуты изучению на сенсибилизирующие свойства у морских свинок и у коров, на протективную и иммуноген-ную активность. Исследования проведены в ГУ «Жуковскоя ветеринарная лаборатория» Калужской области и животноводческого хозяйства ЗАО «За Мир» Жуковского района, Калужской области.

Результаты усовершенствования метода получения туберкулезного анатоксина

Изучение сенсибилизирующих свойств туберкулезного анатоксина.

Чувствительность кожи у морских свинок определяли путем внутри-кожного введения 0,1 мл туберкулина ППД Курской биофабрики в разведении 1:100 (50ТЕ) и коровам по 0,2мл.(10000ТЕ) Учет реакции у морских свинок проводили через 24 часа по диаметру гиперемии кожи, а у коров через 72 часа по утолщению кожной складки. Полученные результаты указывают, что подкожное введение анатоксина, вызывает чувствительность кожи к туберкулину на протяжении Зх-4х месяцев, а затем угасает Результаты опытов предоставлены на рис. 4 и рис. 5.

30

50

70

110

130

150

дни

1 и®шДвукратно подкожно по 2,0 мл с интервалом 10 дней

2 «"®а»ПодкожноЗ-х кратно по 2,0 мл с интервалом 10 дней

Рис. 4. Динамика чувствительности кожи у морским свинкам

з ------------------------------------------------------------------------------

30 • 50 70 90 110 130 ■ 150

дни

Рис. 5. Динамика чувствительности кожи у коров

Изучение иммуногенной активности туберкулезного анатоксина

При изучении иммуногенной активности туберкулезного анатоксина использовали иммунную сыворотку. Для ее получения были взяты кролики массой 2,5-3,0 кг, которым 6-ти кратно подкожно в 2-3 точки вводили туберкулезный анатоксин в объеме 2,0 мл с интервалом 5-6 дней. На 10-е сутки после окончания иммунизации получали сыворотку, которую консервировали мертиолятом в разведении 1:10000. Полученную сыворотку изучали на наличие аллергеннейтрализующих и преципитирующих антител.

Результаты инактивирующего действия иммунной сыворотки на аллергенные свойства туберкулина, подтверждаются тем, что специфическая иммунная кроличья сыворотка, полученная после иммунизации туберкулезным анатоксином (цельная и в разведении 1:5 и 1:10) после выдерживания в смеси с туберкулином в термостате при 42-43°С в течение 6-12 ч вызывает снижение аллергенной активности нативного туберкулина на сенсибилизированных морских свинках соответственно на 60%, 40% и 20%. Результаты опыта представлены в таблице №4.

Из полученных данных следует, что туберкулезный анатоксин после 6 кратного подкожного введения кроликам в объеме 2,0 мл вызывает образование в организме аллергеннейтрализующей и преципитирующие антитела.

Таблица 4. Результаты инактивирующего действия иммунной сыворотки на аллергенную активность туберкулина (токсино-аллергена)

№ п/п Разведение иммунной сыворотки Кол-во морских свинок, голов Исходная аллергенная активность туберкулина, ТЕ/мл Аллергенная активность после воздействия иммунной сыворотки на туберкулин, ТЕ/мл Снижение аллергенной активности туберкулина, в%

1. цельная 6 50000 20000 60%

2. 1:5 6 50000 30000 40%

3. 1:10 6 50000 40000 20%

4. контроль 4 без иммунной сыворотки 50000 снижения ал-лерг. активности не установлено

Изучение протективной активности туберкулезного анатоксина Протективные свойства туберкулезного анатоксина определяли с использованием морских свинок и кроликов. В работе использовано 14 морских свинок и 12 кроликов после 3-х кратной вакцинации туберкулезным анатоксином в объеме 2-3 мл с интервалом 10 суток с последующим, через 30 суток заражением 1мг микобактериями туберкулеза во внутреннюю часть тазовой конечности. Наблюдение за животными проводили в течении 90 суток. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 Результаты протективной активности туберкулезного анатоксина __

№ п/п Виды и количество животных Количество животных пало после заражения через(дней Убито через 90 дней после заражения

30 60 90

1. 14 морских свинок, вакцинированных ТА 1 2 3 8

2. 12 кроликов, вакцинированных ТА 1 2 2 7

3. Контроль 4 морских свинки не вакцинированные ТА 3 1 -* -

4. Контроль 4 кролика не вакцинированные ТА 3 1 - -

Повышение бактерицидной и лечебной эффективности модифицированного канамицина к микобактериям туберкулеза

Для снижения токсичности и повышения эффективности производственного канамицина, устойчивости его к ферментативному воздействию микроорганизмов, использовали полимеризацию и детоксикацию с помощью двух детоксикаторов - вначале 0,2 раствором формальдегида при 40,0±2,0°С в течение 3-5 суток, а затем в таком же режиме используя 0,2% раствор этония для полноты детоксикации и повышения терапевтических свойств препаратов.

Исследованиея на безвредность проводили с использованием 10 белых мышей, 8 морских свинок ,которым ежедневно подкожно, вводили модифицированный канамицин. в дозах: белым мышам по 0,5 мл (50 мг) в течение 5 суток, морским свинкам по 1,0 мл (100 мг) в течение 10 суток. По истечении 15 суток после последнего введения канамицина все животные оставались живыми и без гнойно-некротических изменений на месте введения препаратов.

Определение бактерицидной и бактериостатической эффективности модифицированного канамицина проводили на плотной и жидкой синтетической питательной среде, в которую добавляли 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 и 40,0 мкг/мл производственного и модифицированного канамицина.

При этом установлено отсутствие роста лекарственно-устойчивых микобактерий туберкулёза бычьего вида при концентрации 10-15 мкг/мл модифицированного канамицина как на плотной так и на жидких питательных средах.

В то же время рост лекарственноустойчивых микобактерий на плотной и жидкой питательных средах происходил при концентрациях производственного канамицина 40-45 мкг/мл.

Полученные результаты подтверждают, что по эффективности в отношении лекарственноустойчивых микобактерий туберкулёза бычьего вида модифицированный канамицин превышает производственный в 2,53,0 раза.

Результаты определения лечебной эффективности канамицина, модифицированного детоксикацией и полимеризацией

Лечебные свойства модифицированного канамицина изучали с использованием 18 морских свинок по истечении 30 дней после заражения микобактериями туберкулеза бычьего вида в дозе 1,0 мг (40 миллионов микроорганизмов). В качестве контроля использовали производственный канамицин для лечения 8 морских свинок, подвергнутых также заражению 1мг микобактерий туберкулеза. В целом лечение морских свинок, производственным и модифицированным канамицином проводили в течение 30 суток путем ежедневного подкожного введения по 100-120 мг препарата на одно животное. Наблюдение за животными проводили в течение 90 суток. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6. Результаты лечебной эффективности модифицированного детоксикацией и полимеризацией канамицина__1_

№ п/п Количество морских свинок Наименование антибиотика Количество животных пало после заражения через (суток) Количество убитых морских свинок после 90 суток лечения

30 60 90

1. 8 Производственный канамицин 1 7 - -

2. 18 Модиф ицирован-ный канамицин - 3 6 9

Из данных, представленных в таблице 6, следует, что при ежедневном введении в течение 30 суток морским свинкам производственного канамицина в дозе 100-120мг все опытные 8 голов погибли в течение 60 суток после заражения с обширными гнойно-кавернозными очагами в легких, печени, селезенке.

В тоже время однократное ежедневное введение модифицированного канамицина морским свинкам в дозе 100-120мг обеспечило выживаемость животных свыше 60 суток (30%-3 голов) и свыше 90 суток (9 голов -50%).

4. ВЫВОДЫ

1. Обработка суспензий из 5-20 граммов органов и тканей, обсемененных 10 тысячами сальмонелл, кишечной палочки и стафилококков и 1 мг микобактериями туберкулеза бычьего вида вначале 4-6% раствора лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, с последующем добавлением раствора содержащего 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода с последующей, через 30-60 минут, нейтрализацией полученной суспензии 5-7% раствором аммиака до РН - 6,8 - 7,0 подавляет рост сальмонелл, стафилококков и кишечной палочки при сохранении роста мико-бактерий туберкулеза на среде Левенштейна-Йенсена.

2. Выращивание лабораторных и свежевыделенных микобактерий туберкулеза бычьего вида в 2-х литровых биобутылях с объемом синтетической питательной среды равной 1 литру в течение 55-60 суток обеспечивает стабильное накопление бактериальной массы до 120-130 граммов и содержание 0,72-0,76 мг/мл эндогенных растворимых токсидо-аллергенов (нативного туберкулина), протеинов, липидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот с аллергенной активностью 52000±ЗОООТЕ/мл.

3. Усовершенствованный метод получения туберкулезного анатоксина включает увеличение времени автоклавирования культуральной жидкости до 3-х часов при давление 1 атмосфера, декантация надосадочной жидкости, детоксикацию и инактивацию растворимых токсино- аллерге-

нов вначале 0,4% раствором формальдегида при 42-45°С в течение 3- 5 суток, а затем 0,2% раствором этония в том же режиме для полноты де-токсикации с последующей сорбцией на 3-5 мг/мл гидроокиси алюминия.

4. Шестикратная иммунизация кроликов туберкулезным анатоксином в объеме 2-3 мл с интервалом 5-6 суток вызывает образование в сыворотке крови преципитирующие антитела в разведении 1:5 -1:10 в отношении нативного туберкулина и аллергеннейтрализующие антитела в титре 1:1 -1:2, обеспечивающих нейтрализацию 70-80% аллергенной активности нативного и ППД - туберкулина, содержащих 50000±5000ТЕ/мл.

5.Двукратное подкожное введение туберкулезного анатоксина морским свинкам и кроликам в объеме 2-3 мл с интервалом 10 суток обеспечивает устойчивость животных к заболеванию туберкулезом в течение 3-х месяцев после подкожного введения суспензии с 1 мг микобактерий туберкулеза бычьего вида вместо общепринятых 0,01 - 0,001 мг.

6. Канамицин полученный путем детоксикации и полимеризации 0,2% раствором формальдегида при 40-42°С в течение 3-5 суток, а затем 0,2 раствором этония в том же режиме повышает в 1,5 раза бактерицидную эффектив-ность в отношении канамицино-устойчивым микобактериям туберкулеза бычь-его вида, а ежедневное подкожное введение морским свинкам 100000 ЕД (0,1 г) препарата в течение 30 суток защищает животных от заболевания, после заражения 1мг микобактерий туберкулеза бычьего вида вместо общепринятых 0,01 - 0,001 мг.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Целесообразно использовать туберкулезный анатоксин для специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.

2. Способ создания биологической модели аллергии к туберкулину создает возможность изучать проявления аллергических реакций у животных и определения процесса детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов при изготовлении туберкулезного анатоксина.

3. Способ подавления роста посторонней микрофлоры в суспензии органов и тканей вначале 4-6% раствора лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, с последующем добавлением раствора содержащего 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода с последующей, через 30-60 минут, нейтрализацией полученной суспензии 5-7% раствором аммиака до РН - 6,8 - 7,0 рекомендуем как щадящий метод выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза.

Полученные результаты создают перспективу применения:

- туберкулезного анатоксина, полученный усовершенствованным методом, для профилактики заболевания туберкулезом морских свинок, кроликов и крупного рогатого скота;

- усовершенствованного канамицина для повышения эффективности лечения больных туберкулезом животных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

* работы, опубликованные в рекомендованных ВАК РФ изданиях

1. Евглевский А.А Состояние и перспективы создания туберкулёзных биопрепаратов / Евглевский A.A., Коваленко A.M., Евглевский Д.А., Смирнов И.И. // Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины. 2009. - С. 47-49.

2. Смирнов И.И. Десенсибилизирующие свойства и аллергизирую-щая активность туберкулёзного анатоксина / Смирнов И.И., Коваленко A.M., Евглевский Д.А. // Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины. -2009. - С. 49-50.

3. Смирнов И.И. Протективная активность туберкулёзного анатоксина. / Смирнов И.И., Евглевский Д.А. // Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины. -2009. - С.57-58.

4. Смирнов И.И. Иммуногенные свойства туберкулёзного анатоксина. / Смирнов И.И., Евглевский Д.А. // Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины.- 2009. - С.61.

5. ^Евглевский A.A. Совершенствование средств специфической профилактики лейкоза крупного рогатого скота / Евглевский A.A.,Кузьмин В.А., Евглевский Д.А.,Смирнов И.И. // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2010. №4. - С. 100-102.

6. Евглевский A.A. Изучение иммуногенной активности туберкулёзного анатоксина. / Евглевский A.A., Стебловская С.Ю., Евглевский Д.А., Смирнов И.И. и др. // Актуальные проблемы ветеринарной медицины.-2010.-№ 141,-С. 19-27.

7. *Евглевский A.A. Повышение эффективности канамицина к ми-кобактеориям туберкулёза. / Евглевский A.A., Евглевский Д.А,Смирнов И.И. // Вестник Курской ГСХА,- 2011,- № ,1-С. 63.

8. »Евглевский Д.А. Универсальная синтетическая среда для выращивания патогенных и пробиотических микроаргонизмов при получении биопрепаратов. / Евглевский Д.А., Евглевский A.A.,Смирнов И.И.-//-Вестник Курской ГСХА,- 2011,- №4. - С.64-66.

9. Патент Российской Федерации на изобретение № 2439142. Сентетическая питательная среда для выращивания микроорганизмов / Евглевский Д.А., Евглевский A.A., Тимкова Е.А.,Смирнов И.И. (Ru) КГСХА.

10. Положительное решение о выдачи патента на изобретение. 19 января 2012 года. Способ выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза / Евглевский A.A.Евглевский Д.А., Коломиец В.М., Коваленко A.M., Смирнов И.И. (Ru) КГСХА.

Формат 60x84 1/16. Бумага для множительных аппаратов.

Печать на копировальном аппарате КГСХА. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 107.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Смирнов, Игорь Иванович, Курск

61 12-16/119

Министерства сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреяедение высшего профессионального образования «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова»

на правах рукописи

СМИРНОВ ИГОРЬ ИВАНОВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА И ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ КАНАМИЦИНА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Евглевский Анатолий Алексеевич

Курск-2012

СОДЕРЖАНИЕ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

2.1. Структура и функции иммунной системы..............................................11

2.2. Виды и характеристика микобактерий туберкулеза..............................19

2.3. Диагностика туберкулеза у животных....................................................22

2.4. Специфическая профилактика туберкулеза...........................................28

2.5. Иммунобиологические препараты, механизмы и средства детоксикации и полимеризации токсино-аллергенов........................................35

2.6. Биотехнологические основы повышения эффективности....................42

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 47

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 54

4.1. Усовершенствование жидкой и плотной с агаром синтетической среды для выращивания и выделения микобактерий туберкулеза.............................54

4.2. Сравнительная оценка разных методов деструкции микобактерий туберкулеза для получения растворимых эндотоксино-аллергенов................67

4.3. Результаты сенсибилизации морских свинок и температурного воздействия на проявление реакции кожи на токсино-аллергены...................72

4.4. Результаты редуцирующего и инактивирующего действия формальдегида на туберкулезные токсино-аллергены и получение анатоксина...................................... . .......................................................................76

4.5. Результаты усовершенствования метода получения туберкулезного анатоксина..............................................................................................................85

4.5.1. Изучение сенсибилизирующих свойств туберкулезного анатоксина. 85

4.5.2. Изучение иммуногенной активности туберкулезного анатоксина......88

4.5.3. Изучение протективной активности туберкулезного анатоксина.......92

4.6. Повышение эффективности модифицированного канамицина к микобактериям туберкулеза.................................................................................95

4.7. Результаты определения лечебной эффективности канамицина, модифицированного формольной детоксикацией и полимеризацией............97

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 100 ВЫВОДЫ 115 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ( - , 119 ПРИЛОЖЕНИЯ 138

Принятые в работе сокращения

СПС - синтетическая питательная среда

ТА - туберкулезный анатоксин

РИД - реакция иммунодиффузии

РП - реакция преципитации

^М - иммуноглобулины М

МС - натуральные киллеры

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

МТ - микобактерии туберкулеза

ТЕ и МЕ — туберкулиновые и международные единицы

ПАВ - поверхностно-активные вещества

ТА - туберкулезный аллерген

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

ГОА - гидроокись алюминия

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

ПАБК - парабензойная кислота

ИБК - иммунобиологические препараты

ИГ - иммуноглобулины

ИФ - интерфероны

ПЧЗТ - повышенная чувствительность замедленного типа ППД - очищенный протеин дериват (туберкулин)

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие эпизоотического процесса при туберкулезе у животных в определенной степени связано с эпидемическим процессом у человека и наоборот, т.к. невакцинированные животные, не обладая достаточным иммунитетом, будут заражаться и создавать резервуар возбудителя (Биргер М.О. 1982; Донченко A.C. 1997; Ридер Г.Л. 2001).

Наличие более 50 видов микобактерий, сложность строения, резкое повышение устойчивости к средствам химико- и антибиотикотерапии представляют серьезную медико-ветеринарную и социальную проблему (Беляков В.Д. 1998; Данилевская Н.В. 2005; Коротяев А.И. 1998).

Использование вакцины БЦЖ, туберкулезного аллергена (туберкулина токсино-аллергена), адьюванта Фрейнда экспериментальных ДНК - вакцин, анатоксинов и антибиотикотерапия не решили проблему эффективности профилактических, диагностических и лечебных мероприятий в борьбе с туберкулезом (Бектемиров Т.А. 2007; Леви Д.Т. 1999).

Во второй половине 80-х годов 20-го столетия создавалось впечатление, что профессия фтизиатора со дня на день канет в лету и армии борцов с чахоткой придется искать новую профессию. Именно тогда сменила вывеску «кафедра туберкулеза» на кафедру «фтизиопульманологии». Однако с начала 90-х годов в России, да и во многих странах мира туберкулез вновь стал проблемой ( Перельман М.И. 2001 ).

В настоящее время уровень заболеваемости туберкулезом в России в 10 раз выше, чем в странах Западной Европы, а осужденных в 62 раза превышает среднеевропейский показатель (более 4 тысяч случаев на 100 тысяч в 1999), смертность - в 28 раз. По сравнению с 1991 годом смертность возросла более чем в 2 раза (Медуницин Н.В. 2008).

Микобактерии туберкулеза поражают любую ткань и находятся в организме в 3-х состояниях: внеклеточное - метаболически активные, внутриклеточное - малоактивные и локализованные в казеозных массах.

Как инфекционное заболевание туберкулез является наиболее используемой моделью аллергии в иммунологии и аллергологии. Почти нет модели в иммунологии, при изучении которой не использовали бы микобактерии туберкулеза, туберкулин, вакцину БЦЖ (Авербах М.М. 1976; Алуксандров И.Д. 2000).

В настоящее время пока нет четких сведений о том, какие компоненты (белки, липиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты) индуцируют протек-тивный эффект (Bernstein I.L. 1996).

Однако очевидно, что для определения защитного эффекта важны адъ-ювантное действие микобактерий и длительное персистирование иммуно-генных антигенов в организме (Калинина O.A. 1993).

Живая вакцина БЦЖ была получена А. Кальметом и Ш. Гереном в 1919 году путем аттенуации вирулентных свойств микобактерий туберкулеза бычьего вида, выделенного в 1902 году Нокардом, после 230 кратного пересева в течение 13 лет на глицериновый картофель с желчью. С 1921 года вакцина БЦЖ в течение 35 лет применялась орально, а затем внутрикожно и является обязательной к применению в 64 странах мира и рекомендована в 118 государствах (4; 5). В тоже время вакцина БЦЖ не способна стимулировать «правильное» сочетание субпопуляций Т-лимфоцитов, необходимое для создания протекции. Одновременно разрабатываются новые вакцины на основе БЦЖ путём удаления «супрессивных» последовательностей из генома, создавая штаммы «нокауты» по данному нену. Однако существенных протективных свойств не выявлено. Широкое применение вакцины БЦЖ, создание реком-бинантной вакцины, экспрессирующие гены белков-цитолезинов и т.д. не безразлично для востановления вирулентности микроорганизмов.

Перспективными являются препараты, созданные на основе вакцинного штамма, который по антигенному составу как можно больше соответствовал бы составу патогена. Использование в качестве терапевтических и профилактических преппаратов из живых и убитых нагреванием штаммов M.vaccae, microti, Habana и ДНК-вакцины не нашли пока практического применения (Еремеев В.В. и др.).

Научную и практическую заинтересованность вызывает получение субьединичных молекулярных вакцин из культуральных фильтратов с адь-ювантами в том числе туберкулёзных анатоксинов и комплексных противотуберкулёзных препаратов ПКП-2 и ПКП-3 (Коваленко A.M., Евглевский A.A.). По иммуногенной и протективной активности указанные препараты превосходят вакцину БЦЖ при испытании на морских свинках и кроликах.

Одним из критериев оценки качества вакцинных препаратов является уровень их иммунологической активности, то есть способность вызывать выработку специфических антител. Однако методика серологической оценки иммунологической эффективности не применима к вакцинам ряда инфекций (бруцеллез, туляремия, туберкулез), в патогенезе которых ведущая роль принадлежит клеточному иммунитету. Иммунологическая эффективность соответствующих вакцин может оцениваться по профилактической эффективности и проявлению клеточного иммунитета или путем постановки кожно- аллергических проб ( Воробьев A.A. 1999; Герман В.В. 2003; Змужко H.H. 2001).

Туберкулёзный анатоксин и ПКП вызывают сенсибилизацию лабораторных животных и крупного рогатого скота, это один из факторов иммунитета, так как аллергия является обязательным компонентом защиты от заболеваний, в том числе и туберкулёза; ........................

Следует отметить, что в прошлом для изготовления туберкулёзных аллергенов использовались штаммы, выделенные до эпохи применения анти-

биотикотерапии и соответственно в отсутствии лекарственно устойчивых микобактерий.

В тоже время продолжаются исследования по получению и применению противотуберкулезных протективных препаратов типа анатоксина, так как при других болезнях аналогичными препаратами достигнуты весомые результаты (Торбан М.А. 1970; Трйполитова A.A. 1981; Урбан В.П. 2000).

Актуальными проблемами остаются совершенствование средств и способов аллергодиагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота, повышения эффективности и снижения токсичности антибиотиков (Никитин A.B. 2009; Сорокин Г.В. 2008; Федоров Ю.Н. 2005).

Вышеизложенное определило выбор темы, цель и задачи исследований.

Цель работы: Целью работы явилось усовершенствование синтетической питательной среды для выращивания, выделения микобактерий туберкулеза бычьего вида для получения нативного туберкулина и токсино- аллергенов, изыскание биологической модели аллергии и повышения эффективности туберкулезного анатоксина и канамицина.

Для достижения поставленной цели были определены следующие

задачи:

1. Усовершенствование жидкой и плотной синтетической питательной среды для выращивания, выделения микобактерий туберкулеза и получение токсино-аллергенов;

2. Создание способа безопасной биологической модели аллергии туберкулёза, путём сенсибилизации морских свинок и сельскохозяйственных животных убитыми микобактериями туберкулёза, для изучения процесса де-токсикации и инактивации токсина аллергена и проявление аллергических реакций;

3. Усовершенствование средств и способа детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов и модификации канамицина;

4. Изучение протективных, иммуногенных свойств полученного туберкулезного анатоксина, а также лечебной и бактерицидной эффективности модифицированного канамицина.

Научная новизна. Детоксикация, полимеризация и инактивация туберкулезных молекулярных токсино-аллергенов позволило получить анатоксин, обладающий протективными и иммуногенными свойствами.

Установлено, что иммунизация кроликов туберкулезным анатоксином вызывает образование в сыворотке крови аллергеннейтрализующие и преци-питирующие антитела, которые могут быть использованы в качестве новых диагностических тестов.

Модификация канамицина по способу получения туберкулезного анатоксина повысило бактерицидную активность препарата в отношении кана-мициноустойчивым микобактериям туберкулеза бычьего вида и лечебную эффективность при полной утрате токсичности.

Сенсибилизация морских свинок и сельскохозяйственных животных суспензией из автоклавированных микобактерий туберкулеза, сорбированных в гидроксиде алюминия не вызывает образование гнойных абсцессов в отличие от адьюванта Фрейнда, обеспечивает стабильную чувствительность на внутрикожное введение туберкулина в течение 9-10 месяцев, создает основу контроля детоксикации и инактивации токсино-аллергенов и изучения проявления аллергических реакций.

Полученные результаты по детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов для получения анатоксина и модификация канамицина по принципу получения анатоксинов выявление в сыворотке крови иммунизированных туберкулезным анатоксином кроликов преципитирующих и аллергеннейтрализующих антител и получение биологической модели аллергии к туберкулину являются приоритетными.

Практическая ценность. Иммуногенные протективные и иммуномо-дулирующие свойства туберкулезного анатоксина могут составить основу специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота и сопроводительной иммунокоррекции при вакцинации крупного рогатого скота противолейкозной вакциной.

Детоксикация, полимеризация и инактивация туберкулезных токсино-аллергенов и канамицина вначале ОД-0,6% раствором формальдегида целесообразно использовать при изготовлении других анатоксинов и модифицированных антибиотиков.

Разработанный и апробированный способ сенсибилизации морских свинок и сельскохозяйственных животных суспензией из автоклавированных

микобактерий туберкулеза позволит использовать в качестве безопасной биологической модели аллергии при туберкулезе для изучения аллергической реакции и динамики детоксикации и инактивации туберкулезных ток-сино-аллергенов при изготовлении туберкулезного анатоксина.

Установленное образование у вакцинированных кроликов туберкулезным анатоксином преципитирующих и аллергеннейтрализующих антител создают возможность использование новых диагностических проб при диагностике туберкулеза у животных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Материалы апробации синтетической питательной среды для выращивания и выделения микобактерий туберкулеза, получения и применения токсино-аллергенов (нативного туберкулина);

2. Способ и средства детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов для получения туберкулезного анатоксина;

3. Способ сенсибилизации морских свинок и сельскохозяйственных животных для определения полноты детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов;

4. Результаты изучения протективной, иммуногенной, сенсибилизирующей и моделирующей активности туберкулезного анатоксина и лечебной эффективности модифицированного канамицина.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены и одобрены на всеросийских научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова и Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Публикации результатов исследований. По теме работы опубликовано 8 научных статей, в том числе три в журналах перечня ВАК РФ, получен один патент РФ и одно положительное решение о выдачи патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного текста и включает общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и практические предложения. Работа иллюстрирована 10 рисунками, 5 фото и 11 таблицами. Список литературы включает в себя 196 источников, в том числе 71 иностранных авторов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура и функции иммунной системы

Уровень защитных механизмов обусловлен как генетическими факторами, так и условиями, в которых находится животное, обеспеченностью его необходимым количеством и набором питательных веществ, макро- и микроэлементов, витаминов (Белозеров Е.С. 1991; Борознов С.Л. 2004; Федоров Ю.Н. 2006).

Способ защиты организма от генетически чужеродных веществ называется иммунитетом (лат. Immunitas- освобождение от чего либо), а органы, клетки и ткани, отвечающие за иммунитет - иммунной системой.

В современной иммунологии различается два вида иммунитета: естественный (врожденный) и приобретенный (адаптивный). Естественный иммунитет является неспецифическим по отношению к микроорганизмам, а приобретенный - специфическим (Воробьев А.А. 1999).

Неспецифический иммунитет обеспечивает кожа, слизистая, секрет слюнных, сальных и потовых желез, нормальная микрофлора (антагонисты патогенных микроорганизмов), желез желудка - соляная кислота, протеоли-тические ферменты.

В группу специфических иммунных факторов входит система комплемента, лизоцим, р-лизин, фагоциты, клетки киллеры (Макаров В.В. 1999; Нестерова И.В. 2002).

Иммунитет рассматривается как одна из сторон единого биологического закона охраны индивидуальности на протяжении жизни организма, тогда как наследственность охраняет его в нисходящем ряду поколений. За счет иммунных реакций организм защищается от факторов нарушающих его функциональную целостность (Хайтов P.M. 2007).

Иммунитет охраняет и поддерживает гомеостаз или генетическую индивидуальность организма на всем протяжении его существования благодаря многочис�