Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS"



На правах рукописи

ЧИКРИЗОВА Ольга Федоровна

СОЗДАНИЕ ФОРМ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ АОЦОВАСТЕКШМ ТиМЕРАЫЕ^

06.01.05 — Селекция и семеноводство 1 03.00.23 — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1997

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте льна

На\чный руководитель — кандидат сельскохо шйственных наук, старший на\чный сотрудник А. В. Поляков.

Официальные оппоненты доктор биологических на\к, профессор В. В. Мазин, кандидат сельскохозяйственных наук М. Е. Каминская.

Вед\щая организация — Всероссийский на\чно-исследо-вательский институт сельского хозяйства центральных районов Нечерноземной зоны РФ у/^

Защита состоится 7 7 ¿¿¿/>¿/¿¿С- 1997 г

.-ЛгГ

в 7 О часов на заседании диссертационного совета

Д 120 35 04 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва И-550, Тимирязевская у л , 49 Ученый совет ТСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА

Автореферат разослан // 1997 г

Ученый секретарь ,

диссертационного совета — а [

кандидат сельскохозяйственных С /~> ,---)

на\к *' / / Р. Р. Усманов

С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лен-долгунец является важной технической культурой комплексного использования, имеющей большое значение в народном хозяйстве России. Ведущая роль в интенсификации льноводства принадлежит селекции, позволяющей сочетать в одном сорте высокую продуктивность, качество и комплексную устойчивость к болезням и полеганию (Александрова Т.А., Марченков АН., 1994). .. - Основные методы селекции льна-долгунца, базирующиеся на традиционных приемах - подборе пар для скрещиваний, гибридизации и отборе в рассцепляющихся популяция^, остаются трудоемкими и продолжительными. С целью усовершенствования селекционного процесса,в последние годы активно начали проводиться комплексные исследования по использованию биотехнологии. Это культура пыльников или микроспор (Nichterlein К. et.al., 1991; Tejklova Е.. 1996; Poliakov А.,1995) и эм-бриокультура при межвидовой и внутривидо-вой гибридизации (Poliakov

A. at.al., 1995; Поляков A.B., Егорова Е.Г., 1996), культура протопластов (Baracat M., Cocking Е., 1985), сомаклональная вариабельность (Marshal, Courduries et.al.,1991) и клеточная селекция (McHughen А., Swarts М.А., 1984), а также генная инженерия (Drapper J., Scott R., Armitage P., 1988; Mlynarova L., Pretova E., 1993).

Благодаря генной инженерии стало возможным вводить чужеродные ДНК в растительные клетки и в сравнительно короткие сроки целенаправленно создавать трансгенные растения с принципиально новыми признаками:, ' »устойчивость к болезням, вредителям и гербицидам (Шевелуха B.C.,1992; Скрябин К.Г., 1995). Успешно проведены работы по созданию модельных трансгенных растений подсолнечника, зерновых, люцерны, сахарной свеклы, картофеля и др. (Гапоненко А. и др., 1991; Левенко Б.А. и др., 1991; Денейко .В. и др., 1991; Илюбаев С.У. и др., 1991; Корниенко О.В. и др., 1991; Сидоров В.А., 1991; Кучук Н.В., 1991; Картель H.A. и др., 1991). Созданы растения табака, устойчивые к вирусам (Ривкин М.И. и др., 1991). Ведется целенаправленный перенос в клетки картофеля четырех генов устойчивости: к колорадскому жуку, вирусам, бактериозам и грибной инфекции (Шевелуха B.C., 199^/ ;

- Получены трансгенные гербицидоустойчивые растения сои, сахарной свеклы, гороха, фасоли, табака (Левенко БА, Марьюшкин

B.Ф., Стехин И.Н., 1991; Левенко Б.А., Богомолова Н.М. и др., 1991; Кучук Н.В. и др., 1991; Падегимас Л.С. и др.,1991; Скрябин К.Г., 1995; Пастернак Е.Ю. и др., 1991).

На основе генетической трансформации получены трансгенные растения масличного льна, устойчивые к канамицину (Drapper J.,1988; McHughen A., Jordan M., 1989; Mynarova ., Pretova A., 1993). Созданы

формы, устойчивые к хлорсульфурону ( Jordan М.С., 1987; _________у

' ЦЕНТРАЛЬНАЯ

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА ''.осн. . ->ль;:'очоз академии и ,. К. А. "1имивязава

Инв. màzSïàSa

McHughen A., 1989; 1991; 1992) и глифосату (Jordan M.C., 1987; McHughen A.,1991), которые в полевых испытаниях проявили высокую устойчивость, а на обычном фоне не уступали исходным сортам масличного льна по урожаю семян. Однако, на льне-долгунце подобные работы не известны. Наши исследования показали, что отличительной особенностью льна-долгунца от масличного льна в условиях in vitro, является его пониженная морфогенетическая активность. В сязи с этим, необходима адаптация метода трансформации применительно ко льну-долгунцу.

Цель исследований. Интенсификация селекционного процесса льна-долгунца на осове создания трансгенных форм и оптимизация условий трансформации с помощью A. tumefaciens на примере передачи генов устойчивости к канамицину (NPT-II) и хлорсульфурону (ALS).

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

- оптимизировать условия получения трансгенных растений с помощью Agrobacterium tumefaciens применительно ко льну-долгунцу; получить трансгенные растения льна-долгунца;

- разаботать методику оценки трансгенных растений льна-долгунца на примере устойчивости к канамицину и хлорсульфурону;

- изучить устойчивость форм льна, полученных на основе скрещиваний обычных сортов льна-долгунца с трансгенными формами масличного льна, выделить источники гербиидоустойчивости для селекционной практики;

- изучить трансгенные гербицидоустойчивые формы льна-долгунца, по основным хозяйственно-ценным признакам.

Научная новизна и практическая ценность исследований. Впервые созданы трансгенные формы льна-долгунца с повышенной устойчивостью к канамицину и гербицидам группы хлорсульфурона, не уступающие по продуктивности исходным родительским сортам льна-долгунца, которые могут быть использованы в селекции в качестве геноисточиков устойчивости. Оптимизированы условия и установлена возможность генетической трансформации льна-долгунца А. tumefaciens на примере введения маркерного гена NPT-II,'придающего растениям устойчивость к канамицину, что позволит получать трансгенные растения льна-долгунца. Разработана методика оценки на устойчивость к канамицину в культуре ткани и на проростках, а также к хлорсульфурону на проростках и вегетирующих растениях, позволяющя значительно повысить эффективность селекционного процесса при отборе устойчивых форм льна-долгунца.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты докладывались на заседании кафедры биотехнологии ТСХА, на 111 Всесоюз

ном симпозиуме " Новые методы биотехнологии растений " (г.Пущино, 1995), Всероссийском съезде по защите растений ". Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность" (Санкт-Петербург, 1995).

Публикации. Основные материалы и результаты диссертации изложены в 6 печатных работах, 3 статьи находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), общих выводов, предложений производству, списка использованной литературы, включающего 185 наименований, в том числе 65 иностранных авторов. Работа изложена на-157 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 25 рисунков и 11 приложений.

УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение трансгенных форм льна-долгунца велось в двух направлениях : первое, заключалось в агробактериальной трансформации льна-долгунца на примере введения маркерного гена NPT-II, придающего растениям устойчивость к канамицину; второе, предусматривало передачу и экспрессию генов канамицино- (NPT-II) и гербицидоустойчивости (ALS), используя методы традиционной селекции.

Материалом для исследований служили сорта: льна-долгунца -Дашковский 2, Р-736, Белинка; масличного льна Norlin, McGregor и трансгенные формы масличного льна: 12, W, L, устойчивые к канамицину (ген NPT-II) и хлорсульфурону (ген ALS), которые были получены в Саскет-чеванском университете (Канада) в лаборатории профессора Мак Хюгена (A. McHughen).

В исследованиях по генетической трансформации льна-долгунца использовали Agrobacterium tumefaciens штаммов: А 281 (pTiBo 542) pGa 482 и LBA 4404 pBI 121, содержащие маркерный ген неомицин-фосфотрансферазы II (NPT-II), предоставленные нам Филиалом Института биорганической химии РАН (г. Пущино) и Институтом молекулярной биологии РАН (г. Москва). Размножение и культивирование агробактерий проводили по общепринятой методике (Маниатис Г. и др., 1984).

Трансформацию проводили методом кокультивирования с агробак-териями, используя в качестве эксплантов гипокотильные сегменты. Растительный материал выращивали на агаризованных модифицированных питательных средах на основе MS (Murashige, Skoog, 1962). Фитогормо-ны и антибиотики использовали в концентрациях (мг/л): БАП -1,0; НУК -0,05; канамицин (Km) - 50 -300; клафоран (KI) - 100-500; карбенициллин (Kb) - 100-500. Активность неомицинфосфотрансферазы II (NPT-II) on -

ределяли по общегринятои методике (Генная инженерия растений 1991, DrapperJ eta» 1988 Маниатис 1984)

Простерилизованные семена льна-долгунца проращивали гри температуре 22-24 С без доступа света на жидкой MS-среде или дистиллированной воде В качестве селективного агента добавляли канамицин (500-1000 мг/л) или гербициды Препарат-1 (100-200 мг/л) и Метрон (50200 мг/л)

Вегетационные опыты закладывали в сосудах Митчерлиха В почву вносили минеральные удобрения из расчета N 250 Р 500 К 250 мг/сосуд Норма высева составляла 50 семян на 1 сосуд Обработку гербицидом Препарат-1 осуществляли путем его предпосевного внесения в почву, а так же опрыскиванием растениий льна в фазы всходов ' и елочки из расчета 10-75 г/га (го д в ) Повторность опытов была четырехкратная Все наблюдения и исследования вели согласно Методике вегетационного опыта с гербицидами (ВоитеховаВА 1968)

Реципрокные скрещивания льна-долгунца с трансгенными формами масличного льна проводили по общепринятой для льна-долгунца методике (Рогаш Дунаева 1970) Сортовую однородность селекционного материала проверяли в луночном гитомнике согласно методике ВНИИЛ (1968) В качестве стардартсв использовали новые сорта льна-долгунца внесенные в Госудзрственнь и реестр Алексии и А-29

Метеорологические условия в годы проведения исследований были различными Вегетационный гериод 1994 г был холодным с избыточным количеством осадков в гервые декады мая июня и засушливым с повышенными температурами воздуха в юнце июля и первою декаду августа Метеорологические условия 1993 и 1995 гг были удовлетворительными для выращивания льна дог-унца

Экспериментальные данные обрабать вали методом дисперсионного и регрессионного анализа на ПЭВМ с использованием пакета программ БИОСТАТ и STATGRAPHICS" а так ve по методикам оп>Оли кованным у рода автсрсо (Досгехсв Б А 1*179 3>Д1нДВ,1987 Ппсхнн СкийКА, 1970. Седгоискии А И идр 1982)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Трамсформщця льнд-долгунца с помощью ДргоЬя^Ргшт (ите{ас1еп5 на примере введения гена ЫРТ-И На сортах гьна долгунца Дашковскии 2 и Белинка проведена с^рия экспериментов го трансформации с исгогьзованием модельнь х песто ров А Клт^аоепэ штаммов 1.ВА 4404 (рВ1 121) и А 231 ( рЪВо 542 ) рОА 482 , несущих маркерный ген устойчивости к канамицину - ЫРТ-Н Изуча

лись три способа инокуляции эксплантов льна-долгунца агробактериями, лреусматривающие использование непораненных (Basiran N., 1987; Draper J., 1988; Mlynarova L., 1993), проколотых и с частично удаленным эпидермисом (McHughen А., 1989, 1991; 1992; Dong J-Z., 1991) гипоко-тильных сегментов.

Исследования показали, что наибольшей регенерационной способностью обладали трансформированные экспланты льна-долгунца с частично удаленным эпидермисом (табл.1). Было отмечено, что эффективность инокуляции гипокотильных сегментов льна-долгунца A. tumefaciens и дальнейшая регенерация на их основе зависит от продолжильности предкультивирования эксплантов на питательной среде, т.е от их возраста. Изучались экспланты трех возрастов: 7-8, 8-9, 9-10 дней. У гипокотильных сегментов льна-долгунца 7-8 дневного возраста очень легко удалялся эпидермис, не повреждая других слоев растительных тканей. Каллусогенез на их основе протекал достаточно активно и сопровождался образованием почек и побегов в среднем у 53 % трансформированных эксплантов.

Таблица 1.

Характеристика эксплантов льна-долгунца сорта Белинка в зависимости от способа инокуляции А. tumefaciens LBA 4404 pBl 121 (Km -. 100 мг/л, Сх - 200 мг/л, КЬ -200 мг/л, п = 70)

Способ повреждения г. с. * Длина г. е.. Получено г.с. с новообразованиями Образовалось почек, побегов, шт Рост каллуса, балл

мм шт % t 2 sp всего на 1 г.с. +

Без повреждений - 1-2 9 12.7+8.0" 9 1.0 ++

Удаление 50 % эпн- . дермиса 8-10 38 54.3*12.0" 44 1.2 +++

Прокалывание. 8-10 0 О О 0 +

Примечание: * г.с. - гипокотильный сегмент; ** - различия существенны при р = 0,05.

Состав питательной среды оказывал существенное влияние на процесс регенерации. Индукция почек и побегов на инокулированных А. Шпг^ааепэ гипокотилях льна-долгунца на селективной среде МБВб 2", была в среднем в 1,7 раза выше, чем на среде МЭ с таким же содержанием канамицина (50 мг/л).

При изучении действия антибиотиков на регенерацию растений . льна-долгунца при подборе селективных сред было установлено, что на

6 8 неделе от начала культивирования, все используемые антибиотики в разной степени ингибирсвали процесс побегообразовая В контроле выход регенерантов составил 71 % Добавление в среду 25 50, 100 и 200 мг/л Кт снижало выход регенерантов в 1,3 1,3. 5 5 и 50 раз соответственно Действие канамицина (Х1) на образование побегов было наиболее значимым (Н=0,90) и доказано из множественного линейного уравнения плоскости регрессии У= 65,2 - 0 36 XI - О 001 Х2 + 0,003 ХЗ Клафоран (Х2) и карбенициллин (ХЗ) практически не оказывали отрицательного влияния на индукцию побегов

В результате исследовании было выявлено что отбор предположительно трансформированных эксплантов льна долгунца эффективнее проводить на селективных питательных средах содержащих 50-100 мг/л канамицина 200 мг/л карбенициллина и 200 мг/л клафорана и получено 29 растении-регенерантов

Рис 1 ЫРТ-И-активность трансгенного »алл,са лъиа долгунца 1-экстракт бактериальных клеток содержащих КРТ-И 26-экстракты из ^трансформированных тканей льна (контрольные образцы) 3,4 5,- экстракты из каллусной ткани льна, грансфсрмированнь штаммом А 281 (р"ПВо 5-12) рвА 482 Г окстракт каллуснои ткани гербицидоустоичивой формы льна БТГ-ГУ-Ю (Р" х Дашюв-ский 2)

Поскольку селекция на канамицин не дает гогнси гарантии г обучения трансгенного каллуса и побегов после кугьгивирсвэнип на среде с канамицином их доголнительно проверяли на ЫРТII активность Из трех проанализированных образцов инфицированных плазмидои А 281 (РТ1В0 542) рОА 482. положительный сигнал давали два грансфор^знга (рис 1) В транс-енном каллусе (дорожки 3 4 5) ЫРТ-Н - активностью обладал белок с такой -ке эгектрсфоретичесхои гсдвижностью * ж и бактериальный фермент (дорожка 1)

2 3 4 5 6 7

Оценка устойчивости льна-долгуниа к канамииину и геобииидам

Экспресс-оценка льна в культуре ткани на устойчивость к канамици-ну_Гипокотильные сегменты длиной 8-10 мм, полученные от побегов, в стерильных условиях помещали на агаризованные питательные среды, содержащие 50-300 мг/л канамицина. В течение последующих 30-ти суток наблюдали за регенерационной активностью исследуемых экс-плйнтов. На основе эксплантов трансгенных форм льна (12, \А/, 6-1) на различных канамициносодержащих средах была отмечена повышенная морфогенетическая активность по сравнению с обычными сортами льна (Белинка, ЫогНп).

Таблица 2

Морфогенез льна на селективных средах (п=100) _

Концентрация канамицина, мг/л

Генотип 0 50 100 200 300 г Я

число почек и побегов, шт/эсп

.опыт 1

Белинка 1.35 0 0 0 О

Б-1 1.15 0.95* 0.25 0 0 -0.84 7069

12 1.65 1.00* 1.00* 0.70* 0 5* -0 89 7921

1.35 0.75* 0.25 0.20 0 -0.72 52.16

ЫогНп 1.20 0.05 0 0 0 -069 44 80

НСР 0.5 0 70 0.43 061 0.39

рпыт 2'

Белинка 1.45 0 0 О 0

12 1.50 1.10* 080* 0 80* 0.60* -0.84 70.25

Р1 12 X Белинка 1.25 0.25 0 0 0 -069 47 60

П 12 X Белинка 1.45 0.40* 0.35* 0 0 -074 54.66

Р1 Белинка X 12 1.35 0.35 0.25* 0 0 -0.78 61.18

Р2 Белинка X 12 1.40 0.20 0.15 0 0 -0.68 46.10

НСР 0.5 0.40 0 24

Примечание: * - достоверно на 5% уровне.

Особенно выделялась форма 12. Индукция новообразований на основе ее эксплантов была самой высокой. Даже при наличии в питательной среде 200-300 мг/л канамицина, на каллусе образовывались почки и

побеги (табл 2) У формы Б-1 полученной в результате трансформации сорта льна-долгунца Белинка А Шгт^ааепэ штамма 1.ВА 4404 РВ1121, почки и побеги образовывались на среде, содержащей 50 мг/л и 100 мг/л канамицина У сортов льна Белинка и Ыог1т регенерация наблюдалась только в контроле

При тестировании гибридов льна первого и второго поколений комбинаций 12 х Бе инка и Белинка х 12 , а также их родительских форм (Белинка и 12) было отмечено что наибольшая регенерационная активность при культивировании плпокотилей на селективных средах наблюдалась у исходной трансгенной родительской формы 12 (табл 2)

У другого родителя (Белинка) она отсутствовала а у гибридов льна первого и второго поколений обеих комбинации была зафиксирована промежуточная реакция на канамицин На основе их гипокотильных сегментов при наличии в среде 50 мг/л и 100 мг/л канамицина формировался плотный каллус светло-зеленой окраски а на нем - почки и побеги Такая реакция у гибридов льна на действие канамицина свидетельствует об экспрессии у них гена канамициноустойчивости (ИРТ-П), преданного от устойчивого родителя (12)

Экспресс оценка льна на устойчивость к канамицину и гербицидам при проращивании семян Одним из эффективных в селекции является метод отбора на стадии проростков (Кутузова С Н 1993 Хотылева Л В 1989, Войтехова В А, 1967), который на самых ранних стадиях онтогенеза позволяет отбирать нужные селекционеру генотипы Исходя из этого, семена трансгенных генотипов льна проращивали на растворах с канамицином (500 мг/л 1000 мг/л) или гербицидами (50-200 мг/л) Пре-парат-1, Метрон

Концентрации канамицина подбирались экспериментально а гербицидов - исходя из оптимальной дозы рекомендованной к применению (10 г/га по д в) В контроле семена проращивали на стерильной дистиллированной воде На седьмые сутки проводили учет проросших семян

При прорастании семян на растворе канамицина с концентрацией 500 мг/п у сортов льна Белинка Дашковский 2 Р-736, ^сСгедог, МогЬп было отмечено снижение их всхожести по отношению к контролю в среднем на 50 % Увеличение селективной нагрузки в два раза привело практически к полной потере всхожести у перечисленных сортов

У трансгенных форм 12 V/ и I. при наличии 500 мг/л канамицина, всхожесть семян была на уровне 83-92 % а при 1000 мг/л канамицина -60-88 % Аналогичная тенденция по устойчивости изучаемых генотипов просматривалась по длине «■орешков

Оценка гибридов первого и второго поколения комбинаций 12 х Бе пинка и Белинка х 12 а также их родительских ферм показала, что у ус

Концентрация канамицина, мг/л

Ш -0 1=1 - 500 -1000

Рис 2 Влияние канамицина на всхожесть семян л на у гибридов первого и второго поколений (л = 200)

Концентрация Препарата -1 мг/л Ш 0 |=1-100 £52-200

Рис 3 Влияние Препарат -1 на всхожесть семян у гиб-

рилсэ льна (п = 2СЗ)

тойчивых родителей и у устойчивых гибридов наблюдался один тип реакции на действие канамицина и хлорсульфурона (Препарат-1). Потеря всхожести их семян на фоне антибиотика по отношению к контролю была на уровне 25 % (500 мг/л Km) и 45 % (1000 мг/л Km). У исходного сорта льна-долгунца Белинка, она была равна нулю (рис. 2).

На растворе 100 мг/л Препарата-1 у гибридов F1 12 х Белинка и F2 12 х Белинка всхожесть семян была соответственно 76 % и 73 %, а у гибридов F1 Белинка х 12 и F2 Белинка х 12 была одинаковой и составляла 72 % (рис. 3). При наличии в растворе 200 мг/л Препарата-1, всхожесть семян у гибридов F1 и F2 в комбинации 12 х Белинка была на уровне исходного устойчивого родителя (12) и равнялась 69 %, а в обратной комбинации Белинка х 12 соответствовала 50 %. Такая реакция гибридов на действие канамицина и Препарата-1 указывает на наличие у них устойчивости к канамицину и хлорсульфурону, переданную им от устойчивых трансгенных родителей.

Данные исследования позволили отобрать из 32 изучаемых форм льна - 18 устойчивых к хлорсульфурону. Их семена, проросшие на растворе с концентрацией 200 мг/л Препарата -1 укореняли в лочву и выращивали до получения семян, которые в последствие подвергали повторной оценке с целью отбора более устойчивых к гербициду форм.

В результате чего было выделено 7 высокоустойчивых к хлорсульфурону форм льна (БТЛ-ГУ-1, БТЛ-ГУ-2, БТЛ-ГУ-3, БТЛ-ГУ-4, БТЛ-ГУ-6, БТЛ-ГУ-7, БТЛ-ГУ-10), некоторые из них также показали повышенную устойчивость к метсульфуронметилу при проращивании на растворах с концентрациями 100-200 мг/л Метрона.

Оценка форм льна-долгунца на устойчивость к гербицидам группы хлорсульфу - рона в вегетационном опыте. Потомство растений, прошедших тестирование на гербицидоустойчивость в лабораррых условиях, изучали в вегетационном опыте на фоне гербицида.

Исследования позволили выявить, что самым жестким фоном для отбора форм льна с повышенной устойчивостью к хлорсульфурону было внесение 50 г/га (по д.в.) Препарата-1 в почву перед посевом и обработка растений в фазу "всходов" (1-2 см). Была подтверждена повышенная устойчивость к гербициду у форм БТЛ-ГУ-1, БТЛ-ГУ-2, БЛТ-ГУ-3, БТЛ-ГУ-4, БТЛ-ГУ-5, БТЛ-ГУ-6, БТЛ-ГУ-7. В данных условиях у перечисленных образцов общая высота растений снизилась в.среднем на 10 %, а число семян с одного растения и содержание волокна в стебле остались на уровне контроля (табл. 3). Рост растений исходных родительских и стандартных сортов льна-долгунца был почти полностью ингибирован действием гербицида. Лен плохо всходил, наблюдалась гибель проростков, отмечался хлороз листьев, резкая задержка в росте и развитии. В даль

не^ием от основания стебля отрастали очень слабые и низкорослые с уменьшенным соцветием редкими листьями гобеги На стебге сформировалось не более 1 коробочки

Таблица3

Характеристика растений льна подвергшихся предпосевной ооработке Препаратом-1

1995 г

Лии Чис Выс" Гехн Масса Число Чис о Масса Сл ер

I ен » Пре- растен та рас ДТина, гехн коро сеччн с ВО 1С к -к.шие

и п парата 1 ! ыг ген» и р-сг час и оочек с 1 раст, на, мг во к

- 1 СИ сМ рай г 1 рзег шг »и в

I 1.1 мг шт стс е %

\ 0 17 -О! 23 5 144 0 2Х 4

Г 27 0 1»0 ПО 0 2 0 0

22 3 25:

Ы! ° I ) 5 ч -яо 2 470 121 о 27

1 ' Н см ; М 1 ? а 4 -0 2 224 1 24 2

Н(ГО< 4 1 «,»

|гг, I) МО (л 0 ' 8 57 3 1 « X 2^1 ^

I1" Ч) ; > 1-й, <<ь 7 10 7 74 1 1Ч| 4 24 0

1 но* к 1-1 ч, ? I) 10 ч 5 2 1«.

Примьчание * - семена льна-долгунца ссрта Агексим не гроросли ** -достоверно на 5с 5 урезне

У отиссителоно устойчиеь.х Прегарату-1 трансенных ферм гьна в цегс< сС.^ая вь сота растении сиизигась на 20 30 а се\»ен«ая гро-д>\п»энссть с 1 растении нз ?3 Из них на данном селективном среие наряд/со сл?*5ь VI* нсустс.<чизь и/ б >ги отобраны единичное высо-►ср^сг^ерастения котср& а в экстремальных условиях не снижали свою гред^тивнесть по семенам и вогс<ну в сравнении с контролем (табл 4) Та«, Сьто заменено что очи превосходили типичные растения в кон-троге го массе технической части и семенной продуктивности что было

Таблица 5

Характеристика растений формы льна-долгунца БТЛ-ГУ-10-1, подвергшихся лослевсходовой обработке гербицидом Преларат-1 <п=20). 1996 г.

Конц-я Высота Технич. Масса Число Число Масса Содер-

Генотип Препа- расте- длина техн. коробо- семян с волок жание

рата - нин.см растен.. часн чек с 1 1 рас- -на. волокна.

1. г/га см раст.. расте- тения. мг %

мг ния, шт. шт.

Алекам 0 90.8 73.6 1012.5 10.0 643 354.3 35.0

50 32.0 29.0 110.5 0 0 - -

А-29 0 84.2 70.2 877.5 8.1 60.2 297.3 34 0

50 280 23.0 104 6 0 0 - -

ШНУ- 0 87.7 79.9 841.0 11.3 73.5 267.5 31.8

I0-I 50 64.7* 49.9* 734.9* 12.1 89.7 224.2 30.5

НСР 0.5 28.5 19.5 283.5

F 5.2 2.3 89

Примечание: * -достоверно на 5 % уровне значимости при сравнении на фоне гербицида (Рг=2,09).

Таблица 6

Коэффициенты корреляции (г) для сравнительной характеристики методов оценки на гербицидоустойчивость. >

Сравниваемые методы оценки г tr

По ре-^нерационной способности гипокотильных сегментов-по всхожести семян 0.77*' 2.96

По регенерационной способности гипокотильных сегментов-по продуктивности растений 0.68* . 2.95

По всхожести семян - по продуктивности растений 0.65* 2.70

Примечание: * - достоверно на 5 % уровне (Гг =2.37)

Таблица 7

Характеристика л/1 .ых герсицидо/стойчлеых форм льна долгунца по ссновным хозяйстаенно-ценным приемлем 1СС5'

Ои.са рд СЧИИ 7еч>1 ^ «¿.я - /«к*. ^ течниче си -ы части, Число кориб-чгк с 1 растем, Число семян с I растения Содержз ше волокна.

Гепг*хт си 1 '» К ' 4 дл •V /гте л См '» * лСХ * я гено мг °> к исх долгунц роактеню шт °»к исх дспгунц родтено шт % «исх долгунц рг 1 пелю % к исх долгунц родителю

БТ1 Г>-1-1

(Ге. м»» X 73 3 92 4 £50 «3 326 0 1002 23 1150 95 1С4 0 24 6 86 3

ЬПГУ-4 1

(Белина \ XV) ¿з 1 ?< ? 64? »0 287 0 83 2 2 1 1050 14 0 1538 24 4 856

5ТЛ ГУ 6-1

(12 X Белими) 6< 3 £2 3 61 » £52 238 8 73 8 22 1100 12 5 1374 23 8 85 3

Бвтлни 79 3 41 0 335 6 22 91 28 5

БТЛ ГУ-10-1

(Дглг 2 XV) 75 3 > и * "3 3 92 6 3175 97 3 30 107 1 20 5 1666 28 9 94 4

БТЛ ГЛ-3-1

(\ухдллс :> 76 4 93 6 71 1 93 7 356 0 121 3 38 1357 23 3 1894 26 2 856

Д»и;гоз.тЯ 2 316 75 9 326 2 28 12 3 30 6

\У «2 53 0 274 3 24 150 22 6

12 (57 О 7 2 >5 0 23 14 7 19 3'

Ал[1£им(!!) 74 6 61 С 335 6 22 13 2 36 7

Сравнение различных методов оценки сортов и форм льна-долгунца на гирбицидоустойчивость свидетельствует о том, что ее можно осуществлять как вегетационным, так и лабораторным методами. Коэффициенты корреляции составили 0,77; 0,65; 0,68 (табл.6).

Изучение гербицидоустойчивых форм льна-долгунца по основным хозяйственно-ценным признакам

Лучшие формы льна, отобранные из Я4 и Р5 по устойчивости к хлорсульфурону были оценены по хозяйственно-ценным признакам в условиях луночного посева (табл. 7). Стандартом являлся сорт льна-долгунца Алексим. При сравнении с исходными сортами льна-долгунца было отмечено, что гербицидоустойчивые формы уступают им по общей высоте на 8-17 %, а по массе технической части растений некоторые из * них (БТЛ-ГУ-1-1) находятся на уровне или несколько превосходят (БТЛ-ГУ-3-1) долгунцовых родителей. По отношению к стандарту, они уступали по высоте в среднем на 2-12%, а некоторые (БТЛ-ГУ-7-1, БТЛ-ГУ-18-1, БТЛ-ГУ-10-1, БТЛ-ГУ-3-1) были на его уровне. По семенной продуктивности у всех гербицидоустойчивых форм наблюдалось преобладание урожайности семян с одного растения по отношению к исходным родителям льна-долгунца и стандарту в среднем на 50 %. Содержание волокна в стебле у гербицидоустойчивых форм по сравнению с долгунцовыми родителями было несколько ниже (на 15-25 %) и в среднем составляло 26,0 %. У формы БТЛ-ГУ-10-1 (\Л/ х Дашковский 2) было на уровне 28.9 %. Такое содержание волокна в стебле растений, позволяет отнести их к долгунцовому типу.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Созданы формы с повышенной устойчивостью к канамицину и гербицидам группы хлорсульфурона, не уступающие по продуктивности стандартному и родительским сортам льна-долгунца, которые могут использоваться в качестве исходного материала в селекции.

2. Проведена трансформация льна-долгунца с помощью А. Шп^асюпз на примере введения маркерного гена ЫРТ-И, придающего растениям устойчивость к канамицину. Получены растения-регенеранты. Экспрессия введенного гена доказана наличием активности неомицин-фосфотрансферазы II (ЫРТ-И).

З.Отимизированы условия получения трансгенных растений с помощью A. tumefaciens применительно ко льну-долгунцу: определены условия (способ инокулирования, возраст эксплантов, состав питательной среды и режим ее стерилизации) для повышения регенерационной активности тканей in vitro; подобраны концентрации канамицина (50 мг/л и 100 мг/л), клафорана (200 мг/л) и карбенициллина (200 мг/л), позволяющие эффективно вести отбор трансгенных эксплантов.

4. Разработана методика экспресс-оценки в культуре ткани, с помощью которой на фоне 50-200 мг/л канамицина можно отбирать устойчивые генотипы льна.

5. Использование методики экспресс-оценки при проращивании семян на растворах канамицина (500 мг/л, 1000 мг/л) или гербицидов: Препарат-1 (100-200 мг/л), Метрон (50-100 мг/л) способствует отбору устойчивых форм льна.

6. Изучение растений льна с использованием жесткого гербицидно-го фона (50 г/га (по д.в.) Препарата-1, внесенного в почву перед посевом, и в период "всходов") позволило выделить формы с повышенной устойчивостью к хлорсульфурону, а из относительно устойчивых - отобрать единичные растения с повышенной продуктивностью. В результате обработки гербицидоустойчивых форм льна-долГ/нца Препаратом-1 в дозе 75 г/га (по д.в.) в фазу "елочки", получены жизнеспособные растения, которые формировали семена.

7. У устойчивых родительских форм и устойчивых гибридов льна, при оценке в культуре ткани, проростков семян и вегетирующих растений, наблюдалась одинаковая реакция на действие селективного агента (канамицин, Препарат-1. Метрон), что свидетельствует о передаче генов устойчивости к канамицину (NPT-II) и гербициду (ALS) от трансгенных родителей гибридам. Трансгенная природа гербицидоустойчивой формы льна БТЛ-ГУ-10 доказана наличием активности неомицин-фосфотрансферазы II (NPT-II).

8. При скрещивании сортов льна-долгунца с трансгенными формами масличного льна, общая высота растений у гибридов первого поколения наследовалась промежуточно, уклоняясь при этом в сторону высокорослого родителя, а по семенной продуктивности в сторону высокоурожайного по семенам. Содержание волокна в стебле чаще всего наследовалось по типу неполного доминирования, уклоняясь при этом в сторону менее волокнистого родителя.

9. Оценку образцов по устойчивости к гербицидам можно осуществлять как вегетационным, так и лабораторным методами (in vitro).

Предложения для селекционной практики

1. Для создания сортов льна-долгунца, устойчивых к гербицидам группы хлорсульфурона в качестве исходного материала использовать формы: БТЛ-ГУ-1, БТЛ-ГУ-2, БТЛ-ГУ-3, БТЛ-ГУ-4, БТЛ-ГУ-5, БТЛ-ГУ-6, БТЛ-ГУ-7, БТЛ-ГУ-10 и др.

2 Для повышения эффективности селекционнной работы при создании устойчивых форм льна-долгунца использовать методику оценки на селективных фонах при проращи-вании семян (100-200 мг/л Препарата-1; 50-100 мг/л Метрона) и вегетирующих растений (50 г/га по д.в. Препарата-1, внесенного в почву перед посевом или в фазу "всходов").

3. Использовать в селекционной практике адаптированный ко льну-долгунцу метод получения трансгенных растений, основанный на генетической трансформации АдгоЬайегшт илпеГасюпз.

'1. Поляков A.B., Чикризова О.Ф. Влияние ауксинов на ризогенез у побегов льна // Сб. научн. трудов ВНИИЛ.- Торжок. 1991,- № 27,- С.20-23.

2. Поляков A.B., Чикризова О.Ф. Влияние способа стерилизации питательной среды и регуляторов роста на морфогенез льна-долгунца в культуре ткани II Сб. научн. трудов ВНИИЛ.- Торжок, 1994,- № 28.-С.131-135.

3. Чикризова О.Ф. Выделение растительной и плазмидной ДНК для злектропорации льна // Сб. научн. трудов ВНИИЛ,- Торжок, 1994.- № 28.-С.135-138.

4. Чикризова О.Ф., Поляков A.B., Кудрявцев H.A. Создание генои-сточников льна-долгунца, устойчивых'к гербицидам // Тёз. докл. Всероссийского съезда по защите растений " Защита растений в^ условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность " ( Санкт-Петербург, декабрь 1995г. ).- Санкт-Петербург, 1995.- С.268.

Чикризова О.Ф., Поляков A.B. Оптимизация условий получения трансге>Ч':'х растений льна-долгунца, устойчивых к гербицидам группы хлорсульфурона // Сельхоз. биология,-1996.- № 3,- С. 117-121.

б.Чикризова О.Ф., Поляков A.B., Кудрявцев H.A. Оценка устойчивости льна к хлорсульфурону на селективных фонах, получение генои-сточников по этому признаку // Агрохимия.-1997,- №1.- С.72-75.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Объем 1 п л

Заказ 174

Тираж 100

Типография Издательства МСХА 127550 Москва И 550, Тимирязевская ул , 44