Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия генотипов растения и бактерии при получении форм картофеля, устойчивых к колорадскому жуку

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия генотипов растения и бактерии при получении форм картофеля, устойчивых к колорадскому жуку"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

БОГОМАЗ Денис Игоревич

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕНОТИПОВ РАСТЕНИЯ И БАКТЕРИИ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ФОРМ КАРТОФЕЛЯ, УСТОЙЧИВЫХ К КОЛОРАДСКОМУ ЖУКУ

специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук

Лутова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Медведев Сергей Семенович

кандидат биологических наук Брач Нина Борисовна

Ведущее учреждение: Всероссийский Научно-Исследовательский

Институт Биологической защиты растений

Защита состоится "/.У _ 2004 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбТУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Разработка эффективных методов регенерации, изучение процессов морфогенеза in vitro особенно необходимо для важнейших сельскохозяйственных культур. Это обусловлено тем, что данные процессы лежат в основе фактически всех современных биотехнологических методов - будь то клональное микроразмножение, оздоровление посадочного материала, клеточная селекция или трансформация. Ранее в литературе многократно обсуждался вопрос о зависимости процессов регенерации in vitro от генотипа.

Показано также, что и интенсивность трансформации определяется генотипом растения и зависит от штамма бактерии, с помощью которого осуществлен этот процесс. Однако, работы, посвященные изучению взаимосвязи явлений: трансформация - генотип растения- штамм бактерии были выполнены в основном с использованием разнообразных штаммов агробактерий дикого типа. В настоящее время, когда в мировой практике стоит проблема получения трансгенных растений, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам среды, все еще остаются нерешенными вопросы о роли сорта и коммерческих штаммов, во всем их многообразии, в эффективности трансформации. Хорошо известно, что в результате трансформации даже в пределах одной пары сорт — штамм можно получить широкий круг изменчивости, как результат случайного встраивания Т-ДНК в геном растения. Поэтому, для получения трансгенного растения с заданными свойствами необходимо иметь большое число трансгенных растений, среди которых возможно было бы провести направленный отбор.

Все выше сказанное указывает на необходимость, проведения исследований направленных на выявление факторов, определяющих эффективность трансформации, к которым в первую очередь следует отнести подбор генотипа растения, штамма бактерии (вектора), а также условий и конкретных методов эксперимента, таких как питательная среда, тип экспланта. Выполнение работы было поддержано грантом CRDF (ST-012-0), индивидуальным грантм Министерства образования РФ (2003 г.), Мэрии С-Петербурга(2001 г.).

ель и задачи исследования. елью работы явилось - изучение взаимодействия: генотипа растения и штамма бактерии, при получении растений, устойчивых к колорадскому жуку посредством трансформации генами Bt токсина (Bacillus thuringiensis) и ipt (Agrobacterium tumefaciens). В задачи работы входило:

1. Изучение внутривидововой изменчивости по способности к регенерации in vitro среди сортов рекомендованных к возделыванию в Ленинградской области и выявление условий при которых этот процесс максимально выражен.

2. Изучение изменчивости по интенсивности трансформации сортов картофеля в зависимости от штамма

, И ос. национальная

I библиоткка

! jygfcflf

3. Получение коллекции трансгенных растений картофеля, на основе сортов, рекомендованных к возделыванию в условиях Ленинградской' области, несущих бактериальные гены npt II, ipt;Bt.

4. Анализ форм из коллекции трансгенных растений картофеля по устойчивости к колорадскому картофельному жуку.

Научная новизна работы. Впервые проведено детальное описание регенерационной способности клубневых дисков сортов картофеля, рекомендованных к возделыванию в Северо-Западном регионе: выявлена внутривидовая изменчивость сортов картофеля по признаку «тип каллуса»; выявлена изменчивость по способности к побегообразованию разных сортов и зависимость этого признака от типа каллуса. Выявлена изменчивость среди сортов картофеля по способности к трансформации. Показано, что сорта, интенсивно* регенерирующие in vitro, также характеризуются высокой способностью к трансформации. Кроме того, показана, зависимость трансформации от штамма бактерии. Получена коллекция трансгенных растений на основе сортов Невский, Елизавета, Чародей; среди них выявлены формы с повышенной устойчивостью к колорадскому жуку.

Практическая ценность. Характеристики сортов картофеля, возделываемого в Северо-Западном регионе по регенерационной способности при трансформации различными штаммами агробактерий могут быть использованы при получении трансгенных растений этих сортов с новыми генами. Полученные формы с повышенной устойчивостью к колорадскому жуку могут быть использованы для возделывания в условиях СевероЗападного региона.

1. Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференциях: Биотехнология — возрождению сельского хозяйства в России в XXI веке. (С-Петербург, 2001г.), Biotechnology approaches for exploitation and preservation on plant resources"(Yalta. Ukraine, 2002.), "Трансгенные растения -новое направление в биологической защите растений" (Краснодар. 2002) XI International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions(Samt-Petersburg, Russia 2003), VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология»( Саратов, 2003 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материал, методы и результаты исследования, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 117 источников (из них 102 на иностранных

языках) и приложения. Работа изложена на 144-ех страницах и содержит 34 рисунка и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ В работе использованы сорта картофеля Solarium tuberosum, рекомендованные к возделыванию в Северо-западном регионе - Невский, Елизавета, Чародей, Сайте, Луговской, Рождественский (материал любезно предоставлен Северо-Западным НИИСХ). В работе также использовали растения табака (Nicotiana tabacum) в качестве негативного контроля при проведении П Р.

В работе использовали штаммы Agrobacterium tumefaciens, характеристики которых представлены в таблице 1. Штаммы любезно предоставлены профессором Онджеем M.(Institute of Molecular Biology, Czech Republic), профессором Шеллом Д. (Max Plank Institute, Germany) и Шемякиным М. (Институт сельскохозяйственной биотехнологии, Москва).

Таблица 1.

Название штамма Гены устойчивости к селективным агентам Переносимы e целевые трансгены Источник получения

pGV 3850 Кшг NptII — Онджей М.'

pGV 3850 Тг4 NptII ¡Pt Онджей М."

pGV 3850/941 Kmr NptII Шелл Д.

pGV 3850/941tf NptII Bt Шемякин М.

A4 tf Rijr NptII Bt Шемякин М.

Для получения асептических эксплантов и растений in vitro использовали клубни. В условиях ламинарного бокса клубни обрабатывали 70%-ным спиртом в течение 5 минут, затем стерилизовали концентрированной перекисью водорода 20 минут или 15% раствором коммерческого препарата "Доместос" - 30 минут и промывали стерильной дистиллированной водой. От стерильных клубней получали клубневые диски и асептические растения. Регенерацию у картофеля индуцировали у двух типов эксплантов: клубневых дисков и отрезков междоузлий. Клубневые экспланты помещали на среду Мурасига-Скуга (МС) с различными концентрациями, фитогормонов - (табл. 2). Культивирование проводили в условиях 16-ти часового светового дня. Учеты проводили на 31 день эксплантации.

Агробактериальную трансформацию картофеля проводили с использованием клубневых дисков в качестве эксплантов. В 20 мл среды LB с антибиотиками (рифампицина 50 мкг/мл, канамицина 50 мкг/мл), добавляли 1,5-2 микробиологические петли коллоний агробактерий (10б бактерий) и инкубировали на качалке с круговым вращением с частотой 200 об/мин и амплитудой 40 мм, в течение 16 часов при температуре 24°С.

Варианты сред МС, использованные в исследованиях.

Таблица 2

Инокуляцию осуществляли на 3-4 день культивирования эксплантов неразведенной суспензией агробактерий. Кокультивацию с бактерией проводили, в течение суток на питательной среде МС с различными фитогормонами (табл. 2), далее экспланты помещали на ту же среду с канамицином в концентрации 100 мг/л и клафораном в концентрации 500 мг/л. Для контроля использовали неинокулированные экспланты. Через каждые 7 дней экспланты переносили на свежую среду с антибиотиками, уменьшая концентрацию клафорана к 3 пассажу до 100 мг/л. Регенерировавшие побеги отделяли и помещали на среду МС с канамицином в концентрации до 200 мг/л. Устойчивые к канамицину побеги черенковали и помещали на среду MC0.

Часть вегетативного потомства растения-регенеранта использовали для выделения ДНК методом Дрейпера и Скотта (1991) для доказательства его трансгенной природы методом полимеразной цепной реакции (П Р). Другую часть поддерживали in vitro и далее (в случае позитивного результата П Р) переводили in vivo.

Для проведения П Р использовали праймеры к гену nptII, определяющему устойчивость трансгенных тканей к канамицину:

L:GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGAC;

R:CACCATGATATTCGGCAAGCAGGC, синтезированные компанией Синтол (Россия).

Объем реакционной смеси для П Р составлял 50 мкл. В ее состав входили 300 нг матричной ДНК, 2,5 U Taq полимеразы (Sileks M), буфер, предложенный фирмой-производителем фермента, 200 мкМ каждого dNTP и

250 пкМ каждого праймера. П Р проводили по программе: 1 цикл - 5 мин 93°С, 35 циклов - 5 сек 93°С, 30 сек 50°С,45 сек 72°С, 1 цикл - 5 мин 72°С. Электрофорез проводили в 1% агарозном геле с буфером ТВЭ или ТАЭ. В качестве маркера молекулярных весов использовали 100 bp ladder (СибЭнзим, Россия).

Оценку устойчивости полученных форм картофеля к колорадскому картофельному ЖУКУ проводили на базе Всероссийского Института Биологической Защиты Растений г. Краснодар, согласно " Методическим рекомендациям по изучению и оценке форм картофеля на устойчивость к колорадскому жуку" (Шапиро и др., 1993).

Статистическую обработку данных проводили согласно рекомендациям (Лакин,1990; Терентьев, Ростова, 1979). Расчитывали процент эксплантов с каллусами и побегами in vitro, а также процент пораженных колорадским жуком тканей растений in vivo, и их доверительные интервалы. В работе использовали критерий как критерий однородности для проверки согласия

экспериментальных данных между собой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Характеристика сортов картофеля in vitro по регенерационной способности. Сорта картофеля Невский, Елизавета, Санте, Луговской, Чародей, Рождественский охарактеризованы по признакам каллусо- и побегообразование на эксплантах клубневых дисков и участках междоузлий. Нами произведена классификация каллусов по их морфологическим признакам и способам возникновения (табл. 3).

Таблица 3 .

Классификация каллусов по морфологическим признакам и способам

возникновения.

, Зачаток каллуса ^ д

Наплыв Полусфероид JX Сфероид £

Опушенный Наплыв Пальцевидный сфероид Грибовидный Сфероид

Данные типы каллусов изображены на фото 1-5. В наших экспериментах отмечены также и более сложные, смешанные типы каллусов (фото 6). В

таблице 4 приведены количественные характеристики сортов по типам каллусов, формирующихся на клубневых дисках. Показано, что тип каллуса в первую очередь определяется сортовой принадлежностью экспланта. Доказательством этого служит наличие сортоспецифичных типов каллуса, так опушенный наплыв наблюдался только на эксплантах сорта Рождественский, грибовидный каллус формируется на эксплантах сорта Луговской. Кроме того, проявляется зависимость типа каллуса от гормонального состава питательной среды.

Фото 1. Каллус - наплыв

Фото 2. Каллус - полусфероид

Фото 3. Каллус-грибовидный сфероид

Фото 4. Каллус-пальцевидный сфероид

Фото 5. Каллус- сфероид

Фото 6. Каллус сложной формы.

Таблица 4.

Процент встречаемости различных типов каллусов на эксплантах сортов картофеля.

Сорт

1

Среда

Невский

'ПУсфероид 14+4,9

ПУсфероид 24+4,9

ПУсфероид 13+5,0 2Смешан. 9±5,1

ПУсфероид 23+4,7

ПУсфероид 18+4,8

Луговской

ПУсфероид 7+5,3 Сфероид 10±5,2

ПУсфероид 20+4,9 Сфероид 3±5,6-

Сфероид 12+5,1 Гриб.сфер. 8+5,2

Сфероид 20+4,8 Гриб.сфер. 3+5,6

3Гриб.сфер. 16+5,0'

Елизавета

Сфероид 24+5,6

Сферовд 21+5,7

Сфероид 18+5,8

Сфероид 24+5,5

Сфероид 13±6,0

Сайте

Наплыв 40±4,9

Наплыв 13+5,9

Наплыв 16+5,8-

Наплыв 27+5,4-

Смешан. 4+6,5

Рождественский

Наплыв 16+5,8

4Опуш.напл. 23+5,5

Опуш.напл. 9±6,1

Сфероид-30+5,2

Сфероид 23+5,5-

Чародей

Сфероид 9+6,5

Сфероид 33+4,9-

ПУсфероид 14,0+6,2

Сфероид 17+6,1

ПУсфероид 27,2+5,7

'П./сфероид - полусфероид; 2смешан. - смешаный; Згриб.сфер - грибовидный сфероид;

4

опуш.напл — опушенный наплыв.

Регенерация побегов на клубневых эксплантах in vitro. У большей части эксплантов регенерация происходила из каллуса. Однако, в некоторых случаях регенеранты формировались прямо на поверхности экспланта, минуя стадию каллусообразования. Количественные характеристики регенерационных процессов у двух контрастных по данному признаку сортов картофеля представлены на диаграммах (рис. 1). Интенсивность регенерации определялась типом каллуса, из которого формировались побеги. Наиболее выраженными побегообразующими свойствами обладал каллус типа "полусфероид" (65% регенерантов) в меньшей степени "опушенный наплыв"(25% регенерантов) и "сфероид" (23% регенерантов). Таким образом, нами впервые описана связь между признаками "интенсивность регенерации" и типом каллуса для картофеля. Наличие такой связи позволяет уже на ранних этапах каллусообразования отбирать сорта с интенсивным типом регенерации. Наибольшей регенерационной способностью характеризовался сорт Невский. Интересно отметить практически полное отсутствие способности к регенерации

на эксплантах клубневых дисков у сортов Луговской и Сайта. Они образовывали каллусы типа "наплыв", "сфероид" и "грибовидный сфероид". На каллусах этого типа регенераты формировались лишь в единичных случаях. Остальные сорта характеризовались промежуточным проявлением исследуемого признака.

Рис. 1. Каллусо- и побегообразование на эксплантах клубневых дисков у сортов картофеля Невский и Сайте на разных средах

Получение трансгенных растений картофеля с генами Bt и ipt. В экспериментах по агробактериальной трансформации использовали среду с 3 мг/л БАП. Мы предполагали, что у сортов с минимальной способностью к регенерации с помощью трансформации геном ipt удастся максимально повысить этот показатель. Поэтому в экспериментах по трансформации мы использовали штамм с геном 1р1, с помощью которого в трансгенных растениях можно повысить уровень цитокининов. Следует напомнить, что по литературным данным формы с повышенным уровнем цитокининов, обладают повышенной устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды. При трансформации штаммом с геном 1р1, регенерация и отбор трансформантов проводились на среде MS0 без добавления гормонов.

В качестве селективного агента для отбора трансгенных растений в среды для регенерации добавляли канамицин, а для подавления роста бактерий -клафоран. Контрольные экспланты помещали на те же среды, но без обработки их суспензией агробактерий. Регенерация картофеля в контроле была практически полностью подавлена из-за присутствия канамицина в питательной среде. В различных вариантах опыта регенерация протекала с различной интенсивностью.

В условиях эксперимента на эксплантах всех сортов при трансформации использованными штаммами, наблюдали высокий процент каллусообразования, который колебался в среднем от 40 до 90%. Наиболее важным в данных опытах, является способность к регенерации побегов. В зависимости от штамма, которым была осуществлена трансформация, сорта значительно различались по регенерационной способности. Как и в предыдущих экспериментах

максимальной регенерационной способностью характеризовался сорт Невский (рис. 2). Процент побегообразования, например, при трансформации штаммом с геном, определяющим устойчивость к канамицину, достигал 100. Относительно высокий процент побегообразования также наблюдался у сортов Елизавета и Рождественский (рис. 3,4).

Экспланты сортов Сайта (рис. 5) и Луговской, формировали лишь единичные побеги при трансформации, как и в случае экспериментов по регенерации in vitro.

Таким образом, ранее проведенный нами отбор генотипов по регенерационной способности является важным этапом при подборе сортов для трансформации, особенно если целью экспериментов является получение максимального числа трансформированных растений. В литературе неоднократно отмечалось, что растительные клетки компетентные к регенерации оказываются компетентными и для трансформации (Шарова 1992)

Рис. 2. Процент клубневых эксплантов сорта Невский, образующих каллусы и побеги при трансформации штаммами Agшbacterшm tumefaciens.

Полученные в экспериментах по трансформации побеги, были укоренены на среде МСО. В ходе укоренения и перенесения растений в условия теплицы и поля нам не удалось сохранить все трансгенные растения. Однако, мы. получили небольшую коллекцию трансгенных растений, содержащих различные бактериальные гены (табл.5). От 15 трансгенных растений получено клубневое потомство.

□ эксл. с калл. В эксл. с лоб

штаммы

Рис. 3. Процент клубневых эксплантов сорта Рождественский, образующих каллусы и побеги при трансформации различными штаммами А§шЬас1;егшт ШтЫкаеиз.

Рис. 4. Процент клубневых эксплантов сорта Елизавета, образующих каллусы и побеги при трансформации штаммами Agrobacterium ШтеГашет.

Рис. 5. Процент клубневых эксплантов сорта Санте, образующих каллусы и побеги при трансформации штаммами ^гоЬайегшт Ште1ашет.

Для доказательства трансгенной природы полученных растений, кроме их предварительного отбора на селективных средах, проведена П Р с праймерами к гену прШ, цифрами обозначены исследованные трансгенные растения (фото 7). В ходе реакции выявлен П Р фрагмент соответствующий таковому в позитивном контроле (около 600 пн). В негативном контроле фрагмент не синтезировался. Данный эксперимент подтверждает трансгенную природу исследованных образцов.

Фото 7 Результат ПЦР на матрице ДНК трансгенных растений картофеля с праймерами к гену прШ.

Таким образом, в ходе экспериментов выявлена изменчивость среди сортов картофеля по способности к трансформации. Кроме того, показана зависимость

эффективности трансформации от штамма бактерии. В экспериментах, проведенных в нашей лаборатории ранее уже было показано, что характер и интенсивность трансформации зависят от штамма агробактерии (Лутова и др., 1998). К такому же выводу пришли и другие исследователи (Yanofsky et al.,1985). Однако, в ранних экспериментах были использованы агробактериальные штаммы с плазмидами дикого типа. В наших экспериментах использованы штамы, несущие плазмиды с различными бактериальными генами. Тем не менее, результаты повторились - интенсивность трансформации определяется не только генотипом растения, но и штаммом бактерии.

Таблица 5

Количество трансгенных растений картофеля, полученных на основе агробактериальной

трансформации.

Сорт Трансгены Количество линий

Невский 0 4

Bt 2

Ipt 2

Чародей Bt 1

Ipt 3

Елизавета 0 1

Bt 2

Анализ трансгенных линий картофеля с генами Bt и ipt на устойчивость к колорадскому картофельному ЖУКУ.

Линии картофеля, трансгенность которых была доказана с использованием селективной среды и методом П Р, были переведены в условия in vivo. Из клубней на опытном поле Всероссийского НИИ биологической защиты растений (Краснодар), были выращены растения картофеля, которые анализировали на устойчивость к колорадскому картофельному жуку. В качестве контроля использовали исходные сорта.

На контрольных растениях личинки и взрослые особи жука появлялись к первому сроку учета и начинали повреждать ткани растения. Степень повреждения увеличивалась в течение вегетации растений, и к третьему сроку учета растения повреждались полностью.

По степени устойчивости к колорадскому жуку различались как трансгенные растения так и исходные сорта. Например, контрольные растения сорта Невский характеризовались большей по сравнению с растениями других сортов устойчивостью, однако, к последним срокам учета растения сорта Невский также оказались пораженными. Следует отметить, что согласно биологии развития жука, на территории Ленинградской области, которая относится к четвертой (наиболее северной) зоне обитания колорадского жука, массовый выход жука из

почвы смещен в среднем на полтора месяца относительно территорий, на которых расположен исследовательский полигон (первая, климатическая зона расселения). Поэтому на территории Ленинградской области пик агрессивности колорадского жука приходится на более поздние сроки. Исходя из того, что на территории Краснодарского края первые атаки колорадского жука растения сорта Невский выдерживают, в условиях Ленинградской области можно ожидать достаточно высокой устойчивости этого сорта. Таким образом, сорт Невский можно признать относительно устойчивым к колорадскому жуку в агроклиматических условиях Ленинградской области, что подтверждается и данными Саулич (1999).

Растения трансгенные только по одному селективному гену пр! II, определяющему устойчивость к канамицину, были проанализированны в тех же условиях на устойчивость к колорадскому жуку (рис. 6). По сравнению с контролем трансгенные растения с геном ирШ, начинали поражаться значительно раньше, а одно из них уже на стадии бутонизации. В момент цветения одна линия была поражена полностью.

Трансгенные растения с геном В!, полученные на основе сорта Невский, характеризовались повышенной устойчивостью к колорадскому жуку (рис.7): так растения одной из линий показали устойчивость превосходящую уровень устойчивости контрольных форм статистически достоверно по всем срокам учета. Даже в условиях Краснодарского края, поражение свыше 30 % было, выявлено только в самый последний срок учета. Таким образом, выявленную трансгенную линию Невский-ВА можно считать устойчивой, для условий Ленинградской области.

Рис. 6. Динамика поражения колорадским жуком форм картофеля на основе сорта Невский, трансформированных обеззаруженным вектором.

Устойчивость трансгенных растений сорта Невский с геном ipt была заметно ниже, чем в контроле (рис. 8).

Контрольные растения сорта Елизавета характеризовались сравнительно низкой устойчивостью к колорадскому картофельному жуку. Растения линии, трансформированные обеззаруженным вектором, обладали, как и исходный сорт, низкой устойчивостью к патогену. Трансгенные растения с геном Bt, полученные на основе этого сорта, как и в случае Bt растений сорта Невский, характеризовались сравнительно высокой устойчивостью к колорадскому жуку (рис. 9).

Рис. 7. Динамика поражения колорадским жуком трансгенных растений на основе сорта Невский, содержащих ген Bt.

Рис. 8 Динамика поражения колорадским жуком трансгенных растений на основе сорта Невский содержащих ген ipt.

Рис. 9. Динамика поражения колорадским жуком трансгенных растений на основе сорта Елизавета.

Для сорта Чародей отмечена та же тенденция: растения с геном Bt являлись сравнительно учтойчивыми к патогену, трансгенные растения с геном ipt были заметно чувствительнее к колорадскому жуку (рис.10).

Рис. 10. Динамика поражения колорадским жуком трансгенных растений картофеля на основе сорта Чародей.

В целом, трансгенные растения с геном Bt, характеризовались повышенной, устойчивостью к колорадскому жуку: так многие линии показали устойчивость превосходящую уровень устойчивости контрольных форм статистически достоверно по всем срокам учета. Кроме того, среди устойчивых растений оказалось и одно растение трансформированное "обезаруженным штаммом".

Группа линий, представленная трансгенными растениями с геном синтеза цитокинина 1р1, характеризовалась низкой устойчивостью к колорадскому жуку Таким образом, наши результаты не подтверждают литературные данные о том, что повышение уровня цитокинина в растении влечет за собой повышение устойчивости растения к насекомым. Возможно, в условиях, исследуемых нами, избыточный синтез цитокинина и стимулируемые им эффекты приводили к повышенной нагрузке на метаболический аппарат растения и отвлечению биохимических ресурсов последнего от реакций, направленных на защиту растения.

Фенотипически трансформированные растения не отличались от растений исходного сорта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, нами показана изменчивость среди сортов картофеля по регенерационной способности, впервые описана связь между признаками "интенсивность регенерации" и типом каллуса для картофеля. В работе выявлена изменчивость среди сортов картофеля по способности к трансформации. Показано, что сорта с максимальной регенерационной способностью обладают и максимальной способностью к трансформации. Кроме того, показана зависимость трансформации от штамма бактерии. Получена коллекция трансгенных растений. На основе трех сортов были получены трансгенные линии растений достоверно различающиеся по устойчивости к патогену.

Пять трансгенных линий проявили себя как сравнительно устойчивые. Среди них были линии, трансгенные по гену В1 и линия, трансформированная обеззаруженным вектором.

ВЫВОДЫ

1) Впервые описаны и дана классификация типов каллусов, возникающих при развитии клубневых эксплантов различных сортов картофеля на синтетической питательной среде МС с фитогормонами.

2) Выявлена зависимость между типом каллуса, развивающегося на экспланте, и регенерационным потенциалом у различных сортов картофеля. Предложено использовать данный признак для раннего прогнозирования и отбора генотипов с высокой регенерационной способностью.

3) Среди проанализированных сортов картофеля выявлена изменчивость по регенерационной способности и показана ее зависимость от генотипа, состава фитогормонов в питательной среде и типа экспланта.

4) Показана зависимость между интенсивностью трансформации и штаммом агробактерии (вектором) использованным для трансформации.

5) Подтверждена гипотеза о том, что генотипы с высокой регенерационной способностью обладают высокой способностью к трансформации.

6) Получена коллекция трансгенных растений, содержащих бактериальный ген Bt из Bacillus thuringiensis, ген из Agrobacterium tumefaciens - ipt, кодирующий ключевой фермент биосинтеза цитокининов - изопентенилфосфотрансферазу и ген npt II - продукт которого придает устойчивость к антибиотику канамицину. Среди трансгенных растений не выявлено морфологических изменений по сравнению с исходными сортовыми формами.

7) Подтверждено, что мероприятия по трансгенозу гена Bt повышают уровень полевой устойчивости картофеля к колорадскому жуку независимо от уровня исходной устойчивости сорта.

8) Показано, что трансгеноз гена ipt, кодирующего ключевой фермент биосинтеза цитокининов - изопентенилфосфотрансферазу, не приводит к повышению полевой устойчивости исходных сортов к колорадскому жуку.

Список публикаций по теме диссертации

1. Богомаз Д.И. Характеристика регенерационной способности сортов картофеля, перспективных и рекомендованных для возделывания на Северо-Западе России.// Сб: Биотехнология - возрождению сельского хозяйства в России в XXI веке. 2001г. С.14-17.

2. L.T. Khodjaiova, E.A. Andreeva, D.I. Bogomaz, S.S. Altukhova, G.M. Shumilina and L.A. Lutova. New biotechnological in vitro methods in improving potato and tomato plants resistance to the late blight disease, caused by Phytophthora infestans. International Symposium "Biotechnology approaches for exploitation and preservation on plant resources". 26-31 may. 2002. Yalta. Ukraine, p.80.

3. Богомаз Д.И. Получение трансгенных растений и клеточная селекция картофеля на устойчивость к колорадскому картофельному жуку// Шестая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. С-Петербург,2001.

4. Лутова Л.А., Богомаз Д.И., Алтухова С.В. Трансформация -метод получения растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства..// Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений. Краснодар, 2003. С. 186-193

5. Khodjaiova L., Andreeva E., Altukhova S., Bogomaz D., Shumilina G., Lugovaya E., Nikitin P., Bodunova I. and Lutova L. Plant resistance to Phytophthora based on plant sterol composition//Proceedings of XI International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. - July 18-26, 2003, Saint-Petersburg, Russia

6. Андреева Е.А., Богомаз Д.И., Шумилина Г.М., Луговая Е.А., Ходжайова Л.Т., Лутова Л.А. Использование методов клеточной селекции для получения растений, устойчивых к патогенам рода Phytophthora//Teзисы VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология».- 9-13 сентября 2003 г., Саратов, Россия.

N2 - 75 98

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богомаз, Денис Игоревич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Получение растений, устойчивых к колорадскому жуку на основе трансформации геном ВТ bacillus thuringiensis.

1.1. Биологические особенности Bacillus thuringiensis.

1.2. Доменная организация эндотоксинов.

1.3. Механизм действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis.

1.4. Применение культуры в. thuringiensis в качестве инсектицида.

1.5. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ТОКСИН В. thuringiensis.

1.6. Изучение функциональной роли cc-спиралей.

1.7. Генная инженерия генов токсинов в. thuringiensis.

1.8. Введение cry генов в геном растений.

1.9. Придание устойчивости растениям посредством бактериального гена изопентенил-трансферазы (ipt).

1.10. Гены хозяйской специфичности агробактерий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Материал.

2.2. Методы.

Агробактериальная трансформация в оптимальных для регенерации условиях.

2.2.1. Поддержание растительного материала.

2.2.2. Подбор сред для регенерации и характеристика сортов картофеля по регенерационной способности.

2.2.3. Получение трансгенных растений картофеля.

2.2.4. Выделение растительной ДНК.

2.2.5. Выделение ДНК агробактерий.

2.2.6. Полимеразная цепная реакция.

2.2.7.0ценка устойчивости картофеля к колорадскому картофельному жуку.

2.2.8. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика сортов картофеля in vitro по регенерационной способности.

3.1.1. Морфофизиологическая характеристика каллусов in vitro.

3.1.2. Регенерация побегов на клубневых эксплантах in vitro.

3.2. Получение трансгенных растений картофеля с генами Вт и ipt.

3.3. Анализ трансгенных линий картофеля с генами Вт и ipt на устойчивость к колорадскому картофельному жуку. :.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимодействия генотипов растения и бактерии при получении форм картофеля, устойчивых к колорадскому жуку"

Разработка эффективных методов регенерации, изучение процессов морфогенеза in vitro особенно необходимо для важнейших сельскохозяйственных культур. Это обусловлено тем, что данные процессы лежат в основе фактически всех современных биотехнологических методов -будь то клональное микроразмножение, оздоровление посадочного материала, клеточная селекция или трансформация. Ранее в литературе многократно У обсуждался вопрос об зависимости процессов регенерации in vitro от генотипа .

Показано также, что и интенсивность трансформации определяется генотипом растения и зависит от штамма бактерии, с помощью которого осуществлен этот процесс. Однако работы по зависимости трансформация — генотип - штамм бактерии были выполнены в основном с использованием разнообразных штаммов агробактерий дикого типа. В настоящее время, когда в мировой практике стоит проблема получения трансгенных растений, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам среды, все еще остаются нерешенными вопросы о роли сорта и коммерческих штаммов, во всем их многообразии, в эффективности трансформации. Хорошо известно, что в результате трансформации даже в пределах одной пары сорт - штамм можно получить широкий круг изменчивости, как результат случайного встраивания Т-ДНК в геном растения. Поэтому, для получения трансгенного растения с заданными свойствами необходимо иметь большое число трансгенных растений, среди которых возможно провести направленный отбор.

Все выше сказанное указывает на необходимость, проведения исследований направленных на выявление причин, определяющих эффективность трансформации, к которым в первую очередь следует отнести подбор генотипа растения, штамма бактерии (вектора), а также условий, таких как питательная среда, тип экспланта.

Целью работы явилось - изучение взаимодействия: генотипа растения и штамма бактерии, при получения растений, устойчивых к вредителям' посредством трансформации генами Bt токсина (Bacillus thuringiensis) и ipt (Agrobacterium tumefaciens). В задачи работы входило:

1. Изучение внутривидововой изменчивости по способности к регенерации in vitro среди сортов рекомендованных к возделыванию в Ленинградской области и выявление условий при которых этот процесс максимально выражен.

2. Изучение изменчивости по интенсивности трансформации сортов картофеля в зависимости от штамма бактерии.

3. Получение коллекции трансгенных растений картофеля, на основе сортов, рекомендованных к возделыванию в условиях Ленинградской области, несущих бактериальные гены npt II, ipt, Bt.

4. Анализ форм из коллекции трансгенных растений картофеля по устойчивости к колорадскому картофельному жуку.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Богомаз, Денис Игоревич

ВЫВОДЫ

Таким образом, в ходе работы полученны следующие результаты:

1) Описаны и классифицированы типы каллусов, возникающие при развитии клубневых эксплантов картофеля на синтетической питательной среде МС с различными фитогормональными добавками.

2) Выявлена зависимость между типом каллуса, развивающегося на зкспланте, и регенерационным потенциалом у различных сортов. Предложено использовать данный признак для раннего прогнозирования и отбора генотипов с высокой регенерационной способностью.

3) Среди проанализированных сортов картофеля выявлена изменчивость по регенерационной способности и показана ее зависимость от состава фитогормонов в питательной среде и типа экспланта.

4) Показана зависимость между интенсивностью трансформации и штаммом агробактерии использованным для трансформации.

5) Подтверждена гипотеза о том, что генотипы с высокой регенерационной способностью обладают высокой способностью к трансформации.

6) Получена коллекция трансгенных растений, содержащих бактериальный ген Bt из Bacillus thuringiensis, и ген из Agrobacterium tumefaciens - ipt, кодирующий ключевой фермент биосинтеза цитокининов - изопентенилфосфотрансферазу.

7) Подтверждено, что мероприятия по трансгенозу гена Bt повышают уровень полевой устойчивости картофеля к колорадскому жуку независимо от уровня исходной устойчивости сорта.

Показано, что трансгеноз гена ipt, кодирующего ключевой фермент биосинтеза цитокининов — изопентенилфосфотрансферазу, не приводит к повышению полевой устойчивости исходных сортов к колорадскому жуку.

Среди трансгенных растений не выявлено изменений фенотипа по сравнению с исходными сортовыми формами.

Заключение

Менее чем за 300 лет своей Российской истории картофель прошел путь от насильственного внедрения в начале XVIII века и до нашего времени, когда картофель стал важнейшей стратегической агрокультурой. Широкое распространение картофеля в мире и в России обусловлено его удивительными питательными свойствами клубней, содержащими углеводы, витамины и незаменимые аминокислоты. Картофель относится к культурам легко возделываемым и характеризуется высокой адаптационной способностью к широкому спектру природных условий. Однако, картофель -культура, в значительной степени подверженная поражению различными патогенами: грибами, бактериями, вирусами. Среди вредителей картофеля на первом месте по вредоносности стоит колорадский картофельный жук: впервые появившись на полях нашей страны около 50-ти лет назад, он распространился на площади около 3 млн.га. Жуки и личинки повреждают листья картофеля, а при массовом заражении уничтожают всю надземную часть растения. Потеря урожая может достигать 90% в зависимости от сорта. Сегодня к арсеналу традиционных методов борьбы добавлены и новые биотехнологические методы, основанные на достижениях клеточной и генной инженерии.

Картофель наряду с табаком был одним из первых растений, подвергшихся генетической трансформации с применением почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens. С большей или меньшей эффективностью картофель удалось регенерировать, подвергая трансформации клубневые диски (Shermann, Bevan, 1988) или молодые листья. Однако спектр генотипов (сортов), на которых велись работы, был ограничен несколькими легко трансформируемыми сортами (Davis, 1996).

За время, прошедшее с момента получения первых трансгенных растений картофеля (1986), уже опубликовано более ста работ, основной целью которых была оптимизация процесса генетической трансформации. Чем можно объяснить такой неослабевающий интерес к модификации казалось бы уже налаженного метода? Это связано с тем, что спектр успешно трансформируемых сортов картофеля ограничен. В основном это сорта американской селекции Russet Burbanc, Atlantic, Superior и голландской селекции — Desirec.

Создание генетически модифицированного растения подразумевает связь между процессом собственно трансформации и последующей регенерации целого растения. Как и для большинства видов этот процесс генотип-зависим (Лутова 2003, Wordragen et al., 1993). Кроме того, эффективность получения трансгенного растения от конкретного генотипа зависит от сочетания множества факторов. Ранее, в работах нашей лаборатории (Лутова и др. 1998) уже была выявлена зависимость эффективности трансформации для ряда объектов от сочетания генотип - штамм, а также от условий культивирования. От исследователя, намеревающегося получить новую генетически модифицированную форму, требуется учитывать и оптимизировать сумму параметров. В решении данной проблемы возможны два подхода: если необходимо трансформировать один или максимум два сорта, то возможен подбор оптимальных условий трансформации - регенерации под каждый сорт. Если же стоит задача трансформировать несколько сортов, то правильнее разработать универсальную для многих сортов систему трансформации -регенерации. Усилия нашей работы были направлены с одной стороны на поиск генотипов (сортов) с максимальной способностью к трансформации -регенерации, а с другой стороны подбор унифицированных подходов для. целого ряда сортов, районированных в условиях Ленинградской области. Анализируя сорта картофеля отечественной селекции по способности к регенерации нам удалось выявить и описать новый признак " тип каллуса", развивающийся на клубневых эксплантах. Сорта значительно различались по способности формировать тот или иной тип каллуса. Наиболее значимым для нас оказалось, что интенсивность регенерации побегов зависит от типа каллуса. Например, на каллусах типа " наплыв" никогда не образуются растения — регенеранты, а на каллусе типа "сфероид" этот процесс происходит достаточно эффективно. Таким образом, регенерационный потенциал сорта можно определить на ранних этапах культивирования эксплантов и по признаку "тип каллуса", как маркерному, отобрать интенсивно — регенерирующие генотипы. Итак, признак " тип каллуса" можно использовать для раннего прогнозирования и отбора генотипов для трансформации и последующей регенерации. Следует обратить внимание на то, что тип каллуса определяется не только генотипом, но и содержанием фитогормонов в питательной среде. Это значит, что изменяя условия культивирования (состав фитогормонов) можно индуцировать каллус определенного типа для последующей успешной регенерации.

В экспериментах на различных сортах картофеля мы подтвердили, полученные ранее данные о связи процессов регенерации и трансформации (Лутова и др. 1998, Глик, Пастернак, 2002). Сорта характеризующиеся высокой регенерационной способностью также хорошо трансформируются, так как клетки компетентные к регенерации компетентны и к трансформации. Нашла подтверждение и высказанная нами ранее гипотеза о зависимости эффективности трансформации от штамма агробактерии. Новым явилось то, что в данном исследовании для трансформации мы использовали не штаммы дикого типа, а векторные конструкции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богомаз, Денис Игоревич, Санкт-Петербург

1. Анисимов Б.В. Сортовые ресурсы и передовой опыт семеноводства картофеля, - Москва, 2000 г., - 150 с.

2. Венгорек В. Влияние продолжительности дня и качества корма на биологию колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say // Колорадский жук и меры борьбы с ним. Т. 2. М., 1958. С. 129-135.

3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. под ред. Н.К. Янковского М.: Мир, 2002. - 589с., ил.

4. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных киспользованию. Сорта растений (Официальное издание), Москва, 2003г.

5. Журавлев В.Н. Биология колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say и его значение как вредителя картофеля в Калининградской области: Автореф. дис.канд. биол. наук. JL, 1964. 23 с.

6. Злотников М.Д. Возможный ареал распространения и сроки развития колорадского жука в Европейской части СССР // Труды ВИЗРа. 1967. Т.27. С. 68-74.

7. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. — СПб: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2003. 228 с.

8. Лутова JI.A., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений.// Генетика,-1998.-Т.34,№2.-С. 165-182.

9. Макеев Г.И. Экологическое обоснование прогноза численности, вредоносности колорадского жука и меры борьбы с ним на Северном Кавказе: Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1982. 25 с.

10. Методические рекомендации по изучению и оценке форм картофеля на устойчивость к колорадскому жуку. Д.: ВИЗР, 1993

11. Саулич А.Х. Сезонное развитие насекомых и возможность их расселения // Издательство С.-Петербургского университета 1999. С. 117-121.

12. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация пасленовых. Киев: Наук. Думка, 1985.-132 с.

13. Ушатинская Р.С. Терморегуляция в классе насекомых // Вопросы экологической физиологии насекомых. М., 1987. С.5-46.

14. Шапиро И.Д., Вилкова Н.А., Фасулати С.Р., Иващенко J1.C. Методические рекомендации по изучению и оценке форм картофеля на устойчивость к колорадскому жуку. М.-1993- 48с.

15. Яковлев Б.В. Колорадский картофельный жук и меры борьбы с ним. // Гос. изд. сельхоз. лит. М., 1950. 64 с.

16. Adams L.F., Mathewes S., O'Hara P., Petersen A., Gurtler H. Elucidation of the mechanism of CrylHA overproduction in a mutagenized strain of Bacillus thuringiensis var. tenebrionis.// Mol Microbiol.-1994-V. 14, №2.- P.381-389.

17. Akiyoshi D.E., Regier D.A., Gordon M.P. Cytokinin production by Agrobacterium and Pseudomonas spp.//J. Bacterid.- 1987- V. 169, N.9.-p. 4242-4248.

18. Akiyoshi D.E., Regier D.A., Jen G., Gordon M.P. Cloning and nucleotide sequence of the tzs gene from Agrobacterium tumefaciens strain T37.//Nucleic Acids Res. 1985 V. 13,N.8- p. 2773-2788.

19. Alonso J.M, Stepanova A.N. T-DNA mutagenesis in Arabidopsis.// Methods Mol Biol.,- 2003.-V.236, P. 177-188.

20. Ananda Kumar P., Sharma R.P., Malik V.S. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis.//Adv. Appl. Microbiol.,-1996.-V.42, P. 1-43.

21. Ananda Kumar P., Sharma R.P., Malik V.S. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis.!/ Adv. Appl. Microbiol. -1996- V.42, P. 1 -43.

22. Ankenbauer R.G., Best E.A., Palanca C.A.,'Nester E.W. Mutants of the Agrobacterium tumefaciens virA gene exhibiting acetosyringone-independent expression of the virregulon.//Mol. Plant-Microbe Interact. 1991- V. 4,N.4.- p. 400-406.

23. Baum J. A., Kakefuda M., Gawron-Burke C. Engineering Bacillus thuringiensis bioinsecticides with an indigenous site-specific recombination system. // Appl Environ Microbiol. 1996 -Vol. 62, №. 12, P. 4367^373.

24. Baum J.A., Malvar T. Regulation of insecticidal crystal protein in Bacillus thuringiensis. // Mol. Microbiol.,- 1995.-V.18, P 1-12.

25. Beijersbergen A.G.M.,Smeth S.J., Hooykaas P.J.J., Localization and topology of VirB proteins of Agrobacterium tumefaciens.//Plasmid. -1994-V.32N.2-p.212-218.

26. Bosch D., Schipper В., van der Kleij H., de Maagd R.A., Stiekema W.J. Recombinant Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properties: possibilities for resistance management.//Bio. Technology.,-1994.-V.12, P.915-918.

27. Buchholz W.G., Thomashow M.F. Host range encoded by the Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid pTiAg63 can be expanded by modification of its T-DNA oncogene complement.// J. Bacteriol. -1984- V. 160,N.l.- p. 327-332.

28. Bundock P., den Dulk-Ras A., Beijersbergen A., Hooykaas P.J.J. Trans-kingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. -1995- V. 14,N.13.- p. 3206-3214.

29. Cangelosi G.A., Ankenbauer R.G., Nester E.W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proc. Natl. Acad. Sci. -1990- V. 87,N.17.- p. 6708-6712.

30. Charles Т., Nester E.W. A chromosomally encoded two-component sensory transduction system is required for virulence of Agrobacterium tumefaciens.// J. Bacteriol. -1993- V. 175,N.20.- p. 6614-6625.

31. Cheng X. et. al. Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cry IA(b) and crylA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. -1989.- Proc. Natl. Acad. Sci.,- V.95, №6-P.2767-2772.

32. Citovsky V., Zupan J., Warnick D., Zambryski P. Nuclear localization of Agrobacterium VirE2 protein in plant cells.// Science. -1992- V. 256,N.5065.-p. 1802-1805.

33. Close T.J., Rogowsky P.M., Kado C.I., Winans S.C., Yanofsky M.F., Nester E.W. Dual control of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid virulence genes.// J. Bacteriol. -1987- V. 169,N. 11.- p. 5113-5118.

34. Cooley M.B., D'Souza M.R., Kado C.I. The virC and virD operons of the Agrobacterium Ti plasmid are regulated by the ros chromosomal gene: analysis of the cloned ros gene. J. Bacteriol. -1991- V. 173,N.8.- p. 2608-2616.

35. Crickmore N., Nicholls C., Earp D.J., Hodgman T.C., Ellar D.J. The construction of Bacillus thuringiensis strains expressing novel entomocidal 5-endotoxin combinations.//Biochem. J.-1990- V.270, P133-136.

36. Davis H.V. Recent development in our knowledge of potato transgenic biology.//Potato research.-1996-V.39,P411-427.

37. Dasgupta I., Hull R., Eastop S., Poggi-Pollini C, Blakebrough M., Boulton М.1., Davies J.W. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium-mediated transfer.//J. Gen. Virol. -1991- V. 72(Pt 6), p. 1215-1221.

38. De Vos G.D., Zambryski P. Expression of Agrobacterium nopaline-specific VirDl, VirD2, and VirCl proteins and their requirement for T-strand production inE. coli. Mol.// Plant-Microbe Interact. -1989- V. 2,N.2.- p. 43-52.

39. Delannay X. et al. Field performance of transgenic tomato plants expressing the Bacillus thuringiensis var. Kurstaki insect control protein.// Bio.Technology.-1989- V.7, P.1265-1269.

40. Dellaporta S.L. et al (1983) Molecular Biology of Plants: A laboratory Course Manual. P.36-37

41. Deng W., Gordon M.P., Nester E.W. Sequence and distribution of IS1312: evidence for horizontal DNA transfer from Rhizobium meliloti to Agrobacterium tumefaciens.//J. Bacteriol. -1995a- V. 177,N.9.- p. 2554-2559.

42. Deng W., Pu X.A., Goodman R.N., Gordon M.P., Nester E.W. T-DNA genes responsible for inducing a necrotic response on grape vines.// Mol. Plant-Microbe Interact. -1995b- V. 8, N.4.- p. 538-548.

43. Doty S.L., Yu M.C., Lundin J.I., Heath J.D., Nester E.W. Mutational analysis of the input domain of the VirA protein of Agrobacterium tumefaciens.// J. Bacteriol. -1996- V.178, N.4 p. 961-970.

44. Douglas C, Halperin W., Gordon M.P., Nester E.W. Specific attachment of Agrobacterium tumefaciens to bamboo cells in suspension cultures.// J. Bacteriol. -1985- V. 161, N.2- p. 764-766.

45. Douglas C, Halperin W., Nester E.W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.// J. Bacteriol. -1982- V. 152, N.3- p. 1265-1275.

46. D'Souza-Ault M., Cooley M., Kado C.I. Analysis of the Ros repressor of Agrobacterium virC and virD operons: molecular intercommunication between plasmid and chromosomal genes.// J. Bacteriol. -1993- V. 175, N.l 1- p. 3486-3490.

47. Fullner K.J., Lara J.C, Nester E.W. Pilus assembly by Agrobacterium T-DNA transfer genes.// Science. -1996- V. 273, N.5278-p. 1107-1109. Gardner R.C., Knauf V.C. (1986) Science. V. 231, p. 725-727.

48. Gonzalez J.M. Brown B.J., Carlton B.C.Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for delta-endotoxin among strains of B. thuringiensis and B.cereus. -1982.- Proc. Natl. Acad. Sci.,- V.79,№22, P.6951-6955.

49. Gray J., Wang J., Gelvin S. Mutation of the miaA gene of Agrobacterium tumefaciens results in reduced vir gene expression.// J. Bacteriol. -1992- V. 174, N.4- p. 1086-109S.

50. Grimsley N. Hohn В., Ramos C, Kado C, Rogowsky P. DNA transfer from Agrobacterium to Zea mays or Brassica by agroinfection is dependent on bacterial virulence functions.// Mol. Gen. Genet. -1989- V. 217, N.2-3 p. 309-316.

51. Grochulski P., Masson L., Borisova S., Pusztai-Carey M., Schwartz J.-L., Brousseau R., Cygler M. Bacillus thuringiensis CrylAa insecticidal toxin: crystal structure and channel formation.// Journal of Molecular Biology.,- 1995.-V.254, P. 447-464.

52. Guerchicoff A., Cluse D. A., Rubinstein C. P., The Bacillus thuringiensis cyt Genes for Hemolytic Endotoxins. // Applied and environmental microbiology.-2001 V. 67, №3.-P. 1090-1096.

53. Hamada S.E., Farrand S.K. Diversity among B6 strains of Agrobacterium tumefaciens.//J. Bacteriol. -1980- V. 144, N.3- p. 732-743.

54. Held G.A., Bulla L.A., Ferrari E., Hoch J., Aronson A.I., Minnich S.A. Cloning and localization of the lepidopteran protoxin gene of Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki. Proc.// Natl. Acad. Sci.,-1982 V.79, P.6065-6069.

55. Herra G., Snyman S.J., Thomson J.A. Construction of a bioinsecticidal strain of Pseudomonas fluorescens active the sugarcane borer, Eldana saccharina.il Appl. Environ. Microbiol.-1994- V.60, P.682-690.

56. Hiei Y., Ohta S., Komari Т., Kumashiro T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.// Plant J. -1994- V. 6, N.2- p. 271-282.

57. Hille J., van Kan J., Schilperoort R. Trans-Acting virulence functions of the octopine Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens.// J. Bacteriol. —1984-V. 158, N.2- p. 754-756.

58. Hirooka Т., Rogowsky P.M., Kado C.I. Characterization of the virE locus of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58.//J. Bacteriol. -1987- V. 169, N.4- p. 1529-1536.

59. Hofmann C., Luthy P. Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to invertebrate cells.// Arch. Microbiology.-1986.- V.146, P.7-11.

60. Hofmann C., Luthy P., Hutter R., Pliska V. Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae).// European Journal of Biochemistry.-1988.-V.173, P.85-91.

61. Hood E.E.,Helmer G.L., Fraley R.T., Chilton M.D. The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of T-DNA.// J Bacteriol. -1986- V.168, N.3-p.l291-1301.

62. Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. In: B. Lugtenberg (ed.) Recognition in microbe-plant symbiotic and pathogenic interactions. Springer-Verlag, Berlin, -1986-pp. 189-202.

63. Hooykaas-Van Siogtercn G.M.S., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A Expression of Ti plasmid genes in monocotyledonous plants infected with Agrobacterium tumefaciens.// Biotechnology. -1984- V.1992 N.24- p.382-383.

64. Horsch R.B., Klee H.J., Stachel S. Winans S.C., Nester E.W., Rogers S.G., Fraley R.T. Analysis of Agrobacterium tumefaciens virulence mutants in leaf discs.//Proc. Natl. Acad. Set-1986-V. 83,N.3- p. 2571-2575.

65. Huang M.L.W., Cangelosi G.A., Halperin W., Nester E.W. A chromosomal Agrobacterium tumefaciens gene required for effective plant signal transduction.//J. Bacteriol. -1990- V. 172, N.4- p. 1814-1822.

66. Ihara H., Kuroda E., Wadano A., Himeno M. Specific toxicity of d-endotoxins from Bacillus thuringiensis to Bombyx mori.// Bioscience, Biotechnology, Вiochemistry.-1993V.57, P. 200-204.

67. Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari Т., Kumashiro T. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.//Nature Biotechnology. -1996- V. 14, N.6- p. 745-750.

68. Jarchow E., Grimsley N.H., Hohn B. virF, the host-range-determining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays.//Proc. Natl. Acad. Sci. -1991- V. 88, N.23- p. 10426-10430.

69. Jin S., Komari Т., Gordon M.P., Nester E.W. Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281.// J. Bacteriol. -1987- V.169, N.l0- p. 4417-4425.

70. Jin S., Song Y.N., Deng W., Gordon M.P., Nester E.W. The regulatory VirA protein of Agrobacterium tumefaciens does not function at elevated temperatures.//J. Bacteriol. -1993a- V. 175, N.21-p. 6830-6835.

71. Jin S., Song Y.N., Pan S.Q., Nester E.W. Characterization of a virG mutation that confers constitutive virulence gene expression in Agrobacterium.// Mol. Microbiol. -1993b- V. 7, N.4- p. 555-562.

72. John M.C., Amasino R.M. Expression of an Agrobacterium Ti plasmid gene involved in cytokinin biosynthesis is regulated by virulence loci and induced by plant phenolic compounds.// J. Bacteriol, -1988- V. 170, N.2- p. 790-795.

73. Kado C.I. Promiscuous DNA transfer system of Agrobacterium tumefaciens: role of the virB operon in sex pilus assembly and synthesis.// Mol. Microbiol. — 1994- V. 12, N.l p. 17-22.

74. Kalogeraki V.S., Winans S.C. The octopine-type Ti plasmid pTiA6 of Agrobacterium tumefaciens contains a gene homologous to the chromosomal virulence gene acvB.// J. Bacteriol. -1995- V. 177, N.4- p. 892-897.

75. Kang H.W., Wirawan I.G.P., Kojima M. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. V. 58, p. 2024-2032.

76. Kerr A. (1992) In: Balows K. et al. (ed.). The prokaryotcs, 2 edition, Vol. III. Springer-Verlag, Berlin, p. 2214-2235.

77. Kim HS. Comparative study of the frequency, flagellar serotype, crystal shape, toxicity, and cry gene contents of Bacillus thuringiensisfrom three environments.//Curr Microbiol.,- 2000.- V.41,№4-P.250-256.

78. Knauf V.C., Panagopoulos C.G., Nester E.W. Comparison of Ti plasmids from three different biotypes of Agrobacterium tumefaciens isolated from grapevines//J Bacteriol. 1983. - V.153, N3.- P. 1535-42.

79. Kovacs L.G., Pueppke S.G. Mapping and genetic organization of pTiChry5, a novel Ti plasmid from a highly virulent Agrobacterium tumefaciens strain.// Mol Gen Genet. 1994 - V. 242, N.3. - P.327-36.

80. Lee Y.W., Jin S., Sim W.S., Nester E.W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the VirA protein of Agrobacterium tumefaciens.//Proc Natl Acad Sci USA.- 1995.- V.92, N. 26. P. 1224512249.

81. Lereclus D., Agaisse H., Gominet M., Chaufaux J. Overproduction of encapsulated insecticidal crystal proteins in a Bacillus thuringiensis spoOA mutant.// Bio. Technology.-1995.-V.13, P.67-71.

82. Li H.Q., Sautter C, Potryjtus 1., Puonti-Kaerlas J. Genetic transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz).//Nat Biotechnol. 1996 V. 14, N. 6. P. 736-740.

83. Lippincott B.B., Lippincott J.A. Bacterial attachment to a specific wound site as an essential stage in tumor initiation by Agrobacterium tumefaciens.//J Bacteriol. 1969. - V. 97,N.2. - P.620-628.

84. Maliga P. Plastid engineering bears fruit.// Nat Biotechnol.-2001 V.19, №9-P.826-827

85. Mantis N., Winans S.C. Mantis N., Winans S.C The chromosomal response regulatory gene chvl of Agrobacterium tumefaciens complements an Escherichiacoli phoB mutation and is required for virulence.// J. Bacteriol. -1993- V. 175,N20.- p. 6626-6636.

86. Masson L, Tabashnik B.E., Liu Y.B., Brousseau R, Schwartz J.L. Helix of the Bacillus thuringiensis CrylAa toxin lines the lumen of the ion channel.// Journal of Biological Chemistyr.- 1999.- V.274, №45.-P.31996-2000.

87. Matthysse A.G. Schizophrenic thought disorder: a model-theoretic perspective.Schizophr Bull. J. Bacteriol. -1987- V. 169,N.l.- p. 313-323.

88. Ondrey M., Macas J., Kostrica P., Potato transgenosis by T-DNA morphoregulatory genes //Rostlina vyroba 1993. - 39(11), - P. 1065 - 1074.

89. Orth P., Zalunin I.A., Gasparov V.S., Chestukhina G.G., Stepanov V.M.// Journal of Protein Chemistry. -1995.- V.14, P. 241-249.

90. Otten L, Canaday J., Gerard J.C., Fournier P., Crouzet P., Paulus F. Evolution of agrobacteria and their Ti plasmids~a review.//Mol. Plant-Microbe Interact. -1992- V. 5,N.4.-p. 279-287.

91. Pan S.Q., Jin S.G., Boulton М.1., Hawes M., Gordon M.P., Nester E.W. An Agrobacterium virulence factor encoded by a Ti plasmid gene or a chromosomal gene is required for T-DNA transfer into plants.//Mol. Microbiol. -1995-V. 17,N.2.-p. 259-269.

92. Panagopoulos C.G., Psallidas P.G., AJivazatos A.S. -1978- In: Proc. 4-th Int. Conf. Planl Pathol. Bacteria, Angers, France, p. 221-228.

93. Panagopoulos C.G., Psallidas P.O. Characteristics of Greek Isolates of Agrobacterium tumefaciens (E. F. Smith & Townsend) Conn.// J. Appl. Bacterioi. -1973- V. 36,N.2.- p. 233-240.

94. Peralta E.G., Ream W. T-DNA border sequences required for crown gall tumorigenesis.//Proc Natl Acad Sci -1985- V.82,N.15.-p.5112-5116.

95. Plant genetic transformation and gene expression. A laboratory manual. 1988./ J. Draper, R. Scott, P. Armitage, R. Walden Blackwell Scientific publications.

96. Powell G.K., Hommes N.G., Kuo J., Castle L.A., Morris R.O. Inducible expression of cytokinin biosynthesis in Agrobacterium tumefaciens by plant phenolics.// Mol Plant Microbe Interact. -1988- V.l,N.6-p.235-242.

97. Schnepf H.E., Whiteley H.R. Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli.ll Proc. Natl. Acad. Sci.,-1981-V.78, P.2893-2897.

98. Sherman S., Bewan M.W. A rapid transformation method for Solanum tuberosum using binary Agrobacterium tumefaciens vectors.// Plant cell Reports.-1998-.,V.7.,P. 13-16.

99. Smigocki A., Neal J.W. Jr., McCanna I., Douglass L. Cytokinin-mediated insect resistance in Nicotiana plants transformed with the ipt gene.// Plant Mol Biol.-1993-V.2, Р.325-335.

100. Sriram R., Kamdar H., Jayaraman K. Identification of the peptides of the crystals of Bacillus thuringiensis var israelensis involved in the mosquito larvicidal activity.//Biochem Biophys Res Commun.,- 1985.-V.132, №1-P. 19-27.

101. Thomashow M.F., Karlinsey J.E., Marks J.R., Hurlbert R.E. Identification of a new virulence locus in Agrobacterium tumefaciens that affectspolysaccharide composition and plant cell attachment.// J. Bacteriol. -1987- V.169,N.7.- p. 3209-3216.

102. Tzfira T, Frankman LR, Vaidya M, Citovsky V. Site-specific integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA via double-stranded intermediates.// Plant Physiol.,-2003.-V.133, №3.-P. 1011-1023.

103. Van Rie J., McGaughey H., Johnson D.E., Barnett B.D., Van Mellaert H. Mechanism of insect resistance of the microbial insecticide Bacillus thuringiensis Л Science.,-1990 V.247, P.72-74.

104. Wordragen M.F., Honee G.,Dons H.S. Insect-resistant chrysanthemum calluses by introduction of a Bacillus thuringiensis crystal protein gene.//Transgenic Res. -1993- V.2, N3-P.170-180.

105. Winans S.C., Kerstetter R.A. Nester E.W. Transcriptional regulation of the virA and virG genes of Agrobacterium tumefaciens.//J. Bacteriol. -1988- V.170,N.9.- p. 4047-4054.

106. Yanofsky M., Montoya A., Knauf V., Lowe В., Gordon M., Nester E. Limited-host-range plasmid of Agrobacterium tumefaciens: molecular and genetic analyses of transferred DNA.// J. Bacteriol. -1985- V. 163,N.l.- p. 341-348.