Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и иммунохимическое исследование полимерной фракции столбнячного анатоксина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бинима Сагу, Москва

'в / "У «> <п / о ,л л »>

е.-''' V-' / **? <«"Г -х"1 «г»!

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи

БИНИМА САГУ

ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМЕРНОЙ ФРАКЦИИ СТОЛБНЯЧНОГО АНАТОКСИНА

Специальность: 03.00.23 - биотехнология 03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель кандидат биологических наук А. В. Ермолаев кандидат биологических наук Н. В. Яшина

Москва -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Краткая историческая справка 10

1.2. Особенности эпидемиологии столбняка 11

1.2.1. Состояние заболеваемости столбняком в странах Африки 14

1.3. Особенности профилактики столбняка 15

1.4. Столбнячный токсин 22

1.4.1. Получение нейротоксина, его характеристика и структура 22

1.4.2. Фрагментация ТС 26

1.4.3. Взаимодействие ТС с рецепторами и физиологическая 28 роль фрагментов ТС

1.4.4. Способ получения С А 3 0

1.5. Методы очистки С А 31

1.5.1. Характеристика метода мембранной диафильтрации для 34 очистки СА

1.5.2. Очистка С А с помощью гель-фильтрации 3 7 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39

2.1. Материалы 39

2.1.1. ТС и СА 39

2.1.2. Сыворотки 39

2.1.3. Диагностикумы 40

2.1.4. Лабораторные животные 40

2.1.5. Буферные растворы, реагенты, хроматографические 41 носители

2.1.6. Оборудование 42

2.2 Методы 43

2.2.1. Диафильтрация 43

2.2.2. Спектрофотометрия 44

2.2.3. Хроматография 44

2.2.4. Определение бежа 46

2.2.5. Иммунохимическая характеристика препаратов 48

2.2.6. Определение удельной антигенной активности препаратов 48

2.2.7. Определение иммунизирующей активности препаратов 48

2.2.8. Определение ревакцинаторного эффекта препаратов 48

2.2.9. Определение белкового азота 49

2.2.10 Приготовление эритроцитарных диагностикумов 49

2.2.11 Получение латексного диагностикума и контрольного ла- 50 текса

2.2.12 Постановка реакции агглютинации латекса 50

2.2.13 Статистическая обработка результатов 51 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБ- 52 СУЖДЕНИЕ

3.1. Очистка СА с использованием ступенчатой диафильтра- 52

нии

3.1.1. Одноступенчатая диафильтрация С А 5 2

3.1.2. Двухступенчатая диафильтрация СА 57

3.1.3. Использование технологии мембранной "рехроматогра- 62 фии"при производственной очистке СА

3.2. Исследование иммуногенной активности высокоочшцен- 64 ной полимерной фракции СА

3.3 Выделение и очистка полимерной фракции СА методами 67 колоночной гель-хроматографии

3.4. Изучение сенситивных свойств молекулярно-однородных 72 фракций препарата СА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 76

ВЫВОДЫ 80

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 81

ОСНОВНЫЕ ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АДС - адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин АКДС - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина АС - адсорбированный столбнячный анатоксин АУФ-аппарат ультрафильтрационный (коммерческое название) АТ - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения ВПУ - половолоконный ультрафильтрационный модуль (коммерческое название)

ВФС - временная фармакопейная статья

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ЕС - единица связывния

кД - килоДальтон

- лимит флокуляции МЕ - международная антитоксическая единица МИЕ - международная иммунизирующая единица Мм - молекулярная масса НКС -нормальная кроличья сыворотка ОБК - отдел биологического контроля ОСО - отраслевой стандартный образец РАЛ - реакция агглютинации латекса РПГА - реакция пассивной гемагглютинации СА - столбнячный анатоксин ТС- тетаноспазмин

ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор

ВВЕДЕНИЕ

Возбудитель столбняка - Clostridium tetani распространен повсеместно в почве и других объектах внешней среды на различных территориях Земного шара, в связи с чем проблема столбняка имеет глобальное значение. Но в развивающихся странах она стоит наиболее остро, так как процент заражения столбняком значимо выше, чем в развитых странах, где заболеваемость в мирное время носит спорадический характер.

В некоторых Европейских странах, в том числе в России, резкое снижение случаев болезни началось с плановой иммунизации населения. Так по данным В. Ф. Рудниченко и соавторов снижение заболеваемости столбняком в России произошло в 4,6 раза за десятилетие (1971-1980) [52], а смертность снизилась к концу 60-х годов в 2,6 раза [6]. На Европейском континенте в таких странах, как Португалия, Франция, Италия, Австрия, Румыния, Болгария самая высокая смертность от столбняка составляет от 1,0 до 3,3% на 100 тысяч населения, тогда как в других странах Европы она не превышает 1,0% [47].

Столбняк имеет преимущественно зональное распространение и чаще регистрируется в регионах с жарким и тропическим климатом [7, 8, 33, 34, 90, 141]. Развивающиеся страны, в разряд которых входит большинство государств африканского континента, отнесены в зону повышенной заболеваемости столбняком, где болезнь принимает эндемичный характер [8, 9, 33, 73, 138, 32]. Столбняк в странах Африки до настоящего времени является одной из десяти главных причин смертности населения, в том числе и детской. К этим странам относится и Мали. В чем причина? Проблема состоит в том, что в развивающихся странах, в частности, в Мали нет возможности прививать все население, 80% которого занимается

сельским хозяйством и животноводством. Это животноводы и овощеводы, механизаторы и рабочие лесозаготовительной промышленности, строители и многие профгруппы сферы коммунального обслуживания, то есть люди, имеющие тесный контакт с почвой. Наряду с военнослужащими этот контингент можно отнести к так называемой ' группе риска по отношению к столбнячной инфекции.

Отсутствие плановой иммунизации населения связано с тем, что в стране нет местного производства профилактических препаратов и их приходится закупать за границей. Именно поэтому вакцинируют только детей, беременных женщин и солдат. Но даже среди этого контингента смертность от столбняка остается высокой, так как за качеством вакцинации этих людей наблюдений не ведется.

Особенно серьезную проблему представляет столбняк новорожденных. Несмотря на неполные данные, до настоящего времени эта форма болезни составляет 40-60% от общего числа заболевших столбняком, а умирает во всех развивающихся странах ежегодно более 1 миллиона детей [7, 148, 149] и в Мали, по данным ВОЗ [147], имеется тенденция к увеличению числа умерших. В столице Мали Бамако 60% смертности детей до одного года обусловлено пятью основными инфекционными заболеваниями, где наряду с корью, острыми кишечными инфекциями, малярией и пневмонией важную роль играет столбняк. Улучшение ситуации по столбняку возможно лишь путем создания активного напряженного иммунитета у населения через вакцинации, ревакцинации и путем последующего наблюдения за уровнем коллективного иммунитета, особенно среди контингента, составляющего группу риска.

В связи с вышеизложенным проблема столбняка для Мали является очень актуальной, а выбор диссертационной темы "Получение и иммуно-

химическое исследование полимерной фракции столбнячного анатоксина (СА)" не был случайным.

Цель настоящих исследований заключалась в разработке технологии получения высокоочшценной полимерной фракции СА методом ступенчатой диафильтрации и изучении ее иммунохимических свойств, антигенной и иммуногенной активности.

По ходу достижения цели последовательно решались следующие задачи:

¡.Получение производственных серий высокоочшценной полимерной фракции СА методом ступенчатой диафильтрации на половолоконных ультрафильтрационных модулях (ВПУ) МВ-100 и мембранах ХМ-300.

2.Исследование фракционного состава производственных серий СА методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3.Выделение и очистка полимерной фракции СА методами колоночной гель-хроматографии;

4.Изучение иммунохимических свойств полимерной фракции СА.

5.Оценка иммунизирующей активности сорбированной высокоочи-щенной полимерной фракции СА в опытах на мышах.

6.Изучение иммуногенности полимерной фракции СА в опытах ревакцинации на морских свинках.

7.Исследование возможности использования полимерной фракции СА как сенситина при изготовлении эритроцитарного и латексного диаг-ностикумов.

Научная новизна. Впервые в условиях производства разработана технология очистки некондиционных серий СА с использованием ступенчатой диафильтрации, позволяющая получить на основе полимерного компонента коммерческие серии с нагрузкой более 1000 единиц связыва-

ния (ЕС)/мг белкового азота, т.е. удовлетворяющие критериям Фармакопейной статьи РФ и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ).

Практическая значимость. Разработанная технология использования ступенчатой мембранной диафильтрации для доочистки СА внедрена на предприятии АО "Биомед" им. И. И. Мечникова. Производственные серии препаратов, дополнительно очищенные по указанной технологии, прошли комиссионную проверку в Государственном институте стандартизации и контроля (ГИСК) им. Л. А. Тарасевича. Подтверждена их высокая удельная специфическая и протективная активность. ГИСК им. Л .А. Тарасевича согласовал дополнение к регламенту производства СА, предусматривающее возможность использования ступенчатой мембранной диафильтрации для доочистки препаратов.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Краткая историческая справка

Столбняк известен с древнейших времен. Развитие бактериологии с середины 70-х годов прошлого века помогло изучить болезнь с научных позиций. Инфекционная природа столбняка доказана Н. И. Пироговым [50] и Н. Д. Монастырским [38], который впервые обнаружил столбнячную палочку в трупах людей, погибших от столбняка. В 1884 году А. Ни-колайер воспроизвел болезнь в эксперименте, заражая подкожно кроликов и морских свинок садовой землей. Итальянские ученые Калре (Caire) и Раттон (Rattone) воспроизвели болезнь на кроликах путем введения в мышцы, спинномозговой канал и в оболочку седалищного нерва эмульсии из раны ноги больного, умершего от столбняка. Чистую культуру возбудителя получил в 1889 году С. Китазато. Он же совместно с Э. Берингом в 1890 году получил столбнячный токсин и предложил использовать для лечения столбняка антитоксическую противостолбнячную сыворотку. В 1923-26 годах французскому исследователю Г. Рамону [122] удалось получить СА путем длительного воздействия на столбнячный токсин формалином при температуре 39-40° С, который в дальнейшем стали применять для профилактики заболевания. Этот же автор использовал СА совместно с вакциной против брюшного тифа и паратифов, что способствовало усилению иммунитета против столбняка. Линкольн и Гринвальд (1933) иммунизировали 18 добровольцев 3 дозами анатоксина с недельным интервалом с хорошим прививочным результатом. Широко использовал иммунизацию СА железнодорожных рабочих Бази (1934), Син-Сасский и Стетке-вич (1934) проводили прививки солдатам. Сравнительное изучение защит-

ного эффекта при иммунизации двумя и тремя дозами СА проводил Лаги-ри (1942), Фрезер, Маклеан, Орр, Плуммер и Уимарт (1942).

В России проблема профилактики столбняка изучалась в работе К. И. Матвеева [31]. Вопросы дифференцированного лечения больных столбняком представлены в трудах К. М. Лобана [27]. Материалами советских (российских) и зарубежных ученых подтверждено широкое распространение столбняка и необходимость проведения плановой и экстренной иммунизации как единственно надежного способа профилактики заболевания [2, 9, 10, 35, 37, 62, 63, 67, 69, 141].

1.2.0собенности эпидемиологии столбняка

Возбудитель столбняка широко распространен в природе. Он является постоянным обитателем кишечника многих травоядных животных (лошадей, коров, овец, коз, свиней, кроликов, обезьян, морских свинок, мышей, крыс). Возбудитель встречается также в кишечнике здоровых людей, инфицированность которых варьирует от 5 до 40%. Столбнячная палочка, попадая с фекалиями в почву, надолго инфицирует ее, преобразуясь в споровую форму. В районах с развитым животноводством и благоприятными почвенно-климатическими условиями обсемененность почв возбудителем колеблется в среднем от 25 до 100%.

Жаркий и тропический климат является наиболее благоприятным для роста и размножения С1Ле1аш в почве. Некоторые растения, по данным Е. Н. Мишустина с соавторами [37], например, пшеница, способствует размножению в почве столбнячной палочки. Вместе с пылью, частичками почвы, предметами хозяйственной деятельности возбудитель переносится на одежду, обувь, кожу человека. За исключением столбняка новорожденных существует параллелизм между обсемененностью почв столбнячной палочкой и уровнем заболеваемости [39, 67]. По мнению В. Ф. Рудниченко

с соавторами [52], почвенные факторы являются моментом, способствующим выживанию инфекционного начала. Авторы считают, что выявление почвенных факторов может определять географию заболеваемости столбняком и делает возможным составление эпидемиологических прогнозов.

Болезнь развивается лишь при проникновении возбудителя через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки. Входными воротами служат различные раны: огнестрельные, колотые, резаные, ожоги, обморожения, травмированные родовые пути, операционные раны при инфицировании их руками, инструментами или перевязочным материалом. Вот почему столбняк обычно сопровождает все воины и связан прежде всего с травматизмом. Ежегодно 10% населения развивающихся стран и более 5 % населения развитых стран подвергаются риску получения травмы. Наиболее часто (до 30% случаев) инфекция проникает через крупные кожные повреждения. В зависимости от геоклиматических и социально-экономических условий вероятность заболевания составляет от 1 до 40 случаев на 1000 ранений [8].

Как уже указывалось, наибольшая заболеваемость столбняком регистрируется у жителей сельской местности. Это объясняется особенностями быта населения, контактом с животными, сельскохозяйственным травматизмом, большим соприкосновением с удобренными почвами. Основная масса населения тропических стран, занятая сельскохозяйственным трудом, не пользуется обувью, ходит босиком или носит кустарную открытую или полуоткрытую обувь. Это приводит к постоянному контакту ног с почвой и частому их травмированию. Жители села при мелких ранениях, связанных с бытовыми травмами обычно не обращаются за медицинской помощью. В развивающихся странах эта группа населения чаще всего не охвачена медицинской помощью из-за слабо развитой сети лечебно-профилактических учреждений, отсутствия медицинских кадров. В хирур-

гической практике описаны случаи послеоперационного столбняка из-за обсеменения спорами перевязочного материала, кетгута [91]. При анализе входных ворот инфекции у 2337 больных столбняком в Парагвае, установлено, что в 7,7% случаев поражение возникало вследствие повреждения кожи после удаления паразитов при дракункулезе, в 5,14% - после инфекций, в 2,74% - после плановых операций. Как важный фактор в возникновении столбняка следует выделить хронические гнойные заболевания ушей [ИЗ].

В развивающихся странах важное место занимает столбняк новорожденных, у которых входными воротами возбудителя служит пупочная рана. Связано это с тем, что в 90% случаев принятие родов на дому проводится лицами без специальной подготовки. Используется нестерильный материал, перерезание пуповины грязными ножницами, ножами, лезвием. К тому же практикуется присыпание пуповины землей, золой, конским пометом.

В мирное время до 85% случаев столбняка обусловлено бытовыми травмами, особенно сельскохозяйственными. Роды, криминальные аборты, хирургические вмешательства в антисанитарных условиях, т.е. с нарушением правил асептики и антисептики, особенно в развивающихся странах, в 60% случаев провоцируют развитие столбняка.

В военное время ситуация меняется. В результате больших ранений и загрязнения ран почвой резко возрастает заболеваемость столбняком. Из истории известно, что все крупные военные действия дают повышение заболеваемости и сопровождаются значительной летальностью от столбняка. Так, в период наполеоновских войн летальность среди заболевших столбняком составляла 82,5%, во время гражданской войны в США (186165 гг.) - 89,3%, в период русско-японской войны (1904-1905 гг.) - 92%, в первую мировую войну - 84,5%. Во вторую мировую войну в связи с при-

менением лечебной сыворотки летальность от столбняка резко снизилась [39].

Столбняком чаще болеют дети в возрасте 3-7 лет, когда они особенно подвижны и многие из них получают травмы. Дети до 14 лет болеют в 2,5 раза чаще, чем лица от 14 до 50 лет [70].

Восприимчивость к столбняку всеобщая, естественного иммунитета не существует. После перенесенного заболевания не происходит развития иммунитета ввиду малого антигенного раздражения, вызываемого токсином и поэтому может быть повторное заражение. Лишь активная иммунизация столбнячным анатоксином или комбинированным препаратом ведет к развитию стойкого иммунитета.

1.2.1. Состояние з