Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ опиатов, барбитуратов и каннабиноидов методом латексной агглютинации с использованием функциональных полимерных микросфер

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Анализ опиатов, барбитуратов и каннабиноидов методом латексной агглютинации с использованием функциональных полимерных микросфер"

На правах рукописи СОЛОДУХИНА НАДЕЖДА МИХАЙЛОВНА

Анализ опиатов, барбитуратов и каннабиноидов методом латексной агглютинации с использованием функциональных полимерных

микросфер

Специальности: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология) 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 9 ДПР 2012

Москва 2012

005018101

005018101

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии Института физиологически активных веществ РАН и на кафедре химии и технологии высокомолекулярных соединений им. С.С. Медведева в Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Профессор, доктор биологических наук, Заслуженный деятель науки РФ, Научные МЯГКОВА Марина Александровна

руководители:

Профессор, доктор химических наук,

Заслуженный деятель науки РФ, ГРИЦКОВА Инесса Александровна

Профессор, доктор химических наук, Василенко Иван Александрович

Генеральный директор ООО «Олфарм», испытательная лаборатория.

Профессор, доктор химических наук,

Царькова Марина Сергеевна

Профессор кафедры органической и биологической химии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина.

Ведущая Московский государственный Университет им. М.В. Ломоносова,

организация химический факультет.

Защита состоится «14» мая 2012 г. в 1630 на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д.86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: г. Москва, пр. Вернадского, д.86.

Автореферат разослан «12» апреля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 212.120.01, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации определяется важностью разработки высокоэффеютгеного, недорогого, простого в исполнении, не требующего специального оборудования скринингового экспресс-метода определения наркотических веществ и их метаболитов в физиологической жидкости человека, основашгого на реакции латексной агглютинации как части диагностического комплекса мер, направленных на предупреждение распространения и мониторинг наркомании в Российской Федерации.

Для определения низкомолекулярных наркотических веществ (НВ), в том числе опиатов, каннабиноидов, барбитуратов и их метаболитов, существует широкий круг иммунохимических методов: иммунохроматографический (ИХА), иммуноферментный (ИФА), поляризащюнно-флюоресцентный (ПФИА) методы, иммуноэлектрофорез, иммунорадиометрический анализ (РИА).

Перспективным направлением для исследователей является поиск новых неизотопных способов иммунохимического анализа, которые не требуют дорогостоящего приборного оснащения и могут использоваться в полевых условиях.

Таким требованиям для качественной диагностики удовлетворяет метод, основанный на реакции латексной агглютинации (ЛА). Он используется для скрининг-диагностики, включает выявление различных биомолекул: как белков, так и соединений низкомолекулярного ряда. Данный способ анализа имеет преимущества в сравнении с другими иммунохимическими методами определения. Он отличается простотой исполнения, позволяет одновременно анализировать несколько проб, не включает предварительную обработку анализируемого объекта, исследование занимает от 2 до 10 минут, не требует высоких материальных затрат. Диагностические тест-системы, полученные на основе полимерных микросфер, работающие по принципу ЛА и направленные на использование в медицинской и научно-исследовательской практике (диагностика инфекций, в кардиологии, в ревматологии, определение группы крови и резус - фактора), выпускаются российскими и зарубежными фирмами. Потребность в создании отечественных диагностикумов для определения НВ чрезвычайно велика.

Цель работы. Разработка эффективного иммунологического метода определения опиатов, каннабиноидов, барбитуратов в моче человека на основе реакции ЛА с использованием функциональных полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер.

Основные задачи исследования. В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Синтезировать полистирольные и полиметилметакрилатные суспензии с различными диаметрами частиц и узким распределением по размерам, и выбрать оптимальный размер диаметра частиц для создания диагностических наборов для определения опиатов, каннабиноидов, барбитуратов в моче человека.

2. Получить иммунохимические реагенты: синтетические антигены, содержащие в своем составе производные опиатов, каннабиноидов, барбитуратов, и наработать специфические антитела к перечисленным выше низкомолекулярным гаптенам.

3. Разработать методы получения новых белково-полимерных комплексов на основе использования полистирольных, полиметилметакрилатных полимерных суспензий и синтетических антигенов опиатов, барбитуратов, каннабиноидов.

4. Разработать метод экспресс - определения опиатов, барбитуратов, каннабиноидов на основе РЛА. Оценить возможность использования разработанного метода РИА в диагностической практике.

Научная новизна исследования определяется тем, что впервые:

— Разработан метод получения конъюгатов низкомолекулярных гаптенов -производных опиатов, барбитуратов и каннабиноидов - с полимерными полистирольными и полиметилметакрилатными микросферами. При существовании многообразия латексных диагностических систем в РФ и за рубежом (в мировой медицинской практике используется приблизительно 35 таких диагностикумов), не зарегистрировано ни одного диагностикума для определения наркотических веществ и их метаболитов.

— Для создания иммунохимических реагентов использованы полимерные микросферы со средним диаметром 0,6 мкм, устойчивые в буферных растворах в широком интервале рН, стабилизированные карбоксилсодержащим кремнийорганическим ПАВ.

— Установлены оптимальные параметры проведения РЛА при анализе опиатов, барбитуратов и каннабиноидов в моче человека.

Практическая значимость.

Разработан экспресс-метод анализа на основе метода ЛА для определения опиатов, каннабиноидов и барбитуратов в физиологической жидкости человека (моче) с чувствительностью, удовлетворяющей требованиям для иммунохимических методов анализа. Разработанные диагностические наборы обладают следующими параметрами: предел обнаружения (ПО) каннабиноидов составляет 50 нг/мл, ПО барбитуратов и опиатов составляет 300 нг/мл.

Автор защищает:

1. Получение и использование полистирольных и полиметилметакрилатных частиц со средним размером 0,6 мкм в качестве носителей биолигандов при создании диагностических наборов для определения опиатов, каннабиноидов и барбитуратов в моче человека.

2. Способы определения низкомолекулярных гаптенов (опиатов, барбитуратов, каннабиноидов) методом латексной агглютинации на основе полимерных монодисперсных микросфер.

3. Диагностическую значимость разработанных наборов реагентов для определения опиатов, барбитуратов, каннабиноидов методом ЛА и возможность их использования в медицинской практике для проведения экспресс-анализа указанных НВ.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались и обсуждались на IV междисциплинарном российском конгрессе «Человек и проблемы Зависимостей»: междисциплинарные аспекты», 28-29 апреля 2010 г., на V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры 2010», Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 21-25 июня 2010 г., на научно -практической конференции «Современные аналитические задачи определения наркотиков, лекарственных средств и других компонентов в различных матрицах» в г.Москва, 20 мая 2010 г.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и их обсуждение», Заключения, Выводов, Списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены

на_страницах машинописного текста, включая _таблицы, и_рисунков. Список

литературы содержит_работы

Во введении дано обоснование актуальности работы и сформулирована ее цель.

5

Глава 1. Литературный обзор. Приведены данные о современном состоянии и проблемах синтеза функциональных полимерных микросфер с различным диаметром частиц и узким распределением частиц по размерам (РЧР), о современных методах диагностики наркомании, об актуальности экспресс-методов диагностики наркомании, в том числе метода латексной агглютинации. Описаны методы получения и основные свойства специфических реагентов, используемых при создании диагностических наборов для определения опиатов, барбитуратов, каннабиноидов в биологических жидкостях человека методом ЛА.

Глава 2. В работе были использованы несколько видов полимерных суспензий.

Стирол - продукт марки «ч», очищали от стабилизатора 5%-ным водным раствором едкого натра, промывали водой до нейтральной реакции, сушили над прокаленным хлористым кальцием и дважды перегоняли в вакууме. Использовали фракцию, кипящую при I = 41 °С (10 мм рт.ст.) сЦ2°=0,906 г/см3, п^ 1,5450.

Метилметакрилат - продукт марки «ч». Для очистки дважды перегоняли в вакууме. Использовали фракцию, кипящую при I = 33 °С (55 мм рт.ст.) с!420=0,936 г/см3, псд20=1,413.

Инициатор полимеризации - персульфат калия (ПК) ^¡¡япа-АМпсЬ) - К^&Ов, применяли продукт марки «ХЧ», содержащий 99,9% активного вещества, дополнительной очистки не подвергался.

Поверхностно-активное вещество - а,ю-бис[10-карбоксидецил] полидиметилсилоксан (КС) общей формулы:

Синтезирован в ГНИИХТООС. ММ=946 г/моль, %(СООН) групп=9,82%, ri25°=132 сСт. Дисперсионная среда - бидистиллированная вода.

Для разработки диагностических наборов применяли: овальбумин (Serva, Германия, Гейдельберг), водорастворимый 1 - этил - 3 (3' - диметиламинопропил)карбодиимид («Реахим», Россия). Амилобарбитал натрий (барбамил) (Aldrich-Sigma), морфин, дельта-9-тетрагидроканнабинол предоставлены кафедрой токсикологической химии Медицинской Академии им. Сеченова. Конъюгированные антигены исходных НВ, содержащие в своем составе производные морфина, дельта-9-тетрагидроканнабинола, барбамила, ковалентно связанные с овальбумином, были получены в лаборатории иммунохимии ИФАВ РАН.

С)

Me Me Ме

О

, где Ме = СНз

Поликлональные антисыворотки против опиатов, барбитуратов и каннабиноидов были получены в лаборатории иммунохимии ИФАВ РАН.

Основными материалами исследований были образцы мочи больных опийной, барбитуратной и гашишной наркоманией с различной продолжительностью злоупотребления данными веществами, предоставленные наркодиспансером №1, ЮАО г. Москвы и московским научно-практическим центром наркологии (МНПЦН), г. Москва.

Для проведения исследований применялись следующие инструментальные и безинструментальные методы:

1. Скорость полимеризации определяли гравиметрическим методом. Глубину полимеризации рассчитывали по формуле: Р= (ДН/ДНтю)-100%, где Р - степень полимеризации, %; ДН - текущее изменение уровня в капилляре дилатометра, см; ДНтах - изменение уровня в капилляре дилатометра, соответствующее 100%-ной конверсии.

2. Размеры частиц полимерных суспензий определяли методом электронной сканирующей микроскопии на приборе "S — 570" фирмы "HITACHI".

3. Молекулярную массу полистирола и полиметилметакрилата рассчитывали по характеристической вязкости методом вискозиметрии.

4. Исследование коллоидной устойчивости полимерных микросфер в физиологических солевых растворах проводили при концентрации раствора NaCl в диапазоне значений от 0,1М до 0,25М, оценивали концентрацию соли при которой полимерная суспензия теряла устойчивость.

5. Иммуноферментный анализ для оценки активности и специфичности антител к гаптенам проводили на полистирольных планшетах фирмы Nunc (Дания). Учет результатов ИФА проводили на спектрофотометре Bio-rad microplate reader, модель 680, Япония, при 492 нм.

6. Реакцию латексной агглютинации (JIA) проводили на стеклянной пластинке черного цвета. Оценку результатов анализа проводили визуально.

7. В качестве подтверждающего метода при определении характеристик разработанного диагностического набора использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), "Милихром А-02", Россия.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Создание иммунохимического диагностического набора для анализа низкомолекулярных веществ, работающих по методу ЛА, включают следующие этапы:

• Выбор природы полимера и диаметра частиц полимерной суспензии для создания

диагностического набора реагентов.

• Разработка методов синтеза и выделения иммунохимических реагентов для получения

различных вариантов белково-полимерных комплексов, содержащих в своем составе низкомолекулярные гаптены: конъюгаты опиатов, барбитуратов и каннабиноидов с овальбумином.

• Создание диагностикума на основе выбранных оптимальных условий взаимодействия

синтезированных иммунохимических реагентов с исследуемой биологической жидкостью (мочой). Параметры, вариацией которых достигали оптимальных условий взаимодействия, являлись: концентрация полимерной суспензии, соотношение белкового конъюгата и полимерных микросфер при синтезе белково-полимерных комплексов, разведение антител кроличьих, специфичных к анализируемым низкомолекулярным веществам.

3.1 Синтез полимерных микрочастиц.

Так как никаких сведений в литературе по выбору природы полимера и размера полимерных частиц для получения диагностического набора для определения опиатов, каннабиноидов, барбитуратов в моче человека не было найдено, то для исследований предполагали использовать функциональные полистирольные и полиметилметакрилатные суспензии с разными диаметрами частиц и выбрать оптимальные, удовлетворяющие требованиям, предъявляемым для их использования для создания диагностических тест-систем: узкое распредлеление частиц по диаметру, устойчивость при хранении и иммобилизации биолигандов.

Полимерные микросферы получали в присутствии нерастворимого в воде карбоксилсодержащего кремнийорганического ПАВ, несовместимого с полимерной фазой. В присутствии этого ПАВ образуются полимерные микросферы со структурой типа «ядро-оболочка». Частицы с такой структурой удобны тем, что они устойчивы в процессе полимеризации из-за формирования на их поверхности структурно-механического фактора

8

устойчивости в результате вытеснения ПАВ образующимся полимером. В результате в поверхностном слое частиц появляются карбоксильные группы, способные после активации ковалентно связываться с функциональными группами биолиганда.

Исследования были начаты с выбора диаметра полимерных микросфер, синтезированных полимеризацией каждого из выбранных мономеров (стирола и метилметакрилата) в эмульсии в присутствии выбранного функционального стабилизатора.

Для выбора оптимального размера микросфер полимеризацию строла и метилметакрилата проводили в широком интервале объемных соотношений мономер:вода =1: (2-9), концентрация персульфата калия была постоянной и равной 1,0 мае. % в расчете на мономер, концентрация КС 1,0 мае. % в расчете на мономер, температура полимеризации 80±0,5 °С (рис. 1 и 2).

Рис.1. Кривые

конверсия - время, полученные при полимеризации стирола в

присутствии КС при различном

соотношении фаз мономер/вода: 1- 1:9; 2- 1:6; 3- 1:4.

0 50 100 150 200 250 300 350

Время, мин.

Ir-'

f

Рис.2. Кривые конверсия время, полученные npi полимеризации метилетакрилатг в присутствии КС прк различном соотношении фа^ мономер/вода: 1- 1:9; 2- 1:6; 3 1:4; 4-1:2..

Полученные кинетические кривые конверсия-время показывают, что полимеризация протекает практически до полной конверсии стирола за 4-5 часа, а полимеризация метилметакрилата за 1 час, при сохранении устойчивости реакционной системы.

В таблицах 1 и 2 приведены характеристики полученных полимерных суспензий.

Таблица 1. Характеристики полистирольных суспензий, стабилизированных КС при различном объемном соотношении фаз.

Соотношение фаз мономер/вода Среднечисловой диаметр частиц, мкм Полидисперстность Dw/Dn Устойчивость, моль/л (NaCl) Содержание коагулюма в суспензии

1:9 0,55 1,014 0,20 -

1:6 0,73 1,020 0,20 -

1:4 0,80 1,041 0,15 <1%

1:2 0,92 1,471 0 Коагулюм

/

Таблица 2. Характеристики полиметилметакрилатиых суспензий, стабилизированных КС при различном объемном соотношении фаз.

Соотношение фаз мономер/вода Среднечислов ой диаметр частиц, мкм Полидисперстность 0\у/0п Устойчивость, моль/л (ТЧаС1) Содержание коагулюма в суспензии

1:9 0,37 1,016 0,20 -

1:6 0,475 1,027 0,20 -

1:4 0,506 1,019 0,15 <1%

1:2 0,645 1,009 0 Коагулюм

С увеличением объемного содержания мономеров в эмульсии от 1:9 до 1:6 при одинаковой концентрации инициатора и стабилизатора устойчивость реакционной системы до объемного соотношения мономер/водная фаза, равного 1:4 соответственно, сохраняется высокой, о чём свидетельствуют данные об отсутствии коагулюма (табл. 1 и 2).

Были получены полистирольные суспензии диаметрами 0,55-0,92 мкм и полиметилметакрилатные суспензии с диаметрами 0,37-0,645 мкм.

Полученные полимерные суспензии характеризуется узким распределением частиц по размерам и сферической формой (рис.3 и 4).

□ .44 0 47 0 50 0.53 0.56 0.59 0 62 0.65 0 68 0.71 Диаиетр частиц, мкм

0 53 0.63 0.68 3.73 0.78 0.83 0.88 0.93 0.98 1.03 Диаметр частиц, мкм

Рис.3. Микрофотографии полистирольных частиц и гистограммы распределения частиц по размерам, полученные при объемном соотношении мономер/вода: а. 1:9; б. 1:6; в. 1:4.

/

Рис.4. Микрофотографии и гистограммы распределения полиметилметакрилатных частиц, при соотношении фаз мономер/вода: 1- 1:9; 2- 1:6; 3- 1:4; 4- 1:2

Для создания диагностического набора для анализа низкомолекулярных наркотических веществ были выбраны монодисперсные полимерные и метилметакрилатные микросферы с диаметром 0,6 мкм, отвечающие всем предъявляемым требованиям, содержащие карбоксильные группы на поверхности.

3.2 Создание диагностических наборов для определения опиатов, барбитуратов, каннабиноидов в моче человека методом латексной агглютинации.

Метод латексной агглютинации - это иммунохимический метод, основанный на агрегации модифицированных полимерных частиц, происходящей вследствие взаимодействия антиген-антитело.

Реакция латексной агглютинации считается положительной при наблюдении агглютинации микрочастиц суспензии, проявляющейся в слипании и осаждении полимерных частиц из первоначально стабильной суспензии. Результат латексной агглютинации выявляется простым визуальным наблюдением: раствор мутнеет или выпадает творожистый осадок белого цвета или реже - окрашенный.

В настоящей работе была использована схема проведения обратной реакции ЛА. Схема протекания реакции обратной латексной агглютинации показана на рисунке 5.

- конъюгат латекса с антигеном Рисунок 5. Схема протекания реакции

обратной латексной агглютинации.

- специфические антитела

- анализируемое низкомолекулярное вещество

Комментарии к рисунку 5:

А. В анализируемом растворе присутствует низкомолекулярный аналит, который конкурирует за сайты связывания с иммобилизованными на поверхности полимерных частиц антигенами. Антитела преимущественно связываются со свободными антигенами с образованием низкомолекулярных комплексов, агглютинации не наблюдается.

Б. В анализируемом растворе отсутствует аналит, свободные антитела связываются с иммобилизованными на поверхности полимерных частиц антигенами. Агглютинация наблюдается.

На основе синтетических полимерных суспензий, синтез которых описан в п.3.1, были разработаны антигенные диагностические системы. На поверхность полистирольных и

полиметилметакрилатных частиц иммобилизовали различное количество гаптенов: морфин-овальбумин, барбамил-овальбумин и ТГК-овальбумин.

Рабочими параметрами, характеризующими эффективность диагностических наборов реагентов, являются: 1) чувствительность, т. е. предел обнаружения определяемого вещества; 2) специфичность, т.е. способность диагностических наборов выявлять вещества только определенного химического класса или других структурно-родственных классов, и отсутствие перекрестных реакций с веществами других классов, а также 3) стабильность или срок годности диагностических наборов реагентов, т.е. время, в течение которого сохраняется их эффективность.

3.2.1 Оптимизация условий реакции ЛА

3.2.1.1 Подбор концентрации полимерных микрочастиц

Был проведен подбор рабочей концентрации полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер с карбоксильными группами на поверхности для последущего синтеза белково-латексных комплексов. Иммобилизацию белковых комплексов на полимерные сферы двух типов проводили при концентрациях полимерной суспензии 8, 6, 4 и 2% в расчете на сухое вещество.

Эффективность выбранной полимерной суспензии для каждой концентрации определяли методом прямой ЛА. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Выбор оптимальной концентрации полимерной суспензии

Рабочая концентрация полимерной суспензии 8% 6% 4% 2%

полистирольная суспензия 1 1 1 1 ++++ N11 +

полиметилметакрилатная суспензия 1111 ++++ N11 +

Было показано, что 4%-ная концентрация полимерной суспензии является оптимальной как для полистирольных, так и для полиметилметакрилатных частиц с диаметром 0.6 мкм, так как она позволяет получить достоверный результат анализа при минимальном расходе реагентов.

3.2.1.2 Синтез белково-полимерных комплексов. Подбор концентрации белкового конъюгата для синеза белково-далимерного комплекса.

Для синтеза белково-полимерных комплексов белковые конъюгаты анализируемых НВ (морфина, барбамила, Д-9-ТГК) иммобилизовали на полимерные микросферы двух типов.

Белково-полимерных комплексы синтезировали стандартным карбодиимидным методом с использованием водорастроримого 1-этил-3(3'-

диметиламинопропил)карбодиимида, выдерживая раствор полимерной суспензии с требуемым белковым конъюгатом в течение часа при комнатной температуре.

Схема синтеза белково-полимерных комплексов приведена на рис.б.

СООН СООН

1 ! ,соон

мн2-рго1-й-^

СООН

СООН

CONH - рго! - и

I

П - ргЫ - нмос / соон

ноос ч\ сомн - рго! - П

и - рго1 - нмос " сомн- ргог - и

ноос (

i соон

сомн - рго( - □

СООН СООН

;оон

поверхности.

соон " Частица латекса с карбоксильными группами на

/ - СООН

-' ""--СООН

СООН ■ "СООН СООН

] - Молекула низкомолекулярного наркотического

вещества в составе белкового или белково-полимерного комплекса

Рисунок 6. Схема синтеза белково-полимерных комплексов.

Выбирали оптимальное количество содержания белкового конъюгата в белково-полимерных комплексах. Исследования проводили методом прямой ЛА в интервале концентраций белкового конъюгата 0.01 - 1 мг/мл. Полученные результаты представлены в таблицах 4,5.

Таблица 4. Оценка эффективности латексной агглютинации при подборе оптимальной концентрации анализируемых белковых конъюгатов в случае использования полистирольных полимерных микрочастиц.

Концентрация исследуемого белкового конъюгата, мг/мл 1 0.5 0.1 0.05 0.01

Морфин - овальбумин ++ ++ +-Н-+ ++ ++

Барбамил - овальбумин + + +++ + +

Д-9-ТГК - овальбумин + + +++ + -

Таблица 5. Оценка эффективности латексной агглютинации при подборе оптимальной концентрации анализируемых белковых конъюгатов в случае использования полиметилметакрилатных полимерных микрочастиц.

Концентрация исследуемого белкового конъюгата, мг/мл 1 0.5 0.1 0.05 0.01

Морфин - овальбумин -Н- ++ +++ ++ +

Барбамил - овальбумин ++ ++ ++ + +

Д-9-ТГК - овальбумин ++ ++ +++ ++

В ходе эксперимента было установлено, что наиболее наглядно и четко агглютинация наблюдается при концентрации белковых конъюгатов, равной 0.1 мг/мл

3.2.1.3 Подбор разведения антител кроличьих, специфичных к опиатам, барбитуратам, каннабиноидам.

Оптимальное разведение антител, специфичных к выбранному аналиту - важный параметр, регулирующий качество РЛА.

Подбор разведений для антител, специфичных к анализируемым НВ (морфину, барбамилу, Д-9-ТГК), проводили для каждого белково-полимерного комплекса, содержащего различное количество белкового конъюгата, связанного с полистирольными и полиметилметакрилатными микросферами. Исследования проводили методом прямой ЛА. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6. Подбор рабочего диапазона разведений для кроличьих антител, специфичных к исследуемому аналиту (морфину, барбамилу, Д-9-ТГК).

Анализируемое НВ Иммобилизация белковых конъюгатов на полистирольные частицы, мг/мл

1 0.5 0.1 0.05 0.01

морфин 1/64-1/256 1/64-1/128 1/8 -1/512 1/32-1/128 1/16-1/512

барбамил 1/128-1/256 1/64-1/128 1/8 -1/256 1/8-1/128 1/4-1/16

ТГК 1/128-1/256 1/256-1/512 1/32-1/1024 1/161/64 1/8-1/16

Проведенный анализ показывает, что конъюгаты, полученные при иммобилизации белковых конъюгатов, взятых в концентрации 0.1 мг/мл, работают в наиболее широком диапазоне разведений антител, специфичных к выбранным наркотическим веществам.

3.2.1.4 Определение чувствительности (предела обнаружения) разработанных диагностических наборов.

При установлении чувствительности диагностического теста, т.е. предела обнаружения определяемого вещества (морфина, барбамила и Д-9-ТГК), реакцию ЛА по торможению проводили с пробами, содержащими двукратно снижающиеся концентрации анализируемого гаптена. Контролем в РЛА являлся буфер, служивший средой реакции. Положительной считалась реакция в том случае, когда не происходило образования видимых невооруженным глазом агрегатов. В контрольном эксперименте такие агрегаты присутствовали. Результаты определения предела обнаружения опиатов, бабитуратов и каннабиноидов представлены в таблице 7.

Таблица 7. Предел обнаружения диагностических наборов для анализа опиатов, барбитуратов и каннабиноидов, разработанных на основе полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер, нг/мл.

Группа наркотических веществ Диагностический набор на основе полистирольных микросфер Диагностический набор на основе полиметилметакрилатных микросфер

опиаты 300 300

барбитураты 300 600

каннабиноиды 50 150

Наиболее высокий предел обнаружения получен в случае использования полистрольных микросфер. В этом случае диагностический набор позволяет выявлять низкомолекулярные наркотические вещества с пределом обнаружения 300 нг/мл (опиаты), 300 нг/мл (барбитураты), 50 нг/мл (каннабиноиды). В то же время предел обнаружения диагностических наборов с использованием пММА микросфер составил 600 нг/мл(барбитураты), 300 нг/мл(опиаты) и 150 нг/мл(каннабиноиды).

Чувствительность (предел обнаружения) диагностических наборов, полученных с использованием полистрольных микросфер, сопоставима с чувствительностью методов ИФА, ПФИА и ИХА. Полученные результаты соответствуют требованиям, предъявляемым к иммунохимическим методам анализа.

Далее были исследованы характеристики наиболее чувствительных диагностических наборов, полученных с использованием полистирольных микросфер.

3.2.1.5 Определение специфичности разработанных диагностических наборов.

Специфичность определяли путем проведения перекрестных реакций с соединениями, близкими по структуре анализируемым НВ. Высокие проценты перекрестного реагирования наблюдались в случае наиболее близких к аналигу по структуре соединений. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8. Определение специфичности диагностических наборов РЛА для опиатов, барбитуратов, каннабиноидов.

Анализируемые вещества Процент перекрестного реагирования, %

Морфин Барбанил А9-ТГК

Морфин 100 <0,1 <0,1

Героин 100 <0,1 0,1

Барбанил <0,1 100 <0,1

Фенобарбитал <0,1 100 0,1

Д9-ТГК <0,1 <0,1 100

Кокаин <0,1 <0,1 <0,1

Эфедрин <0,1 0,1 од

Таким образом, разработанные диагностические наборы для определения низкомолекулярных HB методом латексной агглютинации на основе полимерных микросфер являются специфичными по отношению к индивидуальным веществам и позволяют определять морфин, барбамил и А-9-ТГК в присутствии большинства близких по структуре соединений, то есть являются групп-специфичными.

3.3. Апробация разработанных диагностических наборов и статистический анализ результатов.

Апробацию разработанных диагностических наборов проводили в Московском Научно-практическом центре наркологии Департамента здравоохранения г.Москвы (МНПЦ Наркологии) и в Наркологическом диспансере №1 г.Москвы (НД №1). В соответствии со стандартом лабораторной практики в дальнейшем проводилась оценка достоверности результатов разработанного метода анализа. Для этого результаты, полученные при проведении анализа, сравнивались с результатами исследования подтверждающим стандартным методом анализа - высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В ходе испытаний разработанных диагностических наборов были использованы образцы мочи 67 человек, в том числе 47 проб были взяты от пациентов, поступивших в стационар в состоянии наркотического опьянения в течение последних трех суток, и 20 проб были взяты от здоровых людей. Пробы мочи были протестированы методом ЛА с использованием разработанных диагностических наборов. Кроме того, данные биообразцы анализировали с помощью подтверждающего метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ("Милихром А-02", Россия). Сводные данные по количеству истинно положительных (ИП), истинно отрицательных (ИО), ложноположительных (ЛП) и ложноотрицательных (ЛО) результатов, а также данные по чувствительности (Ч) и специфичности (С) определения каждого класса наркотиков, приведены в таблице 9.

Таблица 9. Статистические характеристики разработанных диагностических наборов для анализа опиатов, барбитуратов, каннабиноидов, полученные в ходе медицинских испытаний в МНПЦ Наркологии и НД №1 г. Москвы.

Определяемая группа веществ ИП ИО ЛП ЛО ч, % С,%

опиаты 19 19 0 0 100 100

барбитураты 18 20 0 1 95 100

каннабиноиды 14 19 1 1 94 95

Таким образом, статистическая чувствительность разработанных диагностических наборов составила 94-100%, их статистическая специфичность - 95-100%. Данные характеристики соответствуют требованиям для иммунохимических методов анализа, принятым в мировой лабораторной практике.

Все вышеприведенные данные позволяют позиционировать разработанные методики для определения опиатов, каннабингоидов и барбитуратов в моче человека, как достоверные и высокоспецифичные экспрессные способы выявления наркотических веществ.

Выводы.

1. Определены оптимальные размеры функциональных полистирольных и полиметилметакрилатных частиц для их использования в качестве носителя биолиганда.

2. Получены иммунохимических реагенты: синтетические конъюгированные антигены, содержащие в своем составе производные опиатов, каннабиноидов, барбитуратов.

3. Разработаны методы получения новых белково-полимерных комплексов исследуемых наркотических веществ (опиатов, барбитуратов, каннабиноидов) с использованием различных полимерных суспензий.

4. Разработаны новые методы иммуноанализа опиатов, барбитуратов и каннабиноидов на основе реакции латексной агглютинации. Аналитическая чувствительность разработанных диагностических наборов, полученных на основе полистирольных полимерных микросфер, составила 300 нг/мл для определения опиатов и барбитуратов, 50 нг/мл для определения каннабиноидов.

5. Показана возможность использования указанных методов в диагностической практике. Сравнение результатов одновременного анализа образцов мочи методами ЛА и ВЭЖХ показало высокую кореляцию.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Солодухина Н.М., Злыднева Л.А., Левшенко E.H., Мягкова М.А., Грицкова И.А., Полистирольные микросферы как носители биолиганда при определении Д-9-тетрагидроканнабинола в моче человека // Биотехнология, 2012, №1, С. 90-96.

2. Солодухина Н.М., Мягкова М.А., Абраменко Т.В., Грицкова И.А. Анализ наркотических веществ метом латексной агглютинации // Вестник МИТХТ, 2011, том 6, №4, стр. 93-96.

3. Солодухина Н.М., Абраменко Т.В., Мягкова М.А., Грицкова И.А. Полимерные микросферы для определения морфина в физиологических жидкостях человека // Вестник МИТХТ, 2010, том 5, № 2, стр. 55-59.

4. Н.М.Солодухина, Т.В. Абраменко, В.В.Пушкина, В.С.Морозова, М.А.Мягкова, И.А.Грицкова. Экспресс-метод для определения опиатов в биологических жидкостях человека. // Микроэлементы в медицине, том 11, вып. 3-4, сент. 2010, стр. 71-74.

5. Солодухина Н.М., Абраменко Т.В., Пушкина В.В., Морозова B.C., Мягкова М.А., Грицкова И.А. Определение морфина в биологических жидкостях человека методом латексной агглютинации. // Научно практическая конференция «Современные аналитические задачи определения наркотиков, лекарственных средств и других компонентов в различных матрицах». Москва, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 20 мая 2010, с. 25-26.

6. Солодухина Н.М. Выявление факта употребления опиатов методом латексной агглютинации. // Сборник «Материалы IV междисциплинарного российского конгресса «Человек и проблемы Зависимостей»: междисциплинарные аспекты». 28-29 апреля 2010, стр. 46-47.

7. Грицкова И.А., Мягкова М.А., Абраменко Т.В., Солодухина Н.М. Полимерные микросферы для определения опиатов в биологических жидкостях человека. // Сборник «Материалы V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры 2010», Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 21-25 июня 2010, с. 40.

Подписано в печать 10.04.12 Заказ № 56 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. ООО «Генезис» 119571, г. Москва, пр-т Вернадского,86 www.copycentr.su (494) 434-83-55

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Солодухина, Надежда Михайловна, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТОНКИХ ХИМИЧЕСКИХ

ТЕХНОЛОГИЙ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

61 12-2/448

СОЛОДУХИНА НАДЕЖДА МИХАЙЛОВНА

На правах рукописи

АНАЛИЗ ОПИАТОВ, БАРБИТУРАТОВ И КАННАБИНОИДОВ МЕТОДОМ ЛАТЕКСНОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР

Специальности: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология) 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: Доктор биологических наук МЯГКОВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

Доктор химических наук ГРИЦКОВА ИНЕССА АЛЕКСАНДРОВНА

Москва 2012

Оглавление

Введение...................................................................................................................4

Глава 1. Литературный обзор.................................................................................7

1.1 Актуальность проблемы наркомании..........................................................7

1.2. Характеристики опиатов, каннабиноидов, барбитуратов........................8

1.3 Методы диагностики наркомании.............................................................11

1.3.1. Иммунохимические методы анализа наркотических веществ........13

1.3.2. Экспресс методы диагностики наркомании: Метод РОСА и метод на основе реакции латексной агглютинации....................................................17

1.4. Использование полимерных носителей для создания

биотехнологических тест-систем............................ ..........................................27

Глава 2. Экспериментальная часть............................ ..........................................43

2.1. Исходные вещества и материалы..............................................................43

2.2 Методы синтеза и исследования................................................................44

2.2.1 Синтез и получение рабочих характеристик полистирольных (пСт)

и полиметилметакрилатных (пММА)суспензий с разными диаметрами,

содержащие карбоксильные группы на поверхности................................45

2.2.2. Синтез и получение рабочих характеристик иммунологических

реагентов.........................................................................................................52

Глава 3. Результаты и обсуждения......................................................................58

3.1 Синтез и определение свойств полимерных микрочастиц.....................61

3.1.1 Синтез полистирольных микрочастиц................................................63

3.1.2 Синтез полиметилметакрилатных микрочастиц................................69

3.2 Синтез белковых конъюгатов морфина, барбамила, А9-ТГК.................75

3.3 Разработка способа иммуноанализа низкомолекулярных соединений (опиатов, барбитуратов, каннабиноидов) на основе реакции латексной агглютинации.....................................................................................................77

3.3.1 Оптимизация условий проведения реакции латексной агглютинации..................................................................................................78

3.3.2. Оценка аналитических параметров разработанных диагностических наборов на выявления наркотических веществ в моче методом латексной агглютинации..................................................................................................84

3.3.3. Апробация разработанных диагностических наборов реагентов... 90

3.3.4. Определение времени хранения разработанных диагностических наборов реагентов..........................................................................................96

Выводы...................................................................................................................98

Сокращения............................................................................................................99

Введение

В последние годы в нашей стране и в мире злоупотребление наркотическими веществами (НВ) приобретает все более широкие масштабы и негативно влияет на все сферы деятельности человека [1]. Начальным этапом выявления и предупреждения наркомании являются массовые обследования людей с помощью скрининговых методов анализа. К ним, в первую очередь, относятся способы, включающие различные методы иммуноанализа с инструментальной либо визуальной детекцией. Наибольшее распространение получили иммунофлуоресцентный, иммуноферментный, иммунохроматографические методы.

Большое значение имеет разработка методов экспресс диагностики для быстрого и достоверного выявления факта употребления НВ в «полевых» условиях (в отсутствие приборного оснащения).

В настоящее время для проведения экспресс анализа на выявление НВ в биологических жидкостях человека используются иммунодиагностические тест-системы, включающие применение функциональных частиц монодисперсных суспензий. Такие тест-системы позволяют получить достоверный результат, обладают высокой скоростью проведения анализа (10-15 минут), простотой интерпретации полученных результатов, низкой стоимостью исследования.

Принцип работы указанных диагностических тест-систем основан на высокоспецифичной иммунохимической реакции между антигеном и антителом, которые предварительно иммобилизовали на полимерные носители. При проведении анализа полимерные конъюгаты, содержащие антигены и антитела взаимодействуют и образуют пространственные сетки -агломераты, наличие которых в растворе может быть зарегистрировано различными методами. Например, методом спектрофотометрии, нефелометрии или простым визуальным наблюдением.

Цель работы - Разработка эффективного иммунологического метода определения наркотических веществ (опиатов, каннабиноидов, барбитуратов) в физиологической жидкости человека (моче) на основе реакции латексной агглютинации с использованием функциональных полистирольных и

полиметилметакрилатных микросфер.

Актуальность темы диссертации определяется важностью разработки высокоэффективного, недорогого, простого в исполнении, не требующего специального оборудования экспресс-метода определения наркотических веществ в физиологической жидкости человека, основанного на реакции латексной агглютинации, как части диагностического комплекса мер, направленных на предупреждение распространения и мониторинг наркомании в РФ.

Научная новизна исследования определяется тем, что впервые:

— Разработан метод получения конъюгатов низкомолекулярных гаптенов - производных опиатов, барбитуратов и каннабиноидов - с полимерными полистирольными и полиметилметакрилатными микросферами.

— Для создания иммунохимических реагентов использованы полимерные микросферы со средним диаметром 0,5 мкм, стабилизированные карбоксилсодержащим кремнийорганическим ПАВ, устойчивые в буферных растворах.

— установлены оптимальные параметры проведения РЛА при анализе опиатов, барбитуратов и каннабиноидов в моче человека.

Практическая значимость.

Разработан новый экспресс-метод анализа на основе метода ЛА для определения опиатов, каннабиноидов и барбитуратов в физиологической жидкости человека (моче) с чувствительностью, удовлетворяющей требованиям иммунохимических методов анализа. Разработанные

диагностические наборы реагкнтов обладают следующими параметрами: предел обнаружения (ПО) каннабиноидов составляет 50 нг/мл, ПО барбитуратов и опиатов составляет 300 нг/мл.

Разработанные диагностические наборы являются готовым продуктом и могут внедряться на рынке изделий медицинского назначения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование полистирольных и полиметилметакрилатных частиц со средним размером 0,5 мкм в качестве носителей биолигандов при создании диагностических наборов реагентов для определения опиатов, каннабиноидов и барбитуратов в моче человека.

2. Способы определения низкомолекулярных гаптенов (опиатов, барбитуратов, каннабиноидов) методом латексной агглютинации на основе полимерных монодисперсных микросфер.

3. Определение диагностической значимости разработанных наборов реагентов для определения опиатов, барбитуратов, каннабиноидов методом ЛА и возможность их использования в медицинской практике для проведения экспресс-анализа указанных НВ.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Актуальность проблемы наркомании.

Под наркоманией принято понимать физическую и психологическую зависимость от наркосодержащих веществ, которые с течением времени наносят непоправимый вред или разрушают человеческий организм [2,3].

По данным общероссийского мониторинга, общая численность лиц злоупотребляющих наркотическими средствами составляет 5,99 млн. человек, среди них 1,87 млн. человек - это подростки и молодежь. Эффективность борьбы с распространением наркомании зависит от решения целого комплекса задач, которые должны быть представлены в единой концепции программных мероприятий, базирующихся на глубоком анализе распространения отдельных видов наркотиков. В соответствии с этим Правительство и Президент РФ за последний год приняли ряд мер по совершенствованию антинаркотической политики. В 2010 г. утверждена Стратегия государственной антинаркотической политики [4], в которой одной из важнейших мер в борьбе с наркоманией является своевременная диагностика наркозависимости, тестирование учащихся образовательных заведений и работников ряда профессий, а также совершенствование системы реабилитации больных наркоманией. Внедрение на региональном и федеральном уровне системы раннего выявления немедицинского потребления психоактивных веществ в различных социальных группах населения на основе использования новых скрининговых методов анализа позволит определять в динамике ситуацию, связанную со злоупотреблением конкретными видами наркотических средств, что обеспечит возможность оперативного контроля за наркоситуацией и своевременного целенаправленного воздействия на группы риска.

Согласно данным ежегодного доклада, который представил исполнительный директор Управления по наркотикам и преступности ООН /ЮНОДК, в 2010 году, наиболее широко употребляемым наркотическим веществом в мире является каннабис (почти 150 млн потребителей). Немногим более 15 млн человек употребляют опиаты (героин, морфин, опий, синтетические опиаты), в том числе приблизительно 10 млн человек употребляют героин. Распространенным случаем является ситуация, когда употребляются сразу несколько психоактивных веществ сразу. Такое явление называется полинаркоманией. Параллельно с опиатами и каннабиноидами наркоманы употребляют седативные успокаивающие препараты наркотического ряда барбитуратов вследствие нарушения сна [5,6].

1.2. Характеристики опиатов, каннабиноидов, барбитуратов.

Опиаты на фармакологическом и «черном» рынках представлены естественными алкалоидами опиума (морфин, кодеин, тебаин, наркотин) и полусинтетическими производными алкалоидов опиума (героин (диацетилморфин), дигидрокодеин, дезоморфин).

Источники опиатов - Мак опийный (лат. Papaver somniferum)

Рисунок 1.1. Морфин, ИЮПАК: 7,8-дидегидро-4,5-эпокси-17-метилморфинан-3,6-диол

н

он-УЛМ

X I

Рисунок 1.2. Героин, ИЮПАК: 7,8-Дидегидро-4,5-эпокси- 17-метилморфинан-3,6-диол диацетат

Все опиаты, в том числе и героин, имеют определённое структурное сходство с эндорфинами. У эндогенных (произведённых организмом) опиатов структура молекулы позволяет точно взаимодействовать с нужным рецептором. У экзогенных опиатов совпадение молекулы и рецептора относительно невелико, что значительно сказывается на эффективности их действия и селективности. Эндорфины, в зависимости от типа, действуют на строго заданную группу рецепторов, а опиаты — на все сразу. По сравнению с эндорфинами для достижения одинакового эффекта необходимая доза опиатов должна быть больше.

Морфин также связывается с 8- и к-опиоидными рецепторами. Вклад этих рецепторов в общее фармакологическое действие героина остается неизвестным [7].

Канннабиноиды - обширная группа природных жирорастворимых психоактивных веществ, получаемая из листьев и цветков верхних частей растения каннабис (cannabis, конопля). Основной ингредиент, ответственный за психотропные свойства конопли - это ТГК, транс-делъта9-тетрагидро-каннабинол.

Психоактивное действие каннабиоидов обусловлено их способностью воздействовать на каннабиоидные рецепторы СВ1 и СВ2 [8]. Рецепторы группы СВ1 расположены в центральной нервной системе (в гиппокампе, коре головного мозга, подкорковых узлах, стриатуме, мозжечке и спинном мозге), их наибольшая концентрация наблюдается в ответственных за координацию движений, обучение и память участках мозга, обычно эти рецепторы активируются анадамидами и способствуют торможению вызванной избытком дофамина гиперактивности. Рецепторы СВ2 обнаруживаются в селезёнке, поджелудочной железе, яичниках и в др. железистых тканях, они хорошо связывают экзогенные каннабиоиды, но демонстрируют низкое сродство с анандамидами (эндогенными каннабиноидами).

Барбитураты - чрезвычайно обширный класс синтетических психоактивных веществ, широко распространенный в медицинской практике в качестве седативных препаратов.

Все барбитураты являются производными барбитуровой кислоты, которая была впервые синтезирована в 1863 г. путем конденсации мочевины и малоновой кислоты.

о

ны мн

о

о

н

Барбамил, ИЮПАК: 5-Этил-5-изоамилбарбитурат натрий

О

Барбитурова кислота, ИЮПАК: 2,4,6-

тригидроксипиримидин

Рисунок 1.4. Барбитуровая кислота и ее производные.

Для разработки биотехнологических тест-систем на определение барбитуратов в физиологических жидкостях человека удобнее использовать барбамил - вещество, обладающее всеми психоактивными свойствами барбитуратов, однако отличающееся высокой растворимостью в воде[9,10].

Барбитураты взаимодействуют с барбитурат-бензодиаземиновым рецептором, нековалентно связанным с рецептором гама аминомасляной кислоты. В результате повышается его сродство к гамма аминомасляной кислоте, что приводит к открытию калиевых и хлорных каналов и снижению возбудимости нервной системы. Передача нервных импульсов в ЦНС замедляется, что клинически выражается седативным, мышечно-расслабляющим, противосудорожным и амнестическим эффектом.

1.3 Методы диагностики наркомании

Для выявлении психоактивных веществ в биологических жидкостях и тканях человека используются различные аналитические методы [11,12], сертифицированные Федеральной службой по надзору в сфере

здравоохранения и социального развития РФ. Все методы можно разделить на две основные группы:

1. Предварительные методы используют для скрининга образцов при массовых обследованиях. Они являются наиболее простыми, недорогими и позволяют быстро сделать заключение о наличии наркотических веществ в исследуемом образце. При получении положительного результата образец направляют на проведение подтверждающего анализа. К указанной группе методов относятся различные виды высокотехнологичного иммунохимического анализа: твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) [13,14,15], поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) [16,17,18], радиоиммуноанализ (РИА), иммунохроматографические методы анализа.

Перспективным, относительно «молодым» методом является иммунохимический метод выявления фактов употребления наркотиков, в отдаленные промежутки времени (до 4 месяцев после последнего попадания психоактивных веществ в организм). Он основан на определении антител к наркотическим веществам в крови человека [19,20]. Этот метод широко используется в наркодиспансерах для подтверждения ремиссии наркозависимых и снятия их с учета, также его применяют при приеме на работу и плановых медицинских осмотрах сотрудников силовых ведомств и авиации [21].

2. Вторую группу составляют подтверждающие методы анализа. Они применяются для идентификации и количественной оценки содержания психоактивных веществ во всех видах биоматериала. К данной группе относятся хроматомасс-спектральные методы. Это газовая хроматография с масс-спектрометрической детекцией, жидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография. Перечисленные методы применяют для экспертизы в химико-токсикологических лабораториях (ХТЛ) и судебно-медицинских лабораториях [22,23]. Использование в качестве биообъектов

волос и ногтей позволяет определить факты приёма наркотиков в отдаленные промежутки времени - спустя 3-6 месяца после последнего употребления психоактивного вещества [24].

Все методы, относящиеся к подтверждающим, являются трудоемкими, дорогими, требуют применения дорогостоящего оборудования.

При решении вопросов, касающихся ответственности за административные и уголовные правонарушения, юридическую силу имеет только заключение ХТЛ, полученное с применением подтверждающего метода [25].

Как указано выше, начальным этапом выявления и предупреждения наркомании являются массовые обследования людей с помощью скрининговых методов анализа. К ним, в первую очередь, относятся способы, включающие различные методы иммуноанализа с инструментальной либо визуальной детекцией.

Для совершенствования направления предварительного выявления наркомании среди больших групп населения большое значение имеет разработка методов экспресс диагностики для быстрого и достоверного выявления факта употребления наркотических в�