Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попов, Сергей Владимирович

Введение.

Глава I Обзор литературы

1. Фагоцитарные реакции нейтрофилов и макрофагов.

2. Способность фагоцитов распознавать полисахариды и гликоконъюгаты.

3. Регуляция функциональной активности лейкоцитов полисахаридами растений.

Строение растительных полисахаридов.

Стимуляция фагоцитоза полисахаридами грибов и водорослей.

Взаимодействие лейкоцитов с гликанами и гликуроногликанами высших растений.

Глава II Материалы и методы исследования

1. Растворы и реактивы.

2. „ Характеристика полисахаридных препаратов.

3. Получение суспензии нейтрофилов и макрофагов.

4. Оценка адгезивных свойств фагоцитов.

5. Определение фагоцитарного показателя.

6. Регистрация кислородного взрыва.

7. Измерение активности лизосомальных ферментов.

8. Подсчет лейкоцитарного числа.

9. Статистическая обработка результатов.

Глава III Результаты исследования

1. Функциональная активность фагоцитов при действии растительных полисахаридов.

Адгезия нейтрофилов и макрофагов на пластик.

Поглощение частиц латекса.

Секреторная дегрануляция.

2. Влияние адгезии на активацию нейтрофилов и макрофагов полисахаридами растении.

Реактивность макрофагов, адгезированных с помощью рецептора комплемента или рецептора-«мусорщика»

3. Секреция лизосомальных ферментов и образование кислородных радикалов фагоцитами в бескальциевом и гиперкальциевом растворе.

4. Влияние оубаина на миелопероксидазную активность макрофагов.

5. Количество фагоцитов в крови и смыве из брюшной полости мышей после внутрибрюшинного введения полисахаридов.

Глава IV Обсуждение результатов

1. Характеристика реакции нейтрофилов и макрофагов на полисахариды растений.

2. Зависимость функционального ответа клеток от адгезии.

3. Возможные механизмы стимуляции фагоцитов растительными полисахаридами.

4. Реакция лейкоцитов на введение полисахаридов in vivo.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды"

Актуальность темы. Взаимодействие нейтрофилов крови и тканевых макрофагов с углеводсо держащими биополимерами микроорганизмов, апоптических и опухолевых клеток рассматривается многими исследователями как реакция распознавания генетически чужеродного материала фагоцитирующей системой млекопитающих (Малов, Пак, 1998; Devitt et al, 1998; Lis, Sharon, 1998). Фагоциты поглощают и разрушают липополисахариды и пептидогликаны бактерий, глюканы дрожжей, протеогликаны и гликопротеины эндогенного происхождения (Вершигора, Позур, 1986; Shepherd, Hoidal, 1990; Ulevitch, Tobias, 1997; Michalek et al, 1998). Какие именно углеводные структуры могут вызывать фагоцитарную и провоспалительную активность лейкоцитов, остается неясным.

Чужеродными объектами для фагоцитирующей системы человека и животных являются гликуроногликаны и гликаны, выделенные из высших растений. Лейкоциты передвигаются в направлении растительных полисахаридов при их внутрибрюшинном введении лабораторным животным (Лоенко и др., 1997), а также вырабатывают цитотоксичные продукты и провоспалительные цитокины при инкубации с пектинами, арабиногалактанами и маннанами растений в условиях in vitro (Wagner, 1995; Zhang, Tizará, 1996; Chanarat et al, 1997; Оводов, 1998). Однако нейтрофилы и макрофаги реагируют далеко не на все растительные полисахариды, что указывает на существование у полисахаридной молекулы структурных особенностей, которые могут восприниматься фагоцитами как признак чужеродного агента и служить сигналом к активации клетки. Для выявления этих особенностей необходимо определить характер реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды в зависимости от их структурно-химических свойств. В то же время, сведения литературы о функциональных реакциях фагоцитов, по которым можно судить о результатах непосредственного взаимодействия клетки с молекулой полисахарида, малочисленны. Слабо охарактеризованы адгезивная и поглотительная способность клеток, секреторная дегрануляция и образование кислородных радикалов в ответ на действие растительных полисахаридов. Неизвестно, как влияет исходное функциональное состояние фагоцитов, прежде всего адгезивность, на взаимодействие с полисахаридами растений. Не установлены рецепторы, с помощью которых нейтрофилы и макрофаги связывают растительные полисахариды, а также мембранные транспортные системы, осуществляющие трансформацию сигнала, инициированного растительными полисахаридами.

Выяснение связи между структурой и физиологической активностью полисахаридов важно для понимания принципов регуляции фагоцитоза, и приобретает особое значение в связи с необходимостью создания иммунокорригирующих средств.

Цель настоящего исследования заключалась в определении способности нейтрофилов крови и тканевых макрофагов млекопитающих отвечать фагоцитарными реакциями на действие гликанов и гликуроногликанов растений.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие основные задачи:

- исследовать адгезивные свойства, поглотительную способность, лизосомальную активность и образование кислородных радикалов фагоцитами при инкубации с растительными полисахаридами;

- сравнить способность адгезированных и неадгезированных фагоцитов генерировать активные формы кислорода под действием полисахаридов растений;

- определить секреторную активность макрофагов, вызванную гликанами и гликуроногликанами растений, при изменении содержания кальция во внеклеточном растворе;

- выявить роль мембранной Na-K-АТФ-зы в стимуляции макрофагов растительными полисахаридами.

Научная новизна. Исследована функциональная активность нейтрофилов крови и тканевых макрофагов млекопитающих в присутствии ранее не изученных полисахаридов растений: лемнана из ряски Lemna minor, силенана из смолевки Silene vulgaris, вибурнана из калины Viburnum opulus и пицеана из хвои ели Picea obovata. Выявлены следующие отличия реакции фагоцитов на растительные полисахариды в сравнении с ответом на действие других биогликанов: образование цитотоксичных продуктов фагоцитами в ответ на действие полисахаридов растений может происходить без изменения адгезивной способности клеток; адгезированные и неадгезированные нейтрофилы крови отвечают респираторным взрывом на действие растительных полисахаридов в равной степени; секреция лизосомальных ферментов, вызванная биогликанами растений, направлена из клетки, а не в фагосому. Обнаружено, что взаимодействие макрофагов с гликуроногликанами требует присутствия внеклеточного кальция. Выявлено участие мембранного Na-K насоса в стимуляции макрофагов полисахаридами растений. Мышиные макрофаги, адгезированные с помощью рецептора-«мусорщика» SR, впервые использованы в качестве тест-мишени для действия растительных полисахаридов.

Научно-практическая значимость. Секреция лизосомальных ферментов и кислородный взрыв, вызываемый растительными полисахаридами в нейтрофилах и макрофагах, подтверждают предположение о том, что фагоциты млекопитающих распознают полисахариды высших растений как чужеродный материал и стремятся его уничтожить. Отсутствие реакции фагоцитов на некоторые из изученных биогликанов (вибурнан V03, силенан SV2 и пицеан РОЗ) свидетельствует в пользу постулированного ранее положения о существовании у полисахаридной молекулы структурных особенностей, ответственных за инициацию фагоцитарного процесса.

Продемонстрирована возможность избирательно регулировать отдельные клеточные реакции нейтрофилов и макрофагов млекопитающих полисахаридами высших растений, что может быть использовано при создании иммуномодуляторов направленного действия. В результате проведенного экспериментального исследования расширено представление о связи между структурой и физиологической активностью растительных полисахаридов. Предложено возможное объяснение механизма действия нейтральных полисахаридов на фагоциты - неспецифическое связывание с мембраной.

Способность полисахаридов калины избирательно стимулировать макрофаги, адгезированные с помощью рецептора CR3 или SR, позволяет рекомендовать вибурнаны для дальнейшего изучения в качестве иммуномодуляторов, регулирующих функции отдельных субпопуляций макрофагов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фагоцитарная активность нейтрофилов крови и тканевых макрофагов млекопитающих увеличивается в ответ на действие полисахаридов ряски малой Lemna minor, смолевки обыкновенной Silene vulgaris, калины обыкновенной Viburnum opulus и ели сибирской Picea obovata.

2. Секреция лизосомальных ферментов и генерация кислородных радикалов фагоцитами, вызванная лемнанами, силенанами, вибурнанами и пицеанами, не сопровождается изменением адгезивной способности клеток.

3. Взаимодействие перитонеальных макрофагов с растительными полисахаридами модулируется адгезией клеток.

4.Рецептор комплемента CR3, рецептор-«мусорщик» SR, а также кальцийзависимые лектины не опосредуют стимуляцию макрофагов нейтральными арабиногалактанами и галактоманнанами растений.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на XIII Коми республиканской молодежной научной конференции (г. Сыктывкар, 1997); Международном Симпозиуме по гликобиологии (г. Брауншвайг, Германия, 1998); XIX Международном симпозиуме по углеводам (г. Сан Диего, США, 1998); XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии ( г. Москва, 1998); IV Международной летней школе по иммунологии (г. Пущино, 1998); III Всероссийском совещании "Лесохимия и органический синтез" (г. Сыктывкар, 1998).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано пять печатных работ. •