Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ SILENE VULGARIS (M.) G. КАК ПРОДУЦЕНТА ПОЛИСАХАРИДОВ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ SILENE VULGARIS (M.) G. КАК ПРОДУЦЕНТА ПОЛИСАХАРИДОВ"

ъзозЧ-

на правах рукописи

ПОНТЕР ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ SILENE VULGARIS (M,) G. КАК ПРОДУЦЕНТА ПОЛИСАХАРИДОВ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2002

Работа выполнена в Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Научные руководители:

академик Ю.С. Оводов

доктор биологических наук, профессор В.Г. Винтер

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.И. Чкков

доктор биологических наук, профессор В.М. Пахомова

Ведущая организация:

Институт биологии Коми НЦ УрО РАН

Зашита состоится ¿Зг 2002 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д.21ЗД81.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацье; -ю ознакомиться \ гой библиотеке Казанского государственного :итета.

Автореферат разослан ' г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, " ¿?_

кандидат биологических наук д-- - —А.Н. Аскарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полисахариды растений известны своими ценными техническими свойствами и физиологической активностью: и и муномодулирующей, противоязвенной, антитоксической, противоопухолевой и т.д. (Wagner et al., 1988; Roesler et al., 1991; Stemmuller el al., 1993; Оводов, 1998). В этом отношении значительный интерес представляют пектины, один из наиболее сложных классов этих биополимеров. В настоящее время, как в нашей стране, так и за рубежом проводятся интенсивные исследования (Witezak and Nieforth, 1997) по использованию растительных биополимеров в дизайне лекарственных препаратов. Это, прежде всего, связано со способностью полисахаридов повышать биоусвояемость лекарственных препаратов и пролонгировать их действие. Такие свойства известны для многих видов биополимеров - декстринов, альгинатов и др., в том числе растительных пектиновых веществ. Многие полисахариды сами обладают широким спектром биологической активности и используются в лечебно-профилактических целях при лечении диабета, ишемии сердца, желудочно-кишечных заболеваний и т.д. (Оводов, 1998; Комиссарекко и Спиридонов, 1998). Несмотря на то, что пектиновые вещества изучаются в течение длительного времени, проблема создания сырьевой базы для получения полисахаридов с заданными свойствами и определенной структурой сохраняет свою актуальность. При этом важными путями решения згой проблемы являются использование новых источников растительного сырья, создание бисгтехнологических методов промышленного получения полисахаридов с использованием культуры клеток растений.

Одно из плавных преимуществ культуры клеток перед традиционным сырьем - это гомогенность системы, состоящей в основном из клеток с первичными клеточными стенками. Применение культуры клеток как модельной системы для изучения строения и различных аспектов метаболизма полисахаридов подразумевает получение штамма-продуцента, оптимизацию роста штамма и биосинтеза полисахаридов.

Растительная клеточная стенка - динамичная сложнеорганизованная система, состав которой может изменяться во время роста и дифференциации клеток (Stolle-Smits et al„ 1999; Geshi et al,, 2000; Kakegawa et al., 2000), а также под влиянием внешних факторов, таких как фитогормоны, источники углерода и азота (Masuda, 1990; Kobayashi et а!„ 1999; Колпо ct al., 1999). Однако возможности физиологической регуляции процессов роста и биосинтеза полисахаридов в культурах клеток изучены недостаточно. Литературные данные о действии различных факторов на количественный и качественный состав полисахаридов малочисленны. Активная метаболизаиня пектиновых полимеров в экстремальных (которые создаются при получении каллусных культур) и естественных условиях развития растений и обнаружение биологически активных фракции полисахаридов дают основа^я предполагать, что в зависимости от у еловой "полученияиГйыр|эда|вания каллусных культур могут НАУЧ1-Ь*.Я б:.лГ>Л.-'ОТЕКА Моск. cs'bvv- гул г-кадем»«

быть получены фракшш пектинов, отличающиеся по своим свойствам от фракций из нативньи растений. В то же время практически не проводилось сравнительное исследование полисахаридов различных органов интактного растения и клеточных культур, полученных из этих органов, а также полисахаридов, продуцируемых различными клеточными линиями растения.

Настоящая работа выполнена с использованием каллусной культуры смолевки обыкновенной (Siteне vulgaris (Moench) Garcke), сем. гвоздичные (Caryophyliaceae) - лекарственного растения, применяемого в народной медицине. Пектиновый полисахарид этого растения, названный силенаном (Оводова и др., 2000), обладает иммуномодулнругощей активностью: усиливает поглотительную способность и миелопероксидазную активность фагоцитов периферической крови человека и макрофагов брюшной полости крыс (Popov etal., 1999).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в сравнительном изучении полисахаридов шшуса и интактного растения, а также в исследовании влияния различных факторов на биосинтез полисахаридов каллусной культурой смолевки обыкновенной.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие

задачи:

1. получение линий каллусных культур смолевки обыкновенной из различных типов эксплантов интактных растений и растений, культивируемых in vitro;

2. изучение влияния различных факторов на каллусогенез и на рост полученных каллусных культур;

3. определение качественного и количественного состава полисахаридов в интактных растениях смолевки обыкновенной;

4. определение качественного и количественного состава полисахаридов в каллусной культуре смолевки обыкновенной и биосшггетячесшй активности различных линий;

5. изучение динамики роста каллусной культуры смолевки обыкновенной и биосинтеза полисахаридов (арабиногалактана и пектина) в цикле выращивания каллуса;

6. изучение влияния гормональных и трофических факторов культивирования на рост каллусной культуры смолевки обыкновенной и на биосинтез полисахаридов.

Научная новизна. Впервые получены каллусные кулыуры смолевки обыкновенной, высокопродуктивные по биомассе и по биосинтезу полисахаридов. Создана коллекция каллусных культур этого растения. Показана принципиальная возможность замены интактного растения каллусной культурой для биотехнологического производства продуцируемых растением полисахаридов.

Оптимизированы и запатентованы питательные среды для получения и культивирования каллусной культуры смолевки обыкновенной. Разработан и запатентован способ получения пектиновых полисахаридов из биомассы культивируемых тканей растений.

Впервые изучен качественный н количественный состав полисахаридов каллусной культуры смолевки обыкновенной в сравнении с интактным растением, и выявлена различная биосинтетическая активность разных каллу сных линий.

Установлено, что в каллусных культурах смолевки, наряду с силенаном (ЭУ), пектином, характерным для интактных растений, синтезируется кислый арабиногалакган (Ав). Каллус по содержанию продуцируемых полисахаридов сравним с интактным и растениями или заметно превосходит их.

Изучены качественные и количественные изменения полисахаридов в течение ростового цикла культуры смолевки. Биосинтез галактуронанового (или рам но галактуронаноео го) кора силенана происходит во время лаг-фазы, в начале экспоненциальной и в течение стационарной фазы роста культуры. Оптимальный биосинтез полисахаридов приходится на экспоненциальную фазу роста клеток. В середине экспоненциальной фазы образуется силенан, содержащий главную линейную углеводную цепь и разветвленные участки макромолекулы.

Выявлена возможность физиологической реляции процессов роста и биосинтеза полисахаридов в культуре клеток смолевки обыкновенной путем изменения содержания во внешней среде ауксина, сахарозы, кальция, азота или фосфата.

Впервые найдено, что полисахариды каллусной культуры смолевки являются биологически активными в отношении регуляции вторичного метаболизма растений. Установлен, в частности, стимулирующий эффект этих полисахаридов на накопление алкалоидов в клеточной культуре раувольфии змеиной.

Научно-практическая значимость. Полученные сведения о составе, содержании и закономерностях биосинтеза силенана и арабиногалакган а в каллусной культуре смолевки обыкновенной необходимы для практического использования культуры клеток. Каллусная культура смолевки может стать модельной системой для более углубленного исследования биосинтеза и метаболизма полисахаридов, в частности, силенана, в растении, для выяснения механизмов регуляции этих процессов.

Разработан способ получения образцов силенана с помощью культур тканей растений. Ряд каллусных линий смолевки обыкновенной с высоким уровнем биосинтеза полисахаридов 5У и АО представляется перспективным альтернативным источником для получения физиологически активных полисахаридов без ущерба природным популяциям. Кроме того, каллус смолевки является удобным объектом для исследования взаимосвязи структуры и физиологической активности полисахаридов данного растения.

Полисахариды каллуской культуры смолевки могут использоваться в качестве регуляторов вторичного метаболизма растений, в частности, процесса синтеза каллусной культурой раувольфии змеиной ценных алкалоидов, широко используемых в качестве лекарственных препарэпгов.

Каллусные линии с высоким содержанием полисахаридов; силенана5У и арабкногалакгана АО, — можно рассматривать как перспективный исходный материал для получения суспензионных культур и создания на их основе линий-продуцентов ценных соединений для медицины, косметики, для пищевой и других областей промышленности и для сельского хозяйства. Основные положения, выносимые на защиту:

1. В качественном составе полисахаридов в недифференцированных культурах клеток относительно интактного растения имеются изменения, что позволяет расширить спектр синтезируемых полисахаридов.

2. Каялусные культуры смолевки продуцируют равное или значительно большее количество полисахаридов по сравнению с интактным растением.

3. Качественный и количественный состав полисахаридов в каллусной культуре смолевки обыкновенной изменяется в цикле вырашивания.

4. Условия культивирования каллусной культуры влияют на содержание и на моносахаридный состав полисахаридов, что дает возможность регуляции роста клеточных культур и биосинтеза ими полисахаридов.

5. Клеточные культуры смолевки обыкновенной эффективно продуцируют полисахариды (пектин и арабиногалактан) и могут в перспективе использоваться вместо интактного растения в биотехнологическим производстве полисахаридов данного растения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме по тликобиологии (Брауншвайг, Германия, 1998); Международном совещании *'Физиолого-биохимические аспекты изучений лекарственных растений" (Новосибирск, 1998); XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии "Химия живого" (Москва, 1998); Ш Всероссийском совещании "Лесохимия и органический синтез" (Сыктывкар, 1998); Всеросссийской электронной научной конференции "Биотехнология XXI века" (Ставрополь, 1999); Международном конгрессе по биотехнологии (Берлин, Германия, 2000); Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2000); Третьей Международной выставке-ярмарке "Инновации-2000. Новые материалы и химические продукты" (Москва,

2000); П-м Европейском симпозиуме по углеводам (Лиссабон, Португалия,

2001); 1-й Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инновацийс нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 2001); итоговом Ученом совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2002); II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Казань, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, получено 3 патента Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов), выводов и списка литературы, включающего 2)2 источников, из них 174 зарубежных. Работа изложена на 163 машинописных страницах, содержит 27 таблиц и IS рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали каллусные культуры и ннтакгные растения смолевки обыкновенной. Каллусные культуры получали из растений, собранных в естественном местообитании в окрестностях г. Сыктывкара, и из стерильных растении. Анализ полисахаридного состава проводили на растениях, выращенных в Ботаническом саду Сыктывкарского государственного университета. Стерильные растения и каллусные культуры S vulgaris получены автором, как описано ниже.

Получение стерильных растений. Семена стерилизовали, проращивали наагаризованиой модифицированной безгормональной среде Мурасиге и С куга (Murashige and Skoog, 1962). Растения выращивали в пробирках и конических колбах объемом 100 мл до ювенильного состояния. Культивирование проводили при 23 ± 1°С, освещении белыми люминесцентными лампами с 12-часовым фотопериодом.

Получение каллусных культур. Для получения каллусной культуры были использованы экспланты органов интактных растений, а также ювенильных растений, выращенных in vitro. Каллусогенез инициировали из эксплактов листьев, стеблей, корней и прикорневых почек. Экспланты интакгных растений стерилизовали путем обработки 70 %-ным этанолом (10-15 сек), затем 5 %-ным раствором гипохлорнта натрия с последующей 3-х кратной промывкой материала в стерильной диет, воде. Экспланты помещали на агаризованные среды с различным сочетанием фитогормонов, затем инкубировали в темноте при 26 ± 1°С. Определяли частоту каллусообразования (%), как отношение числа эксплактов с каллусом к общему числу эксплантов; частоту морфогенеза (%), как отношение числа морфогенных эксплантов к общему числу эксплантов.

Среды для получения и выращивания каллусов готовили на основе макро- и микроэлементов среды Мурасиге и Скуга (Murashige and Skoog, 1962) с добавлением сахарозы, 15 г/л; глюкозы, 15 г/л и витаминов по Стаба, мг/л; фолиевой кислоты-0.5; рибофлавина (В,) -0.5; биотина - 1,0; Са-пантотената - 1.0; шридоксина (В4) - 1.0; тиамина хлорида (В^ - 1.0; ни коти на и ида (РР) — 2.0; кобаламина (В,,)-0.0015. Агар-8 г/л.рНдоавтоклавирования5.$.Сцелью оптимизации гормонального состава питательной среды применяли различные комбинации фитогормонов.

Каллусы выращивали на 30 мл среды в чашках Петри в термостате при температуре 26 ± 1°С, в темноте и субкультивировали с интервалом 21 сутки.

Каллусные культуры характеризовали по морфологическим признакам (консистенция и цвет). Рост и жизнеспособность тканей оценивали по приросту сырой исухой массы за период субкультивирования и выражали индексом роста: (= (т-т^ут^, где и пу (г) исходная и конечная масса каллуса.

Оптимизация условий культивирования каллусных культур. Каллусы взвешивали (по 200 ± 5 мг) в стерильных условиях в ламинарном боксе и навески переносили в чашки Петри с контрольной и опытной средами (по 5 навесок на чашку). В конце цикла культивирования (21 сутки) подсчитывали индексы роста по сырой и сухой массе, а также продуктивность по сухой биомассе (г/л). В опыт на каждый фактор брали 10-15 каллусов. Для определения сухого веса сырую биомассу высушивали при 60°С.

Удельную скорость роста по сухой массе (ц, сут*') подсчитывали согласно формуле (Загребельный, 2000): р = (т|-ш0У(т01), где п^- исходная масса каллуса (г), конечная масса каллуса (г), t - время культивирования (сут).

Время удвоения сухой биомассы (Т, сут) о прокляли по формуле: Т = Ш2/р.

При изучении динамики роста каллуса подсчитывали его продуктивность по сухой массе в сутки (РЬ[П, г/л/сут) следующим образом: РЬП1 = (ш-т0)/1.

Для изучения действия гормональных и трофических факторов культивирования на рост клеточных культур и продуцирование полисахаридов использовали различные ауксины, цитокинины, углеводы, а также источники азота, кальция и фосфата.

Выделение полисахаридов из растений и .каллусных культур. Перед выделением полисахаридов плантационные растения измельчали, а каллусную ткань разрушали путем однократного замораживания — оттаивания. Сырье исчерпывающе экстрагировали в аппарате Сокслета органическими растворителями (метанолом и хлороформом) для удаления низкомолекулярных примесей. Полученный воздушно-сухой остаток биомассы последовательно экстрагировали водой при 50°С, обрабатывали раствором соляной кислоты (рН 4; 50 °С) и экстрагировали 0,7%-ным водным раствором оксалата аммония при 68°С. Экстракты концентрировали, центрифугировали, полисахарид осаждали 2-кратным объемом 96%-ного этанола. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в диет, воде, диализовали, центрифугировали, супернатант лиофилизовали. В результате получили полисахаридные фракции: силенанаЗУ(, 5УИ- из ингактного растения, арабнногалакгана АО и силенана ЭУ -из каллуса.

Содержание полисахар иди ых фракций представляли, как процентный выход от сухой биомассы, предварительно обработанной метанолом и хлороформом, и как продуктивность каллуса по полисахариду в г/л. Анализировали пробы, состоящие из 20-25 каллусов. Эксперименты проводили в трех биологических повторностях.

Общие аналитические методы. В полисахаридных фракциях определяли содержание гликуроновых кислот по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии конц. серной кислоты (\Jsov а!., 1995), содержание белка - по

методу Лоури (Lowry et al., 1951). Общее содержание углеводов устанавливали по реакции с фенолом в присутствии серной кислоты (Dubois et al., 1956). Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 (Великобритания). Газожидкостную хроматографию (ГЖХ) выполняли на приборе Hewlett-Packard 4890А (США) с плазменно-ионизационным детектором и интегратором HP 3395А на капиллярной колонке R.TX-1 (0.25 мм х 30 м), газ-носитель - аргон.

Полный кислотный гидролиз. Полисахаридные фракции (по 2.0-2.5 мг) гндролизовали 2 Мтрифторуксусной кислотой (TFA, 1 мл) при 100°С втечение 3-4 ч, гидролизаты упаривали в вакууме с метиловым спиртом до полного удаления TFA. В качестве внутреннего стандарта использовали лшо-инозит (0.5 мг/мл). Моносахариды идентифицировали с помощью ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов (York et al., 1985),

Гельфнльтрацию выполняли на колонке с сефакрилом S-500 (колонка 1.5 х 49 см, свободный объем Vft=46.5 мл, скорость растворителя 0.45 мл/мин). Фракции собирали по 1.8 мл. Выход вещества контролировали по положительной реакции элюага на углеводы по фенол-сернокислотному методу (Dubois et al., 1956). Полнсахаридые фракции AG и SV растворяли в небольшом количестве 0.01 М NaCI, наносили на колонку с сефакрилом S-500 и злюировали 0.01 М NaCI.

Ионообменная,, хроматография на DEAE-целлюпозе. Полисахаридные фракции растворяли в небольшом количестве воды и наносили на колонку (1.5 х 43 см) с DEAE-целлюлозон (ОН -форма, скорость элюции 54 мл/ч). Элюцию осуществляли последовательно водными растворами 0.01,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 и 1.0 MNaCI. Фракции отбирали по 10 мл. Выход полисахарида контролировали по положительной реакции элюата на углеводы по фенол-сернокислотному методу (Dubois et al., 1956). Объединенные фракции, соответствующие отдельным пикам, диалнзовали, концентрировали и лиофилизовалн.

Анализ углеводного состава питательной среды. Агаризованную среду расплавляли, приливали смесь ацеюнитрила и воды, перемешивали, хлопья агара отделяли фильтрованием. Фильтрат анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), Определение Сахаров проводили на приборе НРР 5001 (ЧССР) при следующих условиях: колонка CGC (150 х 3 мм), сорбент Сепардн NH,, 7 мкм, элгоент—ацетонитрнл-вода 70:30, скорость потока 1 мл/мин, детектор -дифференциальный рефрактометр RJDK.102.

Потребление Сахаров каллусной культурой оценивали по экономическому и метаболическому коэффициенту (Загребельный, 2000). Экономический коэффициент (Y), соответствующий количеству (г) сухой биомассы на 1 г потребленного сахара, рассчитывали по метаболизированным сахарам согласно формуле: Y = (x-x0)/(s0-s), где исходная концентрация биомассы (г/л), х - конечная концентрация биомассы (г/л), s0- исходная концентрация субстрата (г/л), s - конечная концентрация субстрата (г/л).

Метаболический коэффициент (Q), характеризующий скорость потребления субстрата растущей культурой, определяли по соотношению: Q = (s(-s)/Atx, где s0- исходная концентрация субстрата (г/л), s — конечная концентрация субстрата (г/л), х - концентрация биомассы (г/л), t - время (сут).

Анализ каллусной культуры Rauwolfia serpentina на содержание алкалоидов различных групп. Анализ осуществлен сотрудниками кафедры биохимии биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета. Количественное определение алкалоидов проводили по методике Воллосовнча и др. (1981), которая заключается в определении содержания алкалоидов спектрофотометрическим методом в форме продуктов взаимодействия с азотной кислотой по поглощению » области 513 нм. Качественный состав алкалоидов определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе растворителей хлороформ:метанол:аммиак (90:10:0.2) на пластинках Situfol UV-254, с последующей индикацией пятен в ультрафиолетовом свете при 254 нм.

При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднеквадратичное отклонение. Достоверность отличий оценивали по t-критерию Стьюдента (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и характеристика каллусных культур смолевки обыкновенной

1.1. Влияние фитогормонов на каллусогенез S. vulgaris

Эффективность каллусо- и органогенеза определяется видом и концентрацией ауксина н цитокиника, наиболее пригодных для данной культуры, а также тем, какая часть растения используется в качестве экспланта (Бондарев и др., 1998).

В качестве ауксинов применяли 2,4-днхлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилуксусную кислоту (ИУК), а в качестве цитокининов использовали б-бензнламинопурин (БАП) и кинетин.

Сочетания 2,4-Д + БАП и 2,4-Д + кинетин оказались наиболее подходящими для образования каллуса из всех типов эксплантов в отличие от НУК и ИУК в сочетании с кн нети ном, которые стимулируют интенсивный органогенез (образование побегов н корней) (табл. 1). На среде, содержащей ИУК + кинетин, отмечена самая низкая частота каллусогенеза (29%), и независимо от типа экспланта образуется плотный каллус, труаноотделяемый от эксплантов.

Оптимальным сочетанием фитогормонов для поддержания устойчивого роста каллуса при длительном культивировании является комбинация 2,4-Д, 1.0 мг/л + БАП, 0.5 мг/л и 2,4-Д, 1.0 мг/л + кинетин, 0.2 мг/л.

Таблица 1

Влияние фито гормонов на каллусогенез эксплантов органов стерильных растений vulgaris

Среда Ауксин, MJ'/Л Цитокииин, мг/л Общее число эксплантов Частота каллусогенеза, % Частота морфогенеза, % Начало каллусогенеза. CVTKH

1 2,4-Д, 2.0 БАП, 1 5 54 9S 22 4-18

7 2,4-Д 2.0 Кинетин, 1.5 74 91 22 4-18

3 НУК, 2.0 Кия trim, 1.5 J 02 94 43 4-30

4 ИУК.2 0 Кинетин, 1.5 94 29 31 4-1S

1.2. Влияние типа экспланта на каллусогенез S. vulgaris

Первичный каллус получен из листьев, стеблей и прикорневых почек нативных растений смолевки обыкновенной. Наибольшую способность к каллусогенезу проявляют прикорневые почки (S2 % эксплантов). Хуже протекает каллусообразованне наэксшинтах стеблей (43 %) и листьев (39%). На корневых экс пд антах не удается индуцировать каллусообразованне. Дня повышения эффективности каллусогенеза в дальнейших экспериментах мы использовали экспланты органов стерильной культуры растений, что позволило исключить инфицирование исходного материала.

Первичный каллус получен на всех типах эксплантов стерильных растений. Наибольший процент каллусообразования наблюдается на листовых и стеблевых эксплантах (100%) на средах с 2,4-Д + БАП, 2,4-Д+ кинетин и НУК + кинетин. На этих средах корни в качестве эксплантов проявляют меньшую способность к каллусообразованию (56-92%). Экспланты корня образуют каллус с наибольшей эффективностью (92%) при наличии в среде 2,4-Д + БАП. Время начала каллусогенеза зависит от типаэксплаита и варьирует а диапазоне огг 4 до 30 суток.

Таким образом, экспланты стерильных растений смолевки обладают более высокой каллусогенной способностью, чем экспланты нативных растений, и эффективность каллусообразования зависит от типа экспланта. Лучшую способность к каллусообразованию проявляют экспланты листьев и стеблей, меньшую - корни. У нативных растений наиболее каллусогенными являются прикорневые почки.

Получена 21 каллусная линия, Огличня в морфологии и в интенсивности роста каллусных культур, вероятно, определяются генетическими особенностями исходных донорных растений и типом экспланта (табл. 2).

Таблица 2

Характеристики линий из коллекции каллусных культур S. vulgaris

Линия Тип Консистенция Цвет Индекс роста

ясепданта по сырой массе НО СуХОЙ массе

FL Лист Рыхлый, оводненный Белый 8,б±5.7 9 8±5,3

FS Стебель Рыхлый, оводненный Белый 8.1 ±3.1 12.9М.2

KL Лист Рыхлый, оводненный Желто-коричневый 68±3.6 8.U3.8

LL Лист Рыхлый, оводненный Желтоватый 8.5*5.0 8 0±4.2

LS Стебель Рыхлый, оводнешыЛ Белый 12 4±2.9 12.5±2.4

ML Лист Рыхлый, оводненный Белый 100±5.1 16.5±7.|

MS Стебель Рыхлый, ОВОДНСШ1МЙ Желтоаатый 7.2±1.5 7.1±1.5

NS Стебель Рыхлый, оводненный Желтоватый 6.6±1.б 5,8±М

NR Корень Рыхлый, о волнении и Желтоеатый 6.0± 1.7 8,4±1.6

PL Лист Гетерогенный Желтоватый 5.7±2,8 5.6±3.1

PS Стебель Гетерогенный Желтоватый 70±3.7 8.U2.7

PR. Коре!и> Компактный, оводненный Желтоватый 6,0±t.l 8.6±t.7

SV Прикорневая почка Рыхлый, оводненный Белый 14.4±3.5 14.0±2.9

SP Прихорневая почка Рыхлый, оводненный Желтоватый 7.<Н=3. 7,7±3.L

SLB Лист Рыхлый, оводненный Желтоватый 6,0.t2.6 5.2±1.7

QS Стебель Рыхлый, оводненный Желто-коричневый 5.7±1 3 6,I±I.4

QR Корень Рыхлый, оводненный Желто-коричневый 6.1 ±2.3 8.0±1.7

2. Состав и содержание полисахаридов в растениях и каллусных культурах смолевки обыкновенной

2.1. Содержание полисахаридов в плантационных растениях S. vulgaris

Поскольку строение силенана, пектинового полисахарида смолевки обыкновенной, достаточно хорошо изучено (Бушнева и др., 1999; Оводова и др., 2000), мы не проводили дополнительных структурных исследований, а исследовали качественный и количественный состав образцов силенана в различных органах плантационных растений в фазу цветения, атакже в корнях в фазу плодоношения растений.

Полисахариды, выделенные экстракцией водой и раствором оксалата аммония из листьев, стеблей, цветков и корней смолевки, являются кислыми полисахаридами с близким качественным моносахаридным составом, характерным для силенана (табл. 3). В составе фракций обнаружены остатки

О-галактуроновой кислоты, галактозы, арабинозы, рамиозы, глюкозы, ксилозы и маннозы, среди которых первые четыре являются основными.

Таблица 3

Характеристика образцов силенана (ЗУ, и 8Уи), выделенных из различных органов смолевки обыкновенной

Содержание, мол. %* Лист Стебель Цветки Корень

SV, sv„ sv, sv„ sv, SVn SV, SV„

GalA** 87.4 88.8 71.1 84.0 65,0 75.6 38.1 91,8

Gal 4.2 6,9 6.2 2.1 3.0 1.8 3.4 1.8

Ara 3.9 29 4,4 3.0 1.7 1.1 3.4 2,1

Rhú 2.6 2,7 2,2 0.9 14 0,9 2,2 0.7

Glc L¡ 2.6 1.4 1.4' 1.5 1.2 30 1.7

Xyl 0.8 1.3 3.8 2.1 0.3 0.4 2,0 U

Man 0,6 1.2 1.7 1.0 1.1 0.6 0.9 0.7

Белок** 0.4 4.0 3.6 4,3 2.3 S3 15.8 4 4

Примечания: * приведены средние значения из серии экспериментов. ** Весовые проценты, приведены средние значения из трех экспериментов.

Наличие в большом количестве остатков галаетуроновой кислоты подтверждает принадлежность этих полисахаридов к классу пектинов. При фракционировании на ОЕАЕ-целлюлозе силенана, выделенного из листьев, показано! что полисахарид является гетерогенным (табл. 4). Образцы силенана из различных органов растения отличаются соотношением моносахаркцных остатков. Так, относительное содержание остатков галактозы, арабинозы и

рамнозы выше в образцах силенана выделенных из листьев и стеблей, чем из цветков и корней, а содержание остатков ксилозы значительно больше в силенане из стеблей и корней смолевки, чем из листьев и цветков.

Таблица 4

Фракционирование на ОЕАЕ-целлюлозе силенанов ЗУ, и 5УЦ из листьев и характеристика полученных фракций

Характеристика Фракции силенанов SV, и SV„

8У,-1 5УГ2 SV.,-1 5V„-2 SV,r3

Выход, %* 6.0 43.4 7,9 23.2 19.4

Содержание, мол. %:

GalA** 44.0 68.8 26,2 73.9 84.0

Gal 11.5 4.1 10.3 3.4 2.1

Ara 8.0 3.5 7,8 3.8 2.2

Rha 0.9 2.1 2.7 2,8 2.1

Glc 4.4 2.0 7.5 2.1 1.6

Xyl слепы 5.9 2.4 0.4 следы

Man следы 2.1 3.2 0.6 0.4

Белок** 10,6 2.4 19,3 6.4 1,9

Примечания; * вычод от количества полисахарида, нанесенного на колонку с ОЕ АК-цеялто/киой. ** Весовые ироцеЕЛы.

Суммарное содержание силенана в фазе цветения в различных органах растения варьирует от 1 до 3 % от сухой массы, при этом наибольший уровень биосинтеза наблюдается в листьях (табл. 5),

Таблица 5

Содержание* силенаиов SV, и SV,, в различных органах плантационных растений $. vulgaris

Орган растения SV, SV„ Сумма полисахаридов

Лист 1.02 ± 0,07 2.04 ± 0,28 3.06 ± 0.33

Стебель 0.31 ± 0,03 0,92 ±0.10 1.23 ±0,10

Цветки 0.58 ±0.19 0.78 ±0,16 1.36 ±0.18

Корень 0 29 ±0,03 1.01 ±0.02 1.29 ±0.04

Примечания; приведены средние значения и их стандартные отклонения и г 'грех экспериментов. * Содержание полисахаридов в %от сухон массы, предварительно обработанной метанолом и хлороформом.

2.2. Содержание полисахаридов в каллусных культурах S. vulgaris

Качественный состав. Нами впервые изучен качественный состав полисахаридов каллусной культуры смолевки обыкновенной в сравнении с ннтактным растением и проанализировано 15 линий каллусных культур, Разработан и запатентован способ получения пектиновых полисахаридов из биомассы культи виру ем ых тканей растений. Из всех каллусов экстракцией водой и раствором оксалата аммония выделены две полисахаридные фракции: силенан (SV) и арабиногалакган (AG). При гельфкльтрации полисахаридов насефакрилс S-50Û получены гомогенные полисахаридные фракции.

При анализе силенана SV на DE АЕ-целлюлозе показано, что он является кислым полисахаридом, отличающимся незначительной гетерогенностью (табл. 6). Наличие в большом количестве остатков галактуроновой кислоты, присутствие остатков рамнозы, атакже расщепление полисахарида с помощью пектиназы, свидетельствующее о наличии в его составе углеводной цепи, состоящей из а-1,4-связанных остатков D-галактопиранозилуроновой кислоты, подтверждает принадлежность этого полисахарида к классу пектинов, о чем свидетельствует также близкое сходство моносахаридного состава этого полисахарида и силенана из интахтного растения (табл. 4 и 6).

При хроматографии AG на DEAE-целлюлозе водными растворами хлорида натрия возрастающей концентрации получена одна слабокислая фракция 21-AG-1 (0.1 M NaCI). Остатки галактозы и арабинозы в соотношении 3.2 :1 являются основными нейтральными моносахаридами AG, Содержание галактуроновой кислоты составляет 3%(табл. 6).

Кислые арабииогалактаны или арабиногалактано вые протеины выделены из клеточных культур явора (Ыш et al., 1989; Lerouge et al., 1993), смолевки белой (Kwan and Morvan, 1995), наперстянки (Hensel et al., 1995), барвинка. (Tafceuchi ei al., 1980), эхинацеи (Wagner et al., 1988) и многих других.

Они, скорее acero, представляют собой фрагменты боковых цепей пектинов этих растений и образуются в качестве промежуточных продуктов биосинтеза пектиновых полисахаридов.

Таблица б

Характеристика полисахаридных фракций AG и SV, полученных после фракционирования на DEAE-целлюлозе

Характеристика 21 -AG-1 2I-SV-1 21-SV-2

Выход, %* 34,1 21.5 14.7

Содержанке, мол. %'

GalA** 8.1 65.0 76,2

Gal 60.0 3.4 2.6

Ara 19.5 3.2 1,7

RJia 50 2.0 1.6

Gtc 2.4 2,0 1.4

Xyl 0.4 0.3 0.2

Man 0.9 0,5 0.3

Белок** 7.4 7.7 3 5

Примечания: * выход <тг количества полисахарида, нанесенного на колонку с DEAE-цешлшозой. ** Весовые проценты.

Присутствующие в образцах енленана ЭУ и арабиногапактана АС остатки глюкозы, ксилозы и маннозы, скорее всего, являются компонентами сопутствующих пектинам резервных полисахаридов и гемицеллюлоз.

Различные каллусные линии смолевки характеризуются близким качественным моносахаридным составом полисахаридов и имеют отличия в количественном соотношении моносахаридов. Крометого, они различаются по содержанию галактуроновой кислоты в силенане (табл. 7).

Таким образом, составы полисахаридов каллусной культуры и интактного растения различаются: наряду с силенаном каллусная культура продуцирует кислый арабиногалактан Ай.

Количественное содержание. Биосинтетическая активность халлусных линий смолевки обнаруживает (табл. 8) более существенные различия в отношении пектинов, чем арабиногалактанов. Выход силенана в различных линиях составляет от 1 до 11 % от сухой массы, выход А в колеблется в пределах 4-8%. Каллусные культуры смолевки, по сравнению с интактным растением, продуцируют равное или значительно большее количество полисахаридов. Для дальнейших исследований была выбрана линия ЗУ, высокопродуктивная по биомассе и синтезируемым полисахаридам. Мы не обнаружили зависимости процентного содержания полисахаридов и их моносахаридного состава от типа экспланта, из которого была инициирована каллусная линия. Вероятно, изменения в биосннтетической активности линий связаны с их морфо-физиологическими и генетическими особенностями, а также могут быть результатом селекции.

Таблица 7

Характеристика полисахарид пых фракций, выделенных из различных линий каллусной культуры смолевки обыкновенной

Линия Фракция GalA, HeiiTl эальные моносахариды, мол. %** Белок,

вес. %* Gai Ara Rha Glc Xyl Мал вес. %"

SV AG 8.1 41.1 8.9 4.6 6.8 4.0 2.9 15.8

SV 77.7 3.3 2.6 1.6 1.3 0,6 0.7 12.7

FS AG 8.7 34.7 12.3 2.7 9.2 9.5 2.5 14.7

SV 71,9 5.3 3.0 1.6 2.2 0.7 0.9 8.9

LS AG 12.0 37.0 9.7 3.4 7.6 6.5 3.5 17.7

SV 59.5 6.5 4.7 2.8 3.2 2,5 2.1 6.0

ML AG 124 37.1 6.6 2.2 3.2 2.7 2.9 23.1

SV 66.0 4.6 3.1 1.4 1.8 0.8 1.2 13.0

MS AG 10.7 32.3 11.1 2.6 5.6 3.0 3.6 22.9

SV 65.9 5.S 5.1 1.4 1,7 0.7 1.2 188

PS AG 7.8 35.0 6.1 2.6 4.4 2.0 8.6 34.2

SV 68.6 4.9 2.3 0.8 1.2 0.8 t.l 12,2

PR AG 8.7 34.6 5.9 2.2 5.8 3.6 4.7 27.5

SV 66.3 4.4 2.8 1.5 1.5 0.6 0.9 9,9

QS AG 11.1 31.6 11.4 3.2 2.6 2.0 5.6 24.3

SV 54.1 7,3 5.6 2,1 2.4 1,0 2.3 9.9

QR AG 10.6 33,5 11.8 3.1 2.3 1,9 5.0 10.9

SV 55.9 9.2 5.5 2.4 3.4 4.4 3,4 9.7

Примечания: * приведены средние значения m трех экспериментов. ** Приведены средние значения из серии экспериментов.

Таблица 8

Содержание полисахаридов в каллусных линиях S. vulgaris

Линия Tira экспяанта Арабинопшактан A G Силенан SV

Выход, %* г/л Выход, %* т/л

SV Прикорневая почка 5.4 ±0.3 0.42 + 0.03 10.6 ±0.6 0.83 ± 0 03

SP Прикорневая ночка 6,0 ± 0.3 0.35 + 0.01 2.0 ± 0 1 0.1210.01

SLB Лист 7,5 + 0.2 0.42 + 0.02 2.9 ±0.2 0,16 + 0.01

FL Лист 8.5 ±0.4 0.42 ±0.01 2.3 ±0.2 0,11 ±0.01

FS Стебель 6.5 + 1.1 0.44 + 0.08 3.S + 0.6 0.26 + 0 04

LS Стсбе.'о» 6,1 ±0,6 0.34 + 0.04 2.8 ± 0,5 0,16 + 003

ML JIltCT 4.5 ±0.4 0.26 ±0.02 4.9 + 1,7 0.23 + 0.03

MS Стебель 5 2± 1.3 0 22 ± 0.06 2.5 ± 14 0 П ±0.06

QS Стебель 3.9 ±0.2 0 18 + 0.05 2 0 + 0,6 0.11 ±0.05

QR Корень 6.0 ± 1,5 0.31+009 1,4 ±0.04 0 06 ± 0.02

PS Стебель 4.5 ± 0.5 0,28 + 0.03 2 8 ± 0.6 0,18 ±0 04

PR Корень 4.2 ± 0,9 0.26 ± 0.06 2.2 ± 0.2 015 ±0.01

Примечания: приведены средние значения и их стандартные отклонения из трех экспериментов. * Содержание полисахаридов в % от сухой массы, предварительно обработанной метанолом и хлороформом.

2.3. Динамика роста н биосинтеза полисахаридов каллусиой культуры смолевки обыкновенной

Известно, что на каждой стадии 30 развития клеток состав и строение полисаха- г-5 ридов клеточной стенки изменяются (Gibeaut g г,о and Carpita, 1994; Kakegawa et aJ., 2000). £ i.s Пектины синтезируются во время интенсив- to ного деления и растяжения клеток, в это время o,s происходит активный метаболизм полисаха- о.о ридов (Kakegawa et а!., 2000). Тем не менее, имеется недостаточно сведений о метаболизме пектиновых полисахаридов и об изменениях в их составе во время ростового цикла.

Мы установили, что кривые роста каллуса по сухой и сьгрон биомассе имеют типичную S-форму. Длительность лаг-фазы составляет 3 суток, экспоненциальная фаза длится до 18-21 суток, затем наступает стационарная фаза и фаза деградации клеток (рис. 1). Прирост

9 12 1518 21 24 27 SO W Время, суг

Рис. К Динамика роста каллусной культуры 5. \-ulgaris. 1,2- относительный рост культуры в полулогарифмической системе координат по сухой и сырой биомассе соответственно; X - концентрация биомассы в момент времени 1; X, - начальная концентрация биомассы.

сырой биомассы достигает своего пика (518 г/ л) на 21 сутки культивирования, прирост сухой биомассы — на 18 (утки (12 г/л).

Содержание полисахаридов в каллусиой культуре во время ростового никла. Между ростом культуры и биосишезом пектина наблюдается корреляция. Выход силенана, продуктивность каллуса по силенану на литр питательной среды и за сутки являются максимальными во время экспоненциальной фазы роста клеток. В стационарную фазу и фазу деградации клеток биосинтез пектина резко снижается (рис. 2А). Концентрация арзбиногалактана в клетках изменяется незначительно во время культурального цикла, тогда как продуктивность полисахарида на литр среды и скорость продукции за сутки увеличиваются и достигают максимума во время экспоненциальной фазы, что связано с повышением продуктивности культур по биомассе (рнс. 2В).

С 3 Ь « Ч 1е 31 2* 17 30 31

а э « » « и и г* it ю тл

Вр«ми.сут Бречи.сут

Рис. 2. Содержание силенана (А) и арабиногалактана (В) в каллусной культуре смолевки обыкновенной в цикле выращивания. 1 - выход полисахарида, % от сухой массы; 2 - содержание полисахарида, г/л.

Качественный_состав

полисахаридов в каллусной культуре в цикле выращивания. Значительные изменения в моносахаридном составе полисахаридов наблюдаются во время культивирования каллуса смолевки. Так, во время лаг-фазы и в начале экспоненциальной фазы роста каллуса силенан содержит большое количество гал акту роковой кислоты, около 80% (рис. 3). Высокое значение Kiv полисахарида (0.45), полученное при гельфильтрации силенана на сефакриле S-500, свидетельствует о формировании силенана с низкой или средней молекулярной массой. В этот период, вероятно, происходит биосинтез галактуро наново го (или рам но гад акту ро-нанового) гора силенана.

В середине экспоненциальной фазы, во время растяжения клеток, (12-15 сут) наблюдается снижение содержания галактуро но вой кислоты до 65% (рис. 3), увеличение суммарного количества нейтральных моносахаридных остатков за счет остатков галактозы и арабинозы (табл. 9) и тенденция к увеличению моле^ляриой массы силенана (К^ 0.04), Кроме того, ионообменная хроматография на DEAE-целпюлозе указывает на гомогенность полисахарида. Эти факты свидетельствуют о биосинтезе макромолекулы силенана, имеющей, наряду с линейным кором, разветвленные области рамногалактуронана с боковыми цепями из остатков арабинозы и галактозы.

Наши данные подтверждаются результатами, полученными другими исследователями (Goubel and Morvan, 1994; Fujino and Itoh, 1998; Stolie-Smits et a)„ 1999; Geshi et al., 2000).

Во время стационарной фазы и фазы деградации клеток силенан, вероятно, трансформируется в галактуронан (или рамногалактуронан), что сопровождается увеличением содержания галактуро новой кислоты, снижением суммарного количества нейтральных моносахаридных остатков (преимущественно остатков галактозы и арабинозы) и тенденцией к снижению молекулярной массы силенана (К = 0.14-0.43).

Изменение в соотношении галактоза/арабиноза в силенане свидетельствует об изменениях в арабиногалактановых боковых цепях (табл. 9). Снижение этого соотношения во время экспоненциальной фазы до - 1, вероятно, показывает, что арабиногалактан присоединяется к основной цепи силенана. Последующее увеличение соотношения до ~ 2 в течение стационарной фазы и фазы деградации клеток может быть связано с отщеплением остатков арабинозы от арабиногалактановых боковых цепей рамногалактуронана раньше, чем остатков галаютаы.

О -1-1-i-1---

О 3 9 15 21 27 33 Время, сут

Рис, 3. Содержание галактуроновой кислоты в силенане(1)и арабиногалактане (2) в каллусной культуре S. vulgaris в цикле вырашивания.

Таблица 9

Характеристика нейтральных компонентов силенана в каллусной культуре vulgaris в цикле выращивания

Время, сут Gal/A га Моносахариды, мол. %*

Gal А га Rha Man Glc Сумма

3 1.7 2.9 1.7 0.9 0.5 0.7 1.6 8.3

9 1.0 4.5 4.4 1.0 1.1 1.1 1.7 13.8

15 1,3 3.7 2.8 1.2 1.9 1,9 2.6 14.1

21 1.2 2.9 2.4 1.4 0.4 0.9 1.9 9.9

27 1.6 2.5 1.6 1.6 0.8 0.8 1.0 8.3

33 1.9 2.6 1.4 1.4 1.0 0.8 1.3 8.5

Примечание: * приведены средние значения из серии экспериментов

Для кислого арабнногалактана, образующегося во время экспоненциальной фазы каллуса смолевки, характерно высокое суммарное содержание нейтральных моносахаридных остатков, в частности, остатков галактозы и арабинозы (табл. 10), и наблюдается тенденция к увеличению его молекулярной массы (К1У = 0.06). Во время стационарной фазы и фазы деградации клеток наблюдается снижение этих параметров (К^ = 0.23-0.42), а также увеличение содержания галактуроновой кислоты (рис. 3), что, вероятно, свидетельствует о разрушении остатков арабинозы и галактозы в арабиногалактане и о трансформации его в пектин.

Таблица 10

Характеристика нейтральных компонентов арабиногалактана в каллусной культуре & vulgaris в цикле выращивания

Время, сут Gal/Ara Моносахариды, мол. %*

Gal Ага Rha Xyl Man Glc Сумма

3 3.9 40.2 10.2 2,6 5.0 2.3 3.8 64.1

9 3,3 42.9 13.1 2.9 3.6 2.0 3.9 68.4

15 4.1 48.8 11.9 2.7 2.9 2.1 3.2 71.6

21 4.1 41.4 10.0 2,9 2.8 1.4 2.7 61.2

27 4.7 32,7 6.9 2.9 1,5 1.6 1.5 47.1

33 4.5 26.8 6.0 2.9 1.7 1.7 1.8 40.9

Примечание: * приведены средние значения из серии экспериментов.

Итак, мы полагаем, что биосинтез галактуронанового (или рамногалактуронамового) кора силенана происходит во время лаг-фазы и в начале экспоненциальной фазы роста культуры. В середине экспоненциальной фазы араб иногалактан присоединяется к кору рам но галактуронана и образует пектин, содержащий главную линейную углеводную цепь и разветвленные участки макромолекулы. В стационарную фазу и фазу деградации с иле на н трансформируется в галактуронан (или рам ногалактуронан). При этом происходит разрушение арабиногалактановых боковых цепей и увеличение

содержания пивной углеводной цепи макромолекулы силенана. Оптимальный биосинтез снленана и кислого арабиногалактана наблюдается в экспоненциальную фазу роста культуры.

При длительном культивировании (на протяжении 62 пассажей) каллусная культура смолевки сохраняет относительно стабильный уровень биосинтеза полисахаридов.

3. Влияние факторов культивирования на рост каллусной культуры и на биосинтез полисахаридов

3.1, Влияние фнтогормонов

Известно, что внешние факторы, такие как фитогормоны, источники углерода и минеральный состав среды оказывают влияние на полнсахарндный состав клеточных стенок и на рост культивируемых клеток. Однако степень этого влияния изучена недостаточно и часто зависит от вида культуры (Stepan-Sarkissian and Fowler, 1986; Fry et al., 1990; Masuda 1990; Liu and Zhong, 1998).

Синтетические ауксины: 2,4-Д, НУК, ИМК (индол ил масляная кислота), -эффективнее стимулируют рост каллуса смолевки, чем природный ауксин ИУК (рис. 4 А). Вероятно, это об(условлено тем, что ИУК в среде быстро разрушается под действием ИУК-оксидазы. Замена ауксина 2,4-Д на НУК, ИМК и ИУК не оказывает существенного влияния на выход полисахаридов и на их биохимические характеристики. Качественный моносахаридный состав остается постоянным при некоторых различиях в соотношении моносахарид пых остатков.

Отсутствие или недостаток ауксина ингибирует рост каллуса (рис. 4В). Уменьшение концентрации 2,4-Д в среде ниже 1.0 мг/л приводит к незначительному снижению выхода силенана (6-8%). Оптимальной для роста каллуса и биосинтеза силенана является среда, содержащая 1.0-2.0 мг/л 2,4-Д. Изменение концентрации 2,4-Д в среде не оказывает достоверного влияния на выход арабиногалактана, который составляет 3-5% от сухой массы.

При более высоких концентрациях 2,4-Д (1-5-2.0 мг/л) происходит снижение содержания галактуро новой кислоты в силенане до 57-62%. При концентрации 2,4-Д 2,0 мг/л наблюдается увеличение относительного содержания остатков арабинозы в силенане, а при 2,4-Д 1.5-2.0 мг/л - в араби ногалакгане.

Вероятно, повышенная концентрация ауксина 2,4-Д способствует биосинтезу арабиногалактана с более высоким содержанием остатков арабинозы и формированию силенана с большим содержанием остатков арабинозы в боковых цепях. Ранее на культуре клеток явора было показано, что ауксин 2,4-Д стимулирует утилизацию предшественников биосинтеза полисахаридов (Stoddart et al., 1967; Rubery and Norihcote, 1970).

Оптимальным для роста каллуса смолевки является цитокинин БАП, а также зеатин в концентрации 0.2 мг/л. Замена БАП другими цитокннинами и

Sik30 Ос 30 Сэ1Э0 Ära 30 Suc 1S+S« 20+ Gts 15 Ar» 10 Сакам, г/п

30 40

50 75 100 Салрои г/л

НО с . 14 Я 2 312

3 i SlQ

10 £ О У 8

ю ё g. e

5 0 № <0 & о I? г а> 0

0.63 1.25

Кальций, мМ

2.5 3.75 Фосфат, н М

Рис. 4. Влияние факторов культивирования на рост каллуса S. vulgaris и на биосинтез полисахаридов.

А, В - ауксины, контроль - 2,4-Д, 1.0 мг/л; С, D - сахара, контроль - сахароза, 30 г/п; Е, F - азот, инггроль - азот, 60 мМ и NH/: N03" =1 : 2; G - кальций, контроль -3.0 мМ; Н - фосфат; контроль — 1,25 мМ. * Различия достоверны при Р <0.05. Щ Арабиногалактан, О Силекан, Ш Биомасса.

изменение концентрации цитокинина от 0 до 1.0мг/л не влияет на выход полисахаридов.

Таким образом, концентрация ауксина имеет большее значение для биосинтеза полисахаридов, чем природа ауксина. Цитокиннн не является необходимым компонентом питательной среды для роста каллуса смолевки и для биосинтеза полисахаридов,

3.2. Влияние углеводов

Такие источники углеводного питания, как сахароза, глюкоза и галаюоза, за исключением арабинозы, положительно влияютнарост каллуса и на биосинтез полисахаридов (рис. 4С). На среде с галактозой наблюдается увеличение периода адаптации культуры к субстрату. Галактоза оказывает стимулирующий эффект на выход и продуктивность арабиногалактана.

Низкие концентрации сахарозы угнетают рост клеток и биосинтез полисахаридов (рис. 40). Увеличение концентрации сахарозы приводит к накоплению биомассы, но не повышает эффективность использования субстрата. Оптимальным содержанием Сахаров в среде для роста культуры клеток смолевки можно считать 30 г/л сахарозы и смесь сахарозы с глюкозой (по 15 г/л). Увеличение концентрации сахарозы в среде от 30 до 100 г/л не оказывает существенного влияния на выход полисахаридов. Тем не менее, продуктивность по полисахаридам на литр среды возрастает за счет повышения продуктивности культуры по биомассе.

Варьирование питательной среды по источникам углерода не оказывает существенного влияния на биохимические характеристики арабиногалактана и силе и а на, тогда как увеличение концентрации сахарозы до 50-100 г/л приводит к снижению содержания галактуроиовой кислоты в силенане, при этом существенное увеличение остатков галактозы и арабинозы наблюдается при 50 г/л сахарозы (табл. 11). Вероятно, при этом уровне сахарозы формируется разветвленный пектин. Снижение соотношения арабиноза/галакгоза до 1 :0.7-0.8 при дальнейшем увеличении концентрации сахарозы до 75 и 100 г/л, вероятно, связано с реакцией клеток на осмотический стресс.

3.3. Влияние минерального питания

Азот. Снижение или увеличение концентрации азота на 50% по сравнению с контролем (60 мМ) не оказывает достоверного влияния на прирост биомассы, индексы и удельную скорость роста каллуса (рис. 4Е). Отсутствие азота о среде приводитк значительному угнетению роста клеток. С увеличением концентрации азота от 0 до 60 мМ происходит повышение выхода силенана и продуктивности каллуса на литр среды. В то же время высокое содержание азота в среде (90 мМ) приводит к существенному снижению биосинтетических показателей по силенану. Увеличение концентрации азота стимулирует биосинтез кислого арабиногалактана в каллусе и достигает максимума при 90 мМ азота.

Таким образом, оптимальные концентрации азота в среде для биосинтеза силенана и арабиногалактана отличаются.

Таблица 11

Характеристика полнсахарщщых фракций, выделенных из каллуса S. vulgaris,

культивируемого в присутствии различных концентраций сахарозы

Содержание, мол %• Концентрация сахарозы, г/л

20 30 40 50 75 100

AG SV AG SV AG SV AG SV AG SV AG SV

Gal А** 138 80,S 111 70 .Q Ю.7 71.3 U.5 653 9.3 S8.S 9 3 57.8

Gal 35.8 2,9 43.6 1.6 47.5 49 398 5.3 52.3 2.1 49.6 2.6

Ara 7. S 2,8 8,2 0.9 12,5 3.8 12.1 3.9 14A 2,6 17.5 3,7

Rha 3.6 1.6 2,8 0.6 3,0 14 2.8 1.7 2,6 1.1 3,0 1.4

Gfc 2.7 16 1.3 1.5 4.3 1.0 34 18 4.8 1.0 3 0 2.2

Xyl 2.6 1.1 2.0 0,5 34 0.6 2.8 0.7 6 [ 0.5 6.2 0.9

Man 0.9 1.2 1.5 0 7 2.4 0.9 3.6 13 4.5 0.5 4.2 1.2

Белок** 22.4 15 7 87 129 172 17.2 16.8 199 18.S 21 S 2-1.0 21.5

Примечания: ** приведены средние значения из серии экспериментов. *** Весовые проценты, приведены средние значения из трех экспериментов. АО - кислый арабиногалактан, вУ - с члена!), контроль ~ сахароза, 30 г/л.

Равное соотношение нитратной и аммонийной форм азота приводит к значительному подавлению роста каллуса (рис. 4 р). Выход силенана снижается при исключении аммонийной формы азога(0:1) ил и при преобладании ее (2 ; 1). Для биосинтеза силенана необходимо присутствие как нитратной, так и аммонийной формы азота: равное количество обеих форм азота (1 : 1) или доминирование нитратной формы (1 : 2) стимулирует биосинтез силенана. Уровень биосинтеза кислого арабиногалактана является максимальными при исключении из состава среды аммонийного азота.

В табл. 12 приведены данные о влиянии азотного состава среды на биохимические характеристики силенана и арабиногалактана Ав. Так, при отсутствии азота в среде содержание галактуроковой кислоты в силеиане снижается до 21%, а при концентрации азота 90 мМ - увеличивается до 79%. Вероятно, при отсутствии азота происходит разрушение силенана в клетках. Содержание остатков галактозы в арабнногалактане существенно снижается при исключении азота из состава среды или при уменьшении его концентрации до 30 мМ, что, вероятно, свидетельствует о разрушении арабиногалактзнового полисахарида.

Таким образом, оптимальной для роста каллуса является среда, содержащая 30-90 мМ общего азота, для биосинтеза силенана-средас 60 мМ азота, а для биосинтеза арабиногалактана — среда с 90 мМ азота при соотношении аммонийной и нитратной форм 1 : 2, Полисахариды имеют близкий качественный моносахаридный состав и отличаются по соотношению моносахаридов и содержанию галактуроновой кислоты.

Таблица 12

Влияние азота и кальция среды на характеристики _силенана SV и арабнногалактана AG

Фактор Концентра- Полиса- Gal A, Недальние моносахариды, мол % Бело*,

ция, мМ харно BCC %* Gal Ага Rha Glc Xyl Man всс. %*

NH/ + 0 + 0 AG 9.0 19.9 7 7 1.9 4.6 7,7 4.1 17.0

NOj" SV 205" 4.1 3.0 15 1,8 3.9 2.1 1.0

10 + 20 AG 7.S 32.4 6.5 IS 3,2 5.7 2.6 14.0

SV 73.9 2,7 1.6 It 5.6 OS O.S 11.4

30 + 60 AG 9.7 44.1 9,9 2.6 5.3 5.0 1.2 IS 5

SV 79.4" 2.6 1.7 15 1.2 0.6 0.7 142

Контроль*** AG ¡0.8 46.5 7.7 2.1 4,1 5.6 16 12.9

SV 68.3 1.9 1.2 1 0 1.7 0.5 0.7 11.8

Са1' 0 AO 10.7 38. S 13.8 34 3.3 2.0 1.5 187

SV 37,1" 3.0 1.9 1.1 2.1 0.7 0.9 9.7

15 AG 8,3 +3,4 ! 1.2 2.4 6.3 4.6 4 3 16,5

SV 68.2 4.4 2.8 1.4 2.3 0.8 1.0 160

4.5 AG 8.6 45 0 9.2 2.4 1,9 3.1 1.2 13.7

SV 78.1** 2.3 1.4 10 1,2 0.4 0.7 206

Примечания: * приведены средние значения in трех экспериментов. ** Различия достоверны при Р < 0.05. *** Контроль - N11/+ = 20+40 мМ и 3.0 мМ кальция.

Кальций, Отсутствие кальция в среде значительно подавляет рост клеток, а увеличение или снижение его содержания на 50%, по сравнению с контролем, не оказывает существенного влияния на рост каллуса (рис. 40). Снижение концентрации кальция до 0-1,5 мМ вызывает достоверное снижение выхода силенана и продуктивности каллуса, тогда как изменение концентрации кальция не влияет на содержание арабнногалактана в клетках.

При культивировании каллуса смолевки на среде без кальция наблюдается снижение содержания галактуро новой кислоты в силена не на 54% (табл. 12), а увеличение концентрации кальция в среде способствует росту содержания галактуроновой кислоты от 37 до 78%. Изменение уровня кальция не оказывает существенного влияния на моносахариднын состав арабнногалактана.

Таким образом, оптимальной для роста каллуса является концентрация кальция 1,5-4.5 мМ, для биосинтеза силенана - 3.0-4.5 мМ, для биосинтеза арабнногалактана - 1.5-4.5 мМ.

ФосФат. Снижение концентрации фосфата (Рис, 4Н) по сравнению с контролем в два раза или увеличение ее »три раза стимулирует прирост биомассы каллусной культуры смолевки. Благоприятной для роста клеток является среда, содержащая 0,63-3.75 мМ фосфата. Снижение содержания фосфатадо 0-0.63 мМ приводит к уменьшению выхода силенана и продуктивности каллуса, оптимальный биосинтез силенана осуществляется в диапазоне концентраций фосфата 1,25-3.75 мМ. Изменение концентрации фосфата а среде не оказывает существенного влияния на уровень биосинтеза арабнногалактана в клетках и на биохимические характеристики силенана и арабнногалактана.

Таким образом, гормональные и трофические факторы культивирования являются значимыми для регуляции биосинтеза полисахаридов и оптимизации

роста каллуса и продуцирования полисахаридов клеточной культурой смолевки обыкновенной. Изменение содержания во внешней среде ауксина, сахарозы, кальция или азота вызывает изменения в строении пектиновых полисахаридов.

4. Влияние полисахаридов каллусной культуры S. vulgaris на накопление алкалоидов в культуре ткани Rmrwoifia serpentina (Benth.)

Совместно с сотрудниками кафедры биохимии Казанского госуниверситета установлено, что полисахариды каллусной культуры смолевки обыкновенной стимулируют накопление алкалоидов в каллусе раувольфии змеиной в 2-6 раз по сравнению с контролем, при этом для появления эффекта необходимы более высокие концентрации силенана (50 мг/л) и низкие арабиногалактана (0.01 мг/л). Для каждой фракции полисахарида существует оптимальная концентрация, при которой воздействие на клетки максимально, что свидетельствует о специфичности их действия.

Таким образом, данные, полученные с применением каллусных культур смолевки обыкновенной, вносят определенный вклад в изучение строения, биосинтеза и физиологической регуляции биосинтетических процессов пектиновых полисахаридов растений. Высокопродуктивные клеточные культуры смолевки могут в перспективе использоваться вместо интактного растения в биотехнологическим производстве физиологически активных полисахаридов данного растения.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны оптимальные условия каллусогенезасмолевки обыкновенной. Показано, что лучшими экс гигантам н я вля юте я листья и стебли стерильных растений. Количество продуцируемых каллусными культурами полисахаридов и их моносахаридный состав не зависят сггтипаэкспланта.

2. Впервые установлено, что наряду с силенаном, пектином интактного растения, каллуспая культура смолевки продуцирует кислый арабиногалактан, промежуточный продукт биосинтеза силенана. Общее количество полисахаридов, продуцируемых каллусом, равно или заметно превышает содержание полисахаридов в интактном растении.

3. Показано, что биосинтез силенана включает ряд стадий: раздельное образование галактуроиана и арабиногалактана, затем разветвленного пектина и, наконец, галактуроиана, образующегося в процессе утилизации силенана. Изменение содержания ауксина, углеводов, кальция или азота во внешней среде вызывает изменения в моносахаридном составе продуцируемого силенана. Оптимизированы условия роста кап^-аюй культуры смолевки и биосинтеза полисахаридос.

4. Показана принципиальная возможность замены интактного растения каллусной культурой смолевки для биотехнологического производства полисахаридов растения.

СПИСОКОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Popov S.V., Bushneva O.A., Misharina E.A., Ovodova R.G. Characterization of chemical composition and phagocytic activity of Silene vulgaris bioglycans / / Abstr. Intern. GlycoBioTechnol. Symp. Braunschweig, 1998. P. 43.

2. Мишарина E.A., Оводова Р.Г., Бушнева O.A., Оводов Ю.С. Каллусообразование Silene vulgaris (Moench) Garcke in vitro // Расти гел ьные ресурсы. С-Пб.: Наука, 1999. Т. 35, С. 88-95.

3. Бушнева O.A., Оводова Р.Г., Мишарина Е.А. Силенаны - полисахариды смолевки обыкновенной (Silene vulgaris) // Химия растительного сырья. 1999. № 1.С. 27-32.

4. Günter Е.А., Ovodov Yu.S. Biotechnologie production of polysaccharides by Silene vulgaris callus // Biotech News Intern,, 2001. V. 6. P. 14-15.

5. Понтер E.A., Оводов Ю.С. Влияние регуляторов роста на клеточную культуру Silene vulgaris и на химические характеристики продуцируемых ею полисахаридов// Химия растительного сырья, 2001. №2. С. 57-62.

6. Günter Е.А., Ovodov Yu.S. The alternating carbon strategy for enhancing production of polysaccharides by Silene vulgaris callus It Abstr. of 11th European Carbohydrate Symp. Lisboa, 2001. P. 313.

7. Гюнтер Е.А. Культуры клеток нетрадиционных растений как продуценты полисахаридов // Аграрная Россия, 2001. № б, С. 73-74.

8. Гюнтер Е.А., Оводов Ю.С. Питательная среда для культивирования каллус ной ткани Silene vulgaris (Moench) Garcke. Патент РФ №2169769 от 27.06.2001, БИ№ 18,2001.

9. Гюнтер Е.А., Оводов Ю.С. Питательная среда для получения каллусной ткани Silene vulgaris (Moench) Garcke, Патент РФ Ks 2171841 от 10.08.2001. БИ № 22, 2001.

10. Гюнтер Е.А., Оводов Ю.С. Способ получения пектиновых полисахаридов из биомассы культивируемых тканей растений. Патент РФ № 2175843 от 20.11.2001. БИ №32, 2001,

11. Günter Е.А., Ovodov Yu.S. Changes in cell wall polysaccharides of Silene vulgaris callus during culture // Phytochemistiy, 2002. V59. P, 703-708.

12. Gunter E.A., Ovodov Yu.S, An alternative carbon source for enhancing production of polysaccharides by Silene vulgaris callus // Carbohydr. Res., 2002, в печати.

Лицензия КР № 0025 от 20.06.96

Заказ № 39_Тираж 150 эю.

Информационно-издательский отдел Института физиологии Коми НЦ УрО РАН •