Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экдистероидсодержащие растения

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Экдистероидсодержащие растения"

На правах рукописи

ВОЛОДИНА Светлана Олеговна

ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩИЕ РАСТЕНИЯ: РЕСУРСЫ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

03 00.23 - биологические ресурсы 03.00.32 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сыктывкар 2006

Работа выполнена в Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, г. Сыктывкар

Научный руководитель: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Мартыненко Вера Антоновна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мелентьев Александр Иванович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Зарембо Елена Владимировна

Ведущее учреждение' Сибирский ботанический сад Томского государственного университета, г. Томск

Защита диссертации состоится 20 марта 2006 г. в 15е2 на заседании диссертационного совета Д.004.007.01 в Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН по адресу:

Республика Коми, г Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д 28

Факс: (8212) 240163

e-mail: disssovet@ib.komisc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Коми научного центра Уральского отделения РАН по адресу:

Республика Коми, г Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д 24

Автореферат разослан 17 февраля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

—— А.Г. Кудяшева

¿O06 А

М39

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Совершенствование традиционных технологий переработки растительного сырья, разработка принципиально новых технологий «живых систем», возвращение интереса к фитотерапии и опыту народной медицины вызвали новую волну исследований растений как источников ценных биологически активных веществ. На территории европейского северо-востока России произрастает более 1200 видов сосудистых растений, среди которых более 100 видов применяется в официальной медицине Российской Федерации (Мартыненко и др., 1994). В настоящее время большой интерес к использованию в качестве растительного сырья для получения новых адаптогенных лекарственных препаратов, тонизирующих пищевых добавок, косметических композиций представляют экдис-тероидсодержащие растения. С момента обнаружения экдистероидов в растениях в 60-х гг XX в. - полигидроксилированных стеринов, структурно идентичных или близких по структуре истинным гормонам линьки членистоногих, известно уже более 150 различных по структуре соединений этого типа (Dinan, 1998, Lafont, 1998, Фитоэкдистероиды, 2003). Они обнаружены у представителей более 100 семейств покрытосеменных растений. Следует, однако, отметить, что лишь очень немногие виды растений, для которых характерно высокое содержание экдистероидов (до 1-3%), пригодны для практического использования в технологиях получения фитоэк-дистероидов (Володин, 1999, Lafont, Dinan, 2003) В связи с этим актуальными направлениями исследований являются поиск новых растительных источников с высоким содержанием экдистероидов и разработка научных основных технологий получения экдистероидов из растительного сырья и клеточных культур.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института биологии Коми НЦ УрО РАН по теме. «Структурное многообразие и биологическая активность стероидов растений и клеточных культур» (Гос. per. N 01.2 00 107253) и была поддержана грантами Целевой программы сотрудничества ученых УрО и ДвО РАН «Сравнительное исследование экдистероид-содержащих растений географически удаленных флор: Урал, Дальний Восток» и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине Урала» «Разработка экдистероидсодержащих биологически активных добавок и лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний у жителей Крайнего Севера».

Целью настоящей работы является выявление экдистероидсодержащих видов растений в географически удаленных флорах, оценка возможности практического использования перспективных видов по качественным и количественным показателям состава и содержания экдистероидов у дикорастущих и культивируемых растений, разработка научных основ технологий получения экдистероидов из новых растительных источников и

клеточных культур.

Задачи работы:

1 Выборочный скрининг растений географически удаленных флор на содержание экдистероидов, выявление местообитаний экдистеро-идсодержащих видов растений, эколого-ценотическая характеристика сообществ с их участием, определение продуктивности некоторых видов растений и оценка возможности заготовки экдистероид-содержащего растительного сырья в природных популяциях;

2 Сравнительное исследование состава и динамики содержания экдистероидов у дикорастущих и культивируемых растений некоторых представителей родов Silene (сем Caryophyllaceae), Serratilla и Stemmacantha (сем Asteraceae),

3 Разработка научных основ технологии получения фитоэкдистерои-дов из новых растительных источников и клеточных культур;

4 Доклинические исследования новой экдистероидсодержащей субстанции «Серпистен», полученной из надземной части растений Serratula coronata L.

Научная новизна.

Проведен выборочный скрининг растений географически удаленных флор европейская часть России, Урал, Северный Кавказ, Украина, российский Дальний Восток и Китай, позволивший существенно расширить сведения о распространении экдистероидов в мировой флоре Впервые экди-стероиды найдены в папоротниках Athyrium sinense, Aleurítopteris argentea, Callipteris esculenta и Selenodesmium obscurum. Среди покрытосеменных растений экдистероиды обнаружены в четырех видах рода Serratula (Asteraceae) ■ S cardunculus, S. coríaceae, S. radiata и S. gmelinii; Stemmacantha serratuloides (Asteraceae); двух представителях семейства Caryophyllaceae: Silene jundzillii и Oberna cserei; трех представителях семейства Ra-nunculaceae. Helleborus caucasicum, Hepatica insularís и Clematis fusca, a также Bupleurum tríradiatum (Apiaceae), Iris uniflora (Iridaceae).

Дана эколого-ценотическая характеристика сообществ с участием ресурсного экдистероидсодержащего вида растений смолевки татарской (Silene tatarica), определены продуктивность ценопопуляций и выход 20-гидроксиэкдизона (20Е) из надземной части растений (европейский северо-восток России).

Установлено, что для десяти исследованных видов рода Serratula характерными экдистероидами являются 20Е, инокостерон, и экдизон, которые можно считать хемотаксономическими маркерами рода Кроме них, растения различных видов и популяций содержат специфический набор других минорных экдистероидов. Впервые показано влияние эколого-гео-графических факторов на соотношение основных и минорных экдистероидов в растениях этого рода. Показано, что в условиях культуры на Севере в листьях растений S quinquefolia доминирующим экдистероидом является инокостерон, а не 20Е, являющийся основным экдистероидом растений в естественных местообитаниях (Северный Кавказ), что, как показано, связано с различным уровнем освещенности в естественных местообитаниях (полог леса) и при выращивании на открытых делянках.

Показана штаммовая специфичность каллусных культур клеток Serratilla corortata по составу и содержанию экдистероидов. Выявлен штамм 011112-продуцент инокостерона. Практическое значение.

Выявлен ряд практически важных видов растений с повышенным содержанием экдистероидов В целях интродукции рекомендованы следующие виды: Chenopodium bonus-henricus - как пищевое и кормовое растение; S¡lene tatarica, Serratilla radiata, Stemmacantha serratuloides - продуценты 20E; Serratula quinquefolia - продуцент инокостерона в условиях высокой освещенности; Serratula gmelinii - продуцент структурно модифицированных экдистероидов. Для получения клеточных культур рекомендованы редкие виды растений и растения южных широтных групп: папоротник Polypodium vulgare (редкий охраняемый вид на европейском северо-востоке России) и Helleborus caucasicum (флора Северного Кавказа) На основании сравнительных данных по динамике содержания экдистероидов в онтогенезе растений разработаны рекомендации по заготовке растительного сырья с высоким содержанием целевых веществ Разработаны научные основы технологии получения экдистероидов из растительного сырья и клеточных культур Serratula coronata. Получены опытные партии субстанции для организации доклинических исследований На субстанцию «Серпистен» адаптогенного действия получен товарный знак

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены или представлены на Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2000), Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000), Международном симпозиуме «Биотехнологические подходы к использованию и сохранению растительных ресурсов» (Ялта, 2002), Международной конференции «Экологическая ботаника' наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002), V Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2003), III Международном конгрессе по лекарственным и ароматическим растениям (Таиланд, 2003).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в соавторстве в монографии «Фитоэкдистероиды» (СПб: Наука, 2003) Опубликованы 10 статей и тезисы 10 докладов на конференциях, получено 2 патента РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 194 стр , содержит 8 таблиц, 34 рисунка и 5 приложений. Состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов Библиографическое описание состоит из 123 наименований (в том числе 40 на иностранных языках)

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н В А Мартыненко, а также к.х.н. В.Г Лукше за консультации по методам выделения природных соединений, к.б н И. Ф Чадину за многолетнее творческое сотрудничество, к б.н. Л.Д Пчеленко за совместную работу по изучению физиологической активности субстанции «Серпистен», д.б.н А Р Ишбирдину за помощь в организации экспедиции по Южному

Уралу, доктору Лоуренсу Дайнану (Великобритания) за проведение биотеста растительных образцов, к б н В А Каневу за сбор образцов и определение видов растений, к б н. К.Г Ткаченко за сотрудничество и интерес к данной работе и ведущему инженеру А П Турышевой за помощь в подготовке многочисленных образцов для ВЭЖХ-анализа

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1.

ЗАДАЧИ И МЕТОДЫ БОТАНИЧЕСКОГО РЕСУРСОВЕДЕНИЯ

В обзоре литературы раскрыты теоретические и практические аспекты ботанического ресурсоведения, методология биохимических исследований лекарственных растений. Представлены данные о состоянии изученности ресурсов лекарственных растений на европейском северо-востоке России и распространении фитоэкдистероидов в мировой флоре Дан анализ современного состояния исследований физиологической активности фитоэкдистероидов у млекопитающих и человека, показаны тенденции и перспективы практического использования фитоэкдистероидов в медицине

Глава 2.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследований являлись дикорастущие виды растений Сбор образцов производили в течение 1998-2005 гг Растительный материал фиксировали путем высушивания в бумажных пакетах при температуре 60°С. Для анализа отбирали разные части растений на разных фазах развития.

Биотест на присутствие агонистов экдистероидов в растительных образцах проводился в лаборатории д-ра Л. Дайнана в Эксетерском университете (Великобритания) по методике (Dinan, 1992, Clement and Dinan, 1991).

Методика ВЭЖХ-анализа растительных образцов- измельченную растительную пробу 50-100 мг (точная навеска) экстрагировали 3 мл 60%-го метанола при 25°С в течение 16 часов Экстракт освобождали от взвешенных частиц путем центрифугирования (12 000 об /мин, 25 мин ). Затем отбирали 1 мл экстракта и разбавляли 2 мл воды. Разбавленный экстракт (3 мл) пропускали через концентрирующий патрон Диапак С10 (ЗАО «Био-ХимМак»). Экдистероиды смывали с патрона 60%-ным метанолом (3 мл) Перед вторичным использованием патрон промывали чистым метанолом (5 мл), а затем стабилизировали 20%-ным раствором метанола (3 мл). Анализ проводили на аналитической системе ВЭЖХ «Varían», «Pro Star» (США) Состав элюента: водаацетонитрил (100 20), скорость элюента 1.5 мл/мин; I = 242 нм; колонка Diasorb С1еЯ (150*4 мм).

Выявление местообитаний экдистероидсодержащих растений проводили во время серии маршрутных экспедиций в Республике Коми, Республике Башкортостан и Челябинской области. Во время экспедиций выявляли приуроченность произрастания экдистероидсодержащих растений к элементам рельефа, типам растительности и выполняли краткие геоботанические описания Для анализа содержания экдистероидов на пробных площадях отбирали усредненные образцы листьев центральной части генеративных побегов у 10-15 цветущих особей. Листья измельчали Для анализа использовали часть пробы (50-100 мг), полученную методом квартования.

При изучении ценопопуляций смолевки татарской использовали учетные площадки размером 0 5x0 5 м (по 40 для каждой) Для каждой из них составлялся список всех произрастающих видов, а также подсчитывалось количество генеративных и вегетативных особей Сомкнутость растительного покрова указывали для изучаемого сообщества в целом При анализе собранных данных выявляли видовой состав, встречаемость видов (%), общую плотность (особей на м2) и долю генеративных побегов (процентное отношение числа генеративных особей к общему числу особей) Для определения продуктивности определяли массу надземной части растений на десяти учетных площадках в сыром и воздушно-сухом состоянии Содержание 20Е определяли в общей биомассе и, при необходимости, в отдельных частях растений Анализ 20Е проводили методом ВЭЖХ

Культивирование экдистероидсодержащих растений проводили в научной коллекции лаборатории биохимии и биотехнологии в радиобиологическом комплексе Института биологии в окр г Сыктывкар Почву готовили в соответствии с имеющимися рекомендациями (Моисеев и др , 1979) Растения высаживали корневищами, а также выращивали из рассады и семян Растения рода серпуха и стеммаканта высаживали рассадой на площадь питания 40*70 см Посев семян растений смолевки татарской проводили на участке 1 5*3 м с шириной междурядий - 20 см

Каллусную культуру ЭеггаМа согопа(а выращивали на модифицированной среде Мурасиге-Скуга, с добавлением сахарозы - 30 г/л; 2,4-Д - 1, БАП - 0 2; мезо-инозита - 100 и витаминов по Стаба. фолиевой кислоты -0 5; рибофлавина (В2) - 0 5; биотина - 1 0; Са-пантотената - 1 0, кобала-мина (В12) - 0 0015 мг/л рН до автоклавирования - 5 8 Для получения суспензионных культур каллусную культуру переносили в жидкую питательную среду, идентичную по составу среде, на которой культивировались кал-лусные культуры, с исключением агара. Примерно через две недели суспензионную культуру фракционировали, используя отстаивание в течение 1-2 мин (отбирали среднюю фракцию) Суспензии выращивали в конических колбах объемом 500 мл, с 60-70 мл среды при 25-26°С, относительной влажности воздуха 60%, в темноте, на качалке (90-100 мин 1) Режим пересева: 17.5±1.8 мл инокулюма на 100 мл среды Интервал субкультивирования - 12-14 дней.

Статистическая обработка данных проводилась по общепринятой методике (Методика .., 1986).

Глава 3.

ВЫБОРОЧНЫЙ СКРИНИНГ РАСТЕНИЙ НА СОДЕРЖАНИЕ ЭКДИСТЕРОИДОВ

К настоящему времени экдистероиды обнаружены у растений, принадлежащим более чем к 100 семействам отделов Polypodiophyta, Pinophyta и Magnoliophyta Считалось, что экдистероиды присущи папоротникам и голосеменным, но они были обнаружены и у покрытосеменных, хотя вероятность их обнаружения в этом отделе была значительно ниже (Takemoto et al , 1967) Связей между распределением экдистероидов и филогенетической классификацией растений выявлено не было (Лафон, 1998) В Институте биологии Коми НЦ УрО РАИ разработана методология скрининга растений на содержание экдистероидов, основанная на принципах хемо-систематики (принцип «положительных триб») и данных этноботаничес-ких исследований Обширный скрининг растений европейского северо-востока России позволил не только выявить практически важные продуценты экдистероидов, но и установить закономерности распространения этого класса соединений среди царства растений (Фитоэкдистероиды, 2003) Представлялось интересным расширить географию поиска экдистероид-содержащих растений Нами проведены биохимические исследования растений, произрастающих на европейской части России, Урале, Украине, Северном Кавказе, в Западной Сибири, на российском Дальнем Востоке, в Корее и Китае Образцы растений были собраны во время экспедиций биохимического отряда Института биологии Коми НЦ УрО РАН или переданы для анализа другими исследователями Анализ проводили с помощью биотеста на культуре клеток BN Drosophyla melanogaster и ВЭЖХ Учитывая высокую вероятность обнаружения экдистероидов в папоротниках, нами был проведен анализ 42 видов папоротников из 36 родов 22 семейств, произрастающих на территории Северного Урала, российского Дальнего Востока и Китая По данным биотеста экдистероиды были обнаружены у представителей семи семейств отдела Polypodiophyta- Athyriaceae (Athynum sinense, Diplazium sibiricum, Callipteris esculenta), Dryopteridaceae (Dryopteris fragrans), Hymenophylaceae (Selenodesmium obscurum), Ono-cleaceae (Onoclea sensibilis), Osmundaceae (Osmunda asiatica), Polypodia-ceae (Cnptogramma steliri, Polypodium vulgare) и Sinopteridaceae (Aleuri-topteris argentea) В растениях Athyrium sinense, Aleuritopteris argentea, Callipteris esculenta и Selenodesmium obscurum экдистероиды обнаружены впервые Экдистероидсодержащие виды были обнаружены среди папоротников, произрастающих во всех исследованных географических зонах-на Северном Урале (Polypodium vulgare, Cryptogramma stellen, Diplazium sibiricum), на российском Дальнем Востоке (Athyrium sinense, Onoclea sensibilis, Osmunda asiatica) и в Китае (Callipteris esculenta, Selenodesmium obscurum, Aleuritopteris argentea) Видами с высоким содержанием экдистероидов являются папоротники Polypodium vulgare и Onoclea sensibilis

Нами проведен целенаправленный скрининг растений в «положительных трибах» ряда семейств покрытосеменных растений Как и ожидалось,

большое число экдистероидсодержащих видов было обнаружено в под-трибе Cardueae-Centaureinae (Asteraceae). Нами показано высокое содержание экдистероидов во всех десяти исследованных видах «положительного» рода Serratilla (серпуха), причем в растениях S cardunculus, S coríaceae, S radiata, S. gmelinii экдистероиды обнаружены впервые Нами исследованы образцы растений рода Stemmacantha (=Rhaporiticum), являющегося филогенетически близким к роду Serratilla Кроме хорошо изученного вида Stemmacantha carthamoides (=Rhaponticum carthamoides), мы исследовали содержание экдистероидов в двух других представителях этого рода. S uniflorum (российский Дальний Восток) и S. serratuloides, (Южный Урал) По сравнению с известным продуцентом S carthamoides оба других исследованных нами вида характеризуются более высоким содержанием экдистероидов В растениях S serratuloides экдистероиды обнаружены впервые В семействе Caryophyllaceae экдистероиды обнаружены в соответствии с хемотаксономическим прогнозом в образцах десяти видов растений' Lychnis wilfordii (российский Дальний Восток), Silene repens из дальневосточных и южно-уральских популяций; Silene italica, Silene longiflora, Silene supina, Silene gallica, Silene jundzillii, Obema cserei, произрастающих на территории Украины; Silene tatarica, Coccyganthe fíos-cuculi (европейский северо-восток России) Все эти виды являются представителями «положительной» трибы Lychnideae В растениях S jundzillii и О cserei экдистероиды обнаружены впервые Видами с высоким содержанием 20Е являются Silene repens (0 96%) (имеет широкий ареал, однако на территории европейского северо-востока России является редким охраняемым видом) (Красная книга , 1999), Silene italica (2 05%), Silene gallica (1.17%), Silene jundzillii (1 44%) из флоры Украины Среди представителей флоры европейского северо-востока России наиболее перспективным ресурсным видом является растение смолевка татарская (Silene tatarica), содержание экдистероидов в надземной части которого в фазу бутонизации - начала цветения достигает более 2%

Большой интерес представляет обнаружение высокой концентрации экдистероидов в образце растения Chenopodium bonus-henrícus (марь доброго Генриха), являющегося давно забытым пищевым растением Научный интерес представляет обнаружение экдистероидов в представителях сем. Ranunculaceae. Высокое содержание экдистероидов впервые найдено в образце растения морозник кавказский Helleborus caucasicus из флоры Северного Кавказа (0 24%) Экдистероиды обнаружены в двух других дальневосточных видах этого семейства' Hepatica insularís («положительная» триба Anemodeae) и Clematis fusca (триба Clematideae, представители которой на содержание экдистероидов ранее не исследовались). Однако из-за низкого содержания экдистероидов в обоих видах растений эти находки представляют сугубо научный интерес. Неожиданным было обнаружение большого количества экдистероидов (0 23%) в образце растения Bupleurum triradiatum (п-ов Камчатка), поскольку в соответствии с хемотаксономическим прогнозом обнаружение экдистероидов в семействе Apiaceae имело низкую вероятность

Таким образом, использование новой методологии скрининга растений, основанной на принципе «положительных триб» и использовании современных биологических и физико-химических методов анализа растительного материала (биотест на культуре клеток насекомых и ВЭЖХ), позволило нам перейти от случайного скрининга растений и направленному поиску экдистероидсодержащих видов в таксонах растений, в которых обнаружение экдистероидов имело высокую вероятность Для дальнейших ресурсоведческих, интродукционных и биотехнологических исследований весьма перспективными являются папоротники Polypodium vulgare и Onoclea sensibilis, а также покрытосеменные растения' представители родов Serratula и Stemmacantha (сем Asteraceae), Silene (Caryophyllaceae), Chenopodium bonus-henricus (Chenopodiaceae), Helleborus caucasicum (Ranunculaceae).

Глава 4.

СОСТАВ И ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ В РАСТЕНИЯХ В ЕСТЕСТВЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ И В УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (РЕСПУБЛИКА КОМИ)

После выявления практически важных видов растений - продуцентов экдистероидов первостепенное значение имеет сравнительное изучение состава и динамики содержания этих соединений в онтогенезе дикорастущих и культивируемых растений В этих целях нами были выявлены местообитания ряда практически важных видов растений и даны краткие эколо-го-ценотические характеристики сообществ с их участием Для смолевки татарской (5//еле ^¿алса (I.) Регэ.) был выполнен расчет продуктивности по биомассе и выходу 20Е в природных популяциях В настоящей работе представлены результаты сравнительных исследований некоторых перспективных видов растений.

Смолевка татарская - многолетнее травянистое растение сем СагуорИуНасеае высотой 25-100 см, произрастающее преимущественно на песке в сосновых лесах, на лугах, полянах, берегах рек и вдоль дорог На европейском северо-востоке России распространена во всей лесной зоне в бассейнах рек Северная Двина, Мезень, Печора, Вычегда и Луза. За пределами региона вид распространен на всей территории Европы, реже в Западной Сибири (Флора..., 1976).

Для определения продуктивности в природных популяциях нами были выбраны типичные местообитания этого вида, песчаные обнажения вдоль трассы Сыктывкар - Ухта и песчаные пляжи на правом берегу р Сысола в районе сел Пажга и Лозым Сыктывдинского района Республики Коми Смолевка татарская в подзоне средней тайги встречается в несомкнутых или слабо сомкнутых растительных группировках, формирующихся на приречных и придорожных песках, необлесенных участках песчаных боровых террас На изученных пробных площадях отмечено от 11 до 24 сопутствующих

видов, а внутриценотическая встречаемость смолевки татарской на них составила от 67.5 до 100%. Показатели плотности ценопопуляций этого вида вдоль трассы Сыктывкар-Ухта были довольно низки (7.3-9.6 экз./м2), а на песчаных пляжах по р Сысола они изменялись от 5.9 до 46.8 экз./м2. Доля генеративных особей в придорожных ценопопуляциях колебалась от 41.7 до 69.4%, а в приречных экотопах от 15.2 до 58.2%. Следует заметить, что во втором случае время перехода растений в генеративную фазу обусловлено продолжительностью паводка на разных участках поймы. Основные показатели состояния ценопопуляции смолевки татарской за два года наблюдений изменялись незначительно.

Продуктивность смолевки татарской изучали в десяти сообществах в течение двух лет наблюдений в различных местообитаниях. Анализ продуктивности надземной части смолевки татарской в различных ценопопуляциях показывает, что этот показатель выше для прирусловых ценопопуляций, чем для придорожных (табл 1). Учитывая возможное загрязнение участков, примыкающих к автомобильным дорогам, данные по продуктивности и выходу 20Е с единицы площади на этих участках нас интересовали только в сравнительном плане Более детально были исследованы прирусловые ценопопуляции Обращает на себя внимание факт того, что при одинаковой продуктивности ценопопуляций по сырой и сухой биомассе расчетный выход 20Е с единицы площади значительно отличался по своей величине, несмотря на то, что растения находились в одной и той же фазе развития - цветение. Например, максимальными значениями продуктивности характеризуются шестая и 11-ая ценопопуляции (продуктивности по сырой биомассе имеют приблизительно одинаковые значения и составляют соответственно 676.5±155 5 и 601.0±110 2 г/м2), при этом расчетный выход 20Е из надземной части в шестой ценопопуляции более чем в два раза выше, чем в 11-ой (899.7 и 441 0 мг/м2 соответственно). Различные значения расчетного выхода 20Е можно объяснить резкими отличиями в значениях доли генеративных побегов и плотности особей- в шестой ценопопуляции плотность особей 18 6 экз /м2, доля генеративных побегов - 44%; в 11-ой, где выход 20Е ниже, хотя плотность особей самая высокая из всех исследованных ценопопуляций (46.8 экз 1м2), доля генеративных побегов - самая низкая (15.2%) Эти данные согласуются с полученными нами результатами исследования динамики содержания экдисте-роидов в растениях смолевки татарской, которые свидетельствуют о более низком содержании экдистероидов в ювенильных и имматурных особях по сравнению с растениями, находящимися в генеративном возрастном состоянии, в фазах бутонизации и цветения Таким образом, в ценопопуляциях, характеризующихся высокими показателями продуктивности надземной массы растений преимущественно за счет вклада ювенильных и имматурных особей, нельзя прогнозировать высокий выход 20Е с единицы площади. При равной продуктивности выход 20Е выше в ценопопуляциях с высокими значениями доли генеративных побегов. Исходя из этих соображений, не является неожиданным тот факт, что выход 20Е оказался наиболее высоким в ценопопуляциях 4, 8 и 12 с меньшими значениями

Таблица 1

Продуктивность ценопопуляций ЭНепе (а1апса по биомассе и теоретический выход 20-гидроксиэкдизона с единицы площади

№

Расположение ценопопуляции

Дата исследования Фаза развития Продуктивность по биомассе, г/м2 Содержание сухого вещества, % Выход 20Е, мг/м2

сырая сухая

5 07 01 бутонизация 124 9 ±30 2 54 6 ± 7 4 43 7 131 0

4 07 02 бутонизация 216 4 ±82 0 76 7 ±17 2 49 3 653 1

4 07.02 бутонизация 138 4 ±14 5 59 6 ± 3.5 45.8 1553.9

20 07 01 цветение 195 5 ±46 7 71 2± 11 6 31 1 438 0

20 07 01 676 5 ± 155 5* 223 3 ± 37 8 34 1 899 7

цветение 190 3 ±34 6 88 1 ±16 0 50 1 98 0

20 07 01 цветение 226 7 ± 57 6 82 0± 18.0 38 516 6

6 08 02 цветение 249 8 ± 63 0 77 3 ±15 6 36 1366 1

6 08 02 цветение 322 0 ± 64 7 105 6 ±18.7 34 2 807 9

18.07 01 цветение 601 0 ± 110 2 248 9 ± 29 2 31 6 441 0

11.07 02 бутонизация 183 1 ±28 9 75 6 ± 6 8 32 0 1999 9

1 73 км трассы Сыктывкар-Ухта

2 Там же

4 98 км трассы Сыктывкар-Ухта

5 Левый берег р Сысола напротив с Пажга

6 X

Там же

7 Там же

8 Там же

9 Там же

11 Правая сторона р Сысола, остров напротив с Пажга

12 Там же

Примечание: Здесь и далее в числителе - значения продуктивности, содержания сухого вещества и выхода 20Е из надземной части, в знаменателе - значения показателей для корней

продуктивности, но в которых доля генеративных побегов больше. При этом растения смолевки татарской находились в фазах бутонизации и начала цветения, когда содержание 20Е в надземной части достигает максимального значения Мы определили вклад отдельных органов в структуру урожая надземной части и теоретический выход 20Е из отдельных частей растений (на примере 10-ой ценопопуляции). Было установлено, что продуктивность надземной части растений по сухой биомассе составила 58 0+8 9 г/м2. Доля листьев (как наиболее обводненных частей растений) составила 0 23 общей сухой биомассы, доля стеблей - 0.46, а соцветий - 0.31 Суммарный выход 20Е составил 450 мг/м2, при этом более 80% этого количества вещества можно получить из соцветий (370 мг) При изучении продуктивности надземной массы растений смолевки татарской второго года жизни при выращивании в культуре (1 5x3 м, ширина междурядий - 20 см) была определена плотность особей в агроценозе, которая составила 1200 экз /м2, и доля генеративных побегов - 44% Продуктивность по сырой биомассе составила 1 7, продуктивность по сухой биомассе - 0 4 кг/м2. При среднем содержании 20Е в надземной массе растений смолевки татарской - 0 6%, теоретический выход - 2 4 г/м2 Полученные данные свидетельствуют о целесообразности интродукции растений смолевки татарской в качестве перспективного продуцента фитоэкдистероидов Таким образом, этот вид, будучи достаточно распространенным на территории европейского северо-востока России, является перспективным источником экдистероидов.

Представители родов Serratula L. и Stemmacantha Cass. (сем. Asteraceae). Нами выявлены местообитания и проведены сравнительные исследования состава и содержания экдистероидов у представителей рода Serratula и Stemmacantha serratuloides Местообитания растений серпухи красильной (S tinctoria) выявлены вблизи охранной зоны Приокс-кого террасного биосферного заповедника (Серпуховской р-н Московской обл.); серпухи Гмелина (S gmelinii) - на Южном Урале (хребет Ирендык); серпухи лучевой (S radiata) и серпухи пятилистной (S quinquefolia) - на Северном Кавказе (гора Машук); стеммаканты серпуховидной (Stemmacantha serratuloides) - на Южном Урале (засоленный участок степи вдоль трассы Сибай-Орск). Исследование состава и содержания экдистероидов в образцах растений Serratula coronata из географически удаленных популяций (европейская часть России, Южный Урал, Северный Кавказ, Украина, Западная Сибирь, Дальний Восток, Корея), а также 9 других видов этого рода показало, что характерными экдистероидами для них являются 20Е, инокостерон, макистерон А и экдизон, которые можно считать хемо-таксономическими маркерами рода. Набор других минорных экдистероидов для каждого вида специфичен Соотношения характерных экдистероидов в растениях различных видов, а также в образцах растений одних и тех же видов из географически удаленных популяций (S coronata) варьируют в достаточно широком интервале значений. Например, инокостерон и экдизон в образцах различных видов серпух и в образцах растений серпухи венценосной из удаленных популяций могут выступать как в качестве мажорных, так и минорных компонентов (табл. 2). Так, например, в отличие от

Таблица 2

Состав экдистероидов в образцах растений ЗеггаЫа согопа(а 1_ из географически удаленных популяций

Соединение Состав и содержание экдистероидов в образцах растений различного происхождения (%)

Юж Дальний Восток БС-11 Томская обл ЭС-12 Южный Урал Сев Кавказ ЭСИЗ Украина ЭС-14 Моек обл ЭС-15 Культивируемые растения

Корея SC-10 вС-1 SC-2 SC-3 SC-4 вС-6 1 SC-8

20Е 1 55 1 48 1 63 0 69 0 97 3 04 1.02 1 07 0 89 1 76 284 1 17 1 60

2 сл следы следы выр следы следы - - следы следы следы следы сл

Инокостерон 0 06 0 20 0 27 0 15 0.01 0 01 0 02 0.03 0 01 0 01 0 02 0 02 0 37

4 сл сл сл выр сл следы следы сл сл сл сл сл

Макистерон А сл сл сл выр сл следы следы следы следы сл сл сл сл

Центральная

область 2 сл пика 2 сл

хроматограм- МЫ следы выр выр выр следы пика

Е 004 следы 0 35 0 13 0 03 0 08 0 06 0 06 0 08 0 03 0 02 следы 0 42

7 выр выр выр следы - - - - следы сл выр инт инт

8 - - - выр - - сл сл - - сл сл выр

Дальняя

область 2 сл

хроматограм- выр выр пика

мы

Сокращения' сл - слабый пик; выр - выраженный пик, инт - интенсивный пик.

европейских, у азиатских популяций S coronata (Западная Сибирь, Дальний Восток) мажорным компонентом наряду с 20Е является инокостерон Состав и содержание экдистероидов растений в европейских и уральских популяциях при продвижении с Юга на Север до северной границы ареала (Московская область) существенно не меняется Единственным мажорным компонентом в этих образцах является только 20Е «Экдистероид-ные профили» культивируемых растений и растений западно-сибирских популяций, где были собраны образцы для первичной интродукции, совпадают Полученные данные следует учитывать при выборе объектов для интродукции и проведении интродукционных и селекционных исследований Например, в будущем было бы интересно изучить, сохраняется ли соотношение 20Е, инокостерона и экдизона при перенесении образцов растений европейских популяций (как северных, так и южных) в условия Севера так же, как это имеет место в случае интродукции западно-сибирских популяций Обобщение результатов сравнительного исследования динамики содержания экдистероидов в дикорастущих и культивируемых растениях некоторых видов рода Serratula позволило выявить некоторые общие черты и особенности В растениях большинства изученных видов максимальное количество 20Е содержится в надземной части в фазу бутонизации - начала цветения Содержание 20Е в листьях центральных ме-тамеров S. tinctona составляет 1 60%, S. radiata - 0.92%, что несколько уступает известным в литературе данным по содержанию 20Е в листьях центральных метамеров S coronata (2 0%) (Фитоэкдистероиды, 2003). В отличие от серпухи венценосной, содержание сопутствующих экдистероидов (инокостерона и экдизона) в растениях серпухи красильной и серпухи лучевой незначительно Оба указанных вида растений (S tinctona и S radiata) являются перспективными источниками 20Е и рекомендуются для интродукции Серпуха Гмелина уступает по содержанию 20Е другим видам серпух, однако она может использоваться в качестве источника структурно модифицированных экдистероидов' в хроматограммах листьев и дикорастущих, и культивируемых растений наряду с 20Е имеются два мажорных пика соединений, одно из которых имеет время удерживания, близкое инокостерону, а другое - близкое экдизону Характерно, что пики этих соединений отсутствуют в хроматограммах стеблей и корня Принципиальные различия выявлены при сравнительном изучении состава и динамики содержания экдистероидов у дикорастущих и культивируемых растений серпухи пятилистной (S quinquefolia), у которой в естественных местообитаниях основным экдистероидом, как и для других исследованных видов, является 20Е, а в условиях интродукции - инокостерон, структурный изомер 20Е, отличающийся от последнего положением одной гидроксильной группы в боковой цепи Этот важный факт можно объяснить скорее не влиянием пониженных температур при выращивании серпухи пятилистной в условиях Севера, а резким отличием в световом режиме при выращивании в культуре по сравнению с естественными местообитаниями Так, в природных условиях многие виды серпух являются степными или лесостепными видами, те произрастают на хорошо освещенных местах- на

пойменных и суходольных лугах (серпуха венценосная), лесных полянах (серпуха неколючая), степных склонах гор (серпуха лучевая), а серпуха пятилистная произрастает в предгорьях Северного Кавказа под пологом леса Растения достигают до двух метров в высоту, имеют глубокую зеленую окраску. Наши наблюдения за развитием серпухи пятилистной в условиях Севера при выращивании на открытых делянках показали, что растения являются низкорослыми (до 60 см в высоту), имеют бледно-зеленую окраску листьев, листья сжаты. Наблюдаемые изменения в составе основных экдистероидов свидетельствуют об адаптивной реакции вида в измененных условиях произрастания, главным из которых является изменение светового режима В пользу этого предположения свидетельствуют данные о различной биологической активности 20Е и инокостерона Последний по сравнению с 20Е обладает более ярко выраженным антиоксидантным действием, так что в системе целого растения он может выступает в качестве дополнительного защитного фактора против повреждающего действия света Это предположение подтверждено нами экспериментально. При выращивании растений S quinquefolia в условиях искусственного затенения (освещенность 190230 ммоль/м2 сек FAR) соотношение 20Е и инокостерона не изменилось по сравнению с дикорастущими растениями, произрастающих под пологом леса (в обоих случаях мажорным компонентом в листьях растений являлся 20Е) Напротив, у растений, выращенных на открытых делянках, доминирующим экдистероидом в листьях вновь оказался инокостерон (освещенность 833 ммоль/м2 сек FAR) На наш взгляд, исследования по биохимической адаптации серпухи пятилистной следует продолжить, поскольку, кроме теоретического интереса, обнаруженный факт может иметь весьма важное практическое значение При выращивании в местных условиях серпуха пятилистная может служить источником весьма ценного экдистероида - инокостерона, для которого показана перспектива использования в качестве антиоксидан-тного, анаболического и сахароснижающего средства

Впервые экдистероиды обнаружены в редких лекарственных растениях Stemmacantha serratuloides (стеммаканта серпуховидная) На Южном Урале найдены заросли этого вида растений площадью приблизительно 10 га и средней численностью особей около 1 миллиона Показано высокое содержание экдистероидов в листьях имматурных и виргинильных особей (приблизительно 0 7%), а также в молодых листьях генеративных растений (1 43%), что свидетельствует о целесообразности интродукции растений этого вида и дальнейшего его изучения в качестве источника фитоэкдистероидов.

Глава 5.

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОЭКДИСТЕРОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Получение экдистероидов из растительного сырья. В главе 5 дан анализ известных в научной и патентной литературе схем выделения экди-

стероидов из личинок насекомых и растений Задачей настоящего раздела работы была разработка способа получения суммарной экдистероид-ной фракции из надземной части растений серпухи венценосной, который стал бы более дешевым, менее трудоемким, экономически выгодным при сохранении качественных и количественных характеристик конечного продукта Что весьма существенно, разработанная технология должна легко поддаваться масштабированию Особенностями разработанной схемы получения экдистероидсодержащей субстанции из надземной части растений серпухи венценосной являются' 1) водная экстракция растительного сырья; 2) извлечение из сгущенного водного экстракта конечного продукта смесью этилацетат-метанол или хлороформ-метанол; 3) упаривание органических извлечений досуха; 4) очистка экдистероидов путем хроматографии на оксиде алюминия в системе хлороформ-метанол или этилацетат-метанол возрастающей полярности; 5) перекристаллизация конечного продукта в системе этилацетат-метанол при соотношении 9:1 В тексте диссертации представлены технологическая и аппаратурная схемы, которые содержат некоторые не раскрытые «ноу-хау» Способ позволяет получать смесь экдистероидов, содержащую 75-80% 20Е, 11-15% ино-костерона, 3-7% экдизона Выход - 70%. На новую экдистероидсодержа-щую субстанцию указанного выше состава получен товарный знак «Серпи-стен» Разработанный способ применим к выделению экдистероидов из других видов растительного сырья биомассы серпухи неколючей, серпухи пятилистной, серпухи лучевой, серпухи Гмелина, стеммаканты серпуховид-ной, смолевки ползучей, смолевки татарской

Культуры растительных клеток - продуценты экдистероидов. Получение клеточных культур экдистероидсодержащих растений и их физиоло-го-биохимическая характеристика являются предметом многолетних исследований лаборатории биохимии и биотехнологии Института биологии, проводимых совместно с Институтом физиологии растений РАН (г Москва) (Фитоэкдистероиды, 2003) Направленностью этих работ было получение высокопродуктивных штаммов растительных клеток - продуцентов 20Е, основного экдистероида растений В то же время в этих исследованиях получению штаммов клеточных культур - продуцентов преимущественно минорных или нетипичных метаболитов экдистероидной природы уделялось мало внимания Не были разработаны способы выделения экдистероидов из клеточной биомассы

Анализ каллусных культур Serratula coronata на содержание экдистероидов. Нами проведен скрининг восьми штаммов каллусных культур Serratula coronata L из коллекции лаборатории биохимии и биотехнологии Института биологии на содержание экдистероидов Штаммы AI 2 2, AVII11.2, CHI 1 2, Dill 1 3, Dill 1.2, и Gl 11 были получены к б н Л А Ковлер в 1993 г Штаммы И\ 1.1 и HI 2 1 получены автором в 2003 г Нами показано, что качественный и количественный состав этих соединений значительно варьирует и является специфичным для каждого штамма Перспективным продуцентом 20Е остается штамм Gl 1 1, из которого в 1999 г была получена суспензионная культура, впоследствии депонированная во Всероссий-

скую коллекцию растительных клеток' На десятый год культивирования содержание 20Е в этом штамме оставалось на достаточно высоком уровне (0 40%) Штамм Gl 11 способен к биосинтезу и сопутствующих экдисте-роидов - инокостерона и экдизона, которые обнаружены в клеточной биомассе в одинаковой концентрации 0 12% Большинство исследованных штаммов каллусных культур содержало незначительное, а в ряде случаев следовое количество как 20Е, основного экдистероида растений, так и сопутствующих экдистероидов Интерес представляет штамм S coronata HI 11, в хроматограмме биомассы клеток которого обнаружены два интенсивных пика неидентифицированных соединений экдистероидной природы с временами удерживания, идентичными соединениям, обнаруженным в образцах растениях S coronata, которые были собраны на Южном Урале на засоленном участке степи (SC-2). В то же время эти соединения отсутствуют в растениях-интродуцентах, которые использовались для индукции каллусных культур. Полагая, что изменение в составе сопутствующих экдистероидов в растениях может являться следствием адаптивных реакций в системе целого растения в ответ на специфические условия среды обитания, есть целесообразность в дальнейшей работе исследовать влияние стрессирующих факторов на уровень и направление биосинтеза экдистероидов в клеточных культурах. Большой научный и практический интерес представляет штамм CIII 1.2, селективно продуцирующий преимущественно инокостерон в достаточно высокой концентрации (0 29%) и лишь незначительное количество 20Е (0 01%). Способность к селективному биосинтезу инокостерона является ценной характеристикой штамма, поскольку для целей получения индивидуального инокостерона использование штамма S. coronata CIII 12 позволяет избежать весьма трудоемкую стадию разделения смеси 20Е и инокостерона, имеющих очень близкие хроматографические характеристики В будущих исследованиях представляется весьма перспективным более глубокое изучение физиолого-биохимических характеристик штамма CIII 1.2 Serratula coronata - продуцента инокостерона, представляющего практический интерес в качестве высокоактивного биорегулятора развития насекомых, а также субстанции с высокой антиоксидантной активностью

Особенности выделения экдистероидов из клеточной биомассы. Схема выделения экдистероидов из клеточных культур S. coronata была разработана на примере штамма Gl 1.1 - продуцента 20Е. Анализ клеточной биомассы показал, что основным компонентом клеточной биомассы, как и в интактных растениях, является 20Е. В проанализированных образцах биомассы присутствовали сопутствующие экдистероиды инокостерон и экдизон, характерные для интактных растений серпухи венценосной

* Специализированная коллекция клеток высших растений (РКК-ВР) при Институте физиологии им К А Тимирязева РАН приняла на депонирование (01 01 2000 г Per № Serratula coronata - штамм Gl 1 1-164) в связи с подачей заявки на изобретение в растущую культуру клеток- Serratula coronata - штамм Gl 1 1 (суспензия) Авторы В Н Филиппова, С О Володина, Э Н Ануфриева, Л А Ковлер, В. В Володин

Анализ проб культуральной жидкости показал, что на протяжении всего цикла выращивания выделения экдистероидов в среду не происходит Ранее в лаборатории биохимии и биотехнологии было показано, что клеточные культуры S coronata характеризуются повышенным содержанием общих липидов (Ширшова и др , 1999) Поэтому при разработке схемы выделения экдистероидов из клеточной биомассы мы учитывали эти особенности По своему составу экдистероидный препарат, выделенный из биомассы культивируемых клеток, оказался близок субстанции, полученной из нативных растений серпухи венценосной, что указывает на возможность использования суспензионной культуры клеток в качестве альтернативного источника Аналогичным образом была получена субстанция инокост-рона при использовании штамма S coronata CHI 1.2 Таким образом, состав экдистероидов в клеточных культурах S coronata штаммоспецифичен и сохраняется в течение длительного времени культивирования В серии штаммов каллусных культур S coronata различного происхождения отобраны штаммы с преимущественным синтезом интересующих метаболитов' штамм G\ 1 1 - продуцент20Е, штамм CHI 1.2-продуцент инокостеро-на, штамм HI 11- продуцент нетипичных для исходных растений-доноров экдистероидов Из биомассы суспензионных культур S coronata разработана схема выделения экдистероидов

Глава 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩЕЙ СУБСТАНЦИИ «СЕРПИСТЕН»

Исследования, проведенные в лаборатории биохимии и биотехнологии и отделе радиоэкологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН, показали, что в тестах на одновозрастных (2 5-3 мес) половозрелых самцах белых беспородных мышей в диапазоне доз от 5 до 3000 мг/кг субстанция «Серпистен» не обладает ни острой, ни кумулятивной токсичностью А при введении peros в дозе, в 100 раз превышающей терапевтическую дозу (1000мг/кг), не вызывает увеличения частоты образования хромосомных аберраций в клетках костного мозга линейных мышей, что свидетельствует об отсутствии генотоксических свойств у экдистероидсодержащей субстанции «Серпистен» (Пчеленко и др , 2003) Исследование физиологической активности субстанции «Серпистен», проведенное автором совместно с к б.н. Л.Д Пчеленко, показало высокие уровни актопротекторного и ЦНС-тонизирующего составляющих адаптогенного действия, превышающие по величинам значения аналогичной биологической активности для известного препарата «Экдистен», содержащего 20Е из подземных органов рапонтикума сафлоровидного Установлен вклад инокостерона, входящего в состав композиционной экдистероидсодержащей субстанции «Серпистен», в ее анабопическое и антиоксидантное действие. Для выявления новых специфических активностей у субстанции «Серпистен» ее об-

разцы были направлены в ЗАО «Адаптоген» (г Санкт-Петербург) Выявлено выраженное противоишемическое и противодиабетической действие субстанции «Серпистен» (Отчет..., 2005).

По результатам проведенных исследований совместно с ЗАО «Адаптоген» разработана нормативная документация для регистрации новой адап- 5 тогенной экдистероидсодержащей биологически активной добавки «Серпистен»

ВЫВОДЫ

1 Проведен выборочный скрининг 106 видов сосудистых растений из отделов Polypodiophyta, Pinophyta и Magnoliophyta из географически удаленных флор (европейская часть России, Украина, Урал, Северный Кавказ, Западная Сибирь, Дальний Восток) Экдистероиды впервые обнаружены в папоротниках Athyríum sinense, Aleurítopterís argentes, Callipterís esculenta и Selenodesmium obscurum Среди покрытосеменных растений экдистероиды обнаружены в четырех видах рода Serratilla (Asteraceae) • S. cardunculus, S coriaceae, S radiata и S gmelinii; Stemmacantha serratuloides (Asteraceae); двух представителях семейства Caryophyllaceae' Silene jundzillii и Obema cserei; трех представителях семейства Ranunculaceae' Helleborus caucasicum, Hepatica insularis и Clematis fusca; а также Bupleurum triradiatum (Apiaceae); Iris uniflora (Iridaceae) Полученные данные расширяют сведения о распространении экдистероидов в мировой флоре

2. Дана эколого-ценотическая характеристика сообществ с участием ресурсного экдистероидсодержащего вида растений смолевки татарской (Silene tatarica)', определены продуктивность ценопопуляций и выход 20Е из надземной части растений S. tatarica. Установлено, что с точки зрения наибольшего выхода фитоэкдистероидов наряду с данными продуктивности надземной массы наиболее значимым показателем является доля генеративных побегов смолевки татарской в ценопопуляциях

3 Исследована внутривидовая биохимическая изменчивость растений Serratula coronata из географически удаленных популяций по содержанию экдистероидов. Показано, для растений этого вида характерными экдисте-роидами являются 20Е (мажорный компонент), инокостерон, макистерон А и экдизон не зависимо от эколого-географических условий произрастания. В отличие от растений европейских популяций у растений азиатских популяций (Западная Сибирь, Дальний Восток) инокостерон является мажорным компонентом наряду с 20Е. Экдистероидные профили культивируемых растений и растений западно-сибирских популяций, где были собраны образцы для первичной интродукции, не отличаются друг от друга

4 Проведены сравнительные исследования состава и распределения экдистероидов в дикорастущих и культивируемых растениях двух видов рода Silene, пяти видов рода Serratula и одного вида рода Stemmacantha (S serratuloides) Показано влияние эколого-географических факторов на со-

став и содержание экдистероидов. Показано, что в условиях культуры на Севере в листьях растений S quinquefolia доминирующим экдистероидом является инокостерон, а не 20Е, являющийся основным экдистероидом растений в естественных местообитаниях (Северный Кавказ), что, как показано, связано с различным уровнем освещенности в естественных местообитаниях (полог леса) и при выращивании на открытых делянках Ряд исследованных видов рекомендован для интродукции в качестве источников 20Е, инокостерона и других структурно модифициованых фитоэкдисте-роидов.

5 Разработаны научные основы технологии получения экдистероидсо-держащей субстанции адаптогенного действия «Серпистен» из надземной части растений серпухи венценосной, на которую получен товарный знак.

6 Показана штаммовая специфичность каллусных культур клеток Serratula coronata по составу и содержанию экдистероидов Показано, что экдистероидсодержащая фракция, полученная из клеточной биомассы серпухи венценосной (штамм Gl 1.1) существенно не отличается от субстанции «Серпистен» Выявлен штамм CIII 1 2 S coronata - продуцент инокостерона, обладающего высокой активностью гормона линьки насекомых и высокой антиоксидантой и анаболической активностью у млекопитающих

Список основных работ по теме диссертации

1. Володина С.О , Володин В В Технология получения субстанции 20-гидроксиэкдизона за надземной части ЭвггаМа согопа1а 1_ // Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности Тез докп междунар. науч конф Томск, 2000. С. 213

2 Володина С О , Володин В В Технология получения субстанции 20-гидроксиэкдизона - аналога тонизирующего препарата «Экдистен» // Химия и технология растительных веществ. Тез докл Всерос. конф Сыктывкар, 2000. С. 41.

3. Культуры клеток ЭеггаШа coronata и А]ида гер1апз - продуценты экдистероидов / В Н Филиппова, С О Володина, И Н Смоленская и др // Химия и технология растительных веществ' Тез докл Всерос. конф Сыктывкар, 2000. С. 147.

4. Патент 2153346, Россия, МКИ3А 61 К 35/78. Способ получения экдистероидов / В.В Володин, С.О. Володина, Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; № 99106351/14; Заявл. 29 03 99; Опубл. 27.07 2000 Б.И. № 21.

5 Патент N2155599, Россия, МКИ3А 61 К 35/78. Способ выделения индивидуальных соединений из смеси экдистероидов из надземной части растений Serraft^/a coronata/B В. Володин, С О Володина; Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; № 99106350/13, Заявл. 29 03 99, Опубл 10 09 2000 Б.И. № 25

6. Экдистероиды в культуре клеток Serratula coronata / В.Н.Филиппова, С.О. Володина, И.Н. Смоленская и др. II Вестн Башкирского ун-та, 2001. № 2(И). С. 129-131.

7. Экдистероиды в культурах клеток Serrtula coronata и Ajuga reptans / В H. Филиппова, С.О. Володина, И.Н. Смоленская и др. //Химия растительного сырья, 2002. № 1. С. 57-62

8. Пчеленко Л.Д., Метелкина Л.Г., Володина С.О. Адаптогенный эффект экдистероидсодержащей фракции Serratula coronata L // Химия растительного сырья, 2002. № 1. С. 69-80

9. Сравнительный аминокислотный состав растений-продуцентов эк-дистероидов / М.И Алиева, О.А Бездудная, С.О. Володина и др. // Химия растительного сырья, 2002. № 1. С. 63-68.

10 Володин В.В , Чадин И.Ф , Володина С О. Растения европейского северо-востока России как источники природных адаптогенов // Аграрная наука Евро-Северо-Востока, 2002. № 3 С 120-123. - (Науч. журн. СевероВосточного науч. метод, центра Россельхозакадемии).

11 Ecdysteroid accumulation in cell cultures of Serratula coronata and Ajuga reptans/V.N. Filippova, S.O. Volodina, S.E. Zoriniantsetal.//Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abstr. Intrn Symp. Yalta, 2002. P. 24.

12 Фитоэкдистероиды / Под ред B.B. Володина. СПб.: Наука, 2003. 293 с. - (Разделы 3.4, 5.7 и 6.3 подготовила С.О. Володина).

13 Культуры клеток экдистероидсодержащих растений / В.H Филиппова, С Э Зоринянц, С О. Володина и др // Физиология растений, 2003. Т. 50, № 4. С. 564-572.

14. Влияние экзогенного L-аланина на процессы первичного и вторичного метаболизма в культурах клеток растений-продуцентов экдистерои-дов / M И. Алиева, В H Филиппова, С.О. Володина и др. // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Матер V междунар симпоз. М., 2003 С 293-298.

15 Оценка возможного токсического и мутагенного эффектов экдисте-роидов серпухи венценосной (Serratula coronata L.) / Л.Д. Пчеленко, С О. Володина, H Г. Загорская и др. // Радиоэкологические и биологические последствия низкоинтенсивных воздействий. Сыктывкар, 2003 С. 235-241 -(Тр Коми НЦ УрО РАН; № 172).

16. Volodina S.O., Chadin I.F., Volodin V.V 20-Hydroxyecdysone levels and distribution in plants of Silene tatarica (L.) Pers. // Medicinal and aromatic plants for human welfare (WOCMAP III): Programme and Abstracts 3rd World Congress. Chiang Mai (Thailand), 2003. P. 302 - (No. PP02-75).

17 Чадин И.Ф., Володина С.О., Володин В В. Внутрипополяционная изменчивость накопления 20-гидроксиэкдизона Silene tatarica (Caryophyllaceae) // Растительные ресурсы, 2005. Т. 41, вып. 2. С. 97-101.

18. Продуктивность и накопление 20-гидроксиэкдизона в надземной части Silene tatarica (Caryophyllaceae) в природных популяциях (северо-восток европейской России) / СО. Володина, И.Ф. Чадин, В А. Мартыненко и др. // Растительные ресурсы, 2005. Т. 41, вып. 3. С. 64-69.

!

4439

#-4 139

Тираж 110 Заказ 12(06)

Информационно-издательская группа Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Володина, Светлана Олеговна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЗАДАЧИ И МЕТОДЫ БОТАНИЧЕСКОГО РЕСУР

СОВЕДЕНИЯ

1.1. Теоретические и практические аспекты ботаническо- 10 го ресурсоведения

1.2. Методология биохимических исследований лекарст- 17 венных растений

1.3. Изученность ресурсов лекарственных растений на 20 европейском северо-востоке России

1.4. Изученность мировой флоры на содержание фитоэк- 22 дистероидов

1.5. Физиологическая активность фитоэкдистероидов и 29 перспективы их использования в медицине

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

2.1. Выборочный скрининг растений на содержание эк- 32 дистероидов

2.2. Выявление местообитаний экдистероидсодержащих 34 растений и изучение внутривидовой биохимической изменчивости растений. Методика отбора образцов растений для анализа.

2.3. Определение продуктивности ценопопуляций смо- 34 левки татарской {Silene tatarica (L.) Pers.)

2.4. Культивирование растений 35 2.5 Выращивание каллусных и суспензионных культур клеток Serratula coronata

Глава 3. ВЫБОРОЧНЫЙ СКРИНИНГ РАСТЕНИЙ НА СОДЕРЖАНИЕ ЭКДИСТЕРОИДОВ

Глава 4. СОСТАВ И ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ ЭКДИ

СТЕРОИДОВ В РАСТЕНИЯХ В ЕСТЕСТВЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ И В УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (РЕСПУБЛИКА КОМИ)

4.1. Смолевка татарская (Silene tatarica (L.) Pers.)

4.1.1. Эколого-ценотическая характеристика, продуктив- 51 ность и накопление 20-гидроксиэкдизона в надземной части растений смолевки татарской {Silene tatarica) в природных популяциях (европейский северо-восток России)

4.1.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в рас- 60 тениях смолевки татарской {Silene tatarica)

4.2. Смолевка ползучая {Silene repens Patrin) 67 4.2.1. Местообитания смолевки ползучей {S. repens)

4.2.2. Состав и распределение экдистероидов в растениях смолевки ползучей (S. repens)

4.3. Смолевка обыкновенная (Obema behen (L.) Ikonn.)

4.4. Серпуха венценосная (Serratula coronata L.)

4.4.1. Местообитния серпухи венценосной {Serratula сого- 76 nata)

4.4.2. Внутривидовая биохимическая изменчивость расте- 82 ний серпухи (Serratula coronata )

4.5. Серпуха красильная {Serratula tinctoria L.)

4.5.1. Местообитания серпухи красильной {Serratula tincto- 85 ria)

4.5.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в рас- 87 тениях серпухи красильной {Serratula tinctoria)

4.6. Серпуха Гмелина {Serratula gmelinii Tausch)

4.61. Местообитания серпухи Гмелина {Serratula gmelinii)

4.6.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в растениях серпухи Гмелина {Serratula gmelinii)

4.7. Серпуха лучевая {Serratula radiata Waldst. & Kit.)

4.7.1. Местообитания серпухи лучевой {Serratula radiata)

4.7.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в рас- 97 тениях серпухи лучевой {Serratula radiata)

4.8. Серпуха пятилистная {Serratula quinquefolia Bieb. ex 98 Willd.)

4.8.1. Местообитания серпухи пятилистной {Serratula quin- 98 quefolia)

4.8.2. Состав и динамика содержания экдистероидов в рас- 103 тениях серпухи пятилистной {Serratula quinquefolia)

4.9. Экдистероиды в других видах рода Serratula

4.10. Стеммаканта серпуховидная {Stemmacantha serratu- 112 loides (Georgi) M. Dittrich)

4.10.1 Местообитания стеммаканты серпуховидной {Stemmacantha serratuloides (Georgi) M. Dittrich)

4.11 Общие замечания

Глава 5. НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕ

НИЯ ФИТОЭКДИСТЕРОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

5.1. Оценка пригодности сырья серпухи венценосной для 121 технологической переработки

5.2. Научные основы технология получения экдистерои- 123 дов из растительного сырья

5.3. Культуры растительных клеток в качестве альтерна- 138 тивного источника фитоэкдистероидов

5.3.1. Анализ длительно культивируемых каллусных культур Serratula coronata на содержание экдистероидов

5.3.2. Особенности выделения экдистероидов из клеточной 142 биомассы

Глава 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЭК-ДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩЕЙ СУБСТАНЦИИ «СЕРПИ-СТЕН»

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экдистероидсодержащие растения"

Актуальность темы. Совершенствование традиционных технологий переработки растительного сырья, разработка принципиально новых технологий «живых систем», возвращение интереса к фитотерапии и опыту народной медицины вызвали новую волну исследований растений как источников ценных биологически активных веществ. На обширной территории европейского северо-востока России, на которой расположена Республика Коми, произрастает более 1200 видов сосудистых растений, среди которых более 100 видов применяется в официальной медицине Российской Федерации (Мартыненко и др., 1994). В настоящее время большой интерес к использованию в качестве растительного сырья для получения новых адаптогенных лекарственных препаратов, тонизирующих пищевых добавок, косметических композиций представляют экдистероидсодержащие растения. С момента обнаружения экдистероидов в растениях в 60-х годах XX века - полигидрокси-лированных стеринов, структурно идентичных или близких по структуре истинным гормонам линьки членистоногих, известно уже более 150 различных по структуре соединений этого типа. (Dinan, 1998; Лафон, 1998; Фитоэкди-стероиды, 2003). Они обнаружены у представителей более 100 семейств покрытосеменных растений. Следует, однако, отметить, что лишь очень немногие виды растений, для которых характерно высокое содержание экдистероидов (до 1-3%), пригодны для практического использования в технологиях получения фитоэкдистероидов (Володин, 1999; Lafont, Dinan, 2003). В связи с этим актуальными направлениями исследований являются поиск новых растительных источников с высоким содержанием экдистероидов и разработка научных основ технологий получения экдистероидов из растительного сырья и клеточных культур.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института биологии Коми НЦ УрО РАН по теме: «Структурное многообразие и биологическая активность стероидов растений и клеточных культур» (Гос. per. N 01.2.00

107253) и была поддержана грантами Целевой программы сотрудничества ученых УрО и ДвО РАН «Сравнительное исследование экдистероидсодер-жащих растений географически удаленных флор: Урал, Дальний Восток» и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине Урала» «Разработка экдистероидсодержащих биологически активных добавок и лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний у жителей Крайнего Севера».

Целью настоящей работы является выявление экдистероидсодержащих видов растений в географически удаленных флорах, оценка возможности практического использования перспективных видов по качественным и количественным показателям состава и содержания экдистероидов у дикорастущих и культивируемых растений, разработка научных основ технологий получения экдистероидов из новых растительных источников и клеточных культур.

Задачи работы:

- выборочный скрининг растений географически удаленных флор на содержание экдистероидов, выявление местообитаний экдистероидсодержащих видов растений, эколого-ценотическая характеристика сообществ с их участием, определение продуктивности некоторых видов растений и оценка возможности заготовки экдистероидсодержащего растительного сырья в природных популяциях;

- сравнительное исследование состава и динамики содержания экдистероидов у дикорастущих и культивируемых растений некоторых представителей родов Silene (сем. Caryophyllaceae), Serratula и Stemmacantha (сем. As-teraceae);

- разработка научных основ технологии получения фитоэкдистероидов из новых растительных источников и клеточных культур;

- доклинические исследования новой экдистероидсодержащей субстанции «Серпистен», полученной из надземной части растений Serratula coronata L.

Научная новизна.

Проведен выборочный скрининг растений географически удаленных флор: европейская часть России, Урал, Северный Кавказ, Украина, Российский Дальний Восток и Китай, позволивший существенно расширить сведения о распространении экдистероидов в мировой флоре. Впервые экдисте-роиды найдены в папоротниках Athyrium sinense, Aleuritopteris argentea, Cal-lipteris esculenta и Selenodesmium obscurum. Среди покрытосеменных растений экдистероиды впервые обнаружены в четырех видах рода Serratula (As-teraceae): S. cardunculus, S. coriaceae, S. radiata и S. gmelinii; Stemmacantha serratuloides (Asteraceae); двух представителях семейства Caryophyllaceae: Si-lene jundzillii и Oberna cserei; трех представителях семейства Ranunculaceae: Helleborus caucasicum, Hepatica insularis и Clematis fusca; а также Bupleurum triradiatum (Apiaceae); Iris uniflora (Iridaceae).

Дана эколого-ценотическая характеристика сообществ с участием ресурсного экдистероидсодержащего вида растений смолевки татарской {Silene tatarica)-, определены продуктивность ценопопуляций и выход 20-гидроксиэкдизона из надземной части растений (европейский северо-восток России).

Установлено, что для десяти исследованных видов рода Serratula характерными экдистероидами являются 20Е, инокостерон, и экдизон, которые можно считать хемотаксономическими маркерами рода. Кроме них, растения различных видов и популяций содержат специфический набор других минорных экдистероидов. Впервые показано влияние эколого-географических факторов на соотношение основных и минорных экдистероидов в растениях этого рода. Впервые показано, что в условиях культуры на Севере в листьях растений S. quinquefolia доминирующим экдистероидом является инокостерон, а не 20-гидоксиэкдизон, являющийся основным экдистероидом растений в естественных местообитаниях (Северный Кавказ), что, как показано, связано с различным уровнем освещенности в естественных местообитаниях (полог леса) и при выращивании на открытых делянках.

Показана штаммовая специфичность каллусных культур клеток Ser-ratula coronata по составу и содержанию экдистероидов. Выявлен штамм CIII 1.2. - продуцент инокостерона.

Практическое значение.

Выявлен ряд практически важных видов растений с повышенным содержанием экдистероидов. В целях интродукции рекомендованы следующие виды: Chenopodium bonus-henricus - как пищевое и кормовое растение; Silene tatarica, Serratula radiate, Stemmacantha serratuloides — продуценты 20E; Ser-ratula quinquefolia - продуцент инокостерона в условиях высокой освещенности; Serratula gmelinii - продуцент структурно модифицированных экдистероидов. Для получения клеточных культур рекомендованы редкие виды растений и растения южных широтных групп: папоротник Polypodium vulgare (редкий охраняемый вид на европейском северо-востоке России) и Helleborus caucasicum (флора Северного Кавказа).

На основании сравнительных данных по динамике содержания экдистероидов в онтогенезе растений разработаны рекомендации по заготовке растительного сырья с высоким содержанием целевых веществ.

Разработаны научные основы технологии получения экдистероидов из растительного сырья и клеточных культур Serratula coronata. Получены опытные партии субстанции для организации доклинических исследований. На субстанцию «Серпистен» адаптогенного действия получен товарный знак.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены или представлены на Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2000), Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000), Международном симпозиуме «Биотехнологические подходы к использованию и сохранению растительных ресурсов» (Ялта, 2002), Международной конференции «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002), V Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2003), III Международном конгрессе по лекарственным и ароматическим растениям (Таиланд, 2003).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в соавторстве в монографии «Фитоэкдистероиды» (СПб: Наука, 2003). По материалам диссертации опубликованы 10 статей и тезисы 10 докладов на конференциях, получено 2 патента РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 194 стр., содержит 8 таблиц, 34 рисунка и 5 приложений. Состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов. Библиография включает 123 наименования (в том числе 40 на иностранных языках).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Володина, Светлана Олеговна

выводы

1. Проведен выборочный скрининг 106 видов сосудистых растений из отделов Polipodiophyta, Pinophyta и Magnoliophyta из географически удаленных флор (европейская часть России, Украина, Урал, Северный Кавказ, Западная Сибирь, Дальний Восток). Экдистероиды впервые обнаружены в папоротниках Athyrium sinense, Aleuritopteris argentea, Callipteris esculenta и Se-lenodesmium obscurum Среди покрытосеменных растений экдистероиды впервые обнаружены в четырех видах рода Serratula (Asteraceae): S. cardun-culus, S. coriaceae, S. radiata и S. gmelinii; Stemmacantha serratuloides (Asteraceae); двух представителях семейства Caryophyllaceae: Silene jundzillii и Oberna cserei; трех представителях семейства Ranunculaceae: Helleborus cau-casicum, Hepatica insularis и Clematis fusca; а также Bupleurum triradiatum (Apiaceae); Iris uniflora (Iridaceae). Полученные данные существенно расширяют сведения о распространении экдистероидов в мировой флоре.

2. Впервые дана эколого-ценотическая характеристика сообществ с участием ресурсного экдистероидсодержащего вида растений смолевки татарской (Silene tatarica)', определены продуктивность ценопопуляций и выход 20-гидроксиэкдизона из надземной части растений S. tatarica. Установлено, что с точки зрения наибольшего выхода фитоэкдистероидов наряду с данными продуктивности надземной массы наиболее значимым показателем является доля генеративных побегов смолевки татарской в ценопопуляциях.

3. Исследована внутривидовая биохимическая изменчивость растений Serratula coronata из географически удаленных популяций по содержанию экдистероидов. Показано, для растений этого вида характерными экдисте-роидами являются 20Е (мажорный компонент), инокостерон, макистерон А и экдизон не зависимо от эколого-географических условий произрастания. В отличие от растений европейских популяций у растений азиатских популяций (Западная Сибирь, Дальний Восток) инокостерон является мажорным компонентом наряду с 20Е. Экдистероидные профили культивируемых растений и растений Кожевниковской популяции (Томская область), где были собраны образцы для первичной интродукции, не отличаются друг от друга.

4. Проведены сравнительные исследования состава и распределения экдистероидов в дикорастущих и культивируемых растениях двух видов рода Silene, пяти видов рода Serratula и одного вида рода Stemmacantha (S. ser-ratuloides). Показано влияние экоголо-географических факторов на состав и содержание экдистероидов. Впервые показано изменение состава и содержания основных и минорных экдистероидов в растениях Serratula quinquefolia, произрастающих в естественных местообитаниях (Северный Кавказ) и в условиях культуры на Севере. Ряд исследованных видов рекомендован для интродукции в качестве источников 20-гидроксиэкдиона, инокостерона и других структурно модифициованых фитоэкдистероидов.

5. Разработаны научные основы технологии получения экдистероидсо-держащей субстанции адаптогенного действия «Серпистен» из надземной части растений серпухи венценосной, на которую получен товарный знак.

6. Показана штаммовая специфичность каллусных культур клеток Serratula coronata по составу и содержанию экдистероидов. Показано, что экди-стероидсодержащая фракция, полученная из клеточной биомассы серпухи венценосной (штамм GI 1.1) существенно не отличается от субстанции «Серпистен». Выявлен штамм CIII 1.2. S. coronata - продуцент инокостерона, обладающего высокой активностью гормона линьки насекомых и высокой ан-тиоксидантой и анаболической активностью у млекопитающих.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Володина, Светлана Олеговна, Сыктывкар

1. А.с. N 1146050 СССР. Способ получения р-экдизона из растения рода Serratula .// A.M. Гродзинский, Ю.Д.Холодова, И.Ф.Митунин и др.

2. А.с. N 1312774 A 1SU. МКИ3 А 61 К 35/78. Тонизирующее средство / Н.К.Абубакиров, М.Б.Султанов, В.Н.Сыров и др.; N 295016028/14; За-явл. 04.07.80; Опубл. 07.05.88. БИ № 17.

3. Абубакиров Н.К. Гормоны линьки насекомых в растениях Средней Азии // Изв.АН Каз.ССР. Сер хим., 1984. №4. С. 49-53.

4. Абубакиров Н.К. Экдистероиды цветковых растений (Angiospermae) //Химия природных соединений. 1981. № 6. С. 685-701.

5. Ануфриева Э.Н. Ростовые и биосинтетические характеристики культур клеток Serratula coronata и Ajuga reptans продуцентов экдистероидов: Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 1997. 26 с.

6. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск, 1993.241 с.

7. Ахмед I., Воз1ян П.А., Кляшторна Г.В., Мшадера К., Холодова Ю.Д. Serratula tinctoria L. i S. wolffii Andrae перспективш джерела бюлопч-но активних фггоекдистеродав // Укр. боташчний журнал, 1990. Т. 47. № 4. С. 81-84.

8. Ахрем А.А., Ковганко Н.В. Экдистероиды: Химия и биологическая активность. Минск: Наука и техника, 1989. 327 с.

9. Ахрем А.А., Левина И.С., Титов Ю.А. Экдизоны стероидные гормоны насекомых. Минск: Наука и техника, 1973. 232 с.

10. Балтаев У. А., Абубакиров Н.К., Фитоэкдистероиды из Rhaponticum carthamoides II Химия природных соединений. 1987. N 5.1. С. 681-684.

11. Балтаев У.А. Экдистерозид новый экдистероид из Silene tatarica (L.) Pers. // Тез. докл. междунар. совещ. по фитоэкдистероидам. Сыктывкар, 1996. С. 78.

12. Балтаев У.А., Горовиц М.Б., Рашкес Я.В., Абубакиров Н.К. Фито-экдизоны из Rhaponticum integrifolium. II. Интегристерон А // Химия природных соединений, 1987. № 5. С. 681 682.

13. Баньковский А.И, Зарубина М.П., Сергеева Л.Л. Исследование растений применяемых в народной медицине, на содержание алкалоидов. /Тр. ВНИИ лекарственных и ароматических растений, 1947. Т. 9. С. 119-179.

14. Блинова К.Ф., Куваев В.Б. Лекарственные растения тибетской медицины Забайкалья. //В кн.: Вопросы фармакогнозии, 1965. Вып. 3. С. 163 -178.

15. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. / Уч. пособие. М.:ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

16. Вересковский В.В., Чекалинская И.И., Пашина Г.В. Динамика содержания экдистерона у видов рода Rhaponticum Ludw.// Растительные ресурсы, 1983. Т. 19. Вып. 1. С. 60 64.

17. Володин В.В. Экдистероиды в интактных растениях и клеточных культурах: Автореф. дис. . докт. биол. наук. М., 1999. 40 с.

18. Володин В.В., Лукша В.Г., Дайнан Л. и др. Инокостерон и макистерон из Serratula coronata II Физиология растений, 1998. Т. 45. № 3. С. 378 -382.

19. Воробьева А.Н. Таксономия и фитоэкдистероиды дальневосточных видов родов Stemmacantha Cass., Serratula L. и Saussurea Dc (Asteraceaea): Автореф. дис. . канд. биол. наук. Владивосток, 2004. 23 с.

20. Высочина Г.И. Хемотаксономический метод в подборе объектов интодукции // Ускорение интродукции растений Сибири: Задачи и методы: Сб. науч. тр. Новосибирск: Наука. Сиб. Отделение, 1989. С. 56 - 60.

21. Ганиев А.Г. Содержание экдизонов в некоторых растениях родов Serratula и Rhaponticum II Растительные ресурсы, 1980. Т. 16. С. 193-198.

22. Государственная фармакопея СССР. Изд. XI. Вып. 2. М.: Медицина, 1990. 398 с.

23. Дайнан JI. Стратегия оценки роли фитоэкдистероидов как детер-рентов по отношению к беспозвоночным-фитофагам // Физиология растений, 1998. Т. 45. №3. С. 347-359.

24. Дармограй В.Н. Флавоноиды некоторых видов растений сем. гвоздичных// Химия природных соединений, 1976. №4. С. 540 541.

25. Зарембо Е. В. Таксономическое и ресурсоведческое исследование дальневосточных видов трибы CARDUEAEA (Asteraceae): Автореф. дис. . канд. биол. наук. Владивосток, 2000. 26 с.

26. Зацны И.Л., Горовиц М.Б, Абубакиров Н.К. Экдистерон из Serratula coronata II Химия природных соединений, 1970. № 6. С. 804 841.

27. Зибарева JI.H. Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyl-lace: Автореф. дис. . докт. химич. наук. Новосибирск, 2003. 31с.

28. Зибарева Л.Н., Свиридова Т.П. Динамика содержания экдистеро-на в Lychnis chalcedonica L., выращиваемом в Сибирском ботаническом саду // Растительные ресурсы, 1989. Т. 25. № 4. С. 561 564.

29. Зибарева Л.Н., Еремина В.И. Динамика содержания экдистероидов в видах рода Silene L., выращиваемых в Сибирском Ботаническом саду (г. Томск) // Растительные ресурсы, 1996. Т. 32. Вып. 1-2. С. 106-110.

30. Ильина И.В. Народная медицина Коми. Сыктывкар: Коми книжное издательство, 1997. 118 с.

31. Исмаил А. Фитоэкдистероиды серпухи невооруженной (<Serratula inermis) и их влияние на биосинтез нуклеотидов и нуклеиновых кислот в тканях цыплят с различной обеспеченностью витамином Дз: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Киев, 1993. 27 с.

32. Кашин В.И. История познания северных лекарственных растений // Изучение и охрана растительности Севера. Сыктывкар, 1984. С. 115 120.

33. Котелина Н.С., Мартыненко В.А. Целебные растения Севера. Сыктывкар: Коми книжное издательство, 1988. 112 с.

34. Красная книга Республики Коми / Под ред. А.И. Таскаева. Москва-Сыктывкар: ДИК, 1999. 528 с.

35. Куракина И.О., Булаев В.М. Экдистен тонизирующее средство в таблетках по 0,005г // Новые лекарственные препараты. М.: Союзмедин-форм, 1990. Вып. 6. С. 16 - 18.

36. Лафон Р. Фитоэкдистероиды и мировая флора: разнообразие, распределение и эволюция // Физиология растений, 1998. Т.45. Т 3. С. 326 -346.

37. Мартыненко В.А., Груздев Б.И., Котлина НС. Недревесные растительные ресурсы Республики Коми. (Научные рекомендации народному хозяйству.) // Научные доклады / Коми научный центр УрО РАН, Сыктывкар, 1994. Вып. 109. 32 с.

38. Махов А.А. Зеленая аптека. Лекарственные растения Сибири. Изд. 4-е, испр. и доп. Красноярск: Кн. Из-во, 1993. 528 с.

39. Методика определения запасов лекарственных растений. М. 1986.

40. Минаева В.Г. Теоретические и практические аспекты биохимического изучения лекарственных растений Сибири при интродукции // Ускорение интродукции растений Сибири: Задачи и методы: Сб. науч. тр. Новосибирск: Наука. Сиб. Отделение, 1989. С. 97 - 103.

41. Минаева В.Г., Киселева А.В., Волхонская Т.А. Некоторые результаты обследования растений Краснодарского края на содержание флаво-ноидов. В кн.: Перспективные полезные растения флоры Сибири. Новосибирск, 1973. С. 170- 178.

42. Мишуров В.П., Портнягина Н.В., Рубан Г.А. Интродукция серпухи венценосной на севере // Интродукция растений на Европейском Северо-Востоке. Сыктывкар, 1995. С. 91-100. (Труды Коми НЦ УрО РАН N 140).

43. Моисеев К.А., Соколов В.П., Мишуров В.П. и др. Малораспространенные силосные растения. Л.: Колос, 1979. 328 с.

44. Новосельская И.Л., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкди-стероиды Serratula coronata II Химия природных соединений. 1981. № 5. С. 668 669.

45. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro// Биология культивируемых клеток растений / Ред. Бутенко Р.Г. М.:Наука, 1991. С. 5-20.

46. Патент 2063763, Россия, МКИ3 Ф 61 К 35/78. Способ получения а- и Р -экдизонов. / В.В. Володин, В.Г. Лукша, В.В. Пунегов, Ю.А. Тюкавин; Коми научный центр УрО РАН; N 93037260/14; Заявл. 19.07.93; Опубл. 20.07.96. Б.И. N 20.

47. Патент 2153346, Россия, МКИ3 А 61 К 35/78. Способ получения экдистероидов / В.В.Володин, С.О.Володина; Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; N 99106351/14; Заявл. 29.03.99; Опубл. 27.07.2000. Б.И. N 21.

48. Популярный атлас-определитель. Дикорастущие растения. М.: Дрофа, 2002.416 с.

49. Постников Б.А. Маралий корень и основы его введения его в культуру. Новосибирск. 1995. 276 с.

50. Растительные ресурсы СССР. Т. 1. Семейства Magnoliaceae-Limoniaceae / Ред. А.А. Федоров. Л.: Наука, 1984. 460 с.

51. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав. Использование. Сем. Asteraceae / Под ред. П.Д. Соколова. Санкт-Петербург: Наука, 1993. С. 181- 183.

52. Ревина Т.А., Гуреева И.И. Содержание экдистерона в папоротниках горных районов Южной Сибири // Растительные ресурсы, 1985. Т. 21. Вып. 1.С. 75 78.

53. Ревина Т.А., Ревушкин А.С., Ракитин А.В. Экдистероидсодержа-щие виды во флоре Горного Алтая // Растительные ресурсы, 1988. Т. 24. Вып. 4. С. 565 570.

54. Саатов 3., Горовиц М.Б, Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene II Химия природных соединений, 1993. № 5. С. 627 -635.

55. Саатов 3., Горовиц М.Б. Мелибаев С. и Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода Silene IX: 22-о-бензонат экдистерона из Silene scabrifolia II Химия природных соединений, 1986. N 1. С. 77 80.

56. Саатов 3.,Усманов Б.З., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероды растений Silene praemixta I: Силеностерон // Химия природных соединений, 1979. С. 797-799.

57. Соболевская К.А., Минаева В.Г. Актуальная вопросы ботанического ресурсоведения в Сибири // Актуальные вопросы ботанического ресурсоведения в Сибири / под ред. К.А. Соболевской. Новосибирск: Наука, 1976. С.З- 11.

58. Сыров В.Н. К механизму анаболического действия фитоэкдисте-роидов в организме млекопитающих // Биол. науки, 1984. № 11. С. 16-19.

59. Тахтаджян A.JI. Система магнолиофитов. Л.: Наука, 1987. 438 с.

60. Тегисбаев Е. Т. Исследование Silene latifolia (Mill.) Rendle et Britt и ее тритерпенового гликозида силенозида: Автореф. дис. .канд. фармац. наук. Баку, 1966. 14 с.

61. Фаулер М.В. Эффективное производство различных соединений с помощью культуры клеток растений. / В кн.: Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: ВО «Агропромиздат», 1987. С. 9 42.

62. Филиппова В.Н. Получение и физиолого-биохимическая характеристика суспензионных культур Serratula coronata и Ajuga reptans: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2002. 20 с.

63. Фитоэкдистероиды / Под ред. В.В.Володина. Санкт-Петербург: Наука, 2003. 293 с.

64. Флора северо-востока европейской части СССР /Под ред. А.И. Толмачева. В 4-х томах. Д.: Наука, 1976. Т. 3. Семейства Nymphaeaceae-Hyppuridaceae. 293 с.

65. Флора Сибири. Новосибирск: Наука, 1988 -1990. Т. 1 14.

66. Флора СССР /Под ред. Боброва Е.Г и Черепанова С.К. M.-JL: Изд-во АН СССР, 1963. Т. 28. 653 с.

67. Хайдав Ц., Меньшикова Т.А. Лекарственные растения в монгольской медицине. Улан-Батор, 1978. 191 с.

68. Харборн Д. Введение в экологическую биохимию. М.: Мир, 1985. 176 с.

69. Харина Т.Г. Эколого-биологические особенности серпухи венценосной в связи с интродукцией в Западной Сибири: Автореф. дис. .канд. биол. наук. Новосибирск: ЦСБС АН СССР, 1990. 16 с.

70. Холодова Ю.Д. Фитоэкдизоны биологически активные поли-гидроксилированные стерины // Укр. биохим. журнал, 1979. Т. 51. № 5. С. 560- 575.

71. Холодова Ю.Д. Фитоэкдистероиды // Биохимия животных и человека, 1987. № 11. С. 27-41.

72. Чадин И.Ф. Экдистероидсодержащие растения европейского Северо-Востока России: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Сыктывкар, 2001. 28 с.

73. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). М.: Мир и семья, 1995. 992 с.

74. Шретер А.И. Поиски новых лекарственных растений из флоры Дальнего Востока. В кн.: Изучение и использование лекарственных растительных ресурсов СССР. М., 1964. С. 191 - 194.

75. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения: Учеб. пособие / Под ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой, 2-е изд., испр. и доп. СПб.: СпецЛит, Издательство СПХФА, 2002. 407 с.

76. Юханов Д. X., Краснов ЕА. Распределение тритерпеновых глико-зидов и флавоноидов сем. Caryophyllace. // Растительные ресурсы, 1973. Т. 9. Вып. 4. С. 540 547.

77. Якубова М.Р., Генкина Г.Л., Шакиров Т.Т. и др. Хроматографи-ческий метод определения экдистерона в растительном сырье // Химия природных соединений, 1978. № 6. С. 737 740.

78. Яцюк Я.К., Сегель Г.М. О выделении экдистерона // Химия природных соединений, 1970. N 26. С. 281.

79. Bathori М, Mathe I. Droplet countercurrent chromatography to isolate ecdysteroids from the herb Silene tatarica (L.) Pers. // Acta Pharm. Hung., 1996. Vol. 66. N3. P. 125-131.

80. Bathori M. Purification and characterization of plant ecdysteroids of Silene species // Trends in analytical chemistry, 1998. V. 17. N 6. P. 372 383.

81. Bathori M., Szendrei K., Kalasz H. and Ohmatcht R. HPLC Screening of Plant Extracts for Ecdysteroids // J. High Resol. Chromatogr. Chromatogr. Commun., 1988. N 9. P. 539 541.

82. Bergamasco R., Horn D.H.S. Distribution and role of insect hormones in plants // Invertebrate Endocrinology, Vol. 1: Endocrinology of Insects / Eds Downer R.G.H., Laufer H. New York: Alan R. Liss., 1983. P. 627 654.

83. Chong Y.K., Galbraith M.N. Horn D.N.S. Isolation jfdeofycrustexdysone and a-ecdysone from the fern Blechnum minus. II Chem. Commun., 1970. P. 1217 1218.

84. Clement C., Dinan L. Development of a bioassay for ecdysteroid-like and antiecdysteroid activities in plants // Insect chemistry ecology / Ed. Hrdy I. Academia. Prague, 1991. P. 221 226.

85. Corio-Costet M.-F., Chapuis L., Mouillet J.F., Delbecque J.P. Sterol and ecdysteroid profiles of Serratula tinctoria L.: plant and cell cultures producing steroids // Insect Biochem. Molec. Biol., 1993. V. 23. No 1. P. 175 180.

86. Dinan L. Distribution and levels of phytoecdysteroids within individual plants of species of the Chenopodiaceae // Eur. J. Entomoljgy. 1995. V. 92. P. 295 300.

87. Dinan L. The analysis of phytoecdysteroids in single (preflowering stage) specimens of fat hen, Chenopodium album // Phytochemical analysis, 1992b. V. 3.P. 132- 138.

88. Dinan L. The association of phytoecdysteroids with flowering in fat hen, Chenopodium album, and other members of the Chenopodiaceae // Experien-tia, 1992a. V. 48. P. 305 308.

89. Dinan L., Whiting P., Scott A. Taxonomic distribution of phytoecdysteroids in seeds of members of the Chenopodiaceae // Biochemical systematics and ecology, 1998. V.26. P. 553 576.

90. Gilbraith M.N., Horn D.H.S. An insect-moulting hormone from a plant // J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1966. P. 905 906.

91. Gilbraith M.N., Horn D.H.S. Insect Moulting Hormones: Crustecdy-sone (20hydroxyecdysone) from Podocarpuselatu //Australian J. Chem., 1969. Vol. 22, N5. P. 1045 1057.

92. Girault J.-P., Bathori M., Varga E., Szendrei K., Lafont R. Isolation and identiaication of new ecdysteroids from Caryophyllaceae // J. Nat. Prod., 1990. V. 53. N2. P. 627-654.

93. Hardman R., and Benjamin T.V. The Co-ocurence of ecdysones with bufadienolides and steroidal saponins in the genus Helleborus II Phytochemistry, 1976. N 15.-P. 1515-1516.

94. Hikino H., Okuyama Т., Jin H. and Takemoto T. Screening of Japanese ferns for phytoecdysones. I. // Chem. Pharm. Bull., 1973. N 21. P. 2292 -2302.

95. Imai S., Toyosato Т., Sakai M. et al. Screening results of plants for phytoecdysones // Chem. Pharm. Bull., 1969. Vol. 17. P. 335 339.

96. Jizba J., Herout V., Sorm F. Isolation of ecdysterone (crustecdysone) from Polypodium vulgare L. rhizomes // Tetrahedron, 1967. Vol. 18. P. 1689 -1691.

97. Kissmer В., Wichtl M. Ecdysone aus wurzeln und samen von Helleborus И Arten. Arch.Pharm. 1987. N 320. P. 541 546.

98. Lafont R., Dinan L. Practical uses for ecdysteroids in mammals and human: an update // Insect. Sci., 2003. 3.7. 30 p.

99. Lafont R., Bouthier A., Wilson I.D. Phytoecdysteroids: structures, occurrence, biosynthesis and possible ecological significance // Proc. Conf. Insect Chem. Ecol., Tabor 1990. Academia Prague and SPB Acad. Publ. The Hague, 1991. P. 197-214.

100. Matsuoka Т., Imai S., Sakai H., Kamada H. Studies on phytoecdysones a review of our works // Ann. Rep. Takeda Res. Lab., 1969. V. 28. P. 221 -271.

101. Nakanishi К., Koreeda M., Sasaki S., Chang M.L. and Hsu H.Y. The Structure of Ponasteron A an isect moulting hormone from the leaves of Podocar-pus nakaii Hay. // Chem. Commun. 1966. P. 915 917.

102. Ogawa S., Nishimoto N., Matsuda H. Pharmacology of ecdysones in vertebrates. In Burdette W.J. (ed).: Invertebrate endicrinilogy and hormonal heter-ophylly. Springier-Verlag, Berlin, 1974. P. 341 344.

103. Otaka Т., Okui S., Uchiyama M. Stimulation of protein synthesis in mouse lever by ecdysterone // Chem. Pharm. Bull., 1969. V. 17. P.75 81.

104. Prabhu V.K.K., Nayar K.K. Crustecdysone is without estrogenic or antiestrogenic activity in the rat // Experientia, 1974. N 30. P. 821.

105. Rudel D., Bathori M., Gharbi J., Racz I., Melis K., Szendrei K., La-font R. New ecdysteroids from Serratula tinctoria //Planta Medica,1992. V. 58. N.4. P. 357-364.

106. Russell G.B. and Fenemore P.G. Insect moulting activity of some New Zealand Gymnosperms // New Zealand J. Sci., 1970. No 13. P. 61 68.

107. Russell G.B. and Fenemore P.G. Insect moulting hormone activity in some New Zealand Ferns//New Zealand J. Sci., 1971. N 13. P. 61 68.

108. Shing K. et al. Flora Republicae Popularis Sinicae Tomus 3 (1) // Beijing: Science Press., 1990. P. 144 166 (in Chinese).

109. Slama K., Lafon R. Insect hormones ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates // Eur. J. Entomol., 1995. Vol. 92. - P. 355 - 377.

110. Takemoto Т., Ogawa S., Nishimoto N., Arihara S., Bue K. Activity of drugs and plants // Yakugaku Zasshi., 1967. Vol. 87. P. 1414 1418.

111. Takemoto Т., Okuyama Т., Jin H., Arai Т., Kawahara M., Konno Ch., Nabetani S., Hikino H. Isolation of Phytoecdysones from Japanese Ferns // Chem. Pharm. Bull. 1973. Vol. 21. P. 2336-2339.

112. Volodin V.V., Alexeeva L.I., Kolegova N.A. Further ecdysteroids from Serratula coronata L. (Asteraceae) // Biochemical systematics and ecology, 1998. V. 26. P. 459-461.

113. Wang Z. et al. Flora Republicae Popularis Sinicae Tomus 3 (2) // Beijing: Science Press., 1999. P. 476 479 (in Chinese).

114. Williams J., Scott., Ford-Lloid B. Patellaria: a new genus in the Chenopodiaceae // Feddes repertorium., 1976. V.87. P. 289 292.

115. Yao Y. CN 1165662-A. Concentrated medicine-Danshikang for removing cholelith.

116. Zibareva L. Distribution and levels of phytoecdysteroids in plants of the genus Silene during development // Arch Insect Biochem Physiol., 2000. V. 43 .№ l.P. 1-8.

117. Zibareva L. et all. Distribution of phytoecdysteroids in the Caryophyl-lace// Phytochemistry, 2003. V.64. P. 499 517.