Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экдистероиды в интактных растениях и клеточных культурах

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Володин, Владимир Витальевич

ГЛАВА 1. ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩИЕ РАСТЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРО-ВОСТОКА РОССИИ

1.1. Строение, функции, биосинтез и распространение фитоэкдистероидов (обзор литературы)

1.1.1 .Краткая характеристика экдистероидов

1.1.2. Предполагаемые биологические функции фитоэкдистероидов

1.1.3. Биосинтез фитоэкдистероидов

1.1.4. Распространение экдистероидов в растительном мире

1.2. Скрининг флоры Европейского Северо-Востока России на содержание экдистероидов

ГЛАВА 2. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ В ИНТАКТНЫХ РАСТЕНИЯХ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ

2.1. Экдистероиды Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin

2.1.1. Краткая ботаническая характеристика и ареал Rhaponticum carthamoides

2.1.2. Состав экдистероидов Rhaponticum carthamoides

2.1.3. Распределение экдистероидов в растениях Rhaponticum carthamoides

2.2. Экдистероиды Serratula coronata L.

2.2.1. Краткая ботаническая характеристика и ареал Serratula coronata

2.2.2. Состав экдистероидов Serratula coronata

2.2.2.1. Основные экдистероиды Serratula coronata

2.2.2.2. Дополнительные экдистероиды Serratula coronata

2.2.3. Распределение экдистероидов в растениях Serratula coronata

2.3. Экдистероиды Ajuga reptans L.

2.3.1. Краткая ботаническая характеристика и ареал Ajuga reptans

2.3.2. Состав экдистероидов Ajuga reptas

2.3.3. Распределение экдистероидов в растениях Ajuga reptans

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

3.1. Культуры растительных клеток как модели для изучения биосинтеза экдистероидов и объекты для биотехнологии (обзор литературы)

3.2. Физиолого-биохимическая характеристика клеточных культур Rhaponticum carthamoides

3.2.1. Получение и характеристика каллусных культур

3.2.2. Получение и характеристика суспензионных культур

3.3. Физиолого-биохимическая характеристика клеточных культур Serratula coronata

3.3.1. Получение и характеристика каллусных культур

3.3.2. Сравнительное исследование содержания экдистероидов в растениях и культурах клеток in vitro 3.4. Физиолого-биохимическая характеристика клеточных культур Ajuga reptans

3.4.1. Получение и характеристика каллусных культур

3.4.2. Сравнительное исследование содержания экдистероидов в растениях и культурах клеток in vitro

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Оптимизация оф-ВЭЖХ экдистероидов в системах элюентов, содержащих электронодонорные добавки

4.1.1. Методика оф-ВЭЖХ анализа экдистероидов

4.2. Растения

4.3. Методика радиоиммунного анализа и биотеста на культуре клеток Drosophila melanogaster

4.4. Методика выделения экдистероидов из растений и условия ВЭЖХ-анализа

4.5. Получение клеточных культур экдистероидсодержащих растений

4.6. Анализ фитостеринов

4.7. Выделение экдистероидов из клеточных культур и условия ВЭЖХ и иммуноферментного анализа

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экдистероиды в интактных растениях и клеточных культурах"

Актуальность работы. Исследование продуктов вторичного обмена растений имеет важное значение с позиций понимания их функций, а также получения биологически активных соединений из растений и клеточных культур для их практического использования в разнообразных областях человеческой деятельности. В настоящее время большой интерес для исследований представляют фитоэкдистероиды -полигдроксилированные стерины, структурно идентичные или подобные гормонам линьки и метаморфоза насекомых и обладающие анаболическим действием на млекопитающих и человека. Фитоэкдистероиды найдены у большого числа видов растений, однако, до настоящего времени их функции не изучены. Сведения об экдистероидах как регуляторах роста растений носят противоречивый характер (Slama, 1993). А предположение, что фитоэкдистероиды являются аллелохимическими токсинами или детеррентами для неадаптированных видов растительноядных беспозвоночных (Dinan, 1998), также не имеет четких экспериментальных доказательств из-за сложности изучения эволюционно сложившихся взаимоотношений между растениями и насекомыми-фитофагами. В то же время полезная информация, необходимая для понимания роли экдистероидов в жизни растений, может быть получена благодаря комплексным исследованиям фитоэкдистероидов на различных иерархических уровнях организации растительного мира: системе растений, интактном растении и популяции дедифференцированных растительных клеток.

Целью настоящей работы является исследование распространения экдистероидов среди покрытосеменных растений (на примере флоры Европейского Северо-Востока России), различий в количественном содержании экдистероидов и возможности существования между экдистероидсодержащими видами филогенетических связей, детерминированности характера распределения экдистероидов в системе целого растения биологическими особенностями видов и изменений в способности растений к синтезу экдистероидов при введении в культуру in vitro.

Задачи исследования: • провести анализ растений Европейского Северо-Востока России на содержание экдистероидов, сочетая скрининг как произвольно отбираемых видов из различных семейств, гак и видов из определенных родов и триб, в которых ожидалась высокая вероятность обнаружения экдистероидов;

• изучить состав, содержание и характер распределения экдистероидов у растении различных видов: рапонтике сафлоровидном (.Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin), серпухе венценосной (Serratula coronata L.) и живучке ползучей (Ajuga reptans L.), - и сопоставить полученные данные с биологическими особенностями изучаемых видов;

• исследовать изменения в составе и содержании экдистероидов у растений Rhaponticum carthamoides, Serratula coronata и Ajuga reptans при введении в культуру in vitro и оценить возможность биотехнологического получения экдистероидов из клеточных культур.

Научная новизна. Разработана стратегия скрининга растений на содержание экдистероидов, основанная на принципе "положительных" триб и использовании новых методических приемов тестирования растительного материала: биотеста на культурах клеток Drosophila melanogaster (в дальнейшем биотест), радиоиммунного анализа (РИА) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Впервые проведен анализ содержания экдистероидов в растениях флоры Европейского Северо-Востока России. Исследовано 297 видов, принадлежащих 195 родам и 72 семействам покрытосеменных растений.

Установлено, что виды с умеренным (более 10 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) и высоким (до 1000 и более мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) содержанием экдистероидов, выявляемые с помощью биотеста, немногочисленны (5% от общего числа исследованных видов) и принадлежат семействам, в различной степени удаленных в филогенетическом отношении друг от друга. Однако, внутри семейств экдистероидсодержащие растения встречаются группами близкородственных видов (в определенных трибах или родах). Наибольшее число экдистероидсодержащих видов обнаружено в "положительных" трибах Cardueae (сем. Asteraceae), Boragineae (сем. Boraginaceae), Lychnideae (сем. Caryophyllaceae).

Радиоиммунный анализ впервые позволил установить наличие экдистероидов ниже порога их обнаружения рецепторами клеток насекомых в биотесте (0,1-0,5 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) у большого числа видов растений (около 60% исследованных видов). Полученные данные позволяют считать биотесты на культурах клеток насекомых, в основе которых лежат гормон-рецепторные взаимодействия, в качестве критериев выявления видов, у которых содержание экдистероидов достигает уровня, необходимого для реализации функции защиты растений от фитофагов. Низкие концентрации экдистероидов, обнаруженные в молодых растущих органах большинства исследованных видов различных таксономических групп, позволяют постулировать их возможную физиологическую роль в ростовых процессах высших растений.

Установлено, что филогенетически близкие виды (ЯкаропНсит сапкатоикн и БеггашШ согопШа) отличаются по составу и содержанию основных экдистероидов, однако имеют близкий состав минорных экдистероидов, что позволяет использовать их в качестве биохимических маркеров в хемотаксономических исследованиях. В растении БеггМиШ согопаШ впервые обнаружены следовые количества макистеронов А и С, имеющих С28- и С29-типы углеродного скелета, что позволяет предположить наличие у БеггаМа согопа1а альтернативного пути биосинтеза экдистероидов через С28 и С29 стерины, а не только через холестерин, как это считалось ранее.

Показано, что характер распределения экдистероидов в интактных растениях {Ккаропйсит саПкатог/Лез, БеггаЫа согопМа и Ajuga герГат) определяется биологическими особенностями видов и, вероятно, отражает стратегию защиты жизненно важных органов растений от фитофагов.

Впервые показано, что клеточные культуры сохраняют биосинтетические способности экдистероидсодержащих растений в различной мере. В каллусных культурах, инициированных из растений с высоким и умеренным содержанием экдистероидов (БеггаМа согопШа. и Шароп^сит саНкато1(1е$) происходит резкое снижение уровня их биосинтеза. Виды с низким содержанием экдистероидов (Ajuga герХат*) при введении в культуру сохраняют или даже превосходят уровень биосинтеза, характерный для интактного растения. Впервые установлено, что в суспензионных культурах клеток ШаропНсит сапкитоШвн содержание экдистероидов сравнимо с таковым в интактных растениях, причем максимальный синтез экдистероидов соответствует экспоненциальной фазе роста клеточной культуры.

Высказана гипотеза о двойственности функций экдистероидов в растениях: защита от неадаптированных видов насекомых-фитофагов (в концентрациях выше порога обнаружения экзогенных экдистероидов рецепторами клеток насекомых) и физиологическая (в концентрациях менее 10 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) - для стимуляции ростовых процессов в растениях.

Научно-практическое значение. Разработан хемотаксономический прогноз обнаружения экдистероидсодержащих растений и выявлен ряд практически важных видов-продуцентов экдистероидов, произрастающих на территории Европейского Северо-Востока России.

Показано, что Serratula coronata может быть использована в качестве сырья для получения 20-гидроксиэкдизона (20Е) - субстанции тонизирующего препарата "Экдистен": его содержание в надземной части растения на порядок выше, чем подземных органах Rhaponticum carthamoides, в настоящее время используемых в отечественной фармацевтической промышленности. Выделенные из серпухи венценосной экдистероиды: 258-инокостерон, макистероны А и С, аюгастерон С, дакрихайнанстерон, - являются ценными биологически активными соединениями, использующимися в научных исследованиях в качестве гормонов линьки членистоногих.

Разработаны научные основы технологии и получены опытные образцы экдистероидов из надземной части Serratula coronata. Отобраны штаммы клеточных культур Rhaponticum carthamoides, Serratula coronata и Ajuga reptans с повышенным содержанием экдистероидов, перспективные для разработки биотехнологического метода их получения. Технология получения фитоэкдистероидов принята к внедрению в ЗАО "Северная биохимическая компания" (г.Сыктывкар).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 39 работ. На способы получения экдистероидов получено два патента Российской Федерации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на I и II Российских симпозиумах "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1991; Пущино, 1993); XI-XIII Ecdysone Workshop (Ческе Будеевицы, 1994; Барселона, 1996; Йена, 1998); Международном совещании по фитоэкдистероидам (Сыктывкар, 1996); Международном совещании "Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений" (Новосибирск, 1998); Международной конференции по природным соединениям и физиологически активным веществам (Новосибирск, 1998); заседании секции растительных ресурсов Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 1998) и Коми отделения Общества физиологов растений (Сыктывкар, 1998).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 175 страницах, иллюстрирована 53 рисунками и 22 таблицами. Список цитируемой литературы включает 212 наименований, в том числе 148 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Володин, Владимир Витальевич

ВЫВОДЫ

1. Разработана стратегия скрининга растений на содержание экдистероидов, основанная на систематическом принципе "положительных триб" и использовании новых методических приемов тестирования растительного материала: биотеста на культурах клеток Огояоркйа melanogaster, радиоиммунного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это позволило: а) впервые провести скрининг флоры Европейского Северо-Востока России на содержание экдистероидов (исследовано 297 видов, принадлежащих 195 родам и 72 семействам покрытосеменных растений); б) установить, что виды с умеренным (более 10 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) и высоким (до 1000 и более мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) содержанием экдистероидов, выявляемые с помощью биотеста на культурах клеток Вго$орЫ1а melanogaster, немногочисленны (5% от общего числа исследованных видов) и принадлежат семействам, в различной степени удаленных в филогенетическом отношении друг от друга. Однако, внутри семейств экдистероидсодержащие растения встречаются группами близкородственных видов (в определенных трибах или родах). Наибольшее число экдистероид со держащих видов обнаружено в "положительных" трибах Cardueae (сем. Asteraceae), Boragineae (сем. Boraginaceae), Lychnideae (сем. Caryophyllaceae); в) с помощью радиоиммунного анализа доказать наличие экдистероидов ниже порога их обнаружения рецепторами клеток насекомых в биотесте (0,1-0,5 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) у большинства видов растений (около 60% исследованных видов). Полученные данные позволяют считать биотесты на культурах клеток насекомых, в основе которых лежат гормон-рецепторные взаимодействия, в качестве критериев выявления видов, у которых содержание экдистероидов достигает уровня, необходимого для реализации функции защиты растений от фитофагов.

2. Установлено, что филогенетически близкие виды (Rhaponlicum carthamoides и Serratula coronata) отличаются по составу и содержанию основных экдистероидов, однако имеют близкий состав минорных экдистероидов, что позволяет использовать их в качестве биохимических маркеров в хемотаксономических исследованиях.

3. Впервые обнаружены следовые количества макистеронов А и С, имеющих С28- и С29-типы углеродного скелета, в растении Serratula coronata, что позволяет предполагать наличие в данном виде альтернативного пути биосинтеза экдистероидов через С28 и С29 стерины, а не только через холестерин, как это считалось ранее.

4. Показано, что характер распределения экдистероидов в системе целого растения (.Rhaponticum carthamoides, Serratula coronata и Ajuga reptans) определяется биологическими особенностями видов и отражает возможную стратегию защиты жизненно важных органов растений от фитофагов.

5. Впервые показано, что клеточные культуры сохраняют биосинтетические способности экдистероидсодержащих растений в различной мере, что диктует необходимость индивидуального подхода для оценки их использования в биотехнологических целях: а) в каллусных культурах, инициированных из растений с высоким и умеренным содержанием экдистероидов (<Serratula coronata и Rhaponticum carthamoides), происходит резкое снижение уровня их биосинтеза. Виды с низким содержанием экдистероидов (Ajuga reptans) при введении в культуру сохраняют или даже превосходят уровень биосинтеза, характерный для интактного растения; б) в каллусных культурах Serratula coronata и Ajuga reptans содержание экдистероидов выше в тех штаммах, которые были получены из растений-доноров, культивируемых in vitro, с более высоким содержанием экдистероидов; в) впервые установлено, что в суспензионных культурах клеток Rhaponticum carthamoides содержание экдистероидов сравнимо с таковым в интактных растениях, причем максимальный синтез экдистероидов соответствует экспоненциальной фазе роста клеточной культуры; 6. Высказана гипотеза о двойственности функций экдистероидов в растениях: защита от неадаптированных видов насекомых-фитофагов (в концентрациях выше порога обнаружения экдистероидов рецепторами клеток насекомых) и физиологическая (в концентрациях менее 10 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала), доминирующая в клеточных культурах, - для стимуляции ростовых процессов в растениях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследований, проведенных на различных иерархических уровнях организации растительного мира: системе растений, интактных растениях и популяциях дедифференцированных растительных клеток, - позволили приблизиться к ответам на следующие вопросы, стоящие на пути более глубокого понимания функций экдистероидов в растениях:

1. Все ли растения способны к биосинтезу экдистероидов? Скрининг флоры Европейского Северо-Востока России показал, что экдистероиды присущи большому числу видов покрытосеменных растений, причем содержание экдистероидов у растений различных видов варьирует в очень широком интервале концентраций: от предельно малых (менее 0,1 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) до необычно высоких (более 1000 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала). Среди растений выделяется небольшая группа видов с высоким содержанием экдистероидов. Эти виды принадлежат семействам, в различной степени удаленных в филогенетическом отношении друг от друга. Однако, внутри семейств экдистероидсодержащие растения встречаются группами близкородственных видов (в определенных трибах или родах). Принцип "положительных" триб не носит абсолютный характер, поскольку даже в родах обнаруживаются виды с очень низким уровнем содержания экдистероидов или вообще не содержащие эти соединения (например, большинство видов рода Centaurea в трибе Cardueae). Таким образом, филогенетические связи можно считать важным, однако, недостаточным фактором для прогнозирования наличия экдистероидов в растениях. По-видимому, должны быть дополнительные факторы, приводящие к реализации функциональной значимости экдистероидов для растений. Неожиданным оказался факт наличия низких концентраций экдистероидов (0,1-0,5 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала), определяемых с помощью РИА, в молодых органах большинства исследованных растений не зависимо от систематического положения видов. В связи с этим возникает вопрос, не разрушают ли эти данные обнаруженную нами связь между распространением экдистероидов и филогенетической классификацией? Мы полагаем, что нет. Филогенетические связи наблюдаются между видами с относительно высоким содержанием экдистероидов (выше 10 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала). Однако, именно после достижения этой концентрации начинает проявляться и физиологический (детеррентный) эффект экдистероидов на насекомых-фитофагов. Таким образом, получение положительного ответа в биотесте, основанном на гормон-рецепторных взаимодействиях в культурах клеток насекомых in vitro, может служить критерием выявления видов, у которых экдистероиды играют экорегуляторную роль.

Выполняют ли экдистероиды, находящиеся в растениях в следовых количествах (0,1-0,5 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала), экологическую функцию или, подобно брассиностероидам, необходимы для развития самих растений? На этот вопрос пока нет ответа. Однако факт обнаружения нами низких концентраций экдистероидов в молодых тканях большинства исследованных растений убедительно свидетельствует в пользу гипотезы о том, что все растения могут обладать генетически обусловленной способностью синтезировать экдистероиды, но они различаются уровнем экспрессии генов или регуляцией активности ферментов, участвующих в биосинтезе экдистероидов. В не содержащих экдистероиды видах может происходить неполное подавление биосинтеза экдистероидов, что, например, было показано на примере растения Zea mays, в котором были обнаружены следы фосфатов экдистероидов (Adler & Grebenok, 1995). Если далее предположить возможность мутаций, затрагивающих регуляторный механизм биосинтеза экдистероидов, то в популяциях не содержащих экдистероиды видов могут появиться растения, содержащие заметные количества экдистероидов. Можно также предположить, что биосинтез экдистероидов является индуцибельным процессом, который происходит в молодых тканях растений. Если это предположение окажется верным, то биосинтез экдистероидов окажется возможным индуцировать искусственно даже у не экдистероидсодержащих видов, а значит, откроется возможность получения новых форм сельскохозяйственных растений, содержащих экдистероиды, и устойчивых к атаке насекомых, а также получения клеточных культур - суперпродуцентов экдистероидов не путем встраивания в растения генов, кодирующих ферменты биосинтеза экдистероидов, а путем активации регуляторных генов, участвующих в этом процессе.

2. В чем биологический смысл состава и распределения экдистероидов в растениях?

Основным экдистероидом растений является 20-гидроксиэкдизон. Наряду с ним в экдистероидсодержащих растениях могут присутствовать еще один или два основных экдистероида, содержащихся в повышенных количествах. Основные экдистероиды биогенетически связаны с 20-гидроксиэкдизоном и разделены между собой не более, чем одной биохимической стадией. При проведении скрининга растений на присутствие экдистероидов, поиск, как правило, сводится к выявлению основных экдистероидов: 20-гидроксиэкдизона, понастерона А, полиподина В, инокостерона и др. Однако именно широкая распространенность этих соединений не позволяет использовать их в качестве биохимических маркеров в хемотаксономических исследованиях. Вместе с тем в растениях содержится набор минорных экдистероидов, сопутствующих основным в следовых количествах. Исследование состава экдистероидов у филогенетически близких видов: рапонтике сафлоровидном и серпухе венценосной (оба вида входят в подтрибу СеЩаигетае сем. /\steraceae), впервые показало, что для обоих видов характерны одни и те же минорные экдистероиды - макистероны А и С, аюгастерон С и дакрихайнанстерон. По всей видимости еще преждевременно делать заключение о хемотаксономическом значении минорных экдистероидов как маркеров видов, родов или триб. Однако выявление одних и тех же минорных экдистероидов в филогенетически близких видах, открывает перспективу использования экдистероидов в хемотаксономических исследованиях.

Нами впервые показано, что в серпухе венценосной наряду с экдистероидами С27-типа углеродного скелета (20-гидроксиэкдизон, инокостерон и экдизон) содержатся экдистероиды других типов - С28 (макистерон А) и С29 (макистерон С). Их наличие свидетельствует о том, что параллельно главному пути биосинтеза экдистероидов, исходя из холестерина - основного метаболического предшественника, в растениях Serratula coronata существует альтернативный путь биосинтеза, в котором в качестве предшественников используются стерины, имеющие в составе молекул 28 и 29 углеродных атомов. Этот путь не является доминирующим, поскольку продукты биосинтеза присутствуют в пороговых для обнаружения концентрациях. Сделанное предположение справедливо и в отношении рапонтика сафлоровидного, так же содержащего макистероны А и С. Таким образом, состав экдистероидов может свидетельствовать о близости путей их биосинтеза в филогенетически близких видах.

Знание состава экдистероидов у растений составляет основу для установления связей между структурой и биологической активностью этих соединений, а значит, и понимания роли экдистероидов в жизни растений. В этой связи значительный интерес представляет высказанная недавно идея (Alison, Dinan et.al., 1997) о том, что минорные экдистероиды появляются у современных растений в результате эволюции, будучи более активными по отношению к насекомым, чем основные экдистероиды, которые перестают служить защитой от адаптированных форм фитофагов. Можно предположить, что благодаря мутациям в отдаленном будущем возникнут растения с высоким уровнем биологически более активных экдистероидов, которые раньше присутствовали в растениях в качестве минорных экдистероидов, сопутствующих основным в следовых количествах. Например, у современных представителей высших растений очень редко встречается экдизон, являющийся биологически менее активным экдистероидом. По нашим данным в серпухе венценосной 20-гидроксиэкдизон, как более активный экдистероид, действительно значительно доминирует по отношению к экдизону. А при исследовании антифидантной активности фитоэкдистероидов для тли Shizaphis graminum было показано (Kubo & Klocke, 1983), что выделенный из растения Ajuga remota аюгастерон С, который нами обнаружен в качестве минорного экдистероида и в серпухе венценосной, в 10 раз более эффективен в качестве антифиданта по сравнению с 20-гидроксиэкдизоном. В растениях серпухи венценосной, кроме аюгастерона С, нами впервые обнаружены и другие минорные экдистероиды, биологическую активность и роль которых еще только предстоит выяснить. О значении последних для растений этого вида, косвенно свидетельствует факт их повышенного накопления в цветочных корзинках растений.

Нами установлено, что у многолетних травянистых растений: ШаропИсит сагЖато1с1ез, БеггаНйа согопШа и А]ща гер1ат, - повышенное содержание экдистероидов обнаружено в молодых активно функционирующих листьях и соцветиях. Большое количество экдистероидов содержится в семенах, а в период покоя - в запасающих органах (у ЯкаропНсит саг11што1с1е$ и Неггаш1а согопМа - в подземных органах, у А]ща герЮт - в зимне-зеленых листьях). Однако, в характере распределения экдистероидов у растений различных видов имеются и существенные отличия. У рапонтика сафлоровидного вегетативные и генеративный побеги сосуществуют во времени, генеративный побег имеет единственное соцветие. В генеративном побеге высокое содержание экдистероидов обнаруживается в верхних (как самых молодых) листьях до момента цветения, после чего сразу начинается отток экдистероидов в генеративные органы и корневище. В вегетативных побегах высокое содержание экдистероидов сохраняется в молодых, постоянно формирующихся листьях в течение всего вегетационного периода. Наибольшее влияние на экдистероидный профиль серпухи венценосной оказывает образование у генеративного побега побегов второго порядка. Неодновременность перехода к цветению главного и боковых побегов растения, обуславливает, в отличие от рапонтика сафлоровидного, дискретные значения концентрации экдистероидов в листьях генеративного побега в соответствии с их расположением на стебле. В то время как концентрация экдистероидов в верхних листьях главного побега резко падает (как и у рапонтика сафлоровидного), в листьях центральных метамеров, дающих начало побегам второго порядка, сохраняется высокое содержание экдистероидов. Образование наземных плагиотропных побегов и наличие зимне-зеленых листьев определяет специфику экдйстероидного профиля живучки ползучей. На примере живучки ползучей, для которой характерно как семенное, так и вегетативное размножение, нами впервые показано, что изменение стратегии размножения под влиянием экологических условий произрастания, также влияет и на характер распределения экдистероидов. Содержание экдистероидов выше в тех органах, которые в данных экологических условиях ответственны за сохранение вида. Таким образом, характер распределения экдистероидов в системе целого растения связан не положением вида в системе растений, а определяется его биологическими особенностями.

3. Двойственность функций экдистероидов в растениях in vivo и in vitrei

Нами проведено сравнительное исследование образования экдистероидов в клеточных культурах растений трех видов: Rhaponticum carthamoides, Serratula coronata и Ajuga reptans. Было установлено, что каллусные культуры Rhaponticum carthamoides, полученные из различных органов растений, не способны к биосинтезу экдистероидов или синтезируют их в следовых количествах. Никакими значимыми факторами: фитогормонами, элементами углеводного или минерального питания, - не удалось поднять уровень синтеза экдистероидов в каллусных культурах растений этого вида. В клеточных культурах Rhaponticum carthamoides уровень биосинтеза экдистероидов удалось поднять до уровня интактного растения лишь при переходе к глубинному культивированию клеток. Важным фактом является установление соответствия максимального синтеза экдистероидов экспоненциальной фазе роста суспензионных культур. Серпуха венценосная является суперпродуцентом экдистероидов. Их содержание в молодых развивающихся частях растений достигает двух и более процентов. Имея сходный состав и характер распределения экдистероидов, растения Rhaponticum carthamoides накапливают экдистероиды примерно на порядок меньше, чем Serratula coronata. Проведенные исследования показали, что каллусные культуры Serratula coronata, в отличие от Rhaponticum carthamoides, сохраняют способность к биосинтезу экдистероидов, хотя и наблюдается значительное снижение их концентрации в каллусах по сравнению с интактным растением (в среднем в пять раз). Растения Ajuga reptans характеризуются низким содержанием экдистероидов. Однако, в отличие от каллусных культур Rhaponticum carthamoides, не способных к биосинтезу значимых количеств экдистероидов, были получены штаммы каллусных культур Ajuga reptans, которые превышали по содержанию экдистероидов растения, культивируемые in vitro, и дикорастущие растения. Таким образом, нами впервые показано, что клеточные культуры сохраняют биосинтетические способности экдистероидсодержащих растений в различной мере. В каллусных культурах, инициированных из растений с высоким и умеренным содержанием экдистероидов (>Serratula coronata и Rhaponticum carthamoides) происходит резкое снижение уровня их биосинтеза. Виды с низким содержанием экдистероидов {Ajuga reptans) при введении в культуру сохраняют или даже превосходят уровень биосинтеза, характерный для интактного растения. Полученные данные имеют важное значение для более полного понимания функций экдистероидов в растениях. Если предполагать, что у видов с высоким и умеренным содержанием экдистероидов последние играют роль токсинов или детеррентов по отношению к насекомым-фитофагам, тогда подавление синтеза экдистероидов, которое происходит в культурах дедифференцированных клеток, можно объяснить тем, что в популяции клеток в отсутствии организменного контроля исчезает потребность в этих соединениях, как экорегуляторах.

Таким образом, исследования экдистероидов, проведенные на различных уровнях организации растительного мира позволяют сформулировать гипотезу о двойственности функций экдистероидов в растениях: защита от неадаптированных видов насекомых-фитофагов (в концентрациях выше порога обнаружения экзогенных экдистероидов рецепторами клеток насекомых) и физиологическая (в концентрациях менее 10 мкг экдизон эквивалент/г растительного материала) - для стимуляции ростовых процессов в растениях. В будущем необходимо провести дополнительные сравнительные исследования механизмов действия брассиностероидов и малых доз экдистероидов на ростовые процессы в интактных растениях и клеточных культурах.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Володин, Владимир Витальевич, Москва

1. Абубакиров Н.К. Экдизоны гормоны насекомых. Химия и жизнь. 1975. N 11. С.57-62.

2. Абубакиров Н.К. Экдистероиды цветковых растений (Angiospermae) // Химия природных соединений. 1981. № 6. С. 685-701.

3. Ахмед I., Воз1ян П.А., Кляшторна Г.В., Мшадера К., Холодова Ю.Д. Serratula tinctoria L. i S. wolffii Andrae перспективы джерела бюлопчно активних ф1тоекдистеродав // Укр. боташчний журнал. 1990. Т. 47. № 4. С. 81-84.

4. Ахрем A.A., Левина И.С., Титов Ю.А. Экдизоны стероидные гормоны насекомых. Минск: Наука и техника, 1973. 232 С.

5. Ахрем A.A., Ковганко Н.В. Экдистероиды: Химия и биологическая активность. Минск: Наука и техника, 1989. 327 С.

6. Балтаев У.А., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды из Rhaponticum carthamoides II Химия природных соединений. 1987. No 5. С. 681-684.

7. Балтаев У.А., Горовиц M.Б., Рашкес Я.В., Абубакиров Н.К. Фитоэкдизоны из Rhaponticum integrifolium. II. Иитегристерон А // Химия природных соединений. 1987. № 5. С. 681- 682.

8. Барбье М. Введение в химическую экологию. М.: Мир, 1978. 232 с.

9. Вересковский В.В., Чекалинская И.И., Пашина Г.В. Динамика содержания экдистерона у видов рода Rhaponticum Ludw.// Раст. ресурсы. 1983. Т. 19. Вып. 1. С. 6064.

10. В.В.Володин., В.Г.Лукша, В.В.Пунегов, Ю.А.Тюкавин. Способ получения а- и ß -экдизонов. Патент 2063763, Россия, МКИЗ Ф 61 К 35/78. // Коми научный центр УрО РАН; N 93037260/14; Заявл. 19.07.93; Опубл. 20.07.96. Б.И. N 20.

11. Володин В.В., Мишуров В.П., Колегова H.A., Тюкавин Ю.А., Портнягина Н.В., Постников Б.А. Экдистероиды растений семейства Asteraceae // Научные доклады / Коми научный центр УрО РАН. Сыктывкар, 1993. Вып. 319. 20 с.

12. Володин В.В., Чадин И.Ч. Принцип "положительных триб" для скрининга растений на содержание экдистероидов // Международное совещание по фитоэкдистероидам. Программа и тезисы. Сыктывкар, 1996. С. 34-35.

13. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. / А.Хеншен. М., Мир, 1988. 687 С.

14. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1990. - 243 С.

15. Ганиев А.Г. Содержание экдизонов в некоторых растениях р.Serratula и Rhaponticum II Растительные ресурсы. 1980. Т. 16. С. 193-198.

16. Головко Т.К., Гармаш Е.В., Куренкова C.B. и др. Рапонтик сафроловидный в культуре на Европейском Северо-Востоке (эколого-физиологические исследования). Сыктывкар. Коми НЦ УрО РАН, 1996. 140 С.

17. Горовиц М.Б., Зацны И.Л., Абубакиров Н.К. Экдизоны в растительном мире // Раст. ресурсы. 1974. Т. 10. Вып. 2. С. 261-274.

18. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М: Наука. 1981. С. 37-50.

19. Зибарева Jl.H. Фитоэкдистероиды и другие химические компоненты растений рода Lychnis L.: Автореф. дис. .канд. биол. наук. Новосибирск, 1991.

20. Зибарева Л.Н., Балтаев У.А., Свиридова Т.П., Саатов 3., Абубакиров Н.К. Виды рода Lychnis L. перспективные источники экдистероидов // Раст. ресурсы. 1995. Т. 31. Вып. 4. С. 1-9.

21. Зибарева Л.Н., Еремина В.И. Динамика содержания экдистероидов в видах рода Silene L., выращиваемых в Сибирском Ботаническом саду (г. Томск) // Раст. ресурсы. 1996. Т. 32. Вып. 1-2. С. 106-110.

22. Карнучук P.A., Бенсон H.A., Трофимова H.A., Двинянинова И.Б. Клеточная культура серпухи венценосной как перспективные продуцент фитоэкдистероидов // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений / Ред. Бутенко Р.Г. М.: Наука, 1991. С. 39-41.

23. Комарова Т.А. Соотношение внутрипочечных и внепочечных фаз в развитии побега Ajuga reptans L. (Lamiaceae) // Бюлл. МОИП, отдел биологич. 1986. Т. 91. Вып. 4. С. 46-56.

24. Краснов Е.А., Саратиков A.C., Якунина Г.Д. Действующие вещества левзеи сафлоровидной // Изв. Сиб. отд. АН СССР. 1977. № 1, С.93-96.

25. Кузовкина И.Н. Культивирование генетически трансформированных корней растений: возможности и перспективы использования в физиологии растений // Физиология растений. 1992. Т. 39. Вып. 6. С. 1208-1214.

26. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам / О.Микеш. М.,Мир, 1982. Т.1. С.28-29.

27. Лащенкова А.Н. Сем. Caryophyllaceae // Флора Северо-Востока европейской части СССР. Л., 1976. Т. 13. С. 196-242.

28. Лафон Р. Фитоэкдистероиды и мировая флора: разнообразие, распределение и эволюция // Физиология растений. 1998. Т.45. Т 3. С.326-346.

29. Лев C.B., Закирова Р.П., Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Экдистероиды культуры тканей и клеток Ajuga turkestanica II Химия природных соединений. 1990. № 1. С. 51-52.

30. Лесные травянистые растения. М., Агропромиздат. 1988. С. 71-81.

31. Мартыненко В. А. Систематическая и географическая структура флоры Европейского Северо-Востока России // Международное совещание по фитоэкдистероидам. Программа и тезисы. Сыктывкар, 1996. С.30-31.

32. Мишуров В.П., Портнягина Н.В., Рубан Г.А. Интродукция серпухи венценосной на севере // Интродукция растений на Европейском Северо-Востоке. Сыктывкар, 1995. С. 91-100. (Труды Коми НЦ УрО РАН N 140).

33. Моисеев К.А., Соколов В.П., Мишуров В.П. и др. Малораспространенные силосные растения. JL: Колос, 1979. 328 С.

34. Некратова H.A., Некратов Н.Ф., Михайлова С.И., Серых Г.И. Лекарственные растения Кузнецкого Алатау. Ресурсы и биология,-Томск, 1991.С. 126-143.

35. Некратова H.A. Изучение ценокомплексов дикорастущих сырьевых растений как одна из задач ботанического ресурсоведения (на примере Rhaponticum carthamoides (Wild. Ilijny/Растит.ресурсы. 1992. Т.28. № 2. C.l-13.

36. Новосельская И.Л., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды Serratula coronata // Химия природных соединений. 1981. № 5. С. 668-669.

37. Носов A.M. Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной как основа биотехнологии получения фуростаноловых гликозидов: Автореф. дис. . докт. биол. наук. М.: НИПКИ прикладной биохимии, 1992. 43 с.

38. Положий A.B., Суров Ю.П. Ареалы, фитоценотическая приуроченность и прогноз запасов левзеи сафлоровидной и родиолы розовой в Южной Сибири // Ресурсы дикорастущих лекарственных растений СССР. М., 1972. Вып.2. С.113.

39. Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Кожанова Н.И., Буров В.Н. A.c. N 1126600 (СССР). Опубл. в Б.И. N 44. 1984

40. Препаративная жидкостная хроматография / Ред. Б.Бидлингмейер. М. Мир, 1990.360 С.

41. Ревина Т.А., Гуреева И.И. Содержание экдистерона в папоротниках горных районов Южной Сибири //Раст. ресурсы. 1985. Т. 21. Вып. 1. С. 75-78.

42. Ревина Т.А., Ревушкин A.C., Ракитин A.B. Экдистероидсодержащие виды во флоре Горного Алтая // Раст. ресурсы. 1988. Т. 24. Вып. 4. С. 565-570.

43. Саад М.Л. Серпуха венценосная (БеггаШШ согопШа Ь.) как перспективный источник фитоэкдистероидов: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Киев: Институт биохимии АН Украины, 1993. 25 с.

44. Саатов 3.,Усманов Б.З., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероды растений БИепе ргает1х1а I: Силеностерон // Химия природных соединений. 1979. С.797-799.

45. Саатов 3., Горовиц М.Б. Мелибаев -С. и Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода БПепе IX: 22-о-бензонат экдистерона из БПепе зсаЪп/оИа II Химия природных соединений. 1986. N1.0. 77-80.

46. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода 571епе II Химия природных соединений. 1993. № 5. С. 627-635.

47. Саатов 3., Сыров В.Н., Маматханов А.У., Абубакиров Н.К. Фитоэкдистероиды растений рода А}ща и их биологическая активность // Химия природных соединений. 1994. №2. С. 152-160.

48. Сахарова Н.А. Онтогенез маральего корня // Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока: Тез. докл. Всесоюз. конф.Новосибирск, 1983. С.61-63.

49. Схунмакерс П. Оптимизация селективности в хроматографии. М.: Мир, 1989.

50. Тахтаджян А.Л. Система магнолиофитов. Л.: Наука, -1997. 438 с.

51. Тетерюк Л.К. Особенности онтогенеза, демографии и жизненной стратегии живучки ползучей (А;ща ге/Мат) на северной границе ареала. Сыктывкар, 1996. № 149. С. 120-127. (Труды Коми научного центра УрО РАН ).

52. Тимофеев Н.П., Володин В.В., Фролов Ю.М. Распределение 20-гидроксиэкдизона в структуре биомассы надземной части Rhaponticum carthamoid.es (Willd.) Iljin в условиях агроценоза (Республика Коми) // Растительные ресурсы. 1998. Т.34. Вып.З. Стр.63-69.

53. Усманов Б.З., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдизоны Ajuga turkestanica: III. Структура туркестерона//Химия природных соединений. 1975. С.466-470.

54. Флора Северо-Востока Европейской части СССР. Том IV. Семейства Umbelliferae-Compositae. J1: Наука, 1977. С. 82.

55. Фролов Ю.М. Окопник в условиях Севера. JL, 1982. 152 С.

56. Харборн Д. Введение в экологическую биохимию. М.: Мир, 1985. 176 С.

57. Харина Т.Г. Эколого-биологические особенности серпухи венценосной в связи с интродукцией в Западной Сибири: Автореф. дис. .канд. биол. наук. Новосибирск: ЦСБС АН СССР, 1990. 16 с.

58. Холодова Ю.Д. Фитоэкдизоны биологически активные полигидроксилированные стерины // Укр. биохим. журнал. 1979. Т. 51. № 5. С. 560-575.

59. Холодова Ю.Д. Фитоэкдистероиды // Биохимия животных и человека. 1987. №11. С. 27-41.

60. Яцюк Я.К., Сегель Г.М. О выделении экдистерона // Химия природных соединений 1970. N 26. С.281.

61. Adler J. and Grebenok R. Biosynthesis and distribution of insect-moulting hormone in plants: a review//Lipids. 1995. V. 30. P. 257-262.

62. Alison В., Witing P., Sarker S., Dinan L., Underwood E., Sik V., Rees H. 20-Hydroxyecdysone 2-p-D-Glukopyranoside from the Seeds of Xerophyllum tenax II Biochemical Systematics and Ecology. 1997. V. 25. No 3. P.255-261.

63. Ashburner M. Induction of puffs on politene chromosomes of in vitro cultured salivary glands of Drosophila melanodaster by ecdysone and ecdysone analogues // Nature New Biol. 1971. V. 230. P.222-223.

64. Banerji A., Chintalwar G.J., Joshi N.K. and Chadha M.S. Isolation of Ecdysterone from Indian Plants // Phytochemistry. 1971. No 10. P.2225-2226.

65. Bathori M., Szendrei K., Kalasz H. and Ohmatcht R. HPLC Screening of Plant Extracts for Ecdysteroids // J. High Resol. Chromatogr. Chromatogr. Commun. 1988. No 9. P.539-541.

66. Bergamasco R., Horn D.H.S. The biological activities of ecdysteroids and ecdysteroid analogues // Progress in ecdysone recearch / Ed. Hoffman J. Elsevier. Amsterdam, 1980. P.299-324.

67. Bergamasco R., Horn D.H.S. Distribution and role of insect hormones in plants // Invertebrate Endocrinology, Vol. 1: Endocrinology of Insects / Eds Downer R.G.H., Laufer H. New York: Alan R. Liss. 1983. P. 627-654.

68. Butenandt A. and Karlson P. Uber die isoilerung eines metamorphose-hormone der insecten in kristallisierter form // Z. Naturforsch. 1954. V. 9b. P.389-391.

69. Calcagno M.-Pia, Camps F., Coll J., Meie E., Sanchez-Baeza F. New ecdysteroids from roots ofAjuga reptans varieties // Tetrahedron. 1996. V. 52. No 30. P. 10137-10146.

70. Camps F., Coll J., Cortel A., Molins E., Miravitlles C. 2-acetyl- and 3-acetyl-29-norcyasterone, new minor phytoecdysteroids from Ajuga reptans (Labiatae) // J. Chemical Research (S). 1985. P.14-15.

71. Camps F., Claveria E., Coll J., Marco M.-P., Messeguer J., Meie E. Ecdysteroid production in tissue cultures of Polypodium vulgare II Phytochemistry. 1990. V. 29. No 12. P. 3819-3821.

72. Camps F., Coll J., Marco M.-P., Tomas J. Efficient detrmination of phytoecdysteroids from Ajuga species and Polypodium vulgare by high-performance liquid chromatography // J. Chromatography. 1990. - V. 514. - P. 199-207.

73. Camps F. Plant ecdysteroids and their interaction with instects // Ecological Chemistry and biochemistry of plant terpenoids / Eds. Harborn J.B., Tomas-Barberan F.A. Oxford: Claredon Press. 1991. P.331-376.

74. Camps F., Coll J. Insect allelochemicals from Ajuga plants // Phytochemistry. 1993. V. 32. No 6. P. 1361-1370.

75. Canonica L., Danieli B. and Weitsz-Vincze I. Structure of muristerone A, a new phytoecdysone// Cem. Commun. 1972. P. 1060-1061.

76. Carlisle D.B., Osborne D.J., Ellis P.I., Moorhouse J.E. Reciprocal effects of insect and plant-growth substances //Nature. 1963. V. 200. No 4912. P. 1230.

77. Chou W.S., Lu H.S. Growth regulation and silk production in Bombyx mori L. from phytogenous ecdysteroids // Progress in Ecdysone Research / Ed. Hofman J.A. Amsterdam: Elsevier/North Holland, 1980. P. 281-297.

78. Coll J., Reixach N., Sanchez-Baeza F., Casa J., Camps F. New ecdysteroids from Polypodium vulgare II Tetrahedron. 1994. V. 50. No 24. P. 7247-7252.

79. Corio-Costet M.-F., Chapuis L., Mouillet J.F., Delbecque J.P. Sterol and ecdysteroid profiles of Serratula tinctoria L.: plant and cell cultures producing steroids // Insect Biochem. Molec. Biol. 1993a. V. 23. No 1. P. 175-180.

80. Corio-Costet M.-F., Chapuis L., Scalla R., Delbecque J.-P. Analysis of sterols in plants and cell cultures producing ecdysteroids: I. Chenopodium album II Plant Science. 1993b. V. 91. P. 23-33.

81. Clement C., Dinan L. Development of an bioassay for ecdysteroid-like and antiecdysteroid activities in plants // Insect chemistry ecology / Ed. Hrdy I. Academia. Prague, 1991. P.221-226.

82. Cymborowsky B. Bioassays for ecdysteroids // Ecdysone. From chemistry to Mode of action / Ed. Koolman J. Stuttgart: New York: Thieme Med. Publ., 1989. P. 144-149.

83. De Souza N.J., Ghisalberti E.L., Rees H.H., Goodwin T.W. Studies on insect moulting hormones: biosynthesis of ponasterone A and ecdysterone from 2-14C.-mevalonate in Taxus baccata II Biochem. J. 1969. V. 114.P. 895-896.

84. De Souza N.J., Ghisalberti E.L., Rees H.H., Goodwin T.W. Studies on insect moulting hormones: biosynthesis of ecdysone, ecdysterone and 5-hydroxyecdysone in Polypodium vulgare 11 Phytochemistry. 1970. V. 9. P. 1247-1252.

85. Delbecque J.-P., Beydon P., Chapuis L., Corio-Costet M.-F. In vitro incorporation of radiolabeled cholesterol and mevalonic acid into ecdysteroids by hairy root cultures of a plant, Serratula tinctoria // Eur. J. Entomology. 1995. V. 92. P. 301-307.

86. Devarenne T.-P., Sen-Michael B., Adler H. Biosythesis of Ecdysteroids in Zea mays // Phytochemistry. 1995. V. 40. No 4. P. 1125-1131.

87. Djerassi C., Knight J. and Brockman // Neue Sterine aus dem kaktus Wilcoxia viperina. Chem.Ber. 1964. V.97. P.3118-3130.

88. Dinan L. The association of phytoecdysteroids with flowering in fat hen, Chenopodium album, and other members of the Chenopodiaceae // Experientia. 1992a. V. 48. P. 305-308.

89. Dinan L. The analysis of phytoecdysteroids in single (preflowering stage) specimens of fat hen, Chenopodium album // Phytochemical analysis. 1992b. V. 3. P. 132-138.

90. Dinan L. Phytoecdysteroids in Kochia scoparia (burning bush) // J. of chromatography A. 1994. V. 658. P. 69-76.

91. Dinan L. Distribution and levels of phytoecdysteroids within individual plants of species of the Chenopodiaceae // Eur. J. Entomoljgy. 1995a. V. 92. P. 295-300.

92. Dinan L. A Strategy for the identification of ecdysteroid receptor agonists and antagonists from plants // Eur. J. Entomol. 1995b. V.92. P. 271-283.

93. Dinan L., Whiting P., Scott A. Taxonomic distribution of phytoecdysteroids in seeds of members of the chenopodiaceae // Biochemical systematics and ecology. 1998a. V.26. P.553-576.

94. Dinan L. A strategy towards the elucidation of the contribution made by phytoecdysteroids to the deterrence of invertebrate predators on plants // Russian J. Plant Physiology. 1998b. V. 45. N 3. P.347-359.

95. Dreier S.I., Towers G.H.N. Activity of ecdysterone in selected plant growth bioassays // J. Plant Physiology. 1988. V. 132. P. 509-512.

96. Felippe G.M. Insect growth hormones and their effects on some plants // Ciencia e Culture. 1980. V. 32. P. 1384-1390.

97. Fukuzawa A., Kumagai Y., Masamune T., Furuzaki A., Katayama C., Matsumoto T. Acetyl-pinnasterol and pinnasterol, ecdysone-like metabolites from the marine red algae Laurenciapinnata II Tetrahedron Lett. 1981. Vol. 22. P. 4085-4086.

98. Galbraith M.N., Horn D.H.S. An insect-moulting hormone from a plant // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1966. P. 905-906.

99. Girault J.-P., Lafont R., Varga E., Hajudu Zs., Herke I. Ecdysteroides from Rhaponticum carthamoides (Will.) Iljin. // Phytochem. 1988. V. 27. P.737-741.

100. Girault J.-P., Bathori M., Varga E., Szendrei K., Lafont R. Isolation and identiaication of new ecdysteroids from Caryophyllaceae // J. Nat. Prod. 1990. V. 53. N 2. P. 627-654.

101. Grebenok R., Adler J.H. Ecdysteroid distribution during development of spinach // Phytochemistry. 1991a. V. 30. no 9. P. 2905-2910.

102. Grebenok R.J., Ripa P.V., Adler J.H. Occurrence and levels of ecdysteroids in spinach // Lipids. 1991b. V. 26. No 8. P. 666-668.

103. Grebenok R.J., Venkatachari S., Adler J.H. Biosynthesis of ecdysone and ecdysone phosphates in spinach // Phytochemistry. 1994. V. 36. P. 1399-1408.

104. Grebenok R.J., Galbraith D.W., Benveniste I., Feyereisen R. Ecdysone 20-monooxygenase, a cytochrome P450 enzyme from spinach, Spinacia oleracea II Phytochemistry. 1996. V. 42. No 4. P. 927-933.

105. Hardman R., and Benjamin T.V. The Co-ocurence of ecdysones with bufadienolides and steroidal saponins in the genus Helleborus //Phytochemistry. 1976. N 15.-P. 1515-1516.

106. Hardman R., and Benjamin T.V. Quantitative determination of phytoecdysones as illustrated by application to species of Helleborus II J. Chromatogr. 1977. P. 468-470.

107. Hardman R. Recent developments in our knowledge of steroids // Planta Medica. 1987. V. 53. No 3. P. 233-238.

108. Hendrix S.D., Jones R.L. The activity of p-ecdysone in four gibberellin bioassays // Plant Physiology. 1972. V. 50. No 1. P. 199-200.

109. Hendrix S.D. Amer. Nat. 1980. V.115. P.171-196.

110. Hikino H., and Hikino Y. Arthropod Molting Hormones // Prog. Chem. Org. Natural Prod. 1970a. N28. P. 257-312.

111. Hikino H., Kohama T., Takemoto T. Biosynthesis of ponasterone A and ecdysterone from cholesterol in Podocarpus macrophyllus II Phytochemistry. 1970b. V. 9. P. 367-369.

112. Hikino H., Jin H., Takemoto T. Occurrence of insect-moulting substances ecdysterone and inokosterone in callus tissues of Achyranthes II Chem. Pharm. Bull. 1971. V. 19. No 2. P. 438-439.

113. Hikino H., Okuyama T., Jin H. and Takemoto T. Screening of Japanese ferns for phytoecdysones. I. // Chem. Pharm. Bull. 1973. N 21. P.2292-2302.

114. Hikino H., Takemoto T. Ecdysones of plant origin // Invertebrate endocrinology and hormonal heterophylly /Ed. Burdette W.J. New York: Springer-Verlag, 1974. P. 185-203.

115. Hirn M.N., Delaage M.A. Radioimmunological Approaches to the quantification of ecdysteroids // Progress in Ecdysone Research. / Ed. Hoffmann J.A. Amsterdam: Elsevier-N-Holl. Biomed. Press, 1980. P. 69-82.

116. Horn D. The ecdysones // Naturally occuring inseticides / Eds. Jacobson M., Crosby D. New York: Mercel Dekker,1971. Ch.9 P.333-459.

117. Jacobs W.P., Suthers H.B. The culture of apical buds of Xanthium and their use as a bioassay for flowering activity of ecdysterone // Am. J. Botany. 1971. V.58. P.836-843.

118. Jizba J., Herout V., Sorm F. Isolation of ecdysterone (crustecdysone) from Polypodium vulgare L. rhizomes // Tetrahedron Lett. 1967. V.18. P. 1689-1691.

119. Kaplanis J., Tabor L.,Thompson M.,Robbins W., Shortino T. Assay for ecdysone (moulting hormone) activity using the housefly Musca domestica L. Steroids. 1966.

120. Karlson P., Shaaya E. Der ecdysontiter wahrend der insektennwicklung. 1. Eine methode zur bestimmung des ecdysongehalts // J. Insect. Physiol. 1964. V.10. P.797-804.

121. Kholodova Y., Mishunin I. Phytoecdysteroids Insect moulting hormones of different structure in Serratula coronata L. species// Kolloquien Pflanzenphysiol. der Humboldt Universität zu Berlin. 1985. V.9. P.56-57.

122. Kissmer B., Wichtl M. Ecdysone aus wurzeln und samen von Helleborus II Arten. Arch.Pharm. 1987. N 320. P.541-546.

123. Knight J., Petti G. Arizona flora: The sterols of Peniocereus greggii II Phytochemistry. 1969. V.8. P.477-482.

124. Kobayashi M., Nakanishi K., Koreeda M. The moulting hormone activity of ponasterones on Musca domestica (Diptera) // Steroids. 1967. V.9. P.529-536.

125. Koolman J. Ecdysteroids //Zoological Science. 1990. V. 7. P. 563-580.

126. Koreeda M., Nakanishi K., Goto M. Ajugalactone, an insect moulting inhibitor as tested by the Chilo deeping method. J. Amer.Chem.Soc. 1970. V.92. P.7512-7513.

127. Kubo I., Klocke J., Asano S. Insect Ecdysis Inhibitors from the East African medicinal plant Ajuga remota (Labiatae) // Agr.Biol.Chem. 1981. N 45. P. 1925-1927.

128. Kubo I., Klocke J.A. Isolation of phytoecdysones as insect ecdysis inhibitors and feeding deterrents // Plant resistance to insects. American Chemical Society. Series 208 / Ed. Hedin P.A. Washington, 1983a. P. 329-346.

129. Kubo I., Klocke J.A., Ganjian I., Ichikawa N. Matsumoto T. Efficient isolation of phytoecdysones from Ajuga plants by high-performance liquid chromatography and droplet counter-current chromatography// J. Chromatography. 1983b. V. 257. P. 157-161.

130. Machackova I., Vagner M., Slama K. Comparison between the effects of 20-hydroxyecdysone and phytohormones on growth and development in plants // Eur. J. Entomology. 1995. V. 92. P. 309-316.

131. Matsumoto T., Tanaka N. Production of phytoecdysteroids by hairy root cultures of Ajuga reptans var. atropurupurea // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55, N 4. P. 1019-1025.

132. Matsuoka T., Imai S., Sakai H., Kamada H. Studies on phytoecdysones a review of our works // Ann. Rep. Takeda Res. Lab. 1969. V. 28. P. 221-271.

133. Mboma N.D., Callebaut A., Motte J.C. Phytoecdysones in Ajuga reptans plants, callus and cell suspension cultures // Acta Botanica Neerlandica. 1986. V. 35. No 1. P.48

134. McMorris T.C., Voeller B. Ecdysones from gametophytic tissues of a fern // Phytochemistry. 1971. V. 10. P. 3253-3254.

135. Miller R.W., Clardy J., Kozlowski J., Mikolajczak K.L., Planttner R.D., Powell R.G., Smith C.R., Weinleder D. and Zheng Q.T. Phytoecdysteroids of Diploclisia glaucescens seeds // Planta Med. 1985. P.40-42.

136. Nagakari M., Kushiro T., Matsumoto T., Tanaka N., Kakinuma K. Fujimoto Y. Incoroporation of acetate and cholesterol into 20-hydroxyecdysone by hairy root clone of Ajuga reptans var. atropurpúrea II Phytochemistry. 1994. V. 36. No 4. P. 907-910.

137. Nakanishi K., Koreeda M. Sasaki S., Chang M.L. and Hsu H.Y. The Structure of Ponasteron A an isect moulting hormone from the leaves of Podocarpus nakaii Hay. // Chem. Commun. 1966. P. 915-917.

138. Nakanishi K. The Ecdysones // Pure Appl. Chem. 1971. N 25. P.167-195. Novosel'skaya I., Gorotits M., Abubakirov N. Ecdysterone and polipodine B from Paris quadrifolia. Khim. Prir. Soedin. 1981. V. 7. P.402-403.

139. Ogava S., Nishimoto N., Okamoto N., Takemoto T. Studies on the constituents of Achyranthes radix VIII. Insect-moulting substances in Achyranthes genus // Yakagaku Zasshi. Suppl. 1971. V.91. P.916-919.

140. Ohsawa T., Yukawa M., Takao C., Murayama M., Bando H. Studies on constituents of fruit body of Polyporus umbellatus and their cytotoxic activity // Chem. Pharm. Bull. 1992. Vol. 40. P. 143-147.

141. Otaka T., Okui S., Uchiyama M. Stimulation of protein synthesis in mouse lever by ecdysterone // Chem. Pharm. Bull. 1969. V.17. P.75-81.

142. Pandit S.S., Naik S.D., Jathar V.S. and Kulkarni A.B.,Insect Moulting Hormone Ecdysterone from Sida carpinifolia Linn. // Indian J. Chem. 1976. No 14B. P.907-908.

143. Pinheiro M.L.B., Filho W.W., Da Rocha A.I., Porter B. and Wenkert E.Abutasterone, an Ecdysone from Abuta velutina II Phytochemisry. 1983. No 22. P.2320-2321.

144. Pis J., Budesinsky M., Vokac K., Laudova V., Harmatha J. Ecdysteroids from the roots of Leuzea carthamoides II Phytochemistry. 1994. Vol. 37. No 3. P. 707-711.

145. Porcheron P., Moriniere M., Grassi J., Pradelles P. Development of an enzyme immunoassay for ecdysteroids using acetylcholinesterase as label // Insect Biochem. 1989. V. 19. No 2. P. 117-122.

146. Prakash A. and Ghosal S. Phytoecdysones // J. Sci. Indust. Res. (India). 1979. No 38. P.632-647.

147. Ravishankar G.A., Mehta A.R. Control of ecdysterone biogenesis in tissue cultures of Trianthemaportidacastrum II J. Natural Products. 1979. V. 42. No 2. P. 152-158.

148. Rees H.H. Pathways of biosynthesis of ecdysone // Ecdysone. From Chemistry to Mode of Action /Ed. Koolman J. Stuttgart-New York: Georg Thieme Verlag, 1989. P. 152-160.

149. Rees H.H. Ecdysteroid biosynthesis and inactivation in relation to function // Eur. J. Entomology. 1995. V. 92. P. 9-39.

150. Reixach N., Camps F., Casas J., Lafont R. Ecdysteroid metabolism in in vitro cultures of Polypodium vulgare II XII Ecdysone Workshop. Abstracts. Barcelona, 1996. P. 64.

151. Reum L., Koolman J. Radioimmunoassay of ecdysteroids // Ecdysone. From chemistry to mode of action / Ed. Koolman J. Stuttgart; New York: Georg Thieme Verlag. 1989. P.lSIMS.

152. Rimplier H., Pterosteron, Polipodin B und ein neues ecdysonatriges steroid (viticosteron E) aus Vitex megapotamica (Verbenaceae) // Tetrahedron. Lett. 1969. P. 329-333.

153. Russell G.B. and Fenemore P.G. Insect moulting activity of some New Zealand Gymnosperms //New Zealand J. Sei. 1970. No 13. P. 61-68.

154. Russell G.B. and Fenemore P.G. Insect moulting hormone activity in some New Zealand Ferns //New Zealand J. Sei. 1971. No 13. P.61-68.

155. Santos A.C., Chua M.T., Eufemio N. and Abela C. Isolation of commisterone A, a new phytoecdysone from Cyanothis vaga II Experiementia . 1970. No26. P. 1053-1054.

156. Sarker S.D., Savchenko T., Whiting P., Sik V., Lafont R., Dinan L. Occurrence of ecdysteroids in the genus Centaurea (Copmositae): 20-hydroxyecdysone from Centaurea moschata II Biochemical systematics and ecology. 1997a. V.25. No 4. P.367-368.

157. Sarker S.D., Savchenko T., Whiting P., Sik V., Rees H., Dinan L. Analysis of species of the Ranunculaceae for ecdysteroid agonist and antagonist 1. Ecdysteroids in the genus Pulsatilla II Biochemical systematics and ecology. 1997b. V.25 No 5. P.473-474.

158. Sarker S.D., Savchenko T., Sik V., Rees H., Dinan L. 20-Hydroxyecdysone and its glucosides from Trisetum flavencens II Biochemical systematics and ecology. 1998a. V.26 P.135-137.

159. Sarker S.D., Savchenko T., Whiting P., Rees H., Dinan L. Ecdysteroids from the seeds of Trianthema turgidifolia and T. pilosa (Aizoaceae) // Biochemical systematics and ecology. 1998b. V.26 P.691-693.

160. Savchenko T., Whiting P., Sarker S.D., Dinan L. Phytoecdysteroids in the genus Agapantyus (Alliaceae) // Biochemical systematics and ecology. 1997. V. 25 No 7. P.623-629.

161. Savchenko T., Whiting P., Sik V., Underwood E., Sarker S.D., Dinan L. Distribution and identities of phytoecdysteroids in the genus Briza (Gramineae) // Biochemical systematics and ecology. 1998a. V.26 P.781-791.

162. Savchenko T., Whiting P., Sarker S.D., Dinan L. Analysis of species of the Ranunculaceae for ecdysteroid agonists and antagonists II. Ecdysteroids on the genus Anemone //Biochemical systematics and ecology. 1998b. V.26 P. 131-134.

163. Savchenko T., Whiting P., Sarker S.D., Dinan L. Distribution and identity of phytoecdysteroids in Gomphrena spp. (Amaranthaceae) // Biochemical systematics and ecology. 1998c. V.26 P.337-346.

164. Sauer H., Bennet R., Heftman E. ecdysterone biosynthesis in Podocarpus elata II Phytochemistry 1968. V. 7. P. 2027-2030.

165. Schneider J.A., Yochihara K., Nakanishi K., Kato N. Typhasterol (2-deoxy-castasterone): a new plant growth regulator // Tetrahedon Lett. 1983. V. 24. P. 3859-3860.

166. Shah V., De Souza N. Ecdysterone from Cyathula prostrata II Phytochemistry. 1971. V. 10. P. 1398-1399.

167. Singh S.B., Thakur R.S. Structure and Stereochemistry of Paristerone, a Novel Phytoecdysone from the Tubers of Paris poliphylla II Tetrahedron. 1982. No 38. P.2189-2194.

168. Slama K. Insect hormones and antihormones in plants // Herbivores: their Interaction with Secondary Plant Metabolites / Eds Rosenthal G.A., Janzen D.H. New York: Academic Press, 1979. P. 683-700.

169. Slama K. Ecdysteroids: Insect Hormones, Plant Defence or Human Medicine? // Phytoparasitica. 1993. V. 21. No 1. P.3-8.

170. Suksamrarn A., Sommechai C. Ecdysteroids from Vitexpinnata II Phytochemistry. 1993. V.32. P. 303-306

171. Suri O., Ravi Kant., Jamwal R., Suri K., Atal C. Boerhaavia diffusa, a new source of phytoecdysones//Planta medica. 1982. V.44. P.180-181.

172. Takemoto T., Ogawa S., Nishimoto N. Isolation of the moulting hormones of insects from Achyranthes radix // Yakugaku Zasshi. 1967a. Vol. 87. P. 325-327.

173. Takemoto T., Shuntaro O., Nishimoto N., Arihara S. and Bue K. Activity of Grude Drugs and Plants. (1) // Yakugaku Zasshi. 1967b. N 11. P. 1414-1418.

174. Takemoto T., Ogawa S., Nishimoto N., Hirayama H. Studies of the constituents of Ahyranthes and Cyathula genera // Yakugaku Zasshi. 1968. V. 88. P. 1293-1297.

175. Tanaka N., Matsumoto T. Regenerants from Ajuga hairy roots with high productivity of 20-hydroxyecdysone // Plant Cell Reports. 1993. V. 13. P. 87-90.

176. Thompson M., Robbins W., Kaplanis J., Cohen C., Lancaster S. Synthesis of analogues of a-ecdysone. A simplified synthesis of 2(3,3(3,14a-trihedroxy-7-en-6-on-5(3-steroids // Steroids. 1970. V. 16. P. 85-104.

177. Tomas J., Camps F., Claveria E., Coll J., Mele E., Messeguer J. Composition and location of phytoecdysteroids in Ajuga reptans in vivo and in vitro cultures II Phytochemistry. 1992. V. 31. No 5. P. 1585-1591.

178. Tomas J., Camps F., Coll J., Mele E., Messeguer J. Phytoecdysteroid production by Ajuga reptans tissue cultures // Phytochemistry. 1993. V. 32. No 2. P. 317-324.

179. Vanek T., Macek T., Vaisar T. Breznovits A. Production of ecdysteroids by plant cell culture of Pteridium aquilinum II Biotecnology Letters. 1990. V. 12. No 10. P. 727-730.

180. Vokac K., Budesinsky H., Harmatha J. Ecdysteroids from the mushroom Tapinella panuoides (Syn. Paxillus panuoides)!/ Xlth Ecdysone Workshop. Programme and Abstracts. Ceske Budejovice, 29 June-2 July 1994. P. 119.

181. Whiting P., Savchenko T., Sarker S.D., Rees H., Dinan L. Phytoecdysteroids in the genus Limonium (Plumbaginaceae) // Biochemical systematics and ecology. 1998. V.26 P.695-698.

182. Williams J., Scott., Ford-Lloid B. Patellaria: a new genus in the Chenopodiaceae // Feddes repertorium. 1976. V.87. P. 289-292.

183. Wong L.Z., Li H.Y., Chang Y.Y., Zhu G.Q., Shong S.X. Li S.H., Ye J.S. Identification and physiological tests of phytoecdysoned from Chines alora with silkworm Bombix mori L. // Acta Entomol. Sinica. 1979. V. 22. P.396-403.

184. Yang Chong-Ren Occurrence of (3-Ecdysone in Cyanotis arachinoidea and other commelinaceous plants: Xl-th Ecdysone Workoshop Programm and Abstracts. Ceske Budejovice, 1994. P. 123.

185. Yen K.-Y.,Yang L.-L., Okuyama T., Hikino H., and Takemoto T. Screening of formosan ferns for phytoecdysones, I // Chem. Pharm. Bull. 1974. No 22. P.805-808.

186. Yokota T., Arima M., Takahashi N. Castasterone, a new phytosterol with plant-hormone potency, from chesnut gall // Tetrahedron Lett. 1982. No 23. P.1275-1278.