Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция процессов роста и биосинтеза экдистероидов в культуре клеток левзеи сафлоровидной

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляция процессов роста и биосинтеза экдистероидов в культуре клеток левзеи сафлоровидной"

РГ6 и

1 модющ^й государственный университет

имейи м'.в .Ломоносов а б иологический факультет

На правах рукописи

ОРЛОВА Ирина Владимировна

удк 581.198; 547.918

регуляция процессов роста и биосинтеза экдистероидов в культуре клеток левзеи сафлоровидной

специальность 03.00.12— физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1993

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН, в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

А.М.Носов

Официальные оппоненты: доктор биологически^ наук,

Т.Г.Корженевская кандидат биологических наук Н.В.Загоскина

Ведущая организация: Научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии

Защита диссертации состоится " / >> 1993 г>

часов на заседании Специализированного Совета К 053.05.14 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В 234, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета.

Автореферат разослан 7 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

О.Г.Полесская

Актуальность работы. Стало традиционным рассматривать культуру клеток высших растений как удобную модель для физиолого-биохимических исследований с одной стороны, а также как альтернативный природному сырью источник ценных продуктов вторичного метаболизма растений, с другой.

Актуальность данного исследования обусловлена:

- во-первых,уникальностью объекта исследования. Среди растений-продуцентов экдистероидов существует целый ряд растений с узким естественным ареалом распространения. Левзея са&лоровидная, (маралий корень) Rhaponticum carthamoides Willd.(Iljin), относится к эндемикам Алтая, вид нуждается в охране. Кроме того, это ценное лекарственное растение, издавна используемое в народной медицине как аналог женьшеня. Введение этого растения в культуру клеток представляет значительный практический и теоретический интерес.

- во-вторых, представляет несомненный интерес изучение культуры клеток растений как биологической системы, позволяющей прояснить целый ряд физиологических закономерностей ее становления и существования - в частности, зависимость характеристик получаемых клеточных культур от природы экспланта, влияние внешних факторов на процессы первичного и вторичного метаболизма в культивируемых клетках.

- в-третьих, вторичные метаболиты маральего корня, в частности, экдистероиды представляют несомненую практическую ценность. Соединения этого класса представляют собой полиоксистероиды с широким спектром биологической активное™: адаптогенной, анаболической, кардиотонической, гормональной (для насекомых). При этом, слабо изучены механизмы физиологического действия и биосинтеза этих соединений особенно в растениях. Высокая стоимость экдистероидов (цена экдистерона составляет 3000$ за 1г) является важным условием создания биотехнологии для их получения на основе культуры клеток растений-продуцентов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы явилось - полу- ' чение каллусных и суспензионных культур клеток левзеи сафлоровидной (Rhaponticum carthamoides), изучение их физиолого-биохимических характеристик, а также выяснение возможности биосинтеза экдистероидов в культуре клеток данного вида.

Для осуществления поставленной цели было необходимо решить ряд задач:

- получение стабильных клеточных линии из различных типов экс-плантов;

- 2 - ' '

- изучение влияния различных факторов -на эффективность каллусо-Генеаа; , .

- изучение влияния факторов культивирования (трофических, гормональных и др. Г на рост и биосинтез фигостеринов (предшественников биосинтеза экдистероидов) в каллусных куль турах-'различного происхождения ; '

■ получение и характеристика суспензионных -- культур-, клеток' Rhaponticum oarthamoides;

- изучение закономерностей синтеза стероидных соединений в кал-' лусных и■суспензионных культурах Rhaponticum carthamoides.

Научная новизна работы. Впервые получен ряд линий, каллусных культур Rhaponticum carthamoides; показано существование йтаммовой специфичности у культур клеток, полученных из разных типов, эксплан-тоь. Создана коллекция каллусных линий Rhaponticum carthamoides.. Изучено влияние ряда факторов культивирования на рост и синтез сте-риноь б различных клеточных линиях маральего корня.

Получены.две высокопродуктивные по биомассе суспензионные "культуры клеток Rhaponticim carthamoides, отличающиеся по морфо-физио-логическим и биосинтетическим характеристикам: '

Показана принципиальнеая возможность синтеза экдистероидов кле.т-каЫи in vitro. При этом каллусные культуры содержат следовые количества экдистероидов. при переходе к глубинному культивированнию содержание экдистероидов существенно увеличивается.

Установлено, что спектр синтезируемых в культуре клеток экдистероидов отличается от интактного растения, при этом две суспензионные линии RS- 1 и R3-2 различны по составу экдистероидов.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований получены сведения' о составе, содержании и закономерностях синтеза стероидных соединений, необходимые для практического использования культры клеток. Rhaponticum carthamoides. -Получении две суспензионные'* культуры клеток маральего корня RS-1 и RS-2, обладающие.высокой продуктивностью' по биомассе (до 1,5 г сухой биомассы на литр среды за сутки) и содержащие .экдистероиды (экдистерона до 0,05 мг/г сухой массы клеток). Эти. культуры могут быть' использованы в медицине, •парфюмерии как' источник физиологически-активных соединений.

■ Публикации. ' По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

.. Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались

v'-cw Всесоюзном симпозиуме "Яиленернсй йкзймолоГ'йй"' ¡Мооквз, 1991), 1-ом Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1991), семинаре отдела клеточной физиологии и био-

' . ^ з -

технологии №f>P РАН, заседаниях Ученого Совета Института Физиологии КНЦ РАН.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, глав экспериментальной части, заключения, е.ы-водов и списка литератур'I.

Кабота изложена на //у страницам машинописного текста и содержит 27 рисунков и 14 таблиц.

Список литературы включает 163 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования служили интактные растения Rhapont icum carthanioides, находящиеся на разных фазах жизненного цикла. Растения любезно предоставлены Ботаническим садом KHII УрО РАН.

Нз последующ!« этапах работы объекта.«! ксслевосания являлись полученные НclmИ кадлускые И СУСПеНЗИиНКЫб культуры КЛетОК RlViuOiK i■ -7;гп carthamoides. '

Получение каллусных культур. Стерильные экс ¡¡.ланч; размером 0,5-1 см высаживали на поверхность агаризованнсй среды МЗ с 3Z .сахарозы и различным рочетанием фитогормонов. Культивирование провоз дили в темноте при температере 26±2°С. влажность воздуха 60Z.

Процент каллусогенеза определяли как число эксплантов. образовавших первичный каллус, к числу'неинфицированных эксплантов.

Получение суспензионных культур. Суспензионную культуру получали путем переноса каллуса (0.5 г сырого веса)" в 250 мл колбы Зрленмейе-ра, с 50 мл среды MS. 1 мг/л 2,4-iv 0,2 мг/л БАП и витаминами по Стаба. Для R-1 брали половинную норму кальция. Суспензии культивировали на качалке, скорость вращения 98 об/мин, эксцентриситет ±13 мм. при 26°С в темноте. При первых 2-3 субкультивированиях отбирали верхнюю-фракцию, содержащую более мелкие агрегаты и разбавляли равным объемом свежей питательной среды. Субкультивирование проводили через 2 недели. В течение пассирования объем инокулюма уменьшали последовательно до 20, 15. 10 мл на 100 мл питательной^ среды. После пяти пассажей установили окончательный режим пересева - 10 мл ийоку-лята на 100 мл среды, при плотности инокулята 15-16 г/л сухой биомассы или 2x10"-' клеток/мл.

Изучение влияния факторов среды на каллусные культуры. Эксперименты по варьированию среды проводили е 4 линиями каллусных культур СR-1. R-2, R-3, R-4) Rhaponticum carthamoides. различающихся происхождением, возрастом и морфо-физиологическими характеристиками (Таб-

лица 1, стр.9).

Подученные результаты обрабатывали статистически с использованием пакета программ STATGRAF, сравнивая рост и биосинтез каллусных культур в контроле и опыте.

проксанслы с различным соотношением гидрофильно-гидрофобных блоков добавляли в среду вместо ПВП, в концентрации 2,5 г/л.

Морфо-физиологические характеристики суспензионных культур. Для характеристики роста и физиологического состояния клеток использовали сухую и сырую Maccv клеток, концентрацию клеток, жизнеспособность клеток.

Состав популяции определяли как процентное соотношение числа отдельных клеток и агрегатов клеток различного размера.

Число клеток определяли по стандартной методике в гемоцитомет-ре Фукса-Розенталя после мацерации 20Z хромовой кислотой в течение 30 мин при 60°С и шприцевания.

Жизнеспособность клеток определяли по прокрашиванию клеток фе-носафранином.

По первичным данным рассчитывали удельную скорость роста в экспоненте р., экономический коэффициент Y, время удвоения биомассы х

Цитологические и наркологические характеристики суспензионных культур.

Митотический индекс определяли после фиксации клеток смесью спирта и ледяной уксусной кислоты 3 : 1 (v/v). Митозы подсчитывали на давленном препарате, окрашенном гематоксилином по Караччи.

Определение состава клеточной популяции по числу хромосом проводили -на 3-4 сутки роста культуры клеток после обработки 0,05% раствором колхицина и окрашивания лакмоидом.

Биохимические характеристики суспензионных культур. Фракцию свободных стеринов анализировали методом ГЖХ. Анализ проводили на приборе Chrom - 5 (ЧСФР) со стеклянными колонками размером .120 х 0,3 см., заполненными носителем Cromaton-N-super 0,16-0,20 мм, пропитанным 3Z 0V-17. Условия хроматографирования: детектор - ДИН, расход водорода - 25 мл/мин, воздуха - 250 мл/мин. Температура испарителя <270°С, детектора - 2?0°С, температура колонки - 260°С.

Качественное и количественное определение Сахаров в культуралной среде проводили на хроматографе GP3 фирмы "Kovo", .колонка с привитой аминофазой 901-30302 Separon SGX NH , .5 мкм. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и водь (80:20), давление в колонке 14 МПа, скорость элюирования 0,5 мл/мин.

■ - 5 -

Анализ зкдистероидов проводили методом ВЭЖХ на хроматограф Hf-1.- * "Kovo" с детектором"LCD-2563 рабочая длина волны 254 нм. Колонка Separon SGX С18 7ит 901-300014. Скорость подачи элюирующей смеси 0,7 мл/мин. Ввод пробы осуществляли с помощью дозатора LC1-S0, объем петли 3 мкл. Элюирующая смесь состояла из воды, ацетонитртла, бутанола-1, диэтилового эфира, в соотношении 9:3:3:1.

Хромато-масс-спектрометрия стероидов.

Хромато-масс-спектрометрию применяли для идентификации стероидов. Исследования проводили на приСорае Kratos-25-RFA (Великобритания). Режимы работы: ионизирующее излучение 50 и 70 эв..ток эмиссии катода 400 - 600 мкА, ускоряющее напряжение 4-6 кв, температура источника ZOO - 250°С. Хроматографирование проводили на капиллярной колонке CP-Sil 8 СВ 25 т, внутренний диаметр - 0.32 мм. Температура "колонки 270°С, температура инжектора - 220°С.

Масс-спектры зкдистероидов снимали на прямом вводе, температура источника 270°С, ионизирующее излучение 70 эВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Получение каллусных культур Rhaponticum carthamoides.

1. 'Влияний типа экспланта на каллусогенез.

Первичный каллус удалось получить из всех типов эксплантов: корень, стебель, лист, цветочная почка, части проростков (гипокотиль. семядольные листья, корешок), прикорневая почка, зародыш семени. Однако при последующих субкультивированиях более 90% каллусов погибала, вследствие проявления внутренней инфекции (особенно в случае использования в качестве экспланта проростков и зародышей). из-за не-оптимаяьной среды и механических повреждений при' пересадке.

В среднем первичный.каллус удалось индуцировать v 35% эксплантов. При этом на эксллантах из стерильных проростков первичный каллус образовывался примерно в 70% случаев.' Наибольшие трудности были при получении каллуса из корня и цветочной почки как из-за высокой степени инфицированное™. так и вследствие низкой способности этих органов растения к каллусогенезу.

2. Влияние фитогормонов на каллусогенез.

Каллус образовывался на средах с различным сочетанием фитогормонов. Несмотря на то,что каллус индуцировался в широком диапазоне

- 6 - _ концентраций ауксинов и цитокининов, обязательным условием явилось преобладание ауксина над цитокинином. Были испытаны разные ауксины (2,4-Д, НУК, ИУК, ЙМК) в диапазоне концентраций от 0,5 до 2,0 мг/л 'среды и цитокинмны (БАП, кинетин) - от 0 до 1,0 мг/л.

Сочетание 2,4-Д - БАП оказалось наилучшим для каллусогенеза у .всех типов эксплантов: образовавшийся каллус уже в нулевом Пассаже переходил к росту на среде, отделяясь от экспланта. При сочетании 2,4-Д - кинетин часто наблюдали оводненность каллуса, снижение интенсивности роста. На среде с НУК - БАП, как правило образовывался плотный й сухой первичный каллус, долго не отделяющийся от экспланта. При одинаковых концентрациях НУК - БАП у стеблевых эксплантов происходило образование побегов. Для листовых и стеблевых эксплантов наблюдали интенсивный каллусогенез на среде с 0,5 мг/л НУК без цито-кинина. На средах с ИМК и ДОУК также наблюдали образование каллуса, но на средах с этими ауксинами экспланты накапливали большое количество фенольных соединений, выделявшихся в среду, что снижало ¡жизнеспособность образовавшихся каллусов. На среде с 1,5 мг/л ИМК и 0,5 мг/л БАП из стеблевого экспланта образовывались корни. На. среде с 0,5 мг/л ИУК и <р,2 мг/л кинетина происходило образование побегов у стеблевых эксплантов.

Таким образом, показано определенное различие в действии фито-гормонов на каллусогенез для "различных типов эксплантов.' В частности, была выявлена высокая способность к морфогенезу у стеблевых эксплантов: в 7 из 16 пробирок отмечено образование морфогенных структур , в то же время, для эксплантов из различных частей проростков не наблюдали ни одного случая морфогенеза.

В результате экспериментов было установлено отрицательное влияние-высоких -концентраций фитогормонов на процесс каллусогенеза. Уже при суммарной концентрации фитогормонов 3-5 мг/л они оказывались токсичными дляч эксплантов.

Время(начала каллусогенеза варьировало в широком диапазоне от 7 до 30 суток.

По полученным данным можно сделать вывод, что для каллусогенеза ГОшрописшп саг^аттс^еБ оптимальным сочетанием ^чтогормонов является комбинация 1-1,5 мг/л 2,4-Д и 0,1-0,5 мг/л БАП. Это сочетание является оптимальным для всех типов эксплантов, и не зависит .от их эпигенетических характеристик.

В то же время тип экспланта значительно влияг на характеристики полученных каллусных культур (Таблица 1).

Таблица 1.

"Характеристики полученных каллусных культур ЙтаропИсшп сагЧЬапшс^з, находящиеся в коллекции.

Тип экс-планта Конси-• стенция Цвет Рост Дата' введения в КК Шифр ' линии

Прикокневая почка рыхлый белый ++++ сентябрь 1989 РЫ

Лист мелкодисп. сер-зел. +++ май, 1990 Я-2

Цветочная почка рыхлый сер-Сел. +++ май, 1990 Ы-З

Гипокотиль рыхлый, оводненный желтый +++ сентябрь 1990 К-А

Цветочная почка рыхлый, оводненный сероват. +++ май, 1990 !?-5

Семядольный лист рыхлый, оводненный зеленов. ++ август 1990

Корешок проростка рыхлый, оводненный серый ++ - август 1990

Гипокотиль плотный гетероген. желто-коричн. ++ август 1990 И-8

Гипокотиль плотный оводненный желто-коричн. ++ август 1990 й-9

Зародыш плотный коричн. +■ сент. 1990 РМО

Стебель рыхлый сер.-зел нестаС май, 1990 и-и

При использовании 2,4-Д не выявлено случаев морфогенеза ни для одного из типов эксплантов (включая стеблевые экспланты). На средах с ИМК, ИУК, НУК стеблевые экспланты образовывали в ряде случаев корни и побеги. р

Влияние факторов культивирования на рост и синтез фитостеринов в каллусннх культурах КЬароп^сит сшЧЬатепёез.

1. Анализ фитостеринов в каллусных ■ культурах ВИарописип) саг^аятбеБ.

Во всех четырех линиях каллусных культур (К-1, 1?-2,- 1?-3, !?-4) обнаружено 4 фитостерина: ситостерин, стигмастерин, кампестерин и холестерин. Идентификацию фитостеринов проводили ■ хрома-то- масс-спектрометрически и сравнением со стандартными образцами.

Качественный состав стеринов практически не изменялся под влиянием факторов среды. Типичная хроматограмма стеринов из каллусной культуры к:-2 представлены на рис.1.

•Преобладающим стерином для всех линий оказался ситостерин, сумма остальных фитостеринов не превышала 207. от количества ситос-« терина. Из четырех изученных каллусных линий наиболее продуктивной по ситостерину является линия 1?-3, уровень синтеза ситостерина этой линией в _контроле в 2 раза выше, чем у остальных каллусных линий. Линия' 1?-3 была получена из цветочной почки, возможно, что высокий уровень синтеза ситостерина в ней является эпигенетически закрепленным признаком, поскольку ийвестна взаимосвязь синтеза ситостерина с прцессом цветения..

Рис.1. ГЖХ-хроматограммы фитостеринов каллусных культур

Ы-2 (контрольная среда)-и Р-4 (среда с 1/2 нормы СаС1г)

1 - внутренний стандарт (АДЩ, 2 - холестерин 3 - кампестерин,- 4 - стигмастерин, 5 - ситостерин

2. Влияние фитогормонов на рост и' синтез стеринов в каллусных культурах ^аропИсит' саг1Ьато1(1ез.

Клетки линии 1?-1 не росли на средах с ИМК и ИУК, что, возможно, обусловлено высокой ауксиноксидазной активностью данной линии. На среде с НУК для линии И-1 наблюдали снижение роста и уровня биосин-тенза ситостерина (Рис.2).

Линия {?-2 отличалась от остальных линий высокой степенью нестабильности ростовых характеристик. В контрольном варианте коэффициент вариации Су по сухой биомассе составчял 53%, поэтому судить о достоверности влияния факторов на рост этой линии достаточно сложно. Тем не менее, по уровню биосинтеза стеринов выделяются варианты с ИУК и ИМК. На средах с этими ауксинами количество синтезируемого каллусны-ми клетками ситостерина снижалось более чем в 3 раза по сравнению с контролем и при использовании НУК (Рис.2).

Для линии Р-З отмечено ухудшение роста на средах с ИМК и ИУК. в то же время уровень1 'синтеза ситостерина на средах с этими ауксинами мало отличался от контроля. Наилучшим вариантом.для линии Р-З было сочетание БАП - НУК, при этом сочетании фитогормонов усиливался биосинтез ситостерина с 0,8 до 1,4 мг/г, улучшились морфологические характеристики культуры, рост не отличался от контроля.

Для линии И-4 усиление роста и синтеза происходило на среде с НУК, рост и синтез на среде с 2,4-Д, ИУК и ИМК был одинаковым.

3. Влияние различных концентраций кальция на рост и синтез стеринов в каллусных культурах К^аропИсит саг111а'по1с1е5.

В результате проведенных экспериментов было показано, что уменьшение и увеличение концентрации СаС1г в среде вызывает изменение как в росте, так и в биосинтезе стеринов-у каллусных культур' (?-1, Р-2. Р-З и Как и в случае с фитогормонами это влияние неоднозначно

для разных линий.

Для линии Р-1 уменьшение или увеличение концентрации СаС1^ не сказывалось на росте культуры, тогда как уровень биосинтеза на среде с 1/2 нормы СаС1г увеличивался по сравнению с контролем почти в 2 раза (с 0,4 до 0,7 мг/г) (Рис.3).

Для линии К-2 изменение концентрации хлорида кальция в 2 раза по сравнению с контролем, приводило к резкому угнетению синтеза ситостерина. При этом на среде с двойной нормой кальция коэффициент вариации индекса роста составлял как по сырой так и по сухой биомассе около 130£, что, возможно, свидетельствует, с одной стороны,"

(

ИНД. РОСТА КОНЦ. СИТОСТ. МГ/Г ИНД. РОСТА КОНЦ. СИТ0С.7. мг/г

2,4-Д ИУК ИМК НУК

ESJ - сц> б/м { '.. ) - су*. С/к* G3B - ctcroctvpMt

2.4-Л ИУК ИМК НУК

Рис.2. Влияние ауксинов на культуры R-1 и R-2.

ИНД. РОСТА КОНЦ. Oil ОСТ. МГ/Г ИНД РОСТА КОНЦ. СИТОСТ. мг/г " ..1-010 -

R— 1

НОРМА • I /2 НОРМЫ 2 НОРМЫ

R-2

НОРМА . 1/2 НОРМЫ 2 НОРМЫ

9 - с«р. о/м СЗ - су* ft/м вВ-cwoirepw

Рис.3. Влияние кониентрации кальция нгккулктуры R-I и R-2.

ИНД. РОСТА кони. СИТОПТ. иг/г ИНД. РОСТА конц. СИТОСТ. мг/г

* 0 10 г '

R- 1 '

САХ. ГЛШ. ЛАКТ. 9РКУТ. РАЧ\

Рис.4. Влияние углеводов на культуры R-1 и R^2.

САХ. Г7ЮК. ЛАКТ. 4'РУКТ. РАФ.

ИЗ - 04>. Cj* LU - СО". С/м ЯВ . енлх-тфм

о высокой степени гетерогенности данной линии, а с другой - о стрессовом воздействии повышенной концентации СаСЬг (Рис.3).

Изменение концентрации кальция отрицательно влияло на рост и синтез ситостерина линией (?-3.

Для линии И-4 обнаружена интересная особенность: на среде с 1/2 нормы СаС1г значительно усиливался синез холестерина (Рис.4). Уровень содержания холестерина составил 0,6 мг/г сухой биомассы, что вдвое превышает содержание ситостерина. Индекс роста на среде с 1/2 нормы СаС1>2 практически не отличался от контроля. На среде с двойной нормой СаС1г характер биосинтеза и рост не отличался от контрольного варианта, при этом количество синтезируемого ситостерина увеличивалось с 0,4 до 0,6 мг/г.

Таким образом, концентрация ионов кальция в среде является значимым фактором как для роста культуры, так и для синтеза стеринов, однако это влияние неоднозначно для различных линий.

4. Влияние углеводов на рост и синтез стеринов в каллусных культурах Иварописит cart.hamol.cles.

Каллусные линии по-разному реагировали на различные источники углеводов в среде (Рис.4). Культуры погабли на среде с ксилозой, арабинозой, сорбитом, сохраняли жизнеспособность на среде с рамнозой и галактозой.

На среде с глюкозой культура К71 росла несколько хуже, чем в контроле, однако при этом интенсифицировался синтез ситистерина. Для линий И-2 и 1?-3 наблюдали увеличение индекса роста, синтез ситостерина усиливался только у Л1{нии К-2. Рост и синтез ситостерина культурой Я-4 на среде с глюкозой мало отличался от контроля.

Линия Р-1 не росла на среде с лактозой, хотя ткань возобновляла рост после пересадки на контрольную среду. Для линии И-2 наблюдали очень большой разброс между вариантами - индекс роста по сухой биомассе' варьировал от 0 до 15. Для линии 1?-3 индекс роста по сырой биомассе снизился в 2 раза, по сухой -1,2 раза, в то же время уровень синтеза .ситостерина снизился в 10 раз по сравнению с контролем. У линии И-4 на среде с лактозой происходило снижение роста и биосинтеза.

Фруктозу хуже всех усваивали линии К-1 и о чем свидетельствует существенное снижение интенсивности роста и синтеза ситостери-йй. ДЛЯ Линий к-2 При СнйКеййй роиТа СгабйЛЬНим оставался бйбиинТёз. Линия Р-4 хорошо росла на среде с фруктозой, однако синтез ситосте-

- 12 -

рина был в 4 раза ниже по сравнению с контролем.

На среде с рафинозой наблюдали активизацию биосинтеза ситостерина для линий й-1, Н-2 и Я-4, при этом для и й-2 индекс роста снижался в 1,5-2 раза, для 1?-4 рост практически не отличался от контроля. Для линии Й-З было отмечено снижение роста и уровня биосинтеза ситостерина.

Таким образом, установлены различия между линиями по ряду характеристик. . Наиболее выжной из которых, на наш взгляд, является степень "консервативности" роста культур и синтеза стеринов в них под действием различных факторов. Наиболее консервативной оказалась линия 1?-1', ■ линия характеризуется высокой степенью нестабильности ростовых характеристик.

Степень влияния факторов определяется, по-видимому, генетическими и эпигенетическими характеристиками культур и спецификой факторов. Значимого повышения роста линий и синтеза стеринов под Действием изученных факторов не показано.

Заслуживает внимания резкое повышение содержания холестерина при снижении уровня кальцияотмеченное только для линии 1?-4.

Характеристика суспензионных нуль у р Ишрописшп саг1Ьапки(1ез.

1. Ростовые характеристики линии 1?3-1 при культивировании в • колбах. _" ..

На рис.5 представлен график ростовой кривой линии КЗ-1 по сухой биомассе и числу клеток. Как следует из графика, длительность лаг-фазы составляла 2 суток, на 3-4 сутки приходился пик митозов, к. 12 суткам заканчивался экспоненциальный рост. Стационарная фаза у культуры (£>-1 не выражена, и уже на 14-15 сутки наступала фаза деградации. Жизнеспосоность популяции клеток К5-1 в середине экспоненциальной фазы составляла 84-89%. Удельная скорость роста по сухой биомассе равна 0,44 сут-1, максимальная концентрация сухой Оиомассы -- 15-18 г/л. '

2. Характеристика клеточной популяции линии 1^-1.

Определение митотического индекса суспензионной культуры клеток

Кэ-1 проводили на протяжении 11 суток. Наибольшее число делящихся клеток было выявлено на 4 сутки роста. Митотический индекс к этому сроку 'достигал 4,81£. В целом кривая митогической активности имеет двувершинный характер: второй пик митотической активности наблюдается

1п Х/Хо ""А

I. сутки

в

1лХ/Хо »«"А

- по числу «л. Хо,Х-»оч. * «онеч б/*«

Рис.5.Динамика роста и синтеза в 135-1, 135-2.

также на 7 сутки (Рис.6). В остадьнде время митотический индекс колеблется от 0,3 до 3,0 X. Увеличение митотической активности происходило в начале и середине экспоненциальной фазы роста культуры.

Определение состава клеточной популяции по числу хромосом производили на 3-4 сутки роста культуры, в момент наибольшей митотической активности популяции клеток. Число хромосом в интактном растении Йтарописит саг1Ьато1(1ез составляет 24. В суспензионной культуре 15-1 большинство клеток (242) имеют 22-26 хромосом, на клаосы 12-16 и 17-21 приходится по 17Х. Кроме того, приблизительно 152 клеток содержат 27-31 хромосому, около 2% популяции составляют полиплоиды (Рис.7). Таким образом , 1^-1 представляет собой гетерогенную по числу хромосом популяцию клеток с неярко выраженным околоплоидным модальным классом.

3. Динамика поглощения Сахаров линией 1ге-1 при культивировании в колбах.

Контроль за изменением качественного и количественного состава Сахаров в среде осуществляли методом ВЭЖХ, результаты анализов представлены в Таблице 2.

' Таблица, 2.

Характер утилизации сахарозы культурой К>-1.

Период выращивания __ 7. глюкозы у ( 2 фруктозы 1

3-е сутки, лаг-фаза 1,35 1 1 1.45

9-е сутки, середина экспонен. 0,8 1 1.42

12-е сутки, конец экспонен. 0,01 1 1,43

14-е сутки, стационар <0,01 I 0,98

19-е-сутки, фаза деградации 1 <0,01 1 0,9 |

»

Уже на 3 сутки, т.е. к концу лаг-фазы, сахароза в среде полностью гидролизовалась на глюкозу и фруктозу, на 9 сутки концентрация глюкозы в культуральной среде составляла 0,82» при этом количество фруктозы в среде не изменилось. К 12 суткам (конец экспоненциальной фазы) глюкоза полностью усваивалась: конечная концентрация в среде составляла 0,012. И только с этого, момента наблюдали некоторое снижение концентрации фруктозы - до 1.0-0.9Х.'

с

\

.суспензионной культуры ИБ—1.

% метскраэ 25 г—-

7-М 12-16 17-21 22-26 27-31 32 -Ж 37-41 «2-« <7-51 Ь2 ' 73 : 96

число хромосом Рис.7. Классы хромосом культуры RS—1.

Экономический коэффициент, рассчитанный по фактически поглощенным сахарам равен для 1?Б-1 У-О.б, при выращивании КЗ-1 на глюкозе экономический коэффициент оказался равным 0,46. Л

4. Динамика синтеза стеринов линией Р5-1 в' цикле выращивания в колбах на качалке.

По качественному составу фитостеринов суспензионная культура !?3-1 не отличалась от исходной каллусной ткани, преобладающим стери-ном был сигостерин. В целом, уровень биосинтеза ситостерина был выше, чем в исходной каллусной ткани. При этом для суспензионной культуры характерно изменение уровня биосинтеза ситостерина в цикле выращивания: максимальный уровень биосинтеза (1 мг/г) соответствовал 3-м суткам, затем происходило некоторое снижение концентрации ситостерина в клетках до 0,8 мг/г, на 12 сутки вновь происходило увеличение биосинтетической активности (0,9 мг/г). В фазу деградации содержание ситостерина в клетках резко снижалось до 0,48 мг/г (Рис.5).

В целом наблюдается корреляция между митотической активностью культуры и биосинтезом ситостерина (Рис.5, 6). Увеличение концентрации ситостерина и активный его синтез характерен для молодых, активно делящихся клеток. Ситостерин является важной составной частью клеточных мембран. Этим, по-видимому, объясняется взаимосвязь проли-феративной активности клеток и уровня биосинтеза ситостерина в них.

5. Ростовые характеристики линии !?3-2 при культивировании в колбах.

Кривые роста по" числу клеток и по сухой биомассе культуры ¡?3-2 несколько отличаются между собой (Рис.5). Кривая роста по сухой биомассе имеет обычную 5-форму. Длительность лаг-периода составляла 2 суток, фаза экспоненциального роста заканчивалась на 12 сутки. В отличие от (?3-1, у суспензионной культуры 1?3-2 выражена стационарная фаза, которая длится до 17-х суток, затем наступает фаза деградации. Отмечен несколько иной характер кривой роста по числу клеток: фаза экспоненциального роста заканчивается на 7 сутки, до 12-х суток интенсивность делений клеток снижается, а на 12-14 сутки вновь происходит увеличение митотической активности.

Культура ИЗ-2 характеризуется высокой удельной скоростью роста -по сухой биомассе 0.39 сут-1. Максимальная концентрация сухой биомассы ¿оставляла 15-16 Г/Л. Жй&НеОПиОООноОтЬ КЛёТоК'Ъ СёрёДЙнё экспоненциальной фазы роста равнялась 89-94%.

б. Ростовые характеристики линий К5-1 и 1?3-2 при культивировании-в биореакторе.

Для выяснения возможности аппаратурного выращивания суспензионных культур клеток И1ароп(лсит сагЬЬато1с1ез линии Кэ-1 и ЙЗ,-2 культивировали в барботажных биореакторах с рабочим объемом 1,0 л. При этом критерии роста, оказались близкими к ростовым критериям при выращивании в колбах. Содержание ситостерина в линии КЗ-1 оказалось несколько ниже, чем при культивировании ее в колбах на качалке:

В таблице 3 представлены результаты сравнений ростовых характеристик суспензионных культур ГС5-1 и !?3-2 при различных способах культивирования.

Таблица 3'

Ростовые характеристики суспензионных культур и (обозначения см. стр. 4) 4 • ■

Шифр линии

I

1

I I I

-н-

10,4 I 0.53

10.1 | 0,50

10.2 | 0,44 8,2 I 0,40

М

РЗ-1 (колбы) | 0,44

.1?5-1 (ферментер) | 0,41

ГСэ-2 (колбы) | 0,39

РЗ-2 (ферментер) | 0,20

1,4

1 ",7 1,8

3,4

16.5 15,0 15,5 12,0

■ 7. Динамика синтеза стеринов линией в цикле выращивания в колбах на качалке.

В отличие от культуры 1?3-1 для суспензии клеток !?3-2 наблюдали существенные колебания в уровне биосинтеза ситостерина в цикле выращивания. Пик биосинтетической активности приходился на 5 сутки культивирования, концентрация ситостерина в этот период составляла 0,9 мг/г сухой биомассы. Затем уровень биосинтеза резко снижайся до 0,2 мг/г и усиливался на 12 сутки до 0,5 мг/г.- В целом, результаты по биосинтезу ситостерина коррелируют с данными по изменению числа меток в суспензионной культуре время-максимального синтеза сте-рина совпадает • со временем максимальной интенсивности делений клеток, соответствующей 2-7 и 12-.14 суткам (Рис.5).

- показаны существенные различия в морфологических характеристи- , ках суспензионных культур !£3-2;

- для обеих линий суспензионных культур характерны высокие ростовые характеристики (Таблица 3); ■ ■

- культуры Кэ-Г и КЗ-2 не отличается по качественному составу,

синтезируемых ими стеринов; преобладающим стерином в обоих случаях был ситЙЬтерин, что характеризует высокую пролифератиЬную способность клеток этих линий; •

- для обеих линий суспензионных культур характерно два пика биосинтетической активности по ситостерину в цикле выращивания, показана корреляция между митотической активностью культур и уровнем биосинтеза сит'остерина1.

Содержание экдистероидов в растениях и культурах клеток ИиропЫсит сагиштоЫез. .

1. Содержание экдистероидов в интактных плантационных растениях. Для анализ^ использовали плантационные растения, определяли содержание экдистероидов в различных органах - листьях, корневище, стебле, соцветии, бутонах, семенах (таблица 4).

- Таблица 4

Содержание экдистерона в органах ИчаропИсшп сагШалклс^ез на разных Фазах жизненного цикла.

Орган 1 | Фаза жизненного цикла 1 Содерж. экдистерона,%

Побеги' 1 I Начало вегетации 0,16

Листья I Цветение 0,08"

Листья |После цветения 0,096

Листья I После плодоношения 0,03

Бутоны IБутонизация 0,2

Цветки Шветение следы

Обертка корз. I Цветение 0,03

Корень |1 год, осень 0,08

Корневище 110-15 лет, зимний покой 0,01

Семена I Плодоношение . I 0,08

Хроматограммы экдистероидов из различных органов растений представлены на рис.8.

Основным экдистероном интактных ' растений Е^аропИсит саг^апклсЗез является экдйстерон - 20-гидроксиэкдизон. Содержание этого соединения в растениях варьировало от 0.01 до 0,2X, в зависимости от органа и сезона. Наибольшая концентрация экдистерона зафик-

Рис.8. "ЗШХ-хроматограммьг экдистероидов из органов интактного растения1^ каллусной ткани и суспензионных культур клеток левзеи сафлоровидной. . I - экдистерон; 2 - неиденгифицированннй экдисгероид.

сирована в весенних побегах маральего корня и бутонах, наименьшая -в осенний период в корневищах растений 10-15 летнего возраста. Результаты анализа содержания экдистерона в плантационных растениях " представлены в таблице 4; даны средние значения из 3-х определений, сезоны 1990-92 гг.'

Таким образом, максимальное содержание экдистерона характерно для молодых, активно функционируют« тканей, § стареющих органах и тканях количество экдистерона снижается.

2. Содержание экдистероидов в калдусных культурах. Содержание экдистероидов в каллусных культурах РаропМсит

саг1Ьато1с1е5 является весьма низким и на принятом в экспериментах уровне чувствительности (0,001%) обнаружить экдистероиды в каллусных культурах не'удалось. Исключение составляют каллусные линии, полученные из цветочных почек Р-З и Я-5. Хроматограмма каллусной культуры Р-б1 представлена на рис.8, как следует из хроматограммы, данная линия синтезирует неидентифицированное соединение, соответствующее

хроматографической области экдистероидов. Однако, получить дополнил \

тельную спектроскопическую информацию об этом соединении не удалось вследствие его низкого содержания, поэтому нет достаточных оснований относить его к классу экдистероидов.

3. Содержание экдистероидов в суспензионных культурах. Хроматограммы экдистероидов из суспензионных культур и

К?-2, находящихся в середине экспоненциальной фазы роста, представлены на рис.8. Для обеих лиш® характерен пик с № 9,3 мин. Данное соединение было препаративно выделено для его предварительной идентификации.

Так как анализируемое соединение получено в следовых количествах, отсутствовала возможность использования иной спектроскопической . информацией, кроме масс-спекгрометрии. Нами был произведен полный расчет масс-спектра с использованием понятий гомологических групп и ионных серий.

Сравнение ионных серий анализируемого соединения и данных, имеющихся в литературе, показало, что данное соединение не противоречит структуре циклических непредельных спиртов..

Наиболее вероятно, что анализируемый масс-спектр принадлежит соединению, гомологический ряд которого отсутствует в литературе. Исходя из этого нами проведен расчет ионной серии пяти экдистероидов:

интегристерона А, интегристерона В, 20-гидроксиэкдизона, 26-гидрок-сиэкдизона.

Сопоставление ионной серии анализируемого соединения и ионной серии экдистероидов дает их совпадение в пределах двух стандартных отклонений. Этот результат указывает на возможную идентичность структур анализируемого соединения и экдистероидов.

УФ-спектр анализируемого соединения (\max-220 нм; Хтз.х-270 нм), также не противоречит структуре экдистероидов. Несмотря на то, что большинство экдистероидов'имеют основную полосу поглощения в области 242 нм, известны экдистероиды с полосами поглощения в области 220 нм, например са1опуз1егопе. который, в отличие от других экдистероидов, имеет триен-оновую группировку.

Для установления точной структуры выделенного соединения необходимо привлечение других спектроскопических методов.

В культуре КЗ-1 не синтезируется экдистерон (20-гидроксиэкди-зон), характерный для интактных растений. Результаты по динамике синтеза обнаруженного экдистероида в суспензионной культуре РЗ-1 в цикле выращивания представлены на рис.9. Концентрацию данного соединения рассчитывали методом абсолютной калибровки по экдистерону. Максимальное содержание метаболита отмечено на 3 сутки культивирования - начало экспоненциальной фазы роста, затем его количество снижалось почти в 2 раза, и в период экспоненциальной фазы роста содержание данного соединения в клетках составляло 0,05 мг/г на 9 сутки и 0,06 мг/г на 12 сутки. В фазе деградации, на 14 сутки, концентрация метаболита в клетках К.-1 не превышала 0,006 мг/г. Таким образом, максимальный синтез данного метаболита в суспензионной культуре связан с началом экспоненциальной фазы роста.

В суспензионной культуре РЗ-2, наряду с неидентифицированным эк-дистероидом, синтезируется экдистерон (Рис.8). Количество синтезируемого клетками !?5-Я экдистерона сравнимо с его содержанием в интактных растениях.

Результаты по динамике синтеза экдистерона и неидентифицирован-ного соединения представлены на рис.9. -Максимальный и устойчивый ' синтез неидентифицированного метаболита соответствует экспоненциальной фазе роста культуры. Максимальное количество экдистерона синтезируется в середине экспоненциальной фазы роста культуры.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов показано, что б еуезшаиаиш культурах оинтеэмру&тея соединение, которое по предварительным данным можно отнести к классу экдистероидов. Данное

конц. ждист. иг/г

0.12 ' 0.1 -0.08 0.06 0.04 ■ 0.02 •

О

/Г

И

РЕ

Э сутки Я сутки 12 сутки

* I пз непдент. экдистероид

14 сутки

кони, ждист. иг/г

0.6 05 0.4 0.3 0.2 0.1 О

Ь сутки 9 сутки 13 еуткм 15 сутки . 17 сутки

< К Б-

/ - (Т1

МШ * —

К.Ж'З ждистерон • ЕЗ «вид. экдистероид

Рис.9. Синтез экдистероидов в 1^5—1, 2.

соединение содержится и в растениях, однако, основным экдистероидом интактных растений является экдистерон. Максимальное содержание эк-, дистерона характерно для молодых, активно функционирующих оргенов (весенние побеги, бутоны).

Каллусные культуры практически не синтезируют экдистероидов; принадлежность к экдистероидам- метаболита из каллусных культур Р-З и И-5 не доказана.

Линии суспензионных культур {£>-1 и 1?3-2 различаются по спектру синтезируемых экдистероидов; линия 1?3-1 не синтезирует экдистерон, содержание второго экдистероида в данной линии почти на порядок ниже по сравнению с ИЗ-2.

Максимальный синтез экдистероидов в суспензионных культурах и происходит в период экспоненциальной фазы роста.

ВЫВОДЫ

* £

1. Из разных эксплангов получен ряд каллусных культур №аропЫсит саг№ато1йез, отличающихся друг от друга по рс$зтовым и морфологическим характеристикам. Установлены условия каллусогенеза данного вида. Оптимальным соотношением фитогормонов для каллусогенеза является 2.4Д (1,0-1,5 мг/л) и БАЛ (0,2-0,5 мг/л). Лучшим типом эксплантов являются части стерильных проростков. Создана коллекция каллусных культур левзеи сафлоровидной, насчитывающая И линий.

2. Охарактеризованы 4 эпигенетически различные каллусные линии йчаропМсит .саг^атолс^з. Показаны различия в их морфологических' и ростовых характеристиках. Установлена неоднозначность влияния факторов культивирования (фитогормонов, углеводов, элементов минерального питания ипроксанолов) на рост и синтез предшественников экдистероидов (фитостеринов) в этих линиях. Степень воздействия фактора зави-сила как от особенности линии так и от специфики фактора.

3. Получены' две линии суспензионных культур клеток №арописитп саг^амяйеБ, изучены их ростовые, морфо-физиологические и биохимические характеристики. Установлены различия этих линий по указанным критериям. • Осуществлено культивирование суспензионных линий в барбо-тажном биореакторе. Обе линии суспензионных культур являются высокопродуктивными по биомассе (более 1,5'г/л за сутки).

4. Проведено определение качественного и количественного содержания фитостеринов в культурах клеток К^аропИсит саг^атоИеБ. Все культуры . содержат ситостерин, стигмастерян, кампестерин и холестерин.

Преобладающим стерином является си^зстерин. Показана стабильност качественного состава синтезируемых стеринов для разных линий, неза вйсимо от способа культивирования и факторов среды. Условия культи вирования изменяют количесвенное содержание и соотношение фитостери • нов.

5. Проведен анализ содержания экдистероидов в органах интактног растения, каллусных и суспензионных культурах клеток. Установлено что каллусные культуры синтезируют следовые количества экдистерои дов. Переход к глубинному типу культивирования сопровождается интея сификацией синтеза экдистероидов, ' при этом линии различаются по кг чественному составу экдистероидов. В обеих линиях синтезируется эк дистерсид, не являющийся основным для интактного растения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Алексеев И.Н., Володин В.В., Иванов А.Л., Коробейникова Г.Л., Носов A.M., Орлова И.В. • Экдистероиды из культуры клеток Rhaponticum carthamoides // Тез. докладов VII Всесоюзного Симпозиума "Инженерная энзимология". Москва, 1991, с.186.

2. Володин В.В., Иванов А.Л., Орлова И.В., Коробейникова Г.Л., Алексеев И.Н. Виды родов Rhaponticum и Symphytum - объекты, перспективные для биотехнологии //I Всесоюзный Симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1991, с.56.

3. Alexeev I.N., VolodinV.V., IvanovA.L., Korobejnikova G.L., Nosov A.M., Orlova I.V. Ecdysteroids from cell culture of Rhaponticum cartharnoIdes // Russian Biochemistry and Biotechnology v. 1, N 2/3, 1991, p.105.

4. Volodin V.V., Ivanov A.L., Korobejnikova a.L., Orlova I.V., Alexeev I.N. Rhaponticum and Symphytum spp. objects, prospective for biotechnology // Plant biotechnolojy and molecular blolojy. 1-st Symposium "Trends in Plant Biotechnolojy", 1991, p.157.

5. Орлова И.В., Носов A.M., Володин В.В., Иванов А.Л., Бугенко .Р.Г. Культура клеток Rhaponticum carthamoides, как перспективный продуцент экдистероидов //Труды Коми НЦ УрО РАН, Серия "Научные доклады", вып.306, Сыктывкар, 1992, 18 с.