Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ростовые и биосинтетические характеристики культур клеток Serratula coronata и Ajuga reptans - продуцентов экдистероидов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ростовые и биосинтетические характеристики культур клеток Serratula coronata и Ajuga reptans - продуцентов экдистероидов"

На правах рукописи

АНУФРИЕВА Эмилия Николаевна

удк 581.198;547.918

Ростовые и биосинтетические характеристики

культур клеток ЗЕПКАТШЛ СОТЮКЛТЛ и АЛЮЛ НЕРТЛ№ -продуцентов экдистероидов

Специальность 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии Института биологии Коми НЦ УрО РАН

Научные руководители: доктор биологических наук профессор

A.М.Носов,

кандидат химических наук

B.В.Володин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С.С. Шаин,

кандидат биологических наук Л.М. Гайворонская

Ведущая организация: Акционерное общество «Биохиммаш»

Защита диссертации состоится « 23 » апреля 1997 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета К 002. 45.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан «» марта 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук ./ М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Среди соединений специализированного обмена растений в последние годы особое внимание привлекают фитоэкдис-тероиды — полигидроксилированные стериньг, идентичные или структурно близкие с гормонами линьки и метаморфоза насекомых и ракообразных. Обнаруженные в растениях сравнительно недавно, эти соединения выделены из папоротникообразных, голосеменных и цветковых растений, а также из некоторых водорослей и грибов. Несмотря на широкую распространенность в растительном мире и большое разнообразие химических структур, физиологические функции фитоэкдистероидов до конца не выяснены, а биосинтез и метаболизм практически не изучен. Так как культуры клеток и тканей высших растений традиционно используются в фундаментальных исследованиях в качестве моделей для изучения различных аспектов вторичного метаболизма, теоретически разработаны и реализованы подходы к получению культур клеток со стабильным уровнем биосинтеза, создание адекватных экспериментальных систем для углубленного исследования биосинтеза фитоэкдистероидов и механизмов его регуляции представляет научный интерес.

Получение культур клеток экдистероидсодержащих растений, имеющих разное систематическое положение, также имеет теоретическое значение, так как дает возможность изучить в сравнительном аспекте физио-лого-биохимические закономерности существования их как самостоятельных биологических систем и выявить различия их характеристик, обусловленные видовыми отличиями культур.

И наконец, растения-продуценты экдистероидов имеют практическую значимость. В частности, серпуха венценосная (БеггаШа согопШа Ь., А.^егасеае) и живучка ползучая (Ajuga гер1ат Ь., Ьатгасеае) -— лекарственное растопил, издавна используемые в народной медицине. Обнаруженные в них экдистероиды обладают широким спектром биологической активности: анаболической, адаптогенной, тонизирующей, антиоксидантной. Ряд экдистероидов этих растений проявляют гормональную активность в отношении насекомых и могут служить источником гормональных препаратов для научгшх исследований. Поскольку природные запасы этих растений недостаточны, технология выделения экдистероидов из растительного сырья сложна, а стоимость коммерческих препаратов очень высока, то получение культуры клеток как альтернативного источника биологически активных экдистероидов может оказаться целесообразным.

Цель исследования — изучение закономерностей биосинтеза экдис-тероидов в каллусных культурах серпухи венценосной и живучки ползучей.

Задачи исследования:

— получение стабильных каллусных культур серпухи венценосной и живучки ползучей из различных типов эксплантов индивидуальных растений, культивируемых in vitro;

— изучение влияния различных факторов на эффективность каллусо-генеза и рост полученных каллусных культур;

— определение качественного и количественного состава экдистеро-идов в интактных растениях серпухи венценосной и живучки ползучей in vivo и в условиях in vitro;

— определение качественного и количественного состава экдистеро-идов в каллусных культурах серпухи венценосной и живучки ползучей и зависимости биосинтетической активности культур клеток от генетических и эпигенетических особенностей эксплантов;

— изучение влияния факторов культивирования (гормональных, трофических) и условий культивирования (световой режим) на рост и биосинтез экдистероидов в полученных каллусных культурах.

Положения, выносимые на защиту.

1. Возможность эффективного биосинтеза экдистероидов в недифференцированных культурах клеток серпухи венценосной и живучки ползучей — растений с высоким содержанием этих вторичных метаболитов.

2. Большая значимость для продуцирования экдистероидов в культурах клеток генотипа исходного растения, но не эпигенетических свойств эксплантов.

3. Возможность изменения качественного состава экдистероидов в культурах клеток относительно интактных растений. Вероятность как отсутствия некоторых метаболитов интактного растения, так и появления экдистероидов, нехарактерных для вида.

4. Количественное содержание экдистероидов в каллусных культурах может быть ниже, чем в интактных растениях (серпуха венценосная) или оставаться на уровне интактных растений (живучка ползучая). Существует тенденция к ослаблению биосинтетической активности с увеличением продолжительности культивирования каллусных тканей.

5. Возможность физиологической регуляции процессов роста и синтеза экдистероидов в культурах клеток, видовая и штаммовая специфичность в отношении реакции на факторы культивирования.

Научная новизна работы. Впервые получены каллусные культуры серпухи венценосной и живучки ползучей с высоким содержанием экдис-

тероидов и выявлена штаммовая специфичность у каллусных тканей, индуцированных из разных эксплантов разных донорных растений. Создана коллекция каллусных культур этих растений.

Впервые изучен качественный и количественный состав экдистерои-дов в культурах клеток серпухи венценосной и живучки ползучей в сравнении с интактными растениями in vivo и in vitro и выявлена зависимость биосинтетической активности культур клеток от генотипа исходного растения.

Установлено, что в каллусных культурах серпухи венценосной сохраняется способность к синтезу основных экдистероидов интактных растений, таких как 20-гидроксиэкдизон, инокостерон и экдизон. Спектр экдистероидов в культивируемых клетках изменяется: появляется нетипичный для растений метаболит и не обнаруживается макистерон А. Содержание экдистероидов по сравнению с интактными растениями существенно снижается.

В каллусных культурах живучки ползучей доминирующими экдисте-роидами, так же как и в интактных растениях, являются 29-норциастерон и 29-норсенгостерон. Для этой культуры различия в спектре экдистероидов по сравнению с интактными растениями достоверно не установлены. Получены культуры клеток живучки ползучей с равноценным с интактными растениями уровнем синтеза экдистероидов.

Показана возможность физиологической регуляции процессов роста и синтеза экдистероидов в культурах клеток изучаемых видов и выявлены видоспецифические и штаммоспецифические отличия у культур клеток в отношении реакции на одинаковые факторы культивирования.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований получены сведения о составе, содержании и закономерностях синтеза экдистероидов, необходимые для практического использования культур клеток Scrrntub] corcr.ata;; Ajugu repians. Ряд каллусных штаммов с высоким и стабильным содержанием фитоэкдистероидов можно рассматривать как перспективный исходный материал для получения суспензионных культур и создания на их основе линий-продуцентов ценных соединений для медицины, косметики, ветеринарии, а также гормональных препаратов для разведения полезных насекомых и научных исследований в области биохимии и физиологии беспозвоночных животных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XI международном совещании по экдизонам (Чешске Будейовице, 1994), научной конференции молодых ученых Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 1995), III Российском симпозиуме "Новые методы био-

технологии растений" (Пушило, 1995), XII международном совещании по экдизонам (Барселона, 1996), международном совещании по фитоэкдис-тероидам (Сыктывкар, 1996), научной сессии Института биологии Коми НЦУрО РАН (Сыктывкар, 1997).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 166 наименований, из них 101 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования являлись интактные растения, стерильная культура растений и каллусные культуры Serratula coronata и Ajuga reptans.

Растения S. coronata L. выращены в Ботаническом саду Института биологии Коми НЦ Уро РАН. Растения Ajuga reptans L. собраны в естественном местообитании в средней тайге Республики Коми.

Стерильные растения и каллусные культуры Ajuga reptans получены автором, соответствующие культуры Serratula coronata — в соавторстве с к.б.н. JI.A. Ковлер.

Получение стерильной культуры растений. Продезинфицированные семена, прошедшие стратификацию, проращивали в асептических условиях. Стерильные проростки высаживали на агаризованную среду Мура-сиге-Скуга (МС) с 30 г/л сахарозы и выращивали до ювенилыюго состояния при 23-25°С и освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 4500 люкс и фотопериодом 16 час/сут. Микроклональное размножение осуществляли микрочеренкованием и методом индукции адвентивного побегообразования.

Получение каллусных культур. В качестве эксплантов использовали корни, гипокотили, стебли, семядольные листья, черешки и листовые пластинки донорных растений, культивируемых in vitro. Экспланты помещали на поверхность агаризованной среды МС, содержащей 30 г/л сахарозы, витамины по Стаба и различные комбинации фитогормонов. Культивирование проводили в темноте при температуре 25±1°С и влажности воздуха 60%. Процент каллусогенеза определяли как число эксплантов, образовавших первичный каллус, от общего количества использованных эксплантов.

Морфо-физиологические характеристики каллусных культур. Каллус-ные культуры характеризовали по морфологическим признакам (цвет, кон-

систенция); рост оценивали по приросту сырой и сухой массы и выражали индексом роста — величиной отношения разности конечной и первоначальной массы к исходной массе каллуса: 1= (т^т^/гг^.

Анализ экдистероидов. Для анализа использовали высушенный при 60°С растительный материал и биомассу клеток. Первичную экстракцшо экдистероидов осуществляли метанолом. Перед анализом микропроб методом ВЭЖХ очистку экстрактов проводили на концентрирующих патронах Диапак С16 (БиоХимМак, Россия).

При выделении экдистероидной фракции из биомассы каллусных тканей экстракты последовательно обрабатывали н-гексаном и хлороформом, а затем хроматографировали на колонке, заполненной сорбентом Диа-'сорб 130 С16 (БиоХимМак), элюирование проводили в системе метанол-вода со ступенчатым градиентом (1:20 — 7:10).

Аналитическую тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли на пластинках с силикагелем Silufol (Чехия) или Sorbfil (Россия) в системе растворителей хлороформ:метанол 2:1 и 4:1 (v/v). Пластинки просматривали в УФ-свете (Д=254 нм).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили:

а) на хроматографическом оборудовании производства ЧСФР: насос НРР 4001, детектор UV-VIS LCD 2536, Х=254 нм. Колонка Диасорб 130 С16Т, 6 мкм, 250x4 мм (БиоХимМак). Элюент — вода:ацетошприл:тетра-гидрофуран 100:16:4 (v/v/v), скорость элюирования 0.7 мл/мин (система 1);

б) на хроматографическом оборудовании Applied Biosystems Inc.: колонка LiChroCart, 125x4 мм, сорбент LiChrospher 100 RP-18, 5 мкм (Merk), предколонка типа Bondapak С-18, 10 мкм, 24x4 мм. Условия изократиче-ские, температура 55°С, элюент вода:изопропанол 10:1 (v/v), скорость элюирования 1 мл/мин (система 2).

в) на приборе Миллихром (Россия): колонка Силасорб С 600, 5 мкм, 80x2 мм (БиоХимМяк), ?.—2'10 элюент ллороформ:метанол 4:1 (v/v), скорость элюирования 50 мкл/мин (система растворителей 3);

б) на оборудовании DuPont Instruments (Франция): система контроля 8800, УФ-детектор модель 850, Л.=254, колонка Zorbax-Sil, 250x4,6 мм (DuPont), элюент дихлорметан:изопропанол:вода 125:30:2 (v/v/v), скорость элюирования 1 мл/мин (система растворителей 4) и циклогек-сан:изопропанол:вода 100:40:3 (v/v/v), скорость элюирования 1 мл/мин (система растворителей 5).

Идентификацию соединений осуществляли по времени удерживания в сравнении с стандартными экдистероидами. Количество компонентов рассчитывали методом абсолютной калибровки по соотношению на хро-

матограммах площадей пиков точных концентраций стандартов и анализируемых соединений (система 1).

Иммуноферменгный анализ (ИФА) экдистероидов выполняли по методике, разработанной Поршероном с коллегами [Porcheron et al, 1989] в модификации Дельбека [Gliscynski et al, 1995].

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием пакета программ StatView на персональном компьютере Macintosh Classic.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Закономерности каллусогенеза Serratula coronata и Ajuga reptans.

1. Влияние фитогормонов на каллусогенез

Для индукции каллусообразования у Ajuga reptans были испытаны несколько вариантов фитогормонов. На среде с 2,4-Д, 1 мг/л + БАП, 0,2 мг/л у всех типов эксплантов первичный каллус в большинстве случаев был рыхлым, оводненным, легко отделялся от эксплантов и переходил к активному росту на среде. Однако, у ряда первичных каллусов появлялись признаки корневой дифференциации, по-видимому, в результате действия эндогенной ИУК эксплантов.

На средах с НУК,1 мг/л + БАП, 0,2 мг/л-и НУК, 1 мг/л + тидиазурон, 0,002 мг/л независимо от типа экспланта образовывался плотный нежизнеспособный каллус. На этих средах каллусообразование сопровождалось интенсивным стеблевым и корневым морфогенезом.

У Serratula coronata на среде с 2,4-Д, 1 мг/л + БАП, 0,2 мг/л из всех типов эксплантов образовывался рыхлый оводненный первичный каллус без единого случая морфогенеза.

У стерильных проростков БАП, 1 мг/л индуцировал образование ор-ганогешюго каллуса на корнях (A. reptans) и нижней части стебля (A. reptans и S. coronata), из которого регенерировали побеги.

Таким образом, у обоих видов сочетание 2,4-Д + БАП оказалось наилучшим для каллусогенеза у всех типов эксплантов.

Оптимальным сочетанием фитогормонов для поддержания устойчивого роста каллусных тканей A. reptans является комбинация 2,4-Д, 1 мг/л +ИУК, 1 мг/л + БАП, 0,2 мг/л, для S. coronata — 2,4-Д, 1 мг/л + БАП, 0,2 мг/л. Интервал субкультивирования у A. reptans — 16-18 суток, у S. coronata — 24-28 суток.

2. Влияние типа экспланта на каллусогенез.

Первичный каллус получен из всех типов эксплантов. У A. reptans наибольшую способность к каллусогенезу проявили корневые, гипо-котильные и стеблевые экспланты (% каллусогенеза — 100). Несколько хуже каллусообразование происходило на эксплантах семядольных листьев (88%), черешков (83%) и листовых пластинок (75%).

У S. coronata наибольшее число первичных каллусов образовалось из эксплантов корней (99%). Частота образования каллуса из эксплантов ги-покотилей, настоящих и семядольных листьев составила соответственно 91%, 89% и 77%.

Таким образом, у обоих видовустановлена высокая эффективность каллусогенеза при использовании в качестве исходного материала стерильных растений, при этом частота каллусообразования зависит от типа экспланта.

Охарактеризовано 55 штаммов каллусных культур S. coronata и 30 штаммов каллусных культур A. reptans. Тип экспланта оказывает существенное влияние на морфо-физиологические характеристики полученных каллусных культур (таблица 1).

Таблица 1

Характеристики каллусных культур Ajuga reptans и Serratula coronata

Штамм Тип экспланта Консистенция Цвет Индекс роста

по сырой массе по сухой массе

Aiusa reptans

AIP Чашелистик Рыхлый, оводненный Зеленоватый 8.4440.60 7.73+0.56

AIR Корень Рыхлый Белый 13.34+1.0 1327+1.0

AHÍ Гипокотиль Рыхлый, оводненный Белый 8.08+0.56 7.93+0.58

CVIS Стебель Оподнен. Зеленоватый 7.70+0.45 7.79+0.40

CVIIL Лист Плотный Серов. 4.57+0.32 5.96+0.45

EIVR Корень Рыхлый, оводненный Белый ll.08t0.86 10.18-i0.75

Serratula coronata

С1П2.1 Лист Плотный, гетероген. Белый с желт. 7.92+0.64 9.64+0.70

cm 1.2 Семяд. лист Рыхлый Белый 13.93+0.66 12.48+0.47

AI2.2L Лист Рыхлый Бельм с желт. 11.13+0.76 11.27+0.80

AI1.8R Корень Плотный Белый 5.15+0.46 6.42+0.54

АИ.5С Семяд. лист Оводнен. 9 Желт. 10.95+0.30 8.63+0.34

Состав и содержание экдистсроидов в растениях и культурах клеток Serratula coronata и Ajuga reptans

1. Содержание экдистероидов в плантационных растениях Serratula coronata L. и растениях, культивируемых in vitro

Определяли качественный и количественный состав экдистероидов в различных органах плантационных растений на разных фазах развития, а также в корнях и листьях стерильных растений.

Во всех органах плантационных растений S. coronata обнаружено несколько экдистероидов, среди которых соединения с установленной структурой ■— 20-гидроксиэкдизон, инокостерон, макистерон А и экдизон (рис. 1 А). Основным экдистероидом в интакгных растениях является 20-гидроксиэкдизон. Его содержание варьировало в зависимости от органа и фазы развития растений от 0.008% до 1.7%. Высокие концентрации экдистероидов зафиксированы в молодых отрастающих весенних побегах, а также в листьях и цветоносах растений в фазу бутонизации (таблица 2). С развитием растений происходит накопление экдистероидов в репродуктивных органах и семенах, а в стареющих органах и тканях их содержание снижается. В стерильных ювенильных растениях выявлены только 20-гидроксиэкдизон и инокостерон, их концентрация варьировала от 0.002 до 0.009% от сухой массы.

Таблица 2

Динамика содержания экдистероидов в органах Serratula coronata L. в зависимости от фазы развития (% от сухой массы )

Орган растения 20-гидроксиэкдизон Инокостерон Макистерон А Экдизон

Вегетативная фаза

Лист 1.522 0.095 0.015 0.053

Корень 0.032 0.010 0.002 0.006

Фаза бутонизации

Корень 0.276 0.082 0.014 0.038

Стебель 0.640 0.112 Следы 0.120

Лист 1.704 0.208 0.020 0.254

Цветонос 1.392 0.216 Следы 0.210

Обертка бутона 0.416 0.090 Следы 0.038

Цветки бутона 0.052 Следы Следы Следы

?

г *

o io го зо <о

«рем» удерж»»»»"". иия

О 10 20 30 40

У

10 ЯО Я 40

IZ

I:

И

ш а

1Д..

»им****

Рис. 1. Хроматограммы экстрактов листьев интактных растений (А) и каллусных культур (Б) сотопШа и корней стерильных растений (В) и каллусной ткани (Г) Л. гсршп& 1 — 20-гидроксиэкдизон, 2 — инокосте-рон, 3 — макистерон А, 4 — экднзон, 5 — 29-норциастерон+29-норсенго-стерон, 6 — аюгалактон, 7-12 — неидентифнцированныс экдистероиды

2. Содержание экдистероидов в каллусных культурах Serratula coronata

Качественный состав. Методом ТСХ метанольных экстрактов из каллусных тканей выявлено нескольких зон с флуоресценцией, типичной для экдистероидов. Методом ВЭЖХ (система 1) проанализировано 55 каллусных культур S. coronata. На седьмом-восьмом пассаже во всех каллусных тканях обнаружены 20-гидроксиэкдизон, инокостерон, экдизон и ряд не-идентифицированных соединений. Основным компонентом в каллусных культурах оказался метаболит, не характерный для плантационных и клонируемых in vitro растений, и в то же время в каллусах не обнаружен ма-кистерон А (рис.1 Б). При добавлении к каллусным экстрактам стандарт-пых образцов 20-гидроксиэкдизона, инокостерона и экдизона на хрома-тограммах увеличивались пики, соответствующие этим соединениям тогда как при добавлении макистерона А, циастерона и 2-дезоксиэкдизона появлялись дополнительные пики.

Определение экдистероидного профиля очищенного экстракта из биомассы каллусных тканей, проведенное одновременно в условиях обращен-но-фазовой (система 1) и нормально-фазовой ВЭЖХ (системы 3 и 4), подтвердило наличие 20-гидроксиэкдизона и экдизона. Следует отметить, что в условиях нормально-фазовой хроматографии полного разделения 20-гидроксиэкдизона, инокостерона и основного неидентифицированного метаболита добиться не удавалось.

УФ-спектры анализируемых соединений не противоречат структуре экдистероидов: максимумы поглощения, установленные для этих соединений, приходятся на X 240 нм, что совпадает с основной полосой поглощения экдистероидов.

При сочетании ВЭЖХ разделения с ИФА метаболиты из каллусных культур S. coronata оказались иммунореактивными с 20-гидроксиэкдизо-ном.

В совокупности полученные данные подтверждают принадлежность метаболитов из каллусных тканей S. coronata к классу экдистероидов. Однако, для установления точной структуры выделенных соединений необходимо привлечение спектроскопических методов анализа.

Характеризуя качественный состав экдистероидов культуры клеток серпухи венценосной, можно отметить, что дедифференцированиые клетки сохранили способность к продуцированию ряда экдистероидов, типичных для целого растения (20-гидроксиэкдизон, инокостерон и экдизон). Спектр экдистероидов в культуре ткани изменился: появился нехарактерный для интактных растений неидентифицированный метаболит, не обнаружен макистерон А. Спектр синтезируемых экдистероидов в каллусах

шире, чем в исходных донорных растениях. Качественный состав основных экдистероидов во всех штаммах одинаков.

Количественное содержание. Содержание экдистероидов в каллусных тканях разного происхождения представлено в таблице 3; приведены результаты анализа средней пробы из 30-40 каллусов в конце цикла культивирования в трех аналитических повторностях, штаммы анализировали на седьмом-восьмом пассаже. Концентрацию неидентифицированных метаболитов Ет и Ес рассчитывали соответственно по макистерону А и циасте-рону на основании близости ^ этих соединений при ВЭЖХ-разделении.

Суммарное содержание экдистероидов в каллусных культурах варьировало от 0.3 до 3.4 мг/г сухой массы клеток. Наибольшие различия в содержании экдистероидов выявлены у каллусов, полученных из разных донорных растений. Как правило, у родственных каллусов уровень синтеза отличался не столь значительно (рис. 2).

Al А VIII ВIX В XIV CHI Dill Ell Gl

Каллусные штаммы

Рис. 2. Вариабельность суммарного содержания экдистероидов в каллусных культурах.?. coronata, полученных из донорных растений

AI, AVIII, BIX, BXIV, CHI, DIU, Ell, и Gl Каллусы: к — корневой, л •— листовой, ч — черешковый, г — гипо-котильный, с — семядольный.

Способностью продуцировать экдистероиды обладали все каллусные ткани, независимо от типа исходного экспланта. Штаммы, полученные из однотипных эксплантов разных донорных растений, проявили значи-

тельную вариабельность как по суммарному содержанию, так и по соотношению индивидуальных компонентов (таблица 3). Основным экдистерои-дом у всех обследованных каллусных культур был неидентифицирован-ный метаболит Ет. На принятом в эксперименте уровне чувствительности (0,001%) у многих штаммов с невысоким уровнем синтеза экдистероидов не удавалось обнаружить экдизон.

Таким образом, выявлены значительные различия у штаммов по содержанию экдистероидов и соотношению индивидуальных компонентов. Доминирующим соединением у всех каллусных тканей оказался неиден-тифицированный метаболит, нетипичный для интактных растений. Концентрация экдистероидов в каллусах была выше, чем в донорных растениях in vitro, но значительно ниже, чем в плантационных растениях S. coronata. Несмотря на то, что количественное содержание экдистероидов в каллусах не коррелировало с их концентрацией в донорных растениях, показана большая значимость для биосинтеза этих соединений в культуре клеток генотипа исходного растения, но не эпигенетических свойств эксплантов.

Таблица 3

Содержание экдистероидов в каллусных штаммах Serratula coronata, полученных из донорных растений AI, BXI, Ell и Gl (мг/г массы сухого вещества)

Штамм Тип эксплшгта 20-гидро-ксиэкдизон Иноко-стерон Em* Ее* Экдизон

AI 1.5 С Семяд. лист 0.10 0.10 1.50 0.14 0.14

AI 1.6Р Черешок 0.17 0.13 0.71 0.17 0.39

AI 1.8 R Корень 0.24 Следы 0.57 0.31 0.22

A I 2.2 L Лист 0.18 Следы 1.05 0.23 0.59

Ell 1.1 С Семяд. лист 0.05 0.05 0.55 0.05 0

Ell 1.2 H Гипокотиль 0.02 0.03 0.45 0.03 0

Ell 1.3 R Корень 0.09 0.14 0.63 0.10 0

В XI 1.1 R Корень Следы 0.09 0.20 0.03 0

BXI 1.2 L Лист Следы 0.12 0.20 0.01 0

BXI 1.3 С Семяд. лист Следы 0.12 0.21 0.01 0

Gl 1.1 H Гипокотиль 0.23 0.24 1.00 0.19 0.06

Gl 1.2 С Семяд. лист 0.03 0.17 1.15 0.26 0.51

Em* и Ее** — неидентифицированные метаболиты

Стабильность содержания экдистероидов во всех каллусных культурах определяли на протяжении периода исследования (3 года) а также в цикле выращивания в культуре семядольного (штамм CIII 1.2С) и гипоко-тильного (штамм AVIII 1.2Н) каллусов.

Содержание экдистероидов у обоих штаммов в цикле культивирования изменялось незначительно (коэффициент вариации 23 и 27% соответственно). У гипокотилыюго каллуса отмечено снижение уровня синтеза экдистероидов в заключительной фазе ростового цикла, что, возможно, связано с более быстрым старением этой культуры.

Суммарное содержание экдистероидов у штамма CIII 1.2С было относительно стабильным (коэффициент вариации 28%) на протяжении 24 пассажей, у штамма AVTII 1,2Н — на протяжении 16 пассажей, в дальнейшем наблюдалась тенденция к ослаблению биосинтетической активности. К концу третьего года культивирования содержание экдистероидов в каллусных культурах снизилось в 4 раза (рис. 3).

S.coronata (CIII 1.2С)

i S * *

0.9 0.8 0.7 0,6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 \

JLjL г*

■ 20-гидроксиэкдизон □ инокостерон

■ кеиденгиф экдистерсмд Em а неидектиф.экдистероид Ее О экдизон

8 16 24

Номер пассажа

A.reptans (С VI S)

■ 20-гидроксиэкдизон

□ 29-норциастерон+29-норсенгостерон

■ неиндентиф.экдистброид

27

Номер пассажа

Рис.3. Содержание экдистероидов в каллусных культурах в зависимости от продолжительности культивирования

С увеличением продолжительности выращивания культур соотношение индивидуальных экдистероидов в клетках изменялось. На раших пассажах в каллусных культурах абсолютно доминировал неиденифициро-ванный метаболит Ет, с возрастом культуры содержание ощутило снизилась. Напротив, содержание 20-гидрокси-экдизона и инокостерога в культуре клеток в течение двухлетнего периода несколько повысилось.

Таким образом, в цикле выращивания культуры содержание экдистероидов в каллусах S. coronata было достаточно стабильным, а при длительном культивировании тканей отмечалась тенденция к снижению содержания этих метаболитов.

3. Состав и содержание экдистероидов в дикорастущих растениях Ajuga reptans L. и растениях, культивируемых in vitro

По данным ВЭЖХ-анализа (системы 1 и 2), в дикорастущихрастени-яхА. reptans L. обнаружены 20-гидроксиэкдизон, 29-норциастерон, 29-нор-сенгостерон, аюгалактон и ряд неидентифицированных соединешй.

Качественный состав основных экдистероидов в разных органах растений был одинаковым. Доминировали 20-гидроксиэкдизон, 29-норциас-терон и 29-норсенгостерон. Самое высокое содержание экдистероидов в фазе цветения зафиксировано в листьях, соцветиях и цветках, а амое низкое — в корнях (таблица 4).

Таблица 4

Содержание экдистероидов в различных органах дикорастущих растений А]и%а гер1ат Ь. (% от сухой массы)

Орган растения Сумма экдистероидов 20-гидроксиэкдизон 29-норциа-стерон+29-норсенго-стсрон Неиденти-фицирован- ный мстаболет .Аогалактон

Корень 0,071 0,022 0,036 0 0,013

Стебель 0,147 0,074 0,059 0,014 Следы

Лист 0,265 0,083 0,177 0,005 Следы

Генеративный побег 0,139 0,032 0,079 0,017 0,011

Соцветия, цветки 0,363 i 0,070 0,255 0,013 0,025

В отличие от генеративных особей, у ювенильных растенга, клонируемых in vitro, содержание экдистероидов в корнях было значительно выше, чем в листьях, а доминировали 29-норциастерон и 29-норсенгосте-рон (рис. 1 В).

Суммарная концентрация экдистероидов в растениях 10 различных клонов варьировала от 0,015% до 0,1% от сухой массы, при этом уровень синтеза был самым высоким у растений клонов СУ1 и Е1У

4. Содержание экдистероидов в каллусных культурах А. гер1апч

Качественный состав. Методом ВЭЖХ (система 1) проанализировано 20 каллусных культур. Экдистероидный профиль у всех штаммов оказался сходным и включал 20-гидроксиэкдизон, 29-норциастерон, 29-норсенгос-терон и несколько неидентифицированных соединений (рис. 1 Г).

Подтверждение экдистероидной природы метаболитов культуры клеток получено в системах 2 и 4: сопоставление ВЭЖХ-профилей очищенного экстракта из биомассы клеток и экдистероидной фракции из растительного материала показало совпадение времени удерживания у ряда соединений.

Метаболиты из каллусных тканей Л. гер1ат были иммунореактивными с 20-гидроксюкдизоном в ИФА. И хотя антисыворотка АБ4919 слабо реагировала с лактонсодержащими экдистероидами, характерными для этого вида, тем не менее, совпадение пиков иммунореактивных соединений при ВЭЖХ-разделении компонентов очищенного каллусного экстракта и экдистероидной фракции из растительного материала свидетельствует о принадлежности метаболитов культуры клеток к классу экдистероидов.

Как следует из полученных результатов, каллусные ткани А. гер1ат продуцируют экдистероиды, свойственные интактным растениям — 20-гид-роксиэкдизон, 29-норциастерон, 29-норсенгостерон и ряд неидентифицированных соединений. На данном этапе исследования для этой культуры различия в спектре экдистероидов по сравнению с интактными растениями достоверно не установлены.

Количественный состав. Результаты количественного анализа экдистероидов культуры клеток Л. гер1ат представлены в таблице 5.

Выявлена значительная вариабельность каллусных тканей по количественному составу искомых метаболитов и их соотношению. Самое высокое содержание этих соединений зафиксировано у каллусных культур, полученных из растений клонов СУ1 и Е1У, которые отличались более высоким уровнем синтеза по сравнению с другими клонами. И все же по содержанию экдистероидов эти штаммы клеток в несколько раз превосходили самые продуктивные донорные растения и не уступали растениям, произраставшим в естественных условиях.

Таблица 5

Содержание экдистероидов в каллусных культурах Ajuga reptans (в мг/г сухой массы)

Штамм Тип экспланта Сумма экдистероидов 20-гидрокси-экдмзои 29-норциасте-рон+29-нор-сенгостерон Неицеитифи-цированиый метаболит

A I S Стебель 1,44 0,02 0,94 0,48

A I Р Чашелистик 1,04 0,02 0,78 0,24

AIН Гипокотиль 1,17 0,03 0,86 0,28

AIR Корень 0,76 0,02 0,55 0,19

CIVS Стебель 3,49 Следы 2,61 0,88

С VIP Чашелистик 6,24 0,04 4,62 1,58

CVIS Стебель 4,67 0,09 3,13 1,46

CVIH Гипокотиль 2,37 0,04 1,96 0,37

EIVR Корень 5,44 0,05 3,43 1,96

EIVH Гипокотиль 2,58 0,04 1,62 0,92

Несмотря на то, что корреляция между количественным содержанием экдистероидов в стерильных растениях и полученных из них каллусных тканях отсутствовала, биосинтетическая активность каллусных культур A. reptans зависела от генотипа исходных растений в большей степени, чем от эпигенетических особенностей экешуштов. Во-первых, каллусы, полученные из однотипных эксплантов разных донорных растений, сильно различались по содержанию индивидуальных экдистероидов. Во-вторых, доминирующими соединениями у всех тканей независимо от происхождения были 29-норциастерон и 29-норсенгостерон. В-третьих, несмотря на то, что в корнях донорных растений концентрация экдистероидов была значительно выше, чем в стеблях, черешках и листьях, каллусные ткани корневого происхождения не отличались повышенным уровнем синтеза.

Стабильность содержания экдистероидов. У всех каллусных культур с увеличением продолжительности культивирования происходило постепенное снижение уровня биосинтеза, при этом соотношение индивидуальных экдистероидов, характерное для каждого штамма, оставалось постоянным (см. рис. 3).Содержание экдистероидов в культуре стеблевого каллуса CVIS при стандартных условиях культивирования в течение двухлетнего периода было более стабильным (коэффициент вариации 31%), чем у стеблевого каллуса CIVS и корневого каллуса EIVR (коэффициенты вариации соответственно 52% и 58%).

Влияние факторов культивирования на рост и накопление экдисте-роидов в каллусных культурах Serratula coronata и Ajuga reptans

1. Влияние углеводов на рост и накопление экдистероидов в ¡саллус-ных культурах Serratula coronata и Ajuga reptans

Галактоза оказалась неспособной поддерживать рост культуры клеток S. coronata, оказывая токсическое действие на ткани. В то же время культура клеток А. reptans утилизировала галактозу так же успешно, как сахарозу и глюкозу (рис.4 А).

С повышением концентрации сахарозы в среде на 50% и 100% в культурах семядольного (CHI 1.2С), листового (CHI 1.2L) и гипокотильного (AVIII 1.2Н) каллусов S. coronata увеличивалась сухая масса клеток, но при этом содержание экдистероидов снижалось в зависимости от штамма на 25-50%. Поскольку снижение концентрации экдистероидов в клетках компенсировалось повышением продуктивности культур по биомассе, продуктивность по целевым продуктам оставалась на уровне, характерном для контрольного варианта. В отличие от листового каллуса, на среде с глюкозой интенсивность роста и содержание экдистероидов у семядольного каллуса были ниже, чем на среде с сахарозой. Несмотря на подавление роста на среде с глюкозой уровень биосинтеза экдистероидов у гипокотильного каллуса оставался таким же, как в контроле.

Таким образом, влияние различных источников углеводного питания на рост и содержание экдистероидов в каллусных культурах S. coronata и А. reptans специфично и зависит от видовой принадлежности культуры и индивидуальных особенностей штаммов.

2. Влияние элементов минерального питания на рост и накопление 31:д!1СТррг>иггоп в культурах клеток Serratula coronata и Ajugareptans

Количество экдистероидов, синтезируемых клетками S. coronata, варьировало в зависимости от полноценности азотного питания сильнее, чем ростовые параметры культуры. Так, достоверное подавление роста отмечено только на среде, содержавшей половинную по сравнению с контролем дозу NOj" (20 мМ); общее содержание азота в среде 40 мМ, NH4+: N03~ = 1:1. На этой среде индексы роста по сырой и сухой биомассе у всех штаммов снизились в 2 раза, концентрация экдистероидов в клетках была достоверно ниже, чем в контроле (Р<0.05).

При общем уменьшении концентрации азота в среде до 40 мМ (NH4+: N03"=l:3) и до 30 мМ (NH4+: N03"= 1:2) содержание и, соответственно,

S.Coronata (CIN 1.2C)

A-reptans (CVIS)

Cax 30 Cax 45 Cax 60 Гл 30 Гал 30

Углеводы, г/л

Углеводы, г/л

S.coronata (CHI 1.2С)

10+30 20+20

NH4* + N03-, mM

20+40

0 8 и Индекс роста по сырой кассе

I Q Индекс роста по сухой массе 0 6

Содержание экдистероидов (мг/г сухой массы)

S.coronata (AVIII 1.2Н)

A.reptans (EIVR)

2.4-Д НУК И УК ИМК

Ауксины

Ауксины

2.4

2.4 Д

Рис. 4. Влияние факторов культивирования на рост и накопление экдистероидов в каллусных кулыурах ЯеггШиШ согопа1а и Агер(апм А — сахара, Б — источников азота, В — фнтогормонов.

продуктивность по экдистероидам у семядольного каллуса CHI 1.2С снижались по сравнению с контролем на 30-45% (Р<0,05), у листового каллуса CIII2.IL на 50-60%. У гипокотильного каллуса AVIII 1.2Н эти изменения были недостоверными (Р>0,05).

Таким образом, оптимальной для роста и биосинтеза экдистероидов в культуре клеток S. coronata является среда, в которой содержится 60 мМ общего азота при соотношении аммонийной и нитратной форм 1:2. Существенным фактором, влияющим на рост, является соотношение аммонийного и нитратного азота — 1:2 или 1:3 благоприятно для роста, а при соотношении 1:1 рост ингибируется (рис. 4 Б).

Влияние различных концентраций фосфата в питательной среде на рост и содержание экдистероидов в культурах клеток X coronata и А. reptans в целом было сходным. Снижение дозы фосфата до 10% от нормы лимитировало рост культур и способствовало более раннему переходу их в стационарную фазу. На среде с половинной дозой фосфата интенсивность роста и характер ростовой кривой у каллусных культур S. coronata существенно не отличились от контроля. Очевидно, при выращивашга на стандартных средах клетки поглощают не весь фосфор из среды. Напротив, у культуры клеток А. reptans такая доза лимитировала рост. Повышение дозы фосфата на 50 и 100% стимулировало рост, но существенно не влияло на характер ростовой кривой. Варьирование концентрации фосфора в среде не оказывало существеннего влияния на уровень синтеза экдистероидов в каллусных культурах изученных видов.

3. Влияние фитогормонов на рост и накопления экдистероидов в кал-

лусных культурах Serratula coronata и Ajuga reptans

Каллусные культуры S. coronata, оказались способными расти на сре-

дах с 9,4-Л. НУ К, ИУК и ИМК, однако реакция на ауксины разного химического строения у разных штаммов была неоднозначной. У семядольного каллуса CHI 1.2С при замене 2,4-Д на НУК, ИУК и ИМК ухудшались мор-

фологические характеристики: снижалась оводненность, период жизнеспособности клеток сокращался. Тем не менее, эти ауксины не оказывали существенного влияния на накопление экдистероидов.

У листового каллуса CIII2.IL интенсивность роста и содержание экдистероидов на всех средах были одинаковы (Р>0.05).

У гипокотильного каллуса AVIII 1.2Н прирост сырой биомассы на контрольной среде был в 2 раза выше, чем на средах с НУК, ИУК и ИМК. Однако, достоверное снижение содержания экдистероидов отмечено для этого штамма только на среде с ИМК (Р<0,05) (рис. 4 В).

Культура клеток А. гер1ат оказалась более чувствительной к изменению гормонального состава среды культивирования. По сравнению с контрольным вариантом (2,4-Д + ИУК), отмечено ингибирующее действие НУК, ИУК и ИМК как на рост, так и на накопление экдистероидов в культурах корневого (ШУЯ) и стеблевого (СУ1Б) каллусов. При этом культуры сильно различались по способности метаболизировать НУК: на среде с НУК рост корневого каллуса и синтез экдистероидов в нем практически подавлялись. Непригодность НУК для каллусогенеза А. гер1агт отмечали ранее. Неспособность ИУК поддерживать оптимальный рост тканей, возможно, обусловлена высокой оксидазной активностью, характерной для культуры клеток этого вида.

Таким образом, у 5. согопШа фитогормоны в большей степени влияли на рост каллусных тканей и незначительно на их биохимические характеристики, тогда как у А. гер1ат рост и биосинтез экдистероидов в значительной степени зависели от гормонального состава среды.

4. Влияние светового режима на рост и накопление экдистероидов в культурах клеток БеггаН'1а согопШа и Ajuga гср1ат

При выращивании каллусных культур изучаемых видов в условиях круглосуточного освещения красным светом (650-700 нм) с интенсивностью 1000 люкс установлено неоднозначное действие этого фактора на рост и накопление экдистероидов в культурах клеток.

Красный свет не влиял на рост и продуцирование экдистероидов в культурах корневого и стеблевого каллусов А. гер1ат. В культуре клеток 5. согопШа реакция штаммов была специфической. Так, на красном свету подавлялся рост и снижалось содержание экдистероидов в семядольной каллусной ткани. У листовой ткани свет не оказывал влияния на рост, но стимулировал синтез искомых метаболитов (рис. 5). Показатели роста и содержание экдистероидов в гипокотильном каллусе при выращивании в режиме освещения не отличались от соответствующих характеристик тем-новой культуры.

Таким образом, примененный режим освещения оказывал определенное действие на рост и накопление экдистероидов в культуре клеток 5. согопМа и не влиял на каллусные культуры А. гер1ат.

S.coronata

Clll 1.2C

Clll 2.1L

Темнота Кр.свет

Темнота Кр.свет

A.reptans (CVI S)

Темнота

Кр.свет

мпг

Рис. 5. Влияние режима освещения на рост и накопление экдистероидов в каллусных культурах • Serratilla coronata и Ajuga reptans

Таким образом, показана значимость определенных факторов культивирования для процессов роста и накопления экдистероидов в культурах клеток S. coronata и A. reptans. При этом выявлены видоспецифические и штаммоспецифические отличия у культур клеток в отношении реакции на одинаковые факторы культивирования. Однако, значимого повышения роста и синтеза экдистероидов под действием изученных факторов не выявлено.

выводы

1. Из разных эксплантов индивидуальных растений Serratula coronata и Ajuga reptans, клонируемых in vitro, получены каллусные культуры. Установлен условия каллусогенеза этих видов. Стерильные растения являются предпочтительными для введения в культуру клеток, при этом лучшими типами эксплантов являются корни, гипокотили и стебли.

2. Определены морфо-физиологические и ростовые характеристики каллусных культур Serratula coronata и Ajuga reptans. Выявлены различия в характеристиках у каллусных тканей, полученных из разных типов эксплантов и разных донорных растений. Установлено, что ростовые характеристики каллусных культур в большей степени определяются условиями культивирования и в меньшей мере зависят от эпигенетических особенностей эксплантов.

3. Охарактеризован качественный и количественный состав экдисте-роидов в разных органах интактных и стерильных растений Serratula coronata и Ajuga reptans. Установлены различия в качественном составе экдистероидов у этих видов. Основными экдистероидами в растениях Serratula coronata являются 20-гидроксиэкдизон, инокостерон, макистерон А и экдизон. Соответственно у Ajuga reptans — 20-гидроксиэкдизон, 29-норциастерон, 29-норсенгостерон, аюгалактон и ряд неидентифицирован-ных метаболитов. Качественный состав экдистероидов во всех органах растений одинаков. Установлено изменение количественного содержания экдистероидов по органам интактных растений в течение вегетационного сезона и в процессе развития.

4. Определен качественный состав экдистероидов в культурах клеток изучаемых видов. Показано, что состав экдистероидов в культурах клеток видоспецифичен и может отличаться от интактного растения. В культуре клеток Serratula coronata основными экдистероидами, как и для интактного растения, являются 20-гидроксиэкдизон, инокостерон и экдизон, однако не обнаруживается макистерон А и появляется нетипичный для растений неидентифицированный экдистероид. Для каллусов Ajuga reptans спектр экдистероидов аналогичен интактному растению.

5. Количественное содержание экдистероидов в культурах клеток может варьировать в значительных пределах — от следовых количеств до уровня интактного растения. При этом для культуры клеток Serratula coronata содержание экдистероидов в 5-6 раз ниже, чем в интактном растеши (0.03-0.3% от сухой массы). Для Ajuga reptans получены каллусные штаммы, превышающие по количественному составу интактные растения (0,3-0,6%).

6. Не выявлено корреляции между количественным содержанием эк-дистероидов в до норных растениях и полученных каллусных культурах. Показана большая значимость для накопления экдистероидов в культурах клеток генотипа исходного растения, но не эпигенетических свойств эксп-лантов. В процессе субкультивирования наблюдается тенденция к снижению содержания экдистероидов.

7. Оптимизированы условия культивирования для 3-х эпигенетически различных каллусных штаммов S. coronata и 2-х штаммов A. reptans. Выявлены видоспецифические и штаммоспецифические отличия у культур клеток в отношении реакции на факторы культивирования (фитогор-моны, углеводы, элементы минерального питания, режим освещения). Значимого повышения продуктивности по экдистероидам не выявлено.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковлер H.A., Ануфриева Э.Н., Сергиенко С.Ю., Володин В.В. Получение каллусных культур серпухи венценосной — продуцента фитоэк-дистероидов И Тезисы двенадцатой Коми республиканской молодежной конференции, Сыктывкар, 1994, С. 43.

2. Kovler L.A., Anufrieva A.N., Kolegova N.A., Volodin V.V. Tissue and cell culture of Serratula coronata L. and Ajuga reptans L. as a perspective source of phytoecdysteroids // Abstracts of Xlth Ecdysone Workshop, Ceske Budejovice,

1994, P. 79.

3. Ануфриева Э.Н., Ковлер JI.А., КолеговаН.А., Володин B.B. Serratula coronata L. и Ajuga reptans L. — продуценты экдистероидов в культуре in vitro. — Сыктывкар, 1995 — 26 c. (Серия "Научные доклады" /РАН. Уральское отделение. Коми НЦ; выпуск 372).

4. Харитонова Н.В., Ануфриева D.H., Колсттта H.A. Микроклональ-ное размножение лекарственных растений — продуцентов биологически активных экдистероидов // Тезисы докл. Третьей молодежной научной конференции Института биологии, Сыктывкар, 1995, с. 63-64.

5. Anufrieva A.N. Ecdysteroids from callus cultures // Agricell Report,

1995, V. 26, P. 11.

6. Anufrieva A.N., Kovler L.A., Kolegova N.A., Volodin V.V. Tissue and cell culture of phytoecdysone-producing plants as a perspective source of ecdysteroids // European Journal of Entomology, 1995, V. 92, P. 285.

7. Anufrieva A.N., Nosov A.M., Kovler L.A., Kolegova N.A. Effect of different factors on the growth and phytoecdysteroid production in tissue cultures of Serratula coronata L. // Abstracts of Workshop on Phytoecdysteroids, Syktyvkar, 1996, P. 87.

8. Anufrieva A.N., Volodin V.V., Nosov A.M., Lafont R., Garcia M. Phytoecdysteroids in tissue cultures of Serratula coronata L. // Abstracts of Workshop on Phytoecdysteroids, Syktyvkar, 1996, P. 83-84.

9. Volodin V.V, Orlova I.A., Kovler L.A., Anufrieva A.N., Nosov A.M. Cell culture as a model for the study of ecdysteroids biosynthesis and their functions. Biotechnological prospects// Abstracts ofXII Ecdysone Workshop, Barcelona, 1996, No 3.