Разработка и оптимизация биотехнологических методов культивирования in vitro lavandula angustifolia mill. с целью расширения исходного материала для селекции

Бостанова, Лейла Умаровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и оптимизация биотехнологических методов культивирования in vitro lavandula angustifolia mill. с целью расширения исходного материала для селекции
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и оптимизация биотехнологических методов культивирования in vitro lavandula angustifolia mill. с целью расширения исходного материала для селекции"

На правах рукописи

БОСТАНОВА Лейла Умаровна

РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO LAVANDULA ANGUSTIFOLIA MILL. С ЦЕЛЬЮ РАСШИРЕНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь — 2006

Работа выполнена в Ставропольском государственном университете

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Кунижев Станислав Мухадинович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Дмитриев Анатолий Федорович

доктор биологических наук, профессор Майский Виктор Григорьевич

Ведущая организация:

Ставропольский научно-исследовательский институт сельского хозяйства РАСХН

Защита диссертации состоится 18 октября в 12 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул. Пушкина д.1, корпус 2, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г.Сгаврополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 1.

Автореферат разослан « »

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Джандарова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ведущее место среди выращиваемых эфиромасличных культур занимает лаванда, эфирное масло которой широко используется в медицине, парфюмерно-косметической, пищевой промышленности, лакокрасочном производстве и других отраслях.

Отечественная промышленность всегда испытывала острый дефицит в сырье эфиромасличных растений. После распада СССР ситуация с этим видом сырья для России еще больше обострилась, так как основные площади под эфиромасличными культурами были сосредоточены на юге Украины и в Молдове (Воронина и др., 2001). Возрастающую потребность в эфиромасличных растениях можно удовлетворить в первую очередь с выведением новых продуктивных и генетически устойчивых сортов, содержащих высококачественное эфирное масло.

В этой связи нами проведены исследования возможностей использования биотехнологических приемов в расширении генофонда исходного материала лаванды узколистной — культуры, обладающей огромным биологическим и экономическим потенциалом.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований было разработать и оптимизировать биотехнологию получения каллусной культуры и растений-регенерантов Lavandula angustifolia Mill. • • - •

В соответствии с целью исследования нами были поставлены следующие задачи:

• разработать технологию индукции каллусогенеза Lavandula angustifolia

Mill;

• выявить наиболее эффективный режим стерилизации растительных эксплантов;

• оптимизировать технологию получения каллусных культур Lavandula angustifolia Mill;

• подобрать питательные среды для длительного культивирования каллусной ткани;

• разработать технологию получения из каллусной культуры растений-регенерантов;

• исследовать биологическую активность полученной клеточной культуры.

Научная новизна. Впервые разработана технология получения каллусных культур Lavandula angustifolia Mill., позволяющая получить за 20-25 дней до 1300 — 1400 мг биомассы клеток. Подобраны оптимальные режимы стерилизации растительных эксплантов Lavandula angustifolia Mill.

Изучены физико-химические свойства полученных культур, в результате чего выяснено, что каллусная ткань лаванды узколистной содержит все биологически активные вещества, присутствующие в интактном растении.

Разработана технология длительного культивирования каллусной ткани лаванды узколистной, позволяющая поддерживать активно растущую каллусную ткань неограниченное количество времени.

Впервые разработана технология получения из каллусной культуры лаванды узколистной растений-регенерантов, включающая в себя семь стадий. Постепенная адаптация растений-регенерантов к естественным условиям позволило получить нам до 94,7% приживаемости.

В результате проведенных микробиологических исследований выявлена эндо- и экзогенная активность каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill. На основе каллусной культуры лаванды узколистной получен биопрепарат, стимулирующий рост бифидобактерий.

способностью к репродукции в обычных условиях и получение материала с увеличенным потенциалом к дальнейшему размножению за счет повышенной способности к ризогенезу и образованию большого числа побегов.

Использование каллусных культур в получении веществ растительного происхождения позволяет независимо от влияния климатических, сезонных и географических условий стабильно выпускать продукцию в течение года, уменьшить площади почвы, вовлеченной в хозяйственный оборот.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• оптимальной питательной средой для индукции каллусогенеза у лаванды узколистной является среда Мурасиге-Скуга с содержанием в качестве фитогормонов 2,4Д — 1мг/л, ИУК — 0,5 мг/л и кинетин 0,5 мг/л;

• качественный химический состав полученной каллусной культуры соответствует содержанию БАВ (флавонойды, дубильные вещества, сахара, органические кислоты и т.д.) в интактном растении ;

• наиболее эффективной питательной средой для получения из каллусной культуры лаванды узколистной растений-регенерантов является среда Мурасиге-Скуга с гормональным составом 6-БАП — 2 мг/л и НУК — 0,5 мг/л;

• применение вытяжки из каллусной ткани Lavandula angustifolia Mill, в качестве биологически активной добавки к питательным средам стимулирует рост Bifídumbacterium bifidum.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях: 7-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Nova Science Publishers, Inc. New York, 2004; международной конференции "Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразия, окружающая среда, биомедицина". (Пущино 2004), 8-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004), 3-й съезд Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2005), XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав теоретических и экспериментальных исследований, выводов, списка литературы, включающего 173 работ, в том числе 100 работ отечественных авторов и 73 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 26 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве сырья для получения каллусной культуры использовалось растение-интродуцент лаванда узколистная (Lavandula angustifolia Mill.).

Биотехнологические исследования проводились с использованием методических рекомендации и указаний по способам получения культуры in vitro. Все работы, связанные с индукцией и пассированием каллусной ткани, а также получение растений-регенерантов проводили в стерильных условиях.

Качественный состав каллусной культуры лаванды узколистной определяли титрометрическим методом и ТСХ. Исследование действия каллусной культуры лаванды узколистной на рост микроорганизмов проводили методом диффузии в агар и методом серийных разведений в бульоне. В качестве посевного материала Escherichia coli использовали лиофильно высушенный лечебно-профилактический препарат колибактерин, Saccharomyces cerevisiae — сухие пекарские дрожжи, Bifidumbacterim bifidum — лечебно-профилактический препарат бифидумбактерин.

Математическое планирование и обработка данных — осуществлялись с помощью дробного многофакторного эксперимента и методов математической статистики «Statistika-б», кратность опытов составляла 3-9, достоверность оценивалась по критерию Стьюдента.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Получение каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill.

Биотехнология получения каллусной культуры из растительного сырья включает в себя несколько стадий (рис. 1).

В качестве объекта исследования нами было выбрано лекарственное растение-интродуцент лаванда узколистная (Lavandula angustifolia Mill.). Это

растение содержит в своем составе биологически активные вещества, широко используемые в медицине и парфюмерной промышленности. Растительный 1 материал отбирался в ботаническом саду г. Ставрополя.

Рисунок 1 — Схема технологии получения каллусной культуры

Получение и выращивание культур растительных тканей требует соблюдения строгой стерильности. Выбор правильного стерилизующего агента одна из задач, с которой сталкивается исследователь в этой области.

При оптимизации условий стерилизации эксплантов лаванды узколистной

нами было испытано несколько различных схем (табл. 1).

Таблица 1 - Влияние различных комбинаций стерилизующих растворов на

показатели инфицированности эксплантов

вариант Комбинации стерилизующих растворов Экспозиция, мин Число эксплантов без инфекции, %

1 70%-ный раствор этанола 5%-ный раствор хлорамина 2-3 15-20 71±3,4

2 70%-ный раствор этанола 5%-ный раствор хлорамина раствор хлоргексидина 2-3 15-20 15 98±4,2

3 70%-ный раствор этанола раствор хлоргексидина 2-3 15 96±3,7

4 70%-ный раствор этанола 5%-ный раствор хлорамина 0,1% раствор диоцида 2-3 15-20 10 77±2,8

5 70%-ный раствор этанола 0,1 % раствор диоцида 2-3 10 68±3,6

Из данных приведенных в таблице видно, что во всех используемых вариантах стерилизации, инфицированность эксплантов не превышало 32%. Бережная стерилизация растительного материала при достаточно высокой степени эффективности наблюдалось при использовании хлоргексидина. Использование хлоргексидина и этанола позволило получить до 96% стерильных эксплантов.

Следующим этапом в технологии получения каллусных культур является подбор питательных сред для индукции каллусогенеза. Мы в своих исследованиях использовали модифицированную питательную среду, содержащую минеральные соли по Мурасиге-Скуга (МигазЫ£е, Бкхк^, 1962)., Исследовалось десять сред с различным сочетанием фитогормонов для индукции каллусогенеза (табл. 2).

Таблица 2 — Гормональный состав питательных сред используемых для

индукции каллусогенеза, мг/л

Фитогормоны Варианты сред

МС1 МС2 МСЗ МС4 МС5 МС6 МС7 МС8 МС9 МС10

6-БАП 1 0,5 0,5 0,5 - 0,5 0,5 - - -

КИН 2 - - - 0,5 - - 1,5 0,5 1

2.4Д 2 - 1 2 1 5 - - - 2

НУК - - 0,5 - - - 2,5 - 1 -

ИУК - 1 - 1 0,5 - - 0,5 0,5 -

Пробирки и колбы с эксплантами помещали в темный шкаф с температурой воздуха 24 — 26°С. Индукция и рост каллуса у лаванды узколистной происходил обильно и по всему экспланту.

Реакция клеток лаванды узколистной на экзогенное воздействие различных комбинаций регуляторов роста представлена на рисунке 2.

Наиболее высокая каллусообразующая способность отмечена на средах МСЗ, МС5 и МС10, частота каллусогенеза для данных сред 88, 96, 81 % соответственно. На средах МС1 и МС8, где содержание цитокининов преобладает над ауксинами, наблюдаем низкий процент каллусогенеза. Оптимальным сочетанием фитогормонов для индукции каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill, оказалась комбинация кинетин, 0,5 мг/л + 2,4Д,

1 мг/л + ИУК, 0,5 мг/л. На данной среде достигалась высокая эффективность каллусогенеза — 96 %, был получен рыхлый, не слишком обводненный, с хорошим индексом роста каллус.

□ МС1 а МС2 ИМСЗ □ МС4 □ МС5 □ МС6 И МС7 В МС8 И МС9 ШМС10

Рисунок 2 — Зависимость частоты каллусогенеза от присутствия в среде

экзогенных фитогормонов

Поскольку для проведения клеточной селекции in vitro требуется большое количество клеток, необходимо было получить быстро растущие ткани. В связи с этим нами были проведены исследования по выявлению оптимального содержания фитогормонов в питательной среде позволяющих увеличить биомассу получаемой ткани (табл. 3).

Таблица 3 — Результаты влияния 2,4Д, КИН и ИУК на рост каллусов.

№ эпыта Фактор, мг/л Вес сырой биомассы, мг Характеристика каллусной ткани

2,4Д ИУК КИН

1 0,5 0,5 0,5 636±35 Плотная, средние бело-желтые агрегаты, слабо обводненная

2 1 0,5 0,5 1248±35 Рыхлая, крупные белые агрегаты, умерено обводненная

3 2 1 1 401±30 Сильно рыхлая, белые агрегаты, обводненная

4 1 0,5 1,5 272±35 Рыхлая, желтые агрегаты, некроз

5 0,5 0,5 2 - Некроз

Было испытано пять вариантов сред с различным соотношением ауксинов и цитокининов (2:1, 3:1, 1:1, 1:2). Соотношение гормонов роста три к одному оказалось наиболее эффективным для индукции и роста каллусных культур лаванды узколистной. Но как видно из таблицы, использование меньшей концентрации регуляторов роста, 2,4Д, 1мг/л + ИУК, 0,5мг/л + кинетин, 0,5мг/л, в отличие от, 2:1:1 соответственно, позволяло увеличить прирост сырой биомассы и получить жизнеспособный каллус.

Часто в состав питательных сред добавляют растительные экстракты, обладающие ростостимулирующим действием. Мы, в своих исследованиях, для индукции каллусной ткани лаванды узколистной в качестве добавки к питательной среде использовали водную вытяжку самого каллуса (табл. 4).

Таблица 4 — Влияние добавления вытяжки на индукцию и рост каллусной ткани

Lavandula angustifolia Mill, (мл/л)

Кол-во вытяжки, мл Частота каллусогенеза, % Начало каллусогенеза, ДНИ Индекс роста Морфологическая характеристика каллуса

контроль 96 9-13 28,4±0,4 Рыхлая, крупные белые агрегаты, средне обводненная

2 96 9-13 28,4±0,4 Рыхлая, крупные белые агрегаты, средне обводненная

4 100 7-8 30,5±0,8 Рыхлая, крупные белые агрегаты, средне обводненная

6 89 6-7 8±0,6 Средней плотности, желтые агрегаты, слабо обводненная

8 54 6-7 4,5±0,5 Плотная, мелкие желтые агрегаты, слабо обводненная

10 - - -

Для поддержания активно растущей каллусной культуры необходимо систематически пересаживать (пассировать) полученную биомассу клеток на свежую питательную среду (рис. 3).

Пассирование каллусной ткани лаванды узколистной проводили через каждые 20 — 30 дней.

Рисунок 3 — Каллусная культура Lavandula angustifolia Mill, а) начало

каллусогенеза; б) нарастание каллусной ткани; в) каллусная ткань.

При подборе оптимальных для пассажа каллусной ткани лаванды узколистной питательных сред, было испытано пять различных модификаций (табл. 5).

Таблица 5 — Гормональный состав сред используемых при пассаже каллуса, мг/л

Фитогормоны Варианты сред

МСГ МС2' МСЗ' МС4' МС5'

ИУК 3 - 1 1 -

6-БАП 2 2 - 1 -

2ДЦ - 1,5 - - 1

Кинетин - - 3 - 3

Из испытанных нами сред наиболее эффективным для пассирования каллусной ткани оказалась среда МС51, с содержанием 2,4Д 1мг/л и кинетина Змг/л. На данной среде во время пассажей наблюдали хороший рост и развитие каллусной культуры.

В процессе культивирования каллусных линий проводили отбор каллусов с рыхлой умерено обводненной тканью и быстрым ростом. За время длительного культивирования (2,5 года) ткань адаптировалась к питательной среде и имела стабильные ростовые характеристики.

Динамика роста каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill, представлена на рисунке 4.

1400-|

1200-

1000-

L-

S 800-

о го 600-

400-

200-

о-

ппппПП

Г" "Г" ""Г

11 13 15 17 19 21 23 25 27

время, дни

Рисунок 4 — Кривая ростового цикла каллусной культуры лаванды узколистной

Продолжительность ростового цикла каллусных клеток Lavandula angustifolia Mill, составила 21-28 дней. В процессе культивирования каллус пассировали на свежую питательную среду каждые 4-6 недель. Масса транспланта составляла 60-100 мг на 20-40 мл среды.

Качественный химический анализ каллусной ткани Lavandula angustifolia Mill, приведен в таблице 6.

Таблица 6 - Содержание биологически активных соединений

в каллусной культуре

Объект Содержание биологически активных соединений

флавонойды дубильные вещества эфирные масла органические кислоты фитостерины сахара

Каллус + + следы + следы +

Интактное растение + + ' + + + +

В результате проведенных исследований было выяснено, что каллусная ткань содержит весь набор биологически активных веществ присутствующих в интактном растении.

РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ ИЗ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ

Метод регенерации растений путем индукции органогенеза в каллусной культуре является одним из перспективных для получения генетически разнообразных растений. Технология получения растений-регенерантов из каллусной культуры включает в себя семь стадий (рис. 5).

Рисунок 5 — Этапы технологии получения растений-регенерантов из каллусной

культуры.

В качестве исходного материала для индукции побегообразования нами было выделено четыре морфологических типа каллусной ткани: а) плотная, мелкие белые агрегаты, слабо обводненная; б) рыхлая, средние белые агрегаты, умерено обводненная; в) рыхлая крупные желтые агрегаты, обводненная. Каллусы были пересажены на среды для регенерации (таб. 7).

Таблица 7 — Гормональный состав питательных сред для индукции

побегообразования, мг/л

Фитогоомонь Варианты питательных сред

МСрег1 МСрег2 МСрегЗ МСрег4 МСрег5

кинетин 1 2 - - 2

6-БАП - - 2 1,5 -

НУК 1 0,5 0,5 - -

Через 1,5-2 месяца культивирования морфогенных каллусов на 16-ти часовом фото периоде при освещенности 3 кЬх начинается пролиферация почек и побегов. Морфогенные каллусы пассируют каждые 4-6 недель. Побеги, полученные из дедифференцированной ткани, неоднородны по морфологическим признакам. Это обусловлено гетерогенностью каллусов.

МСреМ

МСрег2

МСрегЗ

МСрег4

МСрег5

□ плотная, мелкие белые агрегаты, спабообводненная

О рыхлая, средние белые агрегаты, умеренообводненная

□ рыхлая, крупные желтые агрегаты, обводненная

Рисунок 6 — Частота образования побегов из разных морфологических типов

каллуса, % от общего числа каллусов

Появление побегов наблюдали на всех типах каллусной ткани, но частота регенерации оказалась различной (рис. 6). Данные рисунка свидетельствуют о том, что среда МСрегЗ оказалась наилучшей для всех трех типов каллуса. Сочетание гормонов роста 6-БАП 2мг/л и НУК 0,5мг/л позволило получить наибольшую частоту побегообразования, которая составила 84%.

Следующий этап на пути получения здоровых фертильных растений, способных расти в открытом грунте — это укоренение полученных in vitro побегов, а затем адаптация к почвенным условиям. Перед высадкой побегов на среду для укоренения их помещали на среду Мурасиге-Скуга с половинным содержанием минерального состава и органических источников, и без добавления гормонов роста. На данной среде шел рост побегов, а в некоторых случаях наблюдался ризогенез. Но образование корней у побегов происходило с довольно низкой частотой — около 10 — 15%, и только добавление определенных ауксинов приводило к повышению корнеобразования. В качестве источников ауксинов нами были использованы 2,4Д, ИУК, НУК (табл. 8).

Таблице 8 — Гормональный состав питательных сред используемых при укоренении растений - регенерантов, мг/л

Фитогопмоны Варианты питательных сред

У1Сукор1 МСукор2 МСукорЗ МСукор4 МСукор5 МСукорб

2,4Д 0,5 1 - - - -

ИУК - - 0,5 1 - -

НУК - - - - 0,5 1

Полученные нами экспериментальные данные подтверждают тот факт, что все ауксины могут вызывать процесс ризогенеза. Но перед нами стояла задача выявить наиболее эффективный и оптимальный состав среды, позволяющий получить наибольший выход ризогенных побегов.

В результате проведенных исследований нами была определена степень зависимости укоренения побегов от природы и концентрации ауксина, (рис.7).

Как видно из данных диаграммы, содержание в среде ИУК 1мг/л оказывает наибольший ризогенный эффект. 2,4Д и НУК не позволило получить высокий выход укорененных побегов, кроме того, использование этих двух ауксинов приводило к образованию каллусных «пяток» у основания побегов. Приведенные данные свидетельствуют о том, что использование большей концентрации ауксина (1мг/л), независимо от типа каллусной ткани, позволяет получить более высокую частоту корнеобразования.

МСук1 МСук2 МСукЗ МСук4 МСукб МСукб

Рисунок 7 — Зависимость корнеобразования от присутствия в среде

ауксинов

Одним из ключевых моментов при размножении растений в культуре in vitro является адаптация растений-регенерантов к естественным условиям. Переход от стерильных условий в не стерильные, влечет за собой не мало трудностей.

Для адаптации растений к условиям влажности воздуха, использовали индивидуальные сосуды. По нашему мнению, данный способ адаптации наиболее эффективен, по сравнению с использованием пленки, и более экономичен — чем установка искусственного тумана.

,У

Рисунок 8 — Начало побегообразования в каллусной культуре Lavandula angustifolia Mill.

Рисунок 9 — Растения-регенеранты Lavandula angustifolia Mill

Постепенная адаптация растений к условиям in vivo позволило получить при использовании стерильной почвенной смеси до 94,7% приживаемости растений-регенерантов лаванды узколистной (рис.8,9). Субстрат регулярно увлажняли отстоявшейся водопроводной водой с добавлением в нее небольшого количества перманганата калия. За высаженными в грунт растениями-регенерантами вели постоянное наблюдение и уход.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДО - И ЭКЗОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР LAVANDULA ANGUSTIFOLIA MILL.

В результате проведенных микробиологических исследований была выявлена биологическая активность каллусной культуры лаванды узколистной. Полученные в ходе исследования результаты, для сравнительного анализа, представлены в виде графика зависимости концентрации микробных клеток от присутствия в среде клеточного сока и культуральной жидкости каллуса лаванды различных возрастов (рис. 10,11,12,13).

.....клеточный сок 7-дневный культур ал ьная жидкость 7-дневная

клеточный сок 15-дневный «н^ культуральная жидкость 15-дневная

клеточный сок 27-дневный культуральная жидкость 27-дневная

Рисунок 10 — Динамика изменения концентрации Escherichia coli в зависимости от содержания в среде биологического материала при температуре

выращивания 37°С.

-80

концетрация биологического материала, %

* клеточный сок 7-дневный "^»клеточный сок 15-дневный клеточный сок 27-дневный

•«кФ»культурапьная жидкость 7-дневная " культур апьная жидкость 15-дневная культурапьная жидкость 27-дневная

Рисунок 11 — Динамика изменения концентрации БассЬагошусез сегеу1з1ае в зависимости от содержания в среде биологического материала

при температуре выращивания 37°С.

100

-60

концетрация биологического материала, %

• клеточный сок 7-дневный

клеточный сок 15-дневный ! » клеточный сок 27-дневный

"^"культуральная жидкость 7-дневная ^культуральная жидкость 15-дневная "культуральная жидкость 27-дневная

Рисунок 12 — Динамика изменения концентрации БассЬаготусез сегеушае в зависимости от содержания в среде биологического материала

при температуре выращивания 26°С.

-100

концетрация биологического материала, %

* клеточный сок 7-дневный клеточный сок 15-дневный ■»#!«=» клеточный сок 27-дневный

""в^культуральная жидкость 7-дневная *"*?й!**»культуральная жидкость 15-дневна;

Рисунок 13 — Динамика изменения концентрации Bifidumbacterium bifidum в

В результате сравнительных исследований эндо- и экзогенной активности каллуса лаванды разных возрастов в отношении Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae и Bifidumbacterium bifidum при различных температурных режимах получены следующие данные:

• самый высокий уровень эндо- и экзогенной активности по отношению к Escherichia coli при температуре выращивания 37°С выявлен у каллуса лаванды 15-дневного возраста;

• в отношении Saccharomyces cerevisiae при 37°С использование 7-дневного клеточного сока каллуса лаванды позволяет увеличить концентрацию дрожжевых клеток на 102,4%, а 15—дневного уменьшить на 68,8%;

• наибольшей подавляющей эндогенной активностью в отношении Saccharomyces cerevisiae при 26°С в результате наших исследований обладает клеточный сок 27—дневного каллуса. Ростостимулирующий эффект выявлен у культуральной жидкости среды выращивания 7—дневного каллуса лаванды при использовании 3,12 — 12,5% концентрации.

зависимости от содержания в среде биологического материала при температуре выращивания 37°С.

• наибольшей эндо- и экзогенной активностью в отношении В1йёитЬас1епит bifidum при 37°С обладают клеточный сок и культуральная жидкость среды выращивания каллуса лаванды 15-дневного возраста. Культуральная жидкость среды выращивания каллуса 15-дневного возраста стимулировала рост бифидобактерий на 210% по отношению к контролю.

В настоящее время ведутся многочисленные исследования по выявлению бифидогенного фактора. Однозначной точки зрения по этому вопросу пока не выработано. Разработка технологии получения биопрепарата в качестве биологически активной добавки к питательным средам для выращивания бифидобактерий представляет большой интерес и является актуальной. В связи с этим, на наш взгляд особого внимания заслуживает тот факт, что каллус лаванды узколистной стимулирует рост бифидобактерий.

Технология получения биопрепарата представлена на рисунке 14 и включает в себя пять стадий. Источником получения биопрепарата являлась каллусная культура лаванды узколистной.

Рисунок 14 — Схема получения биопрепарата из каллусной культуры

В процессе микробиологических исследований установлено, что разработанный препарат стимулирует рост бифидобактерий и может быть использован в качестве биологически активной добавки для питательных сред.

В целом, органогенез in vitro — сложный интегральный процесс, регуляция которого осуществляется на клеточном, тканевом и органном уровнях взаимозависимой системой физиологических (главным образом фитогормональных) факторов, определяющих процессы формирования и

развития побегов. В то же время использование полученных экспериментальных данных позволяет сделать сложный процесс органогенеза в культуре in vitro управляемым и получать полноценные фертильные растения-регенеранты. Кроме того, изучение путей и способов получения полноценных фертильных растений-регенерантов в культуре клеток способствует решению актуальных фундаментальных научных проблем: расширение исходного материала для селекции; получение безвирусных культур, ускоренное размножение ценных генотипов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана биотехнология получения каллусной культуры лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.). Экспериментально доказано, что наилучшие показатели каллусогенеза получены на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга содержащей 2,4Д в концентрации 1мг/л, ИУК — 0,5мг/л и кинетина — 0,5мг/л. Начало каллусообразования наблюдалось уже через 10-13 дней после посадки экспланта на питательную среду.

2. Использование вытяжки из каллуса лаванды в качестве биологически активной добавки к питательной среде позволило нам получить 100% частоту каллусогенеза и достаточно высокие показатели индекса роста и начала каллусогенеза.

3. Исследована динамика роста каллусной культуры лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.). Продолжительность ростового цикла каллусных клеток составила 21-28 дней. Каллусная ткань обладала высокой и стабильной скоростью роста.

4. Подобрана эффективная схема получения стерильных растительных эксплантов. Сочетание стерилизующих агентов таких как, хлоргексидин и этанол позволило получить до 96% не инфицированных эксплантов.

5. Выявлено, что каллус лаванды узколистной обладает как эндо - так и экзогенной активностью. Наибольшая биологическая активность в отношении тест-микроорганизмов наблюдалась у клеточного сока и культуральной жидкости среды выращивания каллуса лаванды 15-дневного возраста.

6. Разработана технология длительного пассирования каллусной культуры лаванды узколистной. Пассаж каллуса проводили через каждые 20 — 30 дней на среду Мурасиге-Скуга с содержанием гормонов 2,4Д 1мг/л и кинетина Змг/л.

7. Разработана биотехнология культивирования растений-регенерантов лаванды узколистной. Частота морфогенеза на средах с гормональным составом 6-БАП 2мг/л и НУК 0,5мг/л составила 84%.

8. Установлено, что применение вытяжки из каллуса лаванды для инициации каллусогенеза позволяет получить 100% частоту каллусогенеза и высокие показатели индекса роста и начала каллусогенеза.

9. Разработана технология получения биопрепарата из каллусной ткани лаванды узколистной. Использование данного биопрепарата в качестве добавки к питательным средам для выращивания бифидобактерий позволяет увеличить концентрацию данных микроорганизмов на 210% по отношению к контролю.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Кунижев С.М., Орлова И.Г., Бостанова Л.У. Биотехнология культуры in vitro редких исчезающих и лекарственных растений // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». — Пущино, 2003. — С. 183 - 184.

2. Бостанова Л.У., Бурыкина Е.В., Кунижев С.М., Орлова И.Г., Петин О.В. Индукция каллусогенеза в эксплантах лекарственных растений // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». — М.: «Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - Ч. II.

2003.-С. 186-187.

3. Бостанова Л.У., Бурыкина Е.В., Орлова И.Г. Биотехнология культуры in vitro хозяйственно-ценных растений // 8-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология — наука XXI века". — Пущино, 2004. -С.ЗЗЗ.

4. Bostanova L.U., Burykina E.V., Orlova I.G., Petin O.V., Kunizhev S.M. The callus induction in explats medical plant // Nova Science Publishers, Inc. New York,

2004.-P. 31-36.

5. Бостанова Л.У., Бурыкина E.B., Орлова И.Г. Индукция каллусогенеза в эксплантах лекарственных и хозяйственно-ценных растений // Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразия, окружающая среда, биомедицина. Материалы международной конференции. — Пущино, 2004.-С. 135.

6. Бостанова Л.У., Орлова И.Г., Гуреева Г.С., Кунижев С.М. Эндо- и экзогенная антибактериальная активность каллуса лаванды (Lavandula angustifolia Mill.). // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва, 2006. - С. 89.

7. Бостанова Л.У. Получение биологически активных веществ из каллусных культур лекарственных растений // Материалы Третьего съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. — Москва,: «МАКС Пресс», 2005. - С. 99-100.

Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60x84/16 Физ. печ. л. - 1,3 Усл. печ. л. - 1,2

Заказ 3 Тираж-100 Отпечатано в оперативной полиграфии отдела информации и региональной статистики Ставропольстата г. Ставрополь, ул. Пушкина,4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бостанова, Лейла Умаровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ.

1.1. Пряно-ароматические и эфиромасличные растения источники незаменимых биологически активных веществ.

1.2. Использование биотехнологических методов для решения селекционных задач.

1.3. Микроклональное размножение растений.

1.3.1. Модели микроклонального размножения.

1.4. Стерильность как основа культуры клеток.

1.5. Факторы, определяющие рост и развитие растений in vitro.

1.6. Укоренение растений-регенерантов в культуре in vitro.

1.7. Адаптация пробирочных растений к естественным условиям.

ГЛАВА 2. МЕТОДОЛОГИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ.

2.1. Объект исследований.

2.2. Биотехнологические методы исследования.

2.2.1. Культивирование каллусных тканей на твердых питательных средах.

2.3. Физико-химические методы исследования каллусной ткани.

2.4. Микробиологические методы исследования.

ГЛАВА З.ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ LAVANDULA ANGUSTIFOLIA MILL.

3.1. Индукция каллусогенеза в растительном сырье.

3.1.1. Подбор растительного материала.

3.1.2. Введение эксплантов в стерильную культуру.

3.1.3. Подбор и оптимизация питательных сред для индукции каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill.

3.2. Пассирование каллусной культуры.

3.3. Физико-химический анализ каллусной культуры.

3.3.1. Исследование динамики роста каллусной культуры.

3.3.2. Определение обводненности каллусных тканей.

3.3.3. Химический анализ каллусной культуры.

ГЛАВА 4. РЕГЕНИРАЦИЯ РАСТЕНИЙ ИЗ КАЛЛСНОЙ КУЛЬТУРЫ LAVANDULA ANGUSTIFOLIA MILL.

4.1. Побегообразование в каллусной ткани как разновидность морфогенеза в культуре клеток.

4.2. Оптимизация методов укоренения побегов.

4.3. Адаптация растений-регенерантов к естественным условиям.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДО- И ЭКЗОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР LAVANDULA

ANGUSTIFOLIA MILL.

5.1. Проведение подготовительных работ для исследования эндо- и экзогенной активности каллусных культур

Lavandula angustifolia Mill.

5.1.1. Подготовка биологического материала и питательных сред к исследованию антибактериальной активности.

5.1.2. Подготовка посевного материала микроорганизмов.

5.2. Исследование антибактериальной активности биологического материала методом серийных разведений в бульоне.

5.3. Изучение эндо- и экзогенной активности клеточного сока и культуральной жидкости среды выращивания каллуса лаванды узколистной различных возрастов.

5.3.1. Исследование 7-дневного биологического материала.

5.3.2. Исследование 15-дневного биологического материала.

5.3.3. Исследование 27-дневного биологического материала.

5.4. Разработка технологии получения биопрепарата на основе каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и оптимизация биотехнологических методов культивирования in vitro lavandula angustifolia mill. с целью расширения исходного материала для селекции"

Актуальность темы. Последнее десятилетие прошлого века охарактеризовалось повышенным интересом к лекарственным и лечебно-профилактическим средствам природного происхождения. К числу наиболее популярных объектов следует отнести эфиромасличные растения, которые на протяжении многих веков применялись не только как пряности и источники парфюмерной продукции, но и как лекарственные средства.

Ведущее место среди выращиваемых эфиромасличных культур занимает лаванда, эфирное масло которой широко используется в медицине, парфюмерно-косметической, пищевой промышленности, лакокрасочном производстве и других отраслях.

Новые возможности для селекции открываются при использовании технологии клонального микроразмножения. Высокая чувствительность каллусной культуры в сочетании с возможной изменчивостью клеток, создают реальные предпосылки для клеточной селекции. Данный метод позволяет быстро размножить уникальный генотип или новый сорт, что ускоряет его практическое использование. В настоящее время найдены условия размножения более 500 экономически важных или исчезающих видов дикорастущих растений. Многие из них размножаются уже в производственных условиях. Что касается лекарственных растений, технологии клонального микроразмножения разработаны в отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН для мандрагоры туркменской, кирказона маньчжурского, женьшеня, в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии для ряда видов раувольфии, в ВИЛАРе для стефании гладкой. Имеющиеся литературные данные о биотехнологических исследованиях эфиромасличных культур, и в частности лаванды узколистной, крайне ограничены.

В этой связи нами проведены исследования возможностей использования биотехнологических приемов в расширении генофонда исходного материала лаванды узколистной - культуры, обладающей огромным биологическим и экономическим потенциалом.

В соответствии с целью исследования нами были поставлены следующие задачи:

• разработать технологию индукции каллусогенеза Lavandula angustifolia Mill;

• выявить наиболее эффективный режим стерилизации растительных эксплантов;

• оптимизировать технологию получения каллусных культур Lavandula angustifolia Mill;

• подобрать питательные среды для длительного культивирования каллусной ткани;

• разработать технологию получения из каллусной культуры растений-регенерантов;

• исследовать биологическую активность полученной клеточной культуры.

Научная новизна. Впервые разработана технология получения каллусных культур Lavandula angustifolia Mill., позволяющая получить за 20-25 дней до 1300 - 1400 мг биомассы клеток. Оптимизированный состав питательной среды Мурасиге и Скуга для индукции каллусогенеза содержит следующий гормональный состав: 2ДЦ - 1мг/л, ИУК - 0,5 мг/л, кинетин 0,5 мг/л. Подобраны оптимальные режимы стерилизации растительных эксплантов Lavandula angustifolia Mill.

В результате проведенных микробиологических исследований выявлена эндо- и экзогенной активности каллусных культур Lavandula angustifolia Mill. На основе каллусной культуры лаванды узколистной получен биопрепарат стимулирующий рост бифидобактерий.

Практическая ценность работы. Разработка биотехнологических методов культуры in vitro позволяет получить возможность комплексного оздоровления посадочного материала; высокий коэффициент размножения; возможность получения большого количества растений за короткий срок; возможность хранения и накопления растений для высадки в оптимальные сроки; возможность тиражирования форм, обладающих пониженной способностью к репродукции в обычных условиях и получение материала с увеличенным потенциалом к дальнейшему размножению за счет повышенной способности к ризогенезу и образованию большого числа побегов у древесных растений.

Разработка альтернативных имеющимся технологиям использования лекарственных растений становится возможной благодаря биотехнологическим методам. Использование каллусных культур в получении веществ растительного происхождения позволяет независимо от влияния климатических, сезонных и географических условий стабильно выпускать продукцию в течение года, уменьшить площади почвы, вовлеченной в хозяйственный оборот.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• технология получения каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill, позволяющая в кроткие сроки получить необходимую клеточную биомассу;

• исследование физико-химических характеристик полученной культуры, в результате которой выявлена биологическая активность каллусной культуры;

• технология длительного пассирования каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill, позволяющая поддерживать активно растущую каллусную ткань неограниченное время;

• технология получения растений-регенерантов из каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill, позволяющая получить до 94,7% приживаемости;

Москва, 2005), XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Бостанова, Лейла Умаровна

выводы

1. Разработана биотехнология получения каллусной культуры лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.). Экспериментально доказано, что наилучшие показатели каллусогенеза получены на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга содержащей 2ДД в концентрации 1мг/л, ИУК - 0,5мг/л и кинетина - 0,5мг/л. Начало каллусообразования наблюдалось уже через 10-13 дней после посадки экспланта на питательную среду.

5. Выявлено, что каллус лаванды узколистной обладает как эндо- так и экзогенной активностью. Наибольшая биологическая активность в отношении тест-микроорганизмов наблюдалась у клеточного сока и культуральной жидкости среды выращивания каллуса лаванды 15-дневного возраста.

6. Разработана технология длительного пассирования каллусной культуры лаванды узколистной. Пассаж каллуса проводили через каждые 20 - 30 дней на среду Мурасиге-Скуга с содержанием гормонов 2ДД 1мг/л и кинетина Змг/л.

8. Разработана технология получения биопрепарата из каллусной ткани лаванды узколистной. Использование данного биопрепарата в качестве добавки к питательным средам для выращивания бифидобактерий позволяет увеличить концентрацию данных микроорганизмов на 210% по отношению к контролю.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бостанова, Лейла Умаровна, Ставрополь

1. Абраменко Н.М., Султанова О.Д. Технология выращивания безвирусного посадочного материала плодовых культур и винограда.- Кишинев, 1977. С. 28-36.

2. Аверьянова И.В., Александрова И.В., Быков В.А. Особенности каллусогенеза ландыша майского (Convallaria majalis L.) в зависимости от физиологического состояния экспланта // Биотехнология, 2002. № 5. - С. 49-58.

3. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. Перевод с анг. к.б.н. Панова М.А. М.: Мир, 1983. - 264 с.

4. Андреева Н.Ф., Логвиненко И.Е., Бакова Н.И., Давыдюк Л.П. Интродукция новых видов и сортов ароматических растений на юге Украины: Тез. докл. всесоюз. конф. «1нтродукщя харчових i кормовых рослин». Кшв, 1994.-е. 136-137.

5. Артемова А. Ароматы и масла омолаживающие и исцеляющие. М.- СПб.: ДИЛЯ, 2000. 160с.

6. Байбурина Н.В. Микроклональное размножение как способ сохранения редких и исчезающих видов растений. -http:www.ib.komisc.rU/t/ru/ir/vt/02-56/06.html.

7. Барнаулов О.Д. Пряности (лечебные свойства, медицинское использование). СПб.: ЗАО Весь, 1999. - 246с.

8. Баширова P.M., Усманова И.Ю., Ломаченко Н.В. Вещества специализированного обмена растений (классификация, функции). -Уфа, 1998.- 159с.

9. Беляк В.Б., Семенова Е.Ф., Елисеев В.И. О возможности интродукции ароматических растений в Пензенской области: Материалы Всесоюз. конф. «Вопросы совершенствования сельскохозяйственного производства». Пенза, 1995. - 4.2. - С. 99108.

10. Бодруг М.В. Биохимические основы интродукции и особенности выращивания новых эфиромасличных растений в Молдавии: Дис. д. биол. наук. Кишинев, 1990. - 582с.

11. Болтенков Е.В., Лабецкая Н.В., Журавлев Ю.Н. Получение и культивирование каллусной ткани Iris setosa Pall, ex Link // Биотехнология. 2000. - № 5. - С. 47-51.

12. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко А.В. Влияние экзогенных регуляторов роста на каллусогенез и рост культивируемых клеток Stevia rebaudiana // Физиология растений, 1998. Т. 45. - №6. -С. 888-892.

13. Бондаренко Е.Д., Кисель И.И. Биотехнология. Культура клеток и тканей, http://vet.kharkov.ua/journals/shbioll2002

14. Бугара А. М. Клеточная дифференциация и экспериментальный морфогенез у эфиромасличных растений: Автореф. дис. д-ра. биол. наук: 03.00.05 / Институт ботаники. Кишинёв, 1992. - С. 43.

15. Бутенко Р. Г. Гормональная регуляция дифференцировки растительной клетки в культуре in vitro / Рост и гормональная регуляция жизнедеятельности растений. Иркутск, 1974. - С. 67-85.

16. Бутенко Р.Г. Жизнь клетки вне организма. М., Знание, 1975. -С. 64.

17. Бутенко Р.Г. Культура изолированной ткани и физиология морфогенеза растений. М., Наука, 1964. - С. 272.

18. Бутенко Р.Г. Культура тканей и клеток растений. М. 1971. - С. 48.

19. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М., Наука, 1975. - С. 50.

20. Величко Н.А. Культивирование эфедры односемянной в условиях in vitro // Биотехнология, 2002. № 5. - С. 59-64.

21. Ветчинникова JI.B. http://insteco.kre.karelia.ru/HP/vetchinnikova/.

22. Вечерко Л.И., Вечерко Н.А. Особенности биологии развития и селекции фрезии в условиях закрытого грунта Юго-Восточного Казахстана // Депонированные научные работы. Алма-Аты. - Вып. 1.- 1996.-С. 42-57.

23. Воробьева Г. А., Приходько Н.И. Использование культуры зародышей in vitro для получения межвидовых гибридов томатов // Тр. по прикл. ботан., генет. и селекции ВНИИ растениеводства. -1980. Т.63. - № 3. - С. 64-74.

24. Воронина Е.П., Горбунов Ю.Н., Горбунова Е.О. Новые ароматические растения для Нечерноземья. М.: Наука, 2001. -С. 173.

25. Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в садоводстве // Современные проблемы плодоводства. Тезисы докладов. -Самохваловичи, 1995. С. 9-13.

26. Высоцкий В.А. О генетической стабильности при клональном микроразмножении плодовых и ягодных культур // Сельскохозяйственная биология. М. - 1995. - С. 57-63.

27. Высоцкий В.А., Дьякова Т.Н. Микроклональное размножение декоративных кустарников // Культура клеток растений и биотехнология. Тезисы докл. IV Всесоюзной конференции, Кишинев, «Штиинца». 1983. - С. 134.

28. Высоцкий В.А., Трушечкин В.Г., Попов Ю.Г. Регенерационная способность верхушек черной смородины под влиянием различных ростовых веществ и условий культивирования // Сельскохозяйственная биология. 1976. - Т. XI. - С. 879-885.

29. Вязов А.А., Пережогина В.В., Ковалев В.П. Пряно-вкусовые растения на Северо-Западе России. СПб.: Дом науч.-техн. Пропоганды, 1992. - С. 23.

30. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений Новосибирск: Наука, 1990. - С. 243.

31. Голодрига П.Я., Осипов А.В. Экспресс-метод и приборы для диагностики морозоустойчивых растений // Физиология и биохимия культурных растений. 1972. - Т. 4. - Вып. 6. - С. 650-655.

32. Горбатенко И.Ю., Сушкова З.В., Полещук С.В., Горбатенко Б.Л., Зоз Н.Н. и др. Использование синтетических антиоксидантов в качестве регуляторов роста в культуре тканей in vitro // Докл. РАСХН. 1993. -№2.-С. 9-13.

33. Горбачев Е.В., Запорожский А.А. Использование пряно-ароматических растений в колбасном производстве: Тез. докл. Всерос. студенчес. науч. конф. с междун. участием « Студенты России пищевой промышленности XXI века». - Краснодар, 1998. -С.33 - 34.

34. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2т. /Пер. с англ. М.: Мир, 1986. - Т.2. - С. 308.

35. Гюнтер Е.А. Получение каллусных культур Silene vulgaris G. // Биотехнология, 2002. -№ 6. С.41-45.

36. Джигадло М.И. Использование биотехнологических и биофизических методов в селекции и сорторазведении плодовых и ягодных культур. Автореф. дис. канд. с.-х. наук. Орел, 2003. -С. 26.

37. Диксон Р.А. Изолирование и поддержание каллусных и суспензионных культур клеток // Биотехнология растений: культура клеток / Пер. с англ. В.И.Негрука; С предисл. Р.Г.Бутенко. М.: Агропромиздат, 1989.-С. 8-32.

38. Дмитриева Н. Н. Проблемы регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток растений // Культура клеток растений.-М.: Наука, 1981.-С. 113-123.

39. Егорова Т.А. Основы биотехнологии: Учеб. Пособие для высш. пед. учеб. заведений / Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. М.: Издательский центр «Академия», 2003. - С. 208.

40. Жирмунская Н.М. Хорошие и плохие соседи на огородной грядке. -М.: Маркетинг, 1999. С. 52.

41. Замятина Н. Лекарственные растения. М.: ABF, 1998. - С. 491.

42. Зарецкий Б.В. Инфильтративный туберкулез легких у лиц, инфицированных вирусом гепатита В: Автореф. дис. канд. мед. наук. -СПб., 1997.-С. 19.

43. Зеленко В.А., Котиков И.В., Трошин Л.П. Влияние регуляторов роста на проявление генетически детерминированных признаков окраски кожицы и сока ягод винограда на уровне каллусной ткани in vitro // Научный электронный журнал КубГАУ. № 2 (4). - 2004.

44. Иванченко В.А. Растения и работоспособность. М.: Знание, 1984. -С. 63.

45. Ишмуратова М.М. Влияние экстрактов радиолы розовой на развитие эксплантов родиолы розовой и иремельской в условиях in vitro. // Биотехнология, 2002. № 6. - С.52 - 56.

46. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев: Наукова думка, 1980. - С. 488.

47. Калинин Ф.Л., Сорнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980. - С. 145.

48. Каранчук Р.А., Бенсон Н.А., Трофимова Н.А., Двинянинова И.Б. Клеточная культура Серпухи венценосной как перспективный продуцент фитоэкдистеройдов // Биология культивируемых кулеток и биотехнология растений. М., 1991. С. 38-41.

49. Карасавиди А.О. Некоторые виды эфиромасличного сырья в медицинской практике //Вестник ВГУ, 2005. -№ 1. С. 205-211.

50. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. -М., Наука. 1983.-С. 96.

51. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста // Физиология растений. 1997. Т. 44. - №3. - С.471-480.

52. Коваленко О.В. Генетические аспекты морфогенеза растений // Успехи соврем, биологии. 1993. Т. 113. - Вып. 3. - С. 269-285.

53. Кокшаров А.И. Пряно-вкусовые лекарственные растения в Северном Зауралье: Сб. науч. тр. науч.-прак. конф. «Сельскохозяйственная наука развитию АПК Тюменской области». - Тюмень, 2000. -С.116-117.

54. Корсак Н.Б. Лекарственные растения в радиозащитном питании: Тез. и докл. Третья междунар. конф. по селекции, технологиям возделывания и переработке нетрадиционных растений. Алушта, 1994.-С. 179-180.

55. Костюченко Д.А., Яговенко Т.В., Костюченко В.И., Пигарева С.А. Сравнительная характеристика различных генотипов люпина в культуре ткани // С.-х. биология. Сер. Биология растений. 1998. -№5.-С. 69-12.

56. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений 3. Каллусообразование in vitro // Биополимеры в клетках. 1997. Т. 13. - №5.-С. 362-371.

57. Курсаков Г.А., Панфиткина Т.И. Применение искусственной культуры зародышей при отдаленной гибридизации моравскойрябины // Бюлл. научн. информ. центр, ген. лаб. им. Мичурина. -1976.-№23.-С. 3-6.

58. Лапинская М.П. Клональное микроразмножение промышленных сортов гладиолуса: Автореф. дис. канд. с-х. наук. М., 1998. - С. 19.

59. Лихарев B.C. Лекарства с огорода. М.: КУбК-а, 1995. - С. 351.

60. Лутова Л.А., Забелина Е.К. Каллусо- и побегообразование у различных форм гороха Pisum sativum в условиях in vitro // Генетика.- 1988. XXIV. - Т. 9. - С. 1632-1640.

61. Ляпкова Н.С., Хадеева Н.В., Шаин С.С., Майсурян А.Н. Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro // Биотехнология. 1999. -№ 1. - С. 55-61.

62. Мардамшин А.Г., Мустафина А.Р. Сравнительный анализ содержания эндогенных фитогормонов в морфогенной и неморфогенной каллусной ткани гороха посевного // Биотехнология.- 2001. № 1.-С. 27-29.

63. Машанов В.И. Некоторые итоги и проблемы интродукции и селекции эфиромасличных культур // Интродукция и селекция эфиромасличных культур. Ялта, 1978. - С. 5-28.

64. Машкина Щ.С., Буторина А.К. Генетическая инженерия лесных древесных растений // Генетика. 2003. - Т. 39. - №3. - С. 309-317.

65. Мигранова И.Г. Анализ каллусной ткани Aconitum septentrionale Koelle: физиологические и генетические аспекты: Дис. канд. биол. наук / Башкирский государственный университет (БашГУ), 2000. -С. 102.

66. Мурсалиева В.К., Вечерко H.A.,2003.-http:/nebrk.by.ru/n2/Art2ll.htm.

67. Мэнтелл С. Г., Смит Г. Факторы культивирования, влияющие на накопление вторичных метаболитов в культурах клеток и тканей растений // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиздат, 1987. С.75-104.

68. Некора B.C., Комов В.П. Способность к каллусогенезу у эксплантов хвои пяти видов рода Taxus L. // Растительные ресурсы, 2001. -Т.37. Вып.4. - С. 100-107.

69. Пасешниченко В.А. Растения продуценты биологически активных веществ // Соросовский Образовательный Журнал, 2001. -№ 8. -С.13-19.

70. Пашинский В.Г. Растения в терапии и профилактике болезней. -Томск, изд-во Томского ун-та, 1989. С. 208.

71. Пилунская О. А, Бугара А. М. Цитологические особенности каллусных культур розы эфиромасличной // Ученые записки ТНУ, 2002. Т. 14 (53). - № 1. - С.45-58.

72. Полуденный JI.B., Никиточкина Т.Д., Семыкин В.И. Эфиромасличные культуры. М.: МСХА, 1994. - С. 144.

73. Попов Ю.Г., Трушечкин В.Г. Получение растений земляники методом культуры изолированных верхушек побегов // Плодоводство и ягодоводство нечерноземной полосы / Сб. научных работ НИЗИСНП.- 1972.-Т. 4. С. 184-193.

74. Рыбак Г.М., Кораблева О.А., Романенко JI.P. Проблемы интродукции пряно-ароматических растений в условиях Полесья Украины // Материалы междунар. науч. конф. Краснодар, 1993. - Ч. 2. - С. 393-396.

75. Савздраг Э.Э., Бакун В.К., Ефименко Д.И., Бакун Т.В., Самосудов В.Н. Оздоровление и размножение земляники в питомниководческом комплексе // Садоводство и виноградарство. -1983.-№7.-С. 17-19.

76. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. Пер. с англ. М. -1987.-С.411.

77. Сковородников Д.Н. Особенности клонального микроразмножения и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины. Автореф. дис. канд. с.-х. наук. Брянск, 2004. - С. 20.

78. Скрипаченко В.В. Культивирование in vitro тканей хвойных Сибири: Автореф. дне. канд. биол. наук. Красноярск, 1992. С. 21.

79. Скуратова Е.В., Гольд В.М., Юшкова Е.В., Репях С.М. Особенности каллусообразования Thalictrum minus L. и Catharanthus roseus (L.) G. Don в условиях in vitro // Растительные ресурсы, 1999. Т. 35. -Вып. 4.-С. 61-67.

80. Табаричева JI.A., Ковалев С.Ю., Кравчук Н.С., Тинькова Г.С. Диетические масла с использованием СОг-экстрактов из лекарственных и пряно-ароматических растений // Тез. докл. науч.-практ. конф. М., 1998. - С. 329.

81. Титова И.Б., Тимин Н.И., Юрьева Н.А., Дмитриева Н.Н. Применение метода изолированных зародышей в межвидовой гибридизации лука // Тр. ВНИИ сел. и семен. овощ, культур. 1982. - Т. 15.- С. 57-65.

82. Туровская Н.И. Регулирование процесса ризогенеза при микроразмножении яблони // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве. Сборник статей. Мичуринск. 1992. - С. 10-15.

83. Тюленев В.М., Осипова Л.В., Расторгуев С.А. Индукция морфогенеза в тканевых культурах плодовых и ягодных растений // Генетика. 1994. - Т. 30. - С. 160.

84. Упадышев М.Т. Клональное микроразмножение и особенности регенерации растений ежевики и малины черной in vitro // Диссер. на соискание уч. ст. кандидата с.-х. наук. 1992. - С. 211.

85. Урманцева В.В. Культивирование каллусных тканей на твердых питательных средах // В кн. Методы культивирования клеток: Сб. науч. тр. Л.: Наука, 1988. - С. 232-241.

86. Фандалок А.В., Кормош С.М., Фогел Л.М. Перспективы интродукции пряно-ароматических культур в Закарпатье: Тез. докл. Третьей междунар. конф. по селекции, технологиям возделывания ипереработки нетрадиционных растений. Симферополь, 1994. -С. 38.

87. Фаулер М.В. Экономические аспекты промышленного культивирования, /из книги Биотехнология сельскохозяйственных растений / Пер. с англ. В.И. Негурка; С предисл. Р.Г. Бутенко. М.: Агропромиздат, 1987. - С. 301.

88. Фролова JI.B. Особенности популяции культивируемых клеток // Культура клеток растений. М.; Наука, 1981. - С. 5-16.

89. Хапова С.А. Условия культивирования in vitro и последующая продуктивность растений земляники // Автореф. дисс. канд. с.-х. наук. -М.- 1997. -С. 20.

90. Харинарайн Р.П., Долгих Ю.И., Гужов Ю.Л. Выбор оптимальных сред для массовой регенерации растений сахарного тростника из каллусной культуры // Физиология растений. 1996. - Т. 43. -Вып.1. - С.111 - 115.

91. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro // В книге биотехнология сельскохозяйственных растений / Пер. с англ.

92. B.И. Негурка, с предисл. Р.Г. Бутенко. М.: Агропромиздат, 1987.1. C. 105-133.

93. Хожиматов К. Эфиромасличные растения Узбекистана и пути их рационального использования: Автореф. дис. д. биол. наук. -Ташкент, 1999.-С. 42.

94. Хомякова У.М., Шевченко Ю.П. Возделывание пряно-ароматических культур в условиях Центральной нечерноземной зоны России // Тез. докл. Первого междунар. симпоз. Пущино, 1995.-С. 530-531.

95. Шевелуха B.C. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высшая школа. - 2003. -С. 469.

96. Шмерко Е.П., Мазан И.Ф. Лечение и профилактика растительными средствами (болезни пищеварительной системы). Баку, Азербайджан, 1992. - С. 316.

97. Шорнинг Б.Ю., Полещук С.В., Горбатенко И.Ю., Ванюшин Б.Ф. Действие антиоксидантов на рост и развитие растений // Изв. РАН. Сер. биол. 1999. -№ 1.-С. 30-38.

98. Alimgazinova В. New technologies in medicinal plants cultivation // Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abstr. Int. Symp. Yalta, 2002. - P. 25.

99. Alimgazinova B.Sh. In vitro technologies in medicinal plants cultivation // Book Abstr. Int. Conf. L «Med. Raw Mater, and Phytoprep. Med. and Agr.», Karaganda, Sept., 29 oct. 1, 1999. - Karaganda, 1999. - P.76.

100. Arapetyan E., Bilinska I. Antibiotics help plants in struggle with bacteria and fungi / Abstr. 11th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Bulg. J.Plant Physiol. 1998. - Spec, issue. - P. 223.

101. Beresneva L.V., Kovalchuk I.U. Clonal micropropagation of grape for preservation in genbank in Kazakhstan // Biotec. Aproaches for Exp. and Preser. of Plant R. Absrtacts, Yalta. 2002. - P. 27.

102. Bhansali R.R. Somatic embryogenesis and regeneration of plantlets in pomegrante // Annals of Botany. 1990. - 66. - P. 249-253.

103. Bogunia H., Pizywara L. Rola cukrowcw w roslinnych kulturach in vitro // Wiad. bot. 1999. - 43, №1-2. - P. 25-36.

104. Broom O.C., Zimmerman R.H. Culture of shoot meristems: fruit plants // Cell culture and somatic cell genetics of plants. 1984. - V. 1. - P. 111122.

105. Calvo M.C., Segura J. Plant regeneration from cultured leaves of Lavandula latifolia Medicus: Influence of growth regulators and illumination conditions // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1989. -19. - № 1. - P. 33-42.

106. Carlson M. Keep insects away the herbal way // Gardens West. 2000. Vol. 14, № l.-P. 26-30.

107. Chipman E. Growing savory herbs // Canada. Dep. of agriculture: Ottawa. Can., 1980.- 17 p.

108. Chung W.W. A novel approach for efficient plant regeneration from tissue culture of Cassava // Plant Cell Rep. 1990. - 8. - 11. - P. 639642.

109. Cousineau J.C., Donnelly D.J. Adventilious shoot regeneration from leaf explants of tissue cultured and greenhouse grown raspberry // Plant cell tissue and organ culture. - 1991. - V. 27. - № 3. - P. 249-25 5.

110. Dalton C.C., Peel E. Product Formation and plant cell specialization: A case of photosynthetic development in plant cell cultures // Progr. Indust. Microbiol. 1983. Vol. 17. P. 109-166.

111. Evans D.A., Sharp W.R., Flik C.E. Cell culture methods for crop improvement // Handbook of plant cell culture. New York, 1981. - P. 47-53.

112. Fenaroli G. Le sostance aromatiche Naturali // Hoepli., Milano. Vol. 1. -1963.-P. 64-97.

113. Filipek J. Antioxidative properties of Alchilla xanthochlora, Salvia officinalis and Solidago virgaurea water extracts. Biologia, Bratislava. -1994. Vol. 49, № 3. - P. 359-364.

114. Fowler M.W. Regulation of carbohydrate metabolism in cell suspension cultures // In Frontiers of Plant Tissue Culture, Calgary: University of Calgary, 1978.-P. 443-452.

115. Fowler M.W. Substrate utilisation by plant cell cultures. Journal of Chemical Tehnology and Biotehnology. 1982. 32. - P. 338-346.

116. Gamborg O.L., Shiluk J.P., Shamin E.A. Plant tissue culture ethods and application in Agriculture. - Academic Press. New York, 1981. - P. 67.

117. Gautheret R. La culture des tissus vegetaux. Paris, 1959. P. 864.

118. Gawrys A. Rabata z ziolami // Kwiernik. 2000. - № 5. - P. 37-39.

119. Gladstones L.S. Prospeets for interspecific hybridization of L. atlantieus with L. cosentini // Theor. and Appl. Genet. 1985. - № 2. - P. 71.

120. Goebel K. Uber Regeneration in Pflanzenreich. Biol. Zbl. Bd., 1902. -22.-P. 385-397.

121. Haberlandt G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. -Sitzungsber. Akad. Wiss., Wien Math. naturw., 1902., Bd.III. - P. 6992.

122. Haccius D. Questions of unicellutar origin of non-zigotic embryos in callus cultures // Phytomorfology. 1978. - 28. - P. 78-81.

123. Hajhashemi V., Ghannadi A., Sharif B. Antiinnflammatory and analgesic properties of the leaf extracts and analgesic properties of the leaf extracts and essential oil of Lavandula // Univ. Isfahan, Iran, 2002. P.184-197.

124. Holdgate D.P. Propagation of ornamentals by tissue culture // Appllied and Fundamental Aspects of plant cell, tissue and organ culture. Ed. J. Reinhert and J.P.S.Bojaj, Berlin, Heidelberg and New York: Springer -Verlag. 1975. - P. 86-94.

125. Huang Hao, Lu Mingbo, Mei Xingguo. Huazhong ligong daxue xuebao // J. Huazhong Univ. Sci. and Technol. 1999. Vol. 27. - № 4. -P. 107-109.

126. Huang, Li-Chun, Liu, Din-Ming. Clonal multiplication of Lycorus aurea by tissue culture // Sci. hort (Neth.). 1989. - 40. - № 2. - P. 145-152.

127. Idrissi A., Berrada M. Etude chimique comparative de quelques population de lavandula du Maroc // Colloque int. sur les plantes aromatiques et medicinales du Maroc. Rabat, 1985. P. 220.

128. Juned S.A., Jackson M.T., Ford-Lloid B.V. Genetic variation in potato cv. Record: evidence from in vitro regeneration ability // Ann. of Bot. 1991. -67.-P. 199-203.

129. Juned S.A., Jackson M.T., Ford-Lloid B.V. Genetic variation in potato cv. Record: evidence from in vitro regeneration ability // Ann. of Bot. 1991. -67.-P. 199-203.

130. Kahkonen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J., Raiha J.-P., Rihlaja K., Kujala T.S., Heinonen M. Antioxidant activity of plant extracts containing phendic compounds // J. Agr. Food Chem. 1999. - Vol. 47, № 10. - P. 3954-3962.

131. Kalinovic I., Martincic J., Rozman V., Guberac V. Insecticidal activity of substanes of plant origin ageinst stored product insects // Ochr. Rostl. -1997.-Vol. 33.-№2.-P. 135-142.

132. Kim H.M., Cho S.H. Lavender oil inhibits immediate type allergic reaction in mice and rats // J. Pharm. Pharmacol. 1999. - Vol. 51. -P.221-226.

133. Leung F.Y., Foster S. Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Food, Drugs and Cosmetics, 2nd ed. John Wiley&Sons, Inc., New York, 1996.-P. 339-342.

134. Lio Z.-H., Nakano H. Antibacterial activity of spice extracts against foodrelated bacteria // J. Fac. Eppl. Biol. Sc. Hirochima Univ. 1996. -Vol. 35.-№2.-P. 181-190.

135. Litz R.E., Jarret R.L., Asokan H.P. Tropical and sutropical fruits and vegetables // Tissue culture as a plant production system for Horticultural crops. Nijhoff; Dordrecht; Netherlands, 1986. - P. 237-251.

136. Maheswaran G., Williams E.G. Direct secondary somatic embryogenesis from immature sexual embryos of Trifolium repens cultured in vitro // Annals of Botany. 1986. - Vol. 57. - P. 109-117.

137. Maretzki A., Thom M., Nickell L.G. Utilisation and metabolism of carbohydrates in cell and callus cultures. In Tissue Culture and Plant Science, London: Academic Press., 1974. P. 239-261.

138. Morard P., Henry M. Optimization of the mineral composition of in vitro culture media // J. Plant Nutr. 1998. - Vol. 21. - №8. - P. 1565-1576.

139. Morel G. Sur la culture des tissus de derux Monocotiledones. C. R. Acad, sci., 1950.-P. 1099-1101.

140. Murashige T. Clonal crops through tissue culture // Plant Tissue Cult. And Its Biotehnol. Appl., Berlin, etc.: Spring. Verl., 1977. - P. 395-403.

141. Murashige T. Plant propagation through tissue cultures // Ann. Rev. Plant Physiol. 1974. - Vol. 25. - P. 136-166.

142. Nemeth G. Induction of rooting // Biotechnology in Agriculture and forestry |Trees|. Ed. Y. P. S. Bajaj. Springer Verlag. - Berlin, Heidelberg. - 1986. - P. 49-64.

143. Newton J. Treasures from the Aegean // Gardens West. 2000. - Vol. 14, №2.-P. 58-61.

144. Padma T.V. Spices protect against cancer // Everymans Sc. 1994. - Vol. 29, №1.-P. 28-29.

145. Parrot W.A., Dryden G., Vogt S., Hildebrandt D., Collins G.B., Williams E.G. Optimization of somatic embryogenesis and embryo germination in soybean // In vitro cell developm. Biol. 1988. - Vol. 24. - P. 817-820.

146. Paster N., Juven B.J., Shaaga E., Menasherov M., Nitzan R., Ravid U. Inhibitory effect of oregano and thyme essential oils on moulds and food borne bacteria. S.I., 1990. Vol. 33 - P. 37.

147. Рокоту J., Reblova Z., Janitz W. Exctrary z rozmaryny a salveje jako prirodni antioxidanty tuky a oleju // Czech J. Food Sc. 1998. - Vol. 16. - № 6. - P. 227-234.

148. Power C.J. Organogenesis from Helianthus annuus ibreds and hybrids from the cotyledons of zigotic embryos // Amer. J. Bot. 1987. - Vol. 74. -P. 497-503.

149. Reustle G., Natter I. Effect of polyvinylpyrrolidone and activated charcoal on formation of microcallus from grapevine protoplasts (Vitis sp.) // Vitis. 1997. Vol. 33.-№3.-P. 117-121.

150. Revilla M.A., Power J.B. Morphogenetic potencial of long-term callus cultures of Actinidia delisiosa. J. hortuc. 1988. - Vol. 63. - № 3. - P. 541-545.

151. Sasanelli N. Persrectives pour Lemploid plantes a nermalicide. Rev. Suisse Agr. 1997. - Vol. 29. - № 3. - P. 157-158.

152. Sharma H.S., Gill B.S. Effect of embryo age and culture media on plant growth and vernalization responce in Winter wheat // Euphytica. 1982. -Vol. 31.-P. 629-634.

153. Sharp W.R., Sondahl M.R., Caldas L.S., Marralfa S.B The physiology of in viro asexual embryogenesis // Hort. Rev. 1980. - Vol. 2. - P. 268310.

154. Shetty K. Plant propagatio compositions and methods: Пат.5906941 США, МПК6 C12N 5/04, A61K 35/12 // University of Massachusetts. -№08/842560; Заявл. 15.04.97.; опубл. 25.05.99; НПК 435/431.

155. Skoog F. Aspects of growthfactor interaction in morphogenesis of tobaco tissue cultures. In: Les cultures de tissus de plantes. Paris, C.N.R.S., 1971.-P. 115.

156. Stafford A. Natural Products and Metabolites from Plant and Plant Tissue Cultures // Plant Cell and Tissue Culture // Eds Stefford A., Warren G. Milton Keyness: Open University Press, 1991. P. 124-150.

157. Steward F. C., Shantz E.M., Pollard J.K., Mapes M.O., Mitra J. Growth induction in explanted cells and tissues: metabolic and morphogenetic manifestations // 19-th Growth Symposium, 1961. P. 193-244.

158. Street H.E. Laboratory Manual of Cell Biology, Hall D. And Hawkins S. (eds.), English Universities Press, London, 1975. P. 222.

159. Thorpe T.A., Meier D.D. Effects of gibberellic acid, abscisic acid on shoot formation in tobacco callus cultures. Physiol. Plantarum, 1973. -Vol. 29.-P. 121.

160. Tisserat В., Esan E.B., Murashige T. Somatic embryogenesis in angiosperms // Horticultural Rev. 1977. - № 1. - P. 1-78.

161. Tolley E., Mead Ch. Hebs: Gardens, decorations, and recipes. New York: Potter, 1985.-P. 244.

162. Vasil I.K., Vasil V. Clonal propagation // Intern. Rev. of Cytol. Suppl: Rerspectives in Plant Cell and Tissue Culture No I. Acad, press. 1980. P. 145-173.

163. Wan G., Sorensen E.L., Liang G.H. The effect of kinetin on callus characters in alfalfa (Medicago sativa L.) // Euphytica. 1988. - Vol. 39. -№ 3. - P. 249-254.

164. Wantanabe K., Sato F., Furuta V., Yamada Y. Induction of pigment production by S-containing compounds in cultured Lavandula vera cells // Agric. Biol. Chem. 1985. - Vol. 49. - № 2. - P. 533-534.

165. Yao Hongjun, Luo Xiaofrang, Tian Yanting // J. Beijing Forest. Univ. 1999. Vol. 21. - № 3. - P. 78-84.

166. Yeoman M.M., Miedzybrodzka M.B., Lindsey K., McLauchlan W.R. The synthetic potential of cultured plant ctll // Plant ctll cultures: Results and perspectives. Amsterdam etc.: Elsevier, 1980. P. 327-344.

Информация о работе

Бостанова, Лейла Умаровна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка и оптимизация биотехнологических методов культивирования in vitro lavandula angustifolia mill. с целью расширения исходного материала для селекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы