Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Теоретическое обоснование и приемы использования методов биотехнологии в селекции сахарной свеклы

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое обоснование и приемы использования методов биотехнологии в селекции сахарной свеклы"

На правах рукописи

ПОДВИГИНА ОЛЬГА АНАТОЛЬЕВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРИЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

06.01.05 - Селекция и семеноводство

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

Воронеж 2003

Диссертация выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского научно - исследовательского института сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова.

Научный консультант - доктор биологических наук,

профессор, Жужжалова Татьяна Петровна

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор, Буторина Анастасия Константиновна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Торон Александр Андреевич

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Калягин Юрий Сидорович

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский и проектно-технологический институт рапса (ВНИПТИ рапса)

Зашита состоится «¡9» мл-Щ- Л 2003 года в №.. часов в аудитории _££/ на заседании диссертационного совета Д 220.010.03 Воронежского государственного аграрного университета имени К.Д. Глинки по адресу: 394087, г. Воронеж, ул. Мичурина, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежского государственного аграрного университета имени К.Д. Глинки

Автореферат разослан « 9 » 01С7~(, С^Л_2003 года.

Ученый секретарь .

диссертационного совета Щ^р0**^ Щедрина Д.И.

1oo3-А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Важнейшей проблемой селекции сахарной свеклы является получение новых исходных форм и ускоренное создание и внедрение высокопродуктивных сортов и гибридов. Дальнейший прогресс в селекции свеклы требует усовершенствования традиционных подходов с, использованием современных методов биотехнологии. Исследования по применению методов биотехнологии на сахарной свекле немногочисленны и очень разрознены. Наиболее изученным и широко используемым в селекции является метод микрокпональ-ного размножения сахарной свеклы (Амерханова, Рахимбаев, 1986; Славова, 1988; Ильенко, 1989; Знаменская, Жужжалова, 1989). Исследования отдельных вопросов по индуцированию гаплоидии методом культуры неоплодотворенных семяпочек (Ильенко, Белоус, 1987; Славова, Рафаилова, 1991; Подвигина, Знаменская, Жужжалова, 1994; Hosemans, Bossoutrot, 1983,1985; Van Geyt, Speckmann, Halluin, 1987; Gibson Margaret, 1987; Lux, Herrmann, Claudia, 1990; Seman, Farago, 1990) проводились независимо друг от друга и не дали полного представления о методе получения гомозиготных линий сахарной свеклы. Представленные в литературе данные по применению методов эмбриокультуры и длительного сохранения микроклонов сахарной свеклы в условиях in vitro (Белоус и др., 1988; Цупикова, 2001; Miedema, 1982; Lux et.al., 1991) очень ограничены и свидетельствуют о недостаточной изученности данных вопросов. В настоящее время наиболее интенсивно развивается метод генетической инженерии, позволяющий получать трансгенные растения сахарной свеклы, устойчивые к гербицидам (Левенко и др., 1993; Богомолова, 2002). , ,

Однако возможности применения известных биотехнологических методов весьма ограничены, т.к. они являются узкоспецифичными не только для различных генотипов одного вида, но даже для разных этапов культивирования эксплантов одного генотипа. Поэтому необходима индивидуальная разработка специфических условий для различных методов биотехнологии, позволяющих создавать новый и сохранять ценный селекцонный материал в культуре изолированных тканей и органов такой важной культуры, как сахарная свекла.

В связи с этим возникает потребность теоретического обоснования особенностей воспроизведения растений в культуре in vitro с учетом тотипотентно-сти клеток сахарной свеклы. Актуальным является также разработка режимов индукции гаплоидных и диплоидных регенерантов при культивировании неоплодотворенных семяпочек и зародышей, условий культивирования полученных гаплоидных, реституционных диплоидных и других новых материалов, режимов длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы.

Методы гаплоидии, эмбриокультуры и длительного субкультивирования и их сочетание с традиционной селекцией позволят повысить репродукционный потенциал системы размножения сахарной свеклы, получать новый исходный материал, обогащенный в генетическом отношении, длительно сохранять цен-

ный генофонд в условиях in vitro и тем самым значительно сокращать селекционный процесс, а следовательно, и период создания новых сортов и гибридов.

Все это определяет актуальность и необходимость проведения данной работы.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в разработке биотехнологических методов индукции и сохранения новых форм сахарной свеклы и установлении особенностей морфогенетического развития микроклонов в условиях in vitro.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1.Определить влияние экзогенных и эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов сахарной свеклы из неоплодотворенных семяпочек.

2. Разработать оптимальные условия получения гаплоидных и реституционных диплоидных линий свеклы в условиях in vitro.

3. Установить лимитирующие факторы воспроизводства растений при культивировании незрелых и зрелых зародышей сахарной свеклы.

4. Разработать параметры длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы.

5.0пределить влияние ингибирующих веществ на морфофизиологическое развитие клонов в период депонирования и после него.

б.Изучить пути морфогенеза растений свеклы в условиях in situ и in vitro.

Научная новизна. Впервые установлено влияние эндо- и экзогенных воздействий на индукцию гаплоидии in vitro из неоплодотворенных семяпочек. Экспериментально показано, что наибольшей склонностью к индукции гаплоидии обладают материалы от самоопыления и гибридного происхождения. Выявлена положительная корреляция между регенерационной способностью неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro и количественным выражением аномального развития мужских гамет, что может служить маркерным признаком при отборе донорского материала. Получены новые данью о взаимосвязи стадий развития зародышевого мешка с этапами развития микрогаметофита, что можно использовать при отборе эксплантов с наибольшей склонностью к индукции. Показано стимулирующее действие рентгеновского облучения и пониженных температур на формирование гаплоидных структур из неоплодотворенных семяпочек свеклы. Получены оригинальные данные о влиянии физиологически активных веществ на индуцирование адвентивных побегов гаплоидных проростков, расширяющие существующие представления о значении гормонов при культивировании растений в условиях in vitro. Впервые разработана последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации, микроразмножения гаплоидных и автодиплоидных линий сахарной свеклы. Установлен эффективный режим колхицинирования гаплоидных растений свеклы в условиях in vitro.

Впервые определены методические подходы эмбриокультуры незрелых зародышей сахарной свеклы, включающие оптимальные стадии развития эксплантов, состав питательной среды и температурно-светойой режим культивирования.

Модифицирован состав питательной среды В5, основанный на изменении осмотического, углеводного уровня и добавлении ингибирующих веществ, для беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы. Впервые показаны морфологические и анатомические изменения клеточных структур растений при длительном субкультивировании на ингибирующих средах и дальнейшем их рекультивировании. Экспериментально доказана возможность увеличения продолжительности хранения меристемного материала свеклы в течение 12-18 месяцев беспересадочного культивирования на модифицированных средах. . .

Впервые выявлены и описаны этапы морфогенетического развития адвентивных почек, незрелых и гаплоидных зародышей в условиях in vitro. Изучены и представлены пути морфогенеза при воспроизведении растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo и in vitro. Определены морфо-анатомические отличия растений свеклы, выращенных в условиях in situ и in vitro, выражающихся в образовании структурных изменений клеток черешка и листа, проводящей системы и паренхимных тканей.

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Установленные параметры культивирования тканей сахарной свеклы позволили усовершенствовать метод индуцирования гаплоидии при культивировании неопло-дотворенных семяпочек. Разработанный метод получения гомозиготного материала методом индукции гаплоидии в условиях in vitro позволил создать и передать на Льговскую ОСС 12 реституционных линий сахарной свеклы, что подтверждает возможность его использования в практической селекции.

Режимы культивирования незрелых зародышей дали возможность разработать параметры метода эмбриокультуры, которые могут бьггь использованы для получения растений от несовместимых и межвидовых скрещиваний и восстановления длительно хранившегося в семенах селекционного материала. С помощью данного метода восстановлены, размножены и переданы селекционерам ВНИИСС 9 линий (семена урожая 1981 года).

Для создания коллекции генофонда сахарной свеклы разработан метод длительного беспересадочного культивирования микроклонов на модифицированных питательных средах, позволяющий в течение длительного периода сохранять ценные селекционные генотипы в условиях in vitro. Данным методом в течение 3-х лет сохранялись 28 селекционных номеров, а затем 12 из них были переданы селекционерам для дальнейшей работы.

Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в различных областях биотехнологии, в учебных программах по биологии, цитологии, селекции в высших и средних учебных заведениях. Полученный в результате изучения новый исходный материал сахарной свеклы также может использоваться в дальнейших фундаментальных и прикладных исследованиях.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Экспериментальное обоснование воздействия экзогенных и стимуляции эндогенных факторов на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro для получения гаплоидов.

2.Процесс формирования гаплоидных, автодиплоидных линий зависит от гормональной нагрузки питательной среды и морфологического развития регенератов.

3.Регенерационная способность незрелых и зрелых зародышей в условиях in vitro определяется генетипическими различиями донорского материала, условиями культивирования (гормональный и углеводный состав среды, темпера-турно-световой режим), стадией дифференциации тканей незрелых зародышей.

4.Устаковленные воздействия модифицированного состава питательной среды на рост и развитие микроклонов сахарной свеклы при субкультивировании позволяют увеличивать беспересадочный период и сохранять в чистоте селекционный материал в виде меристемных коллекций в течение длительного времени (2-5 лет).

5. Регуляция морфобиохимических изменений в росте, развитии и жизнеспособности эксгагантов в период депонирования и после него обеспечивают высокую выживаемость и способность к дальнейшему размножению микроклонов сахарной свеклы.

6. Система воспроизведения растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo и in vitro основана на свойстве тсггипотентности растительных клеток.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на зональной конференции молодых ученых и специалистов (Каменная степь, 1986); районых научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Рамонь, 1987-1989); конференции молодых ученых ВНИИС (Киев, 1988); межрегиональой научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Воронеж, 1993); Всесоюзных и Международных совещания "Гаметная и зиготная селекция", "Онтогенетика высших растений" (Кишенев, 1986, 1989); Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); XI International symposium "Embriology and seed герпх1исйоп"(Ленинград, 1990); Российский симпозиум "Новые методы по биотехнологии растений" (Пущино, 1993); International symposium "Plant biotechnology and genetic engeneering" (Kiev, 1994); конференции "Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений" (Киев, 1994); Международном симпозиуме "Апомиксис у растений: состояние, проблемы и перспективы исследований" (Саратов, 1994); Всероссийской научно-практической конференции "Пути повышения эффективности свеклосахарного производства России в условиях рыночной экономики" (Рамонь, 1996); VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997); II съезде Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 1998); IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999); International conferece "Genetic collections, isogenec and alloplasmic lines" (Novosibirsk, 2001); VI Международной конференции "Регуля-

торы роста и развития растений в биотехнологиях" (Москва, 2001); Межрегиональной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения профессора С.И. Машкина (Воронеж, 2002), заседаниях Ученого совета ВНИИСС (Рамонь, 1986-2003).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Основной текст изложен на 227 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц, 82 рисунка. Список цитируемой литературы состоит из 427 наименований, из них 198 на иностранных языках.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 работы, 4 находятся в печати.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РАБОТЫ

Экспериментальная работа Выполнялась во Всероссийском НИИ сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова в 1985-2002 г.г. (ВНИИСС, Рамонский район, Воронежской области). Исследования проводились в рамках отраслевой научно-технической программы "Сахароносные растения и сахар" и тематического плана ВНИИСС 01.01.Н1. "Изучить роль генотипа и влияния факторов регуляции генома на систему размножения сахарной свеклы".

Для исследований привлекались сорта Рамонской, Льговской, Белоцер-ковской, Уладовской селекции, фертильные и стерильные линии, гибриды F( -F3 на стерильной основе, созданные в селекцентре ВНИИСС (Ошевнев, Бычкова, Нуждина, Богомолов) и дикие виды свеклы Beta corolliflora и Beta trigyna. Экспериментальная часть работы выполнялась в полевых и лабораторных условиях отдела биотехнологии ВНИИСС.

В качестве стерилизующих агентов при введении в культуру изолированных тканей сахарной свеклы использовали растворы сулемы (0,05-0,1%), хлорамина Б (10%),' хлорной воды (0,05), хлоргексилина (2-4%), время экспозиции материала колебалось от 30 минут до 4 часов.

Для культивирования эксплантов применялась питательная среда Гамбор-га (Gamborg, Eveling, 1968). Техника стерилизации, приготовления питательных сред - по Р.Г. Бутенко (1975). В основную питательную среду добавляли 6-бензиламинопурин, кинеггин, гиббереллин, НУК, ИМК, ИУК в различных концентрациях и соотношениях, сахарозу 20-50 г/л, рН рабочего раствора 5,8-6,0.

Обработку материала пониженной температурой (+ 4-6° С) при экспозиции 1-3 суток проводили в бытовом холодильнике, рентгеновское облучение осуществляли установкой "Реис-И-Светлана" при дозах 1000-5000 рентген.

Для культивирование эксплантов в условиях темноты использовались термостаты (температура +23-26°С).

Колхицинирование гаплоидных регенерантов производилось путем накалывания раствора колхицина на точку роста (Мосина, 1967), погружением кор-

ней культуральных растений в раствор мутагена и добавлением колхицина в питательную среду. Концентрации колхицина от 0,005% до 0,5%.

С целью получения межвидовых гибридов Beta vulgaris с Beta corolliflora и Beta trigyna проводили принудительное опыление собранной пыльцой диких видов.

В качестве ингибирующих веществ при длительном беспересадочном культивировании микроклонов сахарной свеклы в питательную среду добавляли химические регуляторы роста: гидразид малеиновой кислоты, феруловую и салициловую кислоты, 2,4-Дихлорфеноксиуксусную кислоту, хлорхолинхлорид, осмотические компоненты: сорбит, увеличенное количество агара, а также изменяли минеральный и углеводный состав среды. Концентрации химических веществ находились в пределах от 0,001 до 5 мг/л, минеральных - 8-14 г/л, осмотических - 2-16 г/л. Режим депонирования длился 12 и более месяцев. По окончании субкультивирования растения размножали, укореняли и высаживали в грунт по методике, разработанной В.В. Знаменской, Т.П. Жужжаловой (1995).

Гистохимические исследования длительно культивируемых растений проводили на 1,3,6,9,12 месяцы депонирования на временных препаратах согласно методике, изложенной в учебном пособии И.А. Паламарчук, Т.Д. Весе-ловой(1965).

Все цитологические и биохимические анализы выполнены на точках роста, сегментах черешка, листа, стебля, соцветиях, семенах по следующим методикам: изучение мейоза и гаметогенеза микроспороцита - по методике Н.Э.Зайковской, Г.И. Ярмолюк (1968), определение фертильности пыльцевых зерен - по методике В.Н. Юрцева, В.А. Пухальского (1968), подсчет числа хромосом - по методике, разработанной в ВИР (1986), формирование зародышей и семени - по методике Э.П. Паушевой (1980), электофорез изоферментов в крахмальном геле - по Е.В. Левитес (1980). Цитологические препараты просматривали на микроскопах МБИ-6, МБИ-15, Ienaval. Фотографирование препаратов на микроскопах МБИ-15 и Ienaval, окуляр 8-10", объектив - 12,5-40". Рисунки выполнены при помощи рисовального аппарата РА-5 при увеличении 7x8.

Повторность каждого опыта 2-3-х кратная. Для математической обработки применялся дисперсионный анализ (критерий %2 и критерий Фишера) (Горя, 1978; Доспехов, 1979).

ИНДУЦИРОВАНИЕ ГАПЛОИДИИ ИЗ НЕОПЛОДОТВОРЕННЫХ СЕМЯПОЧЕК САХАРНОЙ СВЕКЛЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидии

В настоящее время широкое распространение в мировой практике получило использование гетерозисных гибридов при возделывании сахарной свеклы. Основным требованием, предъявляемым к родительским компонентам, используемых в селекции на гетерозис, является их гомозиготность по болыпин-

ству генов. В традиционной селекции гомозиготы ость материала достигается глубоким инцухтом, что влечет за собой инбредную депрессию.

Альтернативным путем получения гомозиготных линий сахарной свеклы является метод индукции гаплоидии из неоплодотворенных семяпочек в условиях in vitro, позволяющий в короткий срок получать гомозиготный материал практически по всем генам.

Процесс воспроизведения гаплоидных растений в условиях in vitro определяется прежде всего на генетическом уровне, но реализуется в зависимости от конкретных физиологических условий и различных по действию индуцирующих факторов (Балыгина, 1987; Атанасов, 1993; Бугенко, 1999; Подвигина, Знаменская, 1993).

Правильное использование индуцирующих факторов, способствующих повышению регенерационной способности неоплодотворенных семяпочек, не-возмоясно без глубокого изучения теоретических основ и закономерностей развития нового растительного организма в условиях in vitro.

Наши исследования показали, что важное значение в регуляции процесса образования гаплоидных структур играют такие эндогенные факторы, как гено-типические особенности донорского материала, стадии развития женского га-метофита, расположение экспланта на растении и другие.

Частота формирования гаплоидов у селекционного материала варьировала в широких пределах от 0,6 до 11,1 %, что является доказательством генетического контроля морфогенетического развития неоплодотворенных семяпочек. Наибольшую склонность к индукции гаплоидии проявлял селекционный материал, подверженный неоднократному инцухту, и гибридные комбинации с участием этого материала. Частота образования гаплоидных регенерантов у такого материала колебалась в пределах 1,7-11,1 % и 4,9-10,5 % соответственно. Формы с ЦМС и сорта-популяции проявляли значительно меньшую склонность к индукции гаплоидии - в среднем 2,0 %.

Нашими исследованиями было установлено, что отзывчивость данного материала на индукцию гаплоидии находилась в прямой зависимости от содержания аномальных структур в мужском гамепгофите (рис.1).

-14 регенерации ' Ч аномальных структур

Рис.1. Зависимость регенерационной способности неоплодотворенных семяпочек от количества нарушений в мужском гаметофите у селекционного материала.

Цитологическое исследование донорского материала позволили выявить некоторые особенности в развитии микрогаметофита фертильиых линий, выражающиеся в нарушении функций веретена, нерегулярном образовании кал-лозной перегородки, отсутствием цитокинеза в ходе мейоза, а затем в появлении нередуцированных гамет и аномальных пыльцевых зерен и микроспор. Наличие аномальных микроспор достигало 18,3 % (при 27 % стерильности) и пыльцевых зерен до 27 % у отдельных растений.

Согласно современным представлениям (Батыгина, 1987,2000), формирование женского гаметофита генетически связано с процессами дифференциации мужского гаметофита. Выявленные нами цитологические нарушения микрогаметофита, по-видимому, являются генетическим признаком, и могут использоваться в качестве маркеров при отборе донорского материала при индуцировании гаплоидии в культуре неоплодотвтренных семяпочек. Поэтому генотипы с наибольшими отклонениями в формировании генеративных органов имеют большую склонность к индукции гаплоидов в культуре in vitro.

Определенное значение при индуцировании гаплоидов сахарной свеклы имеют месторасположение неоплодотворенных семяпочек на соцветии и стадии развития зародышевых мешков. Нами установлено, что регенерационной способностью обладают семяпочки, содержащие зародышевые мешки на разных стадиях развития. Эксплаты из более крупных бутонов (1-10 бутоны от цветка) формировали 2-3,2 % гаплоидных проростков. Неоплодотворенные семяпочки из бутонов средней части соцветия (11-20 бутоны) образовывали 1,8-5,0 % ре-генерантов, а мелкие и менее развитые бутоны (21-30), расположенные в верхней части соцветия, индуцировали от 0,8 до 3 % гаплоидов.

Цитоэмбриологическое изучение стадий развития женского гаметофита показало, что гаплоидные регенеранты наиболее активно индуцировались из семяпочек, содержащих недифференцированные зародышеые мешки - 8 ядерные и прошедшие дифференциацию - 7-клеточные. Подобные зародышевые мешки имели семяпочки средней части соцветия - 16-20 бутоны вверх от цветка.

Склонность неоплодотворенных семяпочек к индукции гаплоидии в культуре in vitro зависит от места нахождения их на семенном растении. Максимальный выход гаплопродукции 4,5 % был зафиксирован при эксплантации семяпочек с центрального побега и почти в 2 раза превышал регенерационную способность семяпочек с ветвей второго порядка (2,5 %).

Регенерационная способность семяпочек зависела и от погодных условий в период введения в культуру. Анализ полученных нами данных показал, что при резких колебаниях дневных и ночных температур воздуха (16,4-19,6° С днем и 7,2-9,5°С ночью) наблюдалось увеличение выхода гаплоидных проростков с веточек нижнего яруса - до 5,8 % против 4,2 % с верхнего. Положительное влияние холода при индукции гаплоидов отмечалось и другими исследователями (Бугара, Русина, 1988; Таратонов, 1999; Lux et.al., 1990).

Воздействие экзогеных факторов на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек в условиях in vitro

Другая часть факторов, оказывающих значительное влияние на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек, искусственно создаются исследователями и относятся к экзогенным. Из комплекса экзогенных факторов существенным является сезонность выращивания донорского материала и введения в культуру. Нами установлено, что привлечение донорского материала, выращенного в поле, способствовало увеличению выхода гаплоидных регенератов до 4,9 % (табл.1).

При зимне-весенней (февраль-март) эксплантации семяпочек с растений, выращенных в условиях теплицы, количество регенерантов было значительно меньше.

Наши эксперименты по изучению условий культивирования семяпочек доказали возможность управления морфогенетическим процессом развития эксплантов. Культивирование эсплантов при 16 часовом фотопериоде и освещенности 5 тыс. люкс более чем в 2 раза стимулировало скорость развития и количество гаплоидных регенерантов. При этом выявлено существенное влияние генотипических особенностей донорского материала на выход гаплопро-дукции при различных условиях культивирования. У большинства генотипов условия темноты индуцировали в большей степени развитие каллуса.

Таблица 1 - Влияние сроков введения семяпочек в культуру in vitro для индуцирования гаплоидии

Условия Введено Получено

выращи- семяпо- новообразо- регенерантов

Годы вания чек ваний

растений- % от % от вве-

доноров шт. шт. % шт. новообра- денных се-

зований мяпочек

1989 поле 720 58 8,1 35 60,3 4,9

1992 595 40 6,7 28 70,0 4,7

1997 1835 34 1,8 29 85,3 1,6

1998 898 29 3,2 26 89,7 2,9

среди 1034,5 40,3 3,9 29,5 73,2 2,9

1992 теплица 946 15 1,6 11 73,3 1,2

1993 660 29 4,4 27 93,1 4,1

1997 1180 22 1,9 19 86,4 1,6

1998 1220 10 0,8 9 90,0 0,7

средн 1001,5 19 1,9 16,5 86,8 1,6

Критерий Фишера поле 9,5 2,72 3,86

теплица 13,23 5,77 5,99

теор. 7,71

Варьирование гормонального состава питательной среды влекло появление четырех основных направлений морфогенеза неоплодотворенных семяпочек:

- прямая регенерация (эмбриоидогенез);

- каллусогенез, образование неморфогенного каллуса;

- перерождение первичного регенеранта в каллусоподобную структуру с вторичной регенерацией растений (образование адвентивных побегов);

- формирование уродливых структур, перерождение первичного регенеранта в каллусоподобную структуру без дальнейшего развития.

Наличие в питательной среде гиббереллина в количестве 0,5-2,0 мг/л вызывало образование гаплоидных проростков путем прямой регенерации. Добавление к гиббереллину цитокининов (6-БАП и кинетина) и ауксинов (ИМК) в различных сочетаниях и концентрациях стимулировало развитие всех четырех направлений морфогенеза. Совместное действие гиббереллина, 6-БАП, ИМК в большей степени влияли на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек, чем присутствие в среде гиббереллина, кинетина, ИМК. На всех вариантах сред с 6-БАП наблюдался достаточно высокий (3-12 %) уровень регенерации, при этом от 20 до 100 % первичных регенерантов под действием гормонов имели измененную структуру и индуцировали от 1,1 % до 14,0 % вторичных регенерантов. Количество адвентивных побегов колебалось от 1 до 8 на один первичный гаплоидный проросток, что являлось важным моментом при дальнейшем размножении гаплоидных растений.

Определенное значение в регуляции индукции гаплоидов играет предварительная обработка эксплантируемых органов физическим факторами (холо-довой шок, рентгеновское облучение). Наши исследования показали, что выход гаплоидных регенерантов зависел от дозы рентгеновского облучения и колебался от 0,8 до 5,3 %. Оптимальная доза обработки составляла 3000 рентген, увеличение доз облучения вело к возникновению нежелательных мутаций.

Эмбриогенная способность семяпочек, подвергнутых обработке пониженной температурой +4-6 0 С, находилась в полной зависимости от времени года при введении эксплантов и экспозиции обработки. При ранне-весеннем введении семяпочек с растений, выращенных в теплице, наибольшее количество гаплоидных структкр (6,15 %) было получено при холодовой обработке в течение 3 суток, при введении летом - 4,12 % при длительности воздействия пониженной температурой в течение 2 суток. Данные результаты объясняются тем, что цветущие растения в теплице подвергались искусственному воздействию холодом и для индукции гаплоидии эксплантам требовалось большая экспозиция обработки.

Изучение совместного влияния холодовой обработки эксплантов и гормонального состава питательной среды на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек показало, что стимулирующий эффект наблюдался при нахождении эксплантов в холоде в течение 3 суток и дальнейшем культивировании на всех вариантах сред. Наибольшей склонностью к индукции гаплоидов

(6,4 %) обладали семяпочки после 3-х дневной холодовой обработки и культивируемые на питательной среде с 2 мг/л гиббереллина (рис.2).

% рег*н«рацнн

экспозиция обработки, сутки

4

питательные среды

1 - ГК-0,5 мг/л; 2-ГК-1,0 мг/л; 3 - ГК-2,0 мг/л; 4 - б-БАП-0,2 мг/л, ГК-2 мг/л, ИМК-0,1 мг/л

Рис.2 Зависимость регенерационной способности семяпочек от длительности холодовой обработки

ГАПЛОИДИЯ КАК УСКОРЕННЫЙ МЕТОД СОЗДАНИЯ ГОМОЗИГОТНЫХ ЛИНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

С получением новых гаплоидных растений перед исследователями встает задача создания гомозиготных линий и применение их в селекционном процессе. Эффективность использования таких линий в селекции прежде всего определяется способностью гаплоидов индуцировать новую генетическую изменчивость, которая не отмечается при обычном получении чистых линий путем самоопыления. Гибридизация полигаплоидов также приводит к большей изменчивости по сравнению с гибридизацией инцухт-линий (Головин. 1977; Gallais, 1978; D.Gerard, 1983). Получение гомозиготных линий сахарной свеклы путем индуцирования гаплоидов в условиях in vitro позволяет ускоренно создавать чистые линии в течение 1,5-2 лет, что сокращает длительность этого процесса в 5-6 раз (Атанасов, 1993).

Наши исследования показали, что гаплоидные регенераты на начальных этапах развития отличались слабым развитием и жизнеспособностью, что обусловлено их одинарным набором хромосом. Гибель растений на этой стадии достигала 45,5 % в зависимости от генотипа донорского материала. Реакция ре-генерантов на смену питательной среды была однозначной ^большинства генотипов и выражалась в незначительном образовании дополнительных побегов и дальнейшей гибели растений, достигающей почти 55 % по отдельным генотипам. В связи с этим, для формирования гаплоидных линий нами было предложено проведение этапа стабилизации, включающего последовательное исполь-

Формирование гаплоидных линий in vitro

зование питательных сред с различной гормональной нагрузкой и отбор наиболее жизнеспособных, активно растущих и размножающихся растений.

Согласно нашим наблюдениям, способность гаплоидных регенерантов быстро адаптироваться к условиям окружающей среды, а именно к смене питательной среды, и приобрести склонность к формированию пазушных побегов зависела от генетических особенностей донорского материала. Выживаемость гаплоидов, полученных путем прямой регенерации на средах с гиббереллином, после первого пассажа у различных генотипов колебалась от 45,5 % до 100 %. Развитие растений и скорость размножения при смене питательных сред (ростовая, безгормональная, ростовая) у некоторых генотипов происходили очень активно, что позволило к 4 пассажу получить 113 гаплоидных растений (регенераты от донора РФ 1338) (табл.2).

Таблица 2-Влияние генотипа при размножении гаплоидных эксплантов

(1992 -1993 г.г.)

Селекционный

материал Получено гаплоидных растений, шт

1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж 4 пассаж

РФ 1338 3 26 20 113

РФ 358 8 25 6 18

РФ 358-с 4 11 7 14

РФ 718 4 23 15 30

РФ 5 х РФ 636 3 10 10 43

При получении гаплоидных растений на средах, содержащих комплекс гормональных веществ, формировались адвентивные побеги различной величины и возникали проблемы образования уродливых структур, признаки витри-фикации у гаплоидных проростков. Повторное культивирование таких структур на среду с гормонами (6-БАП, кинетин, гиббереллин по 0,2 мг/л) влекло за собой гибель 23,3-34,4 % растений. Вероятно, это происходило из-за постепенного накопления в тканях фитогормонов выше необходимого физиологического уровня, что вело к появлению токсического действия, формированию растений с измененной морфологией и гибели (Сельскохозяйственная биотехнология, 1998). В связи с этим, этап стабилизации гаплоидных регенерантов с индукционных сред, содержащих комплекс гормонов - гиббереллин, 6-БАП, ИМК, заключался в чередовании следующих сред: безгормональная - ростовая - безгормональная.

За это время регенераты почти всех генотипов приобретали выравнен-ность и склонность к формированию пазушных побегов. Отбор наиболее развитых, неинфицированных растений позволил создать гаплоидные линии, характеризующиеся стабильной плоидностью и выравненностью по 1<П1, СсШ, Ме-1 изоферментным локусам (Феду лова, По двигана, 1994).

Диплоидизация и создание реституционных линий

Как известно, гаплоидные растения не способны давать потомство, так как при отсутствии гомологичных хромосом нарушено прохождение мейоза, что в результате приводит к формированию нежизнеспособных гамет (Бурма-кина, 1987). Для создания гомозиготных линий, способных участвовать в селекционном процессе, гаплоидные растения необходимо перевести на более высокий уровень плоидности.

Для сахарной свеклы известны различные способы получения полиплоидных форм на основе колхицинирования путем обработки 1) сухих и прорастающих семян (Бормотов, Турбин, 1972; Savitsky, 1968), 2) растений при образовании семядолей (Мосина, 1967; Демчинская, 1968), 3) головок маточных корнеплодов (Юсубов, Мосина, 1970; Rosenthal, 1958), 4) верхушек цветоносных побегов (Лутков и др., 1963; Ernould, 1946). Применение современных методов биотехнологии позволило проводить диплоидизацию при культивировании тканей in vitro с меньшими затратами и времени. Но удвоение хромосом в условиях in vitro происходило у незначительного количества обработанных микроклонов - до 38 % (Bossoutrot, Hosemans, 1985; Hansen et.a!., 1994; Hansen, Andersen, 1998).

Проведенное нами изучение различных способов обработки микроклонов сахарной свеклы раствором колхицина показало различную эффективность их применения. При погружении корневой системы пробирочных гаплоидных растений в раствор колхицина было установлено, что длительность обработки (36 и 48 часов) и повышенные концентрации мутагена (0,2 - 0,3 %) негативно влияли на обрабатываемые растения и увеличивали количество миксоплоидов. При накалывании колхицина на апексы гаплоидных растений, выращиваемых в фунте, было достигнута 100 % диплоидизация при концентрации мутагена 0,20,3 %. Однако, недостатками этих методов оказался большой расход колхицина, трудоемкость, отсутствие быстрого размножения диплоидизированного материала, что привело к необходимости проведения данного этапа работ в условиях in vitro.

Наши исследования показали, что добавление в питательную среду колхицина в концентрации 0,2-0,3 % вызывало полный некроз точек роста и гибель регенерантов. Снижение концентрации мутагена до 0,1 % приводило к угнетению микроклонов, выживаемость их снижалась до 60-65 %, диплоидизации подвергались 65,2-86,5 % выживших растений. Наиболее оптимальной оказалась концентрация колхицина 0,005 % при воздействии в течение двух суток. Количество диплоидных растений в данном случае составляло 83,3 % (рис. 3).

Цитологические иследования колхицинировнных микроклонов позволили нам обнаружить у миксоплоидных растений постепенный возврат к гаплоидному уровню плоидности.

время обработки

□ % выживаемости В % диплоидизации

2 суток

3 суток

2 суток

суток Э суток

0,005 концентрации колхицина

0,01

Рис.3 Состояние регенерантов свеклы после колхицинирования в условиях in vitro

Это происходит потому, что после обработки мутагеном некоторая часть клеток остается незатронутой действием колхицина, и так как цикл деления гаплоидных клеток примерно в 1,4 раза короче диплоидных (Давоян и др., 1972), то через некоторое время гаплоидные клетки способны восстановить прежний уровень плоидности растения. Вместе с тем, физиологически активные вещества группы цитокининов способствуют стимуляции деления полиплоидных клеток (Кунах, Сидоренко, Зосимович,1977; Nagl, Rucker, 1974), что было учтено в экспериментах Н.А.Таратонова (1999) при изучении стабилизации плоидности регенерантов сахарной свеклы после колхицинирования.

Проведенные исследования показали, что повышение концентрации кине-тина в питательной среде (0,5-1 мг/л) способствовали воспроизводству полиплоидных клеток. Культивирование регенерантов после колхицинирования на среде с 0,25 мг/л кинетина в течение месяца приводило к образованию в растениях 0,1 % гаплоидных клеток, 96,4 % - диплоидных, 3,5 % - миксоплоидных (табл.3). Проверка плоидности через 90 дней показала наличие 100 % диплоидных клеток.

Полученные автодиплоидные гомозиготные растения сахарной свеклы размножались в культуре in vitro путем регулярных пересадок на ростовую питательную среду (гиббереллин, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л). Пересадки на свежую питательную среду проводили через 4-6 недель, при этом отбирали наиболее жизнеспособные и неинфицированные растения. Сформированные реституционные линии пересаживали на питательную среду для корнеобразования, а затем в грунт теплицы. Наилучшим периодом посадки микроклонов в теплицу являлся весенне-летний период и смесь почвы с перегноем в качестве субстрата. Приживаемость микроклонов в данных условиях колебалась от 68,8 % до

87,5 %.

Таблица 3 - Влияние концентрации кинетина на воспроизводство клеток разной плоидности

Концентрация гормона, мг/л Количество у стачных клеток с числом хлоропластов, % (на 30 день) Количество дигаюидов,% (90 день)

до 12 12-14 более 14

1 0 27,4 72,6 35,0

0,75 0 49,3 50,7 60,0

0,5 0 73,9 26,1 80,0

0,25 0,1 96,4 3,5 100

контроль 9,5 85,4 5,1 20,0

Метод создания гомозиготных линий сахарной свеклы на основе индуцирования гаплоцдии

Гомозиготные линии сахарной свеклы получают принудительным самоопылением растений исходной формы в течение нескольких поколений. Недостатками известного способа является длительность получения линейного материала, большие затраты, невозможность получения линий от самонесовместимых растений и форм, обладающих мужской стерильностью. Методом, ускоряющим процесс создания гомозиготных линий, является способ получения линий при помощи опыления кастрированных растений или MC-форм пыльцой, обработанной у-лучами в дозе 1500-2000 Гр. (A.c. № 1708210, Жужжалова и др., 1991).

На современном этапе с развитием биотехнологии широкое применение нашел метод индуцирования гаплоидии в культуре репродуктивных органов.

Полученный нами в ходе исследований экспериментальный материал послужил принципиальной основой для разработки метода создания гомозиготного материала сахарной свеклы. Метод включает в себя несколько этапов:

-подбор донорского материала осуществляется путем использования любых генотипов, отдавая предпочтение гибридному и инцухтированному материалу. Для эксплантации используются веточки первого порядка и бутоны с 1 по! 0 от цветка.

-индуцирование гаплоидных регенерантов проводится с использованием предобработки холодом при температуре +4-6°С в течение 2-3-х суток и/или рентгеновским облучением в дозе 3000 рентген. Культивирование неоплодотво-ренных семяпочек осуществляется на питательной среде В5, содержащей 50 г/л сахарозы и гормональный комплекс: гиббереллин - 1 мг/л, 6-БАП - 0,3 мг/л, ИМК - 0,1 мг/л.;

-стабилизация гаплоидов осуществляется одновременно с микроразмножением и проводится в течение 3-4 пассажей с чередованием ростовой (гиббереллин, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) - безгормональной - ростовой сред для

нормально развитых регенерантов, и безгормональной - ростовой - безгормональной сред для для слабо развитых адвентивных побегов.

-диплоидизация гаплоидного материала осуществляется путем добавления в питательную среду 0,005% колхицина и выдержке на ней эксплантов в течение 48 часов. Стабилизация колхицинированных растений ведется при последующем культивировании на питательной среде, содержащей 0,25 мг/л кинети-на в течение месяца.

-микроразмножение реституционных линий проводится путем регулярных пересадок на ростовую питательную среду.

-формирование корней осуществляется при культивировании микроклонов на среде с 1 мг/л НУК. Затем следует пересадка клонов в грунт (рис.4).

В результате проведенных исследований нам удалось от одной исходной формы получать 6-38 гаплоидных регенерантов. Проведение всех последующих этапов позволило сформировать от 1 до 20 гаплоидных линий, а затем 1-18 реституционных линий. В конечном итоге 12 реституционных линий сахарной свеклы были переданы на Льговскую ОСС и в настоящее время участвуют в се-лекционо-генетической программе исследований.

ЭМБРИОКУЛЬТУРА В СИСТЕМЕ IN VITRO

Влияние возраста экспланта на процесс регенерации в условиях in vitro

Половая гибридизация является одним из средств создания генетического разнообразия исходного селекционного материала. Однако лишь ограниченное число межвидовых и внутривидовых скрещиваний может привести к получению полноценных гибридных растений (Прилюк, 1984; Дунаева, 2000; Jassem, 1976; Bosemark, 1979; Bajaj, Gosal, 1982; Savitsky, 1981; Nalini, 1999). Невозможность осуществления таких скрещиваний очень часто связана с приостановкой развития гибридного зародыша, что, в свою очередь, может быть обусловлено либо его ранней гибелью, либо дегенерацией эндосперма.

Поэтому для эффективного получения определенной генетической комбинации желаемых признаков традиционными способами используют метод эмбриокультуры,, позволяющий в условиях in vitro выращивать регенераты из зиготических зародышей на разных стадиях их развития.

В ходе проведенных нами исследований было выявлено, что на процесс регенерации в условиях in vitro большое влияние оказывает возраст экспланта. Введение незрелых зародышей сахарной свеклы в условия in vitro показало, что дальнейшее развитие наблюдалось у небольшой части экстшантов.

первичная регенерация

вторичная регенерация, 6-8 шт.

стабилизация и микроразмножение колхицирование гаплоидов

стабилизация и микроразмножение, депонирование полиплоидов

корнеобразование пересадка в грунт

Рис. 4 Схема получения гомозиготного материала сахарной свеклы in vitro

Общее количество полученных проростков колебалось от 1,3 до 33,9 %, но всего 25,8 % проростков были нормально развитыми (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние возраста зародышей на получение жизнеспособных

проростков

Возраст Введено Получено проростков

зародыша, дни эксплантов, всего, нормально развитых,

после опыле- шт. шт. % шт. %

ния

3 157 2 1,3 2 1,3

5 307 18 5,9 12 3,9

8 186 63 33,9 48 25,8

12 163 41 25,2 34 20,9

НСР0.05 0,39 0,39

Фенологические наблюдения позволили установить, что зародыши на ранних стадиях развития (3-5 дневные) формировали до 3,9 % нормально развитых проростков, но имели склонность в 20 % к образованию каллусной массы. По-видимому, недифференцированные ткани зародыша под действием гормонов питательной среды начинали активно делиться, образуя каллусы. Наибольшей склонностью к дальнейшему развитию в условиях in vitro обладали зародыши 8-12-ти дневные. Очевидно, это связано с тем, что в этот период происходит дифференциация тканей и активное формирование апикальных меристем и проводящей системы зародыша. Гормональный комплекс питательной среды, вероятно, в большей степени стимулирует деление клеток развивающихся эксплантов, увеличивая тем самым количество проростков в условиях in vitro.

Культивирование незрелых 8-12 дневных зародышей вместе с тканями семяпочки снижало уровень образования проростков на питательной среде до 41 %. По-видимому, окружающие ткани ингибировали развитие зародышей, что значительно снижало и количество полученных регенерантов. Подобное явление наиболее часто наблюдается при межвидовой гибридизации (Батыгина, 1974; Банникова, 1986).

Согласно нашим наблюдениям, культивирование зародышей свеклы вместе с тканями семяпочки способствовало и более длительному формированию регенерантов, которые визуально становились заметными через 8-14 дней нахождения в культуре и были слабо развитыми.

Вычлененные из семяпочек 12-ти дневные зародыши (их длина не превышала 2 мм) имели четко выраженные семядольные листочки и первичный корешок, и их выживаемость в условиях in vitro достигала 98 %. Введение в культуру вызывало активизацию деления меристематических тканей, в результате чего к четырем дням культивирования размеры эксплантов увеличивались вдвое, появлялась окраска гипокотиля и листьев.

Проведенные нами исследования позволили отметить, что на жизнеспособность незрелых зародышей в условиях культуры тканей влияет способ опыления. Так, при свободном опылении МС-растений частота формирования ре-генерантов была значительно ниже таковой при принудительном опылении этого же материала. Данная тенденция наблюдалась на различных этапах развития зародышей, и количество морфологически развитых регенерантов колебалось при свободном опылении от 0,6 до 22,7 % и в пределах 1,0-33,3 % при принудительном (рис.5).

Рис.5 Развитие зародышей в культуре in vitro при различных способах опыления

Очевидно, при принудительном опылении возрастала частота гибридизации и увеличивался процент жизнеспособных зародышей.

Проведенные нами попытки культивирования зрелых зародышей с целью восстановления селекционного материала из длительно хранившихся семян (урожай 1981 года) показали, что основную роль при этом играет генотип. У 9 изучаемых селекционных номеров лабораторная всхожесть семян колебалась от 0 до15 %. В условиях in vitro прорастание семян наблюдалось в пределах 26,960,6 %. Количество нормально развитых растений из них составляло 11,5-33,7 % в зависимости от генотипических особенностей материала.

Влияние условий культивирования на жизнеспособность зародышей

Одним из основных факторов при культивировании зародышей in vitro является состав питательной среды. Потребность изолированной завязи в питательных веществах изменяются в зависимости от того, в какой момент она была перенесена в условия in vitro - на ранних этапах, когда она содержит зиготу или ранний проэмбрио и ядерный эндосперм, или на более поздних стадиях, когда эмбрион дифференцирован и хорошо развит эндосперм (Butenko, Strogonov, Balabaeva, 1967; Fujimura, Komamine, 1975).

Экспериментальные данные, полученные нами в ходе исследований, подтвердили тот факт, что незрелым зародышам в возрасте 3 дней для дальнейшего

□ свободное опыление О принудительное опыление

развития требовалось наличие большего содержания сахарозы и гормонов в питательной среде. Количество нормально развитых проростков при этом не превышало 5,0 % (табл.5). С увеличением возраста зародышей их потребность в гормонах несколько снижалась.

Таблица 5 - Влияние состава среды и возраст зародышей на их жизнеспособность в условиях in vitro

3 дня 5 дней 8 дней

№ Гормон. Кол-во Получено пророспсов

состав сахара, всего, норм. всего, норм. всего, норм.

среды, г/л % разви- % разви- % разви-

мг/л тых^ тых,% тых,%

1 0 20 3,1 1,5 17,1 143 10,0 10,0

2 0 40 4,0 2,0 2,5 0 17,8 17,8

3 Гк,Кн, 20 0 0 1,0 0 333 25,0

БАП-0Д

4 Гк,Кн, 40 7,5 5,0 4,0 0 31,1 333

БАП-0,2

5 Гк,Кн, 20 1,7 1,7 12,0 12,0 24,4 24,4

БАП-0,1

6 Гк, Кн, 40 1,7 1,7 12,0 12,0 48,6 48,6

БАП-0,1

7 Гк,Кн-0,1 20 3,1 1,5 13,3 6,7 26,7 233

НУК-0,05

8 Гк,Кн-0,1 40 8,9 4,5 10,0 10,0 30,0 30,0

НУК-0,05

НСРо,о5 0,31 0,31 1,19 1,18 1,66 2,02

Сопоставляя полученные данные, можно проследить общую тенденцию -частота образования проростков увеличивалась при наличии в питательной среде большего количества сахара. Так, культивирование 8-ми дневных зародышей приводило к формированию 10,0-25,0 % растений на среде с 20 г/л сахарозы, а содержание 40 г/л углеводов стимулировало регенерацию 17,8-48,6 % введенных эксплантов.

Наши опыты по изучению культивирования зрелых зародышей сахарной свеклы не выявили острой потребности их в гормональных веществах. Наибольшее количество всхожих семян (59,5 %) и потом развитых регенерантов (31,0 %) наблюдалось при культивировании семян на безгормональной питательной среде. Увеличение углеводного питания положительно влияло на прорастание семян в условиях in vitro.

Определенное значение при культивировании незрелых зародышей имеет и температурно-световой режим. В ходе исследований было выявлено, что незрелые зародыши сахарной свеклы в условиях культуры тканей развивались

как на свету, так и в темноте. В темновых условиях культивирования происходило формирование большего количества недифференцированных структур -каллусы, разросшиеся и верифицированные ткани листьев и гипокотилей. Это увеличивало общее количество полученных проростков с 4,0 до 48,6 %, но одновременно снижало и образование нормально развитых регенератов с 18,9 до 2,7 %. Культивирование эксплантов на световом режиме снижало формирование недифференцированных структур и положительно влияло на развитие жизнеспособных проростков, количество которых увеличивалось с возрастом зародышей до 2,5 -9,0 %.

Возможность применения эмбриокультуры для получения межвидовых гибридов и апомнктичных форм

Дикие сородичи сахарной свеклы, представленные видами из секций Patellaris и Corollinae, как правило, от скрещиваний с Beta vulgaris дают нежизнеспособные или стерильные в силу отсутствия гомологии между хромосомными наборами гибриды (Jassem, 1976). В настоящее время современная техника культуры зародышей и тканей делает реальным более интенсивное вовлечение диких сородичей в работу по переносу желаемых генов от диких форм в культурные сорта сахарной свеклы.

Проведенные нами исследования по получению и доращиванию в условиях in vitro межвидовых гибридов Beta vulgaris и Beta corolliflora, Beta trigyna показали, что недифференцированные зародыши прорастали на питательной среде с частотой 1,3-7,3 %, но на ранних стадиях развития погибали (рис.6)

В corolliflora В. trigyna »»»

□ частота формирования проростков. Ч 0виживаемость проростков. %

Рис.6 Развитие незрелых межвидовых зародышей в условиях in vitro

С увеличением возраста зародышей их жизнеспособность увеличивалась и достигала 25,0 % в скрещиваниях с В. corolliflora и 27,4 % с В. trigyna. При этом также наблюдалась ранняя гибель части регенерантов и образование не-морфогенных структур. В результате этого выживаемость проростков снижалась до 12,5 и 16,2 % соответственно. Дальнейшее культивирование проростков

от межвидовых скрещиваний выявило наличие морфологических признаков диких видов свеклы.

Изучение в условиях in vitro селекционного материала с признаками апо-миктического развития семян выявило низкую склонность клеток зародышевого мешка к автономному развитию. Формирование апомиктичных зародышей в условиях культуры тканей прежде всего зависело от генотипа донорского материала. Частота образования нормально развитых проростков колебалась от 1,4 % до 12,5 %. Однако следует отметить, что до 30,8 % проростков погибали на ранних стадиях своего развития.

На основании проведенных исследований установлены параметры культивирования незрелых и зрелых зародышей сахарной свеклы, позволяющие выращивать растения в условиях in vitro от внутри- и межвидовых скрещиваний и восстанавливать ранее созданный и длительно хранившийся в семенах селекционный материал.

СОХРАНЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Влияние состава питательной среды при длительном беспересадочном культивировании

Проблема сохранения большого количества генотипов различных культур сейчас стоит очень остро. Хранение живой ткани в виде семян не всегда возможно, в виде вегетативного материала - требует много затрат и большие земельные площади.В настоящее время наиболее надежной стала технология сохранения материала в условиях in vitro в виде растущих коллекций или в виде клеточных или меристемных культур, хранящихся в криобанках при глубоком замораживании в жидком азоте (-196° С). Реально возможным при длительном сохранении материала в культуре in vitro является изменение состава питательной среды.

Проведенные нами исследования по изменению минерального состав питательной среды (замена хлорида кальция на нитрат) показали, что повышенное содержание азота вызывало активный рост микроклонов в течение первых 6 месяцев культивирования, а затем наблюдался резкий спад ростовых процессов и некроз нижних листьев. В связи с этим выживаемость эксплантов к 9 месяцам субкультивирования снизилась до 70 % при 75 % на контроле.

Аналогичная тенденция развития микроклонов была установлена при использовании сред с уменьшенным вдвое количеством макросолей. В результате этого к 12 месяцам депонирования не более 30 % растений оставались живыми.

Создание более плотной питательной среды за счет увеличения количества агара (до 16 г/л при норме 7 г/л) вызывало замедление интенсивности роста растений, тем самым увеличивая беспересадочный период. В течение всего периода культивирования наблюдался замедленный рост микроклонов, не превышающий 0,6-0,2 см в месяц (табл.6). Выживаемость растений после 12 месяцев

депонирования колебалось от 80 % до 90 % на изучаемых вариантах сред при 45 % на контроле.

В ходе экспериментов по изучению влияния различных концентраций сахарозы на длительность субкультивирования микроклонов сахарной свеклы нами было установлено, что уменьшение количества углеводов (15-5 г/л при норме 20 г/л) приводило к активизации роста в первые 4-6 месяцев. Затем, вероятно, из-за недостатка углеводного питания, происходила некротизация листьев и гибель растений, при этом их выживаемость к 9 месяцам субкультивирования снизилась до 75-80 %.

Таблица 6 - Влияние модифицированного состава питательной среды на развитие микроклонов свеклы при депонировании

Ингибирующее Концен- Средний Период 12 месяцев

тра-

вещество ция, ежемесяч- активно- отмершие выжива-

г/л ный при- го роста, листья, емость,

рост, месяц % %

см

Сахароза 5 0,5 6 55,0 75

Сахароза 100 0,2 4 68,0 65

Глюкоза 10 0,7 7 56,1 80

Сахаро- 10:4 0,07 4 62,5 80

загсорбит 13 0,2 12 30,0 80

Агар - 0,6 5 69,0 60

Контроль

НСР 1,46 1,78

Повышенное содержание сахарозы (40-60 г/л) не действовало угнетающе на растения свеклы, в течение 7 месяцев они активно росли. К 9 месяцам депонирования микроклоны имели 56,8 % и 51,3 % отмерших листьев, но их выживаемость составляла 100 % и 95 %. Снижение активности роста у растений наблюдалось с повышением количества сахарозы до 80-100 г/л. Высота опытных растений по отношению к контролю составляла 61,7 %, а среднемесячный прирост не превышал 0,2 см. После 9 месяцев субкультивирования микроклоны сохраняли до 52 % живых листьев и 100 % выживаемость. Вероятно, такое увеличение количества сахарозы вызывало осмотический стресс у растений сахарной свеклы, что позволяло замедлять рост и дольше сохранять жизнеспособность.

Наши исследования по замене сахарозы глюкозой в количестве 5-20 г/л показали, что равнозначная замена не оказывала ингибирующего действия на микроклоны свеклы. Период активного роста увеличивался до 7 месяцев, выживаемость после 12 месяцев субкультивирования составляла 60 %. Снижение количества глюкозы до 10-5 г/л способствовало сохранению 43,9-32,2 % листо-

вого аппарата и 80-85 % растений после 12 месяцев беспересадочного культивирования.

Проведенное нами изучение состояния микроклонов при депонировании на питательных средах с частичной заменой сахарозы сорбитом (5 г/л сахарозы + 2 - 4 г/л сорбита) выявило, что у растений в первые 7 месяцев наблюдался активный рост, а затем еще более активно началось отмирание нижних листьев, что повлекло снижение высоты растений от -0,7 до -0,9 см в месяц. К 12 месяцам депонирования при значительной гибели листового аппарата - 73,2-81,1 % резко снизилась выживаемость растений - 45-65 %.

Увеличение содержания сахарозы до 10 г/л и наличие 2-4 г/л сорбита снижали активность роста микроклонов и некроз листьев, тем самым увеличивая выживаемость эксплантов до 80 %. Наибольшим ингибирующим эффектом обладала питательная среда, содержащая 10 г/л сахарозы и 4 г/л сорбита, но физиологическое состояние растений этого варианта было неудовлетворительным.

Для проведения дальнейших исследований нами были отобраны два варианта питательных сред - с повышенной концентрацией агара (13 г/л) и наличием глюкозы (10 г/л), позволяющие при длительном субкультивировании на них сохранять высокую выживаемость и жизнеспособность микроклонов сахарной свеклы.

Роль химических ингибиторов при депонировании микроклонов сахарной свеклы

Все физиологические процессы, в том числе и рост, осуществляются через механизмы гормонально-ингибиториой регуляции, изменить направление которой в условиях in vitro возможно путем добавления определенного физиологически активного вещества в питательную среду.

В наших исследованиях для снижения активности ростовых процессов и увеличения сроков беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы было установлено, что применение гидразида малеиновой кислоты (ГМК) в концентрациях 0,5-2 мг/л оказывало стимулирующий эффект на растения. Активизация роста эксплантов в течение первых 3-5 месяцев вела при дальнейшем культивировании к некрозу 70 % листьев и, следовательно, к отрицательной величине среднемесячного прироста -0,4-0,6 см. Это повлияло на выживаемость микроклонов, которая к 9 месяцам депонирования составляла 30-60 % при 75 % живых растений на контрольном варианте (табл. 7).

Аналогичное стимулирующее действие на растения сахарной свеклы оказывал препарат 2,4-Д. Активный рост отмечался в течение 7-8 месяцев у микроклонов, культивируемых на средах с 0,001 и 0,01 мг/л 2,4-Д, высота их достигала 4,7 см при 3,4 см на контроле. Некроз 71,9 % листьев после 9 месяцев культивирования приводил к снижению высоты растений на 0,9-1,2 см и выживаемости до 15 %.

Таблица 7 - Развитие микроклонов свеклы при субкультивировании на средах, содержащих ингибирующие вещества

Ингибирующее Концентра- Средний Период 12 месяцев

вещество ция, ежеме- активно- отмер- выжива-

мг/л сячный го шие ли- емость,

прирост, роста, стья, %

см месяц %

ГМК 0,5 0,5 5 - 60

2,4-Д 0,001 0,7 8 62,3 85

ССС 2,5 0,2 9 32,7 60

Салициловая к-та 0,2 0,6 6 64,7 95

Феруловая к-та 3,0 1,2 7 70,0 55

Контроль - 0,2 4 66,7 60

НСР 0,704 0,743

Увеличение концентрации 2,4-Д до 0,1 мг/л индуцировало образование каллусной и витрифицированной тканей, что недопустимо при длительном культивировании эксплантов.

В ходе проведенных экспериментов нами было установлено, что добавление в питательную среду хлорхолинхлорида (ССС) в концентрациях от 0,05 до 1,0 мг/л не оказывало ингибирующего эффекта на растения свеклы. Стимуляция роста, как и в предыдущих опытах, при 12-ти месячном субкультивировании приводила к 30 - 55 % гибели растений. Замедленный рост клонов в течение 9 месяцев был отмечен на варианте среды, содержащей 2,5 мг/л ССС. После 12 месяцев депонирования наблюдалась сохранность 67,3 % листового аппарата и 60 % растений. Наличие 5,0 мг/л ССС в среде сильно ингибировало рост микроклонов, прирост был отрицательной величиной -0,1-ОД см, в результате чего к 12 месяцам субкультивирования оставалось живыми лишь 50% эксплантов.

Применение в качестве ингибитора феруловой кислоты не дало ожидаемого результата. Данный регулятор роста в концентрациях от 3 до 10 мг/л действовал как стимулятор, активизируя рост растений до 5,8 см в течение 5 месяцев. В результате последующего некроза листьев оставалось живыми лишь 35,5-24,7 % листового аппарата и выживаемость растений к 12 месяцам субкультивирования снижалась до 20-55 %.

При добавлении в питательную среду другого регулятора роста феноль-ной природы - салициловой кислоты, было установлено ингибирующее действие данного вещества на микроклоны сахарной свеклы. Замедленный рост в течение первых 6 месяцев культивирования на средах, содержащих 0,001-0,8 мг/л салициловой кислоты, позволил к 12 месяцам депонирования сохранить 33,938,1 % листового аппарата. При этом выживаемость растений колебалась в пределах 60-95 %. Увеличение концентрации ФАВ (1-2 мг/л) продемонстрировало наиболее сильный ингибирующий эффект по отношению к микроклонам сахар-

ной свеклы. Средняя величина прироста не превышала 0,3 см и выживаемость растений к 12 месяцам субкультивирования составляла 65-95 %. Однако физиологическое состояние растений было неудовлетворительным.

В результате проведенных нами экспериментов для дальнейшего изучения были выделены два варианта питательных сред, содержащие 2,5 мг/л ССС и 0,2 мг/л салициловой кислоты, позволяющие при небольшой величине среднемесячного прироста (0,2-0,6 см) в течение 9-12 месяцев депонирования сохранять 90-95 % микроклонов.

Гистохимическое и анатомо-морфологическое изучение микроклонов

сахарной свеклы при длительном беспересадочном культивировании '

В основе роста и развития растений лежит реализация генетической информации, которая определяется системой эндогенной биологической саморе- 4 гуляции, формирующейся под действием внешних факторов. Экспериментальное воздействие на растительную клетку экзогенных эффектонов вызывает изменение эндогенной регуляторной системы, экспрессию генетической информации, поднимает на более высокий уровень метаболизм растения (Кефели, 1984; Полевой, Саламатова, 1991; Шевелуха, 1992).

Проведенные нами совместно с Цупиковой Л,А, (2002) гистохимические исследования подтвердили общеизвестный факт, что наибольшая интенсивность реакций главных составляющих метаболических, структурных и функциональных основ клетки (белки, липиды, углеводы) проявлялась в период активного роста микроклонов. Этот период на контрольном варианте среды (безгормональная среда) длился 3-5 месяцев, на опытных вариантах - до 9 месяцев.

Нашими исследованиями было выявлено, что с увеличением срока депонирования микроклонов происходило накопление белковых веществ: пептиды и низкомолекулярные белки обнаруживались в наружных, ассимилирующих тканях паренхимы, полипептиды накапливались в точках роста и окружающих их паренхимных тканях, белки ароматического ряда - в проводящих тканях и точках роста. У микроклонов, культивируемых на среде с ССС, отмечалось преобладание пептидов и низкомолеклярных белков, на других вариантах сред, и особенно с агаром, - полипептидных соединений. ,<

При проведении анализа на наличие аминокислот было установлено, что наибольшая интенсивность реакции наблюдалась в точках роста, молодых ли- '

стьях, в клетках эпидермы и проводящих сосудов. Это указывает на активность .

процессов метаболизма, идущих в данных тканях. В черешках листьев, в старых листьях отмечено незначительное содержание аминокислот. Наличие ингиби-рующих факторов, особенно ССС и салициловой кислоты, снижало интенсивность реакции на аминокислоты.

Сопоставляя наши данные с результатами других исследователей (Кулае-ва, 1973, 1988; Бавина, Константинова, Аксенова, 1975), можно предположить, что растительный организм в этом случае проявляет генетически закрепленную

целесообразность ответных реакции-на воздействия экзогенных факторов, регулируя белковый синтез клеток в создавшейся ситуации.

Изучение ферментативной активности тканей растений свеклы при депонировании показало, что интенсивность качественных реакций к 9 месяцам субкультивирования достигала максимума, а затем уменьшалась. Качественная реакция на цитохромоксидазу прявлялась с большей интенсивностью в ассимилирующих тканях паренхимы и проводящей системе. Реакция на пероксидазу наблюдалась более интенсивно в тканях точки роста и проводящей системе. На опытных вариантах сред отмечалось снижение интенсивности реакций на ферменты, Особенно на цитохромоксидазу при культивировании с дефицитом глюкозы. Вероятно, недостаток углеводного питания снижал энергетическую активность дыхательных процессов. Снижение интенсивности реакций на ферменты, вероятно, связано с приостановкой ростовых и структурно образовательных процессов в период депонирования. Нарушения в деятельности ферментных систем, по-видимому, также определяется действием генетических факторов, локализованных в ядре и других органелах клетки, содержащих ДНК (Powling, 1982).

Усиление интенсивности реакции на аскорбиновую кислоту было нами отмечено в течении периода роста регбнерантов. Локализация аскорбиновой кислоты наблюдалась в зоне проводящих сосудов, эпидермальных и паренхим-ных тканях листьев и стеблей. Наличие в питательной среде химических ингибиторов и глюкозы снижало интенсивность реакции на аскорбиновую кислоту.

Проведенная нами качественная реакция на глюкозу позволила выявить локализацию данного углевода в проводящих и ассимилирующих тканях и отметить возрастание интенсивности реакции при длительном культивировании. Наиболее интенсивное окрашивание препаратов отмечалось у растений, выращиваемых на среде с глюкозой.

Гистохимическое изучение микроклонов свеклы при депонировании на наличие крахмала показало, что в первые месяцы культивирования обнаруживались декстрины - промежуточные продукты гидролиза крахмала, растворимые в воде. Наиболее интенсивно они окрашивались в меристематических тканях точек роста. При дальнейшем культивировании (3-6 месяцев) крахмал был обнаружен в виде мелких зерен во всех ассимилирующих тканях, вдоль проводящих сосудов и в паренхимных клетках в основаниях точек роста. К 12 месяцам депонирования наблюдалось укрупнение крахмальных зерен, что свидетельствует о запасной функции данного углевода. Запасной крахмал локализовался в основном в паренхиме апикальной точки роста и основании пазушных точек роста. Мелкие фракции крахмальных . зерен, располагались вдоль проводящей системы преимущественно в верхней части побега.

Наличие в питательной среде ССС сокращало количество мелких фракций крахмала во всех тканях растений, при этом крупных фракций отмечено не было. Повышенное содержание в среде агара стимулировало у культуральных растений образование амилопластов в клетках эпидермы. По-видимому, при осмотическом действии агара затруднялась подача минеральных веществ из пи-

тательной среды, что вело к обменным реакциям, направленным на накопление запасных веществ в виде крахмальных зерен.

В ходе исследований на наличие основного опорного полисахарида клеточных стенок растений - целлюлозы (клетчатки) нами было установлено, что с увеличением времени культивирования усиливалась интенсивность реакции. Это свидетельствовало о накоплении клетчатки в тканях регенерантов, располагающейся вокруг проводящих сосудов. Наиболее яркой интенсивностью окрашивания были отмечены препараты растений, культивируемые 12 месяцев на средах, содержащих ССС и увеличенное количество агара. Действие ССС на процесс одревеснения изучено давно и применяется в сельском хозяйстве прежде всего для увеличения прочности соломы у злаковых культур (Витвицкий, 1979; Лаханов, 2001; Hoffman, 1974).

Растения сахарной свеклы в условиях in vitro представляют собой укороченные стебли с расположенными на них по спирали листьями, собранных в розетку. В пазухах листьев закладываются пазушные или боковые почки, ростовая активность которых зависит от состава питательной среды.

Проведенные нами цитологическое и анатомо-морфологическое изучение черешков и листьев свеклы показало, что у растений, выращенных в условиях in situ, в "ушках" черешков с ребристой наружной стороны и вокруг центрального проводящего пучка располагалось 2-3 слоя клеток уголковой колленхимы, паренхима состояла из 7-8 слоев мелких, плотно расположенных клеток, встречались сросшиеся кристаллы оксалата кальция - идиобласты. Все это придавало прочность черешку.

В черешках кулыуральных растений нами было отмечено отсутствие уголковой колленхимы, наличие дополнительных проводящих сосудов, 3-4 слоя клеток паренхимной ткани более крупных размеров и рыхлой структуры.

В ходе цитологического изучения поперечного среза листа растений in vitro выявлено формирование более крупных клеток мезофила с рыхлой структурой. Проводящие пучки данных растений были погружены, жилки не выступали над поверхностью листовой пластинки. У микроклонов, культивируемых на средах с комплексом гормональных веществ, наблюдались в центральной жилке листа слившиеся проводящие сосуды. Количество слоев клеток уголковой колленхимы вокруг жилок листа у микроклонов in vitro было в 2-2,5 раза меньше, чем у растений in situ. Также в листьях кулыуральных растений отмечено значительно меньшее количество кристаллов оксалата кальция. У растений, подвегнутых длительному беспересадочному культивированию, кроме всего было замечена беспорядочная структура палисадной паренхимы листа.

Рекультивирование микроклонов сахарной свеклы после депонирования

Длительное беспересадочное культивирование на питательных средах, содержащих ингибирующие вещества, является для растений сильным стрессом. При прекащении действия экстремального фактора организм возвращается к оптимальным условиям среды, включая механизм репарации. В общем плане

он состоит из усиления всех заблокированных стрессом процессов (синтез, энергообразование и т.д.), нормализации разнообразных функций до оптимального уровня и зависит от мобилизации потенциальных возможностей различных физиологических реакций, изменений взаимосвязанных процессов, что обусловлено генетическими особенностями материала (Олейникова, 1976; Stocker, 1961).

Проведенные нами исследования показали, что ослабленные после длительного беспересадочного культивирования микроклоны свеклы проявили различную реакцию при переносе их на свежую питательную среду. Растения, депонируемые на средах с измененным минеральным и углеводным питанием, на свежей питательной среде чувствовали себя прекрасно: активно росли (высота составляла 2,7 см) и формировали пазушные побеги, количество которых достигало 17 шт. на одну пробирку. Средний коэффициент размножения растений на гормональной питательной среде колебался от 8,2 до 10 черенков (табл. 8).

Таблица 8- Действие ингибирующих веществ на рост и развитие

регенератов свеклы при последующем культивировании

№ Ингибиру- Концен- Ростовая среда Безгормональная среда

п/ ющие трации ср. высота ср.коэф. ср. высота ср. коэффи-

п вещества растений, размно- растений, циент раз-

см жения см множения

1 Ca(N03)2 8 г/л 1,1 9,2 1,6

10 1,8 8,5 2,0 1

12 1,8 9,5 2,1 . 1

14 1,3 8,3 2,0 1

2 сахароза 5 г/л 1,5 8,2 2,2 .. 1

10 1,2 9,8 1,9 1

15 1,4 10 2,5 1

3 салицило 0,5 мг/л U 8,5 1,0 1

вая кисло- 1,0 1,1 10,8 0,9 1

та 1,5 1,2 8,0 3,0 1

2,0 0,8 7.8 0,0 1

4 ГМК 0,5 мг/л 0,9 10,2 U 1

1,0 1,0 10,8 0,9 1

1,5 U 9,2 1Д 1

2,0 1,0 9,8 1,4 1

5 Феруло- 0,5 мг/л 1,7 7,5 1,5 1

вая 1,0 13 10 2,5 1

кислота 1,5 1,7 9,0 3,3 1

2,0 1,5 9,3 14 1

Заметное последействие на рост регенерантов при культивировании на ростовой и безгормональной средах оказывали ингибиторы роста, в частности салициловая кислота и ГМК. Средняя высота растений после 4 недель культивирования не превышал 1,3 см и 1,4 см на свежих средах. Это свидетельствует о том, что в тканях растений происходило постепенное накопление ингибирую-щих веществ выше необходимого физиологического уровня, что вело в дальнейшем к появлению токсического действия и торможения роста. Однако данный факт не повлиял на пролиферацию пазушных меристем и коэффициент размножения составил 10,8/ Длительное беспересадочное культивирование на среде с феруловой кислотой не оказало ингибирующего действия на дальнейшее выращивание микроклонов в условиях in vitro.

Проведенные нами фенологические наблюдения позволили определить заметное влияние всех химических ингибиторов на морфологические признаки растений, проявляющиеся в формировании мелких, узких, с бледной окраской листовых пластинок.

Дальнейшее культивирование регенерантов на гормональной ростовой среде для размножения привело к исчезновению морфологических отличий. При этом не отмечалось последействия ингибирующих веществ на последующих этапах микроразмножения, корнеобразования, посадки в грунт и вегетации.

Результатом проведенных исследований явилась разработка метода длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы (до 12 и более месяцев), включающего несколько этапов: -введение и микроразмножение материала; -депонирование на модифицированных средах; -рекультивирование и микроразмножение; -корнеобразование и пересадка в грунт.

Метод позволил создать коллекцию ценных генотипов сахарной свеклы, состоящую из 28 селекционных номеров, и сохранять их в течение 3-х лет. А также в течение 6 лет поддерживать коллекцию стевии из 37 сортообразцов в условиях in vitro.

ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

Пути и способы воспроизведения растений сахарной свеклы в условиях in sito и in vivo

Морфогенез - процесс формирования, заложения, роста и развития органов (органогенез), тканей (гистогенез), клеток (цитокинез). В процессе роста и развития возникает целостный организм специфической формы в соответствии с генотипом вида и конкретными условиями существования. Можно сказать, что морфогенез - это процесс превращения питательных веществ в структуру тела.

Исследования, посвященные изучению морфогенеза у сахарной свеклы, немногочисленны и, в основном, освещают особенности органогенеза (Кобозева, 1962; Красочкин, 1971; Жужжалова, 1999) и взаимосвязь этапов органогенеза с возрастными изменениями растений в период развития (Фоменко, 2003).

Онтогенетическое развитие растений сахарной свеклы в условиях in situ начинается с прорастания семени, при этом меристематическая верхушка стебля в основании семядолей является очагом листообразования. Листья формируются в течение всего вегетационного периода и располагаются по спирали. В первый год вегетации образуется корнеплод и розетка листьев. Головка корнеплода является стеблем с укороченными междоузлиями, с верхушечной и пазушными почками. Верхушечная почка находится в центре головки корнеплода, и из нее формируется центральный стебель с листьями. Из пазушных почек образуются побеги второго порядка. Почки дают начало цветоносным побегам на 2 году жизни или позднее.

Согласно литературным источникам и собственным наблюдениям (Ха-речко-Савицкая, 1940; Зайковская, 1968; Жужжалова, 1971; Подвигина, 1994) воспроизведение нового организма у сахарной свеклы происходит прежде всего путем формирования семени в течение 28 дней. Развитие зародыша в этот период условно делится на следующие этапы:

3-х дневный - четырехклеточйый'проэмбрио;

S-ти дневный - шаровидный зародыш на суспензоре;

8-ми дневный - сердцевидная стадия зародыша;

12-ти дневный - торпедовидная форма зародыша;

16-ти дневный - зародыш изгибается по форме зародышевого мешка и

достигает его половины;

20 -ти дневный - зародыш достигает 3/4 размера зародышевого мешка; 24-х дневный - зародыш дорастает до халазального конца семяпочки и принимает кольцеобразную форму;

28-ми дневный - заканчивается полная дифференциация зародыша. Анализируя литературу, также было выявлено, что кроме полового пути образования нового индивидуума у сахарной свеклы наблюдается бесполый путь при семенном воспроизведении, проявляющийся в явлениях полиэмбрио-нии и апомиксиса. При полиэмбрионии наблюдается образование двух и более зародышей в одном зародышевом мешке или семени. Аналогичное явление отмечалось ранее другими исследователями у многосемянных форм свеклы как аномальное (Харечко-Савицкая,1940; Зайковская, 1968) и рассматривалось как проявление близйец'овости (Добрецова^ Лутков, Манжос, 1965; Kruse, 1960). Позже была установлена цитоэмбрйологическая (Жужжалова, 1978) и генетическая (МалеЦкий, Малецкая, Костыря,1988) природа данного явления, подтверждающие факт формирования репродуктивных органов.

Наличие нуцелярных (Зайковская и др., 1978; Сеилова, Коновалов, Балков, 1994) и интегументальных (Сеилова, Абдурахманов, Хайленко, 1984) зародышей (эмбриоидов) было обнаружено у некоторых форм свеклы, обладающих элементами апомиктического размножения.

Сахарная свекла обладает способностью и к вегетативному размножению, основанное на отделении ростовых почек и новых растений от материнского организма. Получение клонов с головки корнеплода нашло свое широкое применение в селекционной практике сахарной свеклы в прошлом веке (Мазлумов, 1996). Для ускорения селекционного процесса, а главное, для обеспечения участия в направленном регулировании опыления, корни-педигри резались на 6-8 частей, из которых одну часть использовали для клонирования, а остальные -для получения семян в этом же году. С часта корнеплода, предназначенного для размножения, после укоренения вырезали 1-5 клонов и снова укореняли. Таким образом в течение 3-4 лет получали 300 и более клонов, идентичных материнскому растению.

Кроме того, у сахарной свеклы обнаружено такое явление, как "террато-логическое изменение" - возникновение растений из меристемных тканей стебля. У растений 2 года жизни наблюдается образование на стеблях вегетативных проростков, представляющих из себя сформированную розетку листьев, укороченный стебель и корневую часть. При отделении данных растений от материнского организма и посадки в грунт, они достаточно хорошо приживаются (60%), что может быть использовано а селекционной практике для сохранения исходных форм. Аналогичные данные отмечались и другими исследователями (Тутаюк, Алиева, 1975; Нуждина, 1992; Цупикова, 2002).

Согласно литературным данным и собственным наблюдениям, у сахарной свеклы морфогенез в условиях in situ и in vivo может осуществляться половым и бесполым путем, вызывая образование новых организмов. Поэтому сахарная свекла размножается семенами и вегетативными структурами. Это дало нам основание полагать, что развитие растений свеклы в условиях in situ и in vivo подчиняется закономерностям, выявленных для высших цветковых растений, и определить пути морфогенеза: при семенном половом размножении как эмбриогенез, при семенном бесполом - эмбриоидогенез, при вегетативном - геммори-зогенез.

Цитоэмбриологические особенности эмбриогенеза, эмбриоидогенеза и органогенеза у сахарной свеклы в условиях in vitro

Реализация конкретного пути морфогенеза в условиях in vitro детерминирована, т.е. в значительной мере определяется генетическими и физиологическими характеристиками индивида и условиями культивирования. Пластичность растительных клеток весьма высока, что вероятно, определяется их тоти-потентностью и ведет к глубоким морфогенетическим перестройкам на разных этапах развития организма. Такие перестройки могут быть вызваны нарушениями определенных морфогенетических корреляций на клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях.

Морфогенез в условиях in vitro осуществляется различными способами и имеет разные морфологические проявления при получении регенерантов. Как

показали наши исследования в культуре тканей сахарной свеклы воспроизведение растений идет путем прямой регенерации и через каллусогенез.

Формообразовательные процессы развивающихся эксплантов сахарной свеклы (вегетативных и генеративных структур) достаточно часто осуществляется посредством каллусогенеза. Каллус - это гетерогенная структура, образующаяся в результате пролиферации клеток на раневой поверхности растительных объектов. Каллус представляет собой гетерогенную интегрированную систему, поскольку образуется из исходно разных клеток генеративных или вегетативных органов. Его морфогенетические потенции видоспецифичны и могут меняться в процессе генезиса и в определенной степени зависят от определенных факторов (температуры, влажности, времени культивирования и т.д.). Каллус состоит из неоднородных клеток, тотипотентность которых различна, что и определяет их различные пути морфогенеза.

Проведенные нами исследования показали, что при культивировании вегетативных и генеративных структур сахарной свеклы под действием гормонального комплекса питательной среды формируются морфогенные каллусы (более плотной, мелкозернистой структуры, белого или желтоватого цвета), склонные к образованию корней - ризогенез, ростовых почек - геммогенез, реже все вместе - гемморизогенез. Рыхлые, водянистые, крупнозернистые каллусы чаще всего не способны к органогенезу и быстро некротируют. Воспроизведение растений из каллусных структур возможно при геммогенезе и гемморизо-генезе, если не наблюдается физиологических отклонений в развитии регене-рантов. Часто индуцирует развитие каллусов у эксплантов сахарной свеклы присутствие в питательной среде цитокининов, особенно 6-БАП, но этот гормон вызывает витрификацию тканей регенерантов, что недопустимо на многих этапах культивирования. Но в связи с тем, что каллус является нестабильной системой и при этом увеличивается период получения регенерантов, то нами был выбран путь прямой регенерации новых особей свеклы из генеративных и вегетативных структур в условиях in vitro.

При прямой регенерации наблюдается несколько путей морфогенеза культивируемых структур сахарной свеклы.

1. При культивировании незрелых зародышей происходит морфогенети-ческое развитие путем эмбриогенеза. Проведенные нами цитоэмбриологиче-ские исследования эмбриогенеза в культуре незрелых зародышей показали, что развитие глобулярных зародышей в условиях in vitro значительно отличались от развития зародышей, эксплантированных на более поздних этапах роста. У глобулярных зародышей не наблюдалось дифференциации тканей, а образование регенеранта происходило за счет активного деления клеток зародыша в течение 4-6 недель культивирования. Изолированные сердцевидные зародыши в течение 2-3 недель формировали семядоли и первичный корешок, торпедо-видные зародыши на 2-3 день культивирования приступали к активному росту и формировали регенераты.

2. Формирование эмбриоидов (эмбриоидогенез) из половых клеток зародышевых мешков, ведущих к образованию гаплоидных регенератов в культуре

неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы, осуществляется за счет активизации деления гаплоидных клеток под действием гормонального комплекса среды (Подвигина, 1994). В ходе исследований по изучению эмбриоидогеза нами было установлено, что все клетки зародышевого мешка способны к дальнейшему развитию. Через два дня нахождения в культуре in vitro в зародышевых мешках наблюдалось активное деление клеток яйцевого аппарата или антипод. В большинстве случаев зародыши формировались в микропилярной зоне и по истечении 3-х дней культивирования состояли из 8-12 клеток и имели форму овала. К S-му дню нахождения на питательной среде зародыши приобретали форму шара на ножке, размеры которого значительно увеличивались и к 20 дню заполняли все пространство зародышевого мешка. Следует отметить, <

что в данных условиях не наблюдалось четко выраженой дифференциации клеток зародыша, отложения крахмала в клетках нуцелуса и формирования перисперма. После 28 дней культивирования зародыши разрывали интегументы и по- щ являлись на поверхности семяпочки. В это время наблюдалось появление семядольных листочков и первичного корешка. Дальнейший рост и развитие гаплоидного проростка происходило за счет компонентов питательной среды.

Анализируя полученные данные, нами установлено, что эмбриоиды на начальных этапах развития проходили стадии, аналогичные формированию зи-готических зародышей, только несколько быстрее. При этом отсутствовало формирование семени и его частей - эндосперма, перисперма, оболочки и периода покоя в условиях in vitro.

3. Образование эмбриоидов из соматических клеток вегетативных структур (эмбриоидогенез) (Жужжалова, 1999). Формирование эмбриоидов наблюдалось на черешках листьев молодых проростков из клеток эпидермального слоя. Сердцевидные многоклеточные структуры при дальнейшем культивировании преобразовывались в ростовые почки, а затем в растения.

4. Формирование адвентивных побегов (геммогенез) определяется потенциальной способностью клеток к цитодифференцировке и трансформации в другие клеточные типы. Проведенные нами цитологические исследования установили, что оранообразовательный процесс у эксплантов сахарной свеклы начинался с возникновения в субэпидермальном слое клеток черешков и гипокотилей гаплоидных или диплоидных проростков инициальной клетки. * После деления ее по типу дробления формировалась сферическая масса мелких изодиаметрических клеток - меристематический очаг. Наблюдалось единичное

и множественное образование меристематических очагов, когда бугорки .

делящихся клеток располагались кучками рядом друг с другом. Меристематические бугорки имели дорсовентральное строение. На внешней стороне бугорка затем начинались периклинальные деления по всей окружности. Это приводило к образованию серповидного валика и примордия первого листа. Примордий листа появлялся в виде серпа в дистальной части периферической меристемы. При дальнейшем росте первый лист постепенно обрастал среднюю часть меристематического бугорка, а внутренняя часть в ходе своего развития приобретала яйцевидную форму. Позднее наблюдалась

дифференциация клеток внутренней части ростовой почки, в которой выделялись три зоны - апикальная, средняя и базальная. В апикальной зоне происходило разрастание одной из ее латеральных (боковых) сторон, в результате чего формировался следущий примордий листа. В средней части ростовой почки формировался тяж камбия, идущий от ближайщего проводящего пучка. Базальная зона ростовой почки являлась основанием, соединяющим почку с тканями материнского растения.

Визуально ростовые почки на начальных этапах своего развития выглядели в виде белых крупинок, расположенные одиночно или группами, наблюдались на тканях разросшегося гипокотнля, черешков и центральных жилок листьев. По истечении 2-4 недель из них формировались нормально развитые ре-генеранты, количество которых достигало 8-12 штук на один первичный проросток.

В условиях in vitro при создании экспериментальных систем со строго определенными, регулируемыми условиями, свойство тотипотентности растительных клеток проявляется в большей степени и пути морфогенеза у эксплан-тов сахарной свеклы (генеративных и вегетативных структур) развиваются в следующих направлениях:

- эмбриогенез - культура незрелых зародышей;

- эмбиоидогенез - культура неоплодотворенных семяпочек при индуцировании гаплоидии или культивирование вегетативных структур;

-органогенез 1. геммогенез - формирование адвентивных побегов на каллусе, черешке листа, гипокотиле регенеранта; 2. ризогенез - образование корней на регенеранте и/или каллусе; 3. гемморизогенез - формирование проростка с корнем на каллусе или сегменте растения.

Воспроизведение растений для дальнейшего микроразмножения в условиях in vitro происходит со всех направлений морфогенеза, кроме ризогенеза (рис. 7).

Рис. 7 Направления морфогенеза в культуре in vitro эксплантов сахарной свеклы

выводы

1. Определено влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов. Установлено, что наилучшей регенерационной способностью обладают маатериалы гибридного и линейного происхождения (в среднем 5,5 и 4,9%). Снижение выхода гаплоидов наблюдается у донорского материала сортов-популяций и форм с ЦМС - 2,0%. Формирование женского гаметофита генетически связано с процессами дифференциации мужского, поэтому аномалии развития в мужском гаметофите являются надежным маркерными признаками при отборе донорского материала. Показана положительная корреляция между количественным выражением аномального развития мужских гамет и регенерационной способностью неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro. Регенерационная способность неоплодотворенных семяпочек зависит от стадий развития макрогаметофита и расположения экспланта на семенном растении. Частота формирования гаплоидов 4,5% отмечалась у семяпочек, содержащих 7 клеточный /8ядерный зародышевый мешок и расположенных на центральном побеге цветущего растения свеклы.

2. Установлено влияние экзогенных факторов на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре репродуктивных органов. Увеличение выхода гаплоидных регенератов до 4,9% отмечается при эксплантации семяпочек с растений, выращенных в открытом грунте. Преобработка семяпочек холодом, изолированных с растений, выращенных в летний период, в течение 3-х суток вызывает 4,21% индукции гаплоидов. Обработка пониженной температурой эксплантов с тепличных растений при экспозиции 2 суток стимулирует развитие до 6,15% регенерантов. Рентгеновское облучение донорского материала в дозе до 3000 рентген индуцирует регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек до 5,3%.

3. Гормональный состав питательной среды определяет индуцирование гаплоидии в условиях in vitro. Наличие в среде 2 мг/л гиббереллина вызывает развитие гаплоидного зародыша путем прямой регенерации непосредственно из клеток зародышевого мешка. Добавление 6-БАП или кинетина в концентрации 0,1-0,3 мг/л стимулирует развитие каллусогенеза. Комплексное действие гиббереллина, 6-БАП, ИМК индуцирует формирование адвентивных побегов (вторичная регенерация) на структурно измененных гаплоидных проростках в количестве 6-8 растений на один первичный эксплант.

4. Разработаны элементы стабилизации гаплоидных форм в зависимости от морфологического развития регенерантов. Для нормально развитых регенерантов, полученных путем эмбриоидогенеза, этап стабилизации и микроразмножения заключается в чередовании сред: ростовая (Гк, Кн, 6-БАП по 0,2 мг/л) - безгормональная - ростовая. Для менее развитых адвентивных побегов необходимо сначала культивирование на безгормональной, потом на ростовой среде. Это позволяет добиваться 96% выживаемости гаплоидных регенерантов.

5. Формирование реституционных линий сахарной свеклы определяется режимами колхицинирования и стабилизации. Добавление 0,005% колхицина в

питательную среду и культивирование на ней в течение 2 суток ведет к удвоению хромосом у 83,3% гаплоидных растений. Окончательная диплоидизация обеспечивается при культивировании автодиплоидов на питательной среде с 0,25 мг/л кинетина.

6. Разработан метод получения гомозиготного материала путем индукции гаплоидии из неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы, включающий следующие этапы: подбор донорского материала и введение в культуру; индуцирование гаплоидии; стабилизация и микроразмножение гаплоидов; диплоидизация и стабилизация реституционных диплоидов; микроразмножение нового исходного материала; корнеообразование in vitro и пересадка в грунт.

7. Разработаны основные параметры культивирования незрелых зародышей. Лимитирующими факторами, обеспечивающими наибольший уровень регенерации являются 8-12 дневный возраст зародыша в период активной дифференциации тканей, соблюдение температурно-светового режима (культивирование в темноте в течение 4-х недель при температуре +23-25° С ), состава питательной среды (наличие 40 г/л сахарозы и физиологически активных веществ).

8. Модифицирован состав питательной среды В5 для проведения депонирования микроклонов сахарной свеклы в течение 12-18 месяцев. Замена в питательной среде сахарозы глюкозой (10 г/л) позволяет при 7-ми месячном замедленном росте растений к 12 месяцам культивирования сохранить 44% листового аппарата и 80% живых клонов. Увеличение количества агара (13 г/л), повышающее плотность среды, при росте микроклонов в течение года сохраняет 60% листьев и 90% регенерантов. Добавление в питательную среду ретарданта ССС (2,5 мг/л) и салициловой кислоты (0,2 мг/л) оказывают влияние на замедление роста микроклонов, их максимальный среднемесячный прирост не превышает 0,2 см, и выживаемость растений после 12 месяцев депонирования составляет 90-95%.

9. Присутствие в питательной среде ингибиторов роста снижают активность жизнено важных физиологических процессов (активность дыхательных ферментов, аскорбиновой кислоты), тем самым замедляя рост микроклонов. В тоже время ингибирующие вещества способствуют накоплению белков, крахмала, лигнина, увеличивающих жизнеспособность эксплантов при длительном субкультивировании.

10. Длительное беспересадочное культивирование микроклонов сахарной свеклы на средах, содержащих ингибирующие вещества, способствовало накоплению их в тканях растений. Активное последействие этих веществ проявлялось в начальный период рекультивирования материала в виде торможения роста, снижения активности пролиферации пазушных побегов, измельчении листовых пластинок в условиях in vitro и в период вегетации в грунте в удлинении головки корнеплода.

11. Процесс морфогенетического развития растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo определяется прежде всего генотипическими особенностями материала и проявляются в существовании двух способов воспроизведе-

ния - полового и бесполого и двух типов размножения - семенного и вегетативного. Направления морфогенеза в данном случае наблюдаются следующие: при семенном половом - эмбриогенез, при семенном бесполом - эмбриоидогенез, при вегетативном - гемморизогенез.

12. Морфогенетическое развитие эксплантов сахарной свеклы в условиях in vitro определяется гормональным комплексом питательной среды и происходит путем эмбриогенеза (культура незрелых зародышей), эмбриоидогенеза (культура неоплодотворенных семяпочек при индуцировании гаплоидии), органогенеза:

1) геммогенеза - формирование адвентивных побегов на каллусе, черешке листа, гипокотиле регенеранта,

2) ризогенеза - образование корней на регенеранте и/или каллусе,

3) гемморизогенеза - формирование проростка с корнем на каллусе

или сегменте растения.

Рекомендации для практического использования

1. Разработанный метод получения гомозиготного материала сахарной свеклы рекомендуется широко использовать в селекционной практике для создания нового исходного материала и высокопродуктивных сортов и гибридов.

2. Для создания меристемных коллекций ценного селекционного материала сахарной свеклы рекомендовать метод длительного беспересадочного культивирования клонов на модифицированной питательной среде (увеличенное содержание агара до 13 г/л).

3. Разработанные параметры культивирования незрелых зародышей следует использовать при получении гибридных растений от несовместимых и межвидовых скрещиваний и восстанавливать длительно хранившийся в семенах селекционный материал.

4. При разработке новых селекционных программ и технологий по ускоренному созданию нового исходного материала и высокопродуктивных гибридов рекомендуется широко применять разработанные для сахарной свеклы современные методы биотехнологии: получение гомозиготных линий методом гаплоидии, эмбриокультуры, длительного сохранения материала.

5. Полученный в результате проведенных исследований материал (гомозиготные линии, селекционные линии после депонирования, восстановленный материал - урожай 1981 г.) целесообразно использовать в селекционном процессе.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жужжалова Т.П. Особенности мейоза у инбредных линий сахарной свеклы /Т.П. Жужжалова, В.В. Знаменская, O.A. Подвигина //Гаметогенез, оплодотворение и эмбриогенез семенных растений, папоротников и мхов: Тез. докл. IX Всесоюз. совещ. по эмбриологии растений, Кишенев, 1986 г.: Тез. докл. - Кишенев: Штиинца, 1986. -С.55.

2. Подвигина O.A. Особенности микроспорогенеза и фертильности пыльцы инбредных линий сахарной свеклы /O.A. Подвигина, Т.П. Жужжалова //Цитология и анатомия культурных растений: Сб.науч. трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции. - Т. 124. - Л., 1989. - C.83-8S.

3. Подвигина O.A. Особенности микроспорогенеза у сахарной свеклы /O.A. Подвигина, Т.П. Жужжалова, В.П. Ошевнев // Онтогенетика высших растений: Всесоюз. научной конф., Кишенев, 17-18 октября 1989 г.: Тез. докл. - Кишинев: Штиинца, 1989. - С.208-209.

4. Подвигина O.A. Влияние инбридинга на формирование мужского гаметофита сахарной свеклы // Рукопись во ВНИИТЭИ Агропром 30.01.89 - Госагропром СССР.1 153/2. ВС-89 Деп.

5. Подвигина O.A. Особенности формирования мужского гаметофита у самофер-тильных линий-закрепителей ЦМС сахарной свеклы /O.A. Подвигина, Т.П. Жужжалова, В.П. Ошевнев, Н.П. Грибанова // Резервы увеличения производства сахарной свеклы и сахара: Сб. научных трудов Всероссийского НИИ сахарной свеклы и сахара.- Воронеж, 1990. - С.42-47.

6. Знаменская В.В. Индукция гиногенеза у сахарной свеклы /В.В. Знаменская, Т.П. Жужжалова, O.A. Подвигина // Новые методы биотехнологии растений. Российский симпозиум, Пущнно, 18-20 мая 1993г. - Пущино, 1993. - С.141.

7. Подвигина O.A. Культура неоплодогворенных семяпочек in vitro, как способ получения гаплоидных растений /O.A. Подвигина // Обеспечение эффективности функционирования производственного потенциала АПК России в условиях рыночных отношений: Сб.науч. тр. - Воронеж, 1993. - С.127-128.

8. Подвигина O.A. Экспериментальное получение гаплоидных линий у сахарной свеклы / O.A. Подвигина, В.В. Знаменская, Т.П. Жужжалова // Апомиксис у растений: состояние, проблемы и перспективы исследований: Труды междунар. симпозиума, Саратов, 21-24 июля 1994 г. - Саратов, 1994. - С.122-123.

9. ФеДулова Т.П. Изоферментные маркеры в идентификации гаплоидов сахарной свеклы /Т.П. Федулова, O.A. Подвигина // Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений: Матер, конф., Киев, 10-13 мая 1994г. - Киев: Аграрна наука, 1994. -С.69.

10. Подвигина O.A. Морфогенетическая оценка донорных растений при индуцировании гаплоидов у сахарной свеклы /O.A. Подвигина, В.В. Знаменская, Т.П. Жужжалова // Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений: Матер, конф., Киев, 10-13 мая 1994 г. - Киев: Аграрна наука, 1994. - С.121.

11. Знаменская В.В. Создание нового исходного материала в селекции сахарной свеклы / В.В, Знаменская, O.A. Подвигина, Т.П. Жужжалова // Сахарная свекла. - 1994, № 6. - С.8.

12. Знаменская В.В. Новый метод получения нового исходного материала в селекции сахарной свеклы / В.В. Знаменская, O.A. Подвигина// Методы комплексной оцен-

ки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений: Сб. науч. трудов. -М„ 1994. -С.18-19.

13. Подвигина O.A. Индуцирование гаплоидии у сахарной свеклы: Автореф. дис. ...канд. с/х наук /O.A. Подвигина. -Рамонь, 1994. - 18 с.

14. Подвигина O.A. Индуцирование гаплоидов у сахарной свеклы /O.A. Подвигина, В.В. Знаменская //Пути повышения эффективности свеклосахарного производства России в условиях рыночной экономики : Всероссийская научно-практическая конференция, Рамонь, 1996 г.: Тез докл.- Рамонь, 1996. - С.57-58.

15. Знаменская В.В. Влияние физических воздействий на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы /В.В. Знаменская, O.A. Подвигина, H.A. Тараггонов // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VII Международная конференция, Москва, 25-28 ноября 1997 г.: Тез. докл.- М., 1997. - С.97.

16. Знаменская В.В, Микроклональное размножение Beta vulgaris /В.В. Знаменская, O.A. Подвигина // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VII Международная конференция, Москва, 25-28 ноября 1997 г.: Тез. докл. - М., 1997.-С.419.

17. Подвигина O.A. Депонирование сахарной свеклы в культуре in vitro /O.A. Подвигина, В.В. Знаменская, JI.A. Цупикова // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VII Международная конференция, Москва, 25-28 ноября 1997 г.: Тез.докл. - М., 1997. - С.529.

18. Федулова Т.П. Использование молекулярно-генетических маркеров при культивировании растительных клеток сахарной свеклы in vitro /Т.П Федулова, Т.П. Жуж-жалова, O.A. Подвигина, И.Н. Горина // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VII Международная конференция. Москва, 25-28 ноября 1997 г.: Тез. докл. - М., 1997. - С.353.

19. Подвигина O.A. Эмбриологическое изучение гиногеиеза сахарной свеклы в условиях in vitro /O.A. Подвигина, Т.П. Жужжалова // Проблемы ботаники на рубеже XX-XI веков: П(х) схезд Русского ботанического общества. Санкт-Петербург, 26-29 мая 1998 г.: Тез докл. - Т.1. - С.-Петербург, 1998. - С.128.

20. Знаменская В.В. Пути морфогенеза в культуре неоплодотворенных семяпочек Beta vulgaris /В. В. Знаменская, O.A. Подвигина // IV съезд общества физиологов растений России. Международная конф., Москва, 4-9 октября 1999 г.: Тез. докл. - М., 1999. - С.585.

21. Подвигина O.A. Депонирование селекционного материала сахарной свеклы в условиях in vitro /O.A. Подвигина, В.В. Знаменская, Л.А. Цупикова // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии. Матер. II Международной конференции, Москва, 18-19 октября, 2000 г. - М., 2000. - С. 210-211.

22. Подвигина O.A. Депонирование селекционного материала сахарной свеклы на искусственных питательных средах /O.A. Подвигина, В.В. Знаменская, Л.А. Цупикова //Сахарная свекла. - 2000, № 12.-С.18-19.

23. Знаменская В.В. Влияние состава питательных сред на жизнеспособность экс-плантов при длительном культивировании Beta vulgaris /В.В. Знаменская, O.A. Подвигина //11 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург, 1-5 февраля, 2000 г.: Тез. докл. - Санкт-Петербург, 2000. - С. 146-147.

24. Знаменская В.В. Регенерационная способность семяпочек сахарной свеклы /В.В. Знаменская, Подвигина O.A., H.A. Таратонов // Сахарная свекла. - 2001, № 6. - С. 16-18.

25. Подвигина O.A. Влияние гормонального состава питательных сред на индукцию гаплоидии сахарной свеклы / O.A. Подвигина, В.В. Знаменская // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях: VI Международная конф., Москва,2001г.: Тез. докл. - М.: Издательство МСХА, 2001. - С.186.

26. Подвигина. O.A. Индукция ризогенеза у сахарной свеклы в культуре in vitro /В.В. Знаменская, O.A. Подвигина, В.В. Фролова // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях:. VI Международная конф., Москва, 2001г.: Тез докл. - М.: Издательство МСХА, 2001. - С. 160.

27. Подвигина O.A. Пути морфогенеза при индукции гаплоидии in vitro у сахарной свеклы /O.A. Подвигина//Генетические основы эволюции и селекции: Материалы межригион. конф., Воронеж, 16-18 октября 2002 г. - Воронеж, 2002. - С.48-50.

28. Корниенко A.B. Методы биотехнологии в селекционной практике / A.B. Корниенко, Т.П. Жужжалова, В,В. Знаменская, Т.П. Федулова, O.A. Подвигина, М.А. Богомолов, H.H. Черкасова// Сахарная свекла. - 2002, № 9. - С.25.

29. Подвигина O.A. Применение эмбриокультуры для преодоления покоя у дли-тельнохраиившихся семян сахарной свеклы /O.A. Подвигина// Научное обеспечение устойчивого свекловодства в России: Матер. Междунар. научно-практич. конф., Воронеж, 2003г. - Воронеж, 2003. - С. 72-74.

30. Подвигина O.A. Эмбриокулыура сахарной свеклы /O.A. Подвигина// Факторы экспериментальной эволюции растений: Международная научно-практическая конференция, Украина, Алушта, 29 сентября-3 октября 2003г. (в печати)

31. Подвигина O.A. Цитоэмбриологические особенности эмбрио- и эмбриоидоге-неза у сахарной свеклы в условиях in vitro /O.A. Подвигина, Т.П. Жужжалова// Культурные растения России - М., 2003. (в печати)

32. Подвигина O.A. Особенности морфогенеза сахарной свеклы в условиях in vitro /O.A. Подвигина// Сахарная свекла. - 2003. (в печати)

33. Фоменко Н.Р. Развитие апомиктичных зародышей в культуре in vitro / Н.Р. Фоменко, O.A. Подвигина, Т.П. Жужжалова // Международная научно-практическая конференция "Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений": Международная научно-практическая конференция, М.: 2003. (в печати) .

34. Znamenskaya V.V. Haploid inducchion in unfertilized ovules culture of Beta vulgaris L. /V.V. Znamenskaya, T.P. Zhuzhzhalova, O.A. Podvigina // Abstracts of the papers and posters, presented at XI Internationa] symposium"Embriology seed reproduction", Leningrad, July 3-7,1990. - Leningrad: Nauka, 1990. - P. 197.

35. Podvigina O.A. Peculiarities of male gametophyte forming of lines - fixators of sugar beet CMS (Beta vulgaris L.) /O.A. Podvigina, T.P. Zhuzhzhalova, L.I. Oryol // Abstracts of the papers and posters, presented at XI International symposium"Embriology seed reproduction", Leningrad, July 3-7,1990. - Leningrad: Nauka, 1990. - P. 127.

36. Znamenskaya V.V. Haploidy of sugar beet /V.V. Znamenskaya, O.A. Podvigina, T.P. Zhuzhzhalova // International Symposium "Plant Biotechnology and Genetic Engeneering". October 3-6,1994, Kiev Na Ukraine.- Kiev, 1994. - P. 115.

37. Podvigina O.A. Storing Suga Beet Genetic Material under in vitro Conditions / O.A. Podvigina, V.V. Znamenskaya, L.A. Tsupikova // International Conferenc Genetic Collections, Isogenic and Alloplamic Lines. - Novosibirsk, Russia, July 30-August 3, 2001. - Novosibirsk. - 2001.- P. 204-205.

Тип. ВГАУ, зак. 429 - 2003 г., т. 100 экз., объем 2,75 п. л.

1 f

I

Î

It

1

I

^

( Í

s

/ i

if {

2-oaJ-A m 1 5 63 2

Содержание диссертации, доктора сельскохозяйственных наук, Подвигина, Ольга Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ.

2. ИНДУЦИРОВАНИЕ ГАПЛОИДИИ ИЗ НЕОПЛОДОТВО

РЕННЫХ СЕМЯПОЧЕК САХАРНОЙ СВЕКЛЫ В УСЛОВИЯХ

IN VITRO.

2.1. Реакция генотипа на индукцию гаплоидии.

2.2. Влияние стадий развития зародышевого мешка и расположения экспланта на кусте свеклы.

2.3. Зависимость регенерационной способности неоплод отворенных семяпочек от сроков введения и условий культивирования

2.4. Влияние состава питательной среды.

2.5. Воздействие физическими факторами на экспланты.

3. ГАПЛОИДИЯ КАК УСКОРЕННЫЙ МЕТОД СОЗДАНИЯ ГОМОЗИГОТНЫХ ЛИНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ.

3.1. Формирование гаплоидных линий in vitro.

3.2. Диплоидизация и создание реституционных линий.

3.3. Метод создания гомозиготных линий сахарной свеклы на основе индуцирования гаплоидии.

4. ЭМБРИОКУЛЬТУРА В СИСТЕМЕ IN VITRO.

4.1. Влияние возраста эксплан^та на процесс регенерации в условиях in vitro.

4.2. Влияние условий культивирования на жизнеспособность зародышей.

4.3. Возможность применения эмбриокультуры для получения межвидовых гибридов и апомиктичных форм.

5. СОХРАНЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА В УСЛОВИЯХ IN VITRO.

5.1. Влияние состава питательной среды при длительном беспересадочном культивировании.

5.2. Роль химических ингибиторов при депонировании микроклонов сахарной свеклы.

5.3. Гистохимическое изучение микроклонов свеклы при длительном беспересадочном культивировании.

5.4. Рекультивирование растений сахарной свеклы после депонирования.

6. ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ.

6.1. Пути и способы воспроизведения растений сахарной свеклы в условиях in situ и in vivo.

6.2. Цитоэмбриологические особенности эмбрио- и эмбриоидо

Щ генеза сахарной свеклы в условиях in vitro.

6.3. Органообразовательные процессы в условиях in vitro.

6.4. Анатомо-морфологическое развитие растений сахарной свеклы в условиях in situ и in vitro.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Теоретическое обоснование и приемы использования методов биотехнологии в селекции сахарной свеклы"

Актуальность проблемы. Одним из главных путей дальнейшего повышения продуктивности сахарной свеклы и производства сахара - создание и внедрение высокопродуктивных сортов и гибридов свеклы. Задачи селекции сахарной свеклы за последнее время сильно усложнились в связи с повышением требований производства к ряду признаков и с переходом к использованию регулируемого гетерозиса. В настоящее время необходимы прогрессивные научные решения, которые могли бы позволить максимально использовать эффект гетерозиса и создавать гибриды с высокой продуктивностью и комплексом полезных признаков.

Обычно селекционеры в своей работе применяют традиционные методы селекции - гибридизацию, отборы, полиплоидию, привлечение форм с ци-топлазмотической мужской стерильностью (ЦМС). Данные методы очень

Ч - » ' >' \ 1 . ■ трудоемки, затратны и ведут, как правило, к сужению генетической изменчи-Щ> вости и уменьшению многообразия исходного генетического материала

Кузьмин, Шевченко, Павлюк, 1995). Поэтому проблема получения нового исходного материала для селекции становится актуальной.

Многолетняя же практика показала, что основным направлением в селекции на гетерозис является получение гибридных материалов на основе использования форм с ЦМС. Однако гетерозисная селекция раздельноплод-* ной сахарной свеклы с использованием ЦМС требует глубоких теоретических и практических разработок по созданию, изучению исходного материала разных форм, поддержанию материалов прежде всего по хозяйственно-ценным признакам, таким как масса корнеплодов и их сахаристость, устойчивость к ^ болезням, скороспелость, качество семян и т.д.

Дальнейший прогресс в селекции сахарной свеклы требует усовершенt - ствования традиционных методов выведения гибридов, разработки прогрессивных способов создания компонентов скрещивания, их поддержания и улучшения в процессе репродуцирования. Для этого необходимы поиск и применение новых нетрадиционных подходов и методов, позволяющих выявлять все потенциальные возможности растительного организма и получать новые формы с искомыми и, с селекционной точки зрения, полезными признаками (Атанасов, 1993).

Данным направлением является биотехнология, представляющая собой ценное дополнение к ряду классических методов селекции и генетики. Применение методов биотехнологии не уменьшает значения методов селекционной практики, а наоборот, способствует ускорению и улучшению селекционного процесса путем расширения генетического спектра полученного исходного материала, оценки и отбора полезных комбинаций, что, в конечном счете, ведет к получению новых сортов с высокими биологическими и хозяйственными показателями.

Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно разделяются на две группы. Первая группа - это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним относятся: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей, органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов и другого материала. Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.

Из современных методов биотехнологии в растениеводстве интенсивно развиваются методы культуры клеток и тканей первой группы, а также генетическая инженерия. Во многих странах они достаточно широко используются в селекционно-генетических исследованиях как весьма эффективные. Более того, эти методы являются связующим звеном в экспериментах, проводимых на клеточном и молекулярном уровнях, а также на уровне целых растений.

Приемы биотехнологии и биоинженерии, основанные на данных молекулярной и клеточной биологии, позволяют установить эволюционную общность многих особенностей растительной клетки, моделировать уникальные генотипы и экспериментально исследовать феномен эпигенетической наследственности (Бутенко, 1999).

Все методы биотехнологии базируются на принципах управления системами размножения растений, поскольку именно через размножение реализуется неисчерпаемость биологических ресурсов, эволюция, филогенетическое бессмертие, отбор и становление новых признаков, в том числе желательных для человека (Тырнов, 1998).

В плане практического применения методы биотехнологии позволяют решать задачи получения новых важных форм и линий сельскохозяйственных растений, используемых в селекции на устойчивость, продуктивность и качество, размножения ценных генотипов, оздоровление растений от вирусов и т.д.

Наиболее изученным и широко применяемым методом биотехнологии является микроклональное размножение. Во многих странах мира биоиндустрия микроразмножения поставлена на поточную промышленную основу и представлена десятками активно функционирующих предприятий. Например, во Франции 94% всей продукции цветочных культур получают методом культуры изолированных тканей. В США более 100 комерческих предприятий получают посадочный материал декоративных, овощных, полевых, плодовых и лесных культур методом клонального микроразмножения. Ведущим производителем оздоровленного посадочного материала цветочных растений является Голландия, а подвоев яблони, сливы, персика - Италия (до 250-500 тыс. ежегодно). В нашей стране также ведутся интенсивные работы по оздоровлению и размножению многих декоративных, плодовых, овощных, древесных и других культур.

Для сахарной свеклы метод микроклонального размножения достаточно хорошо разработан и используется в селекционной практике (Амерханова, Рахимбаев, 1986; Славова, 1988; Ильенко, 1989; Знаменская, Жужжалова, 1989).

Широкое использование другого метода биотехнологии - получение гаплоидов, нашло в связи с быстротой получения гомозиготного материала. Практическая и теоретическая ценность данного метода состоит в том, что гаплоиды можно использовать для получения чистых линий, межвидовых гибридов, линий-восстановителей ЦМС, создания анеуплоидных форм, выявления рецессивных мутаций, проведения трансформации, проведения геномного анализа (картирование хромосом, данные о эволюции и сцеплении генов и т.д. (Атанасов, 1993).

При помощи метода гаплоидии в Канаде получен сорт ячменя Минго, являющися наиболее продуктивным сортом в Онтарио. В Китае получены высокоурожайные (80 ц/га риса) и устойчивые сорта пшеницы и риса, занимающие в 1999 году 170000 га (рис) и 70000 га (пшеница). В России (Одесса, Краснодар, Поволжье) созданы сорта ячменя, тритикале, табака, риса (Бутен-ко, 1999).

Исследования отдельных вопросов по индуцированию гаплоидии методом культуры неоплод отворенных семяпочек (Ильенко, Белоус, 1987; Славова, Рафаилова, 1991; Hosemans, Bossoutrot, 1983,1985; Van Geyt, Speckmann,

Halluin, 1987; Gibson Margaret, 1987; Lux, Herrmann, Claudia, 1990; Seman, Farago, 1990) проводились независимо друг от друга и не дали полного представления о преимуществах метода при получении гомозиготных линий сахарной свеклы.

Вместе с тем полученные в процессе исследований гомозиготные растения сахарной свеклы проходят генетико-селекционную оценку и включены в селекционные программы.

Сочетание методов культивирования зародышей, семяпочек и оплодотворения in vitro открывает широкие возможности для получения ценных комбинаций признаков при внутри- и межвидовой гибридизации. Данные методы способствуют преодолению несовместимости скрещиваемого материала, покоя семян, получению новых форм растений при отдаленной гибридизации и клеточной селекции. Метод эмбриокулыуры позволяет проводить исследования по цитоэмбриологии, генетике, физиологии растений. С помощью культуры изолированных зародышей получены межвидовые гибриды различных бобовых культур (Mallikaijuna Nalini, 1999), межвидовые гибриды ячменя и ржи (Aviv, Grosser, 1984), пшеницы и элимуса (Mujeeb-Kazi, Rodrigues, 1981), пшеницы с рожью, эгилопсом (Прилюк, 1984) и другие.

На сахарной свекле аналогичных работ нет.

Сохранение разнообразных коллекций зародышевой плазмы и возможность ее использования в любое время для теоретических и практических целей предоставляет метод криосохранения (нахождение меристематических клеток и тканей в жидком азоте при температуре -196° С). В настоящее время разработаны условия криосохранения для культивируемых клеток более 30 видов, каллусных культур около (10 видов), изолированных протопластов (8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 видов) (Сельскохозяйственная биотехнология, 1998).

Литературные данные о длительном сохранении микроклонов сахарной свеклы в условиях in vitro очень ограничены и свидетельствуют о недостаточной изученности данного вопроса. Имеются лишь сведения о субкультивировании растений свеклы при пониженных температурах в Нидерландах (Miedema, 1982) и в Германии при добавлении б среду пактобутразола (Lux Horst et.al., 1991). Культура сохранялась в течение 12-24 месяцев.

В последние годы значительное развитие получил метод генной инженерии, представляющий из себя дальнейшее развитие классических методов генетики, а также их ценное дополнение. Для сельскохозяйственного производства генная инженерия призвана создавать новые сорта растений, устойчивые к болезням, гербицидам, насекомым, стрессовым воздействиям. Возможности переноса и экспрессии в растительной клетке различных генов, ответственных за различные стороны метаболизма позволили создать трансгенные растения картофеля с повышенным содержанием глюкозы и фруктозы (Rober et.al., 1996), рапса с повышенным содержанием белка и жирных кислот (Vandekerckhove et.al., 1989), табака, устойчивые к болезням (Anzai, Yoneyama, Yamaguchi, 1989), формы растений, устойчивые к гербицидам (Comai, Sen, Stalker, 1983) и т.д. Получены формы сахарной свеклы, устойчивые к гербицидам (Левенко и др., 1993).

Однако возможности применения известных биотехнологических методов весьма ограничены, т.к. являются узкоспецифичными не только для различных видов растений, но даже для разных этапов культивирования экс-плантов одного вида. Поэтому необходима индивидуальная разработка специфических условий различных методов биотехнологии, позволяющих создавать новый и сохранять ценный селекционный материал в культуре изолированных тканей и органов такой важной культуры, как сахарная свекла.

В связи с этим возникает потребность теоретического обоснования воспроизведения растений в культуре in vitro с учетом тотипотентности клеток сахарной свеклы.

Поэтому наиболее актуальным является разработка режимов индукции гаплоидных и диплоидных регенерантов при культивировании неоплодотво-ренных семяпочек и зародышей, условий культивирования полученных гаплоидных, реституционных диплоидных и других новых материалов, режимов длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы.

Методы гаплоидии, эмбриокультуры и длительного беспересадочного культивирования и их сочетание с традиционными методами селекции позволят повысить репродукционный потенциал системы размножения сахарной свеклы, получать новый исходный материал, обогощенный в генетическом отношении, длительно сохранять ценный генофонд в условиях in vitro и тем самым значительно сокращать селекционный прцесс, а следовательно и период создания новых сортов и гибридов.

Это определяет актуальность и необходимость проведения данной работы.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в разработке биотехнологических методов индукции и сохранения новых форм сахарной свеклы и установлении особенностей морфогенетического развития микроклонов в условиях in vitro.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1 .Определить влияние экзогенных и эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов сахарной свеклы из неоплодотворенных семяпочек.

2. Разработать оптимальные условия получения гаплоидных и реституционных диплоидных линий свеклы в условиях in vitro.

3. Установить лимитирующие факторы воспроизводства растений при культивировании незрелых и зрелых зародышей сахарной свеклы.

4. Разработать параметры длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы.

5.Определить влияние ингибирующих веществ на морфофизиологиче-ское развитие клонов в период депонирования и после него.

6.Изучить пути морфогенеза растений свеклы в условиях in situ и in vitro.

Научная новизна. Впервые установлено влияние эндо- и экзогенных воздействий на индукцию гаплоидии in vitro из неоплодотворенных семяпоI чек. Экспериментально показано, что наибольшей склонностью к индукции гаплоидии обладают материалы от самоопыления и гибридного происхождения. Выявлена положительная корреляция между регенерационной способностью неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro и количественным выражением аномального развития мужских гамет, что может служить маркерным признаком при отборе донорского материала. Получены новые даные о взаимосвязи стадий развития зародышевого мешка с особенностями развития микрогаметофита, что можно использовать при от/ боре эксплантов с наибольшей склонностью к индукции гаплоидии. Показано стимулирующее действие рентгеновского облучения и пониженных температур на формирование гаплоидных структур из неоплодотворенных семяпочек свеклы. Получены оригинальные данные о влиянии физиологически активных веществ по индуцированию адвентивных побегов на гаплоидных проростках, расширяющие существующие представления о значении гормонов при культивировании растений в условиях in vitro. Впервые разработана последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации, микроразмножения гаплоидных и автодиплоидных линий сахарной свеклы. Установлен эффективный режим колхицинирования гаплоидных растений свеклы в условиях in vitro.

Впервые определены методические подходы эмбриокультуры незрелых зародышей сахарной свеклы, включающие оптимальные стадии развития эксплантов, состав питательной среды и температурно-световой режим культивирования.

Модифицирован состав питательной среды Гамборга , основанный на изменении осмотического, углеводного уровня и добавлении ингибирующих веществ, для беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы. Впервые показаны морфологические и биохимические изменения клеточных структур растений при длительном субкультивировании на ингибирующих средах и дальнейшем их рекультивировании. Экспериментально доказана возможность увеличения продолжительности хранения меристемно-го материала свеклы в течение 12-18 месяцев беспересадочного культивирования на модифицированных средах.

Впервые выявлены и описаны этапы морфогенетического развития адвентивных почек, незрелых и гаплоидных зародышей в условиях in vitro. Изучены и представлены пути морфогенеза при воспроизведении растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo и in vitro. Определены морфо-анатомические отличия растений свеклы, выращенные в условиях in situ и in vitro, выражающиеся в образовании структурных изменений клеток черешка и листа, проводящей системы и паренхимных тканей.

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Разработанный метод получения гомозиготного материала методом индуцирования гаплоидии в условиях in vitro позволил создать и передать на Льговскую ОСС 12 реституционных линий сахарной свеклы, что подтверждает возможность его использования в практической селекции.

Показано, что культивирование незрелых зародышей может быть использовано для получения растений от несовместимых и межвидовых скрещиваний и восстановления длительно хранившегося в семенах селекционного материала. С помощью данного метода восстановлены, размножены и переданы селекционерам ВНИИСС 9 линий (семена урожая 1981 года).

Для создания коллекции генофонда сахарной свеклы разработан метод длительного беспересадочного культивирования микроклонов на модифицированных питательных средах, позволяющий в течение длительного периода сохранять ценные селекционные генотипы в условиях in vitro. Данным методом в течение 3-х лет сохранялись 28 селекционных номеров, а затем 12 из них были переданы селекционерам для дальнейшей работы.

Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в различных областях биотехнологии, в учебных программах по биологии, цитологии, селекции в ВУЗах. Полученный в результате изучения новый исходный материал сахарной свеклы также может использоваться в дальнейших фундаментальных и прикладных исследованиях

На защиту выносятся следующие положения.

1. Экспериментальное обоснование воздействия эндогенных и стимуляции экзогенных факторов на регенерационную способность неоплодотво-ренных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro для получения гаплоидов.

2.Процесс формирования гаплоидных, автодиплоидных линий зависит от гормональной нагрузки питательной среды и морфогенетического развития регенерантов.

3.Регенерационная способность незрелых и зрелых зародышей в условиях in vitro определяется генетипическими различиями донорского материала, условиями культивирования (гормональный и углеводный состав среды, температурно-световой режим), стадией дифференциации тканей незрелых зародышей.

4.Установленные воздействия модифицированного состава питательной среды на рост и развитие микроклонов сахарной свеклы при субкультивировании позволяют увеличивать беспересадочный период и сохранять в чистоте селекционный материал в виде меристемных коллекций в течение длительного времени (2-5 лет).

5.Регуляция морфобиохимических изменений в росте, развитии и жизнеспособности эксплантов в период депонирования и после него обеспечивают высокую выживаемость и способность к дальнейшему размножению микроклонов сахарной свеклы.

6. Система воспроизведения растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo и in vitro.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Подвигина, Ольга Анатольевна

224 ВЫВОДЫ

1 .Определено влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенерантов. Установлено, что наилучшей регенерационной способностью обладают генотипы гибридного и линейного происхождения (в среднем 5,5 и 4,9%). Снижение выхода гаплоидов наблюдается у донорского материала сортов-популяций и форм с ЦМС - 2,0%. Генотипические особенности формирования женского гаметофита определяются взаимодействиями с аномалиями развития мужского, что является надежным маркерными признаками при отборе донорского материала. Показана положительная корреляция между количественным выражением аномального развития мужских гамет и регенерационной способностью неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro. Регенерационная способность неоплодотворенных семяпочек зависит от стадий развития макрогаметофита и расположения экс-планта на семенном растении. Частота формирования гаплоидов 4,5% отмечалась у семяпочек, содержащих 7 клеточный /8ядерный зародышевый мешок и расположенных на центральном побеге цветущего растения свеклы.

2.Установлено влияние экзогенных факторов на регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре репродуктивных органов. Увеличение выхода гаплоидных регенерантов до 4,9% отмечается при эксплантации семяпочек с растений, выращенных в открытом грунте. Холодовая преобработка семяпочек, изолированных с растений, выращенных в летний период, в течение 3-х суток вызывает 4,21% индукции гаплоидов. Обработка пониженной температурой эксплантов с тепличных растений при экспозиции 2 суток стимулирует развитие до 6,15% регенерантов. Рентгеновское облучение донорского материала в дозе до 3000 рентген индуцирует регенерационную способность неоплодотворенных семяпочек до 5,3%.

3.Гормональный состав питательной среды определяет индуцирование гаплоидии в условиях in vitro. Наличие в среде 2 мг/л гиббереллина вызывает развитие гаплоидного зародыша путем прямой регенерации непосредственно из клеток зародышевого мешка. Добавление 6-БАП или кинетина в концентрации 0,1-0,3 мг/л стимулирует развитие каллусогенеза. Комплексное действие гиббереллина, 6-БАП, ИМК индуцирует формирование адвентивных побегов (вторичная регенерация) на структурно измененных гаплоидных проростках в количестве 6-8 растений на один первичный эксплант.

4.Разработаны элементы стабилизации гаплоидных форм в зависимости от морфологического развития регенерантов. Для нормально развитых регенерантов, полученных путем эмбриоидогенеза, этап стабилизации и микроразмножения заключается в чередовании сред: ростовая (Гк,Кн, 6-БАП по 0,2 мг/л) - безгормональная - ростовая. Для менее развитых адвентивных побегов необходимо сначала культивирование на безгормональной, потом на ростовой среде. Это позволяет добиваться 96% выживаемости гаплоидных регенерантов.

5.Формирование реституционных линий сахарной свеклы определяется режимами колхицинирования и стабилизации. Диплоидизация с добавлением 0,005% колхицина в питательную среду и культивирование на ней в течение 2 суток ведет к удвоению хромосом у 83,3% гаплоидных растений. Окончательная диплоидизация обеспечивается при культивировании автодиплоидов на питательной среде с 0,25 мг/л кинетина.

6.Разработан метод получения гомозиготного материала путем индукции гаплоидии из неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы, включающий следующие этапы: подбор донорского материала и введение в культуру; индуцирование гаплоидии; стабилизация и микроразмножение гаплоидов; диплоидизация и стабилизация реституционных диплоидов; микроразмножение нового исходного материала; корнеообразование in vitro и пересадка в грунт.

7.Разработаны основные параметры культивирования незрелых зародышей. Лимитирующими факторами, обеспечивающими наибольший уровень регенерации является 8-12-ти дневный возраст зародыша в период активной дифференциации тканей, соблюдение температурно-светового режима - темновые условия в течение 4-х недель при температуре +23-25 С и состав питательной среды - наличие 40 г/л сахарозы и физиологически активных веществ.

8.Модифицирован состав питательной среды В5 для проведения депонирования микроклонов сахарной свеклы в течение 12-18 месяцев. Замена в питательной среде сахарозы глюкозой (10 г/л) позволяет при 7-ми месячном замедленном росте растений к 12 месяцам культивирования сохранить 44% листового аппарата и 80% живых клонов. Увеличение количества агара (13 г/л), повышающее плотность среды, при росте микроклонов в течение года сохраняет 60% листьев и 90% регенерантов. Добавление в питательную среду ретарданта ССС (2,5 мг/л) и салициловой кислоты (0,2 мг/л) оказывают влияние на замедление роста микроклонов, их максимальный среднемесячный прирост не превышает 0,2 см, и выживаемость растений после 12 месяцев депонирования составляет 90-95%.

9.Присутствие в питательной среде ингибиторов роста снижают активность жизнено важных физиологических процессов (активность дыхательных ферментов, аскорбиновой кислоты), тем самым замедляя рост микроклонов. В тоже время ингибирующие вещества способствуют накоплению белков, крахмала, лигнина, увеличивающих жизнеспособность эксплантов при длительном субкультивировании.

10.Длительное беспересадочное культивирование микроклонов сахарной свеклы на средах, содержащих ингибирующие вещества, способствовало накоплению их в тканях растений. Активное последействие этих веществ проявлялось в начальный период рекультивирования материала в виде торможения роста, снижения активности пролиферации пазушных побегов, измельчении листовых пластинок в условиях in vitro и в период вегетации в грунте в удлинении головки корнеплода.

11. Процесс морфогенетического развития растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo определяется прежде всего генотипическими особенностями материала и проявляется в существовании двух способов воспроизведения - полового и бесполого и двух типов размножения - семенного и вегетативного. Направления морфогенеза в данном случае наблюдаются следующие: при семенном половом - эмбриогенез, при семенном бесполом - эмбриоидогенез, при вегетативном - гемморизогенез.

12. Морфогенетическое развитие эксплантов сахарной свеклы в уелоч виях in vitro определяется гормональным комплексом питательной среды и происходит путем: эмбриогенеза (культура незрелых зародышей), эмбриоидогенеза (культура неоплодотворенных семяпочек при индуцировании гаплоидии), органогенеза: 1 .геммогенеза (формирование адвентивных побегов на каллусе, черешке листа, гипокотиле регенеранта), 2. ризогенеза (образование корней на регенеранте и/или каллусе), 3. гемморизогенеза (формирование проростка с корнем на каллусе или сегменте растения).

228

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

1. Разработанный метод получения гомозиготного материала сахарной свеклы рекомендуется широко использовать в селекционной практике для создания нового исходного материала и высокопродуктивных сортов и гибридов.

2. Для создания меристемных коллекций ценного селекционного материала свеклы рекомендовать метод длительного беспересадочного культивирования клонов на модифицированной питательной среде (увеличенное содержание агара до 13 г/л).

3. Разработанные параметры культивирования незрелых зародышей, следует использовать при получении гибридных растений от несовместимых и межвидовых скрещиваний и восстановлении длительно хранившегося в семенах селекционного материала.

4. При разработке новых селекционных программ ч технологий по ускоренному созданию нового исходного материала и высокопродуктивных гибридов рекомендуется широко применять разработанные для сахарной свеклы методы биотехнологии: получение гомозиготных линий методом гаплоидии, эмбриокультуры, длительного сохранения.

5. Полученный в результате проведенных исследований материал (гомозиготные линии, селекционные линии после 3-х летнего депонирования, восстановленный материал - урожай 1981 года) рекомендуется для включения в селекционный процесс.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора сельскохозяйственных наук, Подвигина, Ольга Анатольевна, Воронеж

1. Авунджян Э.С. Влияние хлорхолинхлорида на рост и обмен азотистых вешеств в проростках пшеницы / Э.С. Авунджян, Э.Х. Широкян // Физиология растений. 1973. -т.20, №5. - С. 936-941.

2. Агрохимия. Под ред. В.М. Клечковского, А.В. Петербургского. -М.: Колос, 1967. - 583с.

3. Азимов Е.Д. Культивирование in vitro зародышей ячменя, изолированных на разных стадиях развития / Е.Д. Азимов // Каз. ун-т.-Алма-Ата, 1989. -17 е.: ил.-Библиогр.: 16 назв. Деп. в КазНИИНТИ 04.11.89, № 2887-Ка 89.

4. Амерханова М.Б. Вегетативное размножение сахарной свеклы в культуре тканей / М.Б. Амерханов, И.Р. Рахимбаев // Вестник АН КазССР. -1986.-№3.-С. 49-54.

5. А.с. 1708210 СССР, МКИ А01Н1/04 Способ получения гомозиготных линий сахарной свеклы. Заявл. 12.03.90 № 4818227. Опубл. 30.01.92. Бюл. № 4. 6с. (Соавт. М.А. Богомолов, Т.П. Жужжалова, А.В. Корниенко, Т.П. Федулова, И.Р. Попова)

6. Асфандиярова P.P. Каллусогенез в культуре пыльников и незрелых зародышей гороха посевного / P.P. Асфандиярова, К.Р. Зиякаева //Биология культивируемых клеток и биотехнология.: Тез. докл. Международной конференции.- Новосибирск, 1988. С.220.

7. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве / А. Атанасов // Новосибирск, 1993. С. 241.

8. Бавина Т.В. Цветение растений и его регуляция /Т.В.Бавина, Т.Н. Константинова, Н.П. Аксенова // Биология развития растений. М.: Наука, 1975.-С. 158-182.

9. Банникова В.П. Межвидовая несовместимость у растений /В.П. Банникова. Наукова думка, 1986. - 230с.

10. Барханова Э.А. Сравнительное изучение влияния салициловой кислоты и (21-51) олигоаденилатов на синтез белка в клетках табака при тепловом шоке / Э.А. Барханова, А.Б. Федина, О.Н. Кулаева // Физиология растений. -1999. -Т.46, № 1. С. 16-22.

11. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы /Т.Б. Батыгина. Л.: Колос, 1974.-206с.

12. Батыгина Т.Б. О некоторых закономерностях морфогенеза при регенерации растений in vitro / Т.Б. Батыгина // Теоретические основы регенерации растений. Махачкала, 1978. - С. 13-14.

13. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно / Т.Б. Батыгина. -Л.: Наука. 1987. -103с.

14. Биологический эпциклопедический словарь. М.: Сов. энциклопедия, 1986. - 832 с.

15. Биотехнология сельскохозяйственных растений. М., ВО Агро-промиздат, 1987. -302 с.

16. Боннер Дж. Молекулярная биология развития / Дж. Боннер. М.: Мир.- 1967.- 172 с.

17. Бормотов В.Е. Экспериментальная полиплоидия и гетерозис у сахарной свеклы / В.Е. Бормотов, Н.В. Турбин. -Минск: Наука и техника, 1972. -230 с.

18. Бугара A.M. Культура неоплодотворенных завязей семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений / A.M. Бугара, Л.В. Русина // Физиология и биохимия культурных растений. 1988. - Т.20, № 5. - С. 419430.

19. Бугара A.M. Гаплоидный каллусогенез в культуре неоплодотворенных семяпочек шалфея мускатного / A.M. Бугара, Л.В. Русина // Физиология и биохимия культурных растений. 1989. - Т.21, № 6. - С. 544-560.

20. Будыкина Н.П. К вопросу об эффективности применения фиторе-гуляторов в условиях Карелии / Н.П. Будыкина, С.П. Дроздов, В.К. Курец, Л.В. Тимейко // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии.- М.: МСХА. 2001. -С. 217-218.

21. Бузанов И.Ф. Влияние климата на рост, сахаристость и химический состав сахарной свеклы / И.Ф. Бузанов // Биология и селекция сахарной свеклы. М.: Колос, 1968. - С. 548-553.

22. Бурмакина Н.В. Исследование мейоза у гаплоидов озимой пшеницы / Н.В. Бурмакина // Генетика: Приложение. 1994. - т.ЗО. - С.20.

23. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и клеток растений / Р.Г. Бутенко // Вестник АН СССР. 1963. - № 2. - С.2.

24. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений / Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1975. - 120 с.

25. Бутенко Р.Г. Физиологические аспекты получения, культивирования и гибридизации изолированных протопластов картофеля / Р.Г. Бутенко, А. Кучко // Физиология растений. 1979. - т.26, вып. 5. - С. 1110-1118.

26. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе / Р.Г. Бутенко. М.: ФБК- Пресс, 1999. - 159с. -Библиогр.: С.147-159.

27. Вавилов Н.И. Генетика на службе социалистического земледелия (1932) /Н.И. Вавилов // М.: Колос, 1966. - С. 32-56.

28. Вайсман Н.Я. Мейотическая мутация "нередуцированные гаметы" у сахарной свеклы / Н.Я. Вайсман // Цитогенетика сельскохозяйственных растений: Теоретические и прикладные аспекты генетики растений. Новосибирск, 1989. - С. 18-24.

29. Витвицкий МА. Селекция и семеноводство / М.А. Витвицкий. -1979, № 2. С. 34-35. ,

30. Внучкова В.А. Получение гаплоидов из пыльников тритикале и их цитологическая характеристика / В.А. Внучкова // Докл.ВАСХНИЛ, 1979. -№10.-С. 8-10.

31. Воробьев Б.И. Изменчивость сортов форм сливы по способности образовывать фракцию нередуцированных пыльцевых зерен / Б.И. Воробьев, А.В. Исачкин, А.Л. Сильченко // Известия ТСХА, 1999. № 1. - С. 100-107.

32. Вутеева С. Влияние гамма-лучей и низких температур на индуцированный андрогенез D. Innoxia Mill / С. Вутева, Н. Загорска // Биологиякультивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 162-165.

33. Высоцкая О.Н. Длительное сохранение in vitro коллекции растений земляники / О.Н. Высоцкая // Физиология растений. 1994. - т. 41, № 6. -С. 935-941.

34. Высоцкая О.Н. Преимущество глюкозы перед сахарозой при криосохранении меристем земляники / О.Н. Высоцкая, А.С. Попов, Р.Г. Бу-тенко // Физиология растений. 1999. - т. 46, № 2. - С. 300-302.

35. Головин В.П. Получение гомозиготных линий кукурузы из гаплоидов / В.П. Головин // Цитогенетические основы селекции растений. Новосибирск: Наука, 1977. - С. 236-242.

36. Горя B.C. Алгоритмы математической обработки результатов исследований / B.C. Горя. Кишинев, 1978. - 180 с.

37. Гришина Е.В. Получение гаплоидов у кукурузы при воздействии химическими мутагенами и физиологически активными веществами / Е.В. Гришина, М.И. Зайцева // Апомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов, 1968. - С. 65-68.

38. Гудвин Б. Временная организация клетки. Динамическая теория врунтенних процессов / Б. Гудвин. М.: Мир, 1966. - С. 25-33.

39. Давоян Н.И. Сравнительное изучение продолжительности мито-тического цикла у гаплоидов, диплоидов и тетраплоидов кукурузы /Н.И. Давоян, B.C. Тырнов, В.М. Суханов // Цитология и генетика. 1972. - № 3. - С. 59-63.

40. Давоян Н.И. Проблема диплоидизации гаплоидов / Н.И. Давоян, B.C. Тырнов // Гаплоидия у покрытосеменных растений. Саратов, 1974. -180 с.

41. Давоян Э.И. Получение гаплоидов у риса методом культивирования неоплодотворенных завязей в условиях in vitro / Э.И. Давоян // Доклады ВАСХНИЛ. 1985. - Вып. 3. - С. 15-16.

42. Давоян Э.И. Оптимизация условий оздоровления и хранения ген-банка картофеля методом культуры изолированной меристемы / Э.И. Давоян, Н.Н. Ефремова, Ю.В. Болонкина, Ахмед Махталат // Сельскохозяйственная биология. 1995. - № 5. - С. 52-55.

43. Демчинская Е.Н. К методике получения тетраплоидных форм сахарной свеклы / Е.Н. Демчинская // Основные выводы научно-исследовательских работ по сахарной свекле за 1966 год. Киев, 1968. - т.1. -С. 124-126.

44. Джеймс Е. Хранение клеток в условиях низких температур / Е. Джеймс // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: ВО Агро-промиздат, 1987. -С. 153-175.

45. Добрецова Т.Б. О возможности получения диплоидных и гаплоидных форм сахарной свеклы из близнецовых растений / Т.Б. Добрецова, А.Н. Лутков, A.M. Манжос // Полиплоидия и селекция: труды совещания. -М.-Л., 1965а.-С. 232-238.

46. Добрецова Т.Б. Спонтанные полиплоидные и гаплоидные формы сахарной свеклы у близнецовых растений / Т.Б. Добрецова, А.Н. Лутков, A.M. Манжос // ДАН СССР. 1965 б. - т. 160, № 2. - С. 454-457.

47. Добросотсков В.В. Сочетание различных систем инбридинга при создании линейных материалов сахарной свеклы / В.В. Добросотсков, В.Г. Перетятько // Сельскохозяйственная биология. -1975. т. 10, № 1. - С. 26-31.

48. Добросотсков В.В. Изменчивость самонесовместимости / В.В. Добросотсков // Сахарная свекла. 1983. - № 3. - С. 31-33.

49. Домблидес Е.А. Влияние температур на развитие микроспор у представителей ряда Brassica / Е.А. Домблидес // Тез. докл. междунар. научной конф.молодых ученых овощеводов 28-29 марта 2000 г. М.: 2000. - С. 32-42.

50. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта /Б.А. Доспехов. М.: Колос,1979. -416 с.

51. Дьячук Т.И. Культура пыльников пшеницы и ее использование в селекции / Т.И. Дьячук, П.А. Дьячук // Биология культивируемых клеток и биотехнология. : Тез. докл. Международной конференции. Новосибирск, 1988.-С. 207.

52. Дьячук Т.И. Культура пыльников злаков: современное состояние, проблемы, перспективы / Т.И. Дьячук, П.А. Дьячук // Сельскохозяйственная биология. 1989. - № 5. - С. 3-10.

53. Жужжалова Т.П. Полиэмбриония у сахарной свеклы / Т.П. Жуж-жалова Киев: Наукова думка, 1978. - ч. 3. - С. 26-27.

54. Жужжалова Т.П. Закономерности развития репродуктивных органов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.): Автореф. дис. доктора биол.наук / Т.П. Жужжалова. Воронеж, 1999. - 40 с.

55. Жукова П.С. Гербициды и стимуляторы роста в овощеводстве / П.С. Жукова. Минск, 1976. - 86 с.

56. Зайковская Н.Э. Биология цветения, цитология и эмбриология сахарной свеклы / Н.Э. Зайковская; Под ред. И.Ф. Бузанова. Биология и селекция сахарной свеклыю - М.: Колос, 1968. - С. 137-206.

57. Зайковская Н.Э. Гаметогенез и развитие семян у триплоидных растений сахарной свеклы / Н.Э. Зайковская, Г.И. Ярмолюк // Докл. ВАСХ-НИЛ. 1968. - № 7. - С. 24-25.

58. Зайковская Н.Э. Апомиксис у форм сахарной свеклы / Н.Э. Зайковская, Н.А. Перетятько, Э.И. Ширяева, Г.И. Ярмолюк // Апомиксис и цито-эмбриология растений, вып.4. Саратов: Изд. Саратовского универс., 1978. -С. 39-40.

59. Знаменская В.В. Индукция гиногенеза у сахарной свеклы /В.В. Знаменская, Т.П. Жужжалова, О.А. Подвигина // Новые методы биотехнологии растений. Российский симпозиум, Пущино, 18-20 мая 1993г. Пущино, 1993.-С. 141.

60. Знаменская В.В. Микроклональное размножение сахарной свеклы (методические рекомендации) / В.В. Знаменская, Т.П. Жужжалова, А.И. Корниенко. Воронеж, 1995. - 23 с.

61. Знаменская В.В. Пути морфогенеза в культуре неоплодотворенных семяпочек Beta vulgaris /В. В. Знаменская, О.А. Подвигина // IV съезд общества физиологов растений России. Международная конф., Москва, 4-9 октября 1999 г.: Тез. докл. М., 1999. - С. 585.

62. Знаменская В.В. Регенерационная способность семяпочек сахарной свеклы /В.В. Знаменская, Подвигина О.А., Н.А. Таратонов // Сахарная свекла. 2001, № 6. - С. 16-18.

63. Иванова С.В. Биологические особенности гаплоидных растений томата / С.В. Иванова, Е.В. Кучковская // Изв. ТСХА. 1999. - № 3. - С. 5871.

64. Иванова С.В. Морфометрическая и цитогенетическая характеристика гаплоидов томата / С.В. Иванова, Л.И. Долгодворова, Г.И. Карлов, Е.В. Карлов, Е.В. Кучковская // Генетика. 2000. - т. 36. - № 1. - С. 52-61.

65. Ивановская Е.В. Строение эндосперма зерновок, полученных от опыления пшеницы (Triticum durum и Т. vulgare) элимусами (Elemus arenarius и Е. giganteus) /Е.В.Ивановская //Ботанический журнал. 1959. - т. 44. - С. 1934.

66. Ильенко И.И. Использование культуры незрелых зародышей при получении гаплоидных растений сахарной свеклы / И.И. Ильенко, В.Е. Белоус // Гаметная и зиготная селекция растений. Кишинев, 1987. - С. 156-158.

67. Калачеева Г.С. Состав жирных кислот Spirulina platensis в зависимости от возраста и минерального питания культуры / Г.С. Калачеева, Н.И. Сущик // Физиология растений. 1994. - т. 41, № 2. - С. 275-282.

68. Калинин Ф.Л. Регуляторы роста растений / Ф.Л. Калинин. Ю.Г.Мережинский. Киев: Наук, думка, 1965. - 406 с.

69. Калинин Ф.Л. Биологически активные вещества в растениеводстве /Ф.Л. Калинин. Киев: Наукова Думка, 1984. - 320 с.

70. Капля А.В. Кинетика роста побегов как критерий эффективности действия хлорхолинхлорида на плодовые культуры / А.В. Капля, Т.А. Мороз, A.M. Косян, А.Н. Двойное // Физиология и биохимия культурных растений. -1990.-т. 22, №4.-С. 366-371.

71. Карпеченко Г.Д. Экспериментальная полиплоидия и гаплоидия / Г.Д. Карпеченко // Теоретические основы селекции растений. М.: Л.: Сель-хозгиз, 1935. - т. 1. - С. 397-434.

72. Катаева Н.В. Клональное микроразмножение растений / Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко. М.: Наука, 1983. - 96 с.

73. Катаева Н.В. Особенности микроразмножения трудноукореняе-мых сортов яблони / Н.В. Катаева // Сельскохозяйственная биология. 1986.-№4.-С. 18-22.

74. Кашин А.С. Особенности развития мегагамет апомиктичных и половых форм Asteraccae в культуре неоплодотворенных завязей in vitro. /А.С. Кашин, Е.А. Блюднева, О.В. Седлецкая, В.В. Григорьева // Физиология растений. 2000. - т.47, № 4. - С. 548-554.

75. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны / В.И. Кефели. М.: Наука, 1974. - 24 с.

76. Кефели В.И. Рост растений / В.И.Кефели. М.: Колос, 1984. -175 с.

77. Киселева Н.С. Использование новых методов с целью создания исходного материала для селекции чая в Краснодарском крае: Автореф. дис. канд. биол. наук / Н.С. Киселева. Краснодар, 2000. - 25 с.

78. Кихара X. Цитоплазматическая мужская стерильность и селекция пшеницы / X. Кихара // Сельскохозяйственная биология. 1967. - т.2. - С. 214-225.

79. Книпл Я.С. Влияние кумарина и синтетических ретардантов роста на синтез РНК и белка в срезанных листьях ячменя в темноте и на свету / Я.С. Книпл, О.Н. Кулаева // Физиология растений. 1970. - т. 17, № 3. - С. 549-557.

80. Кобозева Л.Н. Биологический контроль за развитием и ростом свеклы / Л.Н. Кобозева // Боилогический контроль в сельском хозяйстве. М.: МГУ, 1962.-С.134-139.

81. Ковалевская М.Ф. Метод "раневых раздражений" в применении к сахарной свекле с целью получения мутаций / М.Ф. Ковалевская // Научные записки ВНИС . Киев, 1933. - С. 35-41.

82. Кожахметов К.К. Получение межвидовых гибридов пшеницы в эмбриокультуре / К.К. Кожахметов, А.Р. Искаков, Б.Ш. Алимгазинова // Биология кл. растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VIII Ме-ждунар. конференция. Москва, 1997. - С. 113.

83. Козлова Н.А. Воздействие гидразида малеиновой кислоты на мяту перечную / Н.А. Козлова, А.Е. Геращенков // Гидразид малеиновая кислота как регулятор роста растений. М.: Наука, 1973. - С. 190-196.

84. Константинова Т.Н. О способности каллусов стебля табака к образованию вегетативных и генеративных почек в культуре / Т.Н. Константинов, Н.П. Аксенова, Т.В. Баврина, Н.Х. Чайлахян // Докл. АН СССР. 1969. -187.-С. 466-472.

85. Копертех JI. Нативные фитогормоны экспланта и морфогенез пшеницы in vitro / Л. Копертех, Р. Бутенко // Физиология растений 1995. - т. 42, вып. 4. - С. 555-558.

86. Корак З.С. Некоторые причины пониженной всхожести семян диплоидной и тетраплоидной односемянной сахарной свеклы / З.С. Корак, Н.А. Неговский // Вопросы генетики, селекции и цитологии сахарной свеклы. -Киев, 1971.-С. 94-100.

87. Костов Д. Частота полиэмбрионии у ржи / Д. Костов // Докл. АН СССР. 1939. - т.24. - С. 468-471.

88. Кравченко А.Н. Методы гаметной и зиготной селекции томатов / А.Н. Кравченко, В.А. Лях, Л.Г. Тодераш, Т.И. Салтанович, М.К. Паскал. -Кишинев: Штиинца, 1988. 152 с.

89. Красочкин В.Т. Характеристика семейства маревых или солянко-вых Chenopodiaceae Less. / В.Т. Красочкин // Культурная флора СССР. Л.: Колос, 1971. - т.19 - С. 5-266.

90. Кузьмин Н.А. Селекция и семеноводство полевых культур / Н.А. Кузьмин, В.Е. Шевченко, Н.Т. Павлюк. Воронеж: Издательство ВГАУ, 1995. -352 с.

91. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция / О.Н. Кулае-ва. М.: Наука, 1973.-262 с.

92. Кулаева О.Н. Достижения и перспективы в использовании фитогормонов / О.Н. Кулаева, М.Х. Чайлахян // По материалам XI Международной конфер. по ростовым веществам // Агрохимия. 1984.- № 1. - С. 106-128.

93. Кулаева О.Н. Экспрессия генома растений и ее регуляция / О.Н. Кулаева // Геном растений. Под ред. К.М. Сытника. Киев: Наукова думка, 1988.-С. 83-136.

94. Кунах В.А. Влияние кинетина на репродукцию клеток различной плоидности / В.А. Кунах, П.Г. Сидоренко, В.П. Зосимович // Успехи полиплоидии. Киев, 1977. - С. 205-215.

95. Курьята В.Г. Изменение в морфогенезе, состоянии покоя и морозостойкости малины при воздействии ретардантов / В.Г. Курьята, Т.М. Даби-жук, Г.А. Ременюк// Физиология и биохимия культурных растений. 1991. -т. 23, №3.-С. 257-263.

96. Кучеренко JI.A. Условия получения растений-регенерантов в культуре тканей риса / JI.A. Кучеренко // Сельскохозяйственная биология. -1984.-№4.-с. 70-72.

97. Кучеренко JI.А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro / Л.А. Кучеренко // Биотехнология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 232-242.

98. Лазаричева С.Г. Земледелие и растениеводство / С.Г. Лазаричева. 1978, №1.-С. 214-215.

99. Лаханов А.П. Действие ССС на физиологические процессы, устойчивость и семенную продуктивность гречихи и фасоли / А.П. Лаханов // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии: Тез. докл. М.: Издательство ТСХА, 2001. - С. 256-257.

100. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений / Е.В. Левитес. -Новосибирск: Наука, 1986. 144 с.

101. Лукина Ю.А. Каллусогенез и морфогенез в культуре незрелых зародышей различных видов рода (Fagopyrum (polygonaccac) / Ю.А. Лукина, Н.И. Румянцева // Ботанический журнал. 1999. - 84, №3. - С. 74-80.

102. Лукьянюк С.Ф. Метод гаплоидии в селекции зерновых культур / С.Ф. Лукьянюк, С.А. Игнатова // Сельскохозяйственная биология. 1983. -№5.-С. 8-15.

103. Лутков А.Н. Методика получения полиплоидных гибридов сахарной свеклы / А.Н. Лутков, В.А. Панин, Е.Б. Панина, З.П. Карташова, Э.Н. Щипачева // Селекция и семеноводство. 1963. - № 4. - С. 58-61.

104. Мазлумов А.Л. Селекция сахарной свеклы / А.Л. Мазлумов. М.: Бета, 1996.-208 с.

105. Малецкая Е.И. Наследование признаков многосемянности и мно-гозародышевости у сахарной свеклы / Е.И. Малецкая // Генетика сахарной свеклы. Новосибирск: Наука, 1984. - С. 79-93.

106. Малецкий С.И. Наследование признака одно- и многосемяпочко-вости цветков свеклы / С.И. Малецкий, Е.И. Малецкая, М.А. Костыря // Од-норостковость свеклы (эмбриология, генетика, селекция). Новосибирск: Наука СО, 1988. - С.35-78.

107. Малюта Э.И. Получение мейотических тетраплоидов сахарной свеклы с помощью нередуцированных гамет / Э.И. Малюта // Генетика сахарной свеклы. Новосибирск: Наука, 1984. - С. 161-171.

108. Маринчик А.Ф. Межвидовые гибриды свеклы высокосахаристый материал для селекции / А.Ф. Маринчик // Основные выводы научно-исследовательских работ по сахарной свеклы за 1966 год. - Киев, 1968. - т.1. -С. 9-12.

109. Марьяхина И.Я. Возможность использования метода полиплои-дизации in vitro в селекции лука / И.Я. Марьяхина, И.В. Полумордвинова, Н.П.Шевченко // Сельскохозяйственная биология. 1994. - №5. - С.32-31.

110. Методические указания по цитоэмбриологическим исследованиям в селекции сахарной свеклы. Киев, 1984. - 62 с.

111. Миляева Э.Л. Формирование клубнелуковиц-регенерантов шафрана посевного в культуре in vitro / Э.Л. Миляева, Н.Ш. Азизбекова, Э.Н. Комарова, Д.Д. Ахундова// Физиология растений. 1995. - т. 42. С. 127-134.

112. Мишуренко А.Г. Применение гидразида малеиновой кислоты в виноградорстве / А.Г. Мишуренко, Н.И. Нагорный // Гидразид малеиновой кислоты как регулятор роста растений. М.: Наука, 1973. - С. 203-214.

113. Моисеева Н.А. Выявление антигенов-маркеров стеблевой меристемы табака / Н.А. Моисеева, А. Володарский, Р. Бутенко // Физиология растений. 1979. - Т. 26, вып. 3. - С. 479-484.

114. Моисеева Н.А. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений / Н.А. Моисеева // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 166-185.

115. Мосина Н.Р. Получение тетраплоидных форм сахарной свеклы воздействием колхицина / Н.Р. Мосина // Наука производству. - Воронеж, 1967. - С. 17-20.

116. Молхова Е.М. Влияние генов мужской стерильности ms 32, ms-35/10 на развитие женского гаметофита и эмбриогенез томата / Е. Молхова, М. Михайлова, Б. Атанасова // Генетика и селекция. - 1990. - 23, № 4. - С. 298-300. '

117. Мочалова О.В. Основные пути формирования гаплоидных и полиплоидных микроспор в результате химических шоков у облепихи / О.В. Мочалова // Состояние и проблемы садоводства России: ч.1 / НИИ садоводство Сибири. Новосибирск, 1977. - С. 105-112.

118. Мураненко И.М. Каллусогенез и эмбриоидогенез в культуре пыльников картофеля / И.М. Мураненко, А.А. Кучко // Цитология и генетика. 1989. - 23, №3.-С. 48-51.

119. Муратова С.А. Влияние регуляторов роста на морфогенез в культуре листовых тканей сливы домашней / С.А. Муратова // Регуляторы роста в биотехнологии.- М., 2001. С. 180-181.

120. Муромцев Г.С. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений /Г.С. Муромцев, Д.И. Чкаников, О.Н. Кулаева, К.З Гамбург. М.: Агрохимиздат, 1987. - 385 с.

121. Муромцев Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, И.Т. ТихоненкоИ.М. Прокофьев М.: Агро-промиздат, 1990. - С. 187.

122. Мюнцинг А. Генетические исследования / А. Мюнцинг. М.: Изд. иностранной литературы, 1963. - 488 с.

123. Мясоедов Н.А. Оптимизация питательной среды и выделение новых штаммов для культуры тканей женьшеня / Н.А. Мясоедов, З.Б. Шамина, Р.Г. Бутенко // Физиология растений. 1985. - т.32, №4. - С.800-806.

124. Навашин М.С. Новая возможность в селекции (об использовании гаплоидов) / М.С. Навашин // Ботанический журнал. 1934. - Т. 19, № 4. - С. 640-641.

125. Нежевенко Г.И. Близнецовый метод получения гаплоидных растений / Г.И. Нежевенко, В.К. Шумный // Генетика. 1970. -т.6. - С. 173-180.

126. Новак Ф.Й. Индукция гаплоидов в культуре тканей и их значение в селекции растений / Ф.Й. Новак // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. - С. 159-167.

127. Нуждина В.В. Изучение и разработка новых способов создания закрепителей стерильности у сахарной свеклы: Автореф. дис. канд. с.-х. наук / В.В.Нуждина. Киев, 1992. - 24 с.

128. Оканенко А.С. Химия вегетирующей свеклы второго года / А.С. Оканенко, В.И. Товарницкий // Физиология сельскохозяйственных растений. М.: МГУ, 1968. - т. 7. - С. 388-404.

129. Олейникова Т.В. Водоудерживающая способность и устойчивость к засухе видов и сортов пшеницы / Т.В. Олейникова // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции, ВНИИ растениеводства. 1976. - 57, № 2. - С.46-58.

130. Определение числа хромосом и описание их морфологии в меристеме и пыльцевых зернах культурных растений: Методические указания ВИР.-Л., 1986.-62 с.

131. Ошевнев В.П. Образование пистилодий у сахарной свеклы / В.П. Ошевнев, Н.П. Грибанова, Т.П. Жужжалова, Э.И. Черепухин // Генетика. -1986.-т. 22,№4.-С. 889-891.

132. Павлова М.К. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек: возможности и перспективы (обзор) / М.К. Павлова // Сельскохозяйственная биология. 1987. -№ 1. - С. 27-33.

133. Паламарчук И.А. Учебное пособие по гистохимии /И.А. Паламар-чук, Т.Д. Веселова. М.: МГУ, 1965. - 108 с.

134. Парий Ф.Н. Повышение выхода гаплоидов у сахарной свеклы / Ф.Н. Парий, Л.О. Рябовол // Селекция и семеноводство. 1992. - № 6. - С.ЗО.

135. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева -М.: Колос, 1980.-304 с.

136. Перетятько В.Г. Ослабленный инбридинг в селекции / В.Г. Перетятько // Сахарная свекла, 1986. № 12. - С. 26-29.

137. Першина JT.A. Проблема использования методов in vitro при отдаленной гибридизации злаков / JI.A. Першина, В.К. Шумный // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 102-113.

138. Петров Д.Ф. Передача апомиксиса от трипсакум к кукурузо-подобным гибридам / Д.Ф. Петров, Н.И. Белоусова, Е.С. Фокина // Отдаленная гибиридизация и апомиксис. Новосибирск, 1982. - С. 32-52.

139. Плаксина Т.В. Культура зародышей in vitro при селекции сибирских сортов вишни на иммунитет к коккомикозу / Т.В. Плаксина // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VII Между-нар. конференция. М., 1997. - С. 151.

140. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии / Н.А. Плохинский. М.: МГУ, 1980.- 150 с.

141. Подвигина О.А. Экспериментальное получение гаплоидных линий у сахарной свеклы / О.А. Подвигина, В.В. Знаменская, Т.П. Жужжалова // Апомиксис у растений: состояние, проблемы и перспективы исследований:

142. Труды междунар. симпозиума, Саратов, 21-24 июля 1994г. Саратов, 1994. -С.122-123.

143. Подвигина О.А. Депонирование селекционного материала сахарной свеклы на искусственных питательных средах / О.А. Подвигина, В.В. Знаменская, JI.A. Цупикова//Сахарная свекла. 2000. - № 12. - С.18-19.

144. Подлисских В.Е. О возможности использования в селекции картофеля фертильных дигаплоидных образцов доноров мейотических мутаций /В.Е. Подлисских, B.JI. Подлисских, Б.Ю. Аношенко // Сельскохозяйственная биология. - 1999. - № 3. - С. 54-60.

145. Полевой В.В. Физиология роста и развития растений / В.В. Полевой, Т.С. Саламатова. Л.: Изд-во Ленинград, ун-та, 1991.- 239 с.

146. Попов В.И. Условия культивирования изолированных апексов хмеля для клонального микроразмножения / В.И. Попов, В.А. Высоцкий, И.М. Туктагулов // Физиология растений. 1985. - т.32, вып.6. - С. 1191-1195.

147. Попович Е.А. Влияние цитокининов на регенерацию адвентивных побегов гипсофилы / Е.А. Попович, О.Н. Козлова, И.О. Брель // Регуляторы роста.-2001. С. 187.

148. Постон Т. Теория катастроф / Т. Постон, Ф. Стюард. М.: Мир, 1980.-С. 505-513.

149. Прилюк Л.В. Получение гибридов тетраплоидной пшеницы одно-зерняной и рожью / JI.B. Прилюк//Генетика. 1984,- т.20. - С.1344-1347.

150. Ракитин Ю.В. Гидразид малеиновой кислоты, природа его действия и практическое применение / Ю.В. Ракитин // Гидразид малеиновой кислоты как регулятор роста растений. М.: Наука, 1973. - С. 5-39.

151. Ралдугина Г.Н. Анализ роста культуры клеток сахарной свеклы семядольного происхождения в жидкой питательной среде / Г.Н. Ралдугина, И.Н. Смоленская//Физиология растений. 1983. - т. 30, вып.6. - С. 1156.

152. Редысо В.И. Реакция меристем сахарной свеклы на солевой стресс /В.И. Редько, Л.А. Редько, Л.А. Сахно // Биотехнологические методы в селекции сахарной свеклы. М., 1989. - С. 27-32.

153. Самойленко Н.А. Регуляция плодоносящих насаждений земляники на обработку плантации препаратом ССС / Н.А. Самойленко // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии.: Тез. докл. М.: ТСХА, 2001. - С. 273-274.

154. Сарапуу Л.П. Основные соединения и рост растений/ Л.П. Сара-пуу, В.И.Кефели // Фенольные соединения и их биологические функции. М.: Наука, 1968. - С. 129.

155. Сатарова Т.Н. Культивирование пыльников кукурузы /Т.Н. Сатарова // Биология культивируемых клеток и биотехнология.: Тез. докл. Международной конференции. Новосибирск, 1988. - С. 217.

156. Сафразбекян С.А. Роль сахарозы в регуляции морфогенеза каперса in vitro / С.А. Сафразбекян, В.В. Урманцева, Н.В. Катаева // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 192-197.

157. Сеилова Л.Б. Эмбриология индуцированного апомиксиса у сахарной свеклы / Л.Б. Сеилова, А.А. Абдурахманов, Н.А. Хайленко // Цитология и генетика, 1984. № 2. - С.90-92.

158. Сеилова Л.Б. Пути формирования апомиктического потомства у сахарной свеклы с факультативным апомиксисом / Л.Б. Сеилова, А.А. Коновалов, И.Я. Балков // Цитология и генетика. 1994. - № 4. - С.45-47.

159. Сельскохозяйственная биотехнология. Под общ. ред. Шевелухи B.C. М.: Высшая школа, 1998. - 416 с.

160. Семан И. Результаты научного исследования биотехнологии сахарной свеклы / И. Семан, Ю. Фараго // Использования биотехнологических методов в селекции сахарной свеклы. Киев, 1989. - С. 58-63.

161. Семенов И.Л. Влияние осмотически активных веществ на поглощение и метаболизацию сахарозы тканями корня сахарной свеклы / И.Л. Семенов, В.И. Пузанов// Физиология растений. 1985. - т. 32, вып.5. - С. 876883.

162. Синнот Э. Морфогенез растений / Э. Синнот. М., 1963. - 603с.

163. Славова И.В. Разработка метода вегетативного размножения и получения гаплоидов в культуре in vitro у сахарной свеклы: Авто-реф.дис.канд. с.-х. наук / И.В. Славова. Пловдив, 1988. - 33 с.

164. Славова И.В. Получение гаплоидных растений из неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы Beta vulgaris L. в условиях in vitro / И.В. Славова, Е.Г. Рафаилова // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С.285-287.

165. Слесаравичус А.К. Получение межродовых и трехродовых гибридов злаковых трав методом изолированных зародышей / А.К. Слесаравичус, Г.А. Дабкавиченс // Селекция и семеноводство. -1984. т.9. - С. 14-16.

166. Соловых Н.В. Оптимизация состава питательных сред для регенерации адвентивных побегов из листовых сегментов земляники / Н.В. Соловых // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологии. 2001. - М.: Изд-во ТСХА, 2001. - С 193.

167. Стрибуль Т.Ф. Влияние криовоздействий на семена овощных культур / Т.Ф. Стрибуль, Т.К. Лесив // Криобиология. 1990. - № 2. - С. 39-43.

168. Стрибуль Т.Ф. Оптимизация метода криоконсервирования меристемы картофеля /Т.Ф. Стрибуль, С.Т. Олейник, А.Н. Новиков, А.И. Геращенко //Проблемы криобиологии. 1999. -№ 1. - С. 37-60.

169. Таратонов Н.А. Влияние экзогенных факторов на рост и развитие регенерантов в процессе формирования дигаплоидных форм сахарной свеклы: Автореф. дис. канд.с.-х.наук / Н.А. Таратонов. Рамонь, 1999. - 20 с.

170. Тарчевский И.А. Янтарная кислота миметик салициловой кислоты / И.А. Тарчевский, Н.Н. Максютова, В.Г. Яковлева, А.Н. Гречкин // Физиология растений. - 1999. - т. 46, № 1. - С.23-28.

171. Титова И.В. Преодоление постгамной несовместимости в скрещиваниях лука репчатого с дикими видами методом культуры зародышей / И.В. Титова // Культура клеток растений и биотехнологии, М.: Наука, 1986. -С. 195-199.

172. Тихонова В.А. Влияние замораживания на жизнеспособность семян некоторых культивируемых лекарственных растений / В.А. Тихоно-ва, Т.Н. Кружалин, Е.В. Шугаева // Растительные ресурсы. 1997. - № 1. - С. 6874.I

173. Тихонова В.А. Долговременное хранение семян / В.А. Тихонова // Физиология растений. -1999. т. 46, № 3. - С. 467-477.

174. Тодуа В.А. Индуцированный партеногенез у Nicotiana tabacum L. / В.А. Тодуа. Е.Г. Тавдумадзе, М.Ф. Терновский, Ю.Ф. Сарычев // Докл. АН СССР. 1967. - т. 177. - С. 449-459.

175. Тупик Н.Д. Некоторые биохимические процессы, протекающие в репродуктивных органах сахарной свеклы при воздействии гидразид малеичновой кислоты / Н.Д. Тупик, Ф.Л. Калинин. М.: Наука, 1973. - С. 211-214.

176. Турбин Н.В. Генетика гетерозиса и метода селекции растений на комбинационную способность /Н.В. Турбин // Генетические основы селекции растений. М.: Наука, 1971. - С. 112-155.

177. Турков В.Д. Сравнительная эффективность гамма- и ультрофио-летового облучения в получении гаплоидных семян у томатов Licopersicon esculentum / В.Д. Турков, А.П. Дубрава // Докл. АН СССР. 1968. - т.181. - С. 486-487.

178. Турков В.Д. Экспериментальный партеногенез у таматов / В.Д. Турков // II совещание по проблемам апомиксиса у растений и животных: Тез. докл. Новосибирск: Наука, 1968. - С. 63.

179. Тутаюк В.Х. Изучение онтогенеза и наследования процесса формирования надземных корнеплодов у сахарной свеклы / В.Х. Тутаюк, С.Д.

180. Алиев // Проблемы онкологии и тератологии растений. Л.: Наука, 1975. - С. 144-145.

181. Тырнов B.C. Гаплоидия у растений: научное и прикладное значение /B.C. Тырнов. М.: Наука, 1998. - 53 с. - Библиогр.: 40-51.

182. Уизерс Л.А. Хранение ткани при биотехнологии растений / Л.А. Уизерс // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиз-даг, 1987. - С. 176-205.

183. Федосенко В.А. Консервация семян культурных и диких видов картофеля при сверхнизкой температурой / В.А. Федосенко // Научно-технический бюллетень ВИР. 1980. - № 105. - С. 80-82.

184. Федулова Т.П. Изоферментные маркеры в идентификации гаплоидов сахарной свеклы / Т.П. Федулова, О.А. Подвигина // Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений, Матер, конфер., Киев 10-13 мая 1994. Киев: Аграрна наука, 1994. - С. 69.

185. Фенина Н.А. Поддержание коллекции оздоровленных сортов картофеля in vitro / Н.А. Фенина // Биотехнология в картофелеводстве: Научн. тр. Рос. с.-х.акад. НИИ картофел. хоз-ва. М.:НИИКХ, 1991. - С. 22-24.

186. Физиология сельскохозяйственных растений / Под ред. Б.А. Рубина. М.: Изд-во Москов. ун-та, 1968. - т.7. - С. 426.

187. Халитов А.Х. Методические указания по использованию тура как средства повышения урожая зерновых культур и предотвращения их полегания / А.Х. Халитов. М.: Колос, 1974. - С. 26.

188. Харечко-Савицкая Е.И. Цитология и эмбриология сахарной свеклы / Е.И. Харечко-Савицкая // Свекловодство. т.1. - Киев: Госсельхозиздат, 1940.-С. 453-550.

189. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro / Г. Хасси // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиз-дат, 1987. - С. 105-133.

190. Хорошайлов Н.Г. Длительное хранение семян мировой коллекции ВИР / Н.Г. Хорошайлов, Н.В. Жукова // Научно-технический бюл.ВИР. -1978.-№77.-С. 9-19.

191. Хохлов С.С. Гаплоидия у покрытосеменных растений / С.С. Хохлов, Е.В. Гришина, М.И. Зайцева, B.C. Тырнов, Н.А. Малышева-Шишкинская . Изд. Саратовского университета, Саратов, 1970. - 137 с.

192. Хохлов С.С. Гаплоидия и селекция / С.С. Хохлов, B.C. Тырнов, Е.В. Гришина. М.: Наука, 1976. - 221 с.

193. Цветова М.И. Эффективность различных способов колхициниро-вания растений (на примере злаков) / М.И. Цветова, А.Т. Ишин // Сельскохозяйственная биология. 1999. - № 5. - С. 110-121.

194. Черемис Ю.К. Влияние недостатка минерального питания на фотосинтетический аппарат хлореллы / Ю.К. Черемис, А.В. Попова, А.А. Ару-тюнян, П.С. Венедиктов // Физиология растений. 1989. - т. 36, вып. 1. - С. 57-67.

195. Чуб В. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весеннецветущих видов Crocus L. / В. Чуб, Т. Власова, Р.Г. Бутенко / Физиология растений. 1994. - т. 41, вып. 6. - С. 815-820.

196. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор / З.Б. Шамина // Культура клеток растений. М,: Наука, 1981. - С. 124-135.

197. Шатилов Ф.В. О совместном действии ГМК и аммиачной селитры на ростовые процессы вяза перистоветвистого / Ф.В. Шатилов, Н.К. Не-упокоева // Гидрозид мапеиновая кислота как регулятор роста растений. М.: Наука, 1973. - С. 180-187.

198. Шевелуха B.C. Рост растени и его регуляция в отногенезе / B.C. Шевелуха. М.: Наука, 1992. - 599 с.

199. Шевченко А.Г. Оптимизация системы технологических приемов безвысадочного семеноводства гетерозисных межлинейных гибридов сахарной свеклы: Автореф. дис. доктора с.-х. наук / А.Г. Шевченко. - Рамонь, 2002. - 46 с.

200. Ширяева Э.И. Гистохимическое и биохимическое изучение формирования семян у разных форм сахарной свеклы / Э.И. Ширяева // Современные проблемы физиологии и биохимии сахарной свеклы. Киев: Наукова думка, 1981.-С. 200-205.

201. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции / -Под ред. Т.Б. Батыгиной.- С-Пб.: Мир и семья, 2000. т. 3. - 640 с.

202. Эмануэль Н.М. Физико-химические основы применения феноль-ных соединений в химии и биологии / Н.М. Эмануэль // Фенольные соединения и их биология. М.: Наука, 1968. - С. 311.

203. Юрцева В.Н. Методическое руководство к лабораторно-практическим занятиям по цитологической и эмбриологической микро технике / В.Н. Юрцева, В.А. Пухальский. М.: ТСХА, 1968. - 113 с.

204. Юсубов A.M. Создание полиплоидных форм сахарной свеклы / A.M. Юсубов, Н.Р. Мосина // Полиплоидия и селекция сахарной свеклы. М.: Наука, 1970.-С. 120-133.

205. Adams A.N. Elimination of viruses from the hop by therapy and meristem culture / A.N. Adams // Horticult. Sci. 1975. - v.50, № 2. - P.151.

206. Alleweldt G. Der Einflub von Wachstumsinhibitoren auf die Langzeitagerung von in-vitro-Kulturen der Rebe / G.A lleweldt //Harst-LangenbucherMargit. "Vitis", 1987. 2, № 2. - P. 57-64.

207. Anzai H. Transgenic Tobacco Resistant to a Bacterial Disease by the Detoxification of a Pathogenic Toxin / H. Anzai, K. Yoneyama, I. Yamaguchi // Mol.Gen.Genet. 1989. v.219. -P.492-494.

208. Ao G.M. Induction of Haploid plantlets from unpollinated maize ovaries in vitro / G.M. Ao, S.X. Zhao, G.H. Li // Acta Genetica Sinica. 1982. - 9, 4.-P. 281-283.

209. Asano Y. Studies on the crosses between distanty related species of Lilies. The culture of immature hybrid embiyos 0,3-0,4 mm long / Y. Asano // J Jpn SocHortic Sci. 1980.-49.-P. 114-119.

210. Augereau J.M. Long term storage of callus cultures at low temperatures or under mineral oil layer / J.M. Augereau, D. Courtois, V. Petiard // Nestle Res. News, 1986-1987. Veveiy, 1987. - P. 121-124.

211. Bajaj Y.P.S. Survival of Nicotiana and Atropa pollen embryos frozen at 196°C. / Y.P.S. Bajaj// Current Science (India), 1977a.-46. - 305-7.

212. Bajaj Y.P.S. Ciyobiology of plant cell cultures and establishment of gene banks / Y.P.S. Bajaj, J. Reinert// In Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Berlin, 1977. -P.757-77.

213. Bajaj Y.P.S. Regeneration of shoots from bltra lou -frezen anthers of Primula obconia / Y.P.S. Bajaj // Scientia Horticulturae. - 1981. -14. - P. 93-5.

214. Bajaj Y.P.S. Induction of genetic variability in grain-legumes through tissue culture / Y.P.S. Bajaj, S.S. Gosal // Rao AN (ed) Proc COSTEO Symp. Tissue culture of economically important plants. Natl Univ Singapore. 1982. - P. 25-41.

215. Barro F. Response of different genotypes of Brassica carinata to microspore culture / F. Barro, A. Martin // Plant Breed. 1999. - 188, № 1. - P. 7981.

216. Belous V.E. Sugar beet embryos during cultivation of isolated non-^ pollinated ovules in vitro / V.E. Belous // Embryology and seed reproduction: XI1.t. symp., Leningrad, USSR, July 3-7, 1990. Leningrad. - 1990. - P. 19.

217. Blakeslee A.F. Chromosomal mutations in the jion weet, Datura stramonium / A.F. Blakeslee, J. Belling // J.Heredity. 1924. - v. 15. - P.195-206.

218. Blakeslee A.F. Methods of inducing doubling of hromosomes in plants /A.F. Blakeslee, A. Avery//J. Heredity. 1937.-v.28. - P. 393-411.

219. Bosemark N.O. Nove kierunki w hodowli genetyiznie jednonasiennych odmian buraka cukrowego / N.O. Bosemark // Biologia buraka cukrowego. -Warszawa, PNN. 1979. - P. 286-305.

220. Bossoutrot D. Gynogenesis in Beta vulgaris L.: From in vitro culture of unpollinated ovules to the production of doubled haploid plants in soil / D.

221. Bossoutrot, D. Hosemans // Plant Cell Repts. 1985. - 4, № 6. - P. 300-303.

222. Bothmer Roland Von. Haploid barley from the in :ergeneric cross Hordeum vulgare x Psathyrostachys fragilis / Roland Bothmer, Niels Jacobsen, Rikke Sorgensen, T. Linde-Laursen // Euphytica. 1984. - 33, № 2. - P.363-367.

223. Botrill D.E. The effects of nutrient deficiensies on photosynthesis and respiration in spinach PI. / D.E. Botrill, J.M. Possingham, P.E. Kriedeman // Soil. -1970. -v.32,№2.-P. 424.

224. Butenko R.G. Somatic embryogenesis in carrot tissue cultures under conditions of high salf concentrations in the medium / R.G. Butenko, B.P. Strogonov, Z.A. Babaeva//Dokl. Akad. Nayk SSSR. 1967. - P.l 179-1181.

225. Campion B. Spontaneous and induced chromosome doubling in gynogenic lines of onion (Allium сера L.) / B. Campion, E. Perri, M.T. Azzimonti, E. Vicini, M. Schiavi // Plant Breed. 1995. - 114, №3. - P.243-246.

226. Chase S.S. The monoploid of developing inbred lines / S.S. Chase // Proc. 6-th Annal. Hybrid Corn Industry Res. Corn. 1951. - 6. - P. 29-34.

227. Chan J.L. Regeneration of coconut (cocos nucifera L.) from plumule explants through somatis embryogenesis / J.L. Chan, L. Saenz, C. Talavera, R. Hornung, M. Robert, C. Oropeza // Plant Cell Repts. 1998. - 17, №6-7. - P. 515521.

228. Chekurov V.M. Effect of inbreeding and gromth regulators on the in vitro androgenesis of wheatgrass, Agropyron glaucum / V.M. Chekurov, E.P. Razmakhnin // Plant Breed. 1999. - 118, №6. - C. 571-573.

229. Chmielarz P. Research note: Gryopreservation of Norway spruce Picea abies (L) Karst. seeds for two years / P. Chmielarz // Plant Varieties and Seeds. -1998. 11,№2.-P. 129-130.

230. Coll Yamilet. Improvement of indica rice (Oryza sativa) in vitro regeneration efficiency from callus mtdiated by stress / Yamilet Coll, Mtrardo Pujol,

231. Damans Castillo, Annerys Gonzaltz, Julio Alfonso, Raul Armas // Cereal Res Commun. 1998.- 26, №2. - P. 153-160.

232. Collins G.B. Culture of embiyos / G.B. Collins, J.W. Grosser // Cell culture and comatic cell genetics of plants. L.: Aced. press. 1984. -P. 241-257.

233. Comai L. An Altered aroA Gene Product Confers Resistance to the Herbicide Glyphosate / L. Comai, L.C. Sen, D.M. Stalker // Science. 1983. -v.221. - P.370-373.

234. Cox E.A. In vitro culture of musa babbisiana colla embryos / E.A. Cox, G. Stetuky, R.D. Goos//Nature. 1960. - 185. - P. 403-404.

235. Chopra R.N. In vitro culture of ovules of Gynandropsis gynandra Brid and Impateins balsamina L. / R.N. Chopra, P.S. Sabharwal // Ma heshwavi. 1962. -P. 257-264.

236. D'Amato F. Chromosome number variations in culyured cell and regenerated plants / F. D'Amato // Troutiers of plant Tissue Culture. Calgary: Calgary University, 1978. - P. 287-296.

237. Dale P.J. Comparison of Callus Induction and Plant Regeneration from Different Esplants of Hordeum vulgare / P.J. Dale, E.A. Deambrogio // Pflanzenphysid. 1979. - v. 94. - P. 65-77.

238. Deanon J.R.Treatment of sweet corn silks with mallic hydrade and colhicine as means of increasing the frequency of monoploids / J.R. Deanon // Philipp. Agr. 1957. - 41. - P. 364-377.

239. De Maine M.J. Periderm cell size as a ploidy indicator in potato (Solanum tuberosum L. subspecies tuberosum) / M.J. De Maine // Ann. Appl. Biol. 1998.- 133,№2.-P. 307-312.

240. D'Halluin Katelijn. Production of haploid sugar beets (Beta vulgaris L.) by ovule culture / Katelijn D'Halluin, Birgit Keimer // Gen. Manipulat. Plant Breed: Proc. Int. Symp. Berlin: New York, 1986. - P. 307-309.

241. Doussinault Gerard L'avenir De La selection du bli tendre / D. Gerard // Ind cirial. 1983. - № 24. - P. 7-9.

242. Eid E.D. In vitro culture of Dature innoxia: Flawer bud stage and embryoid level of ploidy / E.D. Eid, E. Delanghe, I. Waterkeyn // Hereditas. 1973. -72.-P. 331-332.

243. Ernould L. L'Autopolyploidie experimental chez la betterave / L. Ernould // La Cellule. 1946. - P. 50-54.

244. Espinasse Ann. Factors controlling in vitro develooment of sunflower embryos / Ann. Espinasse, Charles Lay, C. Dybing // Dean. Agronomie. 1985. - 5, № 9. - P. 825-832.

245. Farrant J. General observation on cell Preservation / J. Farrant, M.J. Ashwood-Smith //Low Temperature Preservation in medicine and biology. 1980. -P. 1-18.

246. Ferguson N.H. Interspecific Trifolium hyprids produced by embryo and ovule culture / N.H. Ferguson, F.A. Rupert P.T. Evans // Crop Sci. 1990. - 30, № 5.-P. 1145-1149.

247. Fujimura T. Effects of varions growth regulators on the embiyogenesis in carrot cell suspension culture / T. Fujimura, A. Komamine // Plant Sci Lett. -1975. -5.-P.359-364.

248. Fukai Seiichi. Storage of chrusanthemum grandiflorum Kitamural plantiets in vitro / Seiichi Fukai, Masaharu Morii // Plant Tissue Cult. Lett. 1988. -v.5, № l.-P. 20-25.

249. Gadgil V.H. Effekts of change of medium, agar concentration and tissue distrirbance on the growth of hollyhock crown gall tummor tissue / V.H. Gadgil // Plant tissue and organ culture. Sumpl. Intern. Soc. Plant Morphol. Univ. Delhi, 1963.-P. 108.

250. Gallais A. Place de e'haploidiedans un schema de selection / A. Gallais // Selec. Frans. 1978. - № 26. - P. 39-49.

251. Gamborg O.L. Culture method and detection of gluconate in suspension cultures of wheat and barley // O.L. Gamborg, D. Eveling // Can.J.Biochem. 1968. - 46. - P. 417-421.

252. Gibson Margaret S. Dihaploid plant production from ovules cultures of sugarbeet/M.S. Gibson//Proc. N.D. .Acad Sci. 1987. - P. 41-44.

253. Gonzales -A.M.T. Cryopreservation of pineapple (ananas comosus) apices / A.M.T. Gonzales, M.M. Ravelo, C.U. Villavicencio, M.M. Montero, F.Engelmann // Cryo-Lett. 1998. - 19, №6. - P.375-382.

254. Grafe C. Inerease of in vitro regeneration in Malus Domestica by the application of phosphatase inhibitors / C. Grafe, G. Wrkke // Plant Breed. 1998. -117, №6.-P. 565-566.

255. Grout B.W.W. Survival of shoot-meristems of tomato seedlings frozen in liqued notrogen / B.W.W. Grout,R.J. Westcott, G.G. Henshaw // Cryobiology. -1978.-15.-P. 478-83.

256. Guha S. In vitro development of ovary and ovule of allium сера L. // S. Guha, B.M. John //Phytomorghology. 1966. - 16. - P. 353-364.

257. Hadi S. Variation in anther culture efficiency among donor plant tillers in rice / S. Hadi, S.K. Raina // Curr. Sci. (India). 1989. - 58, №24. - P. 1397-1398.

258. Halluin Katelijn. Production of haploid sugarbeets (Beta vulgaris L.) by ovule culture / Katelijn Halluin, Birgit Keimer // Gen.Manipulat. Plant Breed. Proc. Int. Symp., Berlin, 1985. New. York. - 1986. - P. 307-309.

259. Hansen A.L. Efficient in vitro chromosome doubling during Beta vulgaris ovule culture / A.L. Hansen, C. Plever, H.C. Pedersen, B. Keimer, S.B. Andersen // Plant Breed. 1994. - 112. - №2. - P. 89-95.

260. Hansen A.L. Antimicrotubule herbicides for in vitro chromosome doubling in Beta vulgaris L. ovule culture / A.L. Hansen, A. Gertz, M. Joersbo, S.B. Andersen //Euphytica. 1998. - 101, №2. - P. 231-237.

261. Hansen N.J.P. Efficient production of doubled Wheat plants by in vitro treatment of microspores with trifluralin or АРМ / N.J.P. Hansen, S.B. Andersen // Hypertension. 1998. - 32, №6. - P. 401-405.

262. Hansen N.J.P. In vitro chromosome doubling with colchicine during microspore culture in wheat (Triticum activim L.) / N.J.P. Hansen, S.B. Andersen // Euphytica. 1998. -102,№1. -P.101-108.

263. Hanzel J.J. Genotype and media effects on Callus Formation and Regeneration in Barley / J.J. Hanzel, J.P. Miller, M.A. Brinkman, E. Fendos // Crop Sci.- 1985.-v.25.-P. 27-31.

264. Harvey B.L. The Inheritance of Erucic Acid Content in Rapeseed (Brassica napus) / B.L. Harvey, R.K. Dawney // Can. J.Plant. Sci. 1964. - v.44. -P.104-111.

265. Herrmann Lutt. Haploiden-technik bei der zuckerrube / Lutt Herrmann, Claudia Wetzel, Horst Lux // Potsdam Porsch. B. 1988. - № 57. - P. 95-99.

266. Hirai D. Cryopreservation of vitro grown meristems of strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) by encapsulation - vitrification / D. Hirai, K. Shirai, S. Shirai, A. Sakai//Euphytica. - 1998. - 101, №1. - P. 109-115.

267. Hitmi A Cryopreservation of Chrysanthemum cinerariaefolium shoot tips effects of pretreatment conditions and retention of biosynthetic capacity / A. Hitimi, C. Barthomeuf, H. Sallanon // Ciyo-Lett, 1999. - 20, №2. - P.109-120.

268. Hoffman G. Nachrichtenbl / G. Hoffman, D. Schuzke, E. Heyter et al // Pflanzenschutz DDR, 1974. 28, № 12. - P. 249-252.

269. Hosemans D. Induction of haploid plant from in vitro culture of unpollinated beet ovules (Beta vulgaris L.) / D. Hosemans, D. Bossoutrot // Z.Pflanzenzucht. 1983. - 91, № 1. - S.74-77.

270. Hosemans D. In vitro culture of unprollinated beet (Beta vulgaris L.) ovules of male sterile and male fertile plants and induction of haploid plants / D. Hosemans, D. Bossoutrot // The experimental manipulation of ovule tissues. 1985. - P. 79-88.

271. Huang Q.T. Embryological observations on ovary culture of unpollinated young blowers in Hordeum vulgare L. / Q.T. Huang, H.C. Vang, C. Zhou // Acta. Bot. sinca. 1982. - 24, № 3. p.295-300.

272. Indra K. Vasil Developing cell and tissue culture systems for the inprovement of cereal and grass crops / K. Vasil Indra // J. Plant Physiol. 1987. -128: 193.-P. 218.

273. Jakuezun H. Zastasowanie posrednich metod oxnaezania poziomu ploidaenosei ziemniaka /Jakuezun Henryka, Strzelezyk-Zyta Danuta, Narkiewicz Magdalena // Binl. Inst.Ziemn., 1997. 48, № 1. - P.91-98.

274. Jambhole N.D. Induced polyploids in senna a medicinal plant / N.D. Jambhale, H.K. Shiude, J.G. Patil, S.C. Patil // G. Mohorashtra Agz. Univ. 1997. -22, № 3. - P. 359-360.

275. Jassem В. Embryology and genetics of apomixis in the section Corollinae of the genus Beta / B. Jassem // Acta. Biol. Cracovensia. Ser. Botanica. -1976.-v.19.-P. 151-172.

276. John B.M. Growth responses of ovaries of Anethum, Foeniculum, Trachyspermum / B.M. Johri, C.B. Sehgal // Phytomorphology. 1966. - 16. - P. 364-378.

277. Johri B.M. Endosperm culture / B.M. Johri, P.S. Srivastava, A.P. Raste // Vasil I.K. (ed): Perspectives in plant cell and tissue culture. Intl Rew Cytol Suppl. B.Acadimic ress. - London New York, 1980. - P. 157-182.

278. Jones L.H. Long term suririal of embryos of carrot (Daucus carota L.) / L.H. Jones // Plant Scien ce Letters. 1974. - 2. - P. 221-4.

279. Kaul M.H. Mutant genes afFecling higher plant meiosis / M.H. Kaul, T.G.K. Murthy // Ther. and Appl. Genet. 1985. -70, №5. - P. 449-466.

280. Kaur Parampreet. Cajanus cajan Regeneration of haploid plants from microspore culture of pigeonpea (Cajanus cajan L.) /Parampreet Kaur, J.K. Bhalla // Indian J.Exp. Biol. 1998. - 36, № 7. - P. 736-738.

281. Keller J. Culture of unpollinated ovules, ovaries and flover buds in some species of the genus Allium and haploid induction via gynogenesis in onion (Allium сера L.) / J. Keller // Euphyfica. 1990. - 47, № 3. - P. 241-247.

282. Kihara H. Use of alien cytoplasms a new metod of producing haploids / H. Kihara, K. Tsunewaki // J.Genet. - 1962. - v. 37. - P. 310-313.

283. King M.W. The storage of Recalcitrant Seeds-Achievements and Possible approaches / M.W. King, E.H. Roberts // International Beard of Hant Genetic Resources (2BPGR) Repord, AGP: 2BPGR. 1979. - P. 44.

284. Kraeva Elena. Salicylic acid treatment of grape berries retards ripening / Elena Kraeva, C. Andary, A. Carbonneau, A. Deloire // Vitis. 1998.- 37, № 3. -P. 143-144.

285. Kruse A. Polyemryony in Brassica napus v. rapifera L. and Beta vulgaris L. / A. Kruse . Copenhagen: Yearbook, 1960 // Roy. Vet. and Agr.Coll. -1960.-P.37-46.

286. Kruse A. An in vivo/vitro embryo culture technique / A. Kruse // Hereditas. 1974. - v. 77. - P. 219-224.

287. Kruse A. The potential use of heterosis in Beta vulgatis / A. Kruse //1980 arsskrifi. Yeabook Jahrbuch Annuaire. Kobenhavn, 1980. P. 117-137.

288. Lakshmi Sita G. Triploid plants from endosperm culture of sandalwood by experimental embryogenesis / Sita G. Larshmi, Ram.N.V. Raghava, C.S. Vaidyanathan // Plant Sei Lett. 1980. - 20. - P. 63-69.

289. Laurie D.A. The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses / D.A. Laurie, M.D. Bennett // Theor. and Appl. Genet. 1988. - 76, № 3. - P. 393-397.

290. Lelley J. Geneties and cytology of unreduced gametes in cultivated rye (Secale cereole L.) / J. Lelley, A.A. Mahmoud, V. Lein // Genome, 1987. 29, № 4. - P. 635-638.

291. Levin R.L. Ciyobiology of isolated plant protoplasts / R.L.Levin, J.R. Ferguson, M.F. Dowgent, P.L. Stepenkus // Thermodynamic consider-ations (abstract.) Gryobiology. 1970. - 16. - P. 592.

292. Linacero R. Embryogenesis in Polyembrionic Secale cereale L. / R. Linacero, A.M. Varquenz // Plant Cell Rep. 1992. - v. 12.- P. 6-32.

293. Lovelock J.E. Heamolysis by thermal shock / J.E. Lovelock // British Journal ofHaematology. 1955. - 1. - P. 117-129.

294. Lux H. Production of haploid sugar beet (Beta vulgaris L.) by culturing unpollinated ovules / H. Lux, L. Herrmann, Claudia Wetzel // Plant Breed. 1990. -104, №3.-P. 177-183.

295. Luzrs R. Plant Regeneration in vitro from Embryogenic Cultures of spring and winter type Barley (Hordeum vulgare L.) Varieties / R. Luzrs, H. Lorz // Theor. Appl. Genet. - 1987. - v. 75. - P. 16-25.

296. Macleod R.A. Cold shock and freezing damage to microbes /R.A. Macleod, P.H. Calcott // Survival of vegetative microbes: Symp.26 of the society for General microbiology, Cambridge Universite Press. 1976. - P.81-109.

297. Mahapatra D. In vitro hybridization in an incompatible cross -Brassica juncea x Brassica hirta / D. Mahapatra, Y.P.S. Bajaj // Curr. Sci. 1984. - 53, № 9.- P. 489-490.

298. Mahapatra D. Hybridization in Brassica juncea x Brassica campestris through ovary culture/D. Mohapatra, Y.P.S. Bajaj // Euphytica. 1988. - 37, № 1.- P. 83-88.

299. Mallikarjuna Nalini. Ovule and embryo culture to obtain hybrids from interspecific incompatible pollinations in chickpea / Nalini Mallikarjuna // Euphytica. 1999. - 110, № 1. - P. 1-6.

300. Marciniak Karol. Effect of genotype, medium and sugar on triticale (Triticosecale Wittm.) anther culture response // Karol Marciniak, Zofia Banaszak, Matia Wedzony // Cereal Res. Commun. 1998. - 26, № 2. - P. 145-151.

301. Martinez Montero M.E. Cryopreservation of sugarcane embryogenic calluc using a simplified freezing process / M.E. Martinez-Montero, M.T. Gon-zalez-Arnaj, C. Borroto-Nordelo, C. Puentes-Diaz, F. Engelmann // Cryolett. -1998. - 19, №3.-P. 171-176.

302. Matsushima Tomoaki. Regeneration of plants by pollen culture in rice (Oryza sativa L.) / Tomoaki Matsushima, Shoshi Kikucni, Fumio Takaiwa, Kiyoharu Oono II Секубуцу сосики байе = Plant Tissue cult. Left. 1988. - 5, № 2.-P. 78-81.

303. Mazoti L.B. Haploides naturales en maiz / L.B.Mazoti, C.E.Muhlenberg // Rev. Agr. 1958. - v. 25. - P. 171-178.

304. Mdarhri-Alaoui Menem. Obtenion par gynogenese in vitro de plants haploides chlorophyliennes chez lenble dur / Meriem Mdarhri-Alaoui, Averil Chlyan, Hassan Chlyah // C.r.Acad. Sci. Ser. 3. 1998. - 321. - P. 25-30.

305. Mentewab A. Androgenic ability and chromosome doubling by different colchicine treatments in anther culture of hexaploid wheat genotypes (Triticum a estivum L.) / A. Mentewab. A. Sarrafi H Cereal Res. Commun. 1997. -25,№4.-P. 897-903.

306. Metwally E.I. Production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of Cucurbita pepo / E.I. Metwally, S.A. Moustafa, B.I. El-Sawy,S.A. Haroun, T.A. Shalaby // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1998. - 52, №3.-117-121.

307. Meyer R. Isolation and Characterisation of Potato Dioloid Clones Generating in Monohaploid or Homozygous Diploid Androgenetic Plants /R. Meyer, F. Salamini, H. Uhrig // Theor. Appl. Genet. 1993. - v. 85. - P. 905-908.

308. Miedema P. A tissue culture technique for vegetative propagation and low temperature preservation of Beta vulgaris / P.A. Miedema // Euphytica, 1982. - 31, № 3. - P. 635-643.

309. Mikami Tetsuo. Тэжай коэнюо кайхо / Tetsuo Mikami, Yukihiro Yanai, Toshiro Kinoshita // Proc. Sugar Beet Res. Assoc. 1990. - № 31. - P. 145450.

310. Miklovicova M. Anther culrure of triticale / M. Miklovicova // Acta fac. rerum. natur. Univ. comen. Genet. 1983. - 15. - P. 11-20.

311. Monnier Michel. Effect of ovular tissue on the development of Capsella embryos cultivated in vitro / Michel Monnier, Jean Lagriffol // J. Plant Physiol. -1986. 122, № 1. - P. 17-24.

312. Morris G.J. Effect of cooling rate on thermal shock haemolysis / G.J. Morris, J. Farrant // Cryobiology. 1973. - 10. - P. 119-25.

313. Morris G.J. Lipid loss and haemolysis by chermal shock: lack of correlation / G.J. Morris // Cryobiology. 1975. - 12. - P. 192-201.

314. Morris G.J. The cryopreservation of chlorella / G.J. Morris // Effect of growth temperature on freezing tolerance. Archives of Microbiology. 1976. - 107. -P. 309-12.

315. Mujeeb-Kazi A. An intergeneric hybrid of Triticum aestivum x Elymus giganteus / A. Mujeeb-Kazi, R. Rodriguez // J. Hered. -1981. v. 72. - P. 253-256.

316. Munerati O. Sull incrocio della barbabietola coltivata con la beta selvaggia della costa adriatica / O. Munerati // Ind. Sace. Ital. 1932. - v. 25. - P. 303-304.

317. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol plantarum. 1962. - v. 15.-P. 473-497.

318. Nacamura S. Somt Haploid plant in rice / S. Nacamura // Jour. Genet. Jap. 1933. - № 8. - P. 223-227.

319. Nagl W. Shift of DNA replication from diploid to poliploid cell in citocinin controlled differentiation / W. Nagl, W. Rucker // Cytobios. 1974. - v. 10. - 137p.

320. Negro V.Effect of selection and temperature stress on the production of 2n gametes in Lotus tenuis / V. Negro, G. Lemmi // Plant Breed. 1998. - 177, № 4. - P. 345-349.

321. Nitsch J.P. The in vitro culture of flowers and fruits / J.P. Nitsch. -(eds) Maheshwari P., Rangaswamy N.S. // Plant tissue and organ culture. A Symposium. Inte Soe Plant morphologists, Univ Delhi, 1963. - P.198-214.

322. Nogent S. Gynogenesis in sugarbeet, Beta vulgaris: Colloq. Impact Biotechnol. dans secteur veg. agro-aliment / S. Nogent, F. Dubois, P. Lenee // Bull. Soc. bot: Fr. Actual, bo. 1990. - 137, № 3-4. - P. 133.

323. Norstog K. Growth of zye grass endosperm in vitro / K. Norstog // Bot. Gaz. 1956. - 117. - P. 253-259.

324. Pat.285791, DDR, MKI5 с 12 N 5/04 Varfahren zur Langzeitlagerung bei Beta Ruben in vitro / Horst. Lux, Karin Lohmann, Anderas Kaiser, Johannes Oehme // Заяв. 06.07.89 № 3304780; Опубл. 03.01.91.

325. Paz M.M. Influence of culture medium and in vitro conditions on shoot regeneration in Solanum phureja monoplods and fertility of regenerated doubled monoploids / M.M. Paz, R.E. Veilleux // Plant Breed. 1999. - 18, №1. - P. 53-57.

326. Petolino J.F. Anther culture of elite genotypes of maize / J.F. Petolino, A.M. Jones // Crop Sci. 1986. - 26, № 5. - P. 1072-1074.

327. Polge C. Fruzing of spermatozoa / C. Polge // Temperature Preservation in medicine and Biology, ed M.J.Ashouood-Smith and J.Farrant. 1980. - P. 45-64.

328. Powling A. Restriction endonuclease analysis of mitochondrial DNA from sugar beet with normal and male sterile cytoplasms / A. Powling // Heredity/ -1982. v.49, №1. - P.l 17.

329. Pretova Anna. Cultivation of globular and heart stage flax embryos / Anna Pretova // Fert. and Embryogenes. Ovulated Plants. Proc. 7Int. Cytoembryol. Symp., High Tatra (Rackova dolina), June 14-17, 1982. Bratislava. - 1983. - P. 307-309.

330. Pundeva R.S. Using the method of tissue cultures for overcoming onterspecific incompatibility and hybrid sterility in genus Capsicum /R.S. Pundeva, N.A. Zagorska N.A. // Докл. Болг. АН. 1984. - 37, № 7. - P. 939-942.

331. Puri P. Growth in vitro of parthenogenetic embryos of Aerva tomentosa Forsk / P.Puri // Maheshwari R., Rangaswamy NS (eds) Plant Tissue and Organ culture A Symposium. Intl. Soc. Plant Morphologists, Univ. Delhi. - 1963. - P. 281-291.

332. Raghavan V. Experimental embryogenesis in vascular plants I V. Raghavan // Academic Rress, London- New York. 1979. - P. 75-89.

333. Ragot M. Genetic and environmental effects on chromosome doubling of sugarbeet (Beta vulgaris L.) haploids / M. Ragot, P. Steen // Euphytica. 1992. -63, №3.- P. 233-237.

334. Raina S.K. Crossability and in vitro development of hybrid embryos of Triticum durum x Secale cereale / S.K. Raina // Indian J. Genet, and Plant Breed. -1984, №3.-P. 429-437.

335. Rao A.N. Colyledon tissue culture of some tropical fruits / A.N. Rao // Rao A.N.(ed) Proc COSTED Symp. on Tissue culture of economically inportant plants NatP Univ Singapore. 1982. - P. 124-138.

336. Redha A. Improved production of doubled haploids by colchicine application to wheat (Triticun aestivum L.) anther culture / A. Redha, T. Attia, B.

337. Buter, S. Saisingtong, P. Stamp, J.E. Schmid // Plant Cell Repts. 1998. - 17, № 12. - P. 974-979.

338. Renoux H. Arboricult. fhiitiere /Н. Renoux. 1975. - 22, № 250/251. -P. 34-39.

339. Ritchie G.A. In vitro shoot regeneration from callus, leaf axils and petioles of sugar Beet (Beta vulgaris L.) / G.A. Ritchie, K.C. Short, M.R. Davey // J. of Experimental Botany, 1989. -v. 40, № 211. P.277-283.

340. Rober M. Synthesis of Fructans in Tubers of Transgenic Starch Deficient Potato Plants does not Result in an Increased Allocation of Carbohydrates / M. Rober, K. Geider, B. Muller-Rober, L. Willmitzer // Planta. \996. - v. 199. -P.528-536.

341. Rosenthal Ch. Ein Vergleich der Methoden zur Gewinnung polyploiden Ausgangsmaterials fur die Beta Rubenzuchtung Wiss / Ch. Rosenthal // Abh. dtsch. Akad. Landw. -1958. - 34. - P. 1-7.

342. Rongbai Li. Agromorphological characterilation of ovary culture-derived plants of rice (Oryza sativa L.) / Li Rongbai, M.P. Pandey, S.K. Pandey, D.K. Dwivedi // Euphytica. 1999. - 106, № 3. - P. 197-203.

343. Sabir A.A. Processing crop plant germplasm in vitro for mass production of regenerants: a case study with beet / A.A. Sabir, B.V. Ford-iloyd // J. of Biotechnology. -1991 17. - P. 257-268.

344. San Noeum L.H. Haploides d'Hordeum vulgare L. par culture in vitro d'ovaries non fecondes / L.H. San Noeum // Ann. Amelior. Plant. 1976. - 26, № 4. -P. 751-754.

345. San Noeum L.H. In vitro induction of gyhogenesis in higher plants / L.H. San Noeum // Broadening Genet. Base Crops. Proc. Conf. Wageningen. -1979.-P. 327-329.

346. Sares Sonia. Obtencion de plantas haploides en Oryza sativa L. / Sonia Sares // Cult. trop. 1986. - 8, № 3. - P. 9-16.

347. Sarkar Debabrata. Factors affecting minimal growth conservation of potato microplants in vitro / Debabrata Sarkar, Prakash Naik // Euphytica. 1998. -102, №2.-P. 275-280.

348. Savaskan C. Callus production and plant regeneration in Mi plant of barley (Hordeum vulgare L.) / C. Savaskan // Turk J. Nucl. Sci. 1997. - 24, № 1. -C. 57-66.

349. Savitsky H. Effect of low colchicine concentration on inducing tetraploidy in sugar beets / H. Savitsky // J. Amer. Soc. Sugar Beet Technol. 1968. -15.-P. 2-7.

350. Savitsky H.I. Production of homozypons nematode resistance plant lines in diploid Beta vulgaris procumbens hybrids / H.I. Savitsky // Genetics. -1981.-v. 97.-P. 94.

351. Seman I. The cloning of sugar beet (Beta vulgaris L.) in vitro / I. Seman / Biologia (Bratislava). 1984. - 39. - P. 49-54.

352. Seman I. Research biotechnological methods in sugar beet breeding in the research and breeding institute at Bucany / I. Seman, J. Farago // Potsdam. Forsh. B. 1988. -№57. -C. 51-56.

353. Seman I. In vitro cultivation of unfertilized ovules of sugar beet / I. Seman, J. Farago // Embryology and seed reproduction: XI Int. symp., Leningrad, USSR, july 3-4, 1990. Leningrad. - 1990. - C. 146.

354. Singh J. Freezing of isolated from coldhardened and non-hardened winter rye/J. Singh//Plant Scince Letters. 1979. - 16. -P. 195-201.

355. Sitbon M. Production of haploid Gerbera Jameesonii plants by in vitro culture unfertilized ovules / M. Sitbon // Agronomie. 1981. -1, № 9. - P. 807-812.

356. Skoog F. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro / F. Skoog, C.O. Miller // Biological Action of Growth Substances: Symposia of the Society for Experimental Biology. 1957. - 11.- P. 118.

357. Souter E.W. In pollen formation via parallel spindler in the potato cultivar Sebago / E.W. Soulter // Am Potato J. 1980. - v. 57, № 9. - P.449-455.

358. Srivastava P.S. Endosperm culture / P.S. Srivastava ; D.M.Jokri (ed). // Experimental embryology of vascular plants. Springer, Berlin Heidelberg New York, 1982.-P. 175-193.

359. Stalker D.M. Herbicide Resistance in Transgenic Plants Expressing a Bacterial Detoxification Gene / D.M. Stalker, K.E. McBride, L.D. Malyi // Science. 1988. v.242. - P.419-423.

360. Stanzel M. Transport of glucose, fructose and sucrose by Steptanthus torluosus / M. Stanzel, R.D. Siolung, E. Rower // Planta. 1988. - v. 174, №2. - P. 201-210.

361. Stocker 0. Contributions to the problem of drought resistance of plants / O. Stocker // Indian J. Plant Physiol, 1961. 4, №2. - P.87-102.

362. Subrahmahyam N.C. Haploidy from Hordeum in perspecific crossis. Part II: Dihaploids of H.brachvantherum and H.depressum / N.C. Subrahmahyam / Theor. and Appl. Genet. 1979. - 55, № 3. - P. 139.144.

363. Tillberg J.E. Effect of abscisic acid, salicilic acid and trans-cinnamic acid on phosphate up take / J.E. Tillberg // Physiol, plantarum. 1970. - 23. - P. 647.

364. Tilton Varien R. In vitro culture of immature soybean embryos / R. Varien Tilton, H. Sandra Russell // J. Plant Physiol. 1984. - 115, № 3. - P. 191200.

365. Towill Leigh E. Cryopreservation of sour cherry (Prunus cerasus L.) using a dormant vegetative bud method / E. Zecgh Towill, L. Phibip Forsline // Cryo-Lett. 1999. - 20, № 4. - P. 215-222.

366. Truong Andre I. Obtaining plants by in vitro culture of unfertilized maize ovaries (Zea mays L.) and preliminary studies on the Progeny of gynogenetic plant / I. Truong-Andre, V. Demarly // Z. Pflanzenzucht. - 1984. - 92, № 4. - P. 309-320.

367. Turgut K. Efficient shoot regeneration and somatic embryogenesis from immature cotyledons of Brassica napus L. / K. Turgut, M. Barghchi, R. Scott // Plant Breed. 1998. - 117, № 5. - P. 503-504.

368. Yang H.Y. In vitro induction of haploid plantlets from unpollinated young ovaries and ovules / H.Y. Yang, C. Zhou // Theor. Appl. Genet. 1982. - 63, №2-P. 97-104.

369. Yazawa S. Bulbil Formation of Dioscorea opposita cultured in vitro / S. Yazawa, T. Asahira // Mem. Coll. Agr. Kyoto Univ. 1979. - № 113. - P. 39-53.

370. Yu D. Is the High Basab Level of Salicylis acid Important for Disease4

371. Resistana in potato? / D. Yu // Plan Physiol. 1997. - v. 115. - P. 343-349.

372. Yi Hualin. Huanzheng nongye daxue xuebao / Hualin Yi, Xiuxin Deng // J.Huanzhong (Cent. China) Agr. Univ. 1998. - 17, № 1. - P 89-92.

373. Yoshida Shinya. Non-random gametoclonal variation in rice regenerants from callus subcultured for a prolonged period under high osmotic stress / Shinya Yoshida, Kazuhiko Watanabe, Morihiro Fujino // Eu-phytica. 1998. -104, № 2.-C. 87-94.

374. Van Geyt J. Induction of nuclear and cell divisions in microspores of sugarbeet (Beta vulgaris L.) / J. Geyt Van, K. D'Halluin, M. Jacobs // Pflanzen-zucht. 1985. - 95, № 4. - P. 325-335.

375. Van Geyt J. In vitro induction of hapliod plants from unpollinated ovules and ovaries of the sugarbeet (Beta vulgaris L.) / J. Geyt Van, Jr.G.J. Speckmann, K. D'Halluin, M. Jacobs // Theoretical and applied genetics. 1987.73. -P. 920-925.

376. Voelker T.A. Fatty Acid Biosynthesis Redirected to Medium Chains in Transgenic Oilseed Plants / T.A. Voelker, A.C. Worrell, L. Anderson, J. Bleibaum, C. Fan, D.J. Hawkins, S.E. Radke, H.M. Davies // Science. 1992. v.257. - P.7274.

377. Webber J.M. Cytoiogicae featres of Nicoriana glutinosa haploids / J.M. Webber // Jour. Agr. Res. 1933. - 47. - P. 845-867.

378. Westcott R. Tissue culture strorage of potato germplasm / R. Westcott // Potato Res. -1981. v. 24, № 3. . p. 331-352.

379. White Ph. Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial nutrient / Ph.White // Amer. j. Bot., 1963. v. 26. - P. 59-64.

380. Wiberg E. Fatty Acid Distribution and Lipid Metabolism in Developing Seeds of Laurate-Producing Rape (Brassica napus L.) / E. Wiberg, A. Banas, S. Stymne//Planta. 1997.-v.203. - P.341-348.

381. Williams E.G. The use of embryo culture with transplanted nurse endosperm for the production of interspecific hybrids in pasture legumes / E.G. Williams, G. De Lautour // Bot. Gar. 1980. - 141. - P. 252-257.

382. Withers L.A. Freeze-preservation of plant cell cultures / L.A. Whters, H.E. Street // Plant Tissue Culture and its Bio-technological Application, ed. Bars.E.Reinhard, M.H.Zenk. Berlin, 1977. - P. 226-44.

383. Withers L.A. Freeze-preservation of somatic embryos and clonal plantlets of carota (Daucus carota L.) / L.A. Whters // Plant Physiology. 1979. -63.-P. 460-7.

384. Withers L.A. Tissue culture strage for Genetic Conservation / L.A. Withers // IBPGR Technical Report, AGP: 2BPGR, 1980. P. 8.

385. Wu В J. Cytological and embriological studies of haploid plant production from cultured unpollinated ovaries of Nicotiana tabacum L. / B.J. Wu, K.C. Chen // Acta. Bot. sinica. 1982. - 24, № 2. - P. 125-129.

386. Zagorska N.A. Induced androgensis in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) : I. Influence of genotype on androgenetic ability / N.A. Zagorska, A. Shtereva, B.D. Dimitrov, M.M. Kruleva // Plant Cell Repts. 1998. - 17, № 12.-P. 968-973.

387. Zhao De-pei. Межродовой гибрид Raphanus satlvus и Brassica pekinensis, полученный с помощью тканевой культуры / De-pei Zhao // Шнянь шэнъу сюэбао, Acta biol. exp. sin. 1983. - 16, № 1. - P. 21-29.

388. Zhou C. Studies on the in vitro induction of callus from embryo sacs of rice / C. Zhou, H.Y. Yang // Hereditas. 1981. - 3, № 5. - P. 10-12.

389. Zhou H.Huaping. Improvement of anther culture methods for haploid production in wheat / H. Huaping Zhou, S.F. Konzak // Crop. Sci. 1989. -29, № 3.-P. 817-821.

390. Zhu Z.C. In vitro induction of haploid plantlets from unpollinated ovaries of Triticum aestivum and Nicotiana tabacum / Z.C. Zhu, H.S. Wu // Acta genet, sinica. 1979. - 6, № 2. - P. 181-184.

391. Zhu Z.C. Induction of haploid plantlets from unpollinated wheat ovaries cultured in vitro / Z.C. Zhu, H.S. Wu, Q.K. An // Acta Genetica Sinica. -1981.-8, 4.-P. 386-390.

392. Российская Академия сельскохозяйственных наук Всероссийский Ордена Трудового Красного Знамени НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И САХАРА1. ИМ. АЛ. МАЗЛУМОВА396030, ВНИИСС Воронежской области, Телефакс 2-19-93, Телефоны: 2-18-03,2-19-93,

393. Электронная почта: mail@vniiss.vrn.ru1 ■ ■ ■■ - ——— ■ ■ » II ■ I — ■ ■- ■ ■■ ■ ■■от « Ul&Ut'l- 2003 года1. СПРАВКА

394. Заведующий- отдёХом селекции полевБпс культур1. В.В.Нуждина

395. ГУП Льговская ордена " ЗНАК ПОЧЕТА " опытно-селекционная станция ВНИИСС РАСХН307720, п-о Селекционное Льговского района Курской области Телефон (07140) 93-2-38, 93-2-36, факс 93-2-10«з " ^^ 2003г.и1. СПРАВКА

396. О ВНЕДРЕНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

397. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Ministry of Agriculture Russian Federation

398. Департамент кадровой политики и образования Department of Staff and Education394087, г. Воронеж, ул. Мичурина, 1 Тел.: 53-86-51, 53-81-33

399. К ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

400. Ul. Michurina, 1, Voronezh, 394087.1. Phone: 538651, 538133воронежским госыапрствЕнныйпгрлрный университет имени н. в. гпинни1. О/. 2Z 6 flq № от "

401. VORONEZH STATE AGRICULTURAL UNIVERSITYo3 20q3 г. No.Date1. СПРАВКА

402. Заведующий кафедройсе и семеноводства

403. Профессор кафедры селе: и семеноводства1. Шевченко1. Н.Т. Павлюк

404. Тип. ВГАУ. з. № 1835 2003 г. т. 3000.