Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности взаимодействия гипохлорит-аниона с липидами липопротеинов крови человека и липосом

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Закономерности взаимодействия гипохлорит-аниона с липидами липопротеинов крови человека и липосом"

ест со

__ со

!_V—

0 ^ На правах рукописи ил

ш ^

1_ I п

си ■»— МОМЫНАЛИЕВ Куват Темиргалиевич

Закономерности взаимодействия гипохлорит-аниона с липидами липоггротэиноо кропи человека и лилосом

Специальность 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в НИИ Физико-химической медицины N13 Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Сертанко В. И. Научный консультант: кандидат биологических наук Говорун В.М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Иванов АС, доктор биологических наук, профессор Клебанов Г. И.

Ведущая организация: Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится * _1996 г. в_ часов

на заседании Диссертационного совета Д.084.66.01 при НИИ физико-химической медицины МЗ Российской Федерации по адресу: 119828, Москва, Малая Пироговская улица, 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины МЗ Российской Федерации

Автореферат разослан" _1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук_

Мурина М.А.

Общая характеристика работы Актуальность темы. Гипохлорит-анион (ОСТ) - один из важнейших

метаболитов кислорода, образующихся при активации полиморфноядерных

лейкоцитов. На его образование расходуется 28% Ог от общего количества,

*

потребляемого нейтрофилаии при респираторном взрыве. Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью расширения представлений о механизме действия гипохлорита на клеточном уровне, выявления ведущих звеньев этого процесса и факторов, влияющих на степень гипохлорит-индуцированного окисления мембран. До недавнего времени, реакциям этого соединения с липидами - главными структурными компонентами мембран - придавалось мало значения Между тем, известно, что окислительная модификация липидов может приводить к изменению физико-химической организации мембраны, которое вызывает нарушение ее барьерной функции.

Другой мишенью гипохлорита в организме могут быть различные компоненты плазмы крови человека. Описаны случаи спонтанной активации нейтрофилов in vivo, в результате чего может происходить окисление компонентов плазмы гипохлоритом непосредственно в кровяном русле. С другой стороны, модифицированные в результате различных физико-химических воздействий липопротеины (ЛП) являются важным фактором нарушения липидного обмена. Возможно, что одной из причин появления модифицированных ЛП является их окисление гипохлорит-анионом. Кроме того миелопероксидаза (МПО), катализирующая образование ОСТ, была найдена в атеросклеротическом очаге поражения сосудов, и это принято считать доказательством существования реальной основы окисления ЛП in vivo гипохлоритом Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение особенностей модификации гипохлоритом липидов липопротеинов и липосом in vitro,

а также продуктов этого взаимодействия. Дня достижения этой цели были поставлены | следующие задачи:

1. выявить изменения липидных фракций разных классов ЛП под действием ОСТ и параллельно изучить способность ЯП подвергаться гипохлорит-индуцированному ПОЛ,

2. изучить влияние холестерина на гипохлорит-индуцированное ПОЛ фосфатидилхолиновых липосом,

3. идентифицировать образующиеся в результате окисления производные холестерина в составе ЛП, холестерия/фосфатидилхолиновых липосом гипохлоритом натрия.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе изучено влияние холестерина (ХС) на гипохлорит-индуцированное перекисное окисление липидов. Показано, что холестерин, встроенный в фосфатидилхолиновые (ФХ) липосомы (отношение ХС/ФХ=1), усиливает гипохлорит-индуцированное окисление фосфолипидов при мольном соотношении гипохлорит:холестерин £ 1. Определено, что липиды ЛНП наиболее подвержены окислительным изменениям под действием ОСТ по сравнению с ЛОНП и ЛВП. Деструкция затрагивает не только липиды, расположенные во внешнем слое (фосфолипиды и холестерин), но и неполярные, расположенные в ядре частицы ЛП (триглицериды и эфиры холестерина). Накопление вторичных продуктов ПОЛ (малонового диальдегида) при гипохлорит-индуцированном окислении липидов в ЛП отражает степень деградации липидов в них.

Установлено, что в исследованных системах окисления (липосомах из яичного фосфатидилхолина, димиристоилфосфатидилхолина и коллоидной дисперсии) образуется одинаковый набор продуктов окисления холестерина, отличающихся лишь

содержанием полярных соединений. Набор оксипроизводных холестерина, образующихся после его взаимодействия с гипохлоритом, не зависит от степени доступности ХС (микрокристаллы, липосомы, коллоидная дисперсия). Повышенное содержание полярных фракций ХС отмечается при его окислении в липосомах, содержащих фосфатидилхолин с ненасыщенными двойными связями. При окислении ХС з дисперсии образуется незначительное количество сильно полярных соединений, причем их содержание снижается с уменьшением рН среды.

При взаимодействии гипохлорита с ХС выявлено, что изменение структуры ХС происходит только по С-3, С-б и С-7, и в смеси продуктов не обнаружено ни одного производного, окисленного по углеводородному хвосту. Кроме того, найдено 3 диеновых соединения и несколько соединений с положением двойных связей, отличным от положения двойной связи в ХС.

Научно-практическое значение работы. Впервые было описано образование такого большого числа продуктов взаимодействия ХС с ОСТ (18 продуктов). Гипохлорит-анион является не только бактерицидным или цитотоксичсским соединением, но и," вероятно, обладает некоторым регулирующим действием на различные стадии воспалительного процесса. Это действие, возможно, опосредуется через различные оксипроизводные холестерина.

Разработан метод окисления холестерина в коллоидной дисперсии, а также

препаративного разделения и идентификации оксипроизводных холестерина.

>

Апробация днссертациоииой работы. Основные положения научных исследований доложены на международном симпозиуме "Эндогенные интоксикации" (Санкт-Петербург, ■ 1994), на итоговой научно-практической конференции НИИ физико-химической, медицины (1995) и на совместной конференции отделов биофизики и.бидаимии НИИ физико-химической медицины.

Публикации. По результатам дисертационной работы опубликовано 3 статьи в центральной печати.

Структура и обТ'См диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 22 рисунка. Перечень цитируемой литературы включает 193 источника: 38 отечественных и 155 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзор литературы. Обзор литературы состоит из шести частей, которые информируют о современных представлениях об образовании гипохлорит-аниона в организме, его взаимодействии с различными органическими соединениями и о механизмах повреждения гипохлоритом клеток и липопротеинов. Представлены данные по общей характеристике МПО (фермента, катализирующего образование гипохлорит-аниона) и путях образования гипохлорит-аниона МПО. Особое внимание уделено взаимодействию OCt с липидами мембран и ЛП. Гипохлорит-анион реагирует с ненасыщенными липидами по молекулярному механизму с образованием более полярных соединений- хлоргидринов [Winterbourn,1992], в результате чего образуются поры в мембране и нарушается ее проницаемость. Но, с другой стороны, показано, что гипохлорит-анион может инициировать и другой механизм повреждения мембран -ПОЛ [Stelmaszynska, 1992; Панасенко, 1992] В настоящее время нет однозначного мнения и относительно взаимодействия гипохлорит-аниона с холестерином. Кроме оксипроизводных [Van der Berg, 1993], образуются также и хлоргидрины холестерина [Heinecke, 1994] Необходимо отметить, что данных об их биологическом эффекте нет.

S

Большой интерес представляет участие гипохлорит-аниона в окислении ЛП, поскольку МПО была обнаружена в очаге атеросклеротнческого поражения сосудов in vivo [Daugherty,1994], В связи с этим, ЛП, модифицированным гипохлоритом, придается большое значение как важному фактору нарушения липидного обмена. [Heinecke, 1995].

Материалы и методы. Гипохлорит натрия получен электрохимическим методом путем электролиза водного раствора NaCI на установке " ЭДО-3" [Сергненко, 1990]. Использовалась также и синтетическая HOCI ("Serva"). Липосомы, содержащие холестерин, получали иижекцией спиртового раствора фосфатидилхолина и холестерина в интенсивно перемешиваемый фосфатный буфер с последующим разбавлением [Batary, 1973]. Размер полученных липосом составил 200 нм (данные получены методом фотон-корреляционной спектроскопии на лазерном нефелометре Autosizer Ис "Malvern"). Коллоидную дисперсию ХС получали впрыскиванием хлороформного раствора холестерина и стабилизирующего ПАВ (блоксополнмера окиси этилена и окиси пропилена) в воду или фосфатный буфер с различными pH при 50-60°С с последующим удалением хлороформа под вакуумом Выделение ЛНП из плазмы крови человека проводили методом препаративного ультрацентрифугирования в растворах NaBr с соответствующей плотностью [Lindgren, 1975].

Разделение продуктов окисления холестерина проводили на хроматографе фирмы "Gilson" на колонке с прямой фазой Nucleosil 50-5 ("Machery Nagel") 250x4.6 мм в системе гексан.изопропанол (95:5) при скорости элюмрования 1 мл/мин с использованием УФ-детектора UV116 (213нм) и дифференциального рефрактометра "LDC". Приблизительная оценка содержания ХС и обнаруженных продуктов его окисления была проведена по площадям пиков на хроматограмме

ТМС-производные получали действием силильного агента (N,0-бис(триметилсилил)трифтор-ацетамида) в пиридине (объемное соотношение 1:1) при 60°С [Turk, 1983] и анализировали с помощью газового хроматографа, снабженного масс-спектрометрическим детектором в режиме ионизации электронным ударом (Hewlett-Packard, MSD 5970В). Разделение компонентов смесей проводили на капиллярной колонке Fused Silica Capillary Colomn HP-1 (12м х 0.2мм х 0.33 мкм). Начальная температура колонки - 240°С (1 мин) с последующим нагревом до 300°С (скорость нагрева 8 °/мин).

Экспериментальная часть.

Глава 1. Взаимодействие гипохлорит-аниона с липидами разных классов липопротеипов крови человека. Методом ТСХ показано, что липиды ЛНП подвергаются значительной деградации в присутствии 1 мМ гипохлорита натрия (не идентифицируются фракции триглицеридов (11 ) и свободных жирных кислот (СЖК)) по сравнению с контролем. При концентрации гипохлорита _ натрия 3 мМ обнаруживается только фракция холестерина и фосфолипидов. Липиды ЛОНП и ЛВП не претерпевали значительных изменений. На хроматограммах липидов ЛОНП и ЛВП после окисления присутствуют все фракции липидов. Тахим образом, окислительная деструкция, вызванная гипохлоритом, затрагивает не только липиды, расположенные во внешнем слое ЛП (ФЛ и ХС), но и липиды, расположенные в ядре частицы (ТГ и эфиры холестерина)

Сравнительное изучение деградации холестерина и его эфиров в разных классах ЛП под действием гипохлорита показало, что с увеличением концентрации гипохлорита во всех классах ЛП увеличивается степень деградации эфиров

холестерина (эффект проявляется уже при 0,1 мМ гипохлорита) (рис.1). В ЛНП практически полная деструкция эфиров холестерина регистрируется при 1 мМ концентрации ОСТ, причем количество ЭХС снижается на 90-100% от первоначального их содержания. В ЛОНП и ЛВП деструкция ЭХС выражена в меньшей степени: ЭХС сохраняются в ЛОНП и ЛВП даже при концентрации ОСТ - 3 мМ, хотя количество их и снижается на 75-95%. Необходимо отметить, что хроматограмма липидов из ЛП, обработанных ОСТ, характеризовалась не только уменьшением интегральной интенсивности .пиков, соответствующих ХС и ЭХС, но и появлением новых пиков с временем удержания меньшим, чем для ХС. На основании хроматографических исследований можно заключить, что липиды ЛНП подвержены наибольшим окислительным изменениям по сравнению с ЛОНП и ЛВП.

Как один из механизмов повреждения липидов ЛП был рассмотрен процесс ПОЛ. Результаты наших исследований показали, что наиболее подвержены ОСТ -индуцированному переписному окислению ЛНП: максимальный уровень ТБКАП в них составлял 1,5 мкмоль/г общего липида. Меньше всего окислялись ЛВП (максимальный уровень ТБКАП 0.78 мкмоль/г общего липида). Неоходимо отметить, что данные измерения продуктов ПОЛ соответствуют закономерностям, выявленным хроматографическими методами: продуктов ПОЛ больше накапливается в ЛНП, липиды которых в наибольшей степени подвергаются деструкции. Концентрация липидов в пробе и содержание антноксидатчэв в ЛП не являются основными причинами различной чувствительности ЛП к гипохлорит-индуцированному ПОЛ.

Возможно, что действие гипохлорита в используемых нами концентрациях (0,1 -3 мМ) опосредовано через какой-либо компонент частицы ЛП, содержание которого в разных классах ЛП различно, а его расположение в поверхностном слое ЛП может в значительной степени повлиять на взаимодействие ОСТ с липидами. Прежде всего это

№0С1, тМ N3001, тМ

100

о 1 '2 3

№ОС1, тМ ' •

Рис.1. Зависимость содержания основных эфиров холестерина ЛП крови человека от концентрации ОСГ: А - ЛНП, Б - ЛОНП, В - ЛВП. X - арохцзонат; 2 - пальмитэт; 3 - олеат; 4 • линолеат холестерина За 100% принято содержание соответствующей фракции эфиров холестерина в нативных ЛП.

могут быть апобелки. Однако эксперименты показали, что вне зависимости от принадлежности белка к тому или иному классу ЛП происходит их деградация с разрывом пептидных связей при концентрации 1 мМ и выше. Белковая компонента ЛП одинаково реагирует с гипохлоритом в отличие от их липидной компоненты. Другим компонентом, претендующим на такую роль, является ХС, так как его

содержание в ЛП в значительной степени различается. Для проверки данного предположения мы изучали процессы окисления липосом с различным содержанием холестерина под действием гнпохлорит-аниона

Глава 2. Влияние хаяестерниа па гипохюрит-индуиированпое окисление форфолипидных липосом. Окисление фосфатидилхолиновых липосом с разным содержанием холестерина под действием гипохлорита натрия изучали в двух сериях экспериментов. В первом случае суммарное содержание яичного фосфатидилхолина и холестерина было постоянно, но меняли мольное соотношение между ними так, что доля фосфатидилхолина уменьшалась, а холестерина возрастала. Во второй серии - экспериментов количество фосфатидилхолина было одинаково во всех липосомах, но при этом увеличивали мольную долю холестерина в них. Результаты этих серий экспериментов приведены на рисунке 2 а и б соответственно Из данных, представленных на рис.2, следует, что увеличение доли холестерина в липосомах приводит к более выраженной аккумуляции в них ТБКАП даже тогда, когда общее содержание липида в образце остается постоянным (т.е. абсолютное количество фосфатидилхолина уменьшается по мере увеличения доли холестерина, рис.2а). При мольном отношении ХС/ФЛ равном 1 содержание ТБКАП в 2,9 больше по сравнению с контролем. Резкое увеличение ТБКАП наблюдается в липосомах, содержащих 50% холестерина и более (кривые.1 н ^ рис.2). Это может быть обусловлено известной способностью холестерина образовывать кластеры по мере увеличения его доли в липосомах и сегрегацией фосфолипидных доменов. Изучение кинетики накопления ТБКАП в липосомах, приготовленных из яичного фосфатидилхолина, а также в липосомах с мольным содержанием ХЛ/ФЛ=1 при концентрации гипохлорита 3 мМ, показало, что в липосомах, содержащих холестерин, окисление фосфолипндов

N800, тМ ЫаОС1, тМ

Рис.2. Зависимость накопления ТБК-активных продуктов в холестерин/ фосфатндилхолиновых лилосомах от концентрации гипохлорита натрия. А. Суммарная концентрация фосфатидилхолина и холестерина 1.2 иг/мл. Б. Концентрация фосфатидилхолина 0.6 мг/мл. Мольное отношение ХС/ФХ: 1 - 1; 2 - 0.5; 3 - 0.2; 4-0. Среда инкубации 145 мМ №С1, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7.4. В качестве контроля использовали аналогичные образцы, содержащие вместо гипохлорита натрия соответствующее количество ЫаС1.

выражено в большей степени (уровень ТБКАП возрастал в 3,5 раза) по сравнению с фосфолипидными липосомами(уровень ТБКАП возрастал в 2 раза). В суспензии холестерина, инкубированной с гипохлоритом в аналогичных условиях, накопление ТБКАП не происходит, т.е. холестерин не является источником вторичных продуктов ПОЛ.

Здесь следует обратить внимание на тот факт, что обнаруженный нами эффект увеличения аккумуляции ТБКАП в липосомах, содержащих холестерин, был очевидным лишь в случае относительно высокой концентрации гипохлорита (3 мМ). Для того, чтобы проверить влияние холестерина на ОСТ-индуцированное ПОЛ фосфолипида в присутствии низких концентраций гипохлорита (10-100 мкМ), мы увеличили время инкубации до 24 ч., поскольку за 2 ч. накоплений ТБКАП спектрофотометрически зарегистрировать не удалось. Увеличение доли холестерина в

липосомах приводит к снижению аккумуляции ТЕКАП по сравнению с фосфатидилхолиновыми липосомами. В липосомах, содержащих 50 мол% холестерина, продукты ПОЛ вообще не накапливались.

Таким образом, в присутствий относительно малых концентраций ОСТ - холестерин ингибируег ПОЛ яичного фосфагндилхолина, при больших же концентрациях ОСТ наблюдается обратный эффект. Возможны два объяснения полученных результатов. Одно из них заключается в следующем. Зависимость накопления ТБКАП в фосфолипидных липосомах от концентрации гипохлорита, как правило, имеет экстремальный вид, где восходящий участок обусловлен образованием ТБКАП, а нисходягций (при относительно высоких концентрациях гипохлорита) - реакцией избыточного ОСТ с ТБКАП. В последнем случае из альдегидов образуются кислоты, неопределяемые в тесте с ТЕК. Известно, что гипохлорит реагирует с холестерином с образованием различных окси- и хлор-производных, необразующих окрашенный хомплехс с ТБК. .Принимая во вниманне этот факт, можно предположить, что холестерин, введенный в состав фосфолипидных липосом, реагируя с гипохлортом, будет снижать его концентрацию в реакционной смеси. При низких концентрациях гипохлорита это выражается в снижении уровня ТБКАП. При больших же концентрациях ОСТ, когда заметным становится снижение уровня ТБКАП за счет прямого их окисления гипохлоритом, холестерин, реагируя с последним, будет снижать то избыточное -количество ОСТ, которое расходуется на окисление ТБКАП. В результате в липосомах, содержащих холестерин, будет регистрироваться более высокий уровень ТБКАП по сравнению с липосомами из чистого фосфолипнда

Второе объяснение полученных результатов может сводиться к тому, что продукты реакции холестерина с гипохлоритом, встраиваясь в фосфолнпидный бнслой, каким-то '

образом оказывают влияние на ОСТ - индуцированное ПОЛ, например, изменяя физико-химические свойства липидного бислоя.

Для того, чтобы проверить указанные выше предположения, мы провели эксперимент, суть которого заключалась в следующем. Липосомы формировали из яичного фосфатидилхолина (ФХ) или димиристоил-фосфатидилхолина (ДМФХ), а также из с;деси ФХ и холестерина (ФХ/ХС-липосомы) или ДМФХ и холестерина (ДМФХ/ХС-липосомы). Каждый вид липосом помещали в диализные трубки, которые погружали в пробирки с раствором ОСТ. После окончания инкубации в содержимом диализных трубок определяли ТБКАП. В первом опыте в разных диализных трубках были ФХ и ДМФХ/ХС липосомы, во втором ФХ/ХС и ДМФХ липосомы, а третьем ФХ липосомы (Табл. 1).

Таблица 1. Содержание ТБКАП в липосом»! различного вида после их инкубации с гппохлоритом (М+ш).___

N опьгга Состав липосом,входящих в одну систему ТБКАП, мкмоль/г.

окисления фосфолипида

1 ФХ 88 1 ±5.6

ДМФХ/ХС 20.3 ± 2.4

2 ФХ/ХС 179.2 ±12.8

ДМФХ 22.5 ±2.9

3 ФХ 36.4 ±4.0

4 КОНТРОЛЬ 0.7 ±3.5

Примечание. Концентрация ФХ, ДМФХ, ХС в липосомах 1.04 мг/ил. Соотношение ФХ/ХС, ДМФХ/ХС равно 1. Время инкубации 2ч., 37°С. Концентрация гипохлорита натрия 3 мМ. Контроль- образец, не содержащийй липосомы.

Сравнение результатов опытов 1 и 2 показывает, что присутствие холестерина непосредственно в составе ФХ/ХС-липосом сопровождается значительно большим увеличением уровня ТБКАП, нежели в случае, когда холестерин находится в той же системе окисления, но пространственно разделен с ФХ-липосомами. Это свидетельствует, по нашему мнению, о том, что физико-химические изменения бислоя, обусловленные продуктами реакции холестерина с гипохлоритом, оказывают влияние на ход ОСТ - индуцированного ПОЛ липосом из ненасыщенного фосфатидилхолина,

увеличивая накопление вторичных продуктов ПОЛ. Вероятно, что эти продукты (хлор-и оксипроизводные холестерина) могут вызывать изменения структуры фосфолипидного бислоя, приводящие- к его дестабилизации и увеличению числа микродефехтов в мембране. В результате этого увеличивается возможность доступа гипохлорита к ненасыщенным -СН=СН- связям жирнокислотных цепей фосфолипидов, что, безусловно, должно способствовать инициированию ПОЛ.

Для того чтобы понять механизм промотирования холестерином гипохлорит-индуцнрованного окисления липидов, необходимо было изучить продукты взаимодействия гипохлорита и холестерина.

Г.шва 3. Продукты взаимодействия холестерина с гипохлорчт-анионом. Исследование взаимодействия ХС и ОСТ в составе липосом методом ВЭЖХ показало, что в липосомах ХС/Я-ФХ и ХС/ДМФХ образуется одинаковый набор продуктов (см. рис.3 а,б). Ряд продуктов выходит с колонки раньше холестерина- пики 0, Е и I. За холестерином с колонки сходят еще 14 пиков. Следует отметить, что стандартные образцы 5сх,6а-эпокси-холестан-3(3-ол (5а,ба-эпоксид холестерина) и холг .тан-ЗР,5(},бР-триол удалось детектировать только при использовании рефрактометра. Исследование кинетики взаимодействия ОСТ с ХС в составе дисперсии при различных рН в интервале от 0,5 до 48 часов показало, что все продукты реакции присутствуют в смеси уже через 0,5 часа после начала реакции. Далее идет их накопление в смеси. Причем с увеличением'полярности соединения его накопление в смеси происходит медленнее. Так, например, содержание фракции 4 (5-холесген-7а-ол-3-он) в смеси за одни сутки увеличилось в 8 раз, а содержание фракции 8 (содержащей преимущественно 5-холестен-ЗР,7(3-диол) за это же время увеличилось только в 3 раза Из рис.3 видно, что при взаимодействии ОСТ с ХС в липосомах, содержащих

» "Л

и

О

•.00

10.М . ».М 20.00

Рис 3. ВЭЖХ-хроматограммы продуктов взаимодействия ХС с ОСТ в различных системах: А. в липосомах из ЯФХ (3 часа, 37°С, рН 7,4); Б. в липосомах из ДМФХ (3 часа, 37°С, рН 7,4); В. в коллоидной дисперсии ХС в воде (1 сутки, 37"С, рН 7,4).Поглощение при 213 им. В верхней части рисунков приведено 5-кратное увеличение исходной хроматограммы.

ненасыщенные двойные связи, в ацильных остатках содержание продуктов реакции выше, чем при взаимодействии ОСТ с ХС в ДМФХ-липосомах, что свидетельствует о промотирующем эффекте окисления двойных связей на окисление ХС в составе липосом при избытке окислительного агента. В качестве контроля было проведено автоокисление ХС в липосомах (3 часа при ЗТС). Набор продуктов в данном случае значительно беднее, чем при действии ОСТ. Относительное содержание продуктов окисления также существенно ниже. В случае автоокисления ХС в липосомах из ДМФХ содержание продуктов реакции в реакционной смеси больше. Вероятно, это связано с тем, что автоокисление проходит в условиях недостатка окислительного агента (кислорода воздуха, растворенного в буфере), и часть кислорода расходуется на окисление двойных связей в ЯФХ. Состав продуктов реакции был одинаковым как при

использовании электрохимического гипохлорита натрия, так и при использовании синтетической хлорноватистой кислоты.

В качестве еще одной системы окисления было выбрано взаимодействие ОС/" с ХС в составе коллоидной дисперсии в воде, стабилизированной неионным полимерным ПАВ. Хроматограмма реакционной смеси (1 сутки окисления, 37°С) представлена на рис.Зв. Несмотря на различие упаковки ХС в составе липосом и дисперсии, нами было обнаружено, что при взаимодействии ХС с ОСТ в обоих системах образуются одни и те же продукты реакции, но в разном соотношении Основными (при оценке методом ВЭЖХ по поглощению при 213нм) в случае взаимодействия ХС с ОСТ в липосомах являются пики, преимущественно содержащие 4,6-холестадиен-З-он (Ю), холестан-(5 или 6)-ол-3-он (Е), 5-холестен-7а и 7р-ол-3-он (4,6), 5-холестен-ЗР-ол-7-он (10), 5-холестен-3(3,73-диол (14) и 5-холестен-ЗР,7а-диол (15) (пики анализировались ГХ/МС). А в дисперсии содержание сильно полярных продуктов незначительно, и основными продуктами реакции являются 4,6-холестадиен-З-он (И), холестан-(5 или 6)-ол-3-он (Е), 5-холесген-7а-ол-3-он (4), 5-холестен-Зр-ол-7-он (10) и 5а,6а-эпокси-холестан-Зр-ол (3). Малое количество продуктов окисления в этом случае может быть связано с тем, что в дисперсии ХС упакован более плотно, чем в липосомах, и молекулы ХС, находящиеся внутри частиц дисперсии, мало доступны для ОСТ. В то же время дисперсия ХС оказалась удобной системой для препаративного окисления ХС и выделения продуктов реакции, т к стабилизирующее дисперсию ПАВ и возможные продукты его окисгпгтелыюй деструкции легко отделяются от ХС и продуктов его окисления при экстракции.

Продукты реакции ХС с ОСГ , препаративно выделенные с помощью ВЭЖХ были затем проанализированы методом хромато-масс-спектрометрии При

предварительном анализе было выявлено, что фракции, выходящие близко к исключенному объему, являлись смесью большого количества низкомолекулярных продуктов деструкции ХС и дальнейшему анализу не подвергались. Все остальные фракции были обработаны силильным агентом для получения ТМС-производных пщроксил-содержащих соединений, которые затем были проанализированы методом ГХ/МС. Га>овая хроматография показала, что практически все фракции, выделенные методом ВЭЖХ, являются смесью нескольких соединений. Выделенные фракции стабильны и практически не меняют своего состава (профиль ВЭЖХ-хроматограмыы реакционной смеси через 1 сутки после начала реакции и профиль хроиатограммы этой же смеси, хранившейся 3 месяца при 20°С, практически идентичны). Из фракций, полученных методом ВЭЖХ, с помощью ГХ/МС было выявлено 18 соединений, из которых достоверно идентифицировано 12 (рис.4). Идентификация проводилась с использованием масс-спектров стандартных синтетических окисленных производных ХС и каталога масс-спектров [ЕРА/ЮТ! \1SDB, 1978].

При использовании вышеописанных методов нам не удалось обнаружить хлорированные производные ХС в составе реакционной смеси. Как альтернативный метод препаративного разделения продуктов окисления холестерина использовали ТСХ. Были исследованы две модели: ЯФХ/ХС липосомы (1:1) и липопротеины низкой плотности. Образование производных холестерина наблюдалось только при концентрации гипохлорита 3 мМ и в той, и в другой системе и проявилось в виде двух пятен, отличных от пятна ХС. Одна фракция, менее полярная, чем холестерин (1^=0 89) при проявлении серной кислотой дает голубое окрашивание, другая с ШЧ) 37 имеет красно-коричневую окраску и соответствует по величине стандартному 5а,6а-эпокси-холесгерину Но, как показал дальнейший анализ, фракции представляли собой смесь большого количества соединений

* 5а-холест»н- 3,7* диоя (400) 5а,6®->л<жск-хо.*ст*я- 4-холестен-З-он 84)

3|J-on (474)

О 5,7-хопвот»ди«н-зр-ол{456) о

4-хплвстен-3,6-диой (398) За-холеспн-З.б-даон

(400)

ОН ОН ОН

5-халво1ен-Эр,7р-дяол (546) он

Э,5-яолеотадиеп.7-ов(382) 4-холестси-Зр Лр*

дкол(54Л)

ОН 6н о

*5.хопвстек-Зр,7а-Дж»л (546) ОН

•4,6-холеетаяен.З-о* (582) •хол«твн-(5 или 6>

о/1-З-ои (474) ,

•3-холестсн-7р-а»-3*ои (472) ОН

•3-холесте*-7а-а>3-он (472) x<uwcmi-3p.5u.6n>

тряол(636)

он 0

о З-ко.тестен-Зр-ол-7-оя (472) !а-халсс1тм-.ЧР-<1.>б-оя (474)

Рис.4. Продукты окислении холестерина гипохлоритом по данным газовой хроматографии/ масс-спсктромстрии (в скобках указан молекулярный вес соответствующего ТМС-производного). *- предполагаемые структурм.

Таким образом, во всех исследованных системах окисления (лнпосомах из Я-ФХ, ДМФХ и коллоидной диспепсии) образуется одинаковый набор фракции, отличающийся содержанием полярных фракций. Повышенное содержание полярных фракций ХС (12-15) отмечается при его окислении в липосомах, содержащих фосфатидилхолин с ненасыщенными двойными связями (рис.За) При окислении ХС в дисперсии (рис.Зв) образуется незначительное количество сильно полярных соединений, причем их содержание уменьшается с уменьшением рН При

взаимодействии OCt с ХС образуется большой набор соединений, часть из которых являются продуктами деструкции ХС (не анализировались), а часть представляет собой производные ХС, модифицированного по А и В кольцам стероида. Подчеркнем, что изменение структуры ХС происходит только по С-3, С-6 и С-7, и в смеси продуктов не было обнаружено ни одного производного, окисленного по углеводородному хвосту. Кроме того, в реакционной смеси найдено 3 диеновых соединения и несколько соединений с положением двойных связей, отличным от положения двойной связи в ХС. По всей вероятности, последние являются вторичными продуктами, образовавшимися в результате последующей деградации первичных продуктов реакции. Необходимо отмепгть, что эпокси-, кето-, и гидрокси-производные холестерина имеют не только прямой цитотоксичесшй эффект [Smith, 1989], но и влияют на структуру мембраны клеток. Полученные результаты позволили нам предположить, что гипохлорит оказывает регулягорное действие на процессы, происходящие в очаге воспаления, например, изменяя структуру соединений стероидной природы.в том числе и стероидных гормонов.

Выводы.

1. Липиды ЛНП подвержены наибольшим окислительным изменениям под действием гипохлорит-аниона по сравнению с ЛОПП и ЛВП, причем окислительная деструкция затрагивает не только липиды, расположенные во внешнем слое (фосфолнпиды и холестерин), но и расположенные в ядре частицы ЛП (триглицериды и эфиры холестерина).

2. Накопление ТБК-активных продуктов при гипохлорит-индуцированном окислении липидов в ЛП отражает степень деградации липидов в них. Продуктов

ПОЛ больше накапливается в ЛНП (максимальный уровень ТБКАП 1,5±0,12 мкмоль/г общего липида).

3. Холестерин, встроенный в фосфатидилхолиновые липосомы (ХС/ФЛ=1), увеличивает накопление ТБКАП при гипохлорит-индуциросанном окисление фосфолипидов, если мольное соотношение ОСТ :ХС 2 1.

4. Набор оксипронзводных холестерина, образующихся после его взаимодействия с гипохлоритом, не зависит от степени доступности ХС (микрокристаллы, липосомы, коллоидная дисперсия).

5. При взаимодействии гипохлорита с холестерином образуются производные ХС, модифицированные по А и В кольцам стероида, по С-3, С-6 и С-7 положению Модификация ХС гипохлоритом не затрагивает углеводородный хвост.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. К.Т. Момыналиев, В.М, Говорун, О.М. Панасенко, В.И. Сергиенко. "Взаимодействие гипохлорит-аниона с липидным компонентом липопротеиноа крови человека". Тезисы докл. Между народ. Симпоз "Эндогенные интоксикации"

14-16.06.1994. С.190. С.-П.

2. К Т. Момыналиев, В.М. Говорун, О.М. Панасенко, В И. Сергиенко. "Влияние молярного соотношения холестерин:фосфатидилхолин на гипохло/шт-индуцированное окисление липосом". Тезисы докл. Международ. Симш». "Эндогенные интоксикации" 14-16.06.1994. С.191. С.-П.

3. К.Т. Момыналиев, О.М. Панасенко, В.М. Говорун, В.И. Сергиенко. "Гипохлорит-индуцированная деструкция липидноео компонента липопротеинов крови человека". Бнол.Мембр. 1995, Т.12, №4, с.385-390.

4 К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун, О.М. Панасенко, В.И. Сергиенко. "Участие холестерина в гипохлорит-индуцированном окислении холестерин^осфатидилояых липосом". Бюл.Эксп.Биол.Мед. 1996, №5, с.516-519. 5. Момыналиев К.Т., Осипова С В., Садовская В.Л., Говорун В.М., Сергиенко В И "Продукты взаимодейтвия холестерина и гипохлорит-аниона".. Биохимия. 1996, №12.

Подписано»печать /96 Формат GO^&V/.fb Заказ JZ.SO

Усл.печ.л. /.¿¿Г Тираж -//■?

Типография Россельхозакадемян ,