Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение физико-химических свойств липопротеинов крови человека в результате их гипохлорит-индуцированного окисления

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение физико-химических свойств липопротеинов крови человека в результате их гипохлорит-индуцированного окисления"

1 Р Г Б ОД 2 8 АВГ 1995

На правах рукописи

ЕВГИНА Светлана Александровна

ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛИПОПРОТЕИНОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В РЕЗУЛЬТАТЕ ИХ ГИПОХЛОРИТ-ИНДУЦИРОВАННОГО ОКИСЛЕНИЯ

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1995

Работа выполнена ь лаборатории экспериментальной гемосорбцни окислительных методов детоксикации е научно-исследовательско институте физико-химической медицины МЗ России.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Сергиенко В.И. кандидат химических наук, с.н.с. Панасенко О.М.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Ланкин В.З.

ь

доктор биологических наук, профессор Потапенко А.Я.

Ведущая организация: Биологический факультет Московского государственного университета им.М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится С^Í-CÍJLaJ~SI 1995 г. в часов н заседании диссертационного совета Д.084.66.01 при институте физико химической медицины МЗ России по адресу: •<19828, Москва, ул,Малая Пироговская, д.1-а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико химической медицины МЗ России.

Автореферат разослан

bsffe?^ 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук ОФ^у^4«-? Мурина М.А.

с

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. В настоящее время сущестует гипотеза, согласно которой липопротеинам (ЛП), модифицированным в результате перекисного окисления липидов (ПОЛ), отводится важная роль в развитии атеросклероза. Одна из вероятных причин образования окисленных ЛП в крови - взаимодействие нативных ЛП с активными формами кислорода

НОС1/ОС1 ), генерируемыми нейтрофилами и моноцитами-макрофагами при их активации. Исследованиями последних лет установлено, что О2, Н202 сами по себе являются мало эффективными окислителями липидов. Результаты работ ряда авторов дают основание полагать, что ОН", образующийся при взаимодействии этих продуктов с ионами металлов переменной валентности, не принимает участия в реакции окисления ЛП фагоцитами (Panasanko с соавт., 1991; Hiramatsu с соавт., 1987). В этом случае можно предположить, что окислительная модификация ЛП осуществляется в результате взаимодействия последних с хлорноватистой кислотой (Н0С1) или еа ионизированной формой - гипохлорит-анионом (0С1 ). H0CI/0C1 образуется в реакции, катализируемой ферментом нейтрофилов и моноцитов миелопероксидаэой (МПО) и является сильным окислителем. На образование НОС1/ОС1 затрачивается не менее 28% количества 0^, потребляемого ней-трофипами при активации (Foote с соавт., 1983). Установлено, что субстратом МПО наряду с H2Og может служить 02, при этом образуется все тот же гипохлорит (Cuperus с соавт., 1.986). МПО способна встраиваться в липидную фазу белок-липидкых комплексов и там катализировать образование Н0С1/0С1 . Каталитически активная миелопероксидаза была обнаружена в местах атеросклеротического повреждения сосудов человека (Daugherty с соавт., 1994). Если к этому добавить, что Н0С1/0С1 способен модифицировать антиоксиданты, входящие в состав ЛП (G-токоферол, (3-каротин, ликопин) (Hazel 1 с соавт., 1993), а также ряд белков, обладающих антиоксидантной функцией (церулоплазмин, трансферрин, суперок-сиддисмутаэу, каталаау) (Говорова с соавт., 1989; Aruonia с соавт., 1987), то становится ясно, что гипохлорит может играть ключевую роль в окислительной модификации ЛП in vivo.

Актуальность данной темы связана также с тем, что в последнее

время гипохлорит используется внутривенно в качестве бактерицидного и детоксицирующего агента при перитонитах, остром панкреатите, тяжелых ожогах и отравлениях. Для оптимизации применения метода непрямого электрохимического окисления крови в клинике необходимо всестороннее исследование взаимодействия гипохлорита с белок-липидными комплексами крови.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение способности гипохлорита, добавленного извне и образующегося при миепо-пероксидаэном катализе, окислять липиды ЛП и исследование влияния гипохлорита на физико-химические свойства ЛП. Основные задачи исследования:

1. Выяснить, способен ли экзогенный и образующийся в системе "МПО+Н^С^+С! " гипохлорит окислять липиды разных классов ЛП.

2. Исследуя методом спиновых зондов взаимодействие гипохлорита с донорами электронов, локализованными в липидной фазе, изучить способность гипохлорита проникать в липидную фазу ЛП.

2+

3. Методом хемилюминесценции (ХЛ) исследовать роль ионов Ре в гипо-

хлорит-индуцироэанном окислении липидов. 2+

4. Используя ионы Мп в качестве спинового зонда, а также методом электрофореза исследовать влияние Н0С1/0С1 на электрический заряд поверхности частиц липопротеинов низкой плотности (ЛНП).

5. Методом спиновых зондов и меток изучить структурные изменения поверхностного протеояипидного слоя ЛНП под действием гипохлорита. Выяснить, будут ли таковые приводить к нарушению взаимодействия ЛНП с клетками (на примере эритроцитов и нейтрофилов).

Научная новизна. С использованием слинмеченых жирных кислот впервые удалось продемонстрировать способность гипохлорита проникать в поверхностный протеолипидный слой ЛНП. Методом спиновых зондов и меток выявлены изменения физико-химических свойств белковой и липидной фаз ЛНП под действием гипохлорита.

Впервые установлено, что гипохлорит, добавленный извне и образующийся в системе "МПС>+Н202+СП ", инициирует процессы ПОЛ в ЛП всех классов, протекающие с участием свободных радикалов и сопровождающиеся образованием первичных (пероксидной природы), вторичных (альдегидной

природы, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой -ТБК) и конечных (шиф-

2+

фовых оснований) продуктов ПОЛ. Методом ХЛ изучена роль Fe в гипо-хпорит-индуцированном ПОЛ на стадиях инициирования и разветвления цепей .

Проведенное систематическое сравнительное исследование влияния Н0С1/0С1 на разные классы ЯП (ЛНП, ЛП очень низкой плотности - ЛОНП, ЯП высокой плотности - Л8П) показало, что обусловленное гипохлоритом изменение электрофоретической подвижности разных классов ЛЛ качественно совпадает с их способностью окисляться под действием Н0С1/0С1 и уменьшается в последовательности: ЛОНЛ > ЛНП > ЛВП.

Показано, что модификация ЛНП гипохлоритом приводит к усилению их холестерин-донорной способности при нерецепторном, неопосредованном эндоцитозом обмене холестерина с мембранами эритроцитов. Предварительно инкубированные с гипохлоритом ЛНП активируют нейтрофилы, что может способствовать усилению процессов ПОЛ в ЛП.

Практическое_значение работы. Результаты данной работы вносят вклад в развитие теории атерогенеэа, разработку средств профилактики и лечения этого заболевания, а также позволят оптимизировать применение гипохлорита в методе непрямого электрохимического окисления крови, практикуемого при тяжелой интоксикации организма.

Апробация_работы. Результаты работы были представлены на 1-ой Всесоюзной конференции "Электрохимические методы в медицине" (Сочи, 1991), Международной конференции "Активные формы кислорода в химии, биологии, медицине" (Санкт-Петербург, 1991), 10-ой Всесоюзной конференции "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Минск, 1992), Международной конференции "Свободные радикалы в химии, биохимии и медицине. Критические аспекты." (Austria, Vienna, 1993), научных конференциях НИИ ФХМ МЗ РСФСР.

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура_и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, описания результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 187 наименований. В диссертации содержится 39 рисунков и 1 таблица.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзор литературы. Первая часть обзора, состоящая из 4-х разделов, посвящена роли ГШ, модифицированных в процессе ПОЛ, в развитии атеросклероза. В первом разделе рассматривается связь между активацией процессов ПОЛ в крови и атеросклерозом, приведены доказательства существования окисленных ЛП в крови. В следующих двух разделах описаны основные изменения физико-химических свойств ЛП в процессе ПОЛ и, как следствие нарушение механизма взаимодействия окисленных ЛП с клетками. В четвертом разделе обсуждены возможные причины появления в крови окисленных ЛП. Вторая часть обзора посвящена гипохлориту. В нее входят следующие разделы: образование Н0С1/0С1 в организме; пути получения гипохлорита и его химические свойства; взаимодействие гипохлорита с биологически важными соединениями (аминокислотами, ферментами, антиок-сидантами, гемсодержащими белками, пипидами, ЛП). Обоснована постановка цепи и задач данной диссертационной работы.

и_методы_исследования. ЛП выделяли из сыворотки крови препаративным ультрацентрифугированием по методу Lidgren (1975). Экстракцию липидов проводили согласно методике Bligh и Dyer (19S9) (из эритроцитов по методу Фопча). Суспензию липосом получали по методу Barigham (1967). Нейтрофилы выделяли согласно процедурам, описанным 8 работе Boyum (1963), эритроциты - способом, описанным в работе Панасенко с соавт. (1980)

Гипохлорит получали из 0,9 % раствора NaCI электрохимическим методом на установке ЭДО-3. Концентрацию NaOCl определяли по его поглощению при 290 нм и рН 12. Содержание продуктов ПОЛ в образцах определяли по тесту с ТБК, выражая содержание ТБК-активных продуктов через

эквивалентное количество МДА (Uchiyama с соавт., 1978).

2+

Измерения ХЛ в присутствии Fe проводились на установке, описанной в монографии Владимирова и Арчакова (1972). ХЛ нейтрофилов регистрировали на люминометре LKB 1251 (Швеция). Спектры флуоресценции записывали на спектрофлуориметре F-4000 (Hitachi, Япония), спектры ЭПР -на радиоспектрометре ER-420 (Brucker, ФРГ), спектры поглощения - на спектрофотометре DU-7 (Beckman, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Перекисное окисление лилопротеинов кроои человека в присутствии гипохлорита Для ответа на вопрос о способности гипохлорита окислять липиды мы использовали традиционные методы, позволяющие определять содержание в липидах первичных, вторичных и конечных продуктов перекисного окисления липидов. МЫ исследовали собственную флуоресценцию ЛНП в видимой области и ее изменение после инкубации ЛНП с NaOCl. Как видно из рис.1, с ростом концентрации NaOCl в среде инкубации наблюдается достоверное увеличение интенсивности флуоресценции в аидимой области спектра, которая обусловлена содержанием конечных продуктов ПОЛ шиффовых оснований - продуктов взаимодействия малонового диальдегида (МДА) с донорами аминогрупп.

Было также показано, что в процессе инкубации ЛП с гипохлоритом происходит накопление вторичных продуктов окисления липидов альдегидной природы, выявляемых в реакциях с ТБК. Так, если ЛОИП или экстрагированные из них липиды инкубировали в присутствии NaOCl (1,44 мМ), то уже в течение первых 20-40 мин наблюдалось значительное увеличение содержания МДА, тогда как в отсутствии NaOCl на протяжении всего времени инкубации уровень МДА практически не изменялся (рис. 2). Таким образом, окислению гипохлоритом подвергались липиды как в составе лилопротеинов, так и предварительно изолированные из них. В некоторых последующих экспериментах для упрощения исследуемых систем в качестве субстрата окисления нами были использованы фосфолипидные липосомы.

Дополнительным подтверждением способности Н0С1/0С1 инициировать ПОЛ в липидной фазе, служат результаты анализа ХЛ фосфолипидных липосом, лрединкубированных в присутствии или отсутствии NaOCl. Предварительная инкубация липосом с гипохлоритом приводит к 20-кратному увеличению амплитуды быстрой вспышки ХЛ, индуцируемой добавлением в систему

2+ 2+ Fe . Данный факт можно объяснить разложением в присутствии Fe первичных продуктов ПОЛ - липопероксидов, образующихся в период инкубации липосом с NaOCl. Об этом также свидетельствует прирост ТБК-активных продуктов в системе после добавления Fe2+.

Известно, что при взаимодействии гипохлорита с некоторыми органи-

Табл.1. Влияние ионола на гипохлорит-индуцированное окисление ЛОНП.

Инкубируемые МДА, мкМ

компоненты до инкубации через 1 ч инкубации

ЛОНП 0 ,08 + 0,06 0 ,09 + 0. ,10

лонп + ЫаОС7 0, ,17 + 0,06 0, , 67 + 0, ,09

ЛОНП + МаОС!+ионоп (10~4М) 0. ,09 + 0,04 0, лз + 0, ,10

ческими соединениями в системе образуются свободные радикалы. В связи с этим мы решили выяснить участвуют ли свободные радикалы в реакциях гипохлорит-индуцированного окисления липидов. С этой цель» в среду инкубации ЛП с ЫаОС1 мы добавляли бутилированный гидрокситолуол (ионол), который является одним из эффективных перехватчиков свободных радикалов при ПОЛ. Как следует из таблицы 1, ионол полностью предотвращал накопление ТБК-активных продуктов в среде инкубации ЛОНП с ИаОС!. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности гилохпо-рита инициировать в липидной фазе процессы ПОЛ, протекающие с участием свободных радикалов и сопровождающиеся образованием первичных, вторичных и конечных продуктов окисления липидов, аналогично тому, как это имеет место при других известных способах инициирования ПОЛ.

Однако, не вполне понятно, каким образом реализуется реакция гипохлорит-индуцированного ПОЛ в ЛП, поскольку ЫаОСТ хорошо растворим в воде и локализуется, по всей вероятности, преимущественно в водной фазе, тогда как ПОЛ жирнокислотных цепей осуществляется в области локализации их ненасыщенных связей. В связи с этим мы исследовали способность гипохлорита проникать в липидную фазу ЛНП. С этой целью изучали взаимодействие гипохпорита, добавленного в водную фазу суспензии ЛНП, с донорами электронов, локализованными в липидной фазе ЛНП. В качестве доноров электронов использовали нитроксильные радикалы - производные стеариновой кислоты с парамагнитным центром, расположенным на разном удалении от поверхности частицы ЛНП (см.рис.3). За кинетикой окисления

спиновых зондов следили по уменьшению во времени параметра Ь /Ь , где

х о

и - амплитуды центральной компоненты спектра ЭПР до и через *

2.5 1

0.4 0.8 1.2 1.6 ИаОС1,мМ

Рис.1

50 100 150 200

Время, мин

Рис.2

Рис.1. Зависимость собственной флуоресценции ЛНП (А, =360 нм, Л =430

в 0 Ф

нм) от концентрации ИаОСТ через 1 час их инкубации при 37 С. Рис.2. Кинетика накопления МДА в среде инкубации ЛОНП (1,3) и суспензии экстрагированных из них липидов (2,4) в отсутствии (1,2) или присутствии (3,4) 1,44 мМ ЫаОС!.

*—»чь-я 0,54 мМ

1,35 мМ

8

а N-0

зон'д

3 12

5

10 5

12

14 1

'16

2 4 6 Время, мин

Рис.3. Кинетические кривые окисления предварительно встроенных в ЛНП

спиновых зондов Сг, С,,

-5 5 и

- 10 М, ЫаОСТ - указана у кривых.

и С гипохлоритом натрия. Концентрации зондов

минут после добавления NaOCl соответственно). Как с водном растворе, так и будучи предварительно встроенными в фосфолипидный поверхностный монослой ЛНП (рис.3), все три зонда окислялись гипохлоритом с одинаковой скоростью, увеличивающейся с ростом концентрации гипохлорита. Поскольку рК хлорноватистой кислоты составляет "7,5, то при физиологических значениях рН около половины гипохлорита находится в неионизиро-ванной форме - НОС1, и, по-видимому, проникновение Н0С1 в ЛНП не является лимитирующей стадией регистрируемого процесса окисления нитрок-сильных групп. Вероятно, обнаруженная нами способность гипохлорита проникать в поверхностный фосфолипидный слой ЛНП и обуславливает его высокую эффективность в отношении инициирования ПОЛ в липидной фазе.

Сравнительное исследование кинетики окисления ЛП разных классов в присутствии NaOCl (рис.4) показало, что наиболее подвержены гипохло-рит-индуцированному ПОЛ ЛОНП. Максимальный уровнь МДА в них составил 6,2 мкмоль/г белка. В ЛНП максимально накапливалось 1,3 мкмоль МДА/г белка. Меньше других окислялись ЛВП, обладающие антиатерогенными свойствами (максимальный уровень МДА - 0,8 мкмоль/г белка). Вероятно, это обусловлено высоким процентным содержанием в ЛВП белка, так как известно, что гипохлорит при его добавлении к ЛП прежде всего реагирует с SH- и NH^ - группами белка.

Зависимости накопления ТБК-активных продуктов через 1 час инкубации ЛОНП, ЛНП или ЛВП с гипохлоритом от его начальной концентрации (рис,5) носят экстремальный характер. В экспериментах по окислению NaOCl глутарового альдегида, отличающегося от МДА лишь наличием 2-х дополнительных СН2-групп, нами были получены результаты, указывающие на способность гипохлорита окислять образующиеся продукты ПОЛ альдегидной природы до соответствующих кислот, которые уже не способны давать окрашенный комплекс с ТБК. Вероятно, именно этим и объясняется наблюдаемое снижение уровня МДА на кинетических кривых при больших временах инкубации (рис.4) и при больших концентрациях гипохлорита (рис.5).

In vivo гипохлорит образуется при активации нейтрофилов и моноцитов в ходе следующей реакции, катализируемой МПО:

Н2°2 +С1_ ---> °С1~ + Н2°

(tí

if о 50 100 150 200 s 0

Время, мин

Рис.4

12 3 4 NaOCl, мМ

Рис.5

Рис.4. Зависимость содержания МДА в среде инкубации ЛОНП (1), ЛНП (2) и ЛВП (3) от концентрации добавленного NaOCl. Кривая 4 - контроль (в отсутствии NaOCl), одинаковый (в пределах ошибки) для всех классов.

Рис.5. Зависимость содержания МДА в среде инкубации ЛОНП (1), ЛНП (2) И ЛВП (3) от концентрации NaOCl.

Для того, чтобы приблизиться к условиям in vivo, мы инкубировали ЛП в системе "МП0+Н202+С! " и через 1 час инкубации анализировали содержание ТБК-активных продуктов (таблица 2). В отсутствии фермента ЛНП и ЛВП за время инкубации не окислялись. ЛОНП претерпевали незначительное окисление. Присутствие И^0^ не приводило к дополнительному окислению ЛЛ. Если же ЛП инкубировали в системе "МПО+Н^^+С!, то в среде инкубации всех классов ЛП наблюдалось увеличение содержания МДА. Окисление ЛП в системе "МП0+Н2О2+С1 " было обусловлено именно синтезом Н0С1/0С1~ в процессе миелопероскидазного катализа, поскольку в отсутствии одного из субстратов (С1 ) окисления ЛП не происходило (см. таблицу 2). При этом реакционная способность ЛП, как и в случае экзогенного гипохлори-та, изменялась в последовательности: ЛОНП > ЛНП > ЛВП.

Табл.2 Содержание МДА до и после инкубации ЛОНП, ЛНП, ЛВП в отсутствие и в присутствии МПО (0,04 ед./мл). Концентрация НО -4 мМ, рН - 6,0.

Инкубируемые МДА, мкмоль/г белка

компоненты до инкубации после инкубации после/до

ЛОНП 0,13 + 0,01 0,18 + 0,01 1,4

ЛОНП + Н202 0,12 +0,02 0,17 + 0,02 1,4

ЛОНП + Н202 + МПО 0,13 ± 0,02 1,18 + 0,03 9,0

ЛОНП + Н202 ■+ МПО 0,14 í 0,02 0,20 ±0,03 1,4 вотсутствии С1_

ЛНП 0,011 ± 0,004 0,011 + 0,005 1,0

ЛНП + Н202 0,010 ± 0,005 0,010 ± 0.00S 1,0

ЛНП + МПО + Н202 0,010 ± 0,005 0,040 ± 0,005 4,0

ЛВП 0,021 ± 0,005 0,020 ± 0,005 1,0

ЛВП + Н202 0,020 ± 0,006 0,021 ± 0,011 1,0

ЛВП + МПО + Н202 0,021 ± 0,005 0,032 ± 0,005 1,5

tí QJ

Рис.6. Зависимость интенсивности ХЛ 0,4 мМ NaOCl (1 и 3) и 3 мМ НО,

2+- 3+

(2) от концентрации Fe (1 и 2) или Fe (3).

Глава 2. Исследование роли ионов Fe в гипохлорит-индуцированном ПОЛ Известно, что с заметной скоростью свободнорадикальные процессы ПОЛ как in vitro, так и in vivo протекают с участием ионов металлов

г. 2+ 2+

переменмои валентности, в частности ионов Fe . Роль Fe в

Н0С1/0С1 -индуцированном ПОЛ на стадии инициирования может заключаться

2 +

в образовании свободных радикалов в системе Fe + HOCI/OC1 . Мы исследовали данную систему методом ХЛ, а полученные результаты сравнивали с результатами анализа реакции Фентона (в которой образуется он'-радикал) в адекватных условиях. Увеличение концентрации гипохлори-та в измерительной кювете приводило к увеличению интенсивности сверхслабого свечения, подобно тому, как это имело место при увеличении

2+

концентрации Н^О^ в системе Фентона (Fe + Как Бидн0 из Рис-6>

зависимости интенсивности ХЛ гипохлорита (кривая 1)и Н202 (кривая 2) _ 2+

от концентрации Fe носят аналогичный характер, однако, в системе

2+ 2 + Fe + NaOCI интенсивность ХЛ при одних и тех же концентрациях Fe

имеет большее значение по сравнению с системой Фентона. Интересно, что 3+

добавление Fe 8 раствор гипохлорита вообще не сопровождается

сверхслабым свечением (кривая 3 на рис.6).

Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что в систе-2+

ме Fe + Н0С1/0С1 образуются свободные радикалы. Впоследствии наши

результаты были подтверждены в работах Якутовой с соавт. (1992),

Candeias с соавт. (1994), в которых было показано образование ОН" в 2+

системе Fe + Н0С1/0С1 . В таком случае, можно предположить, что вза-2+

имодейстие Fe с гипохлоритом будат способствовать интенсификации процессов ПОЛ в липосомах. С целью выяснения этого вопроса мы исследовали изменение параметров вспышки ХЛ и содержания ТБК-активных продуктов в суспензии фосфолипидных лилосом, добавляя в нее различные кон-

2+

центрации гипохлорита непосредственно перед введением 10 мкМ Fe . Во-первых, увеличение концентрации NaOC) приводило к достоверному снижению уровня ТБК-активных продуктов ПОЛ, зарегистрированного непосредственно после завершения вспышки ХЛ. Во-вторых, наблюдалось уменьшение времени достижения максимума на кривых ХЛ. Оба этих факта можно объяснить, если предположить, что увеличение содержания NaOCI в иэмеритель-

нои кювете приводило к снижению реальной концентрации Ре в результате его окисления гипохлоритом. Зависимость интенсивности вспышки ХЛ от концентрации гипохлорита носила экстремальный характер. Увеличение интенсивности ХЛ в пределах концентраций МаОС1 от О до 40 мкМ свидетельствовало о возрастании продукции свободных радикалов в системе. Однако, по всей видимости, в. условиях нашего эксперимента, реакция гипо-2 +

хлорита с Ре не играла заметной роли в ПОЛ. Во всяком случае увели-

2+

чение концентрации N3001 в присутствии Ре уменьшало содержание продуктов ПОЛ в образце, то есть не способствовало развитию ПОЛ. Возмож-

2 +

но, это связано с тем, что Ре реагируют с №аОС1 в водной среде, а

акт инициирования ПОЛ должен осуществляться в липидной фазе. - 2+

Роль ионов Ре на стадии разветвления цепей ПОЛ заключается в

разложении первичных продуктов ПОЛ (пипопероксидов) с образованием ли-

пидных радикалов, дающих начало новым цепям окисления. Отражением дан-2 +

ного процесса в Ре -индуцированном ХЛ фосфолипидных липосом является так называемая быстрая вспышка. Нами были подобраны такие экспериментальные условия, при которых амплитуда быстрой вспышки при добавлении 2 +

Ре не эависила от дальнейшего увеличения его концентрации. ТБК-

активные продукты регистрировали непосредственно перед добавлением 1,5

мМ Ре2+ к пипосомам, предварительно инкубированным в присутствии или

отсутствии гипохлорита, и сразу после окончания быстрой вспышки ХЛ.

Как видно из рис.7 в отсутствии №аОС1 накопления ТБК-активных продук-

2+

тов не было зарегистрировано даже после добавления Ре (кривые 3 и

4). Присутствие в среде инкубации 100 мкМ ИаОС! приводило к увеличению

продуктов ПОЛ в течение первых 1,5 часов (кривая 2, рис.7). После до-2 +

бавления Ре в системе регистрировалось значительно большее количество ТБК-активных продуктов (кривая 1, рис.7), это сопровождалось увеличением амплитуды быстрой вспышки ХЛ (рис. 8). Полученные результаты указывают на то, что накопленные при инкубации липосом с гипохлоритом продукты имеют ту же природу, как и при других способах инициирования ПОЛ, то есть представляют собой пероксидные соединения. Их количество

в липосомах, а также амплитуда быстрой вспышки линейно возрастали с

2+

увеличением концентрации гипохлорита. Разложение в присутствии Ре первичных продуктов ПОЛ лероксидной природы, накопленных при инкубации

Рис.7. Зависимость содержания ТБК-активных продуктов в липосомах,

инкубированных в присутствии (1,2) или отсутствии (3,4) 100 мкМ Иа0С1

2+

до (2,4) и после (1,3) добавления 1,5мМ Яе от времени их инкубации.

2 +

Рис.8. Зависимость амплитуды быстрой Ре -индуцированной вспышки ХЛ липосом от времени их предварительной инкубации с 100 мкМ N8001.

липосом с Иа0С1, приводило как к трансформации первичных продуктов ПОЛ во вторичные (выявляемые в реакции с ТБК), так и к разветвлению цепей, т.е. к появлению липидных радикалов, дающих начало новым цепям окисления. Представляется, что последняя реакция может играть ключевую роль в гипохлорит-индуцированном ПОП даже в присутствии следовых количеств Ре2+.

Глава.3 Исследование методом спиновых зондов и меток структурных изменений поверхностного протеолипидного слоя ЛНП под действием гипохлорита Логично предположить, что гипохлорит-индуцированное окисление ЛП будет сопровождаться нарушением структуры поверхностного протеолипидного слоя ЛП. Используя спиновые зонды С. С., С.„ и С„_ мы исследова-

О 5 12 1Б

ли изменения физико-химических свойств липидной фазы на различном уда-

лении от поверхности частиц ЛИП, предварительно инкубированных в течении 1 часа с гипохлоритом. В случае зонда С^ (амфифильной молекулы, способной встраиваться в липидную фазу, при этом ее нитроксильный фрагмент располагается на поверхности ЛНП) нами было обнаружено увеличение времени корреляции вращательной диффузии (1) нитроксильного фрагмента зонда по мере возрастания концентрации МаОС1 в инкубационной среде и накопления продуктов ПОЛ в ЛНП. Это свидетельствует об ограничении вращательной подвижности нитроксильного фрагмента, локализованного в полярной поверхностной области ЛНП, что обусловлено, по всей вероятности, иммобилизацией полярных групп фосфолипидов. Как следует из рис. 9, увеличение концентрации ЫаОС1 в среде инкубации приводило к увеличению параметра упорядоченности Б и снижению параметра гидрофоб-

ности Ь для зонда С_. В случае зонда С.„ характер зависимостей указан-5 12

ных параметров от концентрации N300] был аналогичным. Заметные изменения в районе 16-й СН -группы (зонд С ) проявлялись лишь при концен-2 16

трации N8001 более 1 мМ. Таким образом, гипохлорит приводит, с одной стороны, к уменьшению подвижности (увеличению параметров Б и Т), а с другой - к увеличению полярности (уменьшению параметра Ь) микроокружения жирнокислотных цепей фосфолипидов вплоть до 12-й СН^-группы (до глубины ~ 1,7 нм от поверхности частицы ЛНП).

Изменения структуры алолипопротеинов под действием гипохлорита исследовали с помощью слинмеченого малеимида, при физиологических рН ковалентно связывающегося преимущественно с БН-группами алолипопротеинов ЛНП. Добавление ИаОС1 к суспензиии спинмеченых ЛНП не приводило к уменьшению амплитуд сигналов ЭПР, несмотря на достаточно быстрое окисление гилохлоритом малеимида, растворенного в воде. Данный результат можно обьяснить, с одной стороны, тем, что спинмеченный малеимид, связанный с вН-группами алолипопротеинов, становится недоступным для молекул Н0С1, с другой стороны, это может быть причиной высокой константы скорости реакции ЫаОС1 с ЭН- и ЫН^группами по сравнению с константой реакции окисления нитроксильного фрагмента метки гипохлоритом. В то же время добавление гипохлорита к спинмеченым ЛНП приводило к резкому росту в первые пять минут с последующим выходом на плато параметра

Ь(отношение амплитуд низкопольных компонент сигнала ЭПР от слабо В А

и сильно иммобилизованного маленмида). Увеличение доли слабо иммобилизованной на белке метки (т.е. параметра h„/h ) наблюдалось также по

В А

мере возрастания концентрации NaOCI. Эти факты свидетельствуют об увеличении при действии гипохлорита на ЛНП доли белка с более подвижными SH-группами.

Для определения потенциала поверхности ЛНП мы использовали в ка-

2+

чествв положительно заряженного спинового зонда ионы Мп . Измерение

2+

амплитуды 4-ой компоненты спектра ЭПР Мп в водной среде П ) и в

суспензии ЛНП (I ) позволило нам определить соотношение концентраций 2+ 6

ионов Мп в водной фазе (С^) и адсорбированных на ЛНП (сл': Св/'Сл =

I /(I -I ). Потенциал поверхности ЛНП рассчитывали по формуле: в о в

ф=(RT/2F)* 1п[(С /С )/(С /С )], где R - универсальная газовая постоян-в л в л о

ная, Т - абсолютная температура, Z - заряд зонда, F -постоянная Фара-

2 +

дея. (С /С ) - соотношение концентраций ионов Мп при (¡5=0 было опрев л о

делено нами в условиях полной экранировки заряда поверхности ЛНП (при увеличении ионной сипы среды добавлением NaCT до конечных концентраций 150-200 мМ). Рассчитанный таким образом потенциал поверхности ЛНП оказался равен -17,7 - 1,3 мВ, что хорошо согласуется с результатами работы Панасенко с соавт, (1986). Гипохлорит приводил к увеличению отрицательного потенциала поверхности ЛНП (рис.10). Особенно отчетливо это наблюдалось при концентрациях NaOCl выше 1 мМ. Данный результат был подтвержден методом электрофореза в 0,5 % геле агарозы (рис.11). Сравнительный анализ влияния H0C1/0CJ на разные классы ЛП показал, что наибольшее увеличение электрофоретической подвижности было зарегистрировано у ЛОНП и ЛНП, в случае ЛВП эффект был незначительным (рис.11). Обнаруженное Н0С1/0С1 - индуцированное изменение электрофоретической подвижности разных классов ЛП качественно совпадало с их способностью окисляться под действием гипохлорита. Описанные выше изменения заряда поверхности ЛНП являются одним из необходимых условий приобретения ЛНП атерогенных свойств (Brown и Goldstein, 1933).

Столь существенные изменения физико-химических свойств поверхностного лротеолипидного слоя ЛНП должны повлечь за собой нарушение взаимодействия ЛНП с клеточными мембранами. Действительно, используя в качестве модели эритроциты, которые не содержат рецепторов к ЛП, мы по-

0.5

Ь0.4

0.74

0.0 0.5 1.0 1.5 КаОС1, мМ

2.0

0.3

Рис.9. Зависимости параметров упорядоченности (Э) и гидрофобности (Ь)

спинового зонда С. в ЛНП, предварительно инкубированных с МаОС1, от 5

концентрации гипохлорита.

т

я От

О

О

15-

а ' *

<0

и О - 30

И

К й - •45-

Я

Я"

к ф ~ ■60--

0

о

с

12 3 №0С1, мМ

Рис.10

0.8

0.0 0.4 0.8 1.2

КаОС1, мМ

Рис.11

Рис.10. Зависимость потенциала поверхности частицы ЛНП от концентрации ЫаОСТ через 10 мин. после начала их инкубации.

Рис.11. Зависимость электрофоретической подвижности (Я^) ЛОНП (1), ЛНП (2) и ЛВП (3), предварительно инкубированных в течении 1 часа с гипохлоритом, от концентрации ЫаОС!.

1 6

ч:

Рис.12. Кривые люммнол-зависимой ХЛ нейтрофилов (2 млн. клеток/мл) в

присутствии ЛНП, предварительно инкубированных 1 час с разными

концентрациями гипохлорита (мМ): 1-0; 2 - 0,5; 3 - 0,8; 4 - 1,0; 5 -

1,25; 6 - 1,5. Кривая 7 - ЛНП в отсутствии нейтрофилов. Концентрация -5

люминола 10 М, ЛНП - 0,25 мг белка/мл.

казали увеличение нерецепторного, неопосредованного эндоцитозом поступления холестерина в клетки из ЛНП, предварительно инкубированных с N800. Это выражалось в увеличении в эритроцитах (по окончании 4-х часовой инкубации с обработанными гипохлоритом ЛНП) содержания холестерина (до 30%) при постоянном (в пределах ошибки эксперемента) содержании фосфолипидов. Такие изменения холестерин-транспортных свойств ЛНП, модифицированных гипохлоритом, могут играть еажую роль в развитии атеросклероза, приводя к усиленной аккумуляции холестерина в клетках.

Известно, что продукты ПОЛ (предпочтительно гидропероксиды) способны предстимулировать полиморфноядерные лейкоциты, что выражается в 2-3 кратном увеличении ответа клеток на последующую стимуляцию (Клебанов, 1991). Нам удалось продемонстрировать способность ЛНП, предварительно обработанных гипохлоритом, непосредственно вызывать активацию нейтрофилов. Как видно из рис. 12, увеличение концентрации гипохлорита, использованной в период предварительной инкубации с ЛНП, приводило

к увеличению интенсивности люминол-зависимой ХЛ нейтрофилов. 8 тоже время в отсутствии клеток добавление люминола к ЛНП, предварительно обработанным ЫаОС1, не сопровождалось вспышкой ,ХЛ (кривая 7, рис.12). Таким образом, модифицированные в результате гипохлорит-индуцированного окисления ЛНП, способны активировать нейтрофилы, усугубляя протекание процессов ПОЛ в их присутствии, и замыкая тем самым порочный круг образования окисленных ЛП.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что при инкубации липопротеинов крови человека с гипо-хлоритом, добавленным извне или образующимся в системе "миелоперокси-даза+Н^О^+С! " происходит активация перекисного окисления липидов. Способность разных классов липопротеинов окисляться под действием ги-похлорита качественно совпадает с гипохлорит-индуцированным изменением их электрофоретической подвижности и уменьшается в последовательности: ЛОНП > ЛНП > ЛВП.

2. Н0С1/0С1 -индуцированное перекисное окисление липидов, как и 2+

Ре -зависимое, протекает с участием свободных радикалов и сопровождается аккумуляцией первичных (липопероксидов), вторичных (альдегидной природы, реагирующих с ТБК) и конечных (шиффовых оснований) продуктов окисления липидов.

3. С использованием спинмеченных жирных кислот показано, что гипохло-рит проникает в поверхностный протеолипидный слой ЛНП, окисляя с одинаковой скоростью парамагнитные центры, локализованные на разном удалении от поверхности частицы ЛНП.

4. Методом хемилюминесценции лродемонстирована

- 2 +

- генерация свободных радикалов в реакции Н0С1/0С1 с Ре ;

2+

- важная роль Ре в гипохлорит-индуцированном окислении липидов на стадии разветвления цепей.

5. Методом спиновых зондов и меток показано, что при действии гипохло-рита на ЛНП изменяются физико-химические свойства поверхностного протеолипидного слоя, что проявляется:

- в уменьшении подвижности и увеличении полярности микроокружения

жирнокиспотных цепей фосфолипидов вплоть до 12-ого С-атома цепи;

- в увеличении доли белка с более подвижными SH-группами;

- в увеличении отрицательного потенциала поверхности ЛНП.

6. Установлено, что ЛНП, предварительно инкубированные в присутствии Н0С1/0С1~,

- обладают более выраженной способностью по сравнению с нативными транспортировать холестерин в мембраны эритроцитов;

вызывают активацию найтрофилов, способствуя дальнейшей интенсификации процессов ПОЛ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Панасенко О.М., Евгина С.А., Сергиенко В.И. Взаимодействие электрохимически полученного гипохлорита натрия с липопротеинами крови человека. // 8 кн.: Электрохимические методы в медицине. Москва, 1991, стр.7-3.

2. Евгина С.А., Панасенко О.М., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А. Пере-кисное окисление липопротеинов крови человека, индуцированное гипохло-рит-анионом. // Биологические мембраны, 1992, т.9, N9, с.946-953.

3. Panasenko О.М., Evgina S.A., Driomina E.S., Sharov V.S., Sergienko V.I., Vladimirov Yu.A. Hypochlorite as a probable cause of human blood lipoproteins oxidative modification upon atherosclerosis. // In: Book of abstracts. International conference on critical aspects of free radicals in chemistry, biochemistry and medicine. Vienna, February 1417, 1993, p.225.

4. Панасенко O.M., Евгина С.A., Сергиенко В.И. Изучение способности гипохлорита проникать в липидную фазу липопротеинов крови человека. // Бюлпютень экпериыентальной биологии и медицины, 1993, т.115, N4, с.358-360.

5. Панасенко О.М., Евгина С.А., Сергиенко В.И. Исследование методом спиновых зондов изменения структуры липопротеинов крови человека под действием гипохлорита натрия. // Бюллютень экпериментальной биологии и медицины, 1993, т.116, N8, с.153-155.

6. Panasenko О.М., Evgina S.A., Driomina E.S., Sharov V.S., Sergienko

V.I., Vladimirov Yu.A. Oxidative modification of human blood lipoproteins due to hypochlorite, released by activated phagocytes: a possible mechanism of atherogenesi$. // Free Radical Biology & Medicine, 1994, v.16, N1, p.14.

7. Panasenko O.M., Evgina S.A., Aidyraliev R.K., Sergienko V.3., Vladimirov Yu.A. Peroxidation of human blood lipoproteins induced by exogenous hypochlorite or hypochlopite generated in the system of "Myeloperoxidase + H2°2 + "' ^ Free Radical Biology a Medicine, 1994, v.16, N2, p.143-148.

8. Якутова Э.Ш., Дремина E.C., Евгина С.А., Осипов А.Н., Шаров B.C., Панасенко O.M., Владимиров Ю.А. Образование свободных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа (II). // Биофизика, 1994, т.39, N2, с.275-279.

9. Панасенко О.М., Евгина С.А., Дремина Е.С., Шаров B.C., Сергиенко

2+

В.И., Владимиров Ю.А. Роль Fe в перекисном окислении липидов липосо-мапьных мембран, индуцированном гипохлоритом натрия. // Биологические мембраны, 1995, т.12, N2, с.191-199.

10. Panasenko O.M., Evgina S.A., Driomina E.S., Sharov V.S., Sergienko V.I., Vladimirov Yu.A. Hypochlorite induces lipid peroxidation In blood lipoproteins and phospholipid liposomes. // Free Radical Biology 8 Medicine, 1995, v.19, N2, p.133-140.

11. Панасенко O.M., Евгина С.А., Никитин С.В. , Сергиенко В.И. Влияние гипохлорита на электрические свойства поверхности липопротеинов крови человека. // Биофизика, 1995, т.40, N3, с.545-550.