Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация плазматической мембраны тромбоцитов и лейкоцитов и изменение их функций под влиянием гипохлорита натрия

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Модификация плазматической мембраны тромбоцитов и лейкоцитов и изменение их функций под влиянием гипохлорита натрия"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ОIV РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Э-ИССЛЕДОЗАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

ТРУНИЛИНА Наталья Николаевна

МОДИФИКАЦИЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКОМ МЕМБРАНЫ ТРОМБОЦИТОВ И ЛЕЙКОЦИТОВ И ИЗМЕНЕНИЕ ИХ ФУНКЦИЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ ГИПОХЛОРЮА НАТРИЯ

Биофизика 03.00.02.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины (ШШ ФХМ)

Научные руководители:

кандидат биологических наук Мурииа Марина Алексеевна,

профессор, доктор медицинских наук Сергиенко Валерий Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Сороковой Вячеслав Иванович, кандидат биологических наук Деев Анатолий Иванович

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт детской гематологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации

Защита состоится " " 1995 г. в " " часов на заседании совета по защите диссертаций Д.084.66.01. при НИИ физико-химической медицины по адресу: Москва, ул. М.Пироговская, д.1

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины

Автореферат разослан "..." ......... 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.А.Мурина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. Изучение биологического действия ги-похлорита натрия (ГХН) интересно и важно в трех аспектах. 1) Различные клетки крови могут оказывать влияние друг на друга путем высвобождения в окружающую среду различных соединений со стимулирующим или ингибирующим действием [Maeda Т., 1991; Marcus A.J., 1988, 1990, 19933. Одним из таких соединений является ги-похлорная кислота (источник гипохлормт-аниона), образующаяся в фагоцитирующих лейкоцитах в ходе миелопероксидазной реакции [Ма-янский А.Н., 1989; Klebanoff S.J., 19783. Основной "мишенью" для действия гипохлорита являются различные чужеродные агенты CClark R.A., 1975, 1976, 1979; Klebanoff S.J.,1978; Thomas E.L., 19793. Однако возможно его влияние и на собственные клетки организма, находящиеся в ближайшем окружении. В очаге воспаления это преоде всего лейкоциты, в кровяном русле - различные клетки крови. В связи с этим представляет интерес изучение действия ГХН на различные клетки крови. 2) Актуальным является вопрос о возможности применения ГХН в клинике в качестве лекарственного средства. В настоящее время ГХН разрешен к применению в качестве детоксикан-та при эндо- и экзотоксикозах. Однако при внутривенном введении ГХН возможно его побочное и косвенное действие за счет взаимодействия с клетками крови и компонентами плазмы. Так, известно сильное антиагрегационное действие ГХН на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). 3) В настоящее время большое значение имеет поиск и разработка средств, ингибирующих тромбоциты. Генерализованное ингибирование тромбоцитов может требоваться для предотвращения и лечения различных сосудистых патологий, в основе которых лежит повышение активности тромбоцитов. С другой стороны, поиск и разработка ингибирующих тромбоциты средств важны с точки зрения изыскания способов хранения тромбоцитарной массы, предназначенной для последующей трансфузии. Одна из причин, ограничивающих продолжительность хранения тромбоцитов в обычных условиях, состоит в их активации под влиянием различных трудно контролируемых факторов [Becker R.C., 19923. Поэтому представляет интерес поиск способов хранения тромбоцитарной массы, предусматривающих временную обратимую инактивацию клеток. Для решения обсуждаемых проблем перспективно

- г -

изучение механизма противотромбоцитарного действия ГХН. Как уде говорилось, ГХН - природное соединение. Ионы гипохлорита эффективно взаимодействуют с различными химическими группами (сульфидными, аминогруппами), входящим в состав компонентов клеточных мембран [Albrich J.M., 1981; Weiss S., 1982; Zgliczynska J.M., 19683, что может вести к их модификации и как следствие -к общей инактивации клеток. Получены косвенные данные о том, что в 0TF1 при введении ГХН протекает обратимое взаимодействие между клетками и компонентами плазмы [Мурика И.А., 19893. Это указывает на возможность восстанозления инактивированных клеток плазмой.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение закономерностей действия ГХН на различные функциональные процессы в лейкоцитах и тромбоцитах, а также выяснение некоторых молекулярных механизмов этого действия. В соответствии с поставленной целью предусматривалось решение следующих задач:

1) изучение действия ГХН на агрегацию и циклоксигеназное перекисное окисление липидов в лейкоцитах;

2) изучение действия ГХН на функциональные процессы в изолированных тромбоцитах: агрегацию, реакцию выброса и циклоксигеназное перекисное окисление липидов;

3) изучение влияния различных компонентов плазмы, модифицированных ГХН, на агрегацию нативных тромбоцитов;

4) изучение возможности восстановления нативной плазмой и ее компонентами агрегационной способности тромбоцитов, инактивированных ГХН;

5) изучение модификации аминогрупп лейкоцитов и тромбоцитов под действием ГХН, как первичного механизма действия ГХН.

Научная новизна исследования. Было обнаружено, что агрегация лейкоцитов (нейтрофилов, мононуклеарных лейкоцитов и суммар-ногй фракции лейкоцитов), индуцированная арахидоновой кислотой, снижается под действием ГХН в концентрации 1 - 100 мкМ. Возможно, это связано со стимуляцией в этих клетках под действием ГХН циклоксигеназного перекисного окисления липидов (ПОЛ). Такая стимуляция в определенных условиях была показана при действии ГХН на нейтрофилы.

При исследовании прямого действия ГХН на изолированные тромбоциты было обнаружено, что уже в концентрации 10 мкМ ГХН достоверно (с< = 5% по критерию Стьюдента) снижает агрегацию, реакцию выброса и циклонсигеназное ПОЛ в тромбоцитах, индуцированные тромбином. Реакция выброса и циклоксигеназное ПОЛ угнетаются при низких концентрациях ГХН сильнее, чем процесс агрегации клеток. Такое неодинаковое ингибировакие различных процессов говорит о том, что действие ГХН не сводится просто к инактивации тромбинового рецептора. Возможно, при низких концентрациях ГХН модифицируются прежде всего мембранные структуры, обеспечивающие функционирование внутриклеточной трансдунции сигнала.

При исследовании косвенного действия ГХН на тромбоцита показано, что белки плазмы^фибриноген, сывороточный альбумин и аминокислота аланин, модифицированные ГХН, ингибируют тром-бин-индуцированную агрегацию нативных тромбоцитов. Таким образом, при введении ГХН в ОТП его противоагрегационный эффект обусловлен как прямой инактивацией тромбоцитарных клеток, так и действием на них модифицированных ГХН компонентов плазмы.

Установлено, что нативная плазма и фибриноген способны восстанавливать агрегационную способность инактивированных ги-похлоритом тромбоцитов.

В результате проведенных исследовании был установлен один из возможных первичных механизмов действия ГХН на лейкоциты и тромбоциты, а именно модификация под действием ГХН поверхностных аминогрупп мембран этих клеток.

Практическое значение работы. Полученные,данные по воздействии ГХН на лейкоциты и тромбоциты представляют интерес с точки зрения клинического использования ГХН в качестве лекарственного средства. С одной стороны ингибирующее действие ГХН на функциональные процессы в лейкоцитах и тромбоцитах может иметь значение для профилактики и лечения состояний, связанных с повышением активности этих клеток (тромбозы). С другой стороны действие ГХН на лейкоциты и тромбоциты может оказаться для организма вредным, поэтому следует учитывать возможное побочное действие ГХН на клетки крови при его внутривенном введении в качестве детокси-канта.

Данные об инактивирующем действии ГХН на тромбоциты и способности нативной плазмы и фибриногена восстанавливать активность тромбоцитов могут быть использованы при разработке способов хранения тромбоцитарной массы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции "Электрохимические методы в медицине", Дагомыс, октябрь 1991 г., на 4 Всесоюзной конференции "Биоанти-оксидант", Москва, май 1992 г., на Всероссийской научной конференции "Эфферентные методы в медицине", Анапа, октябрь 1992 г., на Всероссийской конференции "Эндогенные интоксикации", Санкт-Петербург, июнь 1994 г.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 129 страницах, включая 2 таблицы и 30 рисунков, список литература содержит 153 названия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реактивы. Гипохлорит натрия (ГХН) получали путем электролиза 0,9 % хлористого натрия LМартынов А.К., 19853. В работе использовались тромбин человека из набора реагентов Chrono-log, арахидоновая кислота (Serva), сывороточный альбумин человека (Serva), фибриноген быка (Serva), аланин (Reanal), глутагион (Reanal), аспирин (Полфа), флуорескамин (Serva), акридиновый оранжевый (Sigma), декстран (Serva), фиколл 400 (Serva), коммерческие препараты ионола (институт химической физики РАН) и три-омбраста, соли марок "ЧДА" и "ХЧ".

Выделение тромбоцитов. В работе исследовались изолированные тромбоциты кроликов и тромбоциты в составе ОТП. Кровь стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Кровь разливали в пластиковые пробирки и центрифугировали 20 мин. при 460 g. Супернатант, представляющий собой ОТП, отбирали для исследования. Для получения изолированных клеток ОТП помещали в пластиковые пробирки по 2 мл, добавляли раствор ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и центрифугировали 7 минут при 1850 g. Осадок

ресусле.чдмоовали в буфере для тромбоцитов с ЭДТА (0,5 мМ) (134 мМ НаС1; 5 мН KCl; 0,4 мМ НаоНР04; ОД мМ HalbPOj; 1,0 мМ MgSO,r, 10 мМ HEPES; 5 мМ глюкозы; рН=7,4) и снова осаждали при тех же условиях. Затем осадок ресуспендировалм в рабочем тромбоцитарном буфере (состав тот же, но без ЭДТА). Концентрация тромбоцитов была близка к их содержании в ОГП, что контролировалось по све-топропускании клеточной суспензии при а = 670 нм. Для получения натнвной плазмы ОТП центрифугировали при 5120 g в течение 10 минут fBills Т.К., 19773.

Выделение мононуклеарных клеток, нейтрофилов и суммарной фракции лейкоцитов. Кровь стабилизировалась 3,8 % раствором цитрата натрия. Затем к ней добавлялся 6 раствор декстрана в фосфатном буфере (2,7 мМ KCl, 136 мМ НаС1, 1,1 мМ К2НРО4, 7,9 мМ НаоНРО^, pH = 7,4) в соотношении 4 : 1, и смесь инкубировалась 15 минут при температуре 37°С и 45 минут при комнатной температуре. В результате эритроциты оседали в виде крупных агрегатов. Для получения суммарной фракции лейкоцитов надосадочную жидкость центрифугировали при 460 в в течение 10 минут при комнатной температуре. Осадок, представлявший суммарную фракцию лейкоцитов, отмывали в фосфатном буфере. Для разделения клеток супернатант наслаивался на раствор фиколл-триомбраста с плотностью 1,077 в соотношении 3 : 1. После центрифугирования при 460 g в течение 40 минут на границе раздела плазмы и фиколла концентрируются мо-нонуклеарные клетки, а гранулоциты и эритроциты образуют осадок. Фракция мононуклеаров отбиралась и отмывалась в фосфатном буфере. Осадочная фракция подвергалась осмотическому шоку, а затем также отмывалась в фосфатном буфере. Концентрация клеток во всех фракциях доводилась до 4 * 10б клеток на миллилитр ГНатвиг Дж.Б.,19801

Регистрация агрегации тромбоцитов и лейкоцитов. Агрегация клеток регистрировалась турбидиметрическим методом Борна ГВогп G.V.R., 19623. В качестве индукторов агрегации для тромбоцитов использовался тромбин, для лейкоцитов - арахидоновая кислота. Для регистрации агрегации к 0,9 мл суспензии клеток добавляли 0,1 мл CaClg (1 мМ), а затем тромбин (в конечной концентрации 0,1 ЕД/кл) - к тромбоцитам и арахидоновую кислоту (в конечной

концентрации ОД - 0,5 мМ) - к лейкоцитам. Количественным показателем агрегационной способности клеток было изменение светоп-ропускания их суспензии (ДТ), регистрируемое через 5-7 минут после введения индуктора агрегации. При исследовании действия ГХН данные представлены в виде отношения AT/ÛTr * 100%, где ДТк и ДТ - изменение светопропускания в суспензии нативных клеток (контроль) и в опытных образцах (с ГХН).

Регистрация продуктов перекисного окисления липидов. Показателем протекания ПОЛ в клетках служил уровень малонового ди-альдегида (КЩА), регистрируемый спектрофотометрически по его реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Asakawa J., 19803. Регистрацию спектра поглощения комплекса МДА с 2-ТБК в диапазоне 500 - 550 нм проводили на спектрофотометре Hewlett-Packard 8451А.

Исследование реакции выброса в тромбоцитах. Реакцию выброса в тромбоцитах исследовали флуориметрическим методом с использованием зонда акридинового оранжевого (АО) [Владимиров Ю.А., 1980; Попов Е.Г., 1987; Popov E.G., 19873. Флуоресценция акридинового оранжевого возбуждалась при 450 нм. Регистрировалось излучение, прошедшее через светофильтр ЖС-17. Для регистрации реакции выброса к 0,9 мл суспензии нагруженных зондом тромбоцитов добавляли CaClo (1 мМ) и тромбин (в конечной концентрации 0,1 ЕД/мл). После введения тромбина регистрировалась зависимость от времени интенсивности флуоресценции зонда. Максимальное изменение интенсивности (AI) служило количественным показателем реакции выброса.

Флуориметрическое определение модификации аминогрупп. Модификацию аминогрупп под действием ГХН в растворе аланина, суспензиях лейкоцитов и тромбоцитов определяли флуоресцентным методом с помощью флууорогенного реагента на первичные амины флуореска-мина. Длина волны возбуждающего света составляла 400 нм. Флуоресценция регистрировалась в области 490 нм (светофильтр ЖС-17). Для проведения измерений 50 мкл 2 мМ раствора флуорескамина в ацетоне добавляли в кювету с 0,5 мл исследуемого раствора либо суспензии клеток при интенсивном перемешивании. Флуоресценцию измеряли через 3 минуты после введения флуорескамина.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась по критерию Стьюдента и по ранговому критерию Уилконсона-Т.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие гипохлорита натрия на функциональные процессы в лейкоцитах. Агрегация лейкоцитов, как часть общего процесса активации этих клеток, может быть ключевым моментом развития и течения различных форм воспаления.

Агрегация лейкоцитов может быть вызвана большой группой веществ. В нашей работе в качестве индуктора агрегации лейкоцитов использовалась арахидоновая кислота (АК). Обязательный условием агрегации являлось присутствие в среде двухвалентных катионов (Са2+).

Максимальная степень агрегации для всех исследованных фракций лейкоцитов наблюдалась при действии арахидоновой кислоты в концентрации 0,1 мМ. В дальнейших экспериментах именно эту концентрация арахидоновой кислоты мы использовали для индукции агрегации лейкоцитов. Различные фракции лейкоцитов отличались по величине изменения светопропускания суспензии клеток после введения индуктора агрегации. Гак, степень АК-индуцированной агрегации суммарной фракции лейкоцитов и нейтрофилов невелика и составляет соответственно 17 ± 3 % и 13 ±6% (рис.1, кривые 2 и 3), в то время как арахидоновая кислота в случае мононуклеарных лейкоцитов приводит к длительной и более выраженной агрегации (рис.1, кривая 1).

В последующей серии экспериментов было исследовано действие ГХН на агрегацию лейкоцитов (рис.2). Ингибирование агрегации всех типов лейкоцитов наблюдалось при введении ГХН в суспензию клеток в конечной концентрации 1 мкМ. Так, агрегация суммарной фракции лейкоцитов, мононуклеарных лейкоцитов и нейтрофилов при добавлении 1 мкМ ГХН снижалась в среднем на 20 %. При повышении концентрации ГХН до 100 мкМ степень агрегации лейкоцитов снижалась на 60 - 70%.

При дальнейшем увеличении концентрации ГХН, вводимого в суспензию клеток, в интервале концентраций от 0,5 до 1,5 мМ,

10 минут ^

Рис. 1. Типичные кинетические кривые агрегации мононуклеарных лейкоцитов (1), нейтрофилов (3) и суммарной фракции лейкоцитов (2) при действии 0,1 мМ арахидоновой кислоты. Т - светопропуска-ние, %; t - время.

дт/дтк;/

Рис. 2. Ингибирование гипохлоритом натрия АК-индуцированной агрегации мононуклеарных лейкоцитов (1), нейтрофилов (2) и суммарной фракции лейкоцитов (3). С - концентрация ГХН, мМ; АТк и ДТ -степень агрегации клеток без ГХН и при введении ГХН.

ДТ. V.

С, мМ

Рис. 3. Зависимость степени агрегации моконуклеарных лейкоцитов (1). нейтрофилов (2) и суммарной фракции лейкоцитов (3) от концентрации индуктора агрегации - гипохлорита натрия. С - концентрация гипохлорита натрия, мМ; ДТ - степень агрегации, %.

наблюдалась агрегация лейкоцитов без дополнительного введения индуктора агрегации (рис.3). Степень ГХН-индуцированкой агрегации мононуклеарных лейкоцитов была в 2 - 3 раза вше степени агрегации суммарной фракции лейкоцитов и нейтрофилов. Расшифровка механизма агрегации лейкоцитов при действии ГХН требует дальнейших исследований.

Таким образом, мононуклеарные лейкоциты и нейтрофилы крови кролика агрегируют в ответ на введение арахидоновой кислоты. Ги-похлорит натрия в низких концентрациях (1 - 100 мкМ) мнгибирует этот процесс.

Известно, что арахидоновая кислота, индуцируя агрегацию лейкоцитов, запускает механизм ферментативного ПОЛ в этих клетках по липсксигеназному пути ГУП1а Б., 19843. При этом уменьшается количество эндогенной арахидоновой кислоты, доступной для конкурентного циклоксмгеназного пути окисления. Ькшго было предположить, что ГХН вызывает ослабление агрегации лейкоцитов за счет стимуляции в них циклоксигеназного перекисного окисления липидов. В связи с этим в последующих экспериментах изучалось

действие ГХН на процесс ферментативного ПОЛ в лейкоцитах.

При действии ряда физико-химических факторов на клетки в них может индуцироваться как ферментативное, так и неферментативное перекисное окисление липидов, которые отличают друг от друга по действию специфических ингибиторов. Так, ПОЛ, подавляемое а-токоферолом или ионолом, относят к неферментативному типу, а ПОЛ, подавляемое аспирином или индометацином, считают процессом циклоксигеназного типа LAkocob A.K., 1989; Горюков A.B., 19893. Этот подход мы использовали при изучении действия ГХН на процесс перекисного окисления липидов в лейкоцитарных клетках.

Наиболее интересные, на наш взгляд, результаты были получены на суспензии нейтрофилов. При определенных условиях, а именно при выделении из 1 мл цельной крови более 0,7 * 106 клеток, была показана стимуляция ПОЛ в нейтрофилах при действии 1 мкМ ГХН. Прирост уровня ВДА составлял 15% от уровня МДА в контрольном образце. Эффект был достоверен с уровнем значимости 5% по критерию Уилкоксона-Т. Прирост уровня МДА снимался аспирином, что позволяет говорить о циклоксигеназной природе ГХН-индуцированного ПОЛ в нейтрофилах. Возможно, такая стимуляция является причиной ослабления гипохлоритом в концентрации 1 мкМ агрегации нейтрофилов.

Действие гипохлорита натрия на функциональную активность тромбоцитов. Активность тромбоцитов оценивалась по трем процессам: агрегации клеток, реакции выброса и циклоксигеназному ПОЛ. В качестве индуктора активации использовался тромбин.

На рис.4 представлены типичные кинетические кривые агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином (0,1 ЕД/мл). ГХН оказывает ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов (рис.4 и 5). Достоверное снижение агрегации тромбоцитов на 10% наблюдалось при концентрации ГХН 10 мкМ. При увеличении концентрации ГХН до 100 мкМ агрегация тромбоцитов практически полностью подавлялась. Таким образом, в случае 0ТП один из возможных путей противоагрегационного действия ГХН заключается в его прямом взаимодействии с клетками.

Известно, что тромбин, активируя тромбоциты, вызывает высвобождение содержимого гранулярного аппарата во внеклеточную

Т, X

о и

1

10 минут

Рис. 4. Типичные кинетические кривые агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином (0,1 ЕД/мл) при действии ГХН (40 мкМ): 1 - без ГХН; 2 - ГХН, 40 мкМ. Т - светопропускание, X; Ь - время. Стрелкой указан момент введения тромбина. ГХН вводился за 1 мин. до введения тромбина.

ДТ/ДТк, 7.

Рис. 5. Действие гипохлорита натрия на агрегацию тромбоцитов, индуцированную тромбином (0,1 ЕД/мл). С - концентрация ГХН, мкМ; ДТк и ДТ - степень агрегации тромбоцитов без ГХН и при введении ГХН.

среду. Мы изучали реакцию выброса с помощью флуоресцентного зонда - акридинового оранжевого. Как известно, акридиновый оранжевый закачивается в плотные гранулы тромбоцитов, но не флуоресцирует там [Межлумян А.Г., 1989; Попов Е.Г., 19873. При активации тромбоцитов, нагруженных АО, под действием тромбина (0,1 ЕД/мл) интенсивность флуоресценции резко возрастала за счет выброса АО из тромбоцитов во внеклеточную среду (рис.6). При введении ГХН (10 - 100 мкМ) в суспензию нагруженных АО тромбоцитов реакция выброса ослаблялась, а при увеличении концентрации ГХН до 0,5 мМ - полностью подавлялась (рис.7).

10 минут

Рис. 6. Типичные кинетические кривые тромбин-индуцированного выброса АО из тромбоцитов при действии ГХН. 1 - без ГХН; 2-10 мкМ ГХН; 3 - 50 мкМ ГХН; 4 - 100 мкМ ГХН; 5-500 мкМ ГХН. I -интенсивность флуоресценции, отн.ед.; 1 - время. Стрелкой указан момент введения тромбина (0,1 ЕД/мл). ГХН вводился за 1 мин. до введения тромбина.

AI/AI*, 7. 10080 60 40 20 о

О 20 40 60 ВО 100

С, мкМ

Рис. 7. Действие гипохлорита натрия на реакцию выброса в тромбоцитах, индуцированную тромбином (0,1 ЕД/мл). С - концентрация гипохлорита натрия, мкМ; Alk и Д1 - изменение интенсивности флуоресценции образцов без ГХН и при введении ГХН.

[МДА], отн. ед. 300

200

100

ПН _Т

1 1 2

Рис. 8. Содержание МДА в суспензии изолированных тромбоцитов при действии ГХН и тромбина. Уровень МДА в контрольном образце (К) принят за 100 отн. ед. 1 - действие ГХН, 10 мкМ (Р > 0,05 относительно К); 2 - действие ГХН, 20 мкМ (Р > 0,05 относительно К); 3 - действие тромбина, 0,04 ЕД/мл (Р < 0,05 относительно К); 4 -действие ГХН, 10 мкМ, и тромбина, 0,04 ЕД/мл (Р < 0,05 относительно 3); 5 - действие ГХН, 20 мкМ, и тромбина, 0,04 ЕД/мл (Р < 0,05 относительно 3).

Сильное ингибирующее действие оказывает ГХН и на циклокси-геназное ПОЛ в тромбоцитах при их активации тромбином (0,04 ЕД/мл). Содержание МДА в контрольном образце (без тромбина и без ГХН), в образце с тромбином без ГХН и в образцах с тромбином и ГХН в концентрациях 10 мкМ и 20 мкМ составило соответственно 100, 346 ± 59, 159 ± 34 и 152 ± 17 огн. ед. (содержание МДА в контрольном образце было принято за 100 единиц) (рис.8).

Таким образом, ГХН угнетает функциональную активность изолированных тромбоцитов. Концентрационные зависимости ослабления агрегации и реакции выброса заметно отличались друг от друга. При низкой концентрации ГХН (10 мкМ) ингибирующий эффект более выражен в случае реакции выброса. Мы полагаем, что подавление агрегации с одной стороны и угнетение реакции выброса и циклок-сигеназного ПОЛ с другой стороны обусловлены различными механизмами и не сводятся просто к инактивации тромбинового рецептора.

Модификация под действием гипохлорита натрия аминогрупп тромбоцитов и лейкоцитов. На основании физико-химических свойств ГХН можно предполагать, что он подавляет активность клеток крови, реагируя с аминогруппами клеточной поверхности. Мы проводили регистрацию аминогрупп флуоресцентным методом с использованием флуорескамина, дающего сильную флуоресценцию при образовании комплекса с первичными аминами 1АгпЬо1(1 I. , 19873.

Сначала в модельной системе была зарегистрирована флуоресценция комплекса флуорескамина с аминогруппами а-аланина. Получена линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации аланина в диапазоне концентраций от 5 до 50 мкМ. При обработке аланина гипохлоритом натрия получено значительное снижение интенсивности флуоресценции (рис.9). Далее флуорескамин вводился к клеткам. При обработке тромбоцитов ГХН в конечной концентрации 40 и 80 мкМ интенсивность флуоресценции снижалась и составляла соответственно 85 ±32 и 72 ± 4%. При этом тром-бин-индуцированная агрегация снижалась на 54 ± 2% и 69 ± 4% соответственно. Параллельно с исследованием модификации аминогрупп под действием ГХН в тромбоцитах исследовалась подобная модификация в нейтрофилах. При обработке нейтрофилов ГХН в конечной кон-

- 15 -

С2, мкМ

С1, мкМ

Рис. 9. Зависимость интенсивности флуоресценции флуорескамина от концентрации аланина (1) и хлораланика (2). С1 - концентрация аланина, мкМ; Сг - концентрация хлораланина, мкМ; 1<^лу - интенсивность флуоресценции, У..

центрации 1 мкМ флуоресценция комплекса флуорескамина с аминогруппами снижалась и составляла 80 ± 77.. Таким образом, при действии на нейтрофилы ГХН в концентрации 1 мкМ происходит модификация примерно 207. от общего количества доступных аминогрупп нейт-рофилов. Можно полагать, что модификация под действием ГХН аминогрупп нейтрофилов и тромбоцитов является начальным этапом изменения структуры мембран этих клеток, что, в свою очередь, ведет н изменению их функциональной активности.

Влияние компонентов плазмы, модифицированных гипохлоритом натрия, на агрегацию нативных тромбоцитов. При введении ГХН в ОТП возможно его косвенное действие - через модификацию компонентов плазмы. Возможность косвенного действия била ранее показана в нашей лаборатории [Мурина М.А.,19893: если ГХН предварительно добавлялся в плазму, а затем в эту плазму вводитесь на-тивнне тромбоциты, наблюдался сильный антиагрегационный эффект. Для выяснения природы компонентов плазмы, модификация которых определяет косвенное действие ГХН на тромбоциты в составе ОТП, нами было изучено влияние на агрегацию изолированных клеток бел-

ков сывороточного альбумина и фибриногена и аминокислоты алани-на. Этот выбор основан на том, что альбумин представляет собой главный по массе белковый компонент плазмы (до 4 X), фибриноген при агрегации тромбоцитов под действием многих индукторов формирует межклеточные молекулярные мостики (0,35 %), свободные аминокислоты содержатся в плазме в большом количестве (их суммарная концентрация в плазме составляет несколько мМ). При исследовании противоагрегационного действия компонентов плазмы, модифицированных ГХН, сопоставляли 2 образца. В опытном образце предварительно приготовленную смесь ГХН и концентрированного раствора исследуемого соединения вводили в суспензию нативных тромбоцитов. В контрольном образце ГХН вводился в заранее приготовленную смесь клеток и исследуемого соединения. При этом концентрация ГХН подбиралась такой, чтобы при его введении в смесь агрегация снижалась примерно на 50%. Все исследованные соединения, модифицированные ГХН, снижали тромбин-индуцированную агрегацию нативных тромбоцитов (Табл.1).

Таблица 1. Противоагрегационное действие компонентов плазмы,

модифицированных гипохлоритом натрия.

1 1 ■ АТ/ЛТк, % |

| СОЕДИНЕНИЕ [ГШ, | мк.Ч | ВВЕДЕНИЕ ГХН В СМЕСЬ КЛЕТОК И СОЕДИНЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ГХН В | РАСТВОР | СОЕДИНЕНИЯ |

| Альбумин; 4 X 300 | 31 + 4 68 + 6 |

| Алании; 1,2 мМ 35 | 59 + 2 58 ± 5 | (100 ± 10) |

| Фибриноген; 0,35 % 220 | 1 + 5 81 + 5 |

Примечание: число в скобках - степень агрегации, когда после ГХН в раствор аланина введен восстановленный глутатион (25 мкМ).

Известно, что при взаимодействии ГХН с аланином образуются хлораминовые производные. В этих производных хлораминовая группа может превращаться обратно в аминогруппу под действием восстановленного глутатиона [Thomas E.L., 19833. В наших экспериментах бьшо получено, что если в раствор аланина после ГХН ввести восстановленный глутатион, противоагрегационное действие модифицированного аланина снимается (Табл.1). Это позволяет предполагать, что противоагрегационное действие модифицированного аланина определяется хлораминовой группой. Таким образом, белки и аминокислоты плазмы являются, вероятно, основными компонентами, первичная модификация которых определяет косвенное противоагрегационное действие ГХН на тромбоциты в ОТП. В случае аланина эта модификация представляет собой образование хлораминовой группы.

Восстановление плазмой и ее компонентами агрегации тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия. Ранее в нашей лаборатории были получены косвенные данные о том, что в ОТП при введении ГХН протекает обратимое взаимодействие между клетками и компонентами плазмы [(.{урина М.А., 19893. Это указывает на возможность восстановления инактивированных клеток плазмой. Мы провели прямые исследования. Был получен эффект восстановления плазмой активности тромбоцитов, предварительно модифицированных ГХН. После кратковременной инкубации инактивированных тромбоцитов с нативной плазмой и последующей их отмывкой от плазмы агрегация клеток под действием тромбина полностью восстанавливалась (Табл.2).

В опытах по восстановлению активности тромбоцитов компонентами плазмы были исследованы те же вещества: фибриноген, альбумин, аланин. При добавлении к суспензии модифицированных тромбоцитов альбумина и аланина эффекта восстановления не наблюдалось. При добавлении к суспензии модифицированных тромбоцитов фибриногена степень агрегации значительно увеличивалась (Табл.2). Таким образом, нативная плазма эффективно устраняет модификации тромбоцитов, возникающие при прямом действии ГХН. Одним из компонентов, обуславливающих указанную способность плазмы, является фибриноген. Такое особое свойство фибриногена, возможно, связано с его способностью адсорбироваться на плазматической мембране.

- IB -

Таблица 2. Восстановление агрегации модифицированных тромбоцитов под влиянием плазмы и ее компонентов.

i-1-1-1-1-1-1

|ДЕЙСТВУЮЩИЙ|ПЛАЗМА i АЛЬБУМИН,|АЛАНИИ,|ФИБРИНОГЕН,|ОТМЫВКА| | АГЕНТ | | 4 % ¡1,2 мМ | 0,35 % | |

I-1-1-i-i-1-1

I lili II

| ДТ/ДТк, % |109±6 | 60±2 | 47±8 | 85±5 | 66±5 | | |(52±2)| (6342) |(52i3) | (52±3) | (52^3)\

I_i_i_i_¡-1-1

Примечание: числа в скобках - исходная степень агрегации модифицированных тромбоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Гипохлорит натрия (10 - 100 миМ) ингибирует в изолированных тромбоцитах способность к агрегации, реакцию выброса и циклоксигеназное перекисное окисление липидов, индуцированные тромбином. Реакция выброса и перекисное окисление липидов при низких концентрациях гипохлорита (10 мкМ) ингибируются сильнее агрегации. Вероятно, ингибирование этих процессов связано с различными типами модификации клеточных мембран.

2. Агрегация изолированных тромбоцитов, вызванная тромбином, подавляется сывороточным альбумином, фибриногеном, алани-ном, модифицированными гипохлоритом натрия. Косвенное действие гипохлорита при его введении в обогащенную тромбоцитами плазму является, в основном, результатом первоначальной модификации белков и аминокислот плазмы. Эта модификация заключается в образовании хлораминовой группы.

3. Нативная плазма и фибриноген восстанавливают агрегацион-ную способность тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия. Это явление может быть использовано при разработке способов хранения тромбоцитаркой массы.

4. Агрегация нейтрофилов и моионуклеарных лейкоцитов, индуцированная арахидоновой кислотой, ингибируется гипохлоритом натрия в концентрациях от 1 до 100 мкМ. Возможная причина этого состоит в ослаблении липоксигеназного переиисного окисления липидов в результате усиления гипохлоритом натрия конкурирующего циклоксигеназного перекисного окисления липидов. Стимуляция этого процесса наблюдается в нейтрофилах при определенных условиях.

5. Гипохлорит натрия вызывает модификацию аминогрупп плазматических мембран нейтрофилов и тромбоцитов, регистрируемых с помощью флуоресцентной метки флуорескамина. Модификация аминогрупп, возможно, существенна для перестройки клеточных мембран, определяющей изменение функциональной активности клеток при действии гипохлорита.

По теме диссертация опубликованы следующие работы:

1. Мурина H.A., Трунилина H.H., Рощупкин Д.И. Липидная пе-роксидация в лейкоцитах и изменение их агрегации при действии гипохлорита натрия. В кн.: "Электрохимические методы в медицине. Тезисы докладов.", Москва, 1991, стр. 12.

2. Мурина М.А., Трунилина H.H., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Ингибмрование реакции выброса и агрегации изолированных тромбоцитов гипохлоритом натрия. В кн.: "Эфферентные методы в медицине. Тезисы докладов.", Москва, 1992, стр. 14.

3. Трунилина H.H., Мурина М.А., Рощупкин Д.И. Липидная пе-роксидация в лейкоцитах, индуцированная гипохлоритом натрия. В кн.: "Биоантиоксидант. Тезисы докладов.Москва, 1993, т.1, стр. 51.

4. Зверева М.В., Мурина М.А., Трунилина H.H., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Стимуляция гипохлоритом натрия фагоцитарной активности лейкоцитов. В кн.: "Эндогенные интоксикации. Тезисы докладов.", Санкт-Петербург, 1994, стр. 178.

5. Мурина H.A., Трунилина H.H., Саркина Э.Э., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Влияние различных компонентов плазмы на модификацию гипохлоритом натрия агрегационной способности тромбоцитов. В кн.: "Эндогенные интоксикации. Тезисы докладов.", Санкт-Петербург, 1994, стр. 193.

6. Трунилина H.H., Мурина М.А., Зверева М.В., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Модификация гипохлоритом натрия сульфгид-рильных и аминогрупп в мембранах тромбоцитов. В кн.: "Эндогенные интоксикации. Тезисы докладов.", Санкт-Петербург, 1994, стр. 199.

7. Сергиенко В.И., Мурина М.А., Панасенко О.М., Трунилина H.H., Евгина СД Айдыралиев Р., Рощупкин Д.И. Молекулярно-кле-точные механизмы действия гипохлорита натрия на тромбоциты и ли-лопротеины. Вестнин РАМН, 1995, 3, стр. 48-S3.