Физико-химические механизмы действия на тромбоциты хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия

Мурина, Марина Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические механизмы действия на тромбоциты хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические механизмы действия на тромбоциты хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия"

Мурина Марина Алексеевна

На правах рукописи

РГб од

1 з ДЕК ш

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ НА

ТРОМБОЦИТЫ ХЛОРАМИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БИОГЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ГИПОХЛОРИТА НАТРИЯ

Биофизика - 03. 00. 02.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РФ

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сергиенко В.И.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор Кубатиев А.А., доктор физико-математических наук, профессор Рууге Э.К., доктор биологических наук, профессор Потапенко А.Я.

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится 2000 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д084.66.01. при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ по адресу: 119828 Москва, ул. М. Пироговская, д. 1 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины МЗ РФ.

Автореферат разослан " "_^'^_2000 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

д.б.н., профессор Азизова О.А.

Ет.цз,/,о , /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Изучение физико-химических механизмов мо-'ляции активности клеток крови биогенными хлораминами и гипохлоритом натрия шяется важным по ряду причин.

Во-первых, хлорноватистая кислота (ионизированная форма - гинохлорит-шон) продуцируется в организме фагоцитирующими клетками в реакции, катализи-емой миелопероксидазой. Как вторичные продукты этой реакции, при взаимодей-вии гипохлорита с биогенными аминами образуются хлораминовые производные 1ИНОКИСЛОТ и родственных соединений [KlebanofT, Clark, 1978; Thomas, 1995; Weiss al. 1982; Maeda, 1991]. Гипохлорит и хлораминовые соединения могут образовы-1ться при активации нейтрофилов локально в концентрациях до 0,1 мМ [Pero et al., >96]. Кроме взаимодействия с чужеродными агентами эти соединения могут оказы-|ть влияние на клетки крови. Таким образом, в организме возможно межклеточное аимодействие, заключающееся в изменении функций клеток крови под влиянием 1ГОЦИТОВ. Механизм действия хлораминовых соединений и гипохлорита натрия на гетки крови мало изучен. Известно, что хлораминовые производные биогенных со-шнений по сравнению с гипохлоритом гораздо слабее модифицируют эритроциты и :йкоциты [Wright et al., 1986; Grisham et al., 1984; Ikuo et al., 1996]. В последнее врез [Park et al., 1995; Marcinkiewicz et al., 1995; Kim et.al, 1996] получены сведения о im, что N-монохлортаурин способен снижать образование медиаторов воспаления зкрофагами (оксида азота, альфа-фактора некроза опухоли, простагландина Е?), тем 1мым защищая ткани от повреждения. К началу работы в литературе практически гсутствовали данные о молекулярно-клеточных механизмах действия гипохлорита и гораминнновых соединений на тромбоциты.

Во-вторых, в последнее время гипохлорит натрия, получаемый электрохими-;ским способом, предложен [Сергиенко с соавт., 1985-1996] как детоксицирующее )едсгво при эндо- и экзотоксикозах и находит применение в клинике. При внутри-:нном введении гипохлорита натрия могут образовываться хлораминовые произ-вдные биогенных соединений. В связи с этим возникает необходимость изучения одифицирующего действия как гипохлорита, так и хлораминов на компоненты кро-i; это действие может выступать в качестве побочного эффекта.

В-третьих, важно, что биогенные хлорамины, как установлено нами, оказывают сраженное противоагрегационное действие на тромбоциты. Актуальной проблемой ияется поиск и разработка новых эффективных препаратов противотромбоцитарно-) типа действия [Кубатиев с соавт., 1980-1999; Becker, 1992; Wu, 1996]. Поэтому ¡учение влияния биогенных хлораминов на функциональную активность тромбоци-)в представляет интерес с точки зрения перспективы получения нового антитромбо-гшрного препарата для предотвращения тромбозов, опосредованных тромбоцитами Цель работы - выяснение молекулярно-клеточных основ модификации струк-/ры и функций тромбоцитов биогенными хлораминами и гипохлоритом натрия; вы-зление свойств хлораминовых соединений, существенных для их использования в 1честве противотромбоцитарпого средства.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать закономерности изменений физико-химических свойств I функций тромбоцитов при действиии пшохлорита иатрия и хлораминовых соединений. В круг изучаемых свойств и функций входили агрегационное взаимодействие тромбоцитов, сфероидная трансформация их формы, способность аккумулировать вещества в цитоплазматические структуры, выброс содержимого цитоплазматических плотных гранул и циклооксигеназная пероксидация липидов.

2. Выяснить зависимость противотромбоцитарного эффекта хлораминовых соединений от их физико-химических свойств.

3. Исследовать физико-химические механизмы взаимодействия гипохлорита и хлораминов с различными химическими группами мембран клеток крови. Провести оценку соотношений констант скорости этого взаимодействия в модельных системах.

4. Изучить свойства Ы,Ы-дихлортаурина как возможного противотромбоцитарного средства.

Научная новизна работы. В диссертационной работе проведено систематическое исследование молекулярно-клеточных механизмов действия гипохлорита и хлораминовых соединений на тромбоциты, изучено действие гипохлорита натрия и хлораминов на лейкоциты и эритроциты.

Обнаружено явление ингибирования гипохлоритом натрия и хлораминовыми соединениями функциональной активности тромбоцитов, включая рецептор-зависимую агрегацию, секрецию плотных гранул, циклооксигеназное окисление липидов. Получены сведения в пользу эффективного нарушения гипохлоритом системы внутриклеточной транедукции сигнала в тромбоцитах. В результате проведенных исследований был установлен один из возможных первичных механизмов действия гипохлорита и хлораминов на клетки крови, а именно - модификация поверхностных сульфгидрильных и аминогрупп мембран этих клеток.

Показано, что изменение функций тромбоцитов происходит в результате прямого взаимодействия гипохлорита с тромбоцитами и за счет модификаций компонентов плазмы. К числу этих компонентов относятся главным образом белки и аминокислоты. Обнаружено явление восстановления нативной плазмой функциональной активности тромбоцитов, инактивированных гипохлоритом натрия. Основным восстанавливающим компонентом является фибриноген.

Для выяснения взаимодействия пшохлорита и хлораминов с различными химическими группами определены относительные константы скорости реакции гипохлорита натрия с активными группами некоторых аминокислот и пептидов, а также М,Ы-дихлортаурина с серосодержащими соединениями. Получено, что наибольшая константа скорости характерна для реакции исследуемых соединений с сульфгид-рильными группами.

Обнаружено, что действие хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы зависит от их структуры, молекулярной массы, молекулярного объема. Хлораминовые производные фенилаланина, глутамина, лейцина, имеющие значительную молекулярную массу (198,5-164,5 дальтон) и, соответственно, большой ван-дер-ваальсовый объем (0,169-0,151 нм3). оказывают приблизительно одинаковый иротивоагрегационный эффект. Противоагрегационный эффект других М-хлораминокислот резко возрастает с

'меньшением молекулярной массы соединений. Более сильное ингибирующее дейст-ме N-хлораминокислот с меньшей молекулярной массой можно объяснить их ¡заимодействием с химическими группами на плазматической мембране тромбоцита, терически недоступными для соединений с повышенной молекулярной массой.

Показано, что в качестве возможного противотромбоцитного средства перфективен М,М-дихлортаурин. Он получен в твердом состоянии, характеризуется вы-окой стабильностью. Ы,Ы-Дихлортаурин оказывает широкое противотромбоцитное (ействие: угнетает агрегационную активность тромбоцитов и секрецию плотных гра-[ул, вызывает дезагрегацию агрегированных тромбоцитов. На кроликах irt vivo пока-ано, что N.N-дихлортаурин оказывает выраженное угнетение агрегационной актив-юети тромбоцитов в тесте с рядом агонистов: коллаген, АДФ, адреналин.

Показано, что Ы,Ы-дихлортаурин при введении в кровь человека также эффек-ивно подавляет агрегацию тромбоцитов, как и общепринятые антитромбоцитарные грепараты аспирин и тиклопидин

Практическая значимость работы. Повышенная функциональная актив-юсть тромбоцитов играет ведущую роль в патогенезе артериальных тромбозов и индрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. Для предот-ращения и лечения таких состояний может требоваться генерализованное ингибиро-ание тромбоцитов. Инактивация тромбоцитов представляет интерес и с точки зрения совершенствования способов хранения тромбоцитарной массы, так как известно, что рок хранения тромбоцитарного концентрата в обычных условиях во многом ограии-ивается постепенной активацией клеток. N-Хлораминокислоты, также как и ацетил-алициловая кислота (аспирин), химически модифицируют плазматическую мембра-:у тромбоцитов. Это ведет к генерализованному ингибированию функциональной ктивности тромбоцитов, то есть ингибированию их активации независимо от приро-ы агониста. Обнаруженные закономерности противоагрегационного действия хло-аминовых производных аминокислот на тромбоциты могут быть использованы для азработки нового противотромбоцитарного лекарственного средства. Потенциально озможным кандидатом на эту роль является Ы,Ы-дихлортаурин, который характери-уется значительной химической устойчивостью, Н1\т-Дихлортаурин эффективно по-авляет начальную и конечную агрегацию тромбоцитов человека, и реакцию выброса одержимого плотных гранул. При введении М,М-дихлортаурина в цельную кровь че-овека значительное ингибирование агрегации тромбоцитов не сопровождается за-[етным повреждением эритроцитов. Важным достоинством М,М-дихлортаурипа сле-ует также считать его способность подавлять агрегацию спонтанно и экзогенно ак-ивированных тромбоцитов человека и вызывать распад образовавшихся агрегатов.

Полученные данные могут иметь практическое значение для оптимизации ме-ода непрямого электрохимического окисления крови, а также в клинической практи-е при разработке схем хранения тромбоцитарной массы для ее последующего пере-ивания. Результаты исследований следует учитывать при внутривенном использова-ии гипохлорита в качестве детоксиканта, чтобы избежать его вредного побочного ействия на клетки крови.

Экспериментальный материал, посвященный изучению механизмов действия япохлорита натрия на клетки крови, вошел в работу «Разработка и внедрение элек-

трохимических методов детоксикации в медицине», которая была отмечена Премпа правительства РФ в области науки и техники за 1996 г.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1 Всесо юзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на Всесоюзном совещания "Биоанти оксидант" (Черноголовка, 1983); на Всесоюзной конференции "Структурная динамик; биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторны: процессов" (Минск, 1988); на IV Всесоюзном съезде патофизиологов "Нарушение ме ханизмов регуляции и их коррекция" (Кишинев, 1989); на Всесоюзной конференцм "Электрохимические методы в медицине" (Дагомыс, 1991); на конференции "Эффе рентные методы в медицине" (Москва, 1992); на Всесоюзной конференции «Биоанти оксидант» (Москва, 1993); на Международном симпозиуме "Эндогенные интоксика ции" (Санкт-Петербург, 1994); на Международном симпозиуме "Физико-химически основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995); на симпозиум! "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 1995) на Всероссийской научно-практической конференции "Озон в биологии и медицине (Нижний Новгород, 1995); на International Symposium "Problems and trends о photobiochemistry" (Moscow, 1997); на I международном симпозиуме "Фундаменталь ные науки и альтернативная медицина " (Пущино, 1997); на V Российском нацио налыюм конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998); на V Международной кон ференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1998); на II Международном симпозиум! "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж

1998); на международной конференции "7th Erfurt Conference on Platelets" (Германия Эрфурт, 1998); на III Съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизико] "Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем" (Минск, 1998); на I Съезде Биофизиков России (Москва, 1999); на Национальной научно-практическо! конференции с международным участием "Свободные радикалы и болезни человека' (Смоленск, 1999); на Всероссийской конференции "Сорбционные электрохимические и гравитационные методы в современной медицине " (Москва

1999); на Российском Национальном конгрессе кардиологов "Кардиология, основан ная на доказательствах" (Москва, 2000); на II Российском национальном конгрессе п< патофизиологии (Москва, 2000); на IV Съезде Белорусского общественного объеди нения фотобиологов и биофизиков "Молекулярно-клеточные основы функциониро вания биосистсм" (Минск, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 58 работ. Получен« 3 патента РФ на изобретения.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литера туры, главы "Материалы и методы", 6 глав по результатам и их обсуждению, за ключения, выводов, списка цитированной литературы. Работа изложена на стра ницах, содержит 59 рисунков и 30 таблиц. Список литературы включает 286 найме нований работ отечественных и зарубежных авторов.

Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан, про анализирован лично автором. Часть исследований, составивших предмет диссерта ции, была выполнена при участии сотрудников лаборатории экспериментальной ге мосорбцни и окислительных методов детоксикации НИИ ФХМ, сотрудников кафед

>ы биофизики РГМУ, а также сотрудников Филиала института биоорганической хи-ши им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы содержатся данные по физико-химическим свойствам ги-юхлорита натрия и хлораминовых производных аминокислот, а также рассмотрены :труктура и функции тромбоцитов, механизмы их активации и агрегации, роль тром-юцитов в патогенезе сосудистых заболеваний. В конце обзора указываются цели и адачи исследования.

Материалы и методы

Получение хлораминовых производных аминокислот и тзурина. В работе ^пользовался гипохлорит натрия фирмы "Aldrich" и гипохлорит натрия, получаемый шектролизом 0,9 % хлорида натрия на аппарате ЭДО-4 [Мартынов и др., 1985]. N-{лораминокислоты получали при взаимодействии гипохлорита натрия с раствором 1Минокислоты в молярной концентрации, превышающей концентрацию ГХН на 10 %. ^,1Ч-Дихлортаурин получали при введении в раствор гипохлорита натрия (ГХН) рас-вора таурина в соотношении конечных концентраций 2:1. Образование N-хлор-1минокислот и дихлортаурина контролировали спектрофотометрически на спектрофотометре Ultrospec II "LKB Biochrom" или СФ-46 (РФ) по наличию в спектре по-лощения максимума 252-255 им для монохлорпроизводных и 300 нм для дихлор-фоизводных [Stelmaszynska, Zglczynski, 1974: Thomas et al., 1982]. Кониенфации ттпохлорита натрия, хлораминовых производных аминокислот и таурина определяли методом иодометрического титрования [Кудрявцев, Вячеславов, 1980].

Объекты исследования. Работа проводилась на клетках крови человека и крошка. Исследовались изолированные тромбоциты, которые выделяли, принимая за зснову методики, описанные в работе Bills et al. (1977), тромбоциты в составе обога-ценной тромбоцитами плазмы (ОТП), выделенные по Born (1962). Эритроциты изо-пфовали из крови путем трехкратного центрифугирования в течение 10 мин при 460 I в 10-кратном избытке забуференного физиологического раствора (142 мМ NaCl; 10 .iM Na2HP04; рН=7,35). Выделение мононуклеарных клеток, нейтрофилов и суммар-юй фракции лейкоцитов проводили по методикам, описанным Натвиг с соавт. (1980).

Методы исследования. В работе использовались следующие основные метода.

1. Кинетическая турбидиметрия для исследования агрегации тромбоцитов, лей-«щитов, агрегации и гемолиза эритроцитов.

2. Кинетическая нефелометрия для изучения агрегации эритроцитов (по типу ;топкообразования) и начальной агрегации тромбоцитов.

3. Кинетический хемилюминесцентный метод для регистрации содержимого тлотных гранул (выход АТФ) с использованием люциферин-люциферазной системы.

4. Флуориметрия для изучения аккумуляции зонда акридинового оранжевого в громбоцитах и процесса его выброса из цитоплазматических гранул, а также для определения количества аминогрупп (по реакции с флуорескамином) на поверхности клеток.

Регистрация агрегации тромбоцитов и лейкоцитов. Агрегация тромбоцитов и тейкоцитов регистрировалась турбидиметрическим методом Борна [Born. 1962] на

анализаторе агрегации фирмы «Биола» (Москва) и на агрегометре, собранном на баз электрофотометра КФК-2МП с использованием светового пучка с длинной волны 671 нм. Турбидиметрическое исследование агрегации тромбоцитов человека проводил! на люмиагрегометре "Platelet ionized calcium aggregometer" (P.I.C.A.) фирмы "Chrono log Corporation" (США). Количественным показателем агрегационной способносп клеток было изменение светопропускания их суспензии, регистрируемое через 5 ми нут после введения агониста, либо по мере выхода кривой изменения светопропуска ния на плато. Результаты представлены в виде отношения ДТ/ДТК, где АТК и ДТ - из менение светопропускания в контрольных и опытных образцах (рис. 1). Величина Д' характеризует количество клеток (приближенно пропорциональна), находящихся i составе агрегатов.

Начальную агрегацию тромбоцитов исследовали новым нефелометрическю методом, который заключается в регистрации увеличения интенсивности света, рас сеянного под малыми углами, при образовании мелких тромбоцитарных агрегата [Рощупкин, Соколов, 1995]. Количественным показателем агрегационной способно сти тромбоцитов служило максимальное изменение интенсивности рассеянного свет в результате их активации после выхода кривой изменения светорассеяния на плате Результаты представлены в виде отношения Д1р/Д1>.(К), где Д1Р и Д1р(к) - изменение све торассеяния в опытных и контрольных образцах.

В агрегометре образец тромбоцитов, находящийся в прямоугольной кювете освещался излучением гелий-неонового лазера с длиной волны 632,8 нм. Пучки рас сеянного света, распространяющиеся в пределах 0,5-7°, выделялись комбинации диафрагм. Согласно общей теории рассеяния света [van de Hülst, 1957], образовани мелких агрегатов, состоящих из нескольких десятков тромбоцитов, должно приво дить к усилению рассеяния света под малыми углами. При действии на изолирован ные тромбоциты агониста (10 мкМ АДФ в присутствии 0,2 мМ хлорида кальция) ин тенсивность рассеянного света постепенно возрастает, что свидетельствует о проте кании агрегации. В то же время агрегация изолированных тромбоцитов с помощьь турбодиметрического агрегометра Chrono-log не обнаруживается. Показано, что и составе ОТП начальный этап агрегации тромбоцитов с образованием мелких arpera тов турбидиметрическим методом не выявляется [Рощупкин с соавт., 1998]

Регистрация дезагрегации тромбоцитов. Дезагрегацию тромбоцитов изучал) при введении исследуемых веществ в момент достижения максимального значени агрегации; этот процесс регистрировался нефелометрическим, либо турбидиметриче

Рис. 1. Кинетические кривые АДФ индуцированной агрегации тромбоцито; кролика в составе ОТП: 1 - в контроле; 2 - после введении 1 мМ Ы-хлоралашша. Т - светопропускание, отн. ед. Стрелками указан момент введения АД<] (10 мкМ).

5 мин t , Время

ким методами. Количественным показателем дезагрегационной способности тромбоцитов служило максимальное уменьшение светорассеяния (светопропускания) их успензии после введения дезагрегирующего соединения. Результаты представлены в иде отношения Д1д/Д1А (ДТд/ДТд), где А1д (ДТД) и Д1А (ДТЛ) - изменение светорас-еяния (светопропускания) при дезагрегации и агрегации соответственно.

Регистрация изменения формы тромбоцитов. Трансформацию формы тромбо-штов по типу дискоид-сфероид, происходящую, в частности, при их активации, ис-ледовали методом, обоснованным Латимером [Latimer et al., 1977]. Метод преду-матривает измерение величины шумов светопропускания или уменьшения самой ветчины светопропускания. При перемешивании нативной ОТП ее светопропускание ;арактеризуется шумами, возникающими в результате нерегулярного изменения ори-нтации дискоидных клеток (рис. 2). При прекращении перемешивания (выключение гешалки) светопропускание постепенно снижается с выходом на плато в результате юстепенной дезориентации клеток, ранее ориентированных в потоке, и шумы исче-ают; при возобновлении перемешивания светопропускание скачком возрастает до [сходной величины. После введения АДФ и быстрого прекращения перемешивания :ветопропускание ОТП также уменьшается в результате как дезориентации, так и ок->углепия тромбоцитов. Согласно данным Латимера (1977), величина шумов, скачка ветопропускания в момент начала перемешивания отражают степень несферичности (анного образца клеток, являются мерой отношения большой и малой оси тромбоци-а. С другой стороны, в качестве показателя перехода клеток в округлое (активное) состояние использовали дТф (уменьшение светопропускания после введения АДФ и ¡ыстрого выключения мешалки) (рис. 2).

Регистрация продуктов пероксидации липидоп. Показателем протекания пе-эоксидации липидов (ПОЛ) в клетках служил уровень малонового диальдегида МДА), регистрируемый спектрофотометрически по его реакции с 2-тиобарбитуровой шелотой (ТБК) [Asakawa, Matsushita, 1980]. Регистрацию спектра поглощения ком-

Рис. 2. Типичные кинетические кривые изменения светопропускания после прекращения перемешивания ОТП в контрольных образцах (4,5,6) и в присутствии ГХН (1,4 мМ) (1,2,3);

а, б - прекращение и последующее начало перемешивания, в -момент введения 10 мкМ АДФ. Гипохлорит натрия вводили за 1 мин до прекращения перемешивания. Т - светопропускание,

t - время, с.

плекса МДА с 2-ТБК в диапазоне 500-550 им проводили на спектрофотометр Hewlett-Packard 8451 А.

Исследование реакции выброса цитоплазматических гранул и транспорта гранулярный аппарат в тромбоцитах. Реакцию выброса АТФ в тромбоцитах человек регистрировали на люмиагрегометре (P.I.C.A.) с использованием люмиреагента, сс держащего 0,008 мг люциферина и 0,88 ЕД d-люциферазы, параллельно с arpcrannci Количественным показателем степени секреции было выбрано максимальное измеш ние интенсивности хемилюминесценции (Д1х) после активации клеток. Результат представлены в виде отношения Д1х/А1х(К)> где Д1х и А1х(к) - изменение интенсивнс сти хемилюминесценции в опытных и контрольных образцах. В случае тромбоците кролика реакцию выброса исследовали флуориметрическим методом с использован» ем зонда акридинового оранжевого (АО) по методу Вютриха [Wuthrich et al.,198' Popov et al., 1988]. Флуоресценцию акридинового оранжевого возбуждали при 450 hs Регистрировали излучение, прошедшее через граничный светофильтр ЖС-17 (прс пускание при длинах волн более 480 нм). Для регистрации реакции выброса к 0,9 м суспензии нагруженных зондом тромбоцитов добавляли СаСЬ (1 мМ) и тромбин ( конечной концентрации 0,1 ЕД/мл). После введения тромбина регистрировали зав! симость интенсивности флуоресценции зонда от времени. Максимальное изменени интенсивности (Д1фл) служило количественным показателем реакции выброса.

Процесс транспорта в гранулярный аппарат тромбоцитов исследовали флуор» метрическим методом с использованием зонда АО. Показателем способности тро\ боцитов аккумулировать зонд была разность интенсивностей флуоресценции зонда плазме и обогащенной тромбоцитам плазме через 5 минут после введения зонд; Флуоресценция АО (в данной серии) возбуждали при 490 нм, излучение регистрирс вали при 522 нм на флуориметре фирмы "Perkin-Elraer".

Флуориметрическое определение модификации аминогрупп. Модификацш аминогрупп под действием гипохлорита в растворе аланина, суспензиях лейкоцитов тромбоцитов определяли флуоресцентным методом с помощью флуорогенного рег гента на первичные амины флуорескамина. Длина волны возбуждающего света 400 нм; измеряемая флуоресценция - излучение, прошедшее через светофильтр ЖС 17. Для проведения измерений 50 мкл 2 мМ раствора флуорескамина в ацетоне дс бавляли в кювету с 0,5 мл исследуемого раствора, либо суспензии клеток при интег сивном перемешивании. Интенсивность флуоресценции измеряли через 3 минут) после введения флуорескамина [Arnhold et al., 1988].

Спектрофотометрическое определение сульфгидрильных групп. В суспензи изолированных тромбоцитов сульфгидрильныс группы анализировали спекфофотс метрическим методом Эллмана (1959г.) с реагентом 5,5'-дитиобис-2-нитробензойно кислотой (ДТНБ). В этих опытах смешивали 1 мл суспензии тромбоцитов в фосфат ном буфере (рН 7,35) и 2 мл трис-HCl-буфера (рН 8,9) с ДТНБ в конечной конце! трации 10 мкМ. Через 10 или 40 мин инкубации при комнатной температуре проб] центрифугировали при 1850 g в течение 10 мин. Снимали спектр поглощения в с) пернатанте, а затем но оптической плотности при 420 нм и калибровочной криво! построенной по результатам аналогичных измерений с восстановленным глутатис ном, определяли содержание тиолов в анализируемом образце.

Регистрация агрегации эритроцитов. Агрегацию эритроцитов человека по типу итлютинации вызывали альциановым синим в конечной концентрации 0,001 % и регистрировали турбидиметрическим методом. Количественным показателем агрегаци-шной способности эритроцитов было максимальное изменение светопропускания ;успензии клеток после введения альцианового синего. Результаты представлены в шде отношения ДТ/ДТк, где ДТк и ДТ - изменение светопропускания в контрольных 1 опытных образцах.

Образование эритроцитарных стопок (монетных столбиков) изучали методом шнетической нефелометрии, который основывается на регистрации кинетики ослаб-1ения интенсивности диффузно-отраженного (рассеянного назад) света после превращения перемешивания эритроцитарной суспензии. Для такого рода измерений нами был собран нефелометр с использованием световодов, причем центральная часть юлокон световода использовалась для освещения объекта, а периферическая для пе-эедачи отраженного света на фотодетекгор (ФЭУ-38). Для количественной характеристики такой агрегации эритроцитов использовали величину максимального изменения интенсивности отраженного света после прекращения перемешивания фитроцитарной суспензии, либо время, за которое уменьшение интенсивности отра-кенного света после прекращения перемешивания суспензии составляло 50 % от ее максимального значения.

Кинетический гемолиз эритроцитов. Гемолиз эритроцитов исследовали турби-1иметрическим методом на агрегометре, собранном на базе электрофотометре КФК-2МП, и на анализаторе агрегации «Биола». Показателем гемолиза эритроцитов служило увеличение светопропускания их суспензии.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по Ькритерию ^тьюдента и непараметрическому критерию Вилкоксона. Данные приведены в виде федних арифметических значений с указанием их среднеквадратичных ошибок.

Результаты и их обсуждение Глава 1. Действие гипохлорита натрия на функциональную активность

тромбоцитов

Было обнаружено, что гипохлорит натрия (ГХН) ингибирует агрегацию тромбоцитов человека и животных, при этом концентрации гипохлорита были близки к концентрациям, применяемым в клинике [Федоровский с соавт., 1991]. Так, степень АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме ОГП), полученной из образцов крови кролика, предварительно проинкубированных ; ГХН (0,5-1,0 мМ), составляла примерно 50 - 30 % от агрегации клеток в контроле. Цалее были изучены закономерности действия ГХН на функциональные процессы в изолированных тромбоцитах.

1.1. Действие гипохлорита натрия на изолированные тромбоциты. Активность громбоцитов оценивалась по трем процессам: агрегации клеток, реакции выброса и диклооксигеназной ПОЛ. В качестве индуктора активации использовался тромбин '0,1 ЕД/чл). ГХН оказывает ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов (рис. 3). Достоверное снижение агрегации тромбоцитов на 10% наблюдалось при концен-грации гипохлоритом натрия 10 мкМ. При увеличении концентрации гипохлорита яатрия до 100 мкМ агрегация тромбоцитов практически полностью подавлялась. Та-

ким образом, в случае ОТП один из возможных путей противоагрегационного действия ГХН заключается в его прямом взаимодействии с клетками.

Известно, что тромбин, активируя тромбоциты, вызывает высвобождение содержимого гранулярного аппарата во внеклеточную среду. Мы изучали реакцию выброса с помощью флуоресцентного зонда - акридинового оранжевого (АО). Как известно, акридиновый оранжевый закачивается в плотные гранулы тромбоцитов, но не флуоресцирует там [Wuthrich et al., 1984]. По сравнению с внеклеточной средой в состоянии равновесия концентрация зонда в цитоплазме, исключая гранулы, более чем в 200 раз выше, а в плотных гранулах концентрация превышает внеклеточную примерно в 30 ООО раз (для тромбоцитов кролика) [Popov et al., 1988]. Известно, что для накопления АО в цитоплазму существенен мембранный потенциал (у тромбоцитов он равен -52 мВ). Механизмы, определяющие накопление зонда в гранулах, до конца не выяснены.

При активации тромбоцитов, нагруженных АО, под действием тромбина (0,1 ЕД/мл) интенсивность флуоресценции резко возрастала за счет выброса АО из тромбоцитов во внеклеточную среду. При введении ГХН (10-100 мкМ) в суспензшо нагруженных АО тромбоцитов реакция выброса ослаблялась (рис. 4), а при увеличении концентрации ГХН до 0,5 мМ - полностью подавлялась.

ДТ/ДТк-, %

120 г

Д1 /Д 1к, %

120

40 80

Гипохлорит, мкМ

Рис. 3.

40 80

Гипохлорит, мкМ

Рис. 4.

Рис. 3. Действие гипохлорита натрия на агрегацию изолированных тромбоцитов, индуцированную тромбином (0,1 ЕД/мл). ДТки ДТ - максимальное изменение свето-пропускания (степень агрегации) соответственно суспензии нативных клеток (контроль) и в опыте.

Рис. 4. Действие гипохлорита натрия на выход акридинового оранжевого из тромбоцитов, индуцируемый тромбином (0,1 ЕД/мл). Д1к и Д1 - максимальное изменение интенсивности флуоресценции акридинового оранжевого соответственно в нативных тромбоцитах и после действия гипохлорита натрия.

Сильное ингибирующее действие оказывает ГХН и на циклооксигеназную ПОЛ в тромбоцитах при их активации тромбином (0,04 ЕД/мл). Содержание МДА в контрольном образце (без тромбина и без ГХН), в образце с тромбином без ГХН и в

образцах с тромбином и ГХН в концентрациях 10 мкМ и 20 мкМ составило соответственно 100, 346 ± 59, 159±34 и 152 ±17 отн. ед. (содержание МДА в контрольном образце было принято за 100 едиииц).

Таким образом, ГХН угнетает функциональную активность изолированных тромбоцитов. Концентрационные зависимости ослабления агрегации и реакции выброса заметно отличались друг от друга. При низкой концентрации ГХН (10 мкМ) ин-гибирующий эффект более выражен в случае реакции выброса. Мы полагаем, что подавление агрегации, с одной стороны, и угнетение реакции выброса и циклооксиге-назной ПОЛ с другой, обусловлены различными механизмами и не сводятся просто к инактивации тромбинового рецептора.

В следующем разделе рассмотрим основные данные, касающиеся действия ги-похлорита на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы.

1.2. Действие гипохлорита натрия на тромбощггы в составе обогащенной тромбоцитами плазмы. В процессе активации тромбоцитов можно, в частности, выделить три основные стадии [Marguerie et al., 1980]: связывание агониста с рецептором на внешней стороне плазматической мембраны и переход клеток в округлое состояние; переход фибриногеновых рецепторов в активное состояние; формирование агрегатов в результате образования фибриногеновых мостиков между клетками. Вначале рассмотрим результаты возможного влияния гипохлорита натрия на переход клеток из дискоидного состояния в округлое методом турбидиметрии [Latimer et al., 1977]. В качестве показателя дискоид-сфероидного перехода клеток (в округлое состояние) использовали снижение ДТФ (величины скачка светопропукания в момент включения мешалки - стрелка б на рис. 2) и уменьшение шума светопропускания (ДТШ) (см. «Материалы и методы»). ГХН (1,4 мМ) не вызывал изменения формы у неактивированных клеток: до л после введения ГХН величина ДТФ составляла соответственно 2,0+0,4 н 2,1+0,4 отн. ед., а ДТШ- 3,0±0,5 и 3,2±0,6 отн. ед. После активации тромбоцитов агонистом АДФ в концентрациях 0,5-10 мкМ светопропускание ОТП в момент включения мешалки (стрелка 26 на рис. 2) возрастает скачком на гораздо меньшую величину и шумы при перемешивании гораздо слабее. Это свидетельствует о протекании дискоид-сфероидной трансформации формы клеток. Добавление ГХН в ОТП до внесения АДФ не влияло на этот процесс. Например, при концентрации АДФ 10 мкМ величины ДТФ и ДТШ составляли соответственно 0,1+0,1 и 0,2+0,01 отн. ед. без ГХН и 0,1+0,1 и 0,2±0,1 отн. ед. в присутствии 1,4 мМ ГХН. Таким образом, ГХН не влияет на начальную стадию активации тромбоцитов, приводящую к изменению формы клеток.

Ослабление агрегации тромбоцитов кролика наблюдается при введении гипохлорита натрия в обогащенную тромбоцитами плазму как до АДФ (табл. 1), так и через 1 мин после АДФ, когда тромбоциты находятся в активном состоянии: снижаются начальная скорость агрегации тромбоцитов (уменьшается тангенс угла наклона начального участка кривой возрастания светопропускания) и степень агрегации.

ГХН оказывает противоагрегационное действие и на тромбоциты человека, хотя в этом случае нужна более высокая концентрация. Например, АДФ-индуцируемая агрегация тромбоцитов в ОТП человека снижается на 20 ± 8 % при введении 2,3 мМ ГХН. Гииохлорит, введенный в ОТП после полной агрегации клеток, оказывает д е-загрегирующее действие на тромбоциты. Таким образом, противоагрегационное дей-

14 ,

ствие ГХН на ОТП проявляется при его введении до активации тромбоцитов, послс их активации агонистом АДФ, после их агрегации.

Таблица 1. Противоагрегационное действие гипохлорита натрия на ОТП при

его добавлении за 1 мин до введения АДФ в разных концентрациях.

Концентрация гипохлорита, мМ Степень агрегации (ДТ/ДТк), %

Концентрация АДФ, мкМ

10 30 50

0 100 100 100

1,0 42+4 53±8 60±12

2,15 20+3 26±4 31±5

В ОТП возможно как прямое действие гипохлорита натрия - непосредственно на тромбоциты, так и косвенное - через модификацию компонентов плазмы. В дальнейшем были изучены эти два возможных механизма действия.

1.3. Прямое и косвенное действие гипохлорита натрия на тромбоциты в составе ОТП. Возможность косвенного действия ГХН - через модификацию компонентов плазмы - была показана в следующем эксперименте. Если гипохлоритом предварительно обрабатывали только плазму, то степень агрегации нативных тромбоцитов в смеси с этой плазмой снижалась и составляла при концентрации ГХН 1 мМ 41+9 %. Примерно такой же противоагрегационный эффект обнаруживался при воздействии ГХН (конечная концентрация 1 мМ) на заранее приготовленную смесь тромбоцитов и плазмы (агрегация была равна 31± 5 % агрегации образца без воздействия ГХН). Из этого можно было заключить, что в ОТП противоагрегационный эффект ГХН в основном косвенный. Однако результаты экспериментов по варьированию в реконструированной ОТП (смесь изолированных тромбоцитов и плазмы) содержания плазмы и количества вводимого ГХН указывают на более сложное противоагрегационное действие ГХН на ОТП. Если концентрацию вводимого ГХН просто уменьшали в 2 раза (до 0,5 мМ), то его противоагрегационное действие на реконструированную ОТП ослаблялось, как и следовало ожидать, приблизительно на 50 % (агрегация составляла 66± 4 % от контроля). Однако при двукратном разведении плазмы изотоническим раствором хлорида натрия и одновременно двукратном уменьшении концентрации вводимого ГХН (конечная концентрация 0,5 мМ) получается иной результат. Выраженность противоагрегационного эффекта (в сравнении с образцом без разведения плазмы и при концентрации ГХН 1 мМ) изменялась незначительно, агрегация составила 39±5 %. Это можно было бы объяснить, наоборот тем, что противоагрегационное действие ГХН на тромбоциты в составе ОТП в основном прямое. Таким образом, представленные данные как бы противоречат друг другу: одни из них указывают на прямое противоагрегационное действие ГХН на тромбоциты в составе ОТП, а другие - на преобладание косвенного действия. В диссертационной работе объяснение этим, на первый взгляд, противоречивым результатам дано, исходя из предположения о том, что в ОТП гипохлорит реагирует и с тромбоцитами и с компонентами плазмы, и одновременно происходит обратимое взаимодействие между химическими группами тромбоцитов и плазмы. Наличие такого обратимого взаимодействия доказывается в опытах по восстановлению агрегационной способности модифицированных тромбоцитов нативной плазмой.

1.4. Восстановление плазмой и ее компонентами агрегации тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия. Получен эффект восстановления плазмой активности тромбоцитов, предварительно модифицированных ГХН. После кратковременной инкубации инактивированных тромбоцитов с нативной плазмой и последующей их отмывкой от плазмы агрегация клеток иод действием тромбина полностью восстанавливалась (табл. 2).

Таблица 2. Восстановление агрегации модифицированных гипохлоритом _натрия тромбоцитов под влиянием плазмы и ее компонентов._

Действующий агент Плазма Альбумин, 4% Аланин, 1,2 мМ Фибриноген, 0,35 % Отмывка

Степень агрегации (ЛТ/ДТК), % 109 ±6 (52 ± 2) 60 ±2 (63 + 2) 47 ±8 (52±3) 85 ±5 (52 + 3) 66 ±5 (52 ± 3)

Примечание: числа в скобках - исходная степень агрегации модифицированных тромбоцитов. Время инкубации гипохлорита натрия с тромбоцитами - 1 мин.

В опытах по восстановлению активности тромбоцитов компонентами плазмы были исследованы: фибриноген, альбумин, аланин. При добавлении к суспензии модифицированных тромбоцитов альбумина и аланина эффекта восстановления не наблюдалось. В случае фибриногена степень агрегации значительно увеличивалась (табл. 2). Таким образом, нативная плазма эффективно устраняет модификации тромбоцитов, возникающие при прямом действии ГХН. Одним из компонентов, обусловливающих указанную способность плазмы, является фибриноген, возможно, это связано с его способностью адсорбироваться на плазматической мембране. Явление восстановления агрегационной способности модифицированных гипохлоритом тромбоцитов может быть использовано при разработке способов хранения тромбоцитарной массы.

1.5. Влияние компонентов плазмы, модифицированных гипохлоритом натрия, на агрегацию нативных тромбоцитов. В разделе 1.3. было показано, что при введении ГХН в ОТП возможно его косвенное действие - через модификацию компонентов плазмы: если ГХН предварительно добавлялся в плазму, а затем в эту плазму вводились нативные тромбоциты, наблюдался сильный антиагрегационный эффект. Для выяснения природы компонентов плазмы, модификация которых определяет косвенное действие ГХН на тромбоциты в составе ОТП, было изучено влияние на агрегацию изолированных клеток белков сывороточного альбумина и фибриногена и аминокислоты аланина. Этот выбор основан на том, что альбумин представляет собой главный по массе белковый компонент плазмы (до 4 %), фибриноген (0,35 %) при агрегации тромбоцитов под действием многих индукторов формирует межклеточные молекулярные мостики, свободные аминокислоты содержатся в плазме в большом количестве (их суммарная концентрация в плазме составляет несколько миллимолей на 1 л). При исследовании противоагрегационного действия компонентов плазмы, модифицированных ГХН, сопоставляли 2 образца. В опытном образце предварительно приготовленную смесь ГХН и концентрированного раствора исследуемого соединения вводили в суспензию нативных тромбоцитов. В контрольном образце ГХН вводился в заранее приготовленную смесь клеток и исследуемого соединения. При этом концентрация ГХН подбиралась такой, чтобы при его введении в смесь агрегация снижалась примерно на 50 %. Все исследованные соединения, модифицированные ГХН, снижа-

ли тромбин-индуцированную агрегацию нативных тромбоцитов (табл. 3).Таким обра зом, белки и аминокислоты плазмы являются, вероятно, основными компонентами первичная модификация которых определяет косвенное противоагрегационное дейст вие ГХН на тромбоциты в ОТП.

Таблица 3. Противоагрегационное действие компонентов плазмы, _ модифицированных гипохлоритом натрия _

Соединение Гипохлорит, мкМ Степень агрегации ( ДТ/ДТК), %

Введение ГХН в смесь клеток и соединений Введение ГХН в раствор соединения

Альбумин; 4 % 300 31+4 68 ±6

Алании; 1,2 мМ 35 59 ±2 58 + 5 (100+10)

Фибриноген; 0,35 % 220 57 + 5 81 ±5

Примечание: число в скобках - степень агрегации, когда после ГХН в раствор

аланина введен восстановленный глутатион (25 мкМ).

Возникает вопрос, модификация каких химических групп обусловливает возникновение антиагрегационного действия указанных веществ. Известно, что при взаимодействии гипохлорита с соединениями, содержащими свободную аминогруппу, образуются соответствующие хлораминовые производные, в которых хлорамино-вая группа может восстанавливаться до аминогруппы в реакции с тиолами. [Thomas, 1983; Chesney et al., 1996]. В наших экспериментах было получено, что если в раствор аланина после ГХН ввести восстановленный глутатион, противоагрегационное действие модифицированного аланина снимается (табл. 3). Таким образом, противоагрегационное действие модифицированного аланина определяется хлораминовой группой. В дальнейшей работе мы исследовали физико-химические механизмы действия специально синтезированных хлораминовых производных биогенных соединений на клетки крови.

Глава 2. Действие хлораминовых производных биогенных соединений на различные функциональные процессы в тромбоцитах

Считается, что аминокислоты, таурин, присутствующий в нейтрофилах в высоких концентрациях (до 20-50 мМ), защищают собственные клетки от повреждающего действия гипохлорита. В исследованиях на эритроцитах и нейтрофилах установлено, что хлораминовые производные биогенных соединений цитотоксически менее активны, чем гипохлорит [Wright et al., 1986; Grisham et al., 1984; Ikuo et al., 1996]. Как уже отмечалось, на изолированных тромбоцитах была обнаружена антиагрегационная эффективность хлораминовых соединений, но оставалась не ясной возможность действия хлораминов на тромбоциты в составе ОТП и цельной крови, и эффективность их действия в сравнении с гипохлоритом натрия.

2.1. Противотромбоцитарное действие хлораминовых производных аминокислот и таурина. Соединения, содержащие аминогруппу, используются как ловушки активного хлора. В дальнейшем нами была изучена возможность защитного действия таурина и аминокислоты аланина при угнетении агрегации тромбоцитов человека и кролика гипохлоритом. В образцы ОТП с добавкой 10 мМ таурина или 5-10 мМ аланина или без них вводили раствор гипохлорита в конечной концентрации 0,5 мМ, а в контроле - физиологический раствор. Через 5 мин анализировали агрегацию с агони-

стом АДФ (10 мкМ). Алании и таурин применялись в сравнительно высоких концентрациях с тем расчетом, чтобы обеспечить перехват значительного количества гипо-хлорита на фоне конкуренции с активными химическими группами в плазме. Был получен неожиданный результат. Алании и таурин не только не защищали тромбоциты, но, наоборот, усиливали противоагрегационное действие гипохлорита примерно в 1,7 раза (табл. 4). Сами аминокислота и таурин в отсутствии гипохлорита не оказывали существенного влияния на агрегацию тромбоцитов. Совокупность этих данных указывает на то, что в отличие от других клеток крови тромбоциты весьма чувствительны к модифицирующему действию хлораминовьтх производных биогенных соединений.

Таблица 4. Угнетение агрегационной способности тромбоцитов гипохлоритом

натрия в присутствии аминокислот и таурина.

Добавленные соединения и их Образец Степень ингибирования

конечная концентрация тромбоцитов ((ДТК-ДТ)/ДТК),%

Алании (5-10 мМ) ОТП кролика 0± 10

Гипохлорит натрия (0,5 мМ) ОТП кролика 39 ±2

Алании (5-10 мМ), затем ОТП кролика 68+2,5

гипохлорит натрия (0,5 мМ)

Таурин (10 мМ) ОТП человека 0 + 5

Гипохлорит натрия (1 мМ) ОТП человека 41 ±4

Таурин (10 мМ), затем ОТП человека 71+4

гипохлорит натрия (1 мМ)

Ы,Ы-Дихлортаурин (0,25 мМ) ОТП человека 40 + 7

Далее была изучена продолжительность взаимодействия с компонентами обогащенной тромбоцитами плазмы на примере двух Ы-хлораминокислот. ОТП инкубировали с Ы-хлораминокислотами в конечной концентрации 1,5 мМ и через 0,5 и 5 мин иодометрическим методом определяли количество оставшегося активного хлора. Спектры поглощения иодо-крахмального комплекса, образующегося при окислении М-хлораминокислотами иодида калия до молекулярного иода, регистрировали на СФ-18 с использованием сферы Ульбрихта. Было получено, что через 0,5 и 5 мин содержание Ы-хлораланина в ОТП составило соответственно около 20 и менее 1 % от введенного количества, а содержание М-хлорфенилаланина было равно соответственно около 33 и менее 1 %. Таким образом, 70-80 % М-хлораминокислот реагирует с компонентами ОТП за 0,5 минуты, а практически полное взаимодействие хлораминов с ОТП происходит за 5 мин. Эти данные подтверждаются результатами, полученными при изучении зависимости противоагрегационного эффекта (степени ингибирования) хлораминов от продолжительности их инкубации с ОТП. Эффект ингибирования проявляется в значительной степени при предварительной инкубации 0.5 минут, а полностью при инкубации хлораминов с ОТП в течение 3-5 минут.

2.2. Влияние №хлораминокислот на транспорт, приводящий к накоплению акридинового оранжевого в гранулярном аппарате тромбоцитов. Угнетение агрегационной активности тромбоцитов исследуемыми хлораминами может происходить в результате модификации плазматической мембраны. Возникает вопрос, повреждают ли хлорамины внутриклеточные структуры в условиях ингибирования агрегационной

активности. Известно, что нативные тромбоциты быстро накапливают из внешней среды в плотные гранулы флуоресцентный зонд акридиновый оранжевый (АО), в результате чего интенсивность флуоресценции АО, добавленного к ОТП, снижается в несколько раз [Wuthrich et al., 1984; Popov et al., 1988]. Аккумуляция зонда нарушается, в частности, при хранении тромбоцитов в составе тромбоцитарного концентрата: на 5-6 сутки накопление АО снижается примерно на 50 % (рис. 5, кривая 3). Хотя транспорт АО является более устойчивым показателем по сравнению с агрегацией тромбоцитов (рис. 5, кривые 1,2), из данных литературы известно, что именно на этих сроках хранения (5-6 сутки) выживаемость тромбоцитов в организме после перели-

Рис. 5. Измение начальной и вторичной агрегации тромбоцитов человека, аккумуляции акридинового оранжевого в зависимости от сроков хранении кошдогграта тромбоцитов. Кривые 1, 2 - начальная и вторичная агрегация тромбоцитов (в % к тому же показателю на 1 сутки) при активации клеток АДФ (10 мкМ). Кривая 3 - измнение интенсивности флуоресценции акридинового оранжевого в суспензии тромбоцитов (в % к показателю на 1 сутки).

В наших опытах ОТП обрабатывали в течение 5 мин N-хлорглицином или N-хлорлейцином в концентрации 1,0 или 1,5 мМ, когда происходит значительное угнетение агрегации, и затем анализировали способность тромбоцитов аккумулировать зонд. Показателем этой способности была разность (Д1) интенсивностей флуоресценции зонда в бедной тромбоцитами плазме и в ОТП через 5 мин после введения зонда. Из таблицы 5 (где Д1к -величина в контроле), видно, что исследованные хлорамины не влияют на накопление АО. Можно полагать, что в наших опытах хлораминовые производные аминокислот оказывают противоагрегационное действие на тромбоциты только путем модификации их плазматической мембраны и поверхностных рсцеп-горных молекул, существенно не проникают внутрь клеток.

Таблица 5. Аккумуляция акридинового оранжевого в тромбоцитах кролика в

составе ОТП при действии хлораминовых производных аминокислот.

Соединение и его концентрация Д1/Д1к,%

N-Хлорглицин (1,0 мМ) 101+2,2

N-Хлорглицин (1,5 мМ) 102 ±2,8

N-Хлорлейцин (1,0 мМ) 104 ± 1,9

N-Хлорлейцин (1,5 мМ) 104 ±2,2

2.3. Ингибирование агрегации тромбоцитов в зависимости от структуры хло-

раминовых производных аминокислот. Для дальнейшего изучения механизма дейст-

вания концентрата начинает снижаться. ДТ/ДТк-,% Д1/Д1к, %

Сутки

вия хлораминов на примере И-хлорглицина и Ы-хлорлейцина были изучены концен-грационные зависимости (рис. 6).

(ДТК ДТ)/ДТК Рис. 6. Зависимость эффекта

ослабления агрегации тромбоцитов, индуцируемой 10 мкМ АДФ, от концентрации вводимых в ОТП К-хлорглицина (кривая 1) и Ы-хлорлейцина (кривая 2) при предварительной инкубации 5 минут.

N-Хлораминокнслота, мМ

Эти зависимости в интервале до 2 мМ аппроксимировались степенным законом вида: S-ЪСГ, где S = (ДТк — ДТ)/ДТк — степень ингибирования агрегации, С — концентрация, b и п- величины, постоянные для данного соединения.

Показатели степени п для N-хлорглицина и N-хлорлейцина равны соответственно 1,8 ± 0,49 и 1,6 ± 0,47. Хотя эти величины отличаются, разница между ними все-таки незначительна. Большая разница, примерно в 7 раз, свойственна параметрам Ь (1,34 ±0,21 и 0,2 ± 0,02 соответственно для N-хлорглицина и N-хлорлейцина), и именно его высокое значение определяет более сильный противоагрегатный эффект N-хлорглицина в сравнении с N-хлорлейцином. Близкое к 2 значения показателей степени п можно интерпретировать как свидетельство того, что каждая клетка утрачивает способность к агрегации после по крайней мере двух химических модификаций плазматической мембраны.

Противоагрегационное действие, измеряемое при фиксированной концентрации N-хлораминокислот, повышено не только в случае N-хлорглицина (рис. 7). Это действие было проанализировано в зависимости от молекулярной массы или объема молекул N-хлораминокислот. Ван-дер-ваальсов объем молекул, то есть объем, непроницаемый для атомов при тепловом движении, рассчитывали на основании данных об объеме атомных групп в таблицах Бонди [Bondi, 1964]. Объем атома хлора в хлора-миновой группе был принят равным 0,020 нм3. Группа соединений со значительной молекулярной массой (N-хлорлейцин, N-хлорглютамин, N-хлорфенилаланин) оказывают практически одинаковое противоагрегационное действие, не зависящее от молекулярной массы (рис. 7).

Ингибирование агрегации остальными исследованными соединениями (N-хлортреонин, N-хлораланин, N-хлорглицин) увеличивается с уменьшением молекулярной массы (объема молекулы). Известно, что гидрофобность аминокислот снижается с уменьшением молекулярной массы. Однако полученная нами разница в проти-

воагрегадионном действии N-хлораминокислот не определяется пидрофобностью ис-

Рис. 7. Зависимость эффекта ослабления агрегации тромбоцитов, индуцируемой 10 мкМ АДФ, от молекулярной массы N-хлорамино-кислот при предварительной инкубации 0,5 мин (1) и 3 мин (значки -■). Кривая 1 - приведены средние данные 5 измерений, ошибки измерений в целях упрощения рисунка не приведены.

Конечная концентрация N-хлораминокислот 0,7 мМ. Буквы а, б, в, г, д, е, ж обозначают хлорпроизводные глицина, аланина, серина, треонина, лейцина, глюта-мина и фенилаланина соответственно.

ходных аминокислот: хлораминовые производные полярных аминокислот серина, треонина и глютамина оказывают промежуточное действие между производными наиболее гидрофобной кислоты фенилаланина и наименее гидрофобной аминокислоты глицина. Таким образом, разницу в противоагрегационном действии хлорамино-кислот обусловливают размеры их молекул.

Обращает на себя внимание тот факт, что зависимость эффекта от молекулярной массы хлораминокислот очень резкая. Эффект увеличивается в 3-5 раз с уменьшением молекулярной массы примерно на 30 % при переходе от N-хлортреонина к N-хлорглицину (это соответствует уменьшению радиуса эквивалентного по объему шара на 15 %). Экспериментальные данные удается аппроксимировать в виде экспоненциальной зависимости величины /и(АТк/ЛТ) от молекулярной массы или объема молекул. Например, в случае молекулярной массы имеем: /п(ДТк-/ДТ) = Gexp(-lm), где Gui- константы. Это следует из того, что приближенно получается линейная зависимость /н[/и(ДТк/ДТ)] от указанных характеристик молекул (рис. 8). При этом величина (-/ ) равна тангенсу угла наклона прямой к оси молекулярных масс. Зависимость эффекта от молекулярной массы может быть объяснена тем, что отношение константы скорости реакции хлораминокислоты с тромбоцитами к константе ее взаимодействия с плазмой увеличивается с уменьшением молекулярной массы по экспоненциальному закону. Интерпретировать полученные результаты можно следующим образом. В плазме крови имеется значительное количество серосодержащих химических групп, с которыми, как известно [Thomas, 1982], может взаимодействовать хлораминовая группа. Поэтому противоагрегационный эффект хлораминовых производных различных аминокислот в ОТП отражает баланс их взаимодействия с тромбоцитами и другими компонентами. Более сильное ингиби-рующее действие низкомолекулярных хлораминокислот можно объяснить их взаимодействием с химическими группами, находящимися в узком кармане плазматической

(ДТк-ДТ)/ДТк,%

Молекулярная масса, дальтон

(-1

»,0

0,5

1.0

-1,5

-2,0

т, дальтон 100 120 "I

140

мембраны тромбоцита. Такие химические группы оказываются недоступными для хлораминокислот со значительной молекулярной массой.

Рис. 8. Линейная зависимость двукратного логарифма средних величин отношения ДТк/ДТ от молекулярной массы т (1) или молекулярного ван-дер-ваальсового объема V (2). Средние величины ДТК/ДТ - данные кривой 2 на рис. 7.

Буквы а, б, в, г - хлорпроизводные соответственно глицина, аланина, серина и треонина.

-2,5

80 100 120 140

V, 10'3 нм3

В организме одним из важнейших агонистов для тромбоцитов является коллаген. С его участием происходит внутрисосудистое тромбообразование на поврежденных атеросклеротических бляшках [\Уи, 1996; 1.ш е1 а1.,1998]. В этой связи специально было изучено действие различных хлораминов на коллаген-индуцируемую агрегацию тромбоцитов в ОТП. Все исследованные соединения ингибировали коллаген-индуцируемую агрегацию. Судя по величине действующей концентрации (0,6-0,7 мМ), это ингибировние было в среднем сильнее, чем в случае АДФ-индуцированной агрегации, когда приблизительно такое же ингибирование происходило при введении 1 мМ хлораминов. Характер зависимости противоагрегационного эффекта от молекулярной массы М-хлораминокислот при стимуляции тромбоцитов коллагеном аналогичен той же зависимости в случае АДФ-индуцируемой агрегации. (ДТК-ДТ)/ДТК,%

Рис. 9. Степень ингибирования агрегации тромбоцитов кролика в ОТП, индуцированной 10 мкМ АДФ, Ы-монохлораминокислотами с различным положением хлораминовой группы. Конечная концентрация М-хлораминокислот - 0,5 мМ.

С1 - еАКК

130 150

ш, дальтон

170

В дальнейшем было исследовано антиагрегационное действие на тромбоциты Ы-хлораминокислот в зависимости от положения аминогруппы относительно карбок-

сильной (рис. 9). Были подобраны пары Ы-хлораминокислот (Ы-хлор-а-аланин и № хлор-Р-аланин; Ы-хлорсерин и Ы-хлор-у-аминомасляная кислота (С1-ГАМК); Ы-хлорлейцин и Ы-хлор-е-аминокапроновая кислота) с одинаковой молекулярной массой, но с различным удалением аминогруппы от карбоксильной (на 1-5 атомов углерода). Наибольший антиагрегационный эффект наблюдается у Ы-хлораминокислот, у которых аминогруппа удалена от карбоксильной на 3-5 атома углерода. Можно предположить наличие отрицательно заряженной группы в месте взаимодействия хлораминов с мембраной тромбоцитов.

Ингибирование агрегации тромбоцитов в составе крови. Анализ агрегации тромбоцитов при введении хлораминов в цельную кровь проводили после удаления других клеток, как это огшсано выше. Для противоагрегационного действия хлорами-новых производных аминокислот при их введении в кровь и последующей стимуляцией тромбоцитов агонистом АДФ была характерна радикально иная картина по сравнению с ОТП. Эффекты соединений второй группы (с меньшей молекулярной массой) снижались до уровня, характерного для хлораминов первой группы, имеющих значительную молекулярную массу (см. рис. 7 и рис. 10). В итоге исчезла зависимость противоагрегационного эффекта от величины молекулярной массы. Для Ы-хлорфенилаланина при его введении в кровь характерно особое поведение. Примерно равный с другими соединениями эффект он вызывал при концентрации в два раза

Рис. 10. Зависимость эффекта ослабления агрегации тромбоцитов, индуцируемой 10 мкМ АДФ, от молекулярной массы Ы-хлораминокислот, предварительно добавляемых в цельную кровь. Конечная концентрация Ы-хлорфенилаланина 0,5 мМ, остальных Ы-хлораминокислот - 1 мМ. При концентрации Ы-

хлорфенилаланина 1 мМ наблюдалось полное подавление агрегации. Буквы а,б,в,г,д,е,ж - хлорпроиз-водные глицина, аланина, серина, треонина, лейцина, глютамина и фенилаланина соответственно.

Снижение противоагрегационного действия на тромбоциты в составе крови соединений с пониженной молекулярной массой, прежде всего Ы-хлорглицина, можно объяснить их дополнительным расходованием в процессе взаимодействия с другими клетками. Для выяснения роли лейкоцитов в этом взаимодействии было изучено действие ряда хлораминовых производных аминокислот на смесь ОТП и лейкоцитов суммарной фракции. Как видно из таблицы 6, лейкоциты в количестве, соответствующем их содержанию в крови, не оказывали влияния на противоагрегационный эффект соединений обеих групп.

меньшей (рис. 10). (ДТк-АТ)/ДТк,%

100 -80 -

60 -

20 -

100 120 140 160 180 200 Молекулярная масса, дальтон

Таблица 6. Противоагрегационное действие N-хлораминокислот на ОТП, добавляемых за 5 мин до введения АДФ (10 мкМ), в присутствии лейкоцитов.

Соединение (1 мМ) Противоагрегацнонный эффект ((ДТк- А Т)/ АТК).%

ОТП с лейкоцитами (8 106 клеток в 1 мл) ОТП без лейкоцитов

N-Хлорглицин 94±0,02 98+1,0

N-Хлораланин 88±1,4 86+6,1

N-Хлорсерин 46+5,7 46+6,2

N-Хлорлейцин 25+1,7 27±2,2

Можно предположить, что в крови соединения с пониженной молекулярной массой взаимодействуют с эритроцитами эффективнее соединений с повышенной молекулярной массой. Для проверки этого предположения была создана модельная система, в которой исследовалось взаимодействие N-хлораланина и N-хлорфенилалапина с иодидом калия в присутствии эритроцитов. Окисление иодида калия (до Ь) в системе контролировали по оптической плотности комплекса молекулярного иода с крахмалом. Анализировали влияние эритроцитов на окисление иодида калия исследуемыми хлораминами. При введении N-хлораланина и N-хлорфенилаланина в изучаемую систему окисление иона иодида составляло соответственно 16±2,9 % и 26±4,3 % (окисление иодида обоими хлораминами в отсутствии эритроцитов было одинаково и принято за 100 %). Таким образом, окисление иодида калия N-хлораланином происходит в меньшей степени. Отсюда следует, что он более эффективно может взаимодействовать с эритроцитами.

Глава 3. Взаимодействие гипохлорита натрия и хлораминовых соединений с биологически важными веществами и тромбоцитами

Судя по данным изучения чистых соединений [Morris, 1967; Weiss. 1982], ги-похлорит натрия и хлорамины могут реагировать со многими соединениями (химическими группами), имеющимися как в цельной крови и в обогащенной тромбоцитами плазме, так и в изолированных клетках. Для расшифровки функционального действия гипохлорита и хлораминов на клетки крови важно было установить, в какой степени модифицируется каждое активное соединение. Как известно, эта степень будет определяться соотношением констант скоростей взаимодействия соединений с гипохлоритом или хлорамином и соотношением их концентраций. К началу проведения работы в литературе отсутствовали данные по значениям констант скорости взаимодействия гипохлорита с рядом аминокислот и серосодержащих соединений.

3.1. Исследование относительных констант скорости взаимодействия гипохлорита натрия с аминокислотами и пептидами. Были изучены реакции гипохлорита натрия с билирубином, аланином, серином, восстановленным и окисленным глутагионом. В аланине и серине с гипохлоритом реагирует аминогруппа [Morris, 1967], а в глутатионе в реакцию должны вступать как аминогруппы, так и серосодержащие группы [Weiss, 1982].

Анализировали действие гипохлорита на смесь двух соединений: билирубина и аминокислоты или пептида. Разрушение билирубина контролировали но уменьшению оптической плотности при 450 нм. Концентрации амнокислот подбирали таким образом, чтобы разрушение билирубина в смеси происходило в небольшой степени (до 15 %). Оптическая плотность раствора билирубина (40 мкМ; pH 7,35) под действием гипохлорита (80 мкМ) снижалось до 25±3, 87±1,4, 89±0,7, 95±0,8, 85±4 % соответствегаю без аминокислот, в присутствии аланина (150 мкМ), серина (340 мкМ), восстановленного (45 мкМ) и окисленного (40 мкМ) глутатиона. Из этих данных видно, что, реагируя с гипохлоритом натрия, аминокислоты и глута-тион в сравнительно небольшой концентрации сильно подавляют разрушение билирубина; наиболее эффективно с гипохлоритом реагируют серосодержащие соединения. Для оценки соотношений констант скоростей взаимодействия исследуемых химических групп с ГХН учтем, что в смеси реакции описываются схемой: h к2 А + ГХН-> Продукты, (1) БР + ГХН-> Продукты, (2)

где А - аминокислота или пептид, БР - билирубин, к\ и ki - константы скоростей реакций.

Гипохлорит натрия вносится в смесь в ограниченном количестве и расходуется полностью. В смеси разрушалось небольшое количество билирубина, что означает выполнение неравенства [А] » кг [БР] ([А] и [БР] - концентрации активных химических групп аминокислот или пептидов и билирубина). При таком условии зависимость концентрации ГХН от времени определяется первой реакцией (1). Из общеизвестных формул [Панченков, Лебедев, 1961] кинетики реакции второго порядка получается, что по завершении реакций будет выполняться следующее равенство:

кг

/и ([БР] / [БР]0) = - /и{([А]0- [ГХН]0)/[А]о}. (3)

В этой формуле [БР]0 и [БР] - исходная и конечная концентрация билирубина; [ГХН]0 и [А]0 - исходная концентрация гипохлорита и активных групп в исследуемых соединениях.

Было принято, что в окисленном глутатионе 3 активные группы (1 дисульфидная и 2 аминогруппы) характеризуются одинаковой величиной к\. Аналогичное допущение сделано в отношении к\ для аминогруппы и сульфгидрильной группы восстановленного глутатиона. Расчет по формуле с использованием значений величин исходной и конечной концентрации билирубина, измеренных по оптической плотности (см. выше), показал, что величины к\ реакций с ГХН активных групп восстановленного глутатиона, окисленного глутатиона, аланина, серина и билирубина соотносятся примерно как 48 :6,9 : 5,5 : 2,4 :1. Полученное соотношение величин для аланина и серина хорошо согласуются с литературными данными: в случае аланина кх в 2,5 раза выше [Morris, 1967]. Наши данные о том, что константы скорости реакции гипохлорита с тиолыюй группой глутатиона примерно на порядок выше аналогичной константы для аминогруппы аминокислот, подтверждны другими авторами [Folkes et al., 1995].

3.2. Сравнительная эффективность взаимодействия N.N-дихлортаурина с различными серосодержащими группами. Известно, что хлораминовые соединения вступают в реакцию с серосодержащими группами, в то время как реакции хлорами-нов с аминогруппами протекают очень медленно [Morris, 1967]. Интересен вопрос, на сколько эффективно хлораминовые соединения реагируют с сульфгидрильными в сравнении с дисульфидными группами. Исследовалось ингибирование аналитической реакции окисления иодида калия (200 мкМ) НМ-дихлортаурипом (100 мкМ по активному хлору) при добавлении окисленного и восстановленного глутатиона, метиони-на. В водном растворе (при pH 3,5) окисление иодида калия в указанной реакции протекало сравнительно быстро, за несколько минут. Восстановленный глутатион в концентрации (150 мкМ) ниже концентрации иодида калия ингибировал окисление иодида на 90±0,7 %. Это указывает на более высокую константу скорости взаимодействия N.N-дихлортаурипа с сульфгидрилыюй группой глутатиона по сравнению. с иодидом. В противоположность этому с окисленным глутатионом N,N-дихлортаурин реагирует гораздо слабее: глутатион при его концентрации в 20 раз более высокой (3 мМ) не оказывал ингибирующего действия на окисление иодида в исследуемой системе. Взаимодействие К,Ы-дихлортаурина с дисульфидными группами окисленного глутатиона удалось обнаружить при pH 6-7, когда скорость реакции Ы,Ы-дихлортаурина с иодидом калия заметно снижалась. При этих условиях окисление иодида до иода наступало примерно через 0,5 часа. В присутствии окисленного глутатиона (3,0 мМ) образование продукта реакции молекулярного иода снижалось через 5 и 25 минут после начала реакции соответственно на 91±1,6 и 95±0,3 %. В описанных условиях N,N-дихлортаури11 реагировал также с метионином. Неожиданным было то, что существенное ингибирование (на 80 %) образования иода наблюдалось при концентрации метионина всего 20 мкМ. Возможно, в этом случае оказывают влияние вторичные реакции, протекающие между продуктом окисления метионина и иодидом. Вместе с тем ясно, что М,1Ч-дихлортаурин довольно эффективно взаимодействует с метионином.

Взаимодействие гипохлорита натрия с серосодержащими группами включает несколько последовательных реакций с образованием конечного продукта - шестивалентной серы, в итоге на один атом серы может расходоваться несколько молекул гипохлорита [Prutz, 1996; Folkes et. al., 1995]. Можно ожидать, что такого рода взаимодействия характерны и для хлораминов; этот вопрос мало изучен. В работе исследовалась стехиометрия взаимодействия N.N-дихлортаурина с серосодержащими соединениями: с сульфгидрилыюй и дисульфидной группами восстановленного и окисленного глутатиона и тиометильной группой метионина. Для сравнения были проведены аналогичные измерения для гипохлорита натрия. Получаемые стехиометриче-ские соотношения отражают полное взаимодействие, включая побочные реакции; эту стехиометрию следует называть кажущейся.

Опыт проводился следующим образом. В раствор исследуемого соединения вводились ЫЛ-дихлортаурин или гипохлорит в разных соотношениях. Через 5 минут после начала реакции в смеси определялся остаточный активный хлор методом иодо-метрического титрования. В данной системе убыль активного хлора происходит только в реакции с серосодержащими группами, так как хлор, прореагировавший с аминогруппой (до соответствующего N-хлораминопроизводного), остаётся активным хло-

ром и определяется нами как остаточный хлор. Стехиометрия определялась как максимальное количество молекул гипохлорита натрия либо активного хлора N,N-дихлортаурина, приходящееся на 1 молекулу серосодержащего соединения. Получено, что гипохлорит реагирует с сульфгидрильной группой в мольном отношении примерно равном (3,1±0,1) : 1, то есть с сульфгидрильной группой реагирует три молекулы гипохлорита натрия. Такая же стехиометрия наблюдается в реакции гипохлорита с тиометилыюй группой метионина (3,3±0,1) : 1, а в случае окисленного глута-тиона - (6,0 ±0,1): 1. Полученные данные по стехиометрии взаимодействия гипохлорита натрия с серосодержащими соединениями соответствуют данным литературы. В работе Prutz (1996 г.) было показано, что с восстановленным глутатионом в реакцию могут вступать 4 молекулы гипохлорита: одна молекула реагирует с аминогруппой, а три - с сульфгидрильной группой, окисляя ее до сульфоновой группы (-S03H). В промежуточных стадиях, при меньших концентрациях гипохлорита натрия, могут образовываться -SC1, сульфеновые (-SOH) и сульфиновые (-S02H) кислотные группы. При относительно высоких концентрациях восстановленного глутатиона (GSH), например в эритроцитах, GSH окисляется гипохлоритом до GSSG.

При взаимодействии активного хлора Ы,М-дихлортаурина с серосодержащими группами окисленного, восстановленного глутатиона и метионина, их мольные отношения составляли соответственно (4,1±0,2) : 1, ( 2,6±0,2) : 1, (1,4±0,1) : 1. Обращает на себя внимание отличие этих величин от соотношений, характерных для взаимодействия гипохлорита. Гипохлорит и КЫ-дихлортаурин не одинаково модифицируют серосодержащие группы: разное количество активного хлора участвует в реакции и, соответственно, различные конечные продукты могут образовываться.

Таким образом, суммируя наши данные и данные литературы [Шаронов с со-авт., 1988-1992; Arnhold et al., 1991; Prutz, 1996], можно представить картину взаимодействия гипохлорита и хлораминовых соединений с доступными химическими группами следующим образом. Повышенную реакционную способность эти соединения проявляют в отношении серосодержащих групп, а в случае гипохлорита и аминогрупп. Константа скорости взаимодействия гипохлорита с аминогруппой свободных аминокислот составляет 106-107 л/(моль'с) [Morris, 1967], а в случае сульфгидрильной группы глутатиона, как показали наши данные, примерно на порядок выше. При изучении действия исследуемых соединений на кровь и клетки крови важно учитывать модификацию их серосодержащих, в первую очередь сульфгидрильных групп. Однако необходимо знать, что эти группы могут находиться в скрытом состоянии в силу стерических, либо электростатических ограничений. В дальнейшей работе мы исследовали модификацию амино- и сульфгидрильных групп плазматической мембраны клеток крови.

3.3. Модификация сульфгидрильных и аминогрупп тромбоцитов при изменении их агрегационной активности гипохлоритом и хлораминовыми соединениями. Мембранные сульфгидрильные группы тромбоцитов играют важную роль в процессах адгезии и агрегации. Поэтому можно предположить, что химическая модификация серосодержащих групп плазматической ме.мбраггы тромбоцитов может привести к изменению ее структуры и инактивации поверхностных рецепторов, следствием чего будет угнетение агрегационной активности тромбоцитов в ответ на действие любого агониста.

Исследовали окисление сульфгидрильных групп и ингибирование начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом и Ы,Ы-дихлортаурином. ЭН-группы определяли спектрофотометрическим методом с использованием дитионитробензойной кислоты (ДТНБ), не проникающей внутрь клеток и реагирующей с химическими группами плазматических мембран. Этот выбор реагента обусловлен тем, что исследованные хлорамины также очень слабо проникают в цитоплазму. Вначале были изучены зависимости количества определяемых 811-групп от концентрации ДТНБ и длительности её взаимодействия с тромбоцитами. В изолированных тромбоцитах за 10 минут инкубации с 10 мкМ ДТНБ обнаруживалось около 1 наномоль БН-групп на 10 миллионов клеток. Далее оказалось, что количество определяемых сульфгидрильных групп повышается на 30-50 % при увеличении этой длительности от 10 до 40 минут; это количество возрастало также с ростом концентрации ДТНБ при данном времени инкубации (рис. 11). Такая закономерность отмечалась и ранее в других работах и объясняется медленным постепенным проникновением ДТНБ внутрь мембраны. В дальнейших опытах использовали ДТНБ в концентрации 10 мкМ, и количество БН-групп определяли при двух режимах инкубации: 10 и 40 минут. Действие исследуемого вещества регистрировали через 5 минут после их введения в образец тромбоцитов по завершении реакции.

Содержание БН-групп в мембранах тромбоцитов снижалось примерно на 50 % при концентрации гапохлорита или М,М-дихлортаурина 50-60 мкМ (рис. 12); дальнейшее увеличение концентрации модификаторов не сказывало значительного до-ЯН-группы, мкМ

вН-группы, мкМ

ДТНБ, мкМ Концентрация, мкМ

Рис.11. Рис.12.

Рис. 11. Зависимость концентрации БН-групп в тромбоцитах (1,710п клеток в 1 л) от концентрации ДТНБ. 1 и 2 - инкубация тромбоцитов с ДТНБ 10 и 40 минут.

Рис. 12. Концентрация БН-групп в тромбоцитах (2,3'1011 клеток в 1 л) в зависимости от концентрации гипохлорита натрия (1,3) и Ы,Ы-дихлортаурина (2, 4). Время инкубации тромбоцитов с ДТНБ (10 мкМ) соответственно 10 (1,2) или 40 минут (3, 4).

полнительного эффекта. Это говорит о том, что в клеточных мембранах только половина регистрируемых вН-групп доступна для исследованных соединений.

Анализировали также изменение агрегационной активности тромбоцитов после введения действующих соединений; количественной мерой этой активности было увеличение интенсивности рассеянного света через 2 минуты после добавления индуктора агрегации (начальная агрегация). Концентрационные зависимости ингибиро-вания агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия не отличались от аналогичных зависимостей в случае Ы,Н-дихлортаурина, если реакция вызывалась агонистом -АДФ. Резкое снижение агрегации примерно на 50 % наблюдалось при концентрации исследуемых веществ - 30 мкМ. При более высоких концентрациях (50-100 мкМ) исследуемого соединения происходило плавное и менее выраженное снижение активности тромбоцитов. При использовании в качестве индуктора агрегации ионов кальция сильный противоагрегационный эффект проявляется при значительно меньшей концентрации гипохлорита, чем Ы,Ы-дихлортаурина. Концентрация ГХН, при которой эффект ингибирования кальциевой агрегации составляет 50 %, в два раза меньше его концентрации, необходимой для такого же ингибирования агрегации, вызываемой агонистом АДФ. Таким образом, ингибирующее действие исследуемых соединений зависит от природы индуктора агрегации. В следующей главе остановимся на этом более подробно.

Все приведённые данные позволяют заключить, что сильный эффект ингибирования агрегационной активности тромбоцитов при низких концентрациях модифицирующих соединений обусловлен окислением доступных сульфгидрильных групп плазматических мембран тромбоцитов.

1фл» %

100

Рис. 13. Зависимость интенсивности флуоресценции флуорескамина от концентрации аланина (1) и хлораланина (2).

1фл - интенсивность флуоресценции.

20 40

Концентрация, мкМ

На основании физико-химических свойств ГХН можно предполагать, что 01 способен подавлять активность клеток крови, реагируя не только с сульфгидрильны-ми, но и с аминогруппами клеточной поверхности. Регистрировали аминогруппь флуоресцентным методом с использованием флуорескамина, дающего сильнук флуоресценцию при образовании комплекса с первичными аминами [АгпЬоМ сЧ а1 1987]. Сначала в модельной системе была зарегистрирована флуоресценция комплекса флуорескамина с аминогруппами а-аланина. Получена линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации аланина в диапазоне концентраций от :

до 50 мкМ. При обработке аланина гипохлоритом натрия получено значительное снижение интенсивности флуоресценции (рис. 13).

Далее флуорескамин вводился в суспензию клеток. При обработке тромбоцитов гипохлоритом в конечной концентрации 40 или 80 мкМ интенсивность флуоресценции снижалась и составляла соответственно 85+3 и 72±4 %. При этом тромбин-индуци-рованная агрегация снижалась на 54±2 и 69+4 % соответственно. Таким образом, модификация (наряду с тиолами) аминогрупп тромбоцитов под действием гипо-хлорита натрия может являться одним из начальных этапов изменения структуры мембран этих клеток, что в свою очередь ведет к изменению их функциональной активности.

3.4. Особенности ингибирование начальной агрегации тромбоцитов исследуемыми соединениями при действии разных агонистов. Активация тромбоцитов может развиваться по различным механизмам в зависимости от природы стимула. Имеются сведения, что процесс активации тромбоцитов адреналином, в отличие от АДФ, включает вход внутрь клетки ионов кальция из внешней среды [Han, 1983].

На рис. 14 представлены концентрационные зависимости действия ДТНБ (реагента, модифицирующего сульфгидрильные группы) на начальную агрегацию тромбоцитов при различных механизмах её индукции. Интересен тот результат, что агрегация тромбоцитов, активируемых ионами кальция (кривая 1) и адреналином (кривая 2), подавлялась под влиянием ДТНБ эффективнее, чем в случае их активации АДФ. Можно предположить, что усиленное ингибирование агрегационной активности тромбоцитов ДТНБ при действии на них индукторов, связанных с участием входа Са2+ внутрь клеток, осуществляется за счёт модификации сульфгидрильных групп кальциевых каналов.

А1р /А1р(к> %

100

Рис. 14. Зависимость угнетения начальной агрегации тромбоцитов от концентрации ДТНБ.

1, 2 и 3 - стимуляция тромбоцитов (после их инкубации с ДТНБ 1 мин) соответственно хлоридом кальция (3 мМ), адреналином (1 мкМ) и АДФ (10 мкМ).

Д1р и Д1р(к) - соответственно изменение интенсивности рассеянного света в опытных и контрольных образцах клеток.

0 20 40 60 80

ДТНБ, мкМ

AIp /Л1р(к), %

Д1р/Д1р(к> %

100

О 20 40 60 80 N-Хлораланин, мкМ

О 20 40 60 80

Гипохлорит натрия, мкМ

Рис. 15.

Рис. 16.

Рис. 15. Зависимость угнетения начальной агрегации тромбоцитов от коицен трации гипохлорита натрия. 1, 2 и 3 - стимуляция тромбоцитов (после их инкубации i гипохлоритом натрия 1 мин) соответственно хлоридом кальция (3 мМ), адреналине» (1 мкМ) и АДФ(ЮмкМ).

Рис. 16. Зависимость угнетения начальной агрегации изолированных тромбо цитов от концентрации N-хлораланина. 1, 2 и 3 - стимуляция тромбоцитов (после и; инкубации с хлораланином 3 мин) соответственно хлоридом кальция (3 мМ), адрена лином (1 мкМ) и АДФ (10 мкМ).

Далее исследовали действие гипохлорита натрия и N-хлораланина на началь ную агрегацию изолированных тромбоцитов кролика при двух типах их стимуляции использовалась либо АДФ, которая способна также вызывать округление клеток, либо адреналин и хлорид кальция, действующие без округления клеток. Обнаружено что выраженность противоагрсгационного действия ГХН значительно зависела oí механизма активации клеток (рис. 15). В случае активации тромбоцитов адреналино\ (кривая 2) или ионами кальция (кривая 1) зависимость ингибирования агрегации от концентрации ГХН были сходны. При этом сильный эффект ингибирования arpera-ционной активности тромбоцитов проявлялся при значительно меньшей концентрации ГХН, чем в случае активации клеток АДФ.

Интересно отметить, что концентрационные зависимости ингибирования агрегации клеток N-хлораланином (рис. 16), в отличие от действия ГХН, были практически одинаковые при активации тромбоцитов АДФ (кривая 1), адреналином (кривая 2] или ионами кальция (кривая 3).

Полученные выше данные о противоагрегационном действии ДТНБ сопоставим с действием на тромбоциты ГХН и N-хлораланина: в 2-3 раза более выраженный противоагрегационный эффект обнаруживался при действии на тромбоциты и ДТНБ, и ГХН в случаях активации клеток теми агонистами, которые не вызывают их округ-

ления. В литературе есть указания на то, что для стимуляции тромбоцитов такими агентами требуется активация кальциевых каналов их клеточных мембран [Doni, 1993]. Поэтому не исключено, что усиленное противоагрегационное действие ГХН и ДТНБ представляет собой изменение кальциевых каналов, заключающееся в модификации их SH-rpynn. Обычное ингибирующее действие ДТНБ, гипохлорита и хлора-минов связано, скорее всего, с модификацией иных тиоловых групп плазматических мембран тромбоцитов.

Глава 4. Действие 1Ч,ГЧ-дихлортаурина на тромбоциты человека

4.1. Получение твердого стабильного препарата N.N-дихлортаурина. Сердечнососудистые нарушения являются одной из основных причин заболеваемости и смертности людей в наиболее продуктивном возрасте. Практически все болезни сердечнососудистой системы сопровождаются нарушениями агрегатного состояния крови и прежде всего агрегационной способности тромбоцитов. Острое повышение активности тромбоцитов является главной причиной развития тромбозов и синдрома диссе-минированного внутрисосудистого свертывания крови. В последние годы достигнуты некоторые успехи в борьбе с этими осложнениями путем внутрисосудистого введения тромболитиков и дезагрегантов. При этом только некоторые из этих средств действуют непосредственно на тромбоциты, подавляя их активность. К таким средствам может быть отнесен аспирин, подавляющий активность тромбоцитов, когда их активация происходит по циклооксигеназному пути. Аспирин относится к группе проти-вотромботических средств, действие которых обусловлено химической (ковалентпой) модификацией тромбоцитов. Между тем универсальное средство для инактивации тромбоцитов должно удовлетворять следующим требованиям: необходимо модифицировать тромбоциты необратимо; модификация должна идти таким путем, чтобы ингибировались все типы активации и функциональной активности тромбоцитов; соединение должно индуцировать дезагрегацию агрегированных тромбоцитов [Becker, 1992,1993].

Этим требованиям удовлетворяет класс хлораминовых производных биогенных соединений. Наиболее перспективным противотромботическим средством, проявляющим активность на основе своих противотромбоцитарных свойств, является дихлораминовое производное таурина (2-аминоэтансульфоновой кислоты). Таурин представляет собой продукт превращения цистеина и содержится в значительном количестве в нейтрофилах. N.N-Дихлортаурин имеет следующую формулу:

СН2—СН2—S03H

С1—N—С1.

Характерное свойство ЫД^-дихлортаурина, выделяющее его из всех биогенных хло-раминов, - высокая стабильность. Это свойство обусловлено следующими структурными особенностями: (1) в отличие от хлораминовых производных аминокислот, пептидов и родственных соединений, в которых протекает реакция хлораминовой группы с карбоксильной, сульфоновая группа таурина не активна; (2) в N,N-дихлортаурине не происходит дезаминирование вследствие реакции с участием атомов водорода и хлора хлораминовых групп.

Разработана технология получения (в реакции с гипохлоритом натрия) стабильного соединения - Ы,М-дихлоргаурина. Впервые это вещество получено в виде

твердого препарата. Синтез Ы,1Ч-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты осуществляется путем введения раствора 2-аминоэтансульфоновой кислоты (таурина) в раствор гипохлорита натрия из расчета 2 моля активного хлора на 1 моль этой кислоты; полученный таким образом раствор М,Ь'-дихлортаурина подвергался лиофилизации. После хранении твердого порошка Ы,Ы-дихлортаурина (до 1 года), с последующим растворением в воде, спектр поглощения полученного раствора содержал характерную полосу поглощения (рис. 17, кривая 2), которая практически совпадала с соответствующей полосой в спектре поглощения свежеприготовленного раствора N,>1-дихлортаурина (рис. 17, кривая 1).

Рис. 17. Спектры поглощения свежеприготовленного раствора НЫ-дихлортаурина (М,Ы-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты) (1) и раствора (2), приготовленного из твердого образца К,К-лихлортаури-

на, хранившегося 10 месяцев при +4 °С.

О - оптическая плотность.

260

280 300 320 Длина волны, им

Была проведена процедура получения сухих препаратов М-монохлортаурипа, М-хлор-е-аминокапроновой киелты, Ы-хлораланина, И-хлорлейцина. Во всех случаях к окончанию процесса лиофилизации в исследуемых образцах активный хлор не регистрировался.

4.2. Противоагрсгационное действие хлораминовых производных таурина и аминокислот на нативные и предстимулированные тромбоциты человека. В некоторых образцах ОТП человека тромбоциты проявляли хотя и слабую (начальная скорость агрегации примерно в 5-10 раз меньше скорости агрегации при введении 0,4-2 мкМ АДФ), но вполне заметную способность к агрегации без введения агониста извне. Вероятно, в таких образцах тромбоциты активировались в результате действия трудно контролируемых факторов, приводящих к высвобождению агонистов, так как хорошо известно, что в ходе агрегации тромбоцитов в составе ОТП человека образуются соединения, стимулирующие нативные клетки. В кровеносных сосудах лишь часть тромбоцитов, контактирующих с поврежденным участком, может непосредственно активироваться тканью, а остальные клетки стимулируют друг друга [\Уи, 1996]. Это побудило провести исследование ответа предварительно стимулированных тромбоцитов на введение хлораминов. Противоагрегационное действие М-хлораминокислот на нативные и предстимулированные тромбоциты человека проявлялось через 0,5 мин после введения К-хлораминокислот в конечных концентрациях 1,5-3,0 мМ в ОТП и зависло от их структуры: Ы-хлораланин более эффективно инги-бировал агрегацию, чем Ы-хлорфенилаланин. Кроме того, в обсуждаемых условиях агрегация прсдстимулированных тромбоцитов подавлялась обоими хлораминами не-

сколько слабее, чем агрегация нативных клеток. Увеличение продолжительности взаимодействия ОТП человека с К-хлорамшкжислотамн до 5 мин (инкубация проходила при 37° С) привело, во-первых, к резкому усилению их противоагрегационного действия как на нативные, так и на предстимулированные тромбоциты. Ингибирова-ние агрегации тромбоцитов на 40-50 % проявлялось при концентрации исследуемых хлораминов и активного хлора в М,М-дихлортаурине 0,5 мМ. Это трудно объяснить лишь тем, что при выдерживании 5 мин с тромбоцитами дополнительно взаимодействует остаток хлораминов, поскольку основная их часть реагирует за период 0,5 мин. Имеются данные, что первичные продукта взаимодействия серосодержащих групп с хлораминами могут сравнительно медленно превращаться во вторичные продукты. Не исключено, что именно этот процесс обусловливает значительное увеличение противоагрегационного эффекта при выдерживании ОТП с хлораминами. Во-вторых, продолжительная инкубация ОТП с хлораминами (5 мин) привела к исчезновению зависимости их противоагрегационного действия от структуры: агрегация как пред-стимулированных, так и нативных тромбоцитов в этом случае в одинаковой степени подавлялась Ы.Ы-дихлортаурином, хлорпроизводными аланина и фенилаланина. В-третьих, хлораминовые производные аминокислот и таурина одинаково эффективно подавляли агрегацию предстимулированных и нативных тромбоцитов.

4.3. Подавление секреции ЛТФ тромбоцитами человека под действием хлора-миновых производных аминокислот и таурина. Типичные кинетические кривые изменения интенсивности хемилюминисценции системы люциферин-люцифераза (лю-миреагента) в ОТП при введении АДФ представлены на рис. 18. Вначале наблюдался непродолжительный латентный период, затем происходило возрастание этой интенсивности, отражающее высвобождение АТФ из плотных гранул и пропорциональное концентрации АТФ. В опыте ОТП выдерживали с хлораминами 5 мин, затем добавляли люмиреагент и через 1-2 мин вводили АДФ. Угнетение секреции хлораминами происходило уже при их концентрации по активному хлору 0,25 мМ и не зависело от их структуры (табл. 7). Более чем на 50 % секреция подавлялась Ы-хлораминами в концентрации 0,5 мМ, а Ы^-дихлортаурином - 0,25 мМ. Исходные соединения тау-рин и фенилаланин в концентрации 0,5 мМ не оказывали влияния на секрецию.

ОТН

1х,

Рис. 18. Кинетические кривые изменения интенсивности хемилюминесцен-ции (1Х, отн.ед) люциферин-люциферазного люмиреагента в ОТП человека.

1 - контроль; 2 - после выдерживания ОТП 5 мин с Ы^-дихлоргаурином (0,25 мМ).

Стрелками указан момент введения АДФ (4 мкМ).

3 мин Время -[_>

Таблица 7. Угнетение активности тромбоцитов человека в составе ОТП при её _инкубации с Ы-хлораминами 5 мин при комнатной температуре._

Вид Степень секреции (Д1х/А1х(ю) или агрегации, %

активности Все Ы-хлорамины, Ы-Хлор- >1-Хлорфенил- Ы,Ы-Дихлор-

мМ аланин, мМ аланин, мМ таурин, мМ

0,25 0,5 0,5 0,5 0,25

Секреция 49+15 38±13 40±11 31±13 39±15

Агрегация 86±4 73+7 75±6 66+7 78±8

Параллельно секреции на тех же образцах ОТП исследовали также эффект подавления агрегации тромбоцитов, учитывая, что в этом случае использовались высокие концентрации АДФ и ОТП выдерживали при комнатной температуре. Противоаг-регационный эффект, как и в предыдущей серии экспериментов при несколько иных условиях, не зависел от структуры хлорамипов (табл. 7). Однако в условиях, использованных для изучения секреции, хлорамины оказывали более слабое противоагрега-ционное действие (суммарные данные при концентрации по активному хлору 0,5 мМ, см. табл. 7), чем при инкубации ОТП с хлораминами при 37° С и одновременном использовании более низких концентраций АДФ. Вопрос о том, температурный режим или концентрация агониста определяют указанную разницу, остается открытым. Интересно, что в одинаковых условиях ингибирование секреции АТФ в тромбоцитах, вызванное хлораминами, было сильнее (на 60-70 % при концентрации по активному хлору 0,5 мМ), чем ингибирование агрегации (на 25-35 %) (табл. 7).

4.4. Действие >Ш-дихлортаурина на циклооксигеназную пероксидацию арахи-доновой кислоты в тромбоцитах. Исследовали влияние Ы,Ы-дихлортаурина на циклооксигеназную ПОЛ в тромбоцитах при их активации тромбином (0,06 ЕД/мл). Содержание МДА в контрольном образце было принято за 100 отн.ед. (суспензия тромбоцитов без тромбина), в образце с тромбином без ЫД^-дихлортаурина и в образцах с тромбином и Ы,Ы-дихлортаурином в концентрациях 37,5 мкМ и 50 мкМ уровень МДА составил соответственно 199±20 и 152+13, 122+15 отн. ед. Ы,Ы-Дихлортаурин в более высоких концентрациях (75 мкМ) снижал уровень циклооксигеназной ПОЛ в нативных тромбоцитах и полностью блокировал тромбин-индуцированный прирост уровня МДА.

Сравнивая действие Ы,К-дихлортаурина на агрегацию тромбоцитов и ферментативное ПОЛ в клетках при активации их тромбином, следует отметить, что эти процессы ингибируются неодинаково. НЫ-Дихлортаурин в низких концентрациях (12,5-25 мкМ) подавляет агрегацию тромбоцитов, тогда как уровень циклооксигеназной ПОЛ при этом не изменяется.

4.5. Дезагрегация тромбоцитов человека под действием К1Ч-дихлортаурина. Важным показателем эффективности антитромбоцитарных препаратов служит не только их противоагрегационное действие, но и способность вызывать распад уже образовавшихся агрегатов. Возможность распада тромбоцитарных агрегатов, так называемая дезагрегация тромбоцитов, исследовалась путем введения исследуемых соединений в момент максимальной агрегации (рис. 19). ЬШ-Дихлортаурин, введенный в ОТП в момент максимальной (спонтанной или АДФ-индуцированной) агрегации, вызывает практически полную дезагрегацию клеток.

1Ч,ГУ-Дихлортаурин

Рис. 19. Типичные кинетические кривые начальной агрегации (изменение интенсивности рассеянного света) тромбоцитов человека в составе ОТП. Д1А и Д1д - степень соответственно агрегации и дезагрегации. Фрагменты кривых 1 и 2 - после дополнительного введения (вторая стрелка) соответственно физиологического раствора и 0,5 мМ N,>1-дихлортаурина. Индуктор агрегации - 0,4 мкМ АДФ.

1 , Время

Таблица 8. Дезагрегационное действие N.N-дихлортаурина на

А1а\ Д1д

1 \ 2

Вид агрегации Степень дезагрегации тромбоцитов, %

тромбоцитов КМ-Дихлортаурин; 0,5 мМ Цитрат; 5 мМ

Спонтанная 85+4 100

Индуцированная АДФ; 0,4 мкМ 96±3 75±5

Примечание: результаты представлены в виде отношения Д1д/ Д1А, где Д1л и Д1д - амплитуды дезагрегации и агрегации соответственно (рис. 19).

Известно, что агрегаты тромбоцитов формируются путем образования межклеточных фибриногеновых мостиков. Для связывания фибриногена с рецептором (белок GP Ilb/IIIa) на мембране тромбоцитов и стабильности этого комплекса необходимы ионы кальция [Smith, 1994]. Связывание С а2* в области межклеточных взаимодействий может привести к распаду уже образовавшихся агрегатов. Действительно, если добавить к агрегированным тромбоцитам комплексен на кальций - цитрат, то без М,К-дихлортаурина наблюдается деза1регация клеток (табл. 8). Следует отметить, что в случае действия дихлортаурина не может быть уменьшения связывания ионов кальция с тромбоцитами за счет образования их комплекса с сульфоновой группой в Ы,Ы-дихлортаурине, так как константа связывания ионов кальция этой группы низкая [Wright et al., 1986]. Дезагрегирующее действие дихлортаурина не устранялось введением ионов кальция (0,4-3 мМ): степень дезагрегации под действием N,N-дихлортаурина без добавления и с добавлением ионов кальция составила соответственно 93+5 и 84±4 %. Можно полагать, что дезагрегация тромбоцитов при действии хлораминов происходит в результате окисления серосодержащих групп плазматической мембраны тромбоцитов. Это приведет к трансформации мембран клеток и, как следствие, к уменьшению связывания ионов кальция в области межклеточных мостиков.

Таким образом, химическая модификация плазматической мембраны тромбоцитов Ы,Ы-дихлортаурином приводит не только к угнетению их исходной агрегационной активности, но и влечет за собой распад тромбоцитарных агрегатов. Такой характер ингибирования активационных ответов тромбоцитов является важ-

ным достоинством биогенных хлораминов, как возможных противотромбоцитарньо соединений.

4.6. Сравнительная оценка эффективности противотромбоцитарного действш аспирина, тиклопидина и N.N-дихлортаурина. В настоящее время в борьбе со склонностью к тромбообразованию в клинике широко применяются аспирин и тиклопидин влияющие соответственно на циклооксигеназный (ЦОГ) и АДФ-индуцированный пути активации тромбоцитов. Был проведен сравнительный анализ противоагрегацион-ного действия аспирина, тиклопидина и Ы,Ы-дихлортаурина при их введении в цельную кровь человека в конечной концентрации 0,5 мМ на тромбоциты в составе ОТГ Было получено, что М,Ы-дихлортаурин, аспирин, тиклопидин, введенные в кровь примерно одинаково эффективно подавляют агрегацию тромбоцитов в составе OTE соответственно на 48±5, 39±5, 52±4 % .

4.7. Противоагрегационнос действие N.N-дихлортаурина in vivo на тромбоците кролика. Следующий этап работы предполагал изучение действия N,N-дихлортаурина in vivo на интактных животных. Эксперименты проводились на беспородных кроликах обоего пола массой 2,5-3,0 кг. Ы,Ы-Дихлортаурин вводился внутривенно в количестве 5-10 мл в краевую вену уха кролика. Расчетная концентрация ^^дихлортаурина в крови животного при этом составляла 0,2 - 0,4 мМ. До введение Ы,Ы-дихлортаурина, через 1 час и через сутки после введения ^Ы-дихлортауринг оценивали агрегацию тромбоцитов в ОТП, индуцированную АДФ (10 мкМ), адреналином (10 мкМ) и коллагеном (5 мкг/мл). Через 1 час после внутривенного введения кролику Ы,Ы-дихлортаурина наблюдалось снижение агрегации тромбоцитов, индуцированной всеми исследованными индукторами. В случае АДФ и адреналина подавление агрегации составляло в среднем 40-50 %. Коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов подавлялась почти полностью. Противоагрегационное действие N,N-дихлортаурина сохранялось в течение суток. Токсического действия после внутривенного введения кроликам К,Ы-дихлортаурина не наблюдалось.

4.8. Избирательность действия хлораминовых соединений при их введении в кровь. Гемолиз и агрегация эритроцитов. Интересно проанализировать вопрос об относительной эффективности взаимодействия хлораминов в крови и ОТП с тромбоцитами, с одной стороны, и другими клетками и плазмой, с другой. Для примера возьмем Ы^-дихлортаурин, который эффективно ингибирует агрегацию тромбоцитов в ОТП и крови в концентрации примерно 1 мМ (здесь и далее будем выражать концентрацию по активному хлору). Допустим, что указанные выше взаимодействия протекают пропорционально объемам, то есть без какой-либо избирательности. Тогда примерно 2-1,2 микромоль дихлортаурина должны прореагировать с тромбоцитами в 1 литре соответственно ОТП и крови, так как относительный объем тромбоцитов составляет там около 0,002 и 0,0012. Однако существенное прямое ингибирование тромбоцитов возможно при концентрации хлорамина на порядок более высокой (рис. 16). Можно полагать, что в крови и ОТП имеет место избирательное действие хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты. Другими словами, тромбоциты в сравнении с другими составляющими крови характеризуются повышенной способностью к взаимодействию с хлораминами.

Представляет интерес, модифицируются ли другие клетки крови при введении хлораминовых соединений в кровь. Исследовалось повреждение эритроцитов челове-

ЛТ/ДТк,

1Ч,1Ч-Дихлортаурин, мкМ

Рис. 20. Ингибирование агрегации эритроцитов человека, индуцированной аль-циановым синим (10 3 %), при действии N,14-дихлортаурина.

Концентрация эритроцитов в суспензии - 12,5 миллионов в 1 мл. Время инкубации эритроцитов с НЫ-дихлортаурином - 5 мин. ДТ/ДТк - степень агрегации в % к контролю.

ка по критерию их гемолиза и агрегации. Вначале исследовали агрегацию эритроцитов человека по типу агглютинации под действием альцианового синего (АС). Молекулы АС положительно заряжены, адсорбируются на внешней поверхности плазматической мембраны и тем самым снижают отрицательный заряд поверхности эритроцитов. В результате клетки агглютинируют. Изучали изменение агрегации эритроцитов человека в суспензии (12,5 млн клеток в 1 мл) под действием М,ГЧ-дихлортаурина (рис. 20). В нашей работе 50 % подавление а1регации тромбоцитов в составе ОТП достигалось введением в цельную кровь дихлортаурина в конечной концентрации 1 мМ (0,2 наномоля на 1 миллион клеток); при этом изменения агрегации изолированных эритроцитов, индуцированной АС, по сравнению с контрольной, не происходило: степень агрегации эритроцитов составила в контроле и под действием дихлортаурина, введенного в кровь в конечной концентрации 1 мМ, соответственно 100 ± 1 и 99 ± 6 %.

Для выявления собственной чувствительности к М,М-дихлортаурину эритроциты изучались в изолированном состоянии. Вообще говоря, при определенных концентрациях Ы^-дихлортаурина обнаруживалось сильное ослабление агрегации. Это может быть обусловлено образованием отрицательно заряженных сульфокислотных групп на поверхности мембраны клеток за счет окисления исходных серосодержащих групп. Снижение агрегации эритроцитов на 50 % наблюдалось при действии примерно 200 мкМ N.Ы-дихлортаурина при концентрации эритроцитов 12,5 миллионов в 1 мл (16 наномолей в расчете на 1 миллион эритроцитов). Небольшой эффект (около 15 %) удается обнаружить при действии Ы,Ы-дихлортаурина в количестве 4 наномоля на 1 миллион клеток. Однако эта величина более чем на порядок превышает уровень М,М-дихлортаурина, вводимого в кровь в выше указанном опыте. Таким образом, в ситуации с цельной кровью количество вводимого Ы,Ы-дихлортаурина совершенно недостаточно для модификации эритроцитов, обусловливающей ослабление агрегации.

Другим критерием повреждения клеток был выбран гемолиз; этот показатель

особенно важен, поскольку входит в систему доклинических испытаний соединений. Анализ гемолиза используется для выяснения механизмов повреждения клеточных мемран [РоСарепко е1 а1., 1999]. Свидетельством гемолиза было увеличение светопро-пускания суспензии эритроцитов, регистрируемое в течение нескольких часов. На рис. 21 представлены примеры кинетических кривых гемолиза эритроцитов человека под действием Ы,Ы-дихлортаурина. Видно, что повреждение эритроцитов по критерию гемолиза, протекающего через 9-10 часов, проявлялось при высоком соотношении количества 1\т,М-дихлортаурина и эритроцитов — 300 наномоль на 1 миллион клеток (рис. 21). Это соответствует введению в кровь Ы.Ы-дихлортаурипа в конечной концентрации 1,5 моль на 1 литр, которая более чем в 1000 раз превышает

Т,%

60 -

0 10

Рис.21. Рис.22.

Рис. 21. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов человека при действии Ы,Ы-дихлортаурина. 1 - контроль; 2, 3, - НЫ-дихлортаурин соответственно в количестве (по активному хлору) 20 и 300 наномоль в расчете на 1 миллион эритроцитов.

Рис. 22. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов кролика при действии ¡4-хлораланина и гипохлорита натрия. 1- конторль; 2, 3 и 4 - Ы-хлораланин соответственно в количестве 20, 200, 320 наномоль в расчете на 1 миллион клеток; 5 -гипохлорит натрия в количестве 2 наномоль на 1 миллион эритроцитов. Т, % - све-топропускание суспензии. Время, мин - время после введения хлораминовых соединений.

«проивотромбоцитарные» концентрации. Аналогичный результат получен для эритроцитов кролика при действии других хлораминовых соединений (рис. 22). В течение 7- 10 часов хлорамины в количестве 20 наномоль на 1 миллион клеток не индуцируют гемолиз (рис. 21 и 22).

Известно, что для химических гемолизирующих агентов время гемолиза 50 % клеток (/5о) обратно пропорционально их концентрации в степени, изменяющейся в пределах от 1 до 2. При действии хлораминов показатель степени близок к 1.

Т,%

180 360 540 720 Время, мин

Время, мин

Возможность повреждения эритроцитов хлораминовыми производными аминокислот и таурина, вводимыми в кровь в конечной концентрации 1 мМ (0,2 наномоля на 1 миллион клеток), можно оценить путем экстраполяции данных, полученных на излированных эритроцитах, при условии, что механизм гемолитического действия при всех концентрациях одинаков. Такая экстраполяция показывает, что величина t<0 для эритроцитов кролика составляет около 150 суток (при действии N-хлораланина и N-хлофенилаланина), а в случае эритроцитов человека и действия >),Ы-дихлортаурина эта величина еще выше. Таким образом, все приведенные данные позволяют предполагать, что в крови значительное противоагрегационное действие КЫ-дихлортаурина на тромбоциты не сопровождается заметным повреждением эритроцитов по критерию гемолиза. Интересно отметить, что эритроциты легко гемолизируют под действием небольших количеств гипохлорита (2 наномоль на 1 миллион клеток) (рис. 22), как это ранее отмечалось и в других работах [Dallegri et al.,1986; Grisham et al.,1984; Ikuo et al., 1996].

Интересно сравнить собственную чувствительность тромбоцитов по критерию их агрегации и эритроцитов по критерию гемолиза. Для этого целесообразно нормировать количество действующего соединения на одинаковый объем вещества клеток. Объем одного эритроцита примерно в 20 раз больше объема одного тромбоцита [Latimer, 1983], то есть сумарные объемы 20 миллионов тромбоцитов и 1 миллиона эритроцитов примерно равны. Из приведенных выше данных следует, что агрегаци-онная активность 20 миллионов тромбоцитов снижается в 2 раза под действием около 1,7 наномоль хлорамина, а для повреждения 1 миллиона эритроцитов, приводящего к гемолизу, требуется 200 наномоль хлорамина. Если действие хлораминов нормировать на одинаковую площадь поверхности клеток, соотношение действующего количества хлораминов для эритроцитов и тромбоцитов будет примерно в 3 раза меньше. Таким образом, собственная чувствительность тромбоцитов к модифицирующему действию хлораминов примерно в 50-100 раз выше чувствительности эритроцитов.

Хлорамины легко реагируют с серосодержащими группами остатков цистеина, цистина, метионина (раздел 3.2; см также [Slivka, 1980; Thomas, 1983; Chesney, 1996]). Плазматическая мембрана тромбоцитов, с которой прежде всего взаимодействуют хлорамины, имеет особое происхождение, формируется из плазматического ретику-лума мегакариоцитов. Многие рецепторные белки тромбоцитов содержат большое количество тиогрупп. Не исключено, что большое количество доступных серосодержащих групп плазматической мембраны тромбоцитов определяет их избирательность взаимодействия с хлораминами в крови. Поэтому необычная реакция тромбоцитов на хлорамины не вызывает удивления. При введении хлораминовых производных аминокислот в кровь или ОТП агрегация тромбоцитов в заметной степени может угнетаться при их умеренной концентрации, на уровне десятых долей миллимолей в 1 литре. Отметим, что при активации фагоцитов в крови возможно локальное образование гипохлорита и, следовательно, хлораминов в количестве около 0,1 мМ [Slivka, 1980].

ВЫВОДЫ

1. Гипохлорит натрия ингибирует функциональные процессы в тромбоцитах: начальную агрегацию (образование мелких агрегатов), обнаруживаемую

нефелометрическим методом, конечную агрегацию, реакцию выброса цитоплазматических гранул, контролируемую по выходу акридинового оранжевого, циклооксигсназную пероксидацию липидов.

В изолированных клетках ингибирование процессов на 50 % наступает при концентрациях гипохлорита от 10 до 40 мкМ в зависимости от вида процесса и природы агониста. В интервале небольших концентраций гипохлорита натрия начальная агрегация, реакция выброса и циклооксигеназная пероксидация липидов в тромбоцитах ингибируются сильнее конечной агрегации.

2. В случае обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) агрегация тромбоцитов ингибируется гипохлоритом натрия в концентрациях 1-2 мМ. При этом гипохлорит не оказывает влияния, судя по турбидиметрическим показателям, на форму исходных клеток и процесс перехода клеток из дискоидной в сфероидную форму при их активации. Экзогенные аминокислоты и таурин вызывают необычный эффект: анти-агрегационное действие гипохлорита резко усиливается.

3. В ОТП антиагрегационное действие гипохлорита носит преимущественно косвенный характер - обусловлено первичной модификацией компонентов плазмы. Предварительно модифицированные гипохлоритом плазма, сывороточный альбумин, фибриноген ослабляют агрегацию изолированных тромбоцитов.

Нативная плазма и фибриноген восстанавливают агрегационную способность тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом.

4. Обнаружено сильное антиагрегационное действие на тромбоциты в изолированном состоянии и ОТП хлораминовых производных аминокислот и родственных им соединений. Образование хлораминов обусловливает усиление действия гипохлорита на тромбоциты в ОТП экзогенными аминокислотами. 14-Хлораминокислоты также ингибируют реакцию выброса АТФ из тромбоцитов.

5. Антиагрегационное действие Ы-хлораминокислот на тромбоциты проявляется при их активации различными агонистами (АДФ, коллагеном, адреналином, тромбином), то есть носит генерализованный характер. Дня ингибирования агрегации изолированных клеток на 50 % требуется концентрация хлораминокислот 20-30 мкМ, а в случае ОТП и наиболее эффективных соединений - около 0,5 мМ.

Степень подавления Ы-хлорглицином и N-хлорлейцином АДФ-индуцирусмой агрегации тромбоцитов описывается степенной функцией от концентрации хлораминов; показатель степени близок к двум. Вероятно, необходимы по крайней мере две модификации мембраны тромбоцита для угнетения его агрегационной активности.

Транспорт флуоресцентного зонда акридинового оранжевого в цитоплазматические гранулы тромбоцитов не ингибируется Ы-хлораминокислотами. Можно предполагать, что хлорамины в исследуемых условиях существенно не проникают внутрь тромбоцитов.

6. Ингибирование агрегации тромбоцитов зависит от строения и физико-химических характеристик (молекулярной массы, ван-дер-ваальсового объема молекулы) К-хлораминокислот. В обогащенной тромбоцитами плазме антиагрегационный эффект в ряду: К-хлортрсонин - М-хлорссрин - Ы-хлораланин - Ы-хлорглицин, резко возрастает с уменьшением молекулярной массы. Это, вероятно, обусловлено их взаимодействием с химическими группами, находящимися в узком кармане тромбоцитов. Зависимость ингибирующего действия соединений указанного ряда от молекулярной

массы (т) эмпирически описывается формулой вида /л?(Д'['к /ЛТ) О ехр(-1т), где ДТк и ДТ - степень агрегации в контроле и опыте, а Б и / - константы; / > 0.

М-Хлораминокислоты с повышенной молекулярной массой от Ы-хлорфенилаланина до Ы-хлорлейцина включительно (198,5-164,5 дальтон; ван-дер-ваальсовый объем 0,169-0,151 нм3) оказывают одинаковое и пониженное антиагрега-ционное действие на тромбоциты.

7. При сравнении антиагрегационной активности соединений с различным расположением хлораминовой группы в молекуле показано, что более эффективны хло-рамины с удаленной от карбоксильной хлораминовой группой (на 3-5 атомов углерода). Можно предположить наличие отрицательно, . заряженной группы в месте взаимодействия хлораминов с мембраной тромбоцитов.

8. В цельной крови все исследуемые Ы-хлораминокислоты, за исключением 14-хлорфенилаланина, оказывают приблизительно одинаковый антиагрегационный эффект на тромбоциты. Наблюдаемое при этом ослабление действия Ы-хлораминокислот с пониженной молекулярной массой обусловлено их большей реакционной способностью по отношению к эритроцитам; взаимодействие с лейкоцитами не существенно.

9. Данные по ингибирующему действию ряда аминокислот и пептидов на окисление билирубина или иодида калия показывают, что наиболее эффективно с гипо-хлоритом натрия и хлораминами взаимодействуют сульфгидрильные группы. Соотношение констант скоростей реакции гипохлорита с активными химическими группами восстановленного глутатиона, окисленного глутатиона, аланина и серина, оцененное на основании интегральных кинетических формул, приближенно составляет соответственно 48 : 6,9 : 5,5 : 2,4.

Взаимодействие гипохлорита и М,1\!-дихлортаурина с серосодержащими группами осуществляется по различным механизмам. С одной тиометильной группой ме-тионина, с сульфгидрилъной или дисулъфидной группой глутатиона в расчете на активный хлор реагируют соответственно 3,3±0,1, 3,1±0,1, 6,0±0,1 молекул гипохлорита, тогда как в случае Ы,Ы-дихлортаурина - соответственно 1,4±0,1, 2,6±0,2, 4,1 ±0,2 хлораминовых групп.

10. В плазматической мембране тромбоцитов уже при низких концентрациях гипохлорита натрия (менее 20 мкМ) наблюдается заметное разрушение периферийных сульфгидрильных групп. Аминогруппы плазматической мембраны тромбоцитов, как установлено с помощью флуоресцентной метки флуорсскамина, также модифицируются при действии гипохлорита. Одинаковая с сульфгидрнльными группами степень модификации аминогрупп проявляется при концентрациях гипохлорита примерно в два раза более высоких. Можно полагать, что функциональное действие гипохлорита сопряжено с модификацией мембранных тиолов и аминогрупп, причем первые наиболее существенны при его малых концентрациях.

11. М-Хлораминокислоты при введении в кровь проявляют значительную избирательность действия на тромбоциты. Это следует из результатов сравнения величин концентраций хлораминов, вызывающих 50 % ингибирование агрегации тромбоцитов в изолированном состоянии и крови.

В крови хлорамины в концентрациях, приводящих к подавлению агрегации тромбоцитов на 50 %, не вызывают существенной модификации эритроцитов по кри-

терию их гемолиза за период примерно 10 часов и агрегации. Гемолитическое повреждение эритроцитов вызывается хлораминами в количествах, на 2-3 порядка выше необходимых для угнетения агрегации тромбоцитов.

12. Впервые получен N.N-дихлортаурин в виде твердого стабильного препарата. Показана его антитромбоцитарная активность при введении in vitro в кровь человека, in vitro и in vivo на животных. Существует перспектива использования N.N-дихлортаурина как антитромбоцитарного средства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Мурина М.А., Аносов А.К., Рощупкин Д.И. Изменение тромбоцитов и эритроцитов в плазме крови при УФ-облучении.// Тезисы докладов 1-ого Всесоюзного биофизического съезда. М., 1982, Т. 3, С. 129.

2. Аносов А.К., Мурина М.А., Рощупкин Д.И. Роль фотоокислительных реакций в ослаблении агрегации тромбоцитов и усилении агрегации эритроцитов в плазме крови при УФ-облучении.// Тезисы докладов 1-ого Всесоюзного биофизического съезда. М., 1982, Т. 2, С. 307

3. Мурина М.А., Рощупкин Д.И. Ослабление агрегации эритроцитов и перекисное окисление их мембранных липидов при УФ облучении.// Биофизика, 1983, Т. 28, № 4, С. 716.

4. Мурина М.А., Рощупкин Д.И. Ослабление антиоксидантами изменений взаимодействия клеток крови при УФ-облучении.// Тезисы Всесоюзного совещания "Биоан-тиоксидант", Черноголовка, 1983, С. 164-165.

5. Мурина М.А., Аносов А.К., Рощупкин Д.И. Изменение агрегации эритроцитов и тромбоцитов под действием ультрафиолетового излучения.// Биофизика, 1984. Т. 29, С. 92-95.

6. Murina М.А., Roshchupkin D.I. Effect of ultra-violet radiation on aggregation of human erythrocytes.// Photobiochemistry and Photobiophysics, 1984, Vol.7, No.l, P.59-65.

7. Рощупкин Д.И., Аносов A.K., Мурина M.A., Козлов A.B. Изменение агрегацион-ного взаимодействия клеток крови при УФ-облучении.// В кн.:"Вопросы использования оптического излучения в медицине", Саранск, 1985, С. 36-42.

8. Мурина М.А., Кузнецов В.Н., Рощупкин Д.И. Противоагрегационное действие гипохлорита на тромбоциты.// Бюл. экспер. биол. мед., 1986, Т. СИ, С. 676-678.

9. Рощупкин Д.И., Аносов А.К., Мурина М.А., Лордкипанидзе А.Т. Фотопревращение мембранных липидов и его роль в изменении функций биомембран под действием УФ-излучения. // В кн.: Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М., Наука, 1988, С. 79-82.

10. Мурина М.А. Механизмы противоагрегационного действия гипохлорита на обогащенную тромбоцитами плазму крови.// Труды 2-ой научной конференции молодых ученых НИИ физико-химической медицины МЗ РСФСР, 1987, С. 33^14. Деп. ВИНИТИ 13.02.87 №8446-В87.

11. Мурина М.А., Горюнов A.B., Рощупкин Д.И. Трансформация агрегационного взаимодействия эритроцитов и тромбоцитов под действием УФ излучения. // В кн.'."Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов", Тезисы докладов на Всесоюзной конференции, Минск, 1988, С. 96.

12. Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Действие гипохлорита натрия на мембранные процессы активации и агрегации тромбоцитов. // Тезисы докладов на IY Всесоюзном съезде патофизиологов."Нарушение механизмов регуляции и их коррекция", М., 1989, Т. 2, С. 548.

13. Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Прямое и косвенное противоагре-гационное действие гипохлорита натрия на обогащенную тромбоцитами плазму кро-ви.//Бюл. экспер. биол. мед., 1989, Т. CYII, С. 702-704.

14. Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Средство для снижения агрегации тромбоцитов. Патент СССР № 1834659. // Официальный бюллетень комитета РФ по патентам и товарным знакам. Изобретения, 1993, № 30, С. 62.

15. Мурина М.А., Трунилина H.H., Рощупкин Д.И. Липидная пероксидация в лейкоцитах и изменение их агрегации при действии гипохлорита натрия.// В кн.: "Электрохимические методы в медицине. Тезисы докладов." Москва, 1991, С. 12.

16. Мурина М.А., Трунилина H.H., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Ингибирование реакции выброса и агрегации изолированных тромбоцитов гипохлоритом натрия.// В кн.: "Эфферентные методы в медицине. Тезисы докладов." Москва, 1992, С. 14.

17. Мурина М.А., Деев А.И., Трунилина H.H., Рощупкин Д.И. Флуоресцентные исследования модификации аминогрупп в мембранах гипохлоритом натрия. // Флуоресцентные методы в клинической диагностики.1992, Выпуск 4, С.12.

18. Трунилина H.H., Мурина М.А., Рощупкин Д.И. Липидная пероксидация в лейкоцитах, индуцированная гипохлоритом натрия.// В кн.: «Биоантиоксидант. Тезисы докладов.» Москва, 1993, Т. 1, С. 51.

19. Рощупкин Д.И., Мурина М.А. Фотобиологические процессы в биомембранах при действии ультрафиолетового излучения на клетки, ткани и органы животных.// Биофизика, Т.38, Вып.6, 1993, С. 1053-1067.

20. Зверева М.В., Мурина М.А., Трунилина H.H., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Стимуляция гипохлоритом натрия фагоцитарной активности лейкоцитов.// В кн.: "Эндогенные интоксикации. Тезисы докладов.", Санкт-Петербург, 1994, С. 178.

21. Мурина М.А., Трунилина H.H., Саркина Э.Э., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Влияние различных компонентов плазмы на модификацию гипохлоритом натрия аг-регационной способности тромбоцитов.// В кн.: "Эндогенные интоксикации. Тезисы докладов."Санкт-Петербург, 1994, С. 193.

22. Трунилина H.H., Мурина М.А., Зверева М.В., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Модификация гипохлоритом натрия сульфгидрильных и аминогрупп в мембранах тромбоцитов. // В кн.: "Эндогенные интоксикации. Тезисы докладов." Санкт-Петербург, 1994, С. 199.

23. Мурина М.А., Трунилина H.H., Рощупкин Д.И., Саркина Э.Э., Сергиенко В.И. Ингибирование агрегации тромбоцитов при действии гипохлорита натрия. Влияние компонентов плазмы крови.// Бюл. эксп. биол. и мед., 1995, Т. 119, № 5, С. 488 - 490.

24. Рощупкин Д.И., Мурина М.А., Трунилина H.H., Сергиенко В.И. Модификация плазматической мембраны тромбоцитов и подавление их функций гипохлоритом натрия, обнаруживаемые оптическими методами.//Биофизика, 1995, Т. 40. № 3, С. 569575.

25. Сергиенко В.И., Мурина М.А., Панасенко О.М., Трунилина H.H., Евгина С.А., Айдыралиев Р.К, Рощупкин Д.И. Молекулярно-клеточные механизмы действия гипо-

хлорита натрия на тромбоциты и липопротсины.//Вестник РАМН, 1995, № 3, С. 4853.

26. Рощупкин Д.И., Мурина М.А., Трунилина H.H., Зверева М.В. Модификация белков и функциональные изменения тромбоцитов и лейкоцитов при действии ионов гипохлорита.//В кн.: "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов". Материалы международного симпозиума, Воронеж, ВГУ, 1995, С. 121122.

27. Рощупкин Д.И., Соколов АЛО., Мурина М.А., Бержицкая В.В. Начальная агрегация и внутриклеточное накопление катионных зондов как показатели функционального состояния тромбоцитов при хранении тромбоцитарной массы.// В кн.:"Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии ". Материалы симпозиума, С.-Петербург, Изд.НИИ гематологии и трансфузиологии, 1995, С. 229-230.

28. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Сергиенко В.И. Действие гипохлорита натрия и N-хлораминокислот на тромбоциты. // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Озон в биологии и медицине". Н.Новгород, 1995, С. 52-53.

29. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Трунилина H.H., Сергиенко В.И. Обратимая инактивация тромбоцитов и ее использование в технологии хранения тромбоцитарной массы.// В кн.:"Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии". Материалы симпозиума, С.-Петербург, Изд.НИИ гематологии и трансфузиологии, 1995. С. 230-231.

30. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Кравченко H.H., Садовников В.Б.. Сергиенко В.И. Противоагрегационное действие хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты в присутствии плазмы крови. //Биофизика, 1997, № 6, С. 1279-1285.

31. Рощупкин Д.И., Дружинин Д.Л., Мурина М.А. Твердое вещество для приготовления окислительного раствора и способ его получения. // Патент РФ № 2115420.

32. Рощупкин Д.И., Бержицкая В.В., Соколов А.Ю., Мурина М.А. Начальная агрегация тромбоцитов. Ее изменение при хранении тромбоцитарного концентрата и при действии продуктов миелопероксидазной реакции. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, № 11, С. 523-526.

33. Roshchupkin D.I., Murina М.А. Lipid oxidation in blood cell and its role in therapeutic action of UV-light on blood.// International Symposium "Problems and trends of photobiochemistry", Moscow, 1997, P.61.

34. Кравченко H.H., Мурина M.A., Рощупкин Д.И., Кравченко И.Н., Садовников В.Б. Противоагрегационное действие хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты в присутствии плазмы крови.// II Открытая городская конференция молодых ученых г.Пущино. Изд. Пущинского научного центра РАН, 1997, С. 139.

35. Рощупкин Д.И., Мурина М.А. Действие УФ- и КВЧ- излучений на клетки крови. // Тез. докладов на 1 международном симпозиуме "Фундаментальные науки и альтернативная медицина ", Пущино, 1997, С. 134-135.

36. Кравченко H.H., Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Кравченко И.Н., Садовников В.Б., Сергиенко В.И. Влияние хлораминовых производных аминокислот на эритроцита человека. // В кн.: «III Пущинская конференция молодых ученых. Тезисы докладов.» Пущино, 1998, С.155-156.

37. Мурина М.А., Рошупкин Д.И., Аднорал Н.В., Сергиенко В.И. Средство для угнетения активности тромбоцитов на основе биогенных хлораминов.// V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", М., 1998, С. 593.

38. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Трунилина H.H., Бержицкая В.В., Соколов А.Ю. Новая технология исследования активности тромбоцитов при испытании их концентрата и противотромбоцитарных средств. // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 1998, С. 510-511.

39. Мурина М.А., Савельева Е.Л., Рощупкин Д.И. Окислительная модификация тромбоцитов гипохлоритом и биогенными хлораминами.//У конференция "Биоанти-оксидант", М„ С.155-156.

40. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Аднорал H.H., Сергиенко В.И. Распад тромбо-цитных агрегатов при окислении белковых серосодержащих групп N,N-дихлортаурином.// II Международный симпозиум "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов", Воронеж, 1998, С. 158-161.

41. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Савельева Е.Л., Зверева М.В. Ингибирование аг-регационной активности тромбоцитов при ковалентной модификации мембран биогенными хлораминами.// II Международный симпозиум "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов", Воронеж, 1998, С. 162-165.

42. Мурина М.А., Аднорал Н.В., Рощупкин Д.И., Савельева Е.Л., Кравченко H.H., Сергиенко В.И. О защитном действии таурина и аминокислот при окислительном повреждении клеток крови гипохлоритом. // V конференция "Биоантиоксидант", М., 1998, С. 154-155.

43. Kravchenko N.N., Murina М.А., Roshchupkin D.I., Kravchenko I.N.. Sadovnikov V.B., SergienkoV.I. Inhibition of platelet aggregation by amino acid chloramines. // Platelets, 1998, No 9, P. 414-415.

44. Рощупкин Д.И., Мурина M.A. Изменение свойств тромбоцитов при ковалентной модификации мембран биогенными хлораминами.//1И Съезд Белорусского общества фотобиологов и биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем.», Минск, Изд. Белорусского общества фотобиологов и биофизиков, 1998, С. 33.

45. Рощупкин Д.И., Мурина М.А., Аднорал Н.В., Кравченко H.H., Сергиенко В.И. Угнетение функции тромбоцитов биогенными хлораминами. // Физиология человека, N° 3, 1998, С. 113-120.

46. Рощупкин Д.И., Мурина М.А. Свободнорадикальное и циклооксигеназное окисление липидов в мембранах клеток крови при УФ-облучении.// Биологические мембраны, №2, 1998, С. 221-226.

47. Рощупкин Д.И., Бержицкая В.В., Мурина М.А. Различие в ингибирующем действии продуктов реакции, катализируемой миелопероксидазой, на тромбоциты.// Биофизика, 1998, Т. 43, № 2, С. 323-328.

48. Мурина М.А., Аднорал Н.В., Савельева Е.Л., Сергиенко В.И. Противоагрегаци-онное действие хлораминовых производных аминокислот и таурина на тромбоциты.// II Съезд Биофизиков России. Тезисы докладов, М., 1999, Т. 1, С. 260-261.

49. Мурина М.А., Трунилина H.H., Рощупкин Д.И.. Оптические методы для анализа свойств тромбоцитов в составе концентрата. // II Съезд Биофизиков России. Тезисы докладов, М„ 1999, Т. И, С. 612-613.

50. Мурина М.А. Мембранный механизм действия на клетки крови продуктов мие-лопероксидазной реакции: гипохлорита натрия и хлораминовых производных аминокислот.// II Съезд Биофизиков России. Тезисы докладов, М., 1999, Т. II, С. 699-700.

51. Мурина М.А.,Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Средство для угнетения активности тромбоцитов. Положительное решение по заявке № 98102736 на патент РФ.

52. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Трунилина H.H., Сергиенко В.И. Циклооксиге-назное и свободнорадикалыюе окисление липидов в мембранах клеток крови при действии гипохлорита натрия и УФ-облучения.// Национальная научно-практическая конференция с международным участием. «Свободные радикалы и болезни человека. Сборник трудов», Смоленск, 1999, С. 30-32.

53. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Трунилина H.H., Аднорал H.H., Сергиенко В.И. Антитромботическое средство на основе гипохлорита натрия: технология получения Ы,Ы-дихлортаурина и механизм его действия на тромбоциты.// Всероссийская конференция "Сорбционные, электрохимические и гравитационные методы в современной медицине. Тезисы докладов", М., 1999, С. 80.

54. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Сергиенко В.И. Разработка антитромботического тромбоцитотропного средства на основе биогенных хлораминов.// Российский Национальный конгресс кардиологов. "Кардиология, основанная на доказательствах. Тезисы докладов." М., 2000, С. 210-211.

55. Мурина М.А., Трунилина H.H., Аднорал Н.В., Чудина H.A., Савельева E.JL, Рощупкин Д.И. Структурная зависимость действия хлораминовых производных биогенных соединений на клетки крови. // IV Съезд Белорусского общественного объединений фотобиологов и биофизиков «Молекулярныо-клеточные основы функционирования биосистем. Тезисы докладов», Минск, 2000, С. 167.

56. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Кравченко H.H., Аднорал Н.В., Сергиенко В.И. Противоагрегационное действие на тромбоциты хлораминовых производных био-геннных соединений в зависимости от их структуры. // Второй Российский конгресс по патофизиологии. '"Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы. Тезисы докладов", М., 2000, С. 97.

57. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Чудина H.A., Савельева ЕЛ. Физико-химические основы противоагрегационного действия хлораминового производного таурина и гипохлорита натрия на тромбоциты. // Второй Российский конгресс по патофизиологии. "Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы. Тезисы докладов", М., 2000, С. 96-97.

58. Трунилина H.H., Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Бержицкая В.В., Сергиенко В.И. Исследование начальной агрегации и аккумуляции акридинового оранжевого в тромбоцитах при хранении тромбоцитарного концентрата с использованием гипохлорита натрия. // Гематология и трансфузиология, 2000, № 5, С.17-19.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мурина, Марина Алексеевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Физико-химические свойства продуктов реакции, катализируемой миелопероксидазой: гипохлорита и хлораминовых производных аминокислот

2. Структура и функции тромбоцитов.

2 Л. Строение тромбоцитов.

2.2. Механизм активации, агрегация и секреция тромбоцитов.

2.3. Система трансдукции сигнала в тромбоцитах.

2.4. Роль тромбоцитов в патогенезе сосудистых заболеваний и противотромбоцитарные препараты

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Реактивы.

1.1. Получение хлораминовых производных аминокислот и таурина

2. Объекты исследования.

2.1 .Получение образцов тромбоцитов кролика.

2.2. Приготовление образцов тромбоцитов человека.

2.3. Выделение мононуклеарных клеток, нейтрофилов и суммарной фракции лейкоцитов.

2.4. Выделение эритроцитов.

3. Методы исследования.

3.1. Регистрация агрегации тромбоцитов и лейкоцитов

3.2. Регистрация дезагрегации тромбоцитов.

3.3. Регистрация изменения формы тромбоцитов.

3.4. Регистрация продуктов пероксидации липидов.

3.5. Исследование реакции выброса цитоплазматических гранул и транспорта в гранулярный аппарат в тромбоцитах.

3.6. Флуориметрическое определение модификации аминогрупп

3.7. Спектрофотометрическое определение сульфгидрильных групп

3.8. Регистрация агрегации эритроцитов

3.9. Кинетический гемолиз эритроцитов

3.10. УФ-облучение исследуемых образцов

3.11. Статистическая обработка полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Действие гипохлорита натрия на функциональную активность тромбоцитов.

1.1 .Действие гипохлорита натрия на изолированные тромбоциты

1.2. Действие гипохлорита на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы

1.3.Прямое и косвенное действие гипохлорита натрия на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы.

1.4. Восстановление плазмой и ее компанентами агрегации тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия

1.5. Влияние компонентов плазмы, модифицированных гипохлоритом натрия, на агрегацию нативных тромбоцитов

Г ЛАВА 2. Действие хлораминовых производных биогенных соединений на различные функциональные процессы в тромбоцитах

2.1. Противотромбоцитарное действие хлораминовых производных аминокислот и таурина.

2.2. Действие N-хлораминокислот на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в присутствии серосодержащих соединений.

2.3. Влияние N-хлораминокислот на изменение формы тромбоцитов

2.4. Влияние N-хлораминокислот на транспорт, приводящий к накоплению акридинового оранжевого в гранулярном аппарате тромбоцитов.

2.5. Зависимость противоагрегационного действия N-хлораминокислот от состояния тромбоцитов кролика.

ГЛАВА 3. Ингибирование агрегации тромбоцитов в зависимости от физико-химических свойств хлораминовых производных аминокислот.

3.1. Концентрационная зависимость антиагрегационного действия N-хлораминокислот на тромбоциты

3.2. Зависимость ингибирования агрегации тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазмы от молекулярной массы

N-хлораминокислот

3.3. Зависимость антиагрегационного действия N-хлораминокислот от положения в молекуле хлораминовой группы.

3.4. Ингибирование N-хлораминокислотами агрегации тромбоцитов в составе цельной крови в зависимости от молекулярной массы.

ГЛАВА 4. Взаимодействие гипохлорита натрия и хлораминовых соединений с биологически важными веществами и компонентами тромбоцитов

4.1. Исследование относительных констант скорости взаимодействия гипохлорита натрия с аминокислотами и пептидами

4.2.Сравнительная эффективность взаимодействия К^-дихлортаурина с различными серосодержащими группами

4.3. Стехиометрия взаимодействия гипохлорита натрия и 1Ч,М-дихлортаурина с серосодержащими соединениями

4.4. Модификация сульфгидрильных и аминогрупп тромбоцитов при изменении их агрегационной активности гипохлоритом и хлораминовыми соединениями.

4.5. Особенности ингибирования начальной агрегации тромбоцитов исследуемыми соединениями при действии разных агонистов.

ГЛАВА 5 . Действие И^-дихлортаурина на тромбоциты.

5.1. Получение твердого стабильного препарата 1М,Ы-дихлортаурина.

5.2. Антиагрегационное действие хлораминовых производных таурина и аминокислот на нативные и предстимулированные тромбоциты человека.

5.3. Подавление хлораминовыми производными аминокислот и таурина секреции АТФ в тромбоцитах человека

5.4. Действие 1Ч,1Ч-дихлортаурина на циклооксигеназную пероксидацию и агрегацию изолированных тромбоцитов

5.5. Ингибирование начальной агрегации и дезагрегация тромбоцитов человека при действии М,1Ч-дихлортаурина

5.6. Сравнительная оценка эффективности противотромбоцитарного действия аспирина, тиклопидина и Ы^-дихлортаурина

5.7. Антиагрегационное действие ]Ч[,Ы-дихлортаурина in vivo на тромбоциты кролика

ГЛАВА 6. Действие хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия на эритроциты и лейкоциты.

6.1. Гемолиз и агрегация эритроцитов при действии N-хлораминокислот.

6.2. Действие гипохлорита натрия и М,]М-дихлортаурина на лейкоциты.

6.3. Избирательность действия хлораминовых соединений при их введении в кровь и обогащенную тромбоцитами плазму.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические механизмы действия на тромбоциты хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия"

Изучение физико-химических механизмов модуляции активности клеток крови биогенными хлораминами и гипохлоритом натрия является актуальным по ряду причин.

Во-первых, хлорноватистая кислота (ионизированная форма - гипохлорит-анион) продуцируется в организме фагоцитирующими клетками в реакции, катализируемой миелопероксидазой. Как вторичные продукты этой реакции, при взаимодействии гипохлорита с биогенными аминами образуются хлораминовые производные аминокислот и родственных соединений [156, 248, 265]. Поскольку и гипохлорит и хлораминовые соединения могут образоваться в местах скопления активированных моноцитов-макрофагов или нейтрофилов в достаточно высоких количествах до 0,1 мМ [200], то кроме взаимодействия с чужеродными агентами, роль этих соединений в модификации самих нейтрофилов и других клеток крови представляется вполне реальной in vivo. Таким образом, в организме возможно межклеточное взаимодействие, заключающееся в изменении функций клеток крови под влиянием фагоцитов.

Механизм действия хлораминовых соединений и гипохлорита натрия на клетки крови мало изучен. Известно, что хлораминовые производные биогенных соединений по сравнению с гипохлоритом гораздо слабее модифицируют эритроциты и лейкоциты [125, 275]. В последнее время получены сведения о том, что N-монохлортаурин способен снижать образование тканеиовреждающих медиаторов воспаления макрофагами (оксида азота, альфа-фактора некроза опухоли, простагландина Е2), тем самым защищая ткани от повреждения [153, 194, 195]. Показано [103], что N-монохлортаурин способен ингибировать коллагеназу, причем этот эффект специфичен по отношению к N-монохлортаурину, так как хлораминовые производные аланина и лейцина не обладают таким свойством. Таким образом, N-монохлортаурин, снижая уровень медиаторов воспаления, повреждающих ткани, может выступать в качестве физиологического регулятора функций макрофагов.

К началу работы в литературе практически отсутствовали данные о молекулярно-клеточных механизмах действия гипохлорита и хлорамининовых соединений на тромбоциты.

Во-вторых, в последнее время гипохлорит натрия, получаемый электрохимическим способом, предложен Сергиенко В.И. с соавторами (19851996) как детоксицирующее средство при эндо- и экзотоксикозах, находит применение в клинике. При внутривенном введении гипохлорита натрия могут образовываться хлораминовые производные биогенных соединений. В связи с этим возникает необходимость изучения модифицирующего действия как гипохлорита, так и хлораминов на компоненты крови; это действие может выступать в качестве побочного эффекта.

В-третьих, важно, что биогенные хлорамины, как установлено нами, оказывают выраженное противоагрегационное действие на тромбоциты. Повышенная функциональная активность тромбоцитов играет ведущую роль в патогенезе артериальных тромбозов и синдрома диссеминированного внутрисосудисгого свертывания крови [1, 15, 16, 27, 56, 57, 277]. Для предотвращения и лечения таких состояний может требоваться генерализованное ингибирование тромбоцитов. Предотвращение активации тромбоцитов представляет интерес и с точки зрения усовершенствования способов хранения тромбоцитарного концентрата, так как известно, что его срок хранения в обычных условиях во многом ограничивается постепенной активацией клеток. Поэтому актуальной проблемой является поиск и разработка новых эффективных препаратов противогромбоцитарного типа действия. Хлораминовые производные биогенных соединений были предложены в качестве основы для разработки нового противотромбоцитарного средства. N-Хлораминокислоты, также как и ацетилсалициловая кислота (аспирин), химически модифицируют плазматическую мембрану тромбоцитов. Это ведет к генерализованному ингибированию функциональной активности тромбоцитов, то есть ингибированию их активации независимо от природы агониста.

Целью настоящей работы было выяснение молекулярно-клеточных основ модификации структуры и функций тромбоцитов биогенными хлораминами и гипохлоритом натрия; выявление свойств хлораминовых соединений, существенных для их использования в качестве противотромбоцитарного средства.

Работа состоит из 3 основных разделов, в первом из которых представлен обзор литературы. В нем содержатся данные по физико-химическим свойствам гипохлорита натрия и хлораминовых производных аминокислот. Также рассмотрены структура и функции тромбоцитов, механизмы их активации и агрегации, роль тромбоцитов в патогенезе сосудистых заболеваний. Во втором разделе представлены материалы и методы, использованные в работе. Далее идут 6 основных глав, содержащие экспериментальные результаты работы: проведено систематическое исследование молекулярно-клеточных механизмов действия гипохлорита и хлораминовых соединений на свойства тромбоцитов, изучены механизмы действия гипохлорита натрия и хлораминов на лейкоциты и эритроциты.

В результате проведенных исследований обнаружено явление ингибирования гипохлоритом натрия и хлораминовыми соединениями функциональных процессов в тромбоцитах, включая рецептор-зависимую агрегацию, секрецию плотных гранул, циклооксигеназную пероксидацию липидов. Получены сведения в пользу эффективного нарушения гипохлоритом системы внутриклеточной трансдукции сигнала в тромбоцитах. В результате проведенных исследований был установлен один из возможных первичных механизмов действия гипохлорита и хлораминов на клетки крови, а именно модификация поверхностных сульфгидрильных и аминогрупп мембран этих клеток.

Предложено использовать гипохлорит натрия с целью генерализованного подавления активности тромбоцитов в качестве консерванта при хранении тромбоцитарного концентрата.

Установлено, что ингибирование агрегационной способности тромбоцитов хлораминами не зависит от природы агониста, но при действии гипохлорита природа агониста существенна. Наибольшее ингибирование гипохлоритом наблюдается в случае агонистов ионов кальция и адреналина. Такой же результат получен при действии реагента на сульфгидрильные группы -дитионитробензойной кислоты. Возможно, что сильный эффект гипохлорита обусловлен модификацией тиолов кальциевых каналов.

Для выяснения взаимодействия гипохлорита и хлораминов с различными химическими группами определены относительные константы скорости реакции гипохлорита натрия с активными группами некоторых аминокислот и пептидов, а также проведена оценка эффективности взаимодействия Ы,Ы-дихлортаурина с серосодержащими соединениями. Получено, что наибольшая константа скорости характерна для реакции исследуемых соединний с сульфгидрильными группами.

Обнаружено, что действие хлораминов аминокислот на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы зависит от их структуры, молекулярной массы. Соединения с пониженной молекулярной массой (N-хлорсерин, N-хлораланин, N-хлорглицин) оказывают более сильный противоагрегационный эффект, чем соединения с повышенной молекулярной массой (от N-хлорфенилаланина до N-хлотреонина). Вероятно, соединения с пониженной молекулярной массой взаимодействуют с химическими группами в углублениях мембран тромбоцитов, куда ограничен доступ более крупных молекул.

Показано, что в качестве возможного противотромбоцитарного средства перспективен М,К-дихлортаурин. Он получен в твердом состоянии, характеризутся высокой стабильностью. N.N-Дихлортаурип оказывает генерализованное противотромбоцитное действие: угнетает агрегационную акивность тромбоцитов и секрецию плотных гранул, вызывает дезагрегацию агрегированных тромбоцитов. На кроликах in vivo показано, что 1Ч,М-дихлортаурин оказывает выраженное угнетение агрегационной активности тромбоцитов в тесте с рядом таких агонистов, как коллаген, АДФ, адреналин. Показано, что 1Ч,Тч1-дихлортаурин и общепринятые антитромбоцитарные препараты аспирин и тиклопидин при введении в кровь человека одинаково эффективно подавляют агрегацию

11 тромбоцитов. При введении ]Ч,1Ч-дихлортаурина в цельную кровь человека значительное ингибирование агрегации тромбоцитов не сопровождается заметным повреждением эритроцитов.

Представляемая работа выполнялась в лаборатории физико-химических методов исследования и анализа отдела биофизики (руководитель отдела -академик РАМН, профессор Владимиров Ю.А.) в НИИ физико-химической медицины (директор - академик РАМН, профессор Лопухин Ю.М.). Часть исследования была проведена на кафедре биофизики Российского государственного медицинского университета.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Мурина, Марина Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Гипохлорит натрия ингибирует функциональные процессы в тромбоцитах: начальную агрегацию (образование мелких агрегатов), обнаруживаемую нефелометрическим методом, конечную агрегацию, реакцию выброса цитоплазматических гранул, контролируемую по выходу акридинового оранжевого, циклооксигеназную пероксидацию липидов.

2. В случае обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) агрегация тромбоцитов ингибируется гипохлоритом натрия в концентрациях 1-2 мМ. При этом гипохлорит не оказывает влияния, судя по турбидиметрическим показателям, на форму исходных клеток и процесс перехода клеток из дискоидной в сфероидную форму при их активации. Экзогенные аминокислоты и таурин вызывают необычный эффект: антиагрегационное действие гипохлорита резко усиливается.

4. Обнаружено сильное антиагрегационное действие на тромбоциты в изолированном состоянии и ОТП хлораминовых производных аминокислот и родственных им соединений. Образование хлораминов обусловливает усиление действия гипохлорита на тромбоциты в ОТП экзогенными аминокислотами. N-Хлораминокислоты также ингибируют реакцию выброса АТФ из тромбоцитов.

5. Антиагрегационное действие N-хлораминокислот на тромбоциты проявляется при их активации различными агонистами (АДФ, коллагеном, адреналином, тромбином), то есть носит генерализованный характер. Для ингибирования агрегации изолированных клеток на 50 % требуется концентрация хлораминокислот 20-30 мкМ, а в случае ОТП и наиболее эффективных соединений

- около 0,5 мМ.

Степень подавления N-хлорглицином и N-хлорлейцином АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов описывается степенной функцией от концентрации хлораминов; показатель степени близок к двум. Вероятно, необходимы по крайней мере две модификации мембраны тромбоцита для угнетения его агрегационной активности.

Транспорт флуоресцентного зонда акридинового оранжевого в цитоплазмагические гранулы тромбоцитов не ингибируется N-хлораминокислотами. Можно предполагать, что хлорамины в исследуемых условиях существенно не проникают внутрь тромбоцитов.

6. Ингибирование агрегации тромбоцитов зависит от строения и физико-химических характеристик (молекулярной массы, ван-дер-ваальсового объема молекулы) N-хлораминокислот. В обогащенной тромбоцитами плазме антиагрегационный эффект в ряду: N-хлортреонин - N-хлорсерин - N-хлораланин

- N-хлорглицин, резко возрастает с уменьшением молекулярной массы. Это, вероятно, обусловлено их взаимодействием с химическими группами, находящимися в узком кармане тромбоцитов. Зависимость ингибирующего действия соединений указанного ряда от молекулярной массы (т) эмпирически описывается формулой вида /я(АТк /AT) = G ехр(-1т), где АТК и AT - степень агрегации в контроле и опыте, a G и / - константы; / > 0.

N-Хлораминокислоты с повышенной молекулярной массой от N-хлорфенилаланина до N-хлорлейцина включительно (198,5-164,5 дальтон; ван-деру ваальсовый объем 0,169-0,151 нм) оказывают одинаковое и пониженное антиагрегационное действие на тромбоциты.

7. При сравнении антиагрегационной активности соединений с различным расположением хлораминовой группы в молекуле показано, что более эффективны хлорамины с удаленной от карбоксильной хлораминовой группой (на 3-5 атомов углерода). Можно предположить наличие отрицательного заряженной группы в месте взаимодействия хлораминов с мембраной тромбоцитов.

8. В цельной крови все исследуемые N-хлораминокислоты, за исключением N-хлорфенилаланина, оказывают приблизительно одинаковый антиагрегационный эффект на тромбоциты. Наблюдаемое при этом ослабление действия N-хлораминокислот с пониженной молекулярной массой обусловлено их большей реакционной способностью по отношению к эритроцитам; взаимодействие с лейкоцитами не существенно.

9. Данные по ингибирующему действию ряда аминокислот и пептидов на окисление билирубина или иодида калия показывают, что наиболее эффективно с гипохлоритом натрия и хлораминами взаимодействуют сульфгидрильные группы. Соотношение констант скоростей реакции гипохлорита с активными химическими группами восстановленного глутатиона, окисленного глутатиона, аланина и серина, оцененное на основании интегральных кинетических формул, приближенно составляет соответственно 48 : 6,9 : 5,5 : 2,4.

Взаимодействие гипохлорита и N,N-дихлортаурина с серосодержащими группами осуществляется по различным механизмам. С одной тиометильной группой метионина, с сульфгидрильной или дисульфидной группой глутатиона в расчете на активный хлор реагируют соответственно 3,3±0.1. 3,1±0,1, 6,0±0.1 молекул гипохлорита, тогда как в случае N.N-д ихл ортаур и на - соответственно 1,4±0,1, 2,6±0,2, 4,1±0,2 хлораминовых групп.

10. В плазматической мембране тромбоцитов уже при низких концентрациях гипохлорита натрия (менее 20 мкМ) наблюдается заметное разрушение периферийных сульфгидрильных групп. Аминогруппы плазматической мембраны тромбоцитов, как установлено с помощью флуоресцентной метки флуорескамина, также модифицируются при действии гипохлорита. Одинаковая с сульфгидрильными группами степень модификации аминогрупп проявляется при концентрациях гипохлорита примерно в два раза более высоких. Можно полагать, что функциональное действие гипохлорита сопряжено с модификацией мембранных тиолов и аминогрупп, причем первые наиболее существенны при его малых концентрациях.

11. N-Хлораминокислоты при введении в кровь проявляют значительную избирательность действия на тромбоциты. Это следует из результатов сравнения

199 величин концентраций хлораминов, вызывающих 50 % ингибирование агрегации тромбоцитов в изолированном состоянии и крови.

В крови хлорамины в концентрациях, приводящих к подавлению агрегации тромбоцитов на 50 %, не вызывают существенной модификации эритроцитов по критерию их гемолиза за период примерно 10 часов и агрегации. Гемолитическое повреждение эритроцитов вызывается хлораминами в количествах, на 2-3 порядка выше необходимых для угнетения агрегации тромбоцитов.

12. Впервые получен Н>1-дихлортаурин в виде твердого стабильного препарата. Показана его антитромбоцитарная активность при введении in vitro в кровь человека, in vitro и in vivo на животных. Существует перспектива использования N, N - д и хл opi ay ри на как антитромбоцитарного средства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гипохлорит натрия оказывает свое действие на клетки крови в концентрациях 1-100 мкМ. Встает вопрос, насколько эти концентрации соизмеримы с концентрациями гипохлорита, образующимися при активации нейтрофилов. По данным Slivka [240], стимулированные форболмеристатом нейтрофилы (2 105 клеток) могут синтезировать около 10 наномолей хлорноватистой кислоты, и в очаге воспаления концентрация гипохлорита может достигать 0,1 мМ [200]. Интересно отметить, что в клинической практике используется 0,8 мМ раствор гипохлорита натрия при его введении в кровь в объеме, не превышающем 1/10 объема циркулирующей крови. Таким образом, используемые нами концентрации гипохлорита натрия являются вполне физиологическими.

При изучении действия гипохлорита на изолированные тромбоциты, было показано, что в концентрациях 10-100 мкМ гипохлорит натрия ингибирует агрегацию, реакцию выброса и циклооксигеназную пероксидацию в этих клетках, индуцированные тромбином. Наблюдалось различие в действии низких (около 10 мкМ) и высоких концентраций гипохлорита: циклооксигеназная пероксидация и реакция выброса в тромбоцитах ингибировались гипохлоритом натрия в концентрации 10 мкМ гораздо сильнее, чем их агрегация. Получено, что константа скорости реакции гипохлорита с сульфгидрильной группой примерно на порядок выше константы скорости реакции с аминогруппой. Возможно, для низких концентраций начальным этапом действия гипохлорита может быть некоторая модификация мембран клеток вследствие его взаимодействия с поверхностными сульфгидрильными группами, в результате чего происходит изменение механизмов внутриклеточной передачи сигнала. При увеличении концентрации гипохлорита его ингибирующее действие, по-видимому, связано с более существенной перестройкой мембраны, вследствие чего может происходить инактивация поверхностных рецепторов. При увеличении концентрации гипохлорита натрия функциональные процессы в тромбоцитах (агрегация и реакция выброса) ингибировались сходным образом. Существенную роль в подобной инактивации может играть модификация под действием гипохлорита доступных периферических сульфгидрильных и аминогрупп. Получено, что при действии гипохлорита (40 мкМ) происходит модификация примерно 40 и 15 % соответственно периферических сульфгидрильных и аминогрупп тромбоцитов.

Кроме прямого ингибирующего действия на тромбоциты гипохлорит оказывает косвенное действие - через модификацию компонентов плазмы. Было показано, что сывороточный альбумин, фибриноген и аланин, модифицированные гипохлоритом натрия, ослабляют агрегацию тромбоцитов, индуцированную тромбином. Это свидетельствует о том, что косвенное антиагрегационное действие гипохлорита натрия при его введении в обогащенную тромбоцитами плазму является результатом первоначальной модификации многих белков и аминокислот. В случае соединений, содержащих аминогруппы, эта модификация представляет собой образование хлораминовой группы. Именно эти группы существенны для антиагрегационных свойств модифицированных белков и аминокислот.

Нативная плазма и фибриноген эффективно устраняют модификации тромбоцитов, возникающие при прямом действии гипохлорита. Все это позволяет считать, что прямое действие гипохлорита натрия на тромбоцит ы сопряжено с его взаимодействием с плазматической мембраной, а не с компонентами цитоплазмы. В данных, касающихся участия фибриногена в косвенном действии гипохлорита и восстановлении модифицированных тромбоцитов, можно усмотреть некоторое противоречие. Допустим, что восстановление модифицированных тромбоцитов (Тц*) происходит в химической реакции с образованием модифицированного фибриногена (ФГ*). Но такой модифицированный фибриноген инакгивирует клетки. Противоречие снимается, если рассматриваемые процессы являются взаимно обратимыми, по схеме:

Тц* + ФГ^Тц + ФГ* Здесь Тц и ФГ - нативные тромбоциты и фибриноген.

В опытах с восстановлением равновесие сдвинуто вправо вследствие высокой концентрации нативного фибриногена. Антиагрегационное действие предварительно модифицированного фибриногена проявляется за счет сдвига равновесия влево. Конечно, не исключено, что процессы восстановления и инактивации тромбоцитов с участием фибриногена различны по физикохимической природе. Тогда они могут и не быть взаимно обратимыми. Как бы то ни было, важно, что в изученной системе наблюдается восстановление плазмой инактивированных тромбоцитов и дальнейшее изучение этой системы будет полезно для разработки способов хранения тромбоцитарной массы.

Согласно полученным результатам, хлораминовые производные аминокислот обладают сильным антиагрегационным действием на тромбоциты в составе ОТП в концентрациях 0,5-1 мМ. Эффект ингибирования агрегации тромбоцитов N-хлораминокислотами зависит от молекулярной массы (молекулярного объема) этих соединений. Хлораминовые производные фенилаланина, глютамина и лейцина, имеющие значительную молекулярную массу (199,45-153,45 Да) и, соответственно, большой молекулярный ван-дер-ваальсовый объем (0,169-0,151 нм3), оказывают приблизительно одинаковый антиагрегационный эффект. Это может быть результатом того, что данные соединения взаимодействуют одновременно с однотипными химическими группами тромбоцитов и компонентов плазмы. Антиагрегационный эффект других N-хлораминокислот резко возрастает с уменьшением молекулярной массы соединений. Более сильное ингибирующее действие N-хлораминокислот с пониженной молекулярной массой (вторая группа) можно объяснить их взаимодействием с химическими группами в плазматической мембране тромбоцита, стерически недоступными для соединений с повышенной молекулярной массой.

Зависимость антиагрегационного эффекта N-хлораминокислот второй группы от их молекулярной массы аппроксимируется уравнением, в котором отношение константы скорости реакции N-хлораминокислоты с тромбоцитами к константе ее взаимодействия с плазмой увеличивается с уменьшением молекулярной массы по экспоненциальному закону.

Проведено исследование зависимости антиагрегационного эффекта от концентрации отдельно взятых хлораминовых производных глицина и лейцина. Выяснено, что эту зависимость можно аппроксимировать степенной функцией, показатель степени которой, близкий к 2 для этих соединений, указывает, что необходимо по крайней мере две модификации мембраны тромбоцита для утраты клеткой агрегационной активности.

Показано, что при снижении концентрации тромбоцитов в ОТП хлораминовые производные аминокислот с повышенной молекулярной массой ингибируют агрегацию тромбоцитов несколько слабее, чем в случае неразведенной ОТП, что является следствием повышенного расходования соединений в реакциях с компонентами плазмы. Кроме того, на примере метионина показано, что введение в ОТП серосодержащих соединений приводит к снижению антиагрегационного эффекта всех исследованных N-хлораминокислот.

Влияние хлораминовых производных глицина и лейцина в конечной концентрации 1 мМ на трансформацию формы АДФ-активированных тромбоцитов слабо выражено по сравнению с их антиагрегационным действием в ОТП; не выявлено изменения процесса транспорта флуоресцентного зонда акридинового оранжевого в клетки под действием этих соединений.

Обнаружено, что эффективность действия N-хлораминокислот на агрегацию тромбоцитов при их введении в кровь меняется. Все исследуемые соединения, за исключением N-хлорфенилаланина, оказывают приблизительно одинаковый антиагрегационный эффект. Это является следствием ослабления действия на тромбоциты соединений с пониженной молекулярной массой. Полученные нами данные свидетельствуют, что лейкоциты в количестве, соответствующем их содержанию в крови, не оказывают влияния на антиагрегационный эффект всех N-хлораминокислот. Следовательно, можно полагать, что в крови N-хлораминокислоты с пониженной молекулярной массой конкурентно больше расходуются в реакциях взаимодействия с эритроцитами, чем с плазмой и тромбоцитами.

Заметно повышенную антиагрегационную активность в составе цельной крови при активации тромбоцитов агонистами АДФ и коллагеном проявляет N-хлорфенилаланин. Возможно, это обусловлено его более медленным взаимодействием с эритроцитами, в результате чего большее количество соединения взаимодействует с тромбоцитами.

При изучении действия N-хлораминокислот и ^^дихлортаурина на изолированные эритроциты было показано, что данные соединения взаимодействуют с эритроцитами. Однако важно отметить, что в крови в результате такого взаимодействия не происходит заметного повреждения эритроцитов по критерию гемолиза. В условиях, соответствующих сильному угнетению активности тромбоцитов (при введении в цельную кровь человека N,N-дихлортаурина в концентрации 1 мМ), на эритроциты приходится около 0,2 нмоль на 1 миллион клеток. Добавление в суспензию изолированных эритроцитов N,N-дихлортаурина из расчета 0,2 нмоль на 1 миллион клеток не вызывало гемолиза даже за длительный промежуток времени (12 часов) (рис. 69). Гемолиз эритроцитов регистрировался при использовании Ы,1\Г-дихлортаурина в концентрациях примерно в 1000 раз более высоких. Экстраполяция данных на низкие концентрации дихлортаурина при условии постоянства механизма модификации мембран показывает, что гемолиз эритроцитов в крови с 1 мМ N,N-дихлортаурина следует ожидать через сроки, превышающие время их жизни в организме.

Получены аргументы в пользу того, что в крови и ОТП имеет место избирательность действия хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты, то есть тромбоциты в сравнении с другими составляющими крови характеризуются повышенной способностью к взаимодействию с хлораминами. Возможно, это обусловлено тем, что плазматическая мембрана тромбоцитов, с которой прежде всего взаимодействуют хлорамины, имеет особое происхождение, формируется из плазматического ретикулума мегакариоцитов. Избирательность действия хлораминовых производных аминокислот и таурина на тромбоциты в составе ОТП и крови, по-видимому, определяется большим количеством серосодержащих групп рецепторных белков плазматической мембраны тромбоцита, с которыми эффективно реагируют хлорамины. Например, согласно данным литературы, молекула фибриногенового рецептора GP ПЬ-Ша содержит в своем составе 29 дисульфидных связей, 21 из которых определяет четвертичную структуру гликопротеина GP Ша, и 8 дисульфидных групп входят в состав GP lib [73,74]. Эти группы имеются также в структуре коллагенового (содержит 35 полуцистиновых остатков), аг-адренергического рецепторов плазматической мембраны тромбоцитов [181].

Хлораминовые соединения эффективно реагируют с серосодержащими соединениями. Мембранные сульфгидрильные группы играют важную роль в процессах адгезии и агрегации тромбоцитов. Химическая модификация сульфгидрильиых плазматических мембран приводит к угнетению агрегационной активности тромбоцитов. В наших экспериментах введение в цельную кровь N-метилмалеимида (модификатора SH-групп, проникающего внутрь мембраны и в цитоплазму) в конечной концентрации 300 мкМ снижало на 50 % АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека в составе ОТП. В суспензии изолированных тромбоцитов подавление агрегации в два раза наблюдали при действии N-метилмалеимида в конечной концентрации около 3 мкМ. Таким образом, тромбоциты (по критерию агрегации) проявляют высокую чувствительность к химической трансформации сульфгидрильиых групп. Концентрация мембранных периферических сульфгидрильиых групп всех тромбоцитов составляет приблизительно 20 мкМ (рис. 32-33) [280]. Указанный очень сильный антиагрегационный эффект N-метилмалеимида, вероятно, обусловлен его взаимодействием с внутримембранными сульфгидрильными группами.

N-Хлораминовые соединения окисляют в пределе только примерно 50 % периферических сульфгидрильиых групп тромбоцитов (рис. 33) при концентрациях 80-100 мкМ, вызывающих сильное ингибирование агрегации изолированных клеток (см., например, рис. 43). Вероятно, взаимодействие хлораминокислот с другими химическими группами (дисульфидными и др.) вносит дополнительный вклад в противотромбоцитарный эффект N-хлораминов.

Секреторная активность тромбоцитов, отражающая выброс во внеклеточную среду содержимого плотных гранул и приводящая к каскадной активации клеток крови, подавлялась хлораминовыми производными аминокислот и таурина в большей степени, чем агрегация: в одинаковых условиях снижение степени секреции тромбоцитов на 60-70 % сопровождалось угнетением их агрегации на 2535 %. Таким образом, мембранные структуры тромбоцитов, обеспечивающие реакцию выброса гранулярного аппарата, сильно модифицируются хлораминами. В этой связи необходимо вспомнить, что коллаген- и адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов кролика, сопровождающаяся реакцией выброса, подавлялась N-хлораминокислотами в большей степени, чем агрегация, вызванная АДФ и протекающая без стимуляции реакции выброса.

Итак, химическая модификации плазматической мембраны тромбоцитов может привести к инактивации рецепторов к тромбоцитарным агонистам и генерализованному подавлению агрегации и секреции тромбоцитов.

Работы многих исследователей направлены на поиск и создание лекарственных средств, способных предотвращать аретериальные тромбозы путем ингибирования активности тромбоцитов [56, 57, 227]. Химическая модификация плазматической мембраны тромбоцита в целом может обеспечить генерализованное ингибирование тромбоцитов, т.е. ингибирование их активации в ответ на действие любого агониста. Хлораминовые соединения, которые химически модифицируют серосодержащие группы плазматических мембран тромбоцитов, могут оказаться эффективными для этих целей. В результате этого могут образовываться дисульфиды тиолов, а также сульфеновые и сульфоновые группы. Ожидается, что эти продукты являются безвредными, так как они образуются и при обычном метаболизме серосодержащих аминокислот. Следует подчеркнуть, что аспирин, широко используемый в клинике для предотвращения тромбозов (раздел "Обзор литературы"), также подавляет активность тромбоцитов путем их химической модификации, ацетилируя по гидроксильной группе серина циклооксигеназу тромбоцитов [216].

Известно, что гиперактивность тромбоцитов играет важную роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Способность тромбоцитов к спонтанной агрегации в клинике является показателем риска развития острого инфаркта миокарда, в организме лишь часть тромбоцитов активируется субэндотелием в месте повреждения сосудистой стенки, остальные тромбоциты активируют друг друга [277]. Поэтому важным достоинством изученных хлораминов, как возможных антитромбоцитарных препаратов, является их способность подавлять агрегацию активированных тромбоцитов (рис. 51).

В ряду исследованных нами биогенных хлораминов лишь 1Ч,1Ч-дихлортаурин характеризуется химической устойчивостью и может считаться потенциально возможным кандидатом на роль противотромбоцитарного средства. N,N-Дихлортаурин нам удалось получить в виде твердого препарата. Важным достоинством КШ-дихлортаурина. наряду с антиагрегационной и антисекреторной активностью, следует считать его способность подавлять начальную агрегацию

195 тромбоцитов и вызывать распад уже образовавшихся агрегатов (дезагрегацию). Кроме того, сравнение эффективности антиагрегационного действия N,N-дихлортаурина с такими антитромбоцитарными препаратами, как аспирин и тиклопидин показало, что исследуемый М,1Ч-дихлортаурин при введении в кровь подавляет агрегацию тромбоцитов в составе ОТП не слабее препаратов сравнения (рис. 55, 56).

Таким образом, хлораминовые производные аминокислот и таурина способны подавлять агрегацию тромбоцитов человека, находящихся на разных этапах активации, угнетать секреторную активность тромбоцитов, циклооксигеназную пероксидацию и вызывать их дезагрегацию на фоне отсутствия заметного повреждения эритроцитов. Всё это позволяет рекомендовать данный класс соединений в качестве потенциальных тромбоцитарных ингибиторов для дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мурина, Марина Алексеевна, Москва

1. Балашова Т.С., Кубатиев А.А.О возможности регуляции блокаторов S2 -рецепторов нафтидофурилом агрегационной способности тромбоцитов больных инсулин-зависимым сахарным диабетом.//Вопросы мед.химии.-1996-Т.4 -С.337-344.

2. Булегенов К.Е., Балмуханов Б.С. Агрегация эритроцитов в присутствии Альцианового голубого.// Кардиология,- 1993.- Т. 33.- № 4,- С. 42-44.

3. Ван де Хюлст Г. Рассеяние света малыми частицами. М., ИЛ, 1961

4. Ваншинкель Н.М., Петров Н.Н. Ультраструктура и функции тромбоцитов человека. Л.: Наука. - 1982.

5. Варфоломеев С.Д., Мевх АХ Простагландины молекулярные биорегуляторы.- Изд-во МГУ,- 1985.

6. Васильев Ю.Б., Сергиенко В.И., Гринберг В.А., Мартынов А.К. Электрохимические методы детоксикации в медцине. Моделирование монооксидаз печени и молекулярных механизмов фагоцитоза. -В кн.: Итоги науки и техники. Электрохимия .-Изд-во ВИНИТИ-1990- Т.31.

7. Васильев С.А., Жердева Л.В., Мазуров А.В. Наследственные дефекты мембранных гликопротеинов тромбоцитов. // Гематол. и трансфузиол. 1994. -Т. 39. -№ 1. - С. 34-38.

8. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран,- М.: Наука.- 1980.

9. Владимиров Ю.А., Оленев В.И., Суслова Т.Б., Потапенко А.Я. Механизм перекисного окисления липидов и его действие на биологические мембраны.- В кн.: Итоги науки и техники. Биофизика, Т.5.- М.: Изд-во ВИНИТИ,- 1975.

10. Ю.Гасилин B.C., Сидоренко Б.А. Стенокардия. М.: Медицина. - 1987.

11. П.Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Влияние низкомолекулярных соединений на хемилюминесценцию люминола, обусловленную действием продуктов миелопероксидазного катализа и экзогенного гипохлорита. // Биохимия,-1988,- Т.53,- Вып.12. С.2025-2032.

12. Горюнов А.В., Рощупкнн Д.И. Перекнсное окисление липидов в тромбоцитах, индуцированное УФ-облучением. // Биол. мембр.- 1989,- Т.6.- N 5.- С. 551 -554.

13. Духанин А.С., Губаева Ф.Р. Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов. // Эксперим. и клинич. фармакология. 1998. - Т. 61. - № 4. - С. 66-71.

14. Журавлёва И.А., Мухпелентьев И.А., Виноградов Н.А. Роль окиси азота в кардиологии и гастроэнтерологии.// Клинич. Мед. 1997,- Т. 75,- № 4.- С. 18-22.

15. Кубатиев А.А., Ядигарова З.Т., Рудько И.А., Быков В.А., Тюкавкина Н.А. Влияние диквертина на содержание циклических нуклеотидов в тромбоцитах.// Бюлл.экспериметальной биологии и медицины,-1999-Т. 128- С.267-270.

16. Кубатиев А. А., Андреев С.В. Эндогенные простагландины в динамике индуцированной агрегации тромбоцитов. // В кн.:Актуальные проблемы гемостазиологии. (Под редакцией Петровского Б.В., Чазова Е.И., Андреева С.В.). Изд-во «Наука» -М.- 1979- С. 115-118.

17. Кудрявцев Н.Т., Вячеславов П.М. Прикладная электрохимия,- JL: Медицина,-1980.

18. Лакин Г.Ф. Биометрия,- М.: Высшая школа.- 1990.

19. Мазуров А.В., Васильев С.А. Структура и функции мембранных гликопротеинов тромбоцитов. // Гематол. и трансфузиол. 1994. - Т. 39. - № 1. -С. 29-34.

20. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге.-Новосибирск: Наука.- 1989.

21. Межлумян А.Г., Гаврилов И.Ю., Попов Е.Г. Количественная оценка аккумулирующей способности интактных тромбоцитов с помощью флуоресцентных красителей. // Бюл. эксп. биол. и мед.- 1987,- N 7,- С. 119121.

22. Метелица В.И. Справочник кардиолога по клинической фармакологии. М.: Медицина. - 1987.

23. Натвиг Д.Б. (ред.) Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика.- М.: Медицина.- 1980.

24. НикулинВ.А., Шура-БураБ.Л. //Врач, дело.- 1977,-N2,-С. 135 138.

25. Панасенко О.М. Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека. Дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук,- 1998 - М.

26. Панченков Г.М., Лебедев В.П. Химическая кинетика и катализ.// -1961- Изд. Московского университета 550 с.

27. Перцев С.С., Сосновский А.С., Кубатиев А.А., Пирогова Г.В.Влияние интерлейкина -1 р на агрегацию тромбоцитов у крыс Август, Вистар и ВЭГ при остром эмоциональном стрессе. Бюл. эксп. биол. и мед.- 1997- №8- С. 144-148.

28. Пеленицын А.Б., Потапенко А.Я., Рощупкин Д.И О механизме фотохимического окисления липидов в мембранах эритроцитов,- В кн.: Биоантиокислители.- М.: Наука.- 1975.

29. Пол У. Иммунология,- М.: Мир,- 1987.

30. Попов Е.Г., Габбасов Э.А., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я., Межлумян А.Г. Аккумуляция аминопроизводных акридина электронноилогными гранулами тромбоцитов. // Бюл. эксп. биол. и мед.- 1987,- N 10,- С. 435 438.

31. Попов Е.Г., Габбасов Э.А., Гаврилов И.Ю., Межлумян А.Г., Позин Е.Я. Способ исследования молекулярного переноса в клетках крови. // АС N 1363071.- Бюл. изобр. и откр,- 1987.- N 48.

32. Рощупкин Д.И. Молекулярные механизмы повреждения биомембран, липидов и белков под действием УФ-излучения.- Дисс. д.б.н.-М.- 1979.

33. Рощупкин Д.И. . Молекулярные механизмы фотоповреждения биологических мембран,- В кн.: Фотобиология животной клетки.- Л.: Наука.- 1977,- С. 23 34.

34. Рощупкин Д.И., Бержицкая В.В., Соколов А.Я. Изменение малоуглового рассеяния света тромбоцитами при их активации и агрегации.// Биофизика.-1998 -Т.43- С.503-510.

35. Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю. Способ исследования начальной агрегации тромбоцитов (варианты) и устройство для его осуществления (варианты). -Патент РФ. № 2067764.

36. Сидоренко Б.А., Преображенский Д.В. Антитромботические препараты, применяемые при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.// Кардиология. -1996,-№1,-С. 37-51.

37. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина. - 1985.

38. Чирков Ю.Ю., Белушкина Н.Н., Тыщук И. А., Северина И.С. Роль гуанилатциклазы в регуляции агрегации тромбоцитов человека. // Вестник АМН СССР, 1991.-С. 51.

39. Шаронов Б.П., Говорова Н.Ю., Лызлова С.Н. Антиокислительные свойства и деградация белков сыворотки активными формами кислорода (02\ ОСГ), генерируемыми стимулированными нейтрофилами. // Биохимия,- 1988,- т.53, вын.5,- С. 816 825.

40. Шаронов Б.П., Чурилова И.В. Окисление супероксиддисмутазы гипохлоритом. Появление изомеров, обладающих каталитической активностью.// Докл. АН СССР.-1990- Т.314-С.1500-1502.

41. Эмануэль Н.М., Сергеев Г.Б. (ред.). Экспериментальные методы химической кинетики,- М.: Высшая школа.- 1980.

42. Affolter PI., Pletscher A. Rheo-optical shape analysis of human blood platelets. // Thromb. Haemost. 1982. - V. 48. - P. 204-207.

43. Agbanyo F.R., Sixma J.J., Degroot P.O., Languino L.R., Plow E.F. Thrombospondin platelet interactions role of divalent cations, wall shear rate, and platelet membrane glycoproteins. // J. Clin. Invest. - 1993,- V. 92.- No. 1. - P. 288-296.

44. Aledort Г.М., Troup S.B., Weed R.I. Inhibition of sulfhydryl-dependent platelet functions by penetrating and non-penetrating analogues of parachloromercuribenzene. // Blood. 1968. - V.31. - No.3. - P.471-477.

45. Altman R., Scazziota A. Synergistic interactions of PAF-acether and sodium arachidonate in human platelet aggregation: unexpected results after aspirin intake. // Thromb. Res. 1986. - V. 43. - P. 113 - 120.

46. Ardlie N.G., Bell L.K., MeGuiness J.A. Synergistic potentiation by epinephrine of collagen or thrombin-induced calcium mobilization in human platelets. // Thromb. Res. 1987.-V. 46. - P.519 - 526.

47. Arnhold J., Wiegel D., Richter O., Hammerschmidt S.,Arnold K., Krumbiegel M. Modification of low density lipoproteins by sodium hypochlorite. // Biomed. Biochim. Acta.- 1991.- V. 50,- No. 3.- P. 967 973.

48. Arnhold J., Hammerschmidt S., Wagner M. , Muller S., Arnold K., Grimm E. On the action of Hypochlorite on human serum albumin. // Biomed. Biochim. Acta.- 1990-V.49-P.991-997.

49. Arnhold J., Herold W., Deev A.I. Reduction of amino groups and changes of the surface charge of liposomes on methylation and peroxidation. // Studia biophysica.- 1988.- V. 128.- No. 1,- P. 45 50.

50. Arnhold J., Mueller S., Arnold K., Sonntag K. Mechanisms of inhibition of chemiluminescence in the oxidation of luminol by sodium hypochlorite. // J. Biolumin. Chemilumin. 1993. - V. 6. - P. 307 - 313.

51. Aruoma O.I., Halliwell В., Holy B.N., Butler J. The antioxidant action of taurine hypotaurine and their metabolic precursors. // Biochim. J. -1988- V.256-P. 251-255.

52. Asakawa J., Matsushita S. // Lipids.- 1980,- V. 15,- No. 6,- P. 137 140.

53. Becker R.C. Thrombin antagonists and antiplatelet agents. // Am. J. Cardiol. 1992.-V. 69. P. 39A- 51A.

54. Becker R.C. Antiplatelet therapy in coronary heart disease. Emerging strategies for the treatment and prevention of acute myocardial infarction. // Arch. Pathol. Lab. Med. 1993.-V. 117.-.P. 89- 96.

55. Berliner S., Fishelson Z., Bruhis S., Kaufman H., Pinhas J., Aronson M. The phenomenon of leukergy: induction and detection of leukocyte aggregation in whole human blood. // J.Lab. and Clinic. Med. 1987. - V. 109. - P. 575 - 582.

56. Berkels R., Stockklauser K., Rosen P., Rosen R. Current status of platelet NO synthases.// Thromb. Reseach. 1997,- V. 87,- No. 1,- P.51-55.

57. Bertolino G., Noris P., Previtali M., et al. Platelet function after in vivo and in vitro treatment with thrombolytic agents. // Am. J. Cardiol. 1992. - V. 69. - P. 457 - 461.

58. Beukers M.W., Pirovano I.M., van Weert A., Kerkhof C.J., Ijzerman A.P., Soudijn W. Characterization of ecto-ATPase on human blood cells. A physiological role in platelet aggregation? // Biochem. Pharmacol. 1993. - V. 46. - No. 11. - P. 1959-66.

59. Bills N.K., Smith J.B., Silver M.J. Selective release of arachidonic acid from the phospholipids of human platelets in response to thrombin.// J. Clin. Invest.- 1977-V.6O-N0 l-P.1-6.

60. Blockmans D., Deckmyn H., Vermylen J. Platelet activation.// Blood Reviews. -1995,- V. 9,-P. 143-156.

61. Bondi A. Van der Waals volumes and radii. // J. Phys. Chem. 1964. - V. 68. - No. 3. -P. 441 -451.

62. Born G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. // Nature.- 1962,- V. 194.- No. 4832,- P. 927 929.

63. Born G.V.R. Observations on the change in shape of blood platelets brought about by adenosine diphosphate. // J. Physiol. Lond. 1970. - V. 209. - P. 487-511.

64. Bourguignon L.Y.W., Walker G., Bourguignon G.J. Phorbol ester-induced phosphorilation of a transmembrane glycoprotein (GP 180) in human blood platelets. // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 11775-11780.

65. Bracht F., Schror K. Isolation and identification of aptamers from defibrotide that act as thrombin antagonists in vitro. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 200. - P. 933 - 937.

66. Brass F., Ahuja M., Belmonte E., Pisarro S., Tarver A., Hoxie J. The human platalet thrombin receptor: turning it on and turning it off.// Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1994.- V. 714,-P. 1-12.

67. Braun M., Kramann J., Strobach H., et al. Incomplete inhibition of platelet secretion by low-dose aspirin. // Platelets. 1994. - V. 5. - P. 325 - 331.

68. Bredt D.S. Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule. /V Annu. Rev. Biochem. 1994. - V. 63. - P. 175 - 195.

69. Bushfield M., McNicol A., Macintyre D.E. Possible mechanisms of the potentiation of blood-platelet activation by adrenaline. // Biochem. J. 1987. - V. 241. - P. 671 -676.

70. Calvete J.J Clues for understanding the structure and function of a prototypic human integrin: the platelet glycoprotein Ilb/IIIa complex. // Thromb. Haemost. 1994. - V. 72. - P. 1 - 15.

71. Calvete J.J. On the structure and function of platelet integrin alpha lib beta 3, the fibrinogen receptor. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1995. - V. 208. - No. 4. - P. 346 -360.

72. Carr C., van den Berg J.J.M., Winterbourn C.C. Chlorination of cholesterol in cell membranes by hypochlorous acid. // Arch. Bioch.Biophys.- 1996- No 1- P.63-69.

73. Carrol R.C., Butler R.G., Morris P.A., Gerrard J.M. Separable assembly of platelet pseudopodal and contractil cytoskeletons. // Cell. 1982. - V. 30. - P. 385-393.

74. Cattaneo M., Akkawat В., Kinlough-Rathbone R.L. Ticlopidine facilitates the deaggregation of human platelets aggregated by thrombin. // Thromb. Haemost. -1994. V. 71. - P. 91 -94.

75. Cattaneo M., Lombardi R., Bettega D. Shear-induced platelet aggregation is potentiated by desmopressin and inhibited by ticlopidine. // Arterioscler. Thromb. -1993,-V. 13.-P. 393 397.

76. Chesney J.A., Eaton J.W., Mahoney J.R. Bacterial glutathione: a sacrificial defense against chlorine compounds.// J. Bacteriol. 1996.- V. 178.- P. 2131-2135.

77. Chignard M., Le Couedic J.P., Vargaftig B.B., Benveniste J. Platelet-activating factor (PAF-acether) secretion from platelets: effects of aggregating agents. // Br. J. Haematol. 1980,- V. 46. - P. 455 - 464.

78. Chilton F.H., Cluzel M., Triggiani M. Recent advances in our understanding of the biochemical interactions between PAF and arachidonic acid. // Lipids. 1991,- V. 26,-No. 12,-P. 1021 -1027.

79. Chow T.W, Heliums J.D., Moake J.L., Kroll M.H. Shear-stress-induced von Willebrand factor binding to glycoprotein lb initiates calcium influx associated with aggregation. // Blood. 1992. - V. 80. - P. 113 - 120.

80. Chronos N.A.F., Wilson D.J., Janes S.L., et al. Aspirin does not affect the flow cytometric detection of fibrinogen binding to, or release of a-granules from, human platelets. // Clin. Sci. 1994,- V. 87. - P. 575 - 580.

81. Clark R.A., Klebanoff S.J., Einstein A.B., Fever A. Peroxidase H202 - halide system: Cytotoxic effect on mammalian tumor cells. // Blood. - 1975.- V. 45.- P. 161 - 170.

82. Clark R.A., Olsson I., Klebanoff S.J. Cytotoxicity for tumor cells of cationic proteins from human neutrophil granules. // J. Cell Biol.- 1976.- V. 70,- P. 719 723.

83. Clark R.A., Klebanoff S.J. Role of the myeloperoxidase H202 - halide system in concanavalin A - induced tumor cell killing by human neutrophils. // J. Immunol.-1979,- V. 122,- No. 6,- P. 2605 - 2610.

84. Clark R.A., Szot S. Chemotactic factor inactivation by stimulated human neutrophils mediated by myeloperoxidase-catalyzed metionine oxidation. // J. Immunol.-1981-V.128- P.1507-1513.

85. Clemetson K.J. Platelet activation: signal transduction via membrane receptors. // Thromb. Haemost. 1995. - V. 74. - No. 1. - P. 111 - 116.

86. Collen D., Lijnen H.R. Strategies for improvement of thrombolytic agents. // Thromb. Haemost. 1991. - V. 66. - P. 88 - 110.

87. Collen D., Lijnen H.R. Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombolysis. // Blood. 1991.-V. 78.-P. 3114-3124.

88. Coller B.S. Platelets and thrombolytic therapy. // N. Engl. J. Med. 1990. - V. 323. -P.33 - 42.

89. Coller B.S., Anderson K., Weisman H.F. New antiplatelet agents: platelet GP Ilbllla antagonists. // Thromb. Haemost. 1995. - V. 74. - No. 1. - P. 302 - 308.

90. Colman R.W. Platelet activation: role of an ADP receptor. // Semin. Haematol. -1986.-V. 23.-P. 119- 128.

91. Cook N.S., Kottirsch G., Zerwes H.G. Platelet glycoprotein Ilbllla antagonists. // Drugs Future 1994. - V. 19. - P. 135 - 159.

92. Coutre S., Leung L. Novel antithrombotic therapeutics targeted against platelet glycoprotein Ilbllla. // Annu. Rev. Med. 1995. - V. 46. - P. 257 - 265.

93. Cristalli G., Mills D.C.B. Identification of a receptor for ADP on blood platelets by phytoaffinity labelling. // Biochem. J. 1993. - V. 291,- P. 875 - 881.

94. Cuperus R.A., Muijsers A.O., Wever R. The superoxide dismutase activity of myleoperoxidase fornation of compound III.// Bioch.Biophys.Acta -1986- V.871-P.78-84.

95. Da Prada M., Richards J.G., Kettler R. Amine storage organells in platelets.- In: J.L.Gordon (ed.). Platelets in Biology and Pathology. Elsevier.- North Holland Biomedical Press.- 1981,- P. 321 348.

96. Dallegri F., Ballestero A., Otonello L., Patrone F. Platelets as inhibitory cells in neutrophyil mediated cytolisis.// J.Lab. Clin. Med. - 1989- V. 114- P. 502-509.

97. Dandona P., Thusu K., Khurata U., Love J., Aljada A., Mousa Sh. Calcium, calmodulin and protein kinase С dependence of platelet shape change.// Thromb. Res each. 1996,- V. 81,- No. 2,- P. 163-175.

98. Davies J.M.S., Horwitz D.A., Davies K.JA. Inhibition of collagenase activity by N-chlorotaurine a product of activated neutrophils. // Arthritis and Rheumatism.-1994- V. 37- No 3- P.424-427.

99. Defreyn G., Bernat A., Delebassee D., et al. Pharmacology of ticlopidine: a review. // Thromb. Haemost. 1989. - V. 15. - P. 159 - 166.

100. Deranleau D.A., Dubler D., Rothen C., Luscher E.F. Transient kinetics of the rapid shape change of unstirred human platelets stimulated with ADF. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982,- V. 79. - P. 7297 - 7301.

101. Dorn H.J.W., Dejesus A. Human platelet aggregation and shape change are coupled to separate thromboxane A2 prostaglandin H2 receptors. // Am. J. Physiol. -1991. -V. 260. - P. H327 - H334.

102. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. //Arch. Bioch.Biophys.- 1959- V.82-P.70-77.

103. Fitzgerald D.J., Fitzgerald G.A. Role of thrombin and thromboxane A2 in reocclusion following coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. - V. 86. - P. 7585 - 7589.

104. Folkes L.K, Candeias L., Wardman P. Kinetics and mechanisms of hypochlorous acid reactions.// Arch. Bioch.Biophys.- 1995- V.323- P.120-126.

105. Foote C.S., Goyne Т.Е., Lehrer R.J. Assesment of chlorination by human neutrofils. //Nature.- 1983- V.301-P.715-716.

106. Frishman W.H., Miller K.P. Platelets and antiplatelet therapy in ischemic heart disease. // Curr. Probl. Cardiol. 1986. - V. 22. - P. 73 - 136.

107. Fuster V. Mechanisms leading to myocardial infarction: insights from studies of vascular biology. // Circulation. 1994. - V. 90. - P. 2126 - 2146.

108. Gabbasov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.Yu., Pozin E.Ya. Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension. // Thromb. Res. 1989. - V. 54. - No. 3. - P. 215 - 223.

109. Gent M., Blakely J.A., Easton J.D. The Canadian American Ticlopidine Study (CATS) in thromboembolic stroke. // Lancet. 1989 - V. 1. - P. 1215 - 1220.

110. Gerrard J.M., White J.G., Peterson D.A. The platelets dense tubular system: its relationship to prostaglandin systesis and calcium flux. // Thromb. Haemost. 1978. -V. 40.-No. 2.-P. 224 - 231.

111. Golino P., Buja M., Ashton J.H. Effect of thromboxane and serotonin receptor antagonists on intracoronary platelet deposition in dogs with experimental stenosed coronary arteries. // Circulation. 1988. - V.78. - P. 701 - 711.

112. Goodnith S.H., Coull B.M., McAnulty J.H., Taylor L.M. (153. Antiplatelet therapy Part I. // West. J. Med. - 1993. - V. 158. - P. 385 - 392.

113. Goodnith S.H., Coull B.M., McAnulty J.H., Taylor L.M. Antiplatelet therapy -Part II.//West. J. Med. 1993.-V. 158. - P. 506 - 514.

114. Gray E.T., Margerum D.W., Huffman R.P. (45. Chloramine equilibria and the kinetics of disproportionation in aqueous solution. // Am. Chem. Soc. Symp. Ser.-1978,- No. 82,-P. 264-277.

115. Greaves M.W., Hensby C.N., Plummer N.A., Warin A.P. The effect of short wave length ultraviolet С (254 nm) irradiation on arachidonic and prostaglandins E2 and F2 concentration in human skin. //Brit. J. Pharmacol.-1977,- V. 6,- P. 445 -446.

116. Grisham M.B., Jefferson M.M., Thomas E.L. Role of monochloramine in the oxidation of erythrocyte hemoglobin by stimulated neutrophils. // J. Biol. Chem.-1984,- V. 259,- No. 11,- P. 6757 6772.

117. Hamberg M., Samuelson B. Prostaglandin endoperoxides. Novel transformation of arachidonic acid in human platelets. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. - N.12. -No. 8. - P. 3400 - 3404.

118. Hamberg M., Swenson I., Samuelson B. Thromboxanes: a new group of biologically active compounds derived from prostaglandin endoperoxides. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. - V. 72. - No. 8. - P. 2994 - 2998.

119. Han P., Boatwright C., Ardlie N.G. Verapamil and collagen-induced platelet reactions evidence for a role for intracellular calcium in platelet activation. // Thromb. Haemostas. - 1983. - V.50. - No.2. - P. 537-541.

120. Hantgan R.R. A study of the kinetics of ADP-triggered platelet shape change. // Blood. 1984. - V. 64. - P. 896 - 906.

121. Harbury С.В., Schrier S.L. Modification of platelet sulfhydryl groups. // Thromb. Diath. Haemorrh. 1974. - V.31. - No.3. - P.469.

122. Hardisty R.M., Powling M.J., Nokes T.J.C. The action of ticlopidine on human platelets: studies on aggregation, secretion, calcium mobilization and membrane glycoproteins. // Thromb. Haemost. 1990. - V. 64. - P. 150 - 155.

123. Harrison J.E. The functional mechanism of myleoperoxidase.//In : Cancer Enzymology. Eds. Schultz J., Cameron B.F. New-York , Academic Press.-1976-P.307-317.

124. Harrison J.E., Schultz J. Studies of cholorinating activity of myleoperoxidase.// J. Biol.Chem.-1976-V.251 -P. 13 71 -1374

125. Hass W.K., Easton J.D., Adams J.H.P., et al. A randomized trial comparing ticlopidine hydrochloride with aspirin for the prevention of stroke in high-risk patients. //N. Engl. J. Med. 1989. - V. 321. - P. 501 507.

126. Held A.M., Hurst J.K. Ambiguity associated with use singlet oxygen trapping agents in myeloperoxidase catalysed oxidation. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1978,- V. 81,- No. 3,- P. 878 - 885.

127. Herbert J.M., Tissinier A., Defreyn G., et al. Inhibitory effect of clopidogrel on platelet adhesion and intimal proliferation after arterial injury in rabbits. // Arterioscler. Thromb. 1993. - V. 13. - P. 1171 - 1179.

128. Holt J.C., Niewiarowski I. Biochemistry of a-granule proteins. // Semin. Haematol. 1985. - V. 22. - P. 151-163.

129. Honda Z., Nakamura M., Miki I. et al. Cloning by functional expression of platelet-activating factor receptor from guinea-pig lung. // Nature. 1991. - V. 349. -P. 342 - 346.

130. Hopkins N., Gorman R.R. Regulation of endothelial cell cyclic nucleotide metabolism by prostacyclin. // J. Clin. Invest. 1981. - V. 67. - P. 540 - 546.

131. Hourani S.M., Hall D.A. Receptors for ADP on human blood platelets. // Trends. Pharmacol. Sci. 1994. - V. 15. - No. 4. - P. 103-108.

132. Isenberg W.M., McEver R.P.,Phillips D.R., Shuman M.A., Bainton D.F. The platelet fibrinogen receptor: An immunologic-surface replica study of agonist-induced ligand binding and receptor clustering. // J. Cell Biol. 1987. - V. 104. - P. 1655 -1663.

133. ISIS-2 Collaborative Group. Randomized trial of intravenous streptokinase, oral aspirin, both, or neither among 17,187 cases of suspected acute myocardial infarction. // Tancet. 1988. - V. 2. - P. 349 - 360.

134. Jackson S.P., Yuan Y.P., Schoenwaelder S.M., Mitchell C.A. Role of the platelet integrin glycoprotein Ilb-IIIa in intracellular signaling. // Thromb. Res. 1993. - V. 71. - No. 2. - P. 159-168.

135. Kaplan K.L., Broekman M.J., Chernoff A., Lesznik G.R., Drillings M. Platelet a-granule proteins: studies on release and subceelular localization. // Blood. 1979. - V. 53. - P. 604-618.

136. Kehrel B. Platelet-collagen interactions. // Semin. Thromb. Hemost. 1995. - V. 21. - No. 2. - P. 123 - 129.

137. Kehrel B. Platelet Receptors for collagens. // Platelets. 1995. - V. 6. - P. 11 - 16.

138. Kehrel В., Kronenberg A., Rautenberg J., et al. Platelets deficient in glycoprotein Illb aggregate normally to collagens type I and III but not to collagen type V. // Blood. 1993. - V. 82. P. 3364 - 3370.

139. Kessels H., Beguin S., Andree H., et al. Measurement of thrombin generation in whole blood: the effect of heparin and aspirin. // Thromb. Haemost. 1994. - V. 72. -P. 78 - 83.

140. Kimura Y., Okuda H. Effects of alpha- and beta-adrenergic antagonist on epinephrine-induced aggregation and intracellular free calcium concentration in human platelets. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 202. - No. 2. - P. 1069-1075.

141. Klebanoff S.J., Clark R.A. The neutrophil function and clinical disorders.-Amsterdam North Holland Publ. Co.- 1978,- P. 425 - 466.

142. Knudsen J.B., Kjoller E., Skagen K., et al. The effect of ticlopidine on platelet functions in acute myocardial infarction: a double blind controlled trial. // Thromb. Haemost. 1985. - V. 53. - P. 332 - 336.

143. Kotze H.F., Lamprecht S., Badenhorst P.N., et al. In vivo inhibition of acute platelet-dependent thrombosis in a baboon model by Bay U3405, a thromboxane A2-receptor antagonist. // Thromb. Haemost. 1993. - V. 70. - P. 672 - 675.

144. Koyama I., Nakamori K., Nagahama Т., Ogasawara M., Nemoto M. The reactivity of taurine with hypohlorous acid and its application for eye drops.// Adv. Exp. Med. Biol. -1996,- V. 403. P. 9-17.

145. Lanza F., Beretz A., Stierle A., Hanau D., Kubina M., Cazenave J.P. Epinephrine potentiates human platelet activation but is not an aggregating agent. // Am. J. Physiol. 1988,- V. 255,- P. H 1276 - H1288.

146. Lapetina E.G. The signal transduction induced by thrombin in human platelets. // FEBS Lett. 1990. - V. 268. - P. 400 - 404.

147. Larrimer N.R., Balcerzak S.P., Metz E.N., Lee R.E. Surface structure of normal human platelets. // Am. G. Med. Sci. 1970. - V. 259. - P. 242-256.

148. Latimer P., Wamble F. Light scattering by aggregates of large colloidal partcles. // Appl.Optics.- 1982- V.21- P.24-47.

149. Lee C.F. Kinetics of reactions between chlorine and phenolic compound.- In: Principles and applications of water chemistry (Faust S.D., Hunter J.W. editors).-1967- P. 54 72.

150. Learm. D.V., Fried W.A., Thomas E.L Taurine and hypotaurine content of human leucocytes.// J. Leukoc. Biol. 1990. - V. 48,- P. 174-182.

151. Lips J.P.M., Sixma J.J., Schiphorst M.E. Binding of adenosine di-phosphate to human blood platelets and to isolated blood platelet membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V. 628. - P. 451-467.

152. Mahautsmith M.P., Sage S.O., Rink T.J. Rapid ADP-evoked currents in human platelets recorded with the nystatin permeabilized patch technique. // J. Biol. Chem. -1992. V. 267. - No. 5. - P. 3060-3065.

153. Marguerie G.A., Edgington T.S., Plow E.F. Interaction of fibrinogen with its platelet receptor as part of a multistep reaction in ADP-induced platelet aggregation. // J. Biol. Chem. 1980. - V. - 255. - No. 1. - P. 154 - 161.

154. Marguerie G.A., Plow E.F. The fibrinogen dependent pathway of platelet aggregation. // Ann. N.-Y. Acad. Sci. -1983. V. 408. - P. 556 - 566.

155. Marguerie G.A., Plow E.F.,Edgington T.S. Human platelets possess an inducible and saturable receptor specific for fibrinogen. // J. Biol. Chem. 1979. - V. - 254. -No. 12.-P. 5357 - 5363.

156. Marietta M., Faeehinetti F., Neri I. L-arginine infusion decreases platelet aggregation through an intraplatelet nitric oxide release. // Thromb. Reseach.- 1997,-V. 88,- No. 2,-P. 229-235.

157. Martin Caterine. Aspirin: New life for old drug.// Chem. Brit. 1996,- V.32. -No. 6.-P. 8-10.

158. Matchar D.B., McCrory Barnett J.M., Feussner et al. // Medical treatment for stroke prevention. // Ann. Intern. Med. 1994. - V. 121. - P. 41 - 53.

159. Mayne R. Collagenous proteins of blood vessels. // Arteriosclerosis 1986. - V. 6. -P.593 - 685.

160. McTavish D., Faulds D., Goa K.L. Ticlopidine: an updated review of its pharmacology and therapeutic use in platelet- dependent disorders. // Drugs 1990. -V. 40. - P. 238 - 259.

161. Meyer D., Girma J.P. Von Willebrand factor: structure and function. // Thromb. Haemost. 1993,- V. 70. - P. 99 - 104.

162. Milton J.G., Frojmovic M.M. Adrenaline and adenosine diphosphate-induced platelet aggregation require shape change. Importance of pseudopods. // J. Lab. Clin. Med. 1984. - V. 104. - P. 805 - 815.

163. Milton J.G., Frojmovic M.M. Adrenalin and adenosin diphosphate-induced platelet aggregation require shape change. Importance of pseudopodies. // J. Lab. Clin. Med. 1984. - V. 104. - P. 805-815.

164. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. // Pharmacol. Rev. 1991,- V. 43. - P. 109 - 142.

165. Moran N., Fitzgerald G.A. Mechanisms of action of antiplatelet drugs. In.: Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J., Salzman E.W., eds. Hemostasis and thrombosis:basic principles and clinical practice. 11 Philadelphia: JB Lippincott. 1994. - P. 1623 - 1637.

166. Morris J.C. Kinetics of reaction between aqueous chlorine and nitrogen compounds.- In: Principles and applications of water chemistry ( Faust S.D., Hunter J.W., ed).- 1967,-P. 23-51.

167. Mullane K.M., Farnabaio D. Thromboxane synthetase inhibitors reduce infarct size by a platelet-dependent, aspirin sensitive pathway. // Circ. Res. 1988. - V. 62. -P. 668 - 678.

168. Musial J., Radwan J. and Szczeklik A. Aspirin delays thrombin generation in vitro through interaction with platelet phospholipids.// Thromb. Reseach. 1997,- V. 85,-No. 4,-P. 367-368.

169. Nathan C.F., Silverstein S.C., Brukner L.H., Cohn Z.A. Extracellular cytolysys by activated macrophages and granulocytes. Hydrogen peroxide as a mediator of cytotoxicity. // J. Exp. Med.- 1979,- V. 149,- No. 1,- P. 100 113.

170. Nishizuka Y. The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and tumor promotion. // Nature. 1984. - V. 308. - P. 693 - 698.

171. O'Brien J.R. Effects of adenosine diphosphate and adrenaline on mean platelet shape. // Nature. 1965. V. 207. - P. 306-307.

172. Packham M.A., Guccione J.P., GreenbergJ.P Release of 14C-serotonine during initial platelet changes induced by thrombin, collagen or A 23187. //Blood.-1977,- V.50.- No. 5,- P. 915 926.

173. Park E., Shuller-Levis G., Qwin M. Taurine chloramine inhibits production of nitric oxide and TNF-a in activated RAW 264.7 cell by mechanisms that involve transcriptional and translational events.// J. Immunol.-1995- V.154- P.4778-4784.

174. Park E., Schuller-Levis G., Jia J.H., Quinn M.R Preactivation exposure of RAW 264.7 cells to taurine chloramine attenuates subsequent production of nitric oxide and expression of iNOS mRNA.// J. Leukoc. Biol.- 1997,- V. 61.- No. 2,- P. 161-166.

175. Patscheke H. Role of activation in epinephrine-induced aggregation of platelets. // Thromb. Res. 1980. - V. 17. - P. 133-142.

176. Patscheke H., Womer P. Platelet activation detected by turbidimetric shape-change analysis. Differential influence of cytochalasin В and prostaglandin Е. // Tromb. Res. 1978. - V. 12. - No. 3. - P. 485 - 496.

177. Pengo V., Boschello M., Marzari A., et al. Adenosine diphosphate (ADP) induces a-granules release from platelets of native whole blood and is reduced by ticlopidine but not by aspirin or dipyridamole. // Thromb. Haemost. 1986. - V. 56. - P. 147 -150.

178. Prutz W.A. Prutz W.A. Hypochlorous acid interactions with thiols, nucleotides, DNA, and other substrates.// Arch. Biochem. Biophys.- 1996. -V.332. -No.l.- P.l 10.

179. Pero R.W., Sheng Y., Olsson A., Brungelsson C., Lung-Pero M. Hypohlorous acid/N-chloramines are naturally produced DNA repair inhibition.// Carcinogenesis. -1996,-V. 17.- P. 13-18.

180. Plow E.F., D'Souza S.E., Ginsberg M.H. (85. Consequences of the interaction of platelet membrane glycoprotein GP Ilbllla and its ligands. // J. Lab. Clin. Med.1992. V. 120. - No. 2. - P. 198 - 204.

181. Popov E.G., Gabbasov Z.A., Gavrilov I.Yu., Pozin E.Ya., Mejlumian A.G. Accumulation and release of acridine derivatives by intact platelets. // Thromb. Res.-1987,-V. 47,-P. 639 645.

182. Puri R.N., Colman R.W. Reocclusion after thrombolytic therapy: strategies for inhibiting thrombin-induced platelet aggregation. // Blood Coagul. - Fibrinolysis.1993,- V. 4.-P. 465 478.

183. Quinn M.R., Park E., Schuller-Levis G. Taurine chloramine inhibits prostaglandin E2 production in activated RAW 264.7 cells by posttranscriptional effects on iducible cuclooxigenase expression.// Immunol Lett. -1996.- V. 50.- P.185-188.

184. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. The role of nitric oxide and cGMP in platelet adhesion to vascular endothelium. // Biochem. Biophys. Res. Comm. -1987.-V. 148.-P. 1482 1489.

185. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. An L-arginine: nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990 -V.87.-P 10043 - 10047.

186. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. The anti-aggregating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide. // Brit. J. Pharmacol. 1987. - V. 92,- P. 639 - 646.

187. Rao A.K., Mintz P.D., Lavine S.J. Coagulant activities of platelets in coronary artery disease. // Circulation. 1984. - V. 69. - P. 15 - 21.

188. Rasmussen U.B., Vouret-Craviari V., Jallat S. cDNA cloning and expression of hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca mobilisation. // FEBS Lett. 1991. -V. 288. - P. 123 - 128.

189. Rinder C.S., Student L.A., Bonan J.L. Aspirin does not inhibit adenosine diphosphate-induced platelet alpha-granule release. // Blood. 1993. - V. 82. - P. 505 -512.

190. Roald H.E., Barstad R.M., Kierulf P. Clopidogrel: a platelet inhibitor which inhibits thrombogenesis in non-anticoagulated human blood independently of the blood flow conditions. // Thromb. Haemost. 1994. - V. 71. - P. 655 - 662.

191. Rote W.E., Mu D.X., Lucchesi B.R. Thromboxane antagonism in experimental canine carotid artery thrombosis. // Stroke. 1993. - V. 24. - P. 820 - 828.

192. Roth G.J., Calverley D.C. Aspirin, platelets and thrombosis: theory and practice. // Blood. 1994. - V. 83. - P. 885 - 898.

193. Roth G.J., Stanford N., Majerus P.W. Acetilation of prostaglandin synthase by aspirin. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1975. - V. 72. - P. 3073.

194. Roux S.P., Sakariassen K.S., Turitto V.T., et al. Effect of aspirin and epinephrine on experimentally induced thrombogenesis in dogs. // Arterioscler. Thromb. 1991. -V. 11. -P. 1182 - 1191.

195. Rudnick G., Fishkes H., Nelson P.J., Schuldiner S. Evidence for two distinct serotonin transport systems in platelets. // J. Biol. Chem.- 1980.- V. 255.- No. 8.-P.3638 3641.

196. Ruggeri Z.M. Mechanisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation. // Thromb. Haemost. 1993. - V. 70. - P.119 - 123.

197. Saelman E.U.M., Nieuwenhuis H.K., Hese K.M., et al. Platelet adhesion to collagen types I through VIII under conditions of stasis and flow is mediated by GP Ialla. // Blood. 1994. - V. 83. - P. 1244 - 1250.

198. Sage S.O., Merritt J.E., Hallam T.J., Rink T.J. Receptor mediated calcium entry in fura-2 loaded human platelets stimulated with ADP and thrombin. // Biochem. J. -1989.-V. 258.-P. 923 - 926.

199. Saltzman A.G., Morse В., Whitman M.M., Ivanshchenko Y., Jaye ML, Felder S. Cloning of the human serotonin 5-HT2 and 5-HT1C receptor subtypes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - V. 181.- P. 1469 - 1478.

200. Santoro S.A. Molecular basis of platelet adhesion to collagen. In: Platelet membrane receptors: molecular biology, immunology, biochemistry, and pathology.(Ed. Jamieson G.A.) New York: Alan R. Liss. - 1988. - P. 291 - 314.

201. Sato Т., Hashizume Т., Fujii T. N-Ethylmaleimide inhibits Ca2f influx induced by collagen or arachidonate on rabbit platelets. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V. 928.-No. 3,-P. 266-271.

202. Savage В., Shattil S.J., Ruggeri Z.M. Modulation of platelet function through adhesion receptors a dual role of glycoprotein Ilbllla mediated by fibrinogen and GPIb-vWF. //J. Biol. Chem. - 1992. - V. 267. - P. 11300 - 11306.

203. Schror K. Antiplatelet drugs. A comparative review. // Drugs 1995. - V. 50. -No. 1.-P. 7-28.

204. Schror К. The basic pharmacology of ticlopidine and clopidogrel. // Platelets1993.-V. 4.-P. 252 -261.

205. Schumacher W.A., Steinbacher Т.Е., Heran C.L. Effects of antithrombotic drugs in a rat model of aspirin-insensitive arterial thrombosis. // Thromb. Haemost. 1993. -V. 69.-P. 509 - 514.

206. Selvaraj R.I., Paul B.B., Strauss R.R., Jacobs A.A., Sbarra A.J. (18. Oxidative peptide cleavage and decarboxylation by the MPO-H202-antimicrobial system. // Infection and immunity.- 1974.- V. 9,- No. 2.- P. 255 260.

207. Sergienko V.I., Vasiliev Yu.B. Electrochemical methods of detoxication for medical use.- Harwood Academic Publishers GmbH.- 1989.- P. 54.

208. Shen Y.C., Hong C.Y. Effect of trilinolein on cyclic nucleotide formation in human platelets: relationship with its antiplatelet effect and nitric oxide synthesis. // Br. J. Pharmacol. 1995. - V. 116. - No. 1. - P. 1644-1648.

209. Siess W. Molecular mechanisms of platelet activation. // Physiol. Reviews. -1989. V. 69. - No. 1.

210. Silk S.T., Wong K.T.H., Marcus A.J. Arachidonic acid releasing activity in platelet membranes: Effects of sulfgydryl-modifying reagents. // Biochemistry 1981 -V. 20, P. 391 - 397.

211. Silverstein R.M., Hager L.P. The chloroperoxidase catalysed oxidation of thiols and disulfides to sulfenyl chlorides. // Biochemistry.- 1974.- V. 13,- No. 25.- P. 5069 - 5073.

212. Simoons M.L., de Boer M.J., van den Brand M.J.B.M., et al. Randomised trial of a GP Ilbllla platelet receptor blocker in refractory unstable angina. // Circulation1994.-V. 89.-P. 596 -603.

213. Skaer R.J. Platelet degranulation.- In: Gordon J.L.(ed.). Platelets in Biology and Pathology. Elsevier.- North Holland Biomedical Press.- 1981.- P. 321 348.

214. Slivka A., LoBuglio A.F. Weiss S.J. A potential role for hypochlorous acid in granulocyte mediated tumor cell cytotoxicity. // Blood.- 1980,- V. 55.- No. 2,- P. 347 - 350.

215. Smith I.B., Ingerman C.M., Silver M.J. Malondialdehyde formation as an indicator of prostaglandin production by human platelets. // J. Lab. Clin. Med.-1976,- V. 88,- No. 1,- P. 167 172.

216. Smith J.W., Piotrowicz R.S., Mathis D. A mechanism for divalent cation regulation of beta 3-integrins. //J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - No. 2. - P. 960-967.

217. Soslau G., Brodsky L, Parker J. Occupancy of P2 purinoceptors with unique properties modulates the function of human platelets. // Biochim. Biophys. Acta. -1993. V. 1177. - No. 2. - P. 199-207.

218. Steen V.M., Holmsen H. Synergism between thrombin and epinephrine in human platelets: different dose-response relationships for aggregation and dense granule secretion. // Thromb. Haemost. 1985. - V. 54. - P. 680 - 683.

219. Stelmaszynska Т., Zgliczynska J.M. Myeloperoxidase of human neutrophilic granulocytes as chlorinating enzyme. // Eur. J. Biochem.- 1974.- V. 45.- P. 305 312.

220. Takahara K., Murray R., Fitzgerald G.A., Fitzgerald D.J. The response to thromboxane A2 analogues in human platelets. Discrimination of two binding sites linked to distinct effector systems. // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P.6836 - 6844.

221. Thomas E.L. Myeloperoxidase, hydrogen peroxide, chloride antimicrobial system: effect of exogenous amines on antibacterial action against E. coli. // Infect. Immunity.- 1979,- V. 25.- N0. 1.- P. 110 116.

222. Thomas E.L., Grisham M.B., Jefferson M.M. Myeloperoxidase dependent effect of amines on functions of isolated neutrophiils. // J. Clin. Invest.- 1983.- V. 72.- No. 2,-P. 441 -454.

223. Thomas E.L., Jefferson M.M., Grisham M.B. Myeloperoxidase catalized incorporation of amines into proteins: role of hypochlorous acid and dichloramines. // Biochemistry. - 1982. - V. 21. - P. 6299 - 6308.

224. Thomas G., Skrinska V.A., Lucas F.V. The influence of glutathione and other thiols on human platelet aggregation. // Thromb. Res. 1986 - V. 44. - P. 859 - 866.

225. Topol E.J. Novel antithrombotic approaches to coronary artery disease. // Am. J. Cardiol. 1995. - V. 75. - P. 27B - 33B.

226. Trip M.D., Cats V.M., van Capelle F.J.L. Vreeken J. Platelet hyperactivity and prognosis in survivors of myocardial infarction. // N. Engl. J. Med. 1990. - V. 322. -P. 1549 - 1554.

227. Tsao P.W., Forsythe M.S., Mousa Sh.A. Dissotiation between the antiaggregatory and anti-secretory effects of platelet integrin ацЬРз (GP Ilb/IIIa) antagonists, C7E3 and DMP 728. // Thromb. Reseach. 1997,- V. 88,- No. 2,- P. 137146.

228. Uchiyama S., Yamazaki M., Maruyama S., et al. Shear-induced platelet aggregation in cerebral ischemia. // Stroke. 1994. - V. 25. - P. 1547 - 1551.

229. Verhoeven A.J.M., Mommersteeg M.E., Akkerman J.W.N. Comparative studies on the energetics of platelet responses induced by different agonists. // Biochem. J. -1986.-V. 236.-P. 879 887.

230. Verstraete M. Thromboxane synthase inhibition, thromboxane/endoperoxide receptor blockade and molecules with the dual property. // Drugs Today 1993. - V. 29.-P. 221 -232.

231. Verstraete M. New developments in antiplatelet and antithrombotic therapy. // Europ. Heart J. 1995. - V. 16. - Supplem. L. - P. 16 - 23.

232. Verstraete M., Zoldhelyi P. Novel antithrombotic drugs in development. // Drugs.- 1995. V. 49,- No. 6. - P. 856 - 884.

233. Villa S., Colotta F., de Gaetano G., Semeraro N. Arachidonic acid and leukotriene B4 induce aggregation of human peripheral blood mononuclear leukocytes in vitro. // Br. J. of Haematology.- 1984,- V. 58,- No. 1,- P. 137 -146.

234. Vizcaino-Salazar G. Platelet physiology. Advances in platelet reactivity. // Invest. Clin. 1994.-V. 35.-No. 1,-P. 41-62.

235. Ware J.A., Smith M., Salzman E.W. Synergism of platelet aggregating agents. Role of elevation of cytoplasmic calcium. // J. Clin. Invest. - 1987. - V. 80. - P. 267 -271.

236. Weil J.C., Morris J.C. Kinetic studies on the chloramine N-chlormethylamine and N-chlordimethylamine. //J. Amer. Chem. Soc.- 1949.- V. 71.- No. 5,- P. 1664 1671.

237. Weiss S., LoBuglio A.F. Biology of disease: phagocyte generated oxygen metabolites and cellular injury. //Lab. Invest.- 1982,- V. 47.- No. 1.- P. 5 - 18.

238. Weiss S., Slivka A. Monocyte and granulocyte mediated tumor cell destruction: a role for the hydrogen peroxide - myeloperoxidase - chloride system. // J. Clin. Invest.- 1982,- V. 69,- No. 2,- P. 255 - 262.

239. White B.P., Sullivan A.T., Lumley P. Prevention of intracoronary thrombosis in the anaesthetised dog: the importance of thromboxane A2 and thrombin. // Thromb. Haemost. 1994. - V. 71,- P. 366 - 374.

240. White J. G. Electron microscopic studies of platelet secretion. // Prog. Haemost. Thromb. 1974. - V. 2. - P. 49-98.

241. White J. G. Shape change. // Thromb. Diath. Haemorrh. 1974. - V. 60. - P. 159171.

242. White J.G., Escolar G. The blood platelet open canalicular system a two-way street. //Eur. J. Cell Biol.-1991.-V. 56,-No. 2,-P. 233 - 242.

243. Wiberg N. Lehrbuch der Anorganische Chemil. // Berlin New-York: Walter de Gruyter.- 1985- P.422-425.

244. Winterbourn C.C. Comparative reactivities of various biological compounds with myeloperoxidase-hydrogen- peroxide-chloride, and similarity of oxidant to hypochlorite. // Вioch.Biophys.Acta -1985- V.840- P.204-210.

245. Winterbourn C.C., van den Berg J.J.M., Roitman E., Kuypers F.A. Chlorohydrin formation from unsaturated fatty acids reacted with hypochlorous acid. // Arch. Bioch.Biophys.- 1993- V.34- P.63-69.

246. Wright C.E., Tallan H.H., Lin Y.Y. //Ann. Rev. Biochem. 1986. V.55. P.427.

247. Wu J.-R., Zhou Z., Bittar E.E. Abolishing with chloramine-T of inactivation in barnacle muscle fibers results in stimulation of ouabain insensitive sodium efflux. // Biochim. et biophys. Acta. Biomembranes. - 1992,- V. 1112,- No. 1.- P. 99 - 104.

248. Wu K.K. Platelet activation mechanisms and markers in arterial thrombosis. // J. Int. Med. 1996. - V. 239. - P. 17-34.

249. Wuthrich C., Deranleau D., A., Dubler D., Luscher E. Human blood platelet secretion: Optical multichannel analyzer measurements using acriflavine as a release indicator.// Biochemistry.- 1984-V.23- P.1224-1229.

250. Xiao Z., Theroux P., Levesque J., et al. Platelet aggregation in response to the thrombin receptor agonist peptide in patiens with coronary artery disease. Circulation 1994. - V. 90.-P.371 - 378.

251. Yamada K, Kubo K, Shuto K, Nakamizo N. Involvment of disulfide-sulfhydryl interaction in anti-platelet actions of KF 4939. // Thromb. Res. -1985,- V. 38.- P. 6169.

252. Zaverio M. Ruggeri The role of von Willebrand factor and fibrinogen in the initiation of platelet adhesion to thrombogenic surfaces.// Thromb. Haemost. 1995. V.74. No.l. P.460-463.225

253. Zgliczynska J.M., Stelmaszynska Т., Ostrowski W., Naskalski J., Sznajd J. Myeloperoxidase of human leukemic leukocytes. Oxidation of aminoacids in the presence of hydrogen. // Eur. J. Biochem.- 1968,- V. 4.- No. 4.- P. 540 547.

254. Zgliczynska J.M., Stelmaszynska Т., Domanski., Ostrowski W. Chloramines as intermediates of oxidation reaction of aminoacids by myeloperoxidase. // Biochem. Biophys. Acta.- 1971,- V. 235,- No. 2.- P. 419 424.

255. Zhou W., Javors M.A., Olson M.S. Platelet activation factor as an intercellular signal in neutrophil-dependent platelet activation. // J. Immunol. 1992. - V. 149. -No. 5.-P. 1763-1769.

Информация о работе

Мурина, Марина Алексеевна
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.02

Диссертация

Физико-химические механизмы действия на тромбоциты хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы