Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хлорамины аминокислот - ингибиторы агрегации тромбоцитов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Хлорамины аминокислот - ингибиторы агрегации тромбоцитов"

На правах рукописи

Петрова Анастасия Олеговна

Хлорамины аминокислот - ингибиторы агрегации тромбоцитов: физико-химические свойства и механизм действия

Биофизика - 03.01.02

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 ОКТ '/012

Москва - 2012

005053377

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении нау* «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федеральног медико-биологического агентства»

Научный руководитель:

доктор биологических наук Мурина Марина Алексеевна

Официальные оппоненты:

Потапенко Александр Яковлевич - доктор биологических наук, профессор, ГБО' ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, заведующий кафедро медицинской и биологической физики

Рууге Энно Кустович - доктор физ.-мат. наук, профессор, ФГБУ «Российски кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития Р<1 руководитель лаборатории физико-химических методов исследования

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки Российско академии наук

Защита состоится «% »ркТ.йЬ^и/ 2012 г. в /оІ.С'Отасов на заседали диссертационного совета Д 208.057.01 при ФГБУН НИИФХМ ФМБА России по адресу 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА Россиі

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Мурина М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сердечно-сосудистые заболевания наравне с онкологическими заболеваниями и диабетом прочно удерживают первенство среди самых распространенных и опасных заболеваний XX и XXI веков.

Патологический тромбоз, связанный с усиленной активностью тромбоцитов и повышенным внутрисосудистым свертыванием крови, - частая и непосредственная причина смерти при ряде сердечно-сосудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда и т.д.). Исходя из чрезвычайно важной роли, которую выполняют тромбоциты в процессе тромбообразования, существует острая необходимость в создании антитромбоцитарного препарата генерализованного типа действия, т.е. средства, которое угнетало бы все виды функциональной активности тромбоцитов независимо от природы агониста.

В последнее время резко возрос интерес к ковалентным (необратимым) ингибиторам тромбоцитов. Эти ингибиторы подавляют функции тромбоцитов путем химической модификации молекулярных мишеней клеток. По сравнению с другими ингибиторами, действие которых связано с обратимым связыванием с мишенью, эффективность ковалентных ингибиторов определяется их двумя основными свойствами. Одно из них заключается в перманентном угнетении функций тромбоцита на весь срок его жизни. Второе свойство - кумулятивность небольших доз ингибитора в организме, что обеспечивает снижение побочного действия. К категории ковалентных ингибиторов относятся ацетилсалициловая кислота (аспирин) и тиенопирцдины (тиклопидин, клопидогрел, прасугрел). Аспирин — давно признанное и высокоэффективное противотромбоцитарное средство (Awtry et al., 2000; Wu, 2003; Undas et al., 2007), необратимо блокирует циклооксигеназу I (синтазу простагландина Н2 - 1), ацетилируя гидроксильную группу 530 серина (Patrono et al., 2009). Тиенопириднны ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (Guerra et al., 2009). Механизм их действия заключается в необратимом блокировании связывания АДФ с тромбоцитарным рецептором P2Y12. Активными блокаторами этих рецепторов являются не сами тиенопиридины, а их метаболиты, образующиеся в печепи (Clutton et al., 2001; Pereillo et al., 2002).

В качестве перспективного средства для борьбы с тромбозами также предложены хлораминовые производные биогенных соединений, главным образом аминокислот и таурина. Аминокислотные хлорамины являются природными веществами; они образуются в организме в активированных нейтрофилах при взаимодействии аминокислот с гипохлоритом, синтезируемым в реакции, катализируемой миелопероксидазой (Slivka et al., 1980; Thomas et al., 1979, 1995). Хлораминовые производные аминокислот обладают выраженной способностью угнетать функции тромбоцитов, в первую очередь их

агрегацию (Мурина и др., 1998, 2004, 2006; Рощупкин и др. 1995, 2007). Поэтому возможно создание на их основе нового ингибитора тромбоцитов для предупреждения артериального тромбообразования (Мурина и др, 1998, 2010). Однако хлораминовые производные аминокислот - внутренне нестабильные соединения, что ограничивает возможность использование их в качестве лекарственного средства. Производные хлорамина таурина более стабильные соединения. Можно полагать, что они могут стать основой получения новых лекарственных соединений с антиагрегационным действием.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение физико-химических свойств и молекулярно-клеточных механизмов антиагрегантного действия стабильных хлораминовых производных аминокислот и таурина.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучить связь констант скоростей распада хлораминовых производных ряда аминокислот с их структурой.

2. Провести компьютерный квантово-механический расчет характеристик хлораминовых производных аминокислот, прежде всего, парциальных зарядов атомов, как показателей их устойчивости.

3. Исследовать антиагрегантные свойства хлораминовых производных аминокислот и таурина, выяснить изменения их активности под влиянием сывороточного альбумина.

4. Исследовать механизм модификации серосодержащих атомных групп при действии хлораминовых производных аминокислот.

Научная новизна исследования. Определены константы скоростей распада хлораминовых производных ряда моноаминовых а-аминокислот.

Спектрофотометрическим методом выявлено несколько аминокислотных хлораминов с повышенной устойчивостью. К ним относятся N-хлорглицин, N-хлорвалин, N-хлортреонин и N-хлоризолейцин. Молекулам этих хлораминов свойственна структурная особенность в {3-положении. В случае хлорамина глицина отсутствует атом углерода в указанном положении, а производные остальных трех аминокислот имеют разветвление структуры. У менее устойчивых хлораминов (N-хлорсерин, N-хлорлейцин, N-хлорнорлейцин, N-хлораланин и N-хлорфенилаланин) замещен лишь один атом водорода. Выходит, устойчивость хлораминов аминокислот в значительной степени можно отнести на счет свойств атома углерода в р-положении. Это заключение подкрепляется результатами расчета парциальных зарядов атомов.

Проведен компьютерный расчет парциальных атомпых зарядов Уанга-Форда хлораминов а-аминокислот параметрическим кваитово-мехапическим методом AMI. Показано, что хлорамины с повышенной устойчивостью отличаются высокими положительными суммами зарядов трех атомов: углерода в а- и р-положениях и атома углерода карбоксильной группы. Высокий парциальный заряд получен и для одного атома

углерода в Р-положеиии. Эти расчетные величины можно использовать для предсказания устойчивости иовых хлораминов. Одно из предсказаний свидетельствует, что наиболее высокие атомные заряды и устойчивость характерны для хлораминовых соединений аминокислотного ряда, у которых все атомы водорода в р-положении замещены углеводородными цепями или гидроксильными группами.

Исследована закономерность угнетения хлориминовыми и хлораминовыми ингибиторами начальной агрегации изолированных тромбоцитов в присутствии сывороточного альбумина быка (БСА). Обнаружено, что в суспензии тромбоцитов с сывороточным альбумином аптиагрегационное действие исследуемых соединений усиливалось. Согласно спектрофотометрическим измерениям, сывороточный альбумин способен связывать хлорамины (показано на примере Ы,М-дихлортаурина), что влечет за собой изменение конформации белка. Можно предполагать, что повышенная антиагрегантная эффективность хлораминов таурина в присутствии сывороточного альбумина есть результат особого взаимодействия с тромбоцитами белково-хлораминового комплекса.

Спектрофотометрическим методом изучены возможные механизмы модификации серосодержащих атомных групп (на примере дитиотреитола) под действием хлораминовых производных аминокислот, а также гипохлорита (хлорноватистой кислоты). Установлено, что в этом процессе происходит окисление серосодержащих групп с образованием циклического дисульфида (1,2-дитиан-^-диола). Действие гипохлорита или хлорамина на 1,2-дитиан-^4-Диол в умеренно кислой среде (рН около 3) приводит к образованию в-оксида (тиосульфината). Получено, что хлорамины способны модифицировать дисульфидные мостики тромбоцитов по пути образования Э-оксидов.

Практическое значение работы. Обнаруженные нами закономерности антиагрегационного действия хлораминовых производных таурина на тромбоциты могут быть использованы для разработки нового лекарственного средства для борьбы с внутрисосудистым тромбообразованием. Кроме того, хлораминовые производные аминокислот являются вторичными продуктами миелопероксидазной реакции, протекающей в нейтрофилах, поэтому изучепие функциональной активности клеток под действием хлораминов представляет интерес.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, алтиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007, 2009, 2011); на крымском симпозиуме «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, 2008, 2009, 2010); на международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы

функционирования биосистем" (Минск, 2008, 2010); на научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2008).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 43 рисунка, 2 таблицы и 5 схем, состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение» и выводов. Список литературы включает 136 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Реактивы коммерческие: гипохлорит натрия (Aldrich, 4%), аминокислоты ("Fluka" и "Sigma"), таурин, АДФ, бычий сывороточный альбумин, глутатион окисленный, глутатион восстановленный, буфер HEPES, 1,4-димеркаптобутан-2,3-диол (все фирмы "Sigma"), коллаген ("Serva").

Получение хлораминовых и хлориминовых производных аминокислот и таурина. Хлораминовые и хлориминовыс производные аминокислот получали при взаимодействии гипохлорита натрия с растворами аминокислот или иминокислот, молярная концентрация которых превышала концентрацию гипохлорита натрия примерно на 10 %. N,N-дихлортаурин получали при введении раствора таурина в раствор гипохлорита натрия в соотношение молярных концентраций 1:2 (Мурина и др., 1997). Образование монохлораминовых производных аминокислот контролировали спектрофотометрическим способом по наличию в спектре поглощения максимума 253 - 255 нм, a N,N-дихлортаурина - по наличию в спектре поглощения максимума 302 нм. Эти спектры снимали на спектрофотометре DU-720 (Beckman-Coulter). Концентрации хлораминовых и хлориминовых соединений и гипохлорита натрия определяли методом йодометрического титрования (Кудрявцев, 1986).

Объект исследования. Работа проводилась на тромбоцитах кролика в составе обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП), цельной крови кролика и изолированных эритроцитах и тромбоцитах кролика.

Выделение тромбоцитов. Для получения ОТП кровь стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 по объем и центрифугировали 15 минут при 460 g. Полученный супернатант, представляющий собой ОТП, отбирали для исследования.

Для выделения изолированных тромбоцитов кровь кролика стабилизировали кислым цитратом натрия (85мМ трёхзамещённого цитрата натрия; 71мМ лимонной кислоты; 11мМ D-гшокозы; рН= 4,5) в объёмном соотношении 5:1. После центрифугирования при 460 g 15 мин в супернатант (ОТП) добавляли 1мМ ЭДТА и центрифугировали 7 мин при 1850 g. Осаждённые тромбоциты рссуспензировали в 0,1 объёма 3,8% цитрата натрия (рН=7,4) и инкубировали 5 мин при 37°С. Для работы суспензию тромбоцитов разбавляли буфером

(10 мМ HEPES; 134 мМ NaCl; 5 мМ KCl; 1 мМ MgS04; 0,5 мМ Na,ItP04; 0,5 мМ глюкозы; рН=7,4) в 10 раз.

Регистрация агрегации тромбоцитов. Начальную агрегацию изолированных тромбоцитов исследовали нефелометрическим методом, который заключается в регистрации увеличения интенсивности света, рассеянного под малыми углами, при образовании мелких тромбоцитарных агрегатов. Для изучения такой агрегации в нашей лаборатории сконструирован кинетический нефелометр-агрегометр (Рощупкин и др., 1995), который позволяет регистрировать зависимость от времени интенсивности света, рассеянного в пределах 0,5-7°. Источником света служит гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 пм. Количественным показателем агрегационной способности тромбоцитов было изменение интенсивности рассеянного света (Д1), регистрируемое через 40 секунд после введения агониста (АДФ). При исследовании действия соединений данные представлены в виде отношения Д1/Д1к*100%, где Д1к и Д1 - изменение интенсивности рассеянного света (степень агрегации), регистрируемое через 60 секунд после введения АДФ, в контроле и при введении исследуемых соединений.

Агрегацию тромбоцитов в ОТП измеряли турбидиметрическим методом на агрегометре P.I.C.A. фирмы "Chronolog Cor." (США). Принцип регистрации агрегации тромбоцитов по методу Борна заключается в том, что при образовании агрегатов происходит увеличение светопропускания образца. Количественным показателем агрегационной способности клеток служило максимальное изменение светопропускания ОТП (ДТ, степень агрегации), регистрируемое через 5-7 мин. после введения индуктора агрегации: АДФ или коллагена (Born, 1962).

Агрегацию тромбоцитов в составе цельной крови регистрировали импедансным методом на агрегометре «Whole Blood Aggregometer 591» фирмы «Chrono-log Cor.». Количественным показателем агрегационной способности тромбоцитов было изменение импеданса крови (ДА), регистрируемое через 8 минут после введения агописта АДФ (10 мкМ) и СаС12 (1 мМ).

Компьютерный расчет парциальных зарядов атомов (электростатического потенциала). Была разработана компьютерная (расчетная) технология предсказания устойчивости хлораминовых антиагрегантов на основе расчета парциальных зарядов их атомов совместно с профессором кафедры биофизики ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России Д.И. Рощупкиным. Компьютерные расчеты проводили с использованием пакета программ ChemBio3D Ultra И. Процедура расчета включала следующие этапы. (1) Создание пространственной структуры молекулы хлорамина. Хлораминовую группу брали в незаряжешюй форме, поскольку, как известно (Gray et al., 1978), ее рК меньше 1. (2) Минимизация энергии и оптимизация геометрии соединения. Это необходимо для создания стандартной пространственной конфигурации

атомов в молекуле, поскольку электростатический потенциал и соответственно парциальные заряды зависят от пространственного расположения атомов в молекуле. (3) Расчет в состоянии минимума энергии парциальных зарядов. Единицей измерения парциального заряда атомов служил модуль заряда электрона (мзэ).

В настоящей работе изучали парциальные заряды в варианте Уанга-Форда (WangFord). Основным методом минимизации энергии (теплоты образования) и расчета зарядов был параметрический метод квантовой механики AMI (от начальных букв английского названия Austin Model 1). В этом методе при расчетном решении волнового уравнения квантовой механики используются экспериментальные параметры. Отличие величин атомных зарядов при повторных расчетах составляло менее 2 %. Расчеты повторяли 3 раза.

Исследование распада хлораминов спектрофотометрическим методом. Водные растворы хлораминов в концентрации 2 мМ и 4 мМ (рН 7,4) сразу после синтеза помещали в кюветное отделение спектрофотометра. Для количественной характеристики измеряли начальную скорость уменьшения оптической плотности в максимуме поглощения хлораминовой группы атомов, а затем рассчитывали основную кинетическую характеристику - константу скорости. Определяли константу начальной скорости распада (к), чтобы исключить влияние вторичных процессов. Для этого в расчеты включали величины оптической плотности в начальный период времени (At), когда ее снижение (AD) составляло не более 15-20% от исходного значения. Указанную величину константы рассчитывали по формуле: k = (|AD|/D)/At (час"1), где D - исходная оптическая плотность образца.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента. Результаты приведены в виде средних арифметических значений, их разброс описывали среднеквадратической ошибкой средней величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.3ависимость устойчивости хлораминовых производных аминокислот от их

структуры

Известно, что аминокислотные хлорамины спонтанно распадаются и при этом происходят отщепление С1 дезаминирование и декарбоксилирование (Zgliczynski et al., 1971). Согласно количественным и полуколичествепным измерениям, разные аминокислотные хлорамины могут сильно отличаться по устойчивости (Hawkins et al., 1998). Однако до сих пор не имеется достаточно полного количественного описания связи устойчивости биохлораминов с их структурой. Одна из проблем применения хлораминовых производных биогенных соединений в качестве противотромботической субстанции состоит в нахождении наиболее стабильной структуры. Была изучена устойчивость хлораминовых производных аминокислот и проведен квантово-

механический расчет характеристик хлораминовых производных аминокислот, прежде всего, парциальных зарядов атомов, как показателей их устойчивости.

1.1. Количественные закономерности распада хлораминовых аминокислот Экспериментально изучали в основном хлорамнновые производные нециклических моноаминовых а-аминокислот, а также хлорамин фенилаланина. Это было продиктовано тем, что невозможно осуществить синтез хлораминовых производных серосодержащих аминокислот, триптофана и тирозина вследствие протекания быстрых реакций гипохлорига не только с аминогруппой, но и с другими группами. Далее важно, что для обеспечения определенности интерпретации результатов целесообразно было исследовать именно хлорамины одинакового типа строения. Измеренные величины констант скоростей распада хлораминов представлены в таблице 1. Хлорамины расположены в порядке уменьшения средних значений констант скоростей, т.е. в порядке повышения устойчивости. Для сравнения в конце приведены данные для хлориминовых производных пролина и оксипролина. Хлориминовые соединения ведут себя как очень неустойчивые соединения (табл. 1).

Таблица 1. Константы начальной скорости распада хлораминовых производных

аминокислот и иминоксислот.

Хлорамнновые производные аминокислот Длина волны максимума спектра поглощения (нм) Константа начальной скорости распада (ч"1)

2 мМ 4 мм

N-Хлорнорлейцин 254 0,72±0,06 -

N-Хлорсерин 255 0,68±0,04 0,72±0,01

N-Хлорлейцин 254 0,66±0,04 -

N-Хлорфеншіалапин 257 0,64±0,01 -

N-Хлораланин 253 0,56±0,04 0,52±0,01

N-Хлоризолейцин 256 0,48±0,04 -

N-Хлорвалин 255 0,4±0,02 0,36±0,01

N-Хлортреонин 256 0,39±0,02 -

N-Хлоргшщин 255 0,06±0,01 0,05±0,01

N-Хлорпролин 257 16,8±1,04 -

N-Хлоргидроксипролин 262 17,38±0,91 -

В целом, как уже отмечалось в других работах (Hawkins et al., 1998), имеется зависимость устойчивости аминокислотных хлораминов от структуры. Константы скоростей N-хлорфенилаланина, N-хлорлейцина, N-хлорсерина, N-хлорнорлейцина статистически не различаются между собой. Условно отнесем эту первую группу хлораминов к категории слабо устойчивых. Константы скорости распада этой группы соединений статистически достоверно выше константы (уровень значимости р<0,01) N-хлораланина. Константа N-хлораланина достоверно (р<0,015) отличается от константы скорости распада N-хлоризолейцина и следующих за шш хлораминов.

Условно назовем N-хлоризолейцин, N-хлорвалин, N-хлортреонин, а также N-хлорглицин повышенно устойчивыми. Среди них особо высокой устойчивостью выделяется хлорамин глицина, что можно отнести на счет отсутствия у него атома углерода в Р-положении. Следует обратить внимание на то, что отличие в структуре слабо устойчивых и повышенно устойчивых аминокислотных хлораминов имеет место уже на уровне атома углерода в Р-положении.

Сравнительно давно известно, что хлорамины серина и лейцина распадаются примерно одинаково, но быстрее хлорамина валина (Zgliczynski et al., 1971). По данным других авторов (Hawkins et al., 1998), которые измеряли время, в течение которого абсорбция уменьшается в 2 раза, можно составить следующий ряд интенсивности распада аминокислотных хлораминов: N-хлорпролин » N-хлорсерип я N-хлорлейцин > N-хлортреонин = N-хлорвалин. Все эти соединения распадаются быстрее хлораминов изолейцина и глицина. Наши результаты измерений констант скоростей распада (табл. 1) удовлетворительно согласуются с указанными данными.

Представляет интерес один из частных случаев зависимости устойчивости аминокислотных хлораминов от их структуры. Имеется разница в устойчивости в группе хлораминовых производных трех структурных изомеров лейцина: повышенной устойчивостью обладает N-хлоризолейцин (табл. 1). Его структура отличается от строения N-хлорлейцина и N-хлорнорлейцина, в частности, тем, что в р-положении имеет место разветвление, один из двух атомов водорода замещен на другую группу атомов.

На основании всех данных можно сформулировать эмпирический структурный признак повышенной устойчивости некоторых аминокислотных хлораминов. У них либо отсутствует атом углерода в р-положении (N-хлорглицин), либо в указанном положении обязательно замещены два атома водорода на другие группы атомов: гидроксильную и метальную группы (N-хлортреонин) или две углеводородные группы (N-хлорвалин, N-хлоризолейцин). У слабо устойчивых хлораминов замещен лишь один атом водорода. Выходит, устойчивость хлораминов аминокислот в значительной степени можно отнести на счет свойств атома углерода в р-положении. Это заключение подкрепляется результатами расчета парциальных зарядов атомов.

1.2. Компьютерный расчет парциальных зарядов

Из данных литературы известно, что устойчивость и реакционную способность соединений можно предсказывать по величине некоторых физико-химических характеристик. Среди них, прежде всего, важны парциальные электрические заряды атомов в молекуле данного соединения. Эта величина представляет собой разность между зарядом ядра атома и расчетным зарядом электронов в области этого атома.

Компьютерный расчет дает парциальные заряды всех атомов изучаемого соединения. Исходя из общих соображений, можно было бы предполагать, что для оценки

устойчивости аминокислотных хлораминов важны заряды атомов азота и хлора хлораминовой группы. Однако результаты расчета зарядов этих атомов оказались неожиданными. Хлораминовые производные различных аминокислот, представленные в таблице, мало отличаются друг от друга по величине зарядов атома хлора хлораминовой группы; эти заряды составляют 0,09 - 0,11 модуля заряда электрона. В ряду изученных хлораминов не наблюдается существенной разницы парциальных зарядов атома азота хлораминовой группы (рис. 1, кривая 5). Поэтому не представляется возможности прямо соотнести разницу в устойчивости хлораминов различных аминокислот со свойствами хлораминовой группы, хотя при их распаде (Zgliczynski et al., 1971, Hawkins et al., 1998) происходит отщепление атома хлора в виде СГ и дезаминирование.

Были сопоставлены заряды атомов углерода в а-положении (С0), р-положения (Ср карбоксильной группы (С). Предварительный анализ показал, что кроме зарядов отдельных атомов полезно использование суммы зарядов трех и двух атомов углерода: С, Са, Ср или Со, Ср. Полученные данные представлены на рис. 1 по следующей схеме. Основной величиной была выбрана сумма зарядов атомов С, С„ и Ср. Соединения ранжировали по величине этой суммы. Хлорамину с наименьшей суммой присваивали номер 1, следующему хлорамину с большим значением суммы устанавливали номер 2 и т. д. Если было необходимо сравнить другой зарядовый показатель (зависимый) с основным или родственные соединения (зависимые) с основной группой, то зависимые соединения располагали в ряд по порядку основной группы. Расчеты проведены и в состоянии недиссоциировапной карбоксильной группой и в ионной форме. Заряды атомов С, Са, Ср этих двух форм хлораминов в некоторой степени различаются. Вместе с тем последовательности величин сумм зарядов и заряда Ср очень близки (данные не приводим).

g j Рис. 1 Парциальные атомные заряды

0,6 0,4 0Л 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1

аминокислотных хлораминов.

1 (кружочки) - сумма зарядов трех атомов

ж углерода: в а-, (5-положении и карбоксильной

2 ж группы;

2 (звездочки) - заряд атома углерода в Р-положении;

3 (треугольники) — заряд атома азота.

3 8, мзэ - атомный заряд, модуль заряда « электрона;

Номера соединений: 1 - 9 - хлораминовое _1_1_ производное цистеиновой кислоты,

0 123456789 фенилаланина, алапина, лейцина, норлейцина, Номер соединения сеРина' изолейцина, валила, треонина.

Для изученных хлораминов характерно резкое отличие и по знаку, и по абсолютной величине сумм зарядов атомов углерода (рис. 1, кривая 1). В значительной степени варьирование этих сумм обусловлено атомом углерода р-положения (рис.1, кривая 2). Далее важно, что выделяется группа хлораминов, состоящая из М-хлоризолейцина, М-хлорвалина и Ы-хлортреонина. Эта группа явно отличается от остальных изученных хлораминов: атом Ср имеет положительный заряд (0,16 - 0,30 мзэ), суммы парциальных зарядов атомов углерода С, С„ и Ср достигают высоких положительных значений (0,5 - 0,6 мзэ). Такие суммы в случае остальных хлораминов в 2-3 раза меньше, либо вообще отрицательные. Сопоставление этих результатов с экспериментальными данными, касающимися констант скоростей распада (табл.1), показывает, что заряд атома Ср и сумма зарядов атомов углерода С, Са и Ср отражают устойчивость аминокислотных хлораминов. К категории повышенно устойчивых относятся те соединения, у которых пара этих показателей достигает значительных положительных значений.

Сейчас строго связать величины расчетных зарядов атомов углерода с механизмом распада хлораминов затруднительно. Формально, возможно, существенно, что в случае повышенно устойчивых хлораминов складывается такая ситуация, что получается система из значительных по абсолютной величине разноименных зарядов: отрицательный заряд атома азота хлораминовой группы (рис.1, кривая 3) и положительный заряд рассматриваемых атомов углерода. Именно такого рода части молекул обладают повышенной устойчивостью.

Таким образом, полученные данные позволяют предложить расчетный зарядовый показатель устойчивости аминокислотных хлораминов. Признаком повышенной устойчивости хлорамина можно считать значительные положительные значения заряда атома Ср и суммы зарядов атомов углерода С, Са и Ср. Одно из направлений проектирования новых более устойчивых аминокислотных хлораминов может заключаться в изменении состояния атома Ср путем разветвления структуры.

1.3. Устойчивость и антиагрегационные свойства новых хлориминовых производных таурина Использование квантово-механического метода расчета парциальных зарядов атомов привело к обнаружению новой (ранее неизвестной) группы хлораминов - производных хлоримина таурина. Хлоримины получаются при замещении атома водорода хлораминовой группы на углеводородные радикалы. Был синтезирован ряд хлориминовых производных таурина, в том числе М-метил-М-хлортаурин (Мурина и др., 2010). Устойчивость хлоримина контролировали спектрофотометрическим методом. Видно, что М-метил-Ы-хлортаурин обладал устойчивостью в течение нескольких месяцев (рис. 2).

ДТ/ДТк, АА/ДАк, % 100

210 250 290 330 Длина волны, нм

75 50 25 0

11

[Ь

[Ь

°'5 1 С, мМ].5

Рис. 2. Спектры поглощения Ы-хлорметилтаурина (2 мМ).

1 - Сразу после синтеза;

2,3 и 4 - соответственно через 4,5 и 6 месяцев хранения. О — оптическая плотность. Образец хранился в концентрации

2 мМ при температуре +10 СС.

Рис. 3. Действие М-метил-Ы-хлортаурина на агрегацию тромбоцитов в составе ОТП и цельной крови. 1,2- Агрегация тромбоцитов в составе ОТП, индуцированная соответственно АДФ (ЮмкМ) или коллагеном (12 мкг/мл) и СаС12 (2мМ); 3,4- агрегация тромбоцитов в составе цельной крови, индуцированная соответственно АДФ (10 мкМ) или коллагеном (12 мкг/мл) и СаС12(4 мМ). ДТ/АТк, АЛ/ДАк, - Степень агрегации тромбоцитов в составе ОТП или цельной крови. С — концентрация, мМ. Получено, что М-метил-"К-хлортаурин обладает выраженным антиагрегационным

эффектом в системах ОТП и цельной крови (рис. 3).

Таким образом, с использованием квантово-механического метода расчета парциальных зарядов атомов, были синтезированы хлориминовые производные таурина, которые являются не только стабильными соединениями, но и проявляют выраженный антиагреационный эффект.

2. Действие хлорамнновых производных аминокислот и таурина на изолированные тромбоциты Для понимания механизма антиагрегантного действия хлораминов на тромбоциты важно изучать не только обычную конечную агрегацию тромбоцитов (образование крупных агрегатов), но и начальную - образование мелких агрегатов клеток. Начальную агрегацию изолированных тромбоцитов в виде суспензии в забуференном физиологическом растворе регистрировали нефелометрическим методом. Было изучено действие нескольких хлораминовых производных таурина. Эти соединения отличаются устойчивостью и могут быть перспектив ним и соединениями для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцитами (Мурина и др., 2010). Ы.К-Дихлортаурин подавляет

начальную агрегацию клеток на 50% (С50) в концентрации примерно 0,2 мМ (рис. 4). М-Монохлортаурин и ЬІ-хлор-ЬЇ-мстилтаурин оказывают более слабое антиагрегационное действие: в конечной концешрации 0,75 мМ ингибирование агрегации составляет соответствеїшо 15 ± 3 и 16 ± 4 %.

АІ/АІК, % 100

75

50

25 Ь

0,2 0,4

0,6 0,8 С, мМ

Рис. 4. Концентрационные зависимости действия Ы-монохлортаурина (кривая 1) и Ы,№дихлортаурина (кривая 3) на начальную АДФ-индуцированную агрегацию изолированных тромбоцитов. 2, 4 - в суспензию тромбоцитов вводили БСА (0,34 мМ), а затем соответственно Ы-монохлортаурин и Ы,Ы-дихлортаурин (С50-0,02 мМ). С - концентрация, мМ.

АТ/Аїк. % 100

0,5

1,5 2 С. мМ

Рис. 5. Концентрационные зависимости действия ІЧ-хлор-М-метилтаурина на начальную АДФ-индуцированную агрегацию изолированных тромбоцитов в суспензии в забуференном физиологическом растворе (кривая 1) и в присутствии БСА (0,34 мМ) (кривая 2). С — концентрация, мМ.

Сравнение данных, представленных на рис. 3 и рис. 5, показывает, что эффективность ингибирования агрегации тромбоцитов Ы-хлор-Ы-метилтаурином в составе ОТП либо в цельной крови значительно выше ингибирования агрегации изолированных тромбоцитов. Можно полагать, что действие хлораминов в ОТП потенцируется белками плазмы крови.

Далее было исследовано действие хлораминовых производных таурина и аминокислот на агрегацию изолированных тромбоцитов в присутствии сывороточного альбумина быка (БСА). Получено, что при действии МД-дихлортаурина, Ы-монохлортаурица и Ы-хлор-М-метилтаурина на суспензию тромбоцитов с БСА (0,34 мМ) антиагрегационное действие хлораминов резко усиливается (рис. 4 и 5).

Для сравнения были исследованы хлораминовые производные глицина и фенилаланина. И-Хлорглицин (0,025 мМ) снижал агрегацию тромбоцитов в чистой суспензии клеток и в присутствии альбумина (0,34 мМ) соответственно на 22±4 и 45±10 %

(р<0,05). Антиагрегационное действие М-хлорфенилаланина в присутствии БСА также усиливается (рис. 6). М-Хлорфснилалакин (0,25 мМ) ипгибирует агрегацию изолированных тромбоцитов на 27±2 %, а если в суспензию тромбоцитов предварительно ввести БСА (0,34 мМ) и затем Ы-хлорфенилаланип (0,25 мМ), то агрегация снижалась на 52±4 % (р<0,05). Такое же антиагрегационное действие оказывало введение в суспензию тромбоцитов смеси БСА и М-хлорфенилаланина, предварительно проинкубированной в течение 5 минут. При добавлении в суспензию тромбоцитов сначала М-хлорфенилаланина (0,25 мМ), а затем БСА (0,34 мМ) степень агрегации снижалась на 44±5 %. Таким образом, антиагрегационный эффект хлораминов в присутствии БСА не зависит от последовательности введении их в суспензию тромбоцитов и обусловлен модификацией альбумина.

Рис. 6. Действие М-хлорфенилаланина (0,25 мМ) на агрегацию изолированных тромбоцитов в присутствии сывороточного альбумина быка (0,34 мМ).

1 — в суспензию тромбоцитов вводили соответственно М-хлорфенилаланин;

2 - в суспензию тромбоцитов вводили смеси соответственно БСА с М-хлорфенил-аланином (р<0,05 от 1);

3 — в суспензию тромбоцитов сначала вводили БСА, а затем соответственно Ы-хлорфенилаланин;

4 - в суспензию тромбоцитов вводили соответственно М-хлорфенилаланин (р<0,05 от 1), а затем БСА.

Д1/Д1к, % 100

75

50

25

1

Известно, что гипохлорит натрия обладает выражешшм антиагрегационным действием на тромбоциты. Встает вопрос, будет ли ингибирующее действие гипохлорита усиливаться в присутствии БСА. В работе было изучено влияние гипохлорита натрия на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов. Получено, что ГХН (0,24 мМ), введенный в чистую суспензию тромбоцитов и суспензию тромбоцитов с альбумином (0,34 мМ), ингибирует агрегацию в одинаковой степени - на 40±4 % и 40±7 % соответственно. Если смесь ГХН и БСА предварительно инкубировать 5-10 минут, а затем ввести ее в суспензию тромбоцитов, то ингибирование агрегации тромбоцитов составляет лишь 23 ± 9 %. Таким образом, получили, что усиления антиагрегационного действия ГХН на изолированные тромбоциты в присутствии БСА не происходит.

Одно из объяснений усиления сывороточным альбумином быка антиагрегационного действия хлораминов может быть представлено следующим образом: БСА образует

комплекс с хлораминовыми производными аминокислот и таурина, и этот комплекс обеспечивает более эффективную реакцию хлораминов с тромбоцитами.

3. Изучение взаимодействия Г\\1Ч-дихлортаурииа с сывороточным альбумнном спектрофотометрическим методом Для экспериментального выяснения меха1шзма взаимодействия хлораминовых производных таурина и сывороточного альбумина было изучено изменение спектра поглощения сывороточного альбумина при введении в него раствора хлорамина. Достаточно определенно такое изучение возможно только в случае КЫ-дихлортаурина, полоса поглощения которого с максимумом 302 нм не полностью перекрывается с полосой поглощения белка. С этой целью в раствор альбумина (0,07 мМ) в фосфатном буфере (рН=7,4) вводили Ы^-дихлортаурин в конечной концентрации 1 мМ (2 мМ по активному хлору) и записывали спектры поглощения. В работе анализировали разность между спектром поглощения смеси хлорамина с альбумином и спектром поглощения чистого белка, так называемые дифференциальные спектры. Их получали расчетным способом на основе электронных таблиц указанных спектров.

Можно было бы думать, что в смеси большая часть хлорамина прореагировала с серосодержащими группами белка. Это не согласуется с характеристиками дифференциального спектра поглощения, т. е. разности спектра поглощения смеси альбумина с хлорамином и спектра чистого раствора белка. На рис. 7 видно (кривая 2), что полоса поглощения N.N-дихлортаурина при длинах волн более примерно 295 нм сохраняется в дифференциальном спектре, полученном сразу после приготовления смеси. Полоса поглощения N,N-flHxnopTaypmia слабее полосы поглощения свободного хлорамина не более 8 % (рис 7, кривые. 1 и 2). Это может быть объяснено тем, что лишь небольшая часть ЫД-дихлортаурина прореагировала с сульфгидрильной группой в альбумине [Сагг et al., 2001]. В наших экспериментах, судя по изменению оптической плотности в максимуме поглощения М,К-дихлортаурина, в первые минуты с БСА реагирует 0,09 ± 0,024 мМ КЫ-дихлортаурина (по активному хлору).

Из анализа остальной части дифференциального спектра поглощения видно, что введете ' N,N-®D0i0pTaypiiHa в раствор альбумина приводит к появлению структурированной полосы в области 265-295 нм в дифференциальном спектре поглощения. Слабо выраженные пики в этой полосе и более коротковолновой области хорошо воспроизводятся. Среди этих пиков имеются следующие: 253, 256, 267, 273, 277, 280, 285, 287, 290, 293 нм. В своем большинстве эти пики проявляются в дифференциальном спектре, полученным путем сдвига спектра поглощения альбумина быка в длинноволновую область на 1 нм. На основании этих результатов и данных литературы (Kandagal et al., 2006; Loll et al., 1994) можно предположить, что N,N-дихлортаурин переводит молекулы альбумина в другое состояние, затрагивающее

микроокружение остатков ароматических аминокислот: фенилаланина (пики в области 255-270 нм), тирозина (пики в области 280-285 нм), триптофана (290-295 нм).

И, ДБ

0,2

0,5

0,1

0,4

0,3

0

Рис. 7. Спектр поглощения раствора Ы^-дихлортаурина в концентрации 2 мМ (по активному хлору) (кривая 1) и разности между спектром поглощения смеси N,14-дихлортаурина (2 мМ) с альбумином (0,07 мМ) и спектром поглощения сывороточного альбумина быка, регистрируемые сразу (кривая 2) и после двух часовой инкубации смеси (кривая 3).

О - оптическая плотность (кривая 1); ДБ - разность оптических плотностей (кривые 2 и 3).

245 265 285 305 325

Длина волны, нм

В итоге есть основания утверждать, что ^Ы-дихлортаурин взаимодействует с сывороточным альбумином, изменяя его конформацию.

Важно отметить, что через 2 часа инкубации смеси альбумина и 1^,Ы-дихлортаурина происходит заметное изменение дифференциального спектра при длинах волн короче 295 нм, относящихся к белку, а поглощение М,Ы-дихлортаурина изменяется примерно на 15% (рис. 7, кривая 3). Это указывает, что изменение состояния белка под влиянием хлорамина в целом развивается во времени.

Итак, антиагрегантное действие хлораминовых производных аминокислот и таурина усиливается в присутствии сывороточного альбумина. Согласно спектрофотометрическим измерениям, сывороточный альбумин способен связывать К,№дихлортаурин, что влечет за собой изменение конформации белка. Можно предполагать, что повышенная антиагрегатная эффективность хлораминов в присутствии сывороточного альбумина есть результат особого взаимодействия с тромбоцитами белково-хлораминового комплекса.

4. Модификация сульфгндрильных и дисульфидных групп аминокислотными

Способность исследуемых хлораминов и гипохлорита вызывать образование дисульфидов из тиолов и превращение дисульфидов в Б-оксиды нами была исследована методом спектрофотометрии. Опыты проведепы на растворах дитиотреитола (1,4-димеркаптобутан-2,3-диол). Этот выбор был обусловлен тем, что в дитиотреитоле очень быстро протекает процесс внутримолекулярного образоваши дисульфидной связи, так что вторичные реакции окисления сульфеновой группы, являющееся начальным продуктом окисления тиолыюй группы, не проявляются. На рисунке 8 видно, что спектр поглощения раствора дитиотреитола после действия М-хлорглицнна имеет выраженный максимум при

хлорамннами

283 нм. Этот спектр принадлежит циклическому дисульфиду 1,2-дитиан-4,5-диолу, ранее полученному в иных условиях (Сараево е! а1., 1984).

и

0,3 0,2 0,1 0

220 260 300

Длина волны, нм

Рис. 8. Спектры поглощения: 1,2-дитиан-4,5-диол, получающийся при окисления 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола (0,5 мМ) Ы-хлорглицином (0,5 мМ, кривая 1); дитиотреитол (0,5 мМ, кривая 2) и М-хлорглнцин (0,5 мМ, кривая 3). Б - оптическая плотность.

Действие гипохлорита или хлораминов на 1,2-дитиан-4,5-диол в умеренно кислой среде (рН около 3) приводит к изменению спектра поглощения в коротковолновой части (рис. 9, кривая 2): здесь резко усиливается поглощение и появляется плечо. Это плечо можно охарактеризовать тем, что в отрицательной области значений первой производной имеются широкий максимум около 230 нм и минимум приблизительно при 240 нм (рис.10). Такие особенности характерны для спектров поглощения органических тиосульфинатов (Б-оксидов).

220 260 300 340 Длина волны, нм

260 300 340 Длина волны, нм

Рис. 9. Спектры поглощения: 1,2-дитиан-4,5-диол (кривая 1); его Б-оксид (кривая 2), получающийся при окислении дитиана (рН=3,5) гипохлоритом (2 мМ).

Рис. 10. Первая производная от спектра поглощения Б-оксид а, представленного на рис. 9.

Можно предположить, что исследуемые нами антиагреганты способны модифицировать дисульфидные связи по пути образования Б-оксидов (см. ниже схему 2). Известно, что й-оксиды цистина, окисленного глутатиона вызывают тиолирование белков (образование смешанных дисульфидов) более эффективно, чем другие соединения, включая соединения с сульфеновой группой (ІЛ е( а1., 2001). В наших экспериментах 8-оксид подавлял начальную агрегацию изолированных тромбоцитов на 50 % в концентрации 0,1 мМ. Поэтому представляется важным учитывать участие Б-оксидов в механизме действия хлораминов на клетки.

Исходя из данных литературы [Віеиегща й а1., 1994] и наших данных картину реакций хлораминов можно представить в следующем виде. Первый этап модификации хлорамином тиолыюго соединения, вероятно, заключается в замещении атома водорода этой группы на хлор с образованием неустойчивого промежуточного соединения. Затем в результате его взаимодействия с гцдроксильной группой (выделяется хлорид) появляется сульфеновое соединение (схема 1).

Хлорамин (или хлоримші)

Н2 1

V

Rj SH -—

Н2

Rj SO

V £

» ^SOH.

Тиольное Сульфеновое

соединение соединение

Схема 1. Начальные стадии окислительной модификации тиольной группы хлорамином или хлоримином.

Сульфеновая кислотная группа проявляет высокую реакционную способность. Во-первых, сульфеновое соединение при избытке хлораминов продолжает подвергаться окислению, превращается в устойчивые сульфиновое и сульфоновое соединения. Такого рода превращение тиольной группы в составе рецепторов тромбоцитов может вызывать существенное изменение их структуры и тем самым инактивацию. Во-вторых, сульфеновые соединения проявляют высокую способность к окислительной модификации других веществ (схема 2).

Можно полагать, что в клетках может происходить реакция между сульфеновой и тиольной группами с образованием смешанного дисульфидного соединения через ряд промежуточных реакций. Один из начальных процессов модификации дисульфидных соединений без разрыва дисульфидной связи — образование S-оксида. S-Оксиды дисульфидных соединений, как и сульфеновые соединения, способны окислять тиольные соединения [Giles et al., 2002].

lb /С Rf SII

Сулъфсновое соединение

Тиольное соединение

Хлоралшн

Н2С R4 {11ЛИ хлоримин) Н2С—R4

1 '

Н2С—R3 Н2С—R3 ■

Дисульфидное соединение

о

S-Оксид дисульфида

Тиольное соединеиие

Схема 2. Модификация тиолыюй группы в реакции с сульфеновой группой и окислительная модификация дисульфидной группы.

Выводы

1. Определены спектрофотометрическим методом константы скоростей распада хлораминовых производных ряда моноаминовых а-аминокислот. Выявлено несколько аминокислотных хлораминов с повышенной устойчивостью. К ним относятся N-хлорглицин, N-хлорвалин, N-хлортреонин и N-хлоризолейцин. Этим хлораминам свойственна структурная особенность в р-положепии: в случае хлорамина глицина отсутствует атом углерода, а производные остальных трех аминокислот в указанном положении имеют разветвление структуры.

2. Проведен компьютерный расчет парциальных атомных зарядов Уанга-Форда хлораминов а-аминокислот полуэмпирическим квантово-механическим методом AMI. Хлорамины с повышенной устойчивостью отличаются высокими положительными суммами зарядов трех атомов: углерода в а- и р-положениях и атома углерода карбоксильной группы. Высокий парциальный заряд получен и для одного атома углерода в р-положении. Одно из направлений создания новых более устойчивых аминокислотных хлораминов может заключаться в изменении состояния атома Ср путем разветвления структуры.

3. Изучено действие хлораминовых производных таурина на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов. Угнетение агрегации зависит от структуры хлораминовых антиагрегантов: наиболее эффективным является NjN-дихлортаурин (С5о=0,2 мМ), более слабые антиагреганты - Ы-хлор-К-метилтаурин и N-хлортаурин в конечной

20

концентрации 0,75 мМ снижают агрегацию тромбоцитов лишь на 15 %. Антиагрегантное действие хлораминовых производных таурина, глицина и фенилаланина усиливается примерно в 2 раза в присутствии сывороточного альбумина. Это, вероятно, обусловлено особым взаимодействием с тромбоцитами хлораминов таурина в комплексе с альбумином.

4. Исследовано взаимодействие хлораминов с сывороточным альбумином методом дифференциальной спектрофотометрии. После введения Ы,Ы-дихлортаурина в раствор сывороточного альбумина в дифференциальном спектре поглощения появляется ряд максимумов, структурированная полоса 265- 290 им. Это указывает на связывание N,N-дихлортаурина с переходом молекул альбумина в другое состояние, затрагивающее микроокружение остатков ароматических аминокислот: фенилаланина (пики в области 255-270 нм), тирозина (пики в области 280-285 нм), триптофана (290-295 нм). Можно полагать, что альбумин образует комплекс с хлораминовыми производными аминокислот и таурина и этот комплекс обеспечивает более эффективную реакцию хлораминов с тромбоцитами.

5. Особегаюстью взаимодействия хлораминовых производных аминокислот с тиолсодержащими соединениями может быть начальное образование активной сульфеновой группы (-SOH), судя по образованию циклического дисульфида (1,2-дитиан-4,5-диола) из дитиотреитола (1,4-димеркаптобутан-2,3-диола). На примере 1,2-дитиан-4,5-диола получены данные о том, что аминокислотные хлорамины или пшохлорит могут вызывать превращение дисульфидной группы в продукт, который обладает выраженным антиагрегантным свойством.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Кравченко H.H., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Антиагрегантное действие биогенных хлораминов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, Приложение 2, С. 94-100.

2. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Чудина H.A., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Антиагрегантное действие хлораминов таурина в присутствии сывороточного альбумина. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009, № 6, С. 642-646.

3.Рощупкин Д.И., Мурипа М.А., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Зависимость устойчивости аминокислотных хлораминов от их структуры. Биомедицинская химия, 2009, № 4, С. 510— 518.

4. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Аминокислотные хлораминовые и хлориминовые антиагреганты: реакционные свойства и механизм действия. Вестник Российской Академии медицинских наук, 2009, № 10, С.43-49.

5. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Реакционная активность и структурные особенности биогенных хлораминов. Пятая национальная научно-практическая конференция «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Материалы конференции, Смоленск. ФГУ «Смоленский ЦНТИ», 2007, С.61-64.

6. Петрова А.О., Мурина М.А., Рощупкии Д.И., Сергиенко В.И. Хемилюминесцентный способ исследования окислительной активности биохлораминов. Пятая национальная научно-практическая конференция «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Материалы конференции, Смоленск. ФГУ «Смоленский ЦНТИ», 2007, С. 74-76.

7. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Чудина Н.А., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Физико-химические характеристики и реакционные свойства хлораминовых антиоксидантов. Сборник тезисов докладов Четвертого крымского симпозиума «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Судак, 2008, С.35.

8. Рощупкин Д.И., Мурина М.А, Петрова А.О., Сергиенко В.И. Парциальные атомные заряды и реакционные свойства хлораминовых антиагрегантов. Сборник статей Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». Минск, 2008, С.128-130.

9. Рощупкин Д.И., Мурина М.А., Петрова А.О., Чудина Н.А. Компьютерное предсказание реакционных свойств биомолекул: хлораминовые антиагреганты, пептиды хромофорной области флуоресцентных белков. Сборник тезисов Научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины», Москва,

2008, С. 88.

10. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Чудина Н.А., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Хлораминовые, хлориминовые и серосодержащие реактивные оксиданты природного происхождения и их действие на тромбоциты. Сборник тезисов V Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», 2009, Изд. ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехыологий», Крым, Судак, С.49.

11. Murina М.А., Petrova А.О., Roshchupkin D.I. Amino acid chloramines and chloramines as reactive oxidants: properties and mechanism of anti-platelet action. 6-th International Confernce "Reactive Oxygen and Nitrogen species, Antioxidants and human Health", Smolensk, Russia,

2009, p. 45-46.

12. Мурина M.A., Рощупкин Д.И., Петрова A.O., Белакина Н.С., Сергиенко В.И. Хлораминовые и хлориминовые антиагреганты - необратимые ингибиторы функций тромбоцитов. Сборник статей Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем". Минск, Беларусь, 2010, часть 2, С. 258-260.

13. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Компьютерное и экспериментальное изучение реакционной способности хлораминовых и хлориминовых оксидантов. Сборник тезисов VI Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», 2010, Изд. ФГУ «Российский кардиологический научпо-производственный комплекс Росмедтехнологий», Крым, Судак, Украина, С. 44.

14. Murina М.А., Roshchupkin D.I., Petrova А.О., Sergienko V.I. Acylamido derivatives of N-chlorotaurine as reactive oxidants: properties and mechanism of anti-platelet action. 7-th International Conference "Reactive Oxygen and Nitrogen species, Antioxidants and Human Health", Smolensk, Russia, 2011, p.185-187.

Подписано в печать: 21.08.2012

Заказ № 7520 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петрова, Анастасия Олеговна

Введение

Обзор литературы

1. Строение и функции тромбоцитов

2. Роль тромбоцитов в патогенезе сосудистых заболеваний

3. Необратимые (ковалентные) ингибиторы тромбоцитов

4. Сывороточный альбумин и его свойства

5. Гипохлорит-анион, хлораминовые производные аминокислот и их взаимодействие с компонентами крови 31 Материалы и методы

1. Реактивы

2. Получение хлораминовых и хлориминовых производных аминокислот и таурина

3. Компьютерный расчет парциальных зарядов атомов

4. Исследование распада хлораминов спектрофотометрическим методом

5. Получение обогащенной тромбоцитами плазмы

6. Выделение тромбоцитов

7. Регистрация агрегации тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме

8. Регистрация агрегации тромбоцитов в цельной крови

9. Регистрация агрегации изолированных тромбоцитов

10. Исследование гемолиза эритроцитов

11. Статистическая обработка полученных данных 51 Результаты и обсуждение

Глава 1. Физико-химические свойства и устойчивость хлораминовых производных аминокислот 52 1.1. Зависимость устойчивости хлораминовых производных аминокислот от их структуры 52 1.1.1.Количественные закономерности распада хлораминовых производных аминокислот

1.2. Метод компьютерного расчета парциальных зарядов атомов

1.2.1. Парциальные заряды атомов углерода альфа и бета положения в молекулах хлораминовых производных аминокислот

1.2.2. Зависимость собственной устойчивости хлораминовых аминокислотных антиагрегантов от парциальных зарядов атомов

1.3. Гемолитическая активность хлораминовых производных аминокислот

1.4. Устойчивость и антиагрегационные свойства новых хлориминовых производных таурина

Глава 2. Действие хлораминовых производных аминокислот и таурина на изолированные тромбоциты 77 2.1. Антиагрегационное действие хлораминов и хлориминов в присутствии сывороточного альбумина

Глава 3. Изучение взаимодействия ]\Ш-дихлортаурина с сывороточным альбумином спектрофотометрическим методом

Глава 4. Реакционные свойства хлориминовых антиагрегантов

4.1. Взаимодействие хлораминов с аминогруппами

4.2. Модификация тиольных и дисульфидных групп хлораминов

4.3. Антиагрегационное действие Б-оксида дисульфида 105 Выводы 110 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хлорамины аминокислот - ингибиторы агрегации тромбоцитов"

Сердечно-сосудистые заболевания наравне с онкологическими заболеваниями и диабетом прочно удерживают первенство среди самых распространенных и опасных заболеваний XX и XXI веков.

Патологический тромбоз, связанный с усиленной активностью тромбоцитов и повышенным внутрисосудистым свертыванием крови, - частая и непосредственная причина смерти. При многих патологических состояниях происходит внутрисосудистая стимуляция тромбоцитов, они становятся гиперактивными. Это происходит, например, при операциях, разрыве атеросклеротических бляшек, в результате поступления в кровь агонистов из других тканей и т.п. Внутрисосудистое тромбообразование во многих случаях лежит в основе острого нарушения кровообращения при ряде сердечно-сосудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, острый коронарный синдром). В Российской Федерации на болезни системы кровообращения приходится около половины всех случаев инвалидности и смертности людей в наиболее продуктивном возрасте. Применяемые в настоящее время противотромботические средства - антикоагулянты, препятствующие превращению фибриногена в фибрин, и антиагреганты, ингибирующие агрегацию тромбоцитов и секрецию тромботически активных соединений из клеточных структур (реакцию высвобождения), - недостаточно эффективны, имеют противопоказания.

В последнее время резко возрос интерес к ковалентным (необратимым) ингибиторам тромбоцитов. Эти ингибиторы подавляют функции тромбоцитов путем химической модификации молекулярных мишеней клеток. По сравнению с другими ингибиторами, действие которых связано с обратимым связыванием с мишенью, эффективность ковалентных ингибиторов определяется их двумя основными свойствами. Одно из них заключается в перманентном угнетении функций тромбоцита на весь срок его жизни. Второе свойство - кумулятивность небольших доз ингибитора в организме, что обеспечивает снижение побочного действия. К категории ковалентных ингибиторов относятся ацетилсалициловая кислота (аспирин) и тиенопиридины (тиклопидин, клопидогрел, прасугрел). Аспирин - давно признанное и высокоэффективное противотромбоцитарное средство [34,122,130], необратимо блокирует циклооксигеназу I (синтазу простагландина Н2 - 1), ацетилируя гидроксильную группу 530 серина [98]. Тиенопиридины ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов [64,105]. Механизм их действия заключается в необратимом блокировании связывания АДФ с тромбоцитарными рецепторами Р2У12. Активными блокаторами этих рецепторов являются не сами тиенопиридины, а их метаболиты, образующиеся в печени [47,49,99]. Хотя аспирин и тиеноперидины и являются эффективными противотромбоцитарными препаратами, они относительно слабо ингибируют агрегацию тромбоцитов. Эти препараты ослабляют активацию тромбоцитарных клеток, но, поскольку число активаторов тромбоцитов очень велико, их эффективность в этом плане ограничена.

Муриной М.А., Рощупкиным Д.И., Сергиенко В.И. (1993-2010) в качестве перспективного средства для борьбы с тромбозами были предложены хлораминовые производные биогенных соединений, главным образом аминокислот и таурина. Аминокислотные хлорамины являются природными веществами, они образуются в организме в реакции аминокислот с гипохлоритом, синтезируемым миелопероксидазой в активированных нейтрофилах [114,117,118]. Хлораминовые производные аминокислот обладают выраженной способностью угнетать функции тромбоцитов, в первую очередь их агрегацию [9,13,17,18,20,21,23]. Поэтому возможно создание на их основе нового ингибитора тромбоцитов для предупреждения артериального тромбообразования [9,10]. Однако хлораминовые производные аминокислот - внутренне нестабильные соединения, это ограничивает возможность использование их в качестве лекарственного средства. Производные хлорамина таурина, более стабильные соединения. Можно полагать, что они могут стать основой получения новых лекарственных соединений с антиагрегационным действием.

Целью настоящей работы было изучение физико-химических свойств и молекулярно-клеточных механизмов антиагрегантного действия стабильных хлораминовых производных аминокислот и таурина.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Петрова, Анастасия Олеговна

Выводы

1. Определены спектрофотометричееким методом константы скоростей распада хлораминовых производных ряда моноаминовых а-аминокислот. Выявлено несколько аминокислотных хлораминов с повышенной устойчивостью. К ним относятся N-хлорглицин, N-хлорвалин, N-хлортреонин и N-хлоризолейцин. Этим хлораминам свойственна структурная особенность в (5-положении: в случае хлорамина глицина отсутствует атом углерода, а производные остальных трех аминокислот в указанном положении имеют разветвление структуры.

2. Проведен компьютерный расчет парциальных атомных зарядов Уанга-Форда хлораминов а-аминокислот полуэмпирическим квантово-механическим методом AMI. Хлорамины с повышенной устойчивостью отличаются высокими положительными суммами зарядов трех атомов: углерода в а- и (5-положениях и атома углерода карбоксильной группы. Высокий парциальный заряд получен и для одного атома углерода в р-положении. Одно из направлений создания новых более устойчивых аминокислотных хлораминов может заключаться в изменении состояния атома Ср путем разветвления структуры.

3. Изучено действие хлораминовых производных таурина на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов. Угнетение агрегации зависит от структуры хлораминовых антиагрегантов: наиболее эффективным является N,N-дихлортаурин (С50=0,2 мМ), более слабые антиагреганты - N-хлор-М-метилтаурин и N-хлортаурин в конечной концентрации 0,75 мМ снижают агрегацию тромбоцитов лишь на 15%. Антиагрегантное действие хлораминовых производных таурина, глицина и фенилаланина усиливается примерно в 2 раза в присутствии сывороточного альбумина. Это, вероятно, обусловлено особым взаимодействием с тромбоцитами хлораминов таурина в комплексе с альбумином.

4. Исследовано взаимодействие хлораминов с сывороточным альбумином методом дифференциальной спектрофотометрии. После введения N,N-дихлортаурина в раствор сывороточного альбумина в дифференциальном спектре поглощения появляется ряд максимумов, структурированная полоса 265- 290 нм. Это указывает на связывание >1,М-дихлортаурина с переходом молекул альбумина в другое состояние, затрагивающее микроокружение остатков ароматических

110 аминокислот: фенилаланина (пики в области 255-270 нм), тирозина (пики в области 280-285 нм), триптофана (290-295 нм). Можно полагать, что альбумин образует комплекс с хлораминовыми производными аминокислот и таурина и этот комплекс обеспечивает более эффективную реакцию хлораминов с тромбоцитами.

5. Особенностью взаимодействия хлораминовых производных аминокислот с тиолсодержащими соединениями может быть начальное образование активной сульфеновой группы (-БОН), судя по образованию циклического дисульфида (1,2-дитиан-4,5-диола) из дитиотреитола (1,4-димеркаптобутан-2,3-диола). На примере 1,2-дитиан-4,5-диола получены данные о том, что аминокислотные хлорамины или гипохлорит может вызывать превращение дисульфидной группы в продукт, который обладает выраженным антиагрегантным свойством.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петрова, Анастасия Олеговна, Москва

1. Баталова М. И.,Левин Г. Я. Влияние натрия гипохлорита на некоторые физико-химические показатели крови ожоговых больных./УЭфферентная терапия. 2001. (4). Р. 62-67.

2. Бояринов Г. А.,Векслер Н. Ю. Свойства и сферы применения натрия гипохлорита.//Эфферентная терапия. 1997. 3. (2). Р. 5-14.

3. Гасилин В. С.,Сидоренко Б. А. Стенокадия. Москва: Медицина, 1987.

4. Грызунов Ю. А.,Добрецов Г. Е. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Москва: Ириус, 1994.

5. Жибург Е. Б. Трансфузиология: учебник. Санкт-Петербург: "Питер", 2002.

6. Лакин Г. Ф. Биометрия. Москва: Высшая школа, 1990.

7. Мурина М. А., Кузнецов В. Н.,Рощупкин Д. И. Противоагрегационное действие гипохлорита на тромбоциты.//Бюл. экспер. биол. мед. 1986. СП. Р. 676-678.

8. Мурина М. А., Рощупкин Д. И., Кравченко Н. Н., Петрова А. 0.,Сергиенко В. И. Антиагрегантное действие биогенных хлораминов.//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Р. 94-100.

9. Мурина М. А., Рощупкин Д. П., Кравченко Н. Н., Садовников В. Б.,Сергиенко В. И. Противоагрегационное действие хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты в присутствии плазмы крови.//Биофизика. 1997. (6). Р. 1279-1285.

10. Мурина М. А., Рощупкин Д. П., Петрова А. 0.,Сергиенко В. И. Аминокислотные хлораминовые и хлориминовые антиагреганты: реакционные свойства и механизм действия.//Вестник РАМН. 2009. (10). Р. 43-49.

11. Мурина М. А., Рощупкин Д. И.,Сергиенко В. И. Патент РФ на изобретение № 2161483 "Средство для угнетения активности тромбоцитов". 2001.

12. Мурина М. А., Рощупкин Д. И.,Сергиенко В. И. Патент РФ на изобретение № 2382764 «Вещество, угнетающее функции тромбоцитов». 2010.

13. Мурина М. А., Савельева Е. Л.,Рощупкин Д. И. Механизм действия биогенных хлораминов и гипохлорита на начальную агрегацию тромбоцитов.//Биофизика. 2006. 51. (2). Р. 299-305.

14. Мурина М. А., Сергиенко В. И.,Рощупкин Д. И. Прямое и косвенное противоагрегационное действие гипохлорита натрия на обогащенную тромбоцитами плазму крови.//Бюл. экспер. биол. мед. 1989. CYII. Р. 702704.

15. Мурина М. А., Сергиенко В. И.,Рощупкин Д. И. Средство для снижения агрегации тромбоцитов. Патент СССР N 1834659.//Официальный бюллетень комитета РФ по патентам и товарным знакам. Изобретения. 1993. (30). Р. 62.

16. Мурина М. А., Трунилина Н. Н., Рощупкин Д. И., Саркина Э. Э.,Сергиенко В. И. Ингибирование агрегации тромбоцитов при действии гипохлорита натрия. Влияние компонентов плазмы крови.//Биофизика. 1995. 40. (3). Р. 569-575.

17. Мурина М. А., Фесенко О. Д., Сергиенко В. И., Чудина Н. А.,Рощупкин Д. И. Противотромботическая активность Ы,К-дихлортаурина in vivo на модели тромбоза у мышей.//Бюл. Экспер. Биол. Мед. 2002. 134. (7). Р. 44-47.

18. Петросян Э. А., Сергиенко В. И., Кулаев Г. К., Мартынов А. К., Лопухин Ю. М., Дубинкин О. В.,Бенсман В. М. Гипохлорит натрия в лечении гнойных ран.//Вестник хирургии. 1991. (1). Р. 40-43.

19. Рощупкин Д. И., Бержицкая В. В.,Мурина М. А. Различие в ингибирующем действии продуктов реакции, катализируемой миелопероксидазой, на тромбоциты.//Биофизика. 1998. 43. (2). Р. 323-328.

20. Рощупкин Д. И., Мурина М. А., Аднорал Н. В., Кравченко Н. Н.,Сергиенко В. И. Угнетение функций тромбоцитов биогенными хлораминами.//Физиология человека. 1998. 24. Р. 113-120.

21. Рощупкин Д. И., Мурина М. А., Кравченко Н. Н.,Сергиенко В. И. Избирательность ковалентного действия биохлораминовых антиагрегантов на обогащенную тромбоцитами плазму крови.//Биофизика. 2007. 52. Р. 527533.

22. Сергиенко В. И. Применение натрия гипохлорита, полученного электрохимически, в качестве антимикробного и ранозаживляющего средства.//Эфферентная терапия. 1996. 2. (4). Р. 25-31.

23. Струков А. П.,Серов В. В. Патологическая анатомия. Москва: Медицина, 1985.

24. Чудина Н. А. Физико-химические свойства и антиагрегационное действие биогенных хлораминов. Автореферат на сосискание ученой степени кандидата медицинских наук.//2002.

25. Эвентов В. JL, Андрианова М. Ю.Дукаева Е. А. Детоксикация и дезинфекция гипохлоритом натрия.//Медицинская техника. 1998. (6). Р. 3639.

26. Alberio L.,Dale G. L. Review article: platelet-collagen interactions: membrane receptors and intracellular signalling pathways.//European journal of clinical investigation. 1999. 29. (12). P. 1066-1076.

27. Andrews R. K.,Berndt M. C. Platelet physiology and thrombosis.//Thrombosis research. 2004. 114. (5-6). P. 447-453.

28. Angiolillo D. J., Ueno M.,Goto S. Basic principles of platelet biology and clinical implications.//Circ J. 2010. 74. (4). P. 597-607.

29. Ardlie N. G., Bell L. K.,McGuiness J. A. Synergistic potentiation by epinephrine of collagen or thrombin-induced calcium mobilization in human platelets.//Thrombosis research. 1987. 46. (4). P. 519-526.

30. Awtry E. H.,Loscalzo J. Aspirin.//Circulation. 2000. 101. (10). P. 1206-1218.

31. Baigent C.,Patrono C. Selective cyclooxygenase 2 inhibitors, aspirin, and cardiovascular disease: a reappraisal.//Arthritis and rheumatism. 2003. 48. (1). P. 12-20.

32. Bian H., Li M., Yu Q., Chen Z., Tian J.,Liang H. Study of the interaction of indirubin with bovine serum albumin.//Chemical & pharmaceutical bulletin. 2006. 54.(9). P. 1239-1243.

33. Bian H., Zhang H., Yu Q., Chen Z.,Liang H. Studies on the interaction of cinnamic acid with bovine serum albumin.//Chemical & pharmaceutical bulletin. 2007. 55.(6). P. 871-875.

34. Biewenga G., de Jong J.,Bast A. Lipoic acid favors thiolsulfinate formation after hypochlorous acid scavenging: a study with lipoic acid derivatives.//Archives of biochemistry and biophysics. 1994. 312. (1). P. 114-120.

35. Born G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.//Nature. 1962. 194. P. 927-929.

36. Bushfield M., McNicol A.,MacIntyre D. E. Possible mechanisms of the potentiation of blood-platelet activation by adrenaline.//The Biochemical journal. 1987. 241. (3).P. 671-676.

37. Calvo P., Crugeiras J.,Rios A. Kinetic and thermodynamic barriers to chlorine transfer between amines in aqueous solution.//The Journal of organic chemistry. 2009. 74. (15). P. 5381-5389.

38. Capasso S., Mazzarella L., Sica F.,Zagari A. Type II' beta-bend conformation of tert.-butyloxycarbonyl-L-amino-succinyl-L-alanyl-glycine methyl ester in the solid state.//Int J Pept Protein Res. 1984. 24. (6). P. 588-596.

39. Carballal S., Alvarez B., Turell L., Botti H., Freeman B. A.,Radi R. Sulfenic acid in human serum albumin.//Amino acids. 2007. 32. (4). P. 543-551.

40. Carr A. C., Hawkins C. L., Thomas S. R., Stocker R.,Frei B. Relative reactivities of N-chloramines and hypochlorous acid with human plasma constituents .//Free radical biology & medicine. 2001. 30. (5). P. 526-536.

41. Cattaneo M. Aspirin and clopidogrel: efficacy, safety, and the issue of drug resistance.//Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2004. 24. (11). P. 1980-1987.

42. Cattaneo M. New P2Y(12) inhibitors.//Circulation. 2010. 121. (1). P. 171-179.

43. Cattaneo M. The platelet P2Y(1)(2) receptor for adenosine diphosphate: congenital and drug-induced defects.//Blood. 2011. 117. (7). P. 2102-2112.

44. Chiang T. M., Rinaldy A.,Kang A. H. Cloning, characterization, and functional studies of a nonintegrin platelet receptor for type I collagen.//The Journal of clinical investigation. 1997. 100. (3). P. 514-521.

45. Clutton P., Folts J. D.,Freedman J. E. Pharmacological control of platelet function.//Pharmacol Res. 2001. 44. (4). P. 255-264.

46. Coughlin S. R. Protease-activated receptors in hemostasis, thrombosis and vascular biology .//Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 2005. 3. (8). P. 1800-1814.

47. Curtis M. P., Hicks A. J.,Neidigh J. W. Kinetics of 3-chlorotyrosine formation and loss due to hypochlorous acid and chloramines.//Chemical research in toxicology. 2011.24.(3). P. 418-428.

48. De Meyer S. F., Vanhoorelbeke K., Broos K., Salles, II,Deckmyn H. Antiplatelet drugs.//Br J Haematol. 2008. 142. (4). P. 515-528.

49. Diaz-Ricart M., Tandon N. N., Carretero M., Ordinas A., Bastida E.,Jamieson G. A. Platelets lacking functional CD36 (glycoprotein IV) show reduced adhesion to collagen in flowing whole blood.//Blood. 1993. 82. (2). P. 491-496.

50. Dorsam R. T.,Kunapuli S. P. Central role of the P2Y12 receptor in platelet activation.//The Journal of clinical investigation. 2004. 113. (3). P. 340-345.

51. Du X.,Ginsberg M. H. Integrin alpha lib beta 3 and platelet function.//Thrombosis and haemostasis. 1997. 78. (1). P. 96-100.

52. Farndale R. W., Sixma J. J., Barnes M. J.,de Groot P. G. The role of collagen in thrombosis and hemostasis.//Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 2004. 2.(4). P. 561-573.

53. Gelamo E. L.,Tabak M. Spectroscopic studies on the interaction of bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants.//Spectrochimica acta. Part A, Molecular and biomolecular spectroscopy. 2000. 56A. (11). P. 2255-2271.

54. Giles G. I., Tasker K. M., Collins C., Giles N. M., O'Rourke E.,Jacob C. Reactive sulphur species: an in vitro investigation of the oxidation properties of disulphide S-oxides.//The Biochemical journal. 2002. 364. (Pt 2). P. 579-585.

55. Giles G. I., Tasker K. M.,Jacob C. Oxidation of biological thiols by highly reactive disulfide-S-oxides.//General physiology and biophysics. 2002. 21. (1). P. 65-72.

56. Giossi A., Pezzini A., Del Zotto E., Volonghi I., Costa P., Ferrari D.,Padovani A. Advances in antiplatelet therapy for stroke prevention: the new P2Y12 antagonists.//Current drug targets. 2010. 11. (3). P. 380-391.

57. Gray G. R., Schwartz B. A.,Kamicker B. J. Proteins containing reductively aminated disaccharides: chemical and immunochemical characterization.//Prog Clin Biol Res. 1978. 23. P. 583-594.

58. Guerra D. R.,Tcheng J. E. Prasugrel: Clinical development and therapeutic application.//Adv Ther. 2009. 26. (11). P. 999-1011.

59. Hampton M. B., Kettle A. J.,Winterbourn C. C. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing.//Blood. 1998. 92. (9). P. 30073017.

60. Hawkins C. L.,Davies M. J. Hypochlorite-induced damage to proteins: formation of nitrogen-centred radicals from lysine residues and their role in protein fragmentation.//The Biochemical journal. 1998. 332 ( Pt 3). P. 617-625.

61. Hawkins C. L.,Davies M. J. Hypochlorite-induced oxidation of proteins in plasma: formation of chloramines and nitrogen-centred radicals and their role in protein fragmentati on .//The Biochemical journal. 1999. 340 ( Pt 2). P. 539-548.

62. Italiano J. E., Jr.,Shivdasani R. A. Megakaryocytes and beyond: the birth of platelets.//Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 2003. 1. (6). P. 11741182.

63. Jarvis G. E. Platelet aggregation in whole blood: impedance and particle counting methods .//Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2004. 272. P. 77-87.

64. Jarvis G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements.//Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2004. 272. P. 65-76.

65. Jarvis G. E., Atkinson B. T., Snell D. C.,Watson S. P. Distinct roles of GPVI and integrin alpha(2)beta(l) in platelet shape change and aggregation induced by different collagens.//British journal of pharmacology. 2002. 137. (1). P. 107-117.

66. Jennings L. K. Role of platelets in atherothrombosis.//The American journal of cardiology. 2009. 103. (3 Suppl). P. 4A-10A.

67. Jordan P. A., Stevens J. M., Hubbard G. P., Barrett N. E., Sage T., Authi K. S.,Gibbins J. M. A role for the thiol isomerase protein ERP5 in platelet function.//Blood. 2005. 105. (4). P. 1500-1507.

68. Kettle A. J., van Dalen C. J.,Winterbourn C. C. Peroxynitrite and myeloperoxidase leave the same footprint in protein nitration.//Redox report : communications in free radical research. 1997. 3. (5-6). P. 257-258.

69. Kim C.,Cha Y. N. Production of reactive oxygen and nitrogen species in phagocytes is regulated by taurine chloramine.//Advances in experimental medicine and biology. 2009. 643. P. 463-472.

70. Lad N., Lunt D. 0.,Tuffin D. P. The effect of thromboxane A2 synthesis inhibitors on platelet aggregation in whole blood.//Thrombosis research. 1987. 46. (4). P. 555-566.

71. Leger A. J., Covic L.,Kuliopulos A. Protease-activated receptors in cardiovascular diseases.//Circulation. 2006. 114. (10). P. 1070-1077.

72. Lordkipanidze M., Pharand C., Palisaitis D. A.,Diodati J. G. Aspirin resistance: truth or dare .//Pharmacol Ther. 2006. 112. (3). P. 733-743.

73. McNicol A.,Israels S. J. Platelets and anti-platelet therapy .//J Pharmacol Sci. 2003. 93.(4). P. 381-396.

74. Midwinter R. G., Peskin A. V., Vissers M. C.,Winterbourn C. C. Extracellular oxidation by taurine chloramine activates ERK via the epidermal growth factor receptor.//The Journal of biological chemistry. 2004. 279. (31). P. 32205-32211.

75. Nieswandt B.,Watson S. P. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor?//Blood. 2003. 102. (2). P. 449-461.

76. Nylander S., Mattsson C., Ramstrom S.,Lindahl T. L. The relative importance of the ADP receptors, P2Y12 and P2Y1, in thrombin-induced platelet activation.//Thrombosis research. 2003. 111. (1-2). P. 65-73.

77. Offermanns S. Activation of platelet function through G protein-coupled receptors.//Circulation research. 2006. 99. (12). P. 1293-1304.

78. Otagiri M. Study on binding of drug to serum protein.//Yakugaku Zasshi. 2009. 129. (4). P. 413-425.

79. Otagiri M.,Chuang V. T. Pharmaceutical^ important pre- and posttranslational modifications on human serum albumin.//Biological & pharmaceutical bulletin. 2009. 32. (4). P. 527-534.

80. Pankert M., Quilici J.,Cuisset T. Role of antiplatelet therapy in secondary prevention of acute coronary syndrome.//Journal of cardiovascular translational research. 2012. 5. (1). P. 41-51.

81. Papathanasiou A., Goudevenos J.,Tselepis A. D. Resistance to aspirin and clopidogrel: possible mechanisms, laboratory investigation, and clinical significance.//Hellenic J Cardiol. 2007. 48. (6). P. 352-363.

82. Patrignani P. Aspirin insensitive eicosanoid biosynthesis in cardiovascular disease.//Thrombosis research. 2003. 110. (5-6). P. 281-286.

83. Patrono C.,Rocca B. Aspirin, 110 years later.//Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 2009. 7 Suppl 1. P. 258-261.

84. Peskin A. V., Midwinter R. G., Harwood D. T.,Winterbourn C. C. Chlorine transfer between glycine, taurine, and histamine: reaction rates and impact on cellular reactivity .//Free radical biology & medicine. 2004. 37. (10). P. 1622-1630.

85. Peskin A. V.,Winterbourn C. C. Kinetics of the reactions of hypochlorous acid and amino acid chloramines with thiols, methionine, and ascorbate.//Free radical biology & medicine. 2001. 30. (5). P. 572-579.

86. Picker S. M. In-vitro assessment of platelet function.//Transfusion and apheresis science : official journal of the World Apheresis Association : official journal of the European Society for Haemapheresis. 2011. 44. (3). P. 305-319.

87. Qi R., Yatomi Y.,Ozaki Y. Effects of incubation time, temperature, and anticoagulants on platelet aggregation in whole blood.//Thrombosis research. 2001. 101.(3). P. 139-144.

88. Quinn M. J.,Fitzgerald D. J. Ticlopidine and clopidogrel.//Circulation. 1999. 100. (15). P. 1667-1672.

89. Qureshi Z.,Hobson A. R. Clopidogrel "Resistance": Where are We Now?//Cardiovascular therapeutics. 2011.

90. Rahmanto A. S., Morgan P. E., Hawkins C. L.,Davies M. J. Cellular effects of peptide and protein hydroperoxides.//Free radical biology & medicine. 2010. 48. (8). P. 1071-1078.

91. Reinhart K. M., White C. M.,Baker W. L. Prasugrel: a critical comparison with clopidogrel.//Pharmacotherapy. 2009. 29. (12). P. 1441-1451.

92. Schuller-Levis G. B.,Park E. Taurine: new implications for an old amino acid.//FEMS microbiology letters. 2003. 226. (2). P. 195-202.

93. Siller-Matula J. M., Krumphuber J.,Jilma B. Pharmacokinetic, pharmacodynamic and clinical profile of novel antiplatelet drugs targeting vascular diseases.//British journal of pharmacology. 2010. 159. (3). P. 502-517.

94. Siller-Matula J. M., Krumphuber J.,Jilma B. Pharmacokinetic, pharmacodynamic and clinical profile of novel antiplatelet drugs targeting vascular diseases.//Br J Pharmacol. 2010. 159. (3). P. 502-517.

95. Slivka A., LoBuglio A. F.,Weiss S. J. A potential role for hypochlorous acid in granulocyte-mediated tumor cell cytotoxicity .//Blood. 1980. 55. (2). P. 347-350.

96. Spector A. A. Fatty acid binding to plasma albumin.//Journal of lipid research. 1975. 16.(3). P. 165-179.

97. Tello-Montoliu A., Tomasello S. D., Ueno M.,Angiolillo D. J. Antiplatelet therapy: thrombin receptor antagonists.//British journal of clinical pharmacology. 2011. 72. (4). P. 658-671.

98. Thomas E. L., Grisham M. B.,Jefferson M. M. Myeloperoxidase-dependent effect of amines on functions of isolated neutrophils.//The Journal of clinical investigation. 1983. 72. (2). P. 441-454.

99. Thomas E. L., Grisham M. B., Melton D. F.,Jefferson M. M. Evidence for a role of taurine in the in vitro oxidative toxicity of neutrophils toward erythrocytes.//The Journal of biological chemistry. 1985. 260. (6). P. 3321-3329.

100. Turell L., Carballal S., Botti H., Radi R.,Alvarez B. Oxidation of the albumin thiol to sulfenic acid and its implications in the intravascular compartment.//Braz J Med Biol Res. 2009. 42. (4). P. 305-311.

101. Ueno M., Kodali M., Tello-Montoliu A.,Angiolillo D. J. Role of platelets and antiplatelet therapy in cardiovascular disease.//J Atheroscler Thromb. 2011. 18. (6). P. 431-442.

102. Undas A., Brummel-Ziedins K. E.,Mann K. G. Antithrombotic properties of aspirin and resistance to aspirin: beyond strictly antiplatelet actions.//Blood. 2007. 109. (6). P. 2285-2292.

103. Varga-Szabo D., Pleines I.,Nieswandt B. Cell adhesion mechanisms in platelets.//Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2008. 28. (3). P. 403-412.

104. Vorchheimer D. A.,Becker R. Platelets in atherothrombosis.//Mayo Clin Proc. 2006. 81. (1). P. 59-68.

105. Ware J. A., Smith M.,Salzman E. W. Synergism of platelet-aggregating agents. Role of elevation of cytoplasmic calcium.//The Journal of clinical investigation. 1987. 80.(1). P. 267-271.

106. Winterbourn C. C.,Kettle A. J. Biomarkers of myeloperoxidase-derived hypochlorous acid.//Free radical biology & medicine. 2000. 29. (5). P. 403-409.

107. Wu K. K. Aspirin and other cyclooxygenase inhibitors: new therapeutic insights.//Semin Vase Med. 2003. 3. (2). P. 107-112.

108. Wu K. K. Platelet activation mechanisms and markers in arterial thrombosis.//J Intern Med. 1996. 239. (1). P. 17-34.

109. Yang F., Bian C., Zhu L., Zhao G., Huang Z.,Huang M. Effect of human serum albumin on drug metabolism: structural evidence of esterase activity of human serum albumin.//Journal of structural biology. 2007. 157. (2). P. 348-355.

110. Zgliczynski J. M., Stelmaszynska T., Domanski J.,Ostrowski W. Chloramines as intermediates of oxidation reaction of amino acids by myeloperoxidase.//Biochimica etbiophysica acta. 1971. 235. (3). P. 419-424.

111. Zunszain P. A., Ghuman J., Komatsu T., Tsuchida E.,Curry S. Crystal structural analysis of human serum albumin complexed with hemin and fatty acid.//BMC structural biology. 2003. 3. P. 6.

112. Zwaal R. F., Comfurius P.,Bevers E. M. Lipid-protein interactions in blood coagulation.//Biochimica et biophysica acta. 1998. 1376. (3). P. 433-453.