Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Начальная агрегация тромбоцитов и ее изменение при химической модификации клеточных мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Начальная агрегация тромбоцитов и ее изменение при химической модификации клеточных мембран"

?Г6 од

На правах рукописи

Бержицкая Валерия Владимировна

Начальная агрегация тромбоцитов и её изменение при химической модификации клеточных мембран

Биофизика - 03. 00. 02.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре биофизики Российского Государствен ного Медицинского Университета (Москва)

Научный руководитель :

доктор биологических наук, профессор Рощупкин Д.И. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Коркина Л.Г. доктор биологических наук Архипенко Ю.В.

Ведущая организация : НИИ Физико-химической медицины МЗ РФ

Защита состоится "_" _ 1997 г. в_часов

на заседании специализированного совета по защите диссертаций К.084.14.04 при Российском Государственном Медицинском Университете по адресу : 117531, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан "_"_ 1997 г.

Учёный секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Буромский И.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Во многих случаях сердечно-сосудистых, хирургических, онкологических заболеваний, при диабете повышенная активность тромбоцитов приводит к тромбозам [Wu К.К., 1996]. Поэтому сейчас ведётся широкий поиск средств, подавляющих активность тромбоцитов [Becker R.C., 1992]. С другой стороны, при пониженном функциональном состоянии этих клеток возникают внутренние кровотечения, геморрагический синдром, анемии. Для борьбы с этими осложнениями в клинике применяется переливание концентрата тромбоцитов [Аграненко В.А., 1994]. Во всех этих случаях необходима адекватная оценка функционального состояния этих клеток.

В качестве основного показателя активности тромбоцитов используют их способность к агрегации, вызываемой каким-либо индуктором (агонистом). Чаще всего агрегацию тромбоцитов исследуют с применением турбндиметрического метода Борна, регистрирующего образование крупных агрегатов (вторичную агрегацию тромбоцитов) [Вот G.V.R., 1962]. Однако уже в первые секунды с момента индукции происходит начальная агрегация тромбоцитов - образование мелких агрегатов, состоящих из 5-10 клеток [Frojmovic М.М., 1983]. На этом проявление активности клеток может заканчиваться. Такая агрегация не фиксируется турбидиметрически-ми агрегометрами, что может привести к ошибочной оценке функционального состояния тромбоцитов. Изучение начальной агрегации тромбоцитов важно как для адекватной характеристики этих клеток, так и для исследования механизмов формирования агрегатов.

Недавно в нашей лаборатории был разработан новый нефелометриче-ский метод анализа агрегации тромбоцитов [Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю., 1995]. Этот способ позволяет регистрировать образование мелких агрегатов тромбоцитов, т. е. именно начальную агрегацию тромбоцитов. Можно предполагать, что использование нефелометрического способа может оказаться особенно эффективным при исследовании (1) агрегации тромбоцитов в присутствии свёртывающейся плазмы крови; (2) агрегации изолированных слабоакгавных тромбоцитов, например, на поздних сроках хранения их концентрата, предназначенного для трансфузии; (3) активности тромбоцитов с использованием низких концентраций индукторов.

Регистрация начальной агрегации тромбоцитов позволяет достаточно быстро и эффективно оценивать их функциональное состояние. Поэтому представлялось возможным провести исследование, интересное с прикладной точки зрения. Известно, что для оценки степени чистоты воды иногда применяют биологические тесты [Поворов A.A., 1994]. Предполагалось выявить изменения начальной агрегации тромбоцитов под влиянием на них примесных соединений из состава водопроводной воды.

Для лечения тромбозов, опосредованных тромбоцитами, может требоваться всеобщая инактивация тромбовдггарных клеток, то есть подавление их активности независимо от природы индуктора и механизма внутриклеточной передачи сигнала. Это можно ожидать при химической модификации плазматической мембраны в целом. С этой целью необходимо

исследовать, изменение каких конкретных химических групп плазматических мембран тромбоцитов может приводить к их ингибированию. Поэтому предполагалось изучить начальную агрегацию тромбоцитов при воздействии на них флуорескамина (связывающего аминогруппы), дитионит-робензойной кислоты (окисляющей сульфгадрильные группы) и ацетилсалициловой кислоты (ацетилирующей гвдроксильные группы).

Также перспективно для этой цели использование продуктов миело-пероксвдазной реакции - гнпохлорита натрия и хлораминовых производных аминокислот. До настоящего времени молекулярно-клеточный механизм их ингабирующего действия на тромбоциты детально не изучен.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей начальной агрегации тромбоцитов нефелометрическим методом и исследование изменений агрегации тромбоцитов под воздействием соединений, химически модифицирующих клеточные мембраны. В соответствии с этим предусматривалось решение следующих задач:

1) Выяснить возможность нефелометрической регистрации начальной агрегации тромбоцитов в условиях свёртывания плазмы крови и при их пониженной активности. Изучить начальную агрегацию тромбоцитов в следующих случаях: при использовании низких концентраций ицдукгоров; при индукции агрегации изолированных тромбоцитов аденозиндифосфа-том; при одновременной турбидиметрической регистрации изменения формы клеток; при определении агрегационной активности тромбоцитов человека, предназначенных для переливания.

2) Оценить влияние примесных соединений, входящих в состав водопроводной воды, на агрегацию тромбоцитов.

3) Исследовать ингибирование начальной агрегации тромбоцитов при химической модификации их мембран. Выяснить роль конкретных химических трупп в этом процессе.

4) Исследовать закономерности ингибирования начальной агрегации Тромбоцитов разными продуктами миелопероксидазной , реакции (гипохлоритом натрия и Ы-хлор-а-аланином) при различных механизмах активации клеток.

Научная довизна исследования. Было выяснено, что начальная агрегация тромбоцитов регистрируется в условиях свёртывания плазмы крови, поскольку формирование мелких агрегатов происходит до начала свёртывания. Выявлено, что можно на одном образце изучать два процесса активации тромбоцитов - изменение формы и агрегацию. Нефелометрическим способом исследованы слабоактивные тромбоциты. При этом показано, что возможно изучение АДФ-ивдуцированной агрегации изолированных тромбоцитов и применение низких концентраций индукторов. Этим же способом обнаружена активность тромбоцитов на 6-7 сутки их хранения в составе концентрата. Его можно предложить для контроля за агрегационной активностью тромбоцитов, предназначенных для переливания.

Показано, что ионы кальция, содержащиеся в водопроводной воде, индуцируют переход изолированных тромбоцитов кролика в рефрактерное состояние, обнаруживаемое по критерию ослабления начальной агрегации,

вызываемой Са2+ в высокой концентрации. Гипохлорит натрия в концентрациях, соответствующих его содержанию в водопроводной воде, вызывает снижение Са2+-индуцируемой агрегации тромбоцитов.

Установлено, что действие на тромбоциты флуорескамина (10 мкМ) и дитионитробензойной кислоты (10-80 мкМ), взаимодействующих соответственно с амино- и сульфгидрильными группами, приводит к снижению начальной агрегации клеток. Ацетилсалициловая кислота (10-100 мкМ), реагирующая с падроксильными группами, не влияет на начальную агрегацию тромбоцитов. Это указывает на то, что амино- и сульфгидриль-ные группы клеточных мембран тромбоцитов важны в механизме угнетения их активности при химической модификации.

Выяснено, что противоагрегационное действие на тромбоциты гипо-хлорита натрия а N -хлор-а- аланина различается. Максимальное снижение агрегации наблюдается уже через 0,5-1 мин инкубации клеток с гипохлори-том, тогда как противоагрегационный эффект Ы-хлор-а-аланина усиливается до 5 мин инкубации. Установлено, что подавляющее действие 14-хлор-а-аланина на агрегацию тромбоцитов не зависит от природы индуктора, а ингибирующее действие гапохлорита в 2-3 раза сильнее при использовании агонистов, требующих присутствия внеклеточного Са2+ для активации клеток. Аналогичная зависимость от механизма индукции выявлена и при действии на тромбоцита дитионитробензойной кислоты. Полученные данные указывают на важную роль БН-групп кальциевых каналов плазматических мембран тромбоцитов в механизме действия гипохлорита натрия.

Практическое значение работы. Обнаруженные возможности нефело-метрического метода позволяют предложить этот способ в качестве адекватного контроля за агрегационой активностью тромбоцитов, в том числе предназначенных для переливания в организм человека. Полученные данные о роли амино- и сульфгидрильных групп плазматических мембран в ингабировании тромбоцитов указывают на перспективность поиска средств для борьбы с тромбозами среди химических модификаторов этих групп клеточных мембран. Обнаруженные закономерности противоагрега-ционного действия гипохлорита натрия и Ы-хлор-а-аланина позволяют теоретически обосновать их лечебное действие в качестве противотромбо-цитных средств и их побочное действие на тромбоциты при введении в кровяное русло в качестве детоксицирующих агентов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Российской конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфу-зиологии", Санкт-Петербург, июнь 1995 г.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 33 рисунка и 3 таблицы, состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Заключение" и выводов. Список литературы включает 220 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Реактивы. В работе использовались соли марок ЧДА и ХЧ, а-тромбин бычий (Медио), коммерческие препараты ацетилсалициловой кислоты (аспирина) (Sigma), акридинового оранжевого (Sigma), флуорес-камина (Sigma), 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислоты (Sigma), адено-зшщифосфата (Serva), коллагена (Chrono-log), эпинефрина (адреналина) (Chrono-log), а-аланина (Reaixal). Гипохлорит натрия получали путём электролиза 0,9 % хлористого натрия на аппарате ЭДО-4. N-Хлор-а-аланин получали при взаимодействии гипохлорита натрия и а-аланина в эквимо-лярных концентрациях [Мурина МА., 1995].

Получение тромбоцитов. Работа в основном проводилась на тромбоцитах кролика в составе обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) и изолированном виде. Использовались также тромбоциты крыс в составе ОТП и тромбоциты человека из концентрата тромбоцитов. Для получения ОТП животных кровь забирали у кролика из краевой вены уха, а у крысы - напрямую из левого желудочка сердца после вскрытия грудной клетки. Кровь стабилизировали цитратом натрия (3,8 % трёхзамещёнвого цитрата натрия; 0,139 мМ NaCl; рН=7,Зб) в соотношении 9:1 по объёму и центрифугировали 15 мин при 460 g. Отобранная надосадочная суспензия клеток представляла собой ОТП. Бедную тромбоцитами хиазму (БТП) получали центрифугированием ОТП 5 мин при 7400 g. Концентрат тромбоцитов человека получали на станции переливания крови. Он представлял суспензию объемом 40 мл, полученную из 400 мл крови. Концентрат хранился в пластиковом мешочке (Green Cross Medical Corp., Korea) при 22°C в термостате рри непрерывном перемешивании (покачивание с частотой 2 Гц). Для измерения агрегации концентрат разводился буфером (10 мМ HEPES; 134 мМ NaCl; 5 мМ KCl; 1 мМ MgS04; 0,5 мМ Na2HP04; 0,5 мМ глюкозы; рН=7,4) в 5 раз.

Выделение изолированных тромбоцитов. Кровь кролика стабилизировали кислым цитратом натрия (85 мМ трёхзамещённого цитрата натрия; 71 мМ лимонной кислоты; 11 мМ D-глюкозы; рН=4,5) в объёмном соотношении 5:1. После центрифугирования при 460 g 15 мин в отобранный су-пернатант (ОТП) добавляли 1 мМ ЭДТА и центрифугировали 7 мин при 1850 g. Осажденные тромбоциты ресуспевдировали в 0,1 объёма 3,8 % цитрата натрия (рН=7,36) и инкубировали 5 мин при 37°С. Для работы суспензию тромбоцитов разбавляли буфером (10 мМ HEPES; 134 мМ NaCl; 5 мМ KCl; 1 мМ MgS04; 0,5 мМ Na2HP04; 0,5 мМ глюкозы; рН=7,4) в 10 или 20 раз.

Регистрация агрегации тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов анализировали двумя оптическими методами: турбидиметрическим по Борну и не-фелометрическим.

1) Турбидиметрический метод. Традиционное турбидиметрическое исследование проводили на агрегометре, собранном на базе фотоэлекгроколори-метра КФК-2МП, а также использовались люмиагрегометр фирмы Chrono-

log (США) и второй турбидиметрический канал кинетического нефеломет-ра-агрегометра, сконструированного в нашей лаборатории [Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю., 1995]. Количественным показателем агрегации было изменение светопропускания суспензии тромбоцитов (AT) через определённое время после введешм индуктора.

2) Нефелометрический метод. Для изучения малоуглового рассеяния света тромбоцитами в нашей лаборатории сконструирован комбинированный прибор (кинетический нефелометр-агрегометр), который позволяет на одном образце регистрировать зависимости от времени интенсивности рассе-шшого в пределах малых углов (0,5-7°) света и интенсивности света, прошедшего без существенного отклонения от первоначального направления (практически в интервале 0-0,005°). Источником света служит гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 им. Количественным показателем агрегационной способности тромбоцитов было изменение интенсивности рассеянного света (AI), регистрируемое через определённое время после введения индуктора агрегации (степень агрегации). При исследовании действия соединений данные представлены в виде отношения Al/AlK*100 %, где А1К и AI - степень агрегации нативных тромбоцитов (контроль) и клеток под действием исследуемых соединений.

Регистрация изменения формы клеток. Округление тромбоцитов при активации исследовали турбидиметрическим методом с использованием второго канала кинетического нефелометра-агрегометра.

Статистическая обработка результатов проводилась по параметрическому t-критерию Стьюдента и по непараметрическим парным Т-критерию Вилкоксона и U-крнтерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение 1. Особенности начальной агрегации тромбоцитов

В работе изучались особенности начальной агрегации тромбоцитов с применением нефелометрического способа регистрации. В ходе этого исследовались также новые, ещё не изучегапле, возможности этого метода.

1.1. Агрегапия тромбопитов в условиях свёртывания плазмы

Через некоторый латентный период после введения тромбина в ОТП кролика (в конечной концентрации 0,4 ед/мл) наблюдалось в условиях постоянного перемешивания увеличение интенсивности рассеянного света, которое достигало максимума через 1,5-2 мин (Рис.1, кривая 1). Аналогичный результат получался при введении в ОТП ионов кальция в значительной концентрации 3-10 мМ (Рис. 1, кривая 5). Отличие состояло в более продолжительном латентном периоде. При действии и тромбина, и ионов кальция обнаруживалось свертывание плазмы ОТП (появление шумов), но начало этого процесса приходилось позже максимума светорассеяния (через 2,5 - 4 мин после введения ивдуктора). Указанное усиление светорассеяния в перемешиваемых образцах ОТП не обусловлено каким-либо изменением состояния плазмы, например, агрегацией белков, поскольку при введении тромбина или ионов кальция в плазму без тром-

боцитов этот эффект не наблюдался (Рис.1, кривые 4 и 7). Результат двух видов экспериментов показывает, что усиление светорассеяния отражает агрегацию тромбоцитов. Во-первых, эффект увеличения светорассеяния резко падал в присутствии 1 мМ ЭДТА (Рис.1, кривая 3), которая, как известно, подавляет агрегацию тромбоцитов. Во-вторых, если сразу после введения тромбина или ионов кальция прекратить перемешивание ОТП, интенсивность рассеянного света не возрастала (Рис.1, кривые 2 и 6). Известно, что агрегация тромбоцитов происходит только в условиях перемешивания, когда обеспечивается эффективное столкновение клеток друг с другом. Важно, что при исследовании светопропускания ОТП на ацетометре СЬгопо-1хщ его увеличения под действием тромбина не регистрировалось (Рис.1, кривая 8). Это свидетельствует об отсутствии в исследованном временном интервале образования крупных агрегатов (вторичной агрегации). На основании всех данных можно заключить, что нефеломет-рический метод регистрирует формирование мелких агрегатов, т. е. начальную агрегацию тромбоцитов.

I' 8

у.е.

Тромбин

I,

у.е.

А5 /

■ 1

2 4

СаСЬ

6

1 2 Время, мин

2 4

Время, мин

1 2 Время, мин

Рис.1. Типичные кинетические кривые изменения интенсивности рассеянного света (I, в условных единицах) или светопропускания (Т, в %) ОТП, плазмы крови кролика после введения активатора тромбоцитов. Стрелки - моменты введения тромбина (0,4 ед/мл) или СаС1г (9 мМ). 1,2 и 3 - ОТП (активация тромбином) соответственно при перемешивании, без перемешивания и в присутствии 1 мМ ЭДТА при перемешивании; 5 и 6 - ОТП (активация раствором СаС^) соответственно при перемешивании и без перемешивания; 4 и 7 - плазма крови при перемешивании соответственно после введения тромбина и СаС^; 8 - ОТП (активация тромбином), измерение светопропускания на а1регометре СЬюпо-1о£.

Количественным показателем этой агрегации может служить величина изменения интенсивности рассеянного света Л1 (степень агрегации) через определенное время после введения индуктора агрегации тромбоцитов (Рис.1). Необходимо подчеркнуть, что таким способом можно зарегистрировать агрегацию тромбоцитов в присутствии плазмы до начала ее свертывания.

1.2. Изучение слабоактивпых тромбоцитов

Проявление агрегациогагой активности тромбоцитов иногда может заключаться в формировании только мелких агрегатов.

1.2.1. АДФ-индуцированиая агрегация изолированных тромбоцитов При индукции агрегации аденозиндифосфатом (АДФ) требуется присутствие экзогенных молекул фибриногена для формирования межклеточных "мостиков" при образовании агрегатов тромбоцитов 1989]. Агрегация изолированных тромбоцитов при введении АДФ (5 мкМ) с добавлением 2 % (от объёма) плазмы крови, в состав которой входит фибриноген, эффективно регистрируется нефелимстрическим методом (Рис. 2, кривая 1) и не выявляется турбидиметрическим методом (Рис. 2, кривая 3). Таким образом, в этих условиях активации клеток происходит только начальная агрегация тромбоцитов, которая характеризуется отсутствием латентного периода и быстрой (в течение 1 мин) агрегацией при постоязшом перемешивании образца (кривая 1). При остановке перемешивания не происходило увеличения рассеянного света (кривая 2). Такую модель АДФ-ивдуцированной агрегации практически изолированных тромбоцитов мы широко применяли в дальнейших исследованиях.

I,

у.е.

Рис.

АДФ

Т,

% 20

10

АДФ

о

12 0 12 Время, мин Время, мин

2. Типичные кинетические кривые агрегации изолированных тромбо-

цитов кролика при индукции АДФ (5 мкМ) в присутствии 2 % (от объёма) плазмы крови. Стрелки - момент введения АДФ. 1 и 2 - изменение интенсивности рассеянного света (I, в условных единицах) суспензии клеток после введения АДФ соответственно без прекращения и с прекращением перемешивания; 3 -изменение светопропускания (Т, в %) суспензии клеток на агрегометре Онопо-к®.

2

у.еГ

50

Т, I, % у.е.

40

30

20

10

. Тром бин

50

Т,

40

30

20

10

0 12 0 12 Время, мин Время, мин

Рис. 3. Агрегация тромбоцитов человека на 3-й сутки их хранения в составе концентрата при действии АДФ (0,2 мкМ) и тромбина (0,02 ед/мл). Кривые 1 и 3 - изменение светопропускания (Т, в %; оси справа) суспензии тромбоцитов в результате введения соответственно АДФ или тромбина. Кривые 2 и 4 - изменение интенсивности рассеянного света (I, в условных единицах; оси слева) суспензии тромбоцитов в результате введения соответственно АДФ или тромбина.

2

1

1.2.2. Использование низких концентраций индукторов Применение низких концентраций индукторов агрегации тромбоцитов позволяет проводить более экономичные исследования и соответствует ситуации в кровеносном русле. При введении в суспензию тромбоцитов человека АДФ в концентрации 0,2 мкМ (Рис. 3, кривые 1 и 2) или тромбина в концентрации 0,02 ед/мл (Рис. 3, кривые 3 и 4) происходила только начальная агрегация клеток (ср. кривые 2 и 4 с кривыми 1 и 3). Такая активность тромбоцитов отражает их функциональное состояние. Поэтому при действии низких, более физиологичных, концентраций агонистов не-фелометрический способ позволяет достаточно быстро (за 1 мин) оценивать агрегационную способность этих клеток.

1.3. Одновременная регистрация изменения формы и агрегациоявой

активности клеток При активации тромбоцитов, помимо агрегации происходит также изменение их формы. В суспензии округление клеток приводит к снижению её светопропускания. Традиционно считается, что при турбидиметри-ческом изучении агрегации тромбоцитов регистрируют и их округление. Об этом судят по начальному участку снижения кинетической кривой. Однако формирование мелких агрегатов происходит уже в первые секунды активации тромбоцитов. Рассеяние света на этих частицах также приводит к ослаблению интенсивности выходящего из образца света. Очевидно, судить о турбидимехрической регистрации изменения формы тромбоцитов можно только при полном отсутствии агрегации клеток. Работа проводилась на тромбоцитах и крысы, и кролика в составе ОТП, для активации клеток применялся АДФ (0,2 мкМ). Используемый нами оптический прибор имеет два канала регистрации: нефелометрический и турбидиметрический.

I,

у.е.

А

а-б 1 в

X

Т, I, 80 % у.е.8

40

а-б

\

' в

Т,

%

40

J

0 12 0 12 Время, мин Время, мин

Рис. 4. Типичные кинетические кривые активации тромбоцитов крысы в составе ОТП. Кривые 1 и 2 - изменение светопропускания (Т, в %; оси справа) и интенсивности рассеянного света (I, в условных единицах; оси слева) ОТП при активации АДФ (0,2 мкМ). А и Б - активация клеток с временным прекращением перемешивания образца соответственно на 10 и 15 сек. Стрелки а-б ив- со-ответстветю прекращение перемешивания образца сразу после введения АДФ и возобновление перемешивания.

Возможность одновременного анализа на одном и том же образце процессов агрегации тромбоцитов и изменения их формы удалось реализовать следующим способом. Сразу после введения АДФ прекращалось перемешивание образца и с помощью турбидиметрического канала регистрировалось уменьшение светопропускания, отражающее округление (Рис. 4, А и Б, кривые 1). Через 10-15 с после введения стимулятора вновь начиналось перемешивание и измерялось увеличение интенсивности рассеянного света как показатель начальной агрегации (Рис. 4, А и Б, кривые 2). Следует отметить, что при описанном режиме измерения увеличение интенсивности рассеянного света несколько меньше, чем обычно, при непрерывном перемешивании. Это является результатом известного явления перехода активированных клеток в так называемое рефрактерное состояние с ослаблением способности формировать агрегаты.

Итак, на первом этапе работы установлены возможности нефеломет-рического способа и исследованы особенности начальной ахрекищи тромбоцитов.

2. Исследование начальной агрегации тромбоцитов для оценки их жизнеспособности

2.1. Оиспка активности тромбоцитов человека, предназначенных для трансфузии

Многие заболевания человека связаны с тромбоцитопениями и тром-боцитопатиями. В таких случаях применяется трансфузия крови или концентрата тромбоцитов. При этом необходимо знать функциональную активность клеток, предназначенных для переливания в организм человека.

АДФ

100*-

Тромбин

В 20

<и

н

2 3 4 5

Ь*^ о

6 7 8

Сутки

J-1-1- > А

2 3 4 5 6 7 8

Сутки

Рис. 5. Начальная и вторичная агрегация тромбоцитов человека в зависимости от срока их хранения (в сутках) в составе концентрата тромбоцитов. Кривые 1 и 3 - степень вторичной агрегации тромбоцитов (в % к тому же показателю на;1-е сутки) при активации клеток соответственно АДФ (10 мкМ) или тромбином (0Л ел/мл). Кривые. 2 и 4 - степень начальной агрегации тромбоцитов (в % к тому же показателю на 1-е сутки) при активации клеток соответственно АДФ (10 мкМ) или тромбином (0,1 ед/мл).

Мы исследовали тромбоциты человека из концентрата в ходе их длительного хранения двумя способами: турбидиметрическим и нефелометриче-ским. Применяя высокие концентрации идукгоров (10 мкМ АДФ и 0,1 ед/мл тромбина), мы изучали начальную и вторичную агрегацию тромбоцитов в зависимости от срока их хранения (Рис. 5). По мере увеличения срока хранения снижается агрегационная активность клеток. Начальная агрегация тромбоцитов обнаруживается вплоть до 6-7 суток хранения концентрата (кривые 2 и 4). Образование же крупных агрегатов практически не регистрируется уже на 5 сутки (кривые 1 и 3). Полученные результаты согласуются с литературными данными о функциональной активности тромбоцитов на таких же поздних сроках хранения, однако применяемые для определения этого концентрации агонистов - в несколько раз выше используемых нами. Мы предполагаем, что начальную агрегацию тромбоцитов можно рассматривать как адекватный показатель их жизнеспособности.

2.2. Влияние водопроводной воды на начальную агрегацию тромбоцитов

Известно, что для оценки степени чистоты воды применяют биологические тесты, выясняющие её влияние на жизнеспособность различных биологических объектов. Мы исследовали начальную агрегацию изолированных тромбоцитов кролика при их инкубации 1 мин в буфере, приготовленном на водопроводной воде. Выяснялось изменение степени их агрегации (по сравнению с клетками, ресуспендированными в буфере на дистиллированной воде - контроль) при различных видах индукции - АДФ, тромбином, ионами кальция.

Получено, что в присутствии водопроводной воды степень агрегации тромбоцитов возрастала в 10 раз при индукции тромбином (Рис. 6, ст. 1) и в 5 раз при индукции АДФ (Рис. 6, ст. 2). Скорее всего этот эффект обусловлен присутствием в водопроводной воде ионов кальция и магния, активирующих тромбоциты. Совсем иная картина наблюдалась при индукции агрегации тромбоцитов ионами кальция. Обнаружено заметное снижение (на 70 %) степени агрегации тромбоцитов в присутствии водопроводной воды (Рис. 6, ст. 3). Этот эффект можно объяснить действием двух раз-ничных агентов, присутствующих в водопроводной воде: ионов 2-валентных металлов (прежде всего - Са2+) и соединений активного хлора (в первую очередь - птохлорита натрия).

Предварительное добавление 2 мМ СаС12 к тромбоцитам в буфере на дистиллированной воде с инкубацией 1 мин приводило к снижению Са2+-индуцированной агрегации на 40-50 %. Известно, что действие небольшой юзы стимулятора переводит клетки в состояние, нечувствительное к дру-тй порции стимулятора, то есть к рефрактерности клеток. По-видимому, в рассматриваемом случае возникает рефракгерность тромбоцитов к действию ионов Са2+. С другой стороны, при инкубации тромбоцитов в буфере на дистиллированной, неотстоявшейся водопроводной и отстоявшейся 2 laca водопроводной воде степень Са2+-индуцированной агрегации состав-

41/д1к, %

1500 г

ооо

500

д1/д1к %

__ 1000 г

к

m

500

Д1/Д1Г

100 г

Д1/Д1К,

К

а

Тромбин . АДФ

К CaCl

Рис. 6. Агрегация тромбоцитов, ресуспен-дированных в буфере на дистиллированной (контроль - К) или водопроводной воде. Столбики 1, 2 и 3 - степень начальной агрегации изолированных тромбоцитов кролика (Д1), выраженная в % к тому же показателю в соответствующем контроле (А1к), при стимуляции клеток соответственно тромбином (0,06 ед/мл), АДФ (10 мкМ; в присутствии 2 объёмных % плазмы крови) или ионами кальция (5 мМ).

0 5 10 15 20 Концентрация ГХН, мкМ

Рис. 7. Начальная агрегация изолированных тромбоцитов в присутствии гипохлорига натрия (ГХН) (5-20 мкМ) при стимуляции клеток ионами кальция (5 мМ). Д1к и Д1 -степень агрегации соответственно в контрольном (без введения ГХН) и опытном (с добавлением ГХН) образцах тромбоцитов.

о

ляла соответственно 100, 30±4 и 61±7 %, т. е. в последнем случае агрегация снижалась слабее. Известно, что водопроводная вода содержит небольшое количество соединений активного хлора (около нескольких мкМ), самым активным из них является гипохлорит натрия. При отстаивании воды эти соединения разрушаются. Добавление шпохлорита натрия в концентрациях 5-20 мкМ к тромбоцитам в буфере на дистиллированной воде приводило к угнетению Са2+-индуцированной агрегации (Рис. 7). Скорее всего, обнаруженное угнетение Са2+-индуцированной агрегации связано с комплексным влиянием примесных соединений из состава водопроводной воды на тромбоциты, однако действие солей кальция перекрывает эффекты всех остальных агентов.

3. Влияние соединений, химически взаимодействующих с клетками, на начальную агрегацию тромбоцитов

Известно, что среди соединений, ингибирующих тромбоциты, выделяется ряд средств, химически вза;шодействующих с клетками [Becker R.C., 1992].

3.1. Действие ацетилсалициловой кислоты (аспирина) на начальную

агрегацию тромбоцитов

Наиболее активно в качестве противоагрегационного средства применяется ацетилсалициловая кислота (АСК). Основное её действие на тромбоцита связано с ингибированием циклооксигеназы. В данной работе влияние АСК на клетки интересовало нас только в плане её химического взаимодействия с гидроксильными группами мембран тромбоцитов. Индуктором агрегации служил тромбин (0,05-0,07 ед/мл). Выяснено, что АСК вызывала достоверное снижение (примерно на 50 %) начальной агрегации изолированных тромбоцитов кролика только в очень высокой концентрации - 500 мкМ. При исследовании действия АСК в концентрациях 10-100 мкМ на тромбоциты не обнаружено изменения их начальной агрегации. Поэтому можно считать, что ацетилирование гидроксильных групп плазматических мембран не имеет существенного значения для ингибирования агрегации тромбоцитов.

3.2. Действие флуорескамина иа начальную агрегацию тромбоцитов

В качестве селективного флуорогенного реагента на первичные амины, используется флуорескамин [Arnhold J., 1988]. В результате этой реакции происходит модификация аминогруппы. Однако неясно, насколько важна роль этих групп в механизме ингибирования агрегации тромбоцитов. Поэтому мы предполагали оценить, какое действие окажет модификация аминогрупп флуорескамином на агрегационную активность этих клеток. Работа проводилась на изолированных тромбоцитах кролика. Агрегация индуцировалась АДФ (в конечной концентрации 5 мкМ) в присутствии 5% плазмы и 1мМ СаС12- Известно, что в водной среде происходит гадролиз флуорескамина за десятые доли секунды. Для исключения возможности влияния на тромбоциты не самого флуорескамина, а продуктов его гидролиза, ставились дополнительные контрольные пробы. На рис. 8 показано, что агрегация тромбоцитов в присутствии ацетона (ст. 2), и продуктов гидролиза флуорескамина (ст. 4) практически не отличалась от контрольной

12

Рис. 8. Действие флуорескамина на агрегацию тромбоцитов.

Д1К и Д1 - степени начальной агрегации изолированных тромбоцитов кролика при активации ДДФ (5 мкМ, в присутствии 5 % плазмы и 1 мМ СаС1г) соответственно в контрольном и опытном образцах. Ст. 1, 2, 3 и 4 - агрегация тромбоцитов соответственно в отсутствие добавок (контроль), в присутствии 0,1 % (от объёма) ацетона, в присутствии флуорескамина (в конечной концентрации 10 мкМ) И в присутствии 0,1 % (от объёма) продуктов гидролиза флуорескамина (в конечной концентрации 10 мкМ).

(ст. 1). Ведение в суспензию тромбоцитов флуорескамина в конечной концентрации 10 мкМ вызывало снижение степени их начальной агрегации более чем на 50 % (ст. 3); различие с контрольными пробами достоверно со статистическим уровнем значимости р<0,01 по t-критерию Стьюдента. Избирательность взаимодействия флуорескамина с аминогруппами позволяет предполагать,; что химическая модификация поверхностных аминогрупп плазматических мембран играет существенную роль в механизме угнетения агрегационной способности тромбоцитов.

3.3. Действие дитионитробеизойиой кислоты на начальную агрегацию

тромбоцитов

Мы изучали действие на тромбоциты 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислоты (ДТНБ), широко используемой в количественном анализе сульфгидрильных групп в клетках [Silk S.Т., 1981]. Активация громбоцитов с конечным результатом в виде агрегации может развиваться по различным механизмам в зависимости от природы стимула. Имеются сведения, что процесс активации тромбоцитов адреналином, в отличие от АДФ, включает вход внутрь клетки ионов кальция из внешней среды [Han Р., 1983]. На рис. 9 представлены концентрационные зависимости действия ДТНБ (10-80 мкМ) на начальную агрегацию тромбоцитов при различных механизмах её индукции. ДТНБ оказывала ингибирующее действие fia клетки. Причём этот эффект зависит от природы индуктора агрегации. Когда тромбоциты стимулировали АДФ, подавление агрегации на 50 % наблюдалось при концентрации (С50) около 45 мкМ (кривая 3). Это согласуется с данными, полученными при изучении ингибирования конечной агрегации тромбоцитов другими гидрофильными реагентами на тиолы. Наиболее интересен тот результат, что агрегация тромбоцитов, активируемых ионами кальция (кривая 1), подавлялась под влиянием ДТНБ в 3 раза эффективнее, чем в случае их активации АДФ. При активации тромбоцитов адреналином ингибирующее действие ДТНБ также было выражено бо-тее сильно, чем при индукции ДДФ (кривая 2). Можно предположить, что усиленное ингибирование агрегационной активности тромбоцитов ДТНБ

Д1/Д1К,

%

ñ ñ

- ñ

12 3 4

Рис. 9. Зависимость угнетения начальной агрегации тромбоцитов от концентрации ДТНБ. 1, 2 и 3 - стимуляция тромбоцитов (после их инкубации с ДТНБ 1 мин) соответственно хлоридом кальция (3 мМ), адреналином (1 мкМ) и АДФ (10 мкМ).

О 20 40 60 80

Концентрация ДТНБ, мкМ

при действии на них индукторов, связанных с участием входа Са2+ внутрь клеток, осуществляется за счёт модификации сульфшдрильных групп кальциевых каналов. Также следует отметить, что в механизме ингибиро-вания тромбоцитов происходит, по всей видимости, модификация и других тиоловых групп клеточных мембран, поскольку значительное угнетение агрегации наблюдается и при действии АДФ.

Таким образом, результаты, полученные в этой части работы, указывают на значительную роль амино- и сульфгидрильных, в отличие от гид-роксильных, групп мембран тромбоцитов в угнетении их активности при химической модификации.

4. Действие продуктов миелопероксидазной реакции на начальную агрегацию тромбоцитов

Гипохлорит натрия (ГХН) и хлораминовые производные аминокислот относятся к категории основного и вторичного продукта реакции, катализируемой миелопероксидазой [г^стутМ 1.М., 1971; К1еЬапо£Г 1978]. Известно, что эти соединения ингибируют конечную агрегацию и реакцию выброса тромбоцитов [Мурина М.А. и др., 1986, 1989, 1995]. Однако молекулярно-клеточный механизм ингибирующего действия ГХН и хлораминокислот на тромбоциты детально не изучен.

4.1, Исследование динамики противоагрегаиионного действия гииохлорига натрия и 1Ч-хлор-а-аланина на тромбошггы

Используя возможность нефелометрического метода сравнительно быстро определять степень начальной агрегации тромбоцитов, мы исследовали динамику действия на изолированные тромбоциты кролика ГХН и И-хлор-а-аланина. К суспензии тромбоцитов добавляли один из этих агентов, затем через разные периоды инкубации определялась агрегационная активность клеток, индуцируемая тромбином (0,05 ед/мл). Ингибирующее

\1/А1к,

Время инкубации, мин

Рис.10. Динамика угнетения начальной агрегации изолированных тромбоцитов кролика различными продуктами мие-лопероксидазной реакции. Ось абсцисс - время после введения ингибитора в суспензию клеток (мин). Ось ординат - степень агрегации по отношению к кошролю (%). 1 - гипохлорит натрия (0.02 -0,04 мМ); 2 - !^-хлор-а-аланин (0,05 - 0,12 мМ).

хействие ГХН максимально уже примерно через 0,5-1 мин инкубации 'Рис. 10,, кривая 1). Противоагрегационное действие М-хлор-а-алашша бо-

тоо » (а тт ттоттт тт: ттг ггг»пт?влл ^ А г^ат/т ч глт/ тпгоч атлгг пттптш ггг* ^ «пит тплг^пттт*

ч^ф^^лх у ^шишии 1.Ч-/1 шшит ди ^ мии1 иди^г иицш!

[Рис. 10, кривая 2). Это различие указывает на то, что механизмы действия ГХН и М-хлор-а-аланина на тромбоциты различаются, хотя оба соединения проявляют свою активность благодаря активному атому хлора. 4.2. Ингибирование начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и

]М-хлор-а-аланином Действие ГХН и Ы-хлор-а-аланина на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов кролика исследовалось при двух типах их стимуля-щи: использовалась либо ДДФ (10 мкМ), которая способна также вызы-зать округление клеток, либо адреналин (1 мкМ), хлорид кальция (3 мМ), действующие без округления клеток. Единственное отличие заключалось в гом, что суспензию изолированных тромбоцитов после введения ГХН выдерживали 1 мин для завершения реакции, а с 1^-хлор-а-аланином - 3 лин, и затем определяли степень начальной агрегации по сравнению с сонтролем. Получено, что при любом типе активации клеток наблюдалось снижение начальной агрегации тромбоцитов при действии на них ГХН в сонечных концентрациях 10-80 мкМ (Рис. 11). Однако выраженность про-гивоатрегационного действия ГХН значительно зависела от механизма ак-гивации клеток. На 50% степень АДФ-индуцированной агрегации снижа-ись при концентрации ГХН около 30 мкМ (кривая 3). Интересно выде-шть два обстоятельства, связанные с эффектом подавления агрегации громбоцитов, стимулированных адреналином (кривая 2) или ионами каль-гия (кривая 1). Во-первых, в случае этой пары стимулов зависимости ин-табирования агрегации от концентрации ГХН были сходны. Во-вторых, ;ильный эффект ингибирования агрегационной активности тромбоцитов троявяялся при значительно меньшей концентрации ГХН, чем в случае

д1/д1к, %

Концентрация ГХН, мкМ

Рис. 11. Зависимость угнетения начальной агрегации тромбоцитов от концентрации гипохлорита натрия.

1, 2 и 3 - стимуляция тромбоцитов (после их инкубации с гипохлори-том натрия 1 мин) соответственно хлоридом кальция (3 мМ), адреналином (1 мкМ) и АДФ (10 мкМ).

активации клеток АДФ. Величина С50 при стимуляции тромбоцитов адреналином или ионами кальция была в 3 раза меньше.

При изучении действия >1-хлор-а-аланина (10-80 мкМ) также получено, что степень агрегации тромбоцитов плавно снижается с ростом его концентрации (Рис. 12). Однако, в отличие от действия ГХН, концентрационные зависимости ингибирования М-хлор-а-аланином были практически одинаковые при активации тромбоцитов АДФ (кривая 1), адреналином (кривая 2) или ионалш кальция (кривая 3). Во всех случаях С50 составляла около 20-25 мкМ.

Л1/Л1К, %

100

Рис. 12. Зависимость угнетения начальной агрегации изолированных тромбоцитов от концентрации Ы-хлор-а-аланина. 1, 2 и 3 - стимуляция тромбоцитов (после их инкубации с хлоралани-ном 3 мин) соответственно хлоридом кальция (3 мМ), адреналином (1 мкМ) и АДФ (10 мкМ). Д1К и А1 - изменение интенсивности рассеянного света после стимуляции в контроле и после действия ингибитора.

0 20 40 60 80 Концентрация хлораланина, мкМ

О

Итак, обнаружены значительные различия в действиях ГХН и Ы-лор-а-аланина на тромбоциты. Они выявляются как в динамике их инги-ирующего действия, так и в зависимости противоагрегационного действия ХН (в отличие от М-хлор-а-аланина) от механизма стимуляции клеток. 1олученные ранее данные противоагрегационном действии ДТНБ мож-го сравнивать с действием на тромбоциты ГХН и Т^-хлор-а-алашша, по-кольку все эксперименты проводились в одинаковых условиях и исследо-ался одинаковый диапазон действующих концентраций. При анализе дей-твия этих трёх соединений можно выявить две группы их ингибирующего лияния на тромбоциты: с обычным и усиленным эффектом. В 2-3 раза олее выраженный прогивоагрсгациошгъгй эффект обнаруживался при ействии на тромбоциты ДТНБ или ГХН в случаях активации клеток теми пшулами, которые не вызывают их округления. В литературе есть указа-ия на то, что для стимуляции тромбоцитов такими агентами требуется ак-ивация кальциевых каналов их клеточных мембран [Оощ ЛЮ., 1993]. 1оэтому не исключено, что усиленное противоагрсгацишшое действие [ТНБ либо ГХН представляет собой изменение кальциевых каналов, за-лючающееся в модификащш их 5Н-1ру1пт. Обьтчное тппбирующее дей-твие ДТНБ, ГХН и К-хлор-а-алатша связано, скорее всего, с модифика-ией иных тиоловых групп плазматических мембран тромбоцитов.

выводы

1. Нефелометрическим методом обнаружено образование мелких агрегатов тромбоцитов (начальная агрегация) в присутствии плазмы крови под действием тромбина или ионов кальция, вызывающих также свёртывание плазмы. Эта агрегация достигает максимума через 1 -2 минуты, раньше момента свёртывания плазмы. Показана возможность одновременной регистрации изменения формы клеток турбидиметрическим способом и процесса начальной агрегации нефелометрическим методом.

2. Обнаружена и исследована нефелометрическим способом начальная агрегация слабоакгивных тромбоцитов: в изолированном виде при индукции АДФ; при действии низких концентраций индукторов; на поздних сроках хранения концентрата тромбоцитов человека, предназначенных для трансфу зип. Формирование мелких агрегатов тромбоцитов человека под действием тромбина или АДФ прослеживается вплоть до 6-7 суток хранения концентрата, а образование крупных агрегатов традиционным турбидиметрическим методом не регистрируется уже на 4-5 сутки. Образование мелких агрегатов тромбоцитов можно рассматривать как адекватный показатель их жизнеспособности.

3. Агрегация тромбоцитов в суспензии, индуцируемая АДФ или тромбином, при замене дистиллированной воды на водопроводную резко усиливается за счёт влияния примесных ионов кальция. Агрегация, индуцируемая ионами кальция в присутствии водопроводной воды, сильно подавляется в результате перехода тромбоцитов в рефрактерное состояние. Гипохлорит натрия в концентрации, равной его содержанию в водопроводной воде (около 5 мкМ), заметно снижает Са2+-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Этот эффект перекрывается действием солей кальция.

4. Обнаружено, что флуорескамин и дитионитробензойная кислота (избирательно реагирующие соответственно с амино- и сульфгидрильными группами) в низких концентрациях (10 мкМ) ингибируют начальную агрегацию тромбоцитов кролика. Ацетилсалициловая кислота (ацетилирующая щдроксильные группы) в той же концентрации не влияет на начальнук агрегацию тромбоцитов. Можно полагать, что тромбоциты инакгавируются при модификации амино- и сульфгидрильных, но не гидроксильных групп их плазматических мембран.

5. Ингибирующее действие пшохлорита натрия на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов максимально уже через 0,5-1 минуту, а противоагрегационное действие Ы-хлор-а-аланина более медленный процесс, эффект усиливается вплоть до 5 минут инкубации. Величинг противоагрегационного эффекта гипохлорита натрия зависит от природа индуктора агрегации (АДФ, адреналин или Са2+), а ингибирующее дей ствие И-хлор-а-алаюша при этом одинаковое. Всё это свидетельствует ( различиях в механизме противоагрегационного действия пшохлорита нат рия и 1^-хлор-а-аланина на тромбоциты, хотя оба соединения проявляю: свою активность благодаря активному атому хлора.

6. Начальная агрегация изолированных тромбоцитов при ицдукщп ионами кальция или адреналином, включающем активацию кальциевые

:аналов, сильнее ингибируется гипохлоритом натрия, чем при индукции ЩФ. Возможно, что под действием гипохлорита натрия происходит инак-ивация кальциевых каналов плазматических мембран тромбоцитов. Инги-¡ирующее действие дитионитробензойной кислоты на изолированные ромбоциты в зависимости от её концентрации и от природы индуктора ходно с противоагрегационным действием гипохлорита натрия. Это ука-ывает на то, что противоагрегационное действие гипохлорита натрия свя-ано с окислением БН-групп.

Рекомендации по практическому внедрению результатов работы:

Результаты работы рекомендуется использовать в гематологии и фактическом здравоохранении при оценке активности тромбоцитов (в том и еле предназначешшх для переливания) и исследовании действия проти-отромбоцитных средств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Аносов А.К., Крамаренко Г.Г., Рошупкин Д.И., Бержицкая В.В. 1зменетше агрегационного взаимодействия тромбоцитов кролика при ре-[нфузии УФ-облучённой собственной крови. - Биофизика, 1988, т. 33, в. , с. 382.

2. Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю., Мурина М.А., Бержицкая В.В. Тачальная агрегация и внутриклеточное накопление катионных зондов как указатели функционального состояния тромбоцитов при хранении тром-оцитарной массы. - Тезисы докладов российской конференции Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии", С.-П., 1995, с. 29-230.

3. Roshchupkin D.I., Sokolov A.Yu., Berzhitskaya V.V. Initial aggregation f platelets, measured with nephelometric method, and its change under ifluence of fluorescamine and acridine orange. - Phys. Chem. Biol. Med., 1996, -

3, No. 2, P. 17-22.