Механизм угнетения начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином

Савельева, Екатерина Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизм угнетения начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизм угнетения начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином"

Савельева Екатерина Леонидовна

Механизм угнетения начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и 1Ч,М-дихлортаурином.

03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 ИЮЛ 2011

Москва - 2011

4851659

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Давыдов Борис Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Потапенко Александр Яковлевич

доктор физико-математических

наук Пантелеев Михаил Александрович

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова

Защита состоится «.........» .................................20_года в 14.00 часов на

заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «..........»............................20_года

Ученый секретарь диссертационного совета: доктор медицинских наук, профессор

Н. Г. Потешкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. При ряде заболеваний повышенная агрегаци-онная активность тромбоцитов становится причиной тромбозов [Weyrich А., 2007; Troxler M., 2007], последствия которых могут оказаться крайне неблагоприятными для организма. Не менее опасна и другая крайность в функциональном состоянии тромбоцитов, их пониженная агрегационная активность, которая может привести к внутренним кровотечениям. В связи с этим, следует внимательно относиться к соединениям, обладающим антиагрегационными свойствами. Среди таких соединений можно выделить гипохлорит натрия, применяемый в настоящее время внутривенно при некоторых острых интоксикациях [Sergienko V. I., 1989], и N-хлорамины, предложенные клинике как перспективные средства для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцитами [Мурина М. А., Сергиенко В. И., Рощупкин Д. И., 1993, 2001]. Это естественные метаболиты организма, которые образуются в активированных нейтро-филах в результате реакции, катализируемой миелопероксидазой [Thomas Е. L., 1995], и могут изменять функциональную активность тромбоцитов в крови. Антиагрегационное действие их на тромбоциты проявляется благодаря «активному» хлору [Мурина М. А., 2000], который способен модифицировать различные химические группы компонентов крови. Однако, механизм этого действия до сих пор остается невыясненным. Его расшифровка должна существенно облегчить решение проблемы о возможности клинического применения этих соединений. Здесь, в первую очередь, актуален вопрос о безопасности их взаимодействия с плазмой. Угнетение активности тромбоцитов при введении в кровь гипохлорита натрия или N-хлораминов может быть результатом первоначальной модификации ими плазмы с образованием продукта, обладающего антитромбоцитарными свойствами. Очевидно, что в этом случае возникает необходимость изучать воздействие этого продукта и на другие клетки, поскольку при его появлении в крови возможны негативные последствия для организма. Иначе говоря, нежелательное влияние гипохлорита натрия и

N-хлораминов на клетки крови и организм в целом может не ограничиваться их прямым действием. Во-вторых, разработка нового антитромбоцитарного лекарственного препарата на основе N-хлораминов и внутривенное применение гипохлорита натрия в качестве детоксицирующего средства требует теоретического обоснования их фармакологического лечебного (N-хлорамины) и побочного (гипохлорит натрия) действия на тромбоциты.

Для понимания механизма антиагрегационного действия исследуемых соединений на тромбоциты и оценки его эффективности необходимо изучать начальную агрегацию тромбоцитов (образование мелких агрегатов - Fromjovic М. М., 1983). К сожалению, в большинстве работ по изучению антитромбоцитарного действия потенциально возможных антиагрегантов в качестве критерия агрега-ционной активности тромбоцитов выбирается только конечная агрегация (образование крупных агрегатов - Вот, G. V. R., 1962). Используемые в клинике препараты, включая такие известные антиагреганты как производные тиенопи-ридиновые основания (тиклопидин, клопидогрель) и аспирин, не обладают способностью разрушать мелкие тромбоцитарные агрегаты [Hechler, в., 1998; Matsuno Н., 1999], наличие которых в кровеносном русле приводит к развитию тромбообразования [Bologna Е., 1990]. В настоящей работе исследовалось влияние на начальную агрегацию тромбоцитов гипохлорита натрия и N,N-дихлортаурина. Последний вызывает особый интерес в ряду N-хлораминов из-за его значительной собственной устойчивости. Кроме того, нами изучалось действие на тромбоциты и некоторых других N-хлорпроизводных: N-хлор-аланина, N-фенилхлораланина и N-хлортаурина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей действия гипохлорита натрия (ГХН) и К,№дихлортаурина (ДХТ) на начальную агрегацию тромбоцитов и выяснение молекулярного механизма этого действия. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать влияние ГХН и ДХТ на начальную агрегацию тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП) и изолированном виде;

-32) Изучить модификацию сульфгидрильных групп тромбоцитов как основного молекулярного механизма их инактивации под действием ГХН или ДХТ;

3) Исследовать влияние ГХН и ДХТ на начальную агрегацию активированных изолированных тромбоцитов.

Научная новизна исследования. Установлено, что гипохлорит натрия и ИДЧ-дихлортаурин, введенные в обогащенную тромбоцитами плазму, в диапазоне концентраций 500 - 2500 мкМ угнетают начальную агрегацию в результате прямого действия на клетки; образующиеся при этом продукты модификации плазмы неактивны, не обладают выраженным антиагрегационным свойством. Показанные на изолированных тромбоцитах эффекты угнетения этими соединениями начальной агрегации проявляются в пределах концентрации, в которой они могут локально образовываться в крови в естественных условиях (около 100 мкМ).

Первичным механизмом действия гипохлорита натрия и 1Ч-хлораминов на тромбоциты является модификация сульфгидрильных групп их поверхности. Инактивация тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия и дихлортаурином, происходит в результате первоначального повреждения белков (а не липидов) их плазматических мембран вследствие прямого действия на сульфгидрильные группы поверхностных белков клеток с образованием кислородсодержащих продуктов необратимого окисления тиолов сульфеновой и сульфоновой кислот. При концентрации 50 мкМ, вызывающей модификацию тиолов поверхности тромбоцитов, гипохлорит натрия и 1Ч,М-дихлортаурин не модифицируют кальциевых каналов тромбоцитов.

Обнаружено, что гипохлорит натрия и Ы-хлорамины угнетают начальную агрегацию при действии на изолированные тромбоциты уже после их активации. И-хлораланин при концентрации 100 мкМ вызывает практически полный распад тромбоцитарных агрегатов.

Практическое значение работы. Во-первых, отсутствие у модифицированной Ы,Ы-дихлортаурином плазмы при его введении в ОТП признака биологической активности (антитромбоцитарного действия) снимает необходи-

мость в дальнейшем исследовать ее влияние на другие клетки. То же самое можно сказать и относительно действия в крови гипохлорита натрия, который уже давно применяется при некоторых острых интоксикациях. Разрушение сульфгидрильных групп тромбоцитов как возможный первичный механизм антиагрегационного действия исследуемых соединений говорит в пользу безопасности их применения для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцитами: продукты таких реакций безвредны, поскольку образуются в организме и в естественных условиях (при метаболизме цистеина и других БН-содержа-щих соединений). Во-вторых, выявленные у Ы^-дихлортаурина и гипохлорита натрия механизмы модифицирующего действия позволяют теоретически обосновать их лечебный эффект как антитромбоцитарного препарата (ДХТ) и побочное действие на тромбоциты при применении в целях детоксикации (ГХН). В-третьих, важнейшим достоинством И-хлораминов как антитромбоци-тарных средств является их способность угнетать агрегационную активность тромбоцитов в составе уже образованных мелких агрегатов. Обнаруженное дезагрегационное свойство 1Ч-хлораланина, проявляющееся в полной мере при концентрации, в которой он может локально вырабатываться при определенных условиях в организме (100 мкМ), характеризует его как перспективное анти-агрегантное средство.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на П Международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов», Воронеж, июль 1998 г., на V Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, ноябрь, 1998 г., на П Съезде биофизиков России, Москва, август 1999 г., на IV Съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем», Минск, июнь 2000 г., на Российском национальном конгрессе кардиологов «Кардиология, основанная на доказательствах», Москва, октябрь 2000 г., на П Российском конгрессе по патофизиологии «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы», Москва, октябрь 2000 г., на IV Всероссийском конгрессе «Профессия и здо-

ровье», Москва, октябрь 2005 г., на II Международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность», Москва, октябрь 2005 г. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 28 рисунков и 6 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (225 наименований).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Реактивы. В работе использовались соли марок ЧДА и ХЧ, 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойная кислота (фирм "Serva" и "Sigma"), дитиотреитол (фирмы "Serva"), N-этилмалеимид (фирмы "Sigma"), коммерческий препарат ионола (институт химической физики РАН), восстановленный глутатион (фирмы "Sigma"), аденозиндифосфат (фирм "Serva" и "Sigma"), таурин и аминокислоты (фирмы "Reanal" и "Реахим").

Получение гипохлорита натрия и N-хлораминопроизводных. ГХН получали путем электролиза 0,9 % хлористого натрия на аппарате ЭДО-34 [Мартынов А. К., 1985]. Для приготовления ДХТ сухую навеску таурина добавляли в раствор ГХН при интенсивном перемешивании в соотношении конечных концентраций 2 : 1 (рН раствора ДХТ доводили до 7). N-хлораланин, N-хлорфенилаланин и N-хлортаурин получали смешиванием растворов аминокислоты или таурина и ГХН (молярная концентрация амина превышала концентрацию ГХН на 10%). Образование N-хлораминов контролировали спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 (Россия) по наличию в спектре поглощения максимума 300 нм для дихлортаурина и 250-255 нм для монохлорпроизводных [Мурина М. А., 1998]. Концентрации ГХН и N-хлораминопроизводных определяли методом йодометрического титрования; концентрация ДХТ рассчитана по активному хлору.

Получение тромбоцитов. Исследования проводили на тромбоцитах кролика в изолированном виде и в составе реконструированной обогащенной тромбо-

цитами плазмы (0111) крови; последний образец получали смешиванием изолированных клеток и плазмы. Для получения исходной ОТП кровь из краевой вены уха кролика стабилизировали цитратом натрия (3,8% трехзамещенного цитрата натрия; 0,139 мМ КаС1; рН = 7,36), центрифугировали при 460 ё в течение 25 мин. Плазму получали центрифугированием ОТП при 7400 £ в течение 15 мин. Для выделения изолированных тромбоцитов в ОТП добавляли 1мМ ЭДТА и центрифугировали при 1850 % в течение 7 мин. Осажденные тромбоциты ресуспендировали в 2 мл фосфатного буфера (137 мМ №С1; 2,7 мМ КС1; 4,7 мМ Иа2Нр04; 1,47 мМ КН2Р04; 1 мМ \^2804 х 12 Н20; 5 мМ глюкозы; рН = 7,4) с ЭДТА в конечной концентрации 0,25 мМ. Способность ЭДТА связывать двухвалентные ионы металлов подтверждали с помощью орто-фенантроли-нового теста [ВаЫгИауеу М. А., БауеГуеуа Е. Ь., 2005]. Полученную суспензию тромбоцитов отмывали при 1850 g в течение 6 мин. Концентрацию клеток доводили до 2,3 х 10 8 клеток в 1 мл. Процедуру выделения клеток проводили при комнатной температуре.

Определение сульфгидрильных групп тромбоцитов. Уровень БН-групп тромбоцитов, модифицированных ГХН или ДХТ, изучали с помощью 5,5"-дитио-бис-2-нитробензойной кислоты (ДТНБ) спектрофотометрическим методом. Концентрацию аниона тионитробензойной кислоты (продукта реакции тиолов и ДТНБ), соответствующую концентрации определяемых БН-групп, рассчитывали, исходя из его оптической плотности при длине волны 412 нм (пик поглощения) с коэффициентом молярной экстинкции 13600 М"1' см"1 [ЕИтап О. Ь„ 1959].

Для постановки реакции ДТНБ добавляли при интенсивном перемешивании в реакционную смесь, содержащую 1мл суспензии тромбоцитов в фосфатном буфере и 2 мл трис-НС1-буфера (0,4М); рН=8,9, который считается оптимальным [Торчинский Ю. М., 1977]. После 10 мин инкубации при комнатной температуре пробы центрифугировали при 1850 ¡> в течение 10 мин. Затем отбирали супернатант и измеряли максимальную оптическую плотность аниона тионитробензойной кислоты на СФ-46.

Определение количества активного хлора. Для определения количества активного хлора в плазме и фосфатном буфере после введения в них ГХН или ДХТ применяли йодометрический метод. Молекулярный йод, образующийся при окислении ГХН или ДХТ йодида калия, выявляли с помощью крахмала, и измеряли его уровень спектрофотометрически на СФ-18 с использованием интегрирующей сферы Ульбрехта по оптической плотности йодо-крахмального комплекса при длине волны 590 нм (максимум поглощения) - [Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1998]. Концентрация йодида калия составляла 7,7 мМ; содержание крахмала 0,13 %. Работа проводилась в присутствии 1Н серной кислоты. Регистрация начальной агрегации тромбоцитов. Начальную агрегацию тромбоцитов исследовали нефелометрическим методом на кинетическом нефе-лометре-агрегометре [Рощупкин Д. И., Соколов А. Ю., 1996]. Регистрировали возрастание интенсивности света (I, отн. ед.), рассеянного в пределах малых углов (0,5 - 7°), отражающее процесс образования микроагрегатов (начальную агрегацию) - (рис.1).

I, отн. ед.

Рис. 1. Типичные кинетические кривые изменения интенсивности расе-янного света (I, отн. ед.) при агрегации тромбоцитов, стимулированных АДФ.

1 и 2 - в контроле и после инкубации с ДХТ (1 мМ по активному хлоРУ)-

Стрелки а и б - моменты введения СаС12 (180 - 230 мкМ) и АДФ (10 мкМ).

—I-1—».

мин

Действие исследуемых соединений на нативные клетки оценивали по изменению отношения ДI / АI к, где АI и АI к - максимальное изменение интенсивности рассеянного света (степень агрегации) в опыте и контроле.

Клетки активировали введением АДФ либо ионов кальция в высокой концентрации (5 мМ). Перед активацией (за 20 - 30 сек до введения индуктора агрегации) к клеткам добавляли ионы кальция в низкой конечной концентрации (180-230 мкМ).

Статистическая обработка результатов. Оценка достоверности полученных данных проводилась по параметрическому ^критерию Стъюдента и непараметрическим Т-критерию Вилконсона, и-критерию Вилконсона - Манна - Уитни и в-критерию знаков.

Результаты и их обсуждение

1.Аитиагрегационное действие гипохлорита натрия и ^1Ч-дихлортаурина на тромбоциты.

Судя по данным изучения чистых соединений [Рги& W. А., 1996], продукты миелопероксидазной реакции способны модифицировать многие химические группы, находящиеся в тромбоцитах и плазме. В ОТП объемная доля тромбоцитов (около 10® клеток в 1 мл) составляет примерно 0,3 %; в связи с этим при введении в ОТП исследуемых соединений основная их масса должна расходоваться в реакциях с плазмой, суммарная концентрация химических групп в которой очень высока. Способность продуктов миелопероксидазной реакции оказывать эффективное антиагрегационное действие на тромбоциты при введении в ОТП в сравнительно низкой конечной концентрации [Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1998] вызывает особый интерес в плане изучения их молекуляр-но-клеточного механизма действия.

1. 1. Угнетение гипохлоритом натрия и 1Ч,1Ч-дихлортаурином начальной агрегации тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазме.

Влияние ГХН и ДХТ на начальную агрегацию тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП) изучали при двух вариантах их введения: в заранее реконструированную ОТП (смесь тромбоцитов и плазмы) и в плазму с последующей (через 5-10 мин) реконструкцией ОТП. Сравнительный анализ антиагрегационных эффектов исследуемого соединения при этих двух вариан-

тах введения позволяет выяснить прямое или косвенное (путем первоначального взаимодействия с плазмой) его действие на тромбоциты в ОТП определяет угнетение их агрегационной активности.

ДХТ и ГХН при действии непосредственно на реконструированную ОТП подавляют начальную агрегацию клеток на 50 % при значении их концентрации (С50) соответственно приблизительно 750 (по активному хлору) и 2000 мкМ (рис. 2, кривые 2 и 4). В такой концентрации ДХТ эффективен при внутривенном введении в опытах in vivo [Мурина М.А., 2002].

Как видно из рис.2, угнетение агрегации тромбоцитов в этих условиях сильно зависит от варианта введения исследуемого соединения. Степень агрегации при их введении в реконструированную ОТП в умеренной концентрации снижается значительно сильнее, чем при введении в плазму. Это говорит о том, что подавление ДХТ и ГХН начальной агрегации тромбоцитов в составе ОТП есть результат преимущественно прямого действия активного хлора на клетки.

Д1 / Д1к, % Рис, 2. Концентрационные зависн-щц» в» . _мости действия гипохлорита нат-

рия (1,2) и N,N-Aiix,iopraypiina (3,4) на начальную агрегацию тромбоцитов, регистрируемую в составе реконструированной ОТП.

1.3 - введение исследуемых соединений в плазму с последующей (через 5-10 мин) реконструкцией ОТП;

2.4 - введение в заранее реконструированную ОТП. AI и Alk — степень агрегации в опытном и контрольном образцах. Эффекты, полученные при концентрациях исследуемого соединения с разбросом 2 - 20 %, обрабатывались вместе и представлены как один ре-

Концентрация исследуемого соединения, мкМ Ч-льтат (среднее значение при числе

независимых опытов п = 4 - 21).

По данным йодометрического определения уровня активного хлора, в плазме за 5 мин ее инкубации с ГХН или ДХТ в конечной концентрации 1500 мкМ происходит расходование основной массы исследуемого соединения: его остаток не превышает 3 % от введенного количества иследуемого соединения.

-10В случае введения в плазму ДХТ, оптическая плотность йодо-крахмального комплекса при длине волны 590 нм (D590), составила 0,263 ± 0,027, что достоверно не отличалось от величины D590 , полученной на образце фосфатного буфера при концентрации этого соединения 50 мкМ (0,368 ± 0,11). 1. 2. Угнетение гипохлоритом натрия и N.N-дихлортаурином начальной агрегации тромбоцитов в изолированном виде. Исследование зависимости величины Д1/Д1к (степень агрегации) от концентрации исследуемого соединения показало, что ГХН и ДХТ в этих условиях дозозависимо подавляют начальную агрегацию тромбоцитов при концентрациях на 1- 2 порядка ниже, чем в случае ОТП. При их введении в суспензию клеток в диапазоне концентраций 10 - 50 мкМ наблюдалось дозозависимое угнетение агрегационной активности клеток в ответ на АДФ (10 мкМ): при концентрации 50 мкМ оба соединения снижали степень агрегации более чем на 50 % по сравнению с контролем (рис. ЗА). Величины С50 для ГХН и ДХТ составляют соответственно около 15 и 35 мкМ по активному хлору.

Если тромбоциты, модифицированные ГХН (15 мкМ) или ДХТ (35 - 40 мкМ), активировать ионами кальция (5 мМ), то их начальная агрегация угнетается также, как и при действии АДФ - примерно на 50 % по сравнению с контролем (рис. ЗБ). Как известно, механизм активации тромбоцитов ионами кальция существенно отличается от механизма АДФ-активации: требует поступления внутрь клеток ионов кальция из внешней среды, вызывает активацию циклоксигеназы и индуцирует секрецию плотных гранул (мощная активация) - [Han Р., 1983; Miyamae Т., 1995]. Исходя из этого, можно было ожидать, что угнетение агрегации исследуемыми соединениями при их активации ионами кальция происходит в ином диапазоне концентраций, нежели при действии АДФ. Совпадение обсуждаемых антиагрегационных эффектов ГХН (15 мкМ) и ДХТ (35 - 40 мкМ) говорит о том, что тромбоциты при разных механизмах активации теряют способность к агрегации под их действием в результате модификации одного типа.

А 1/Л1к, %

А1/А1к-,%

100

10 20 30 40 50

Концентрация исследуемого соединения, мкМ

Рис. 3. Зависимость угнетении АДФ-индуцированнов (Л) и Са2*-ицдуцнрованной (Б) начальной агрегации изолированных тромбоцитов от концентрации гипохлорита натрия (1) н N^I-дихлортаурииа (2).

Тромбоциты (20,7 * 107 клеток в 1 мл) инкубировали с ГХН или ДХТ в течение 5 мнн.

Способность ДХТ при его введении в ОТП угнетать начальную агрегацию тромбоцитов в пределах концентрации, предлагаемой к применению in vivo, 1000 мкМ [Мурина М. А., 2002], является важным показателем его эффективности как антиагрегантного средства. Отсутствие при этом указаний на образование в результате его взамодействия с плазмой продукта, обладающего выраженными антиагрегационными свойствами, говорит в пользу безопасности его клинического применения. Исходя из полученных данных, продукты взаимодействия ГХН и ДХТ с плазмой неактивны, и их появление в крови при введении исследуемых соединений в качестве лекарственных средств не должно сопровождаться нежелательными последствиями для организма.

Эффективность действия ГХН и ДХТ на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов не зависит от применяемых нами механизмов активации (генерализованное ингибирование клеток).

- 122. Модификация сульфгидрильных групп тромбоцитов гипохлоритом натрия и N-хлораминами и роль разрушения этих групп в угнетении их начальной агрегации.

При изучении модификации сульфгидрильных групп тромбоцитов ГХН и ДХТ как первичного механизма их действия особый интерес представляло оценить изменение содержания поверхностных SH-rpynn тромбоцитов; продукты миелопероксидазной реакции очень реакционноспособны, и поэтому при контакте с клеткой основные их взаимодействия должны происходить уже на ее поверхности.

2. 1. Разрушение сульфгидрильных групп тромбоцитов под действием гипохлорита натрия, ГЧ,1Ч-дихлортаурина или N-хлортаурина. Влияние ГХН, ДХТ, а также N-хлортаурина на содержание тиолов в тромбоцитах изучали с помощью 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислоты (ДТНБ) - абсолютно специфичного SH-реагента [Торчинский Ю. М., 1977], характеризующегося слабой проникающей способностью (не проникает внутрь клеток и поэтому взаимодействует с тиолами плазматических мембран, при кратковременном воздействии, в основном, поверхностными) - [Harbury C.B., 1974]. Методика определения тиолов с помощью ДТНБ была отработана на модели восстановленного глутатиона - полученный коэффициент молярной экстинкции (13100 М_1х см"1) оказался близок к литературным данным (13600 M"1 х см"1).

Изолированные тромбоциты инкубировали с исследуемым соединением (25 -100 мкМ) в течение 5 мин и затем ставили реакцию ДТНБ в низкой концентрации (10 мкМ) с их тиолами при рН = 8,9 в течение 10 мин, требуемых для ее завершения [Ellman G.L., 1959].

Обнаружено, что все исследуемые соединения снижают уровень поверхностных сульфгидрильных групп в тромбоцитах, определяемых с помощью ДТНБ (10 мкМ) в условиях его кратковременной инкубации с клетками (рис. 4 и табл. 1). Резкий спад уровня определяемых тиолов, отражающий модификацию наиболее доступных из них, наблюдается уже при концентрации 50 мкМ, при которой происходит почти полное угнетение начальной агрегации.

-1320 г

0 25 50 75 100

Концентрация исследуемого соединения, мкМ

Концентрация Н-этилмалеимида, мкМ

Рис. 4. Влияние гипохлорита натрия (2), 1Ч,1Ч-дихлортаурина (1) и М-этилмалеимида (3) па количество вН-групп в тромбоцитах, определяемое с помощью ДТНБ (10 мкМ). Время инкубации клеток с 1Ч-этилмалеимидом и ДТНБ - 10 мии. Исследуемые образцы содержали 1 % этанола (растворитель N-314).

Количество 5Н-групп в опытах с гипохлоритом натрия и Т^-дихлортаурином приведено в расчете иа 23 • 107 клеток, а в случае Г4-этилмалеимида - на 20,7 • 107 клеток.

Таблица 1

Влияние Г<-хлортаурина на количество сульфгидрильных групп тромбоцитов, определяемое с помощью ДТНБ (10 мкМ).

Концентрация И-хлортаурина, мкМ 0 25 50 100

Количество определяемых 8Н-групп, нмоль (19,3+ 1,78)1,2 (12.8il.48)1 (11,5+ 1,58)2 10,4 ± 3,9

Количество вН-групп приведеио в расчете на 23 х 107 клеток. 1 - р < 0,05; 2 - р < 0,01 - по Т-критерию Вилконсона при п = 5.

Аналогичная картина была получена при применении алкилирующего соединение К-этилмалеимида (рис. 4, кривая 3), который при нейтральном рН и умеренных концентрациях (менее 1 мМ) является специфичным БН-реагентом [Торчинский Ю. М., 1977].

Неспособность исследуемых соединений разрушать все определяемые БН-группы легко обьяснить тем, что постановку их реакции с тромбоцитами проводят при сравнительно невысоком значении рН (примерно 7,4); в таких условиях должны легко разрушаться те тиолы, которые имеют низкий рК, а тиолы с высоким рК могут оказаться недоступными.

2. 2. Влияние ЯН-реагента 1Ч-этилмалеимнда на начальную агрегацию тромбоцитов. Сульфгидрильные группы не единственные химические группы на поверхности тромбоцитов, с которыми могут взаимодействовать исследуемые соединения. Поэтому необходимо знать, какую роль играет их разрушение в угнетении начальной агрегации. В следующей серии экспериментов было изучено влияние 8Н-реагента Ы-этилмалеимида (И-ЭМ) на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов. Постановка реакции между клетками и 14-ЭМ проводилась в тех же условиях, что и при исследовании его влияния на уровень сульфгидрильных групп их поверхности.

Из рис. 5. видно, что Ы-ЭМ при действии на тромбоциты в диапазоне концентраций 2-20 мкМ, в котором разрушаются их поверхностные тиолы, угнетает начальную агрегацию, индуцированную АДФ (10 мкМ) либо ионами кальция (5 мМ); при концентрации 5 мкМ, при которой происходит резкий спад тиолов на поверхности клеток (рис. 4, кривая 3), наблюдается более чем

Д1/Д1К,%

100

■Ф

1 и 2 - агрегацию клеток индуцировали АДФ (10 мкМ) и ионами кальция (5мМ).

Д1 и А1к - степень агрегации (изменение интенсивности рассеянного света) в опытном и контрольном образцах.

Рис. 5. Зависимость угнетения начальной агрегации изолированных тромбоцитов от концентрации 1Ч-этилмалеимида.

Концентрация N-этилмалеимида, МкМ

двукратное снижение степени агрегации (рис. 5). Таким образом, разрушение сульфгидрильных групп на поверхности тромбоцитов сопровождается угнетением их начальной агрегации при любом из применяемых нами механизмов активации. Совпадение полученных концентрационных зависимостей действия 14-ЭМ говорит при этом о том, что ингибирование клеток наступает в результате модификации одних и тех же тиолов.

2.3. Некоторые аспекты в механизме действия гипохлорита натрия и дихлортаурина на тромбоциты. В настоящей работе экспериментально демонстрируется возможность угнетения продуктами миелопероксидазной реакции агрегационной активности тромбоцитов путем разрушения сульфгидрильных групп их поверхности. В связи с обнаруженными эффектами ГХН и ДХТ, в первую очередь, интересно было ответить на следующие вопросы:

прямое их действие или косвеное, через образование продуктов перекисного окисления липидов в результате первоначального повреждения липидного мат-рикса, определяет разрушение сульфгидрильных групп;

обратимая или необратимая модификация тиолов должна рассматриваться в качестве возможной причины угнетения ими начальной агрегации.

Кроме того, выяснялся вопрос о том, имеет ли место расходование исследуемых соединений на модификацию кальциевых каналов. 2. 3. 1. Действие гипохлорита натрия и Ы^-дихлортаурина на тромбоциты в присутствии неспецифического липидного антиоксиданта ионола.

Как выяснилось, в присутствии ионола (спиртовой раствор) эффекты снижения ГХН и ДХТ содержания сульфгидрильных групп тромбоцитов, определяемых с помощью ДТНБ, не отменяются. Количество БН-групп на фоне контрольного значения 20,4 ± 2,04 нмоль при действии на нативные и проинкубированные в течение 20 мин с ионолом (20 мкМ) клетки ГХН (20 мкМ) составляло соответственно 15,1 ±1,57 и 13,8 ± 1,26 нмоль, а при действии ДХТ (20 мкМ) - соответственно 15, 4 ± 2,04 и 15,7 ± 0,63 нмоль (для обоих соединений сравниваемые величины достоверно не различались - р > 0,05 по Т-критерию Вилконсона при п = 5). Во всех опытах отсутствие заметного влияния ионола

на уровень тнолов контролировалось отдельно. Таким образом, можно заключить, что модификация ГХН и ДХТ тиолов тромбоцитов имеет нерадикальную природу.

Предварительное выдерживание изолированных тромбоцитов с ионолом (20 мкМ) в течение 20 мин не предотвращает и антиагрегационное действие исследуемых соединений. Степень агрегации клеток, активированных ионами кальция (5 мМ), при действии ГХН (п = 5) и ДХТ (п = 6) в концентрации 20 мкМ в присутствии ионола (40 ± 21 и 50 ± 20 %) достоверно не отличалась (р > 0,05) от соответствующей степени агрегации в отсутствие ионола (22,5 ±12,5 и 68 ± 14 %). Ионол не оказывал влияния на агрегацию клеток, что контролировалось отдельно. Неспособность ионола предотвратить угнетение этими соединениями агрегации означает, что инактивация тромбоцитов при их действии наступает вследствие первоначального повреждения белков, а не липидов, плазматических мембран. На основании всей совокупности данных, можно полагать, что это повреждение наступает в результате прямого действия ГХН или ДХТ на сульфгидрильные группы.

2. 3. 2. Влияние гнпохлорита натрия и N.N-дихлортаурина на уровень ДТНБ-определяемых сульфгидрильных групп поверхности тромбоцитов при действии в условиях блокады их кальциевых каналов. Далее было проведено сравнительное исследование эффектов снижения ГХН и ДХТ уровня ДТНБ-определяемых поверхностных сульфгидрильных групп в тромбоцитах в условиях блокады их кальциевых каналов и без ее применения. Кальциевые каналы блокировали с помощью ионов никеля, которые широко используются как Са2+-блокатор [Миронюк Е. П., 1987; Kumar S.V., 2000]. Концентрация ионов никеля была не менее 50 мкМ, при которой обеспечивается практически полная блокада кальциевых каналов тромбоцитов [Миронюк Е. П., 1987].

Уровни сульфгидрильных групп, определяемые в условиях кальциевой блокады (19,6 + 2,3 нмоль) и в ее отсутствие (21,3 ± 3,3 нмоль), достоверно не различались (р > 0,05 при п = 11). На таком фоне эффекты исследуемых соединений на определяемые тиолы в условиях Са2+-блокады не усиливались по

сравнению с их эффектами в ее отсутствие, как следовало ожидать в случае их расходования в кальциевых каналах, а были примерно одинаково выражены. Так, при применении избыточной концентрации ионов никеля (75 мкМ) уровень определяемых тиолов после действия ГХН и ДХТ в концентрации 50 мкМ составлял соответственно 14 ± 4,4 и 14 ± 2,2 нмоль, оставаясь практически таким же, как и при их действии в отсутствие ионов никеля (14,13 ± 2,2 и 13,2 ±1,2 нмоль). Отсутствие достоверных различий (р > 0,05) между сравниваемыми эффектами подтверждалось с помощью Т-критерия Вилконсона (п = 6). По-видимому, ГХН и ДХТ в пределах концентрации 50 мкМ не расходуются в их кальциевых каналов.

2. 3. 3. Влияние тиол-восстанавливающего реагента дитиотреитола на угнетение гипохлоритом натрия или N.№дихлоптаурипом начальной агре-гаиии тромбоцитов. Продукты миелопероксидазной реакции при действии на рядом расположенные сульфгидрильные группы (дитиолы) могут окислять их по двум механизмам - обратимом (до дисульфидов) и необратимом (до кисло-род-содержащих продуктов - сульфоновые и сульфеновые кислоты) - [РгШг V/. А., 1996]. Если предположить, что обратимое окисление поверхностных тиолов определяет угнетение ими агрегационной способности тромбоцитов, тогда восстановление этих тиолов с помощью соединения, содержащего в своем составе дитиолы, должно отменить их антиагрегационный эффект. Для выяснения этого вопроса мы посмотрели как влияет на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов, модифицированных ГХН или ДХТ, непроникающий тиосодержащий реагент дитиотреитол (восстанавливает дисульфиды до тиолов), который популярен в аналитических исследованиях серы в белках [Торчинский Ю. М., 1977]. Тромбоциты, модифицированные ГХН или ДХТ, выдерживали в течение 5 мин с дитиотреитолом (15 мкМ), затем активировали с помощью СаСЬ (5 мМ) и измеряли их начальную агрегацию.

Угнетение агрегации тромбоцитов исследуемыми соединениями не отменяется с помощью дитиотреитола: степень агрегации в присутствии и отсутствие дитиотреитола в случае ГХН (15 мкМ) составляла соответственно 47 ± 5 и

-1845 ± 8 %, а в случае ДХТ (40 мкМ) - соответственно 44 ± 7 и 43 ± 10 %. Для обоих соединений сравниваемые величины достоверно не отличались по Т-критерию Вилконсона (р > 0,05). Дитиотреитол не оказывал влияния на агрегацию клеток, что контролировалось отдельно. Отсюда ясно, что в качестве возможного механизма генерализованного угнетения начальной агрегации тромбоцитов под действием ГХН или ДХТ не может выступать обратимая модификация их поверхностных тиолов.

3. Антиагрегационное действие продуктов миелопероксидазной реакции на активированные тромбоциты.

При тромботических патологиях во многих случаях необходима блокада продолжения агрегационного ответа; поэтому оценка эффективности действия соединений, обладающих антиагрегационными свойствами, требует изучения их влияния на тромбоциты после их активации.

На данном этапе работы было изучено антиагрегационное действие ГХН, ДХТ, И-хлораланина и ^хлорфенилаланина на изолированные тромбоциты в составе уже образовавшихся мелких агрегатов как результат разрушения сульфгидрильных групп их плазматических мембран.

3. 1. Угнетение гипохлоритом натрия, М,М-дихлортаурином и ^хлор-аминокислотами начальной агрегации предварительно активированных тромбоцитов. Действие гипохлорита натрия и И-хлораминов на активированные тромбоциты изучали следующим образом. В суспензию изолированных клеток вводили АДФ в конечной концентрации 0,1 - 0,5 мкМ, регистрировали изменение интенсивности рассеянного света и через 1,5 мин добавляли исследуемое соединение. Это вызывало ослабление светорассеяния, которое было максимальным через несколько минут (рис. 6). Отношение изменения интенсивности рассеянного света (степень агрегации) в момент ее максимального снижения (Д12) к ее изменению в момент введения исследуемого соединения (Д1]) сравнивали с соответствующим отношением в контроле. Это сравнение позволяло оценивать антиагрегационное действие, включая дезагрегирующий

Ipc, OTH. ед.

физиологический раствор

2к контроле (1) и при введении исследуемого соединения после активации клеток (2).

Рис. 6. Изменение начальной агрегации изолированных тромбоцитов в

исследуемое соединение

Ipc - интенсивность рассеянного света, отн. ед.

Ali и АЬ (Alik и Д12к) - степень агрегации тромбоцитов в момент введения

2 исследуемого соединения (физиологического раствора) и момент ее последующего (через 2,5-7 мин) максимального изменения.

13 мин

эффект. Отметим, что если в образце прекращается агрегация и начинается дезагрегация, величина AI2/AIj должна принимать значение меньше 1 (рис. б, кривая 2). В случае ингибирования только последующей агрегации без развития дезагрегации величина Д12 / Ali должна быть равна 1 (остановка агрегации) либо больше 1, но меньше, чем в контроле. Величина А12/ Ali в каждом контрольном опыте была выше 1; это свидетельствует о нарастание агрегации (вплоть до 2 - 5 мин после активации клеток).

Все исследуемые продукты миелопероксидазной реакции ослабляли светорассеяние. Это ослабление проявлялось при сравнительно высоких их концентрациях, 100 - 300 мкМ.

ГХН и ДХТ вызывали снижение величины AL/AIi по сравнению с соответствующей величиной в контроле (1,5 ± 0,1 и 1,3 ± 0,08), свидетельствующее об угнетении агрегационной активности клеток, при сравнительно высокой концентрации, 150 и 200 - 300 мкМ (ДЬ/AIi была соответственно 1,16 ± 0,16 при п = 15 и 1,05 ±0,08 при п = 11). Различие между величинами AI2/AIi в опыте и контроле для обоих соединений статистически достоверно при высоком уровне значимости (р < 0,01) по парному t-критерию Стьюдента.

Наиболее сильный антиагрегационный эффект был получен при применении №хлораминокислот (табл. 2).

Таблица 2

Изменение начальной агрегации тромбоцитов при введении ¡Ч-хлорами-нокислот после активации клеток (через 1,5 мин после добавления АДФ).

Исследуемое соединение Д12/Д1,

При действии N-хлораминокислот (100 мкМ) Контроль

N-хлорфенилаланин (0,96 ±0,15)1 2,0 ±0,23

N-хлораланин (0,15 ±0,1) г

Ali и ЛЬ - степень агрегации тромбоцитов в момент введения исследуемого соединения и момент ее последующего (через 2,5 - 7 мин) максимального снижения.

- р > 0,05; - р < 0,01 - при сравнении с 1 по одновыборочному t-крнтерию Стъю-дента (п = 10).

Уже при концентрации 100 мкМ N-хлорфенилаланин останавливал агрегацию клеток, а N-хлораланин вызывал почти полную их дезагрегацию. Зависимость антиагрегационного действия N-хлораланина и N-хлорфенилаланина от их структуры обусловлена разницей их молекулярных масс [Мурина М.А., 1997]. 3. 2. Угнетение N-этилмалеимидом начальной агрегации предварительно активированных тромбоцитов. При действии продуктов миелопероксидазной реакции на клетки в повышенных концентрациях можно ожидать усиления их взамодействия с другими химическими группами, нежели сульфгидрильными [Мурина М. А., 1989]; такие взаимодействия могут рассматриваться как одна из возможных причин его антиагрегационного действия при повышенных концентрациях [Мурина М. А., 1995]. Поэтому необходимо было оценить роль разрушения сульфгидрильных групп тромбоцитов на стадии продолжения их агре-гационного ответа. Для этого было изучено влияние N-этилмалеимида на начальную агрегацию при его действии на изолированные тромбоциты после их активации.

При действии N-ЭМ в концентрации 15 мкМ происходило сильное угнетение агрегационной активности клеток: величина AI2/AIi (0,63 ± 0,19) была примерно в два раза ниже контрольной величины AI2/AIi (1,38 ±0,1). При увеличении его

концентрации до 20 мкМ наблюдался полный распад тромбоцитарных агрегатов: величина AI2/AIi менее 0,12. Примечательно, что сильный антиагрегацион-ный эффект N-ЭМ, выражающийся в двукратном снижении величины AI2/AIi, проявляется при его сравнительно высокой концентрации, 15 мкМ.

Таким образом, N-этилмалеимид действует на активированные тромбоциты по сути также, как и исследуемые продукты миелопероксидазной реакции: угнетает их агрегационную активность, и это угнетение достигается при концентрации выше требуемой для аналогичного угнетения при его действии на нативные клетки. Надо полагать, что при действии N-ЭМ или исследуемых соединений на активированные тромбоциты для угнетения агрегации требуется разрушение ими тиолов, находящихся на внутренней стороне плазматической мембраны.

В заключении необходимо выделить два аспекта. Во-первых, способность N-хлораминов угнетать агрегационную активность клеток в составе уже образованных мелких агрегатов может сыграть решающее значение при рассмотрении их как возможных антитромбоцитарных средств. В этом плане более эффективным выглядит N-хлорапанин - вызывает не только угнетение агрегации клеток, но и практически полную их дезагрегацию. В клинике особо важным показателем эффективности препаратов, применяемых при лечении ряда сердечно-сосудистых заболеваний, служит не только их ингибирующее действие, но и способность вызывать распад уже образовавшихся агрегатов. Во-вторых, такое антиагрегационное действие продуктов миелопероксидазной реакции может представлять интерес в дальнейшем для выяснения их возможной роли в организме в поддержании тромбоцитов в покоящемся состоянии. В крови постоянно образуются мелкие тромбоцитарные агрегаты, которые в норме быстро подвергаются распаду [Bologna Е., 1990; Matsuno Н., 1999]. Возможно, что при определенных ситуациях в этом принимает участие гипохлорит натрия, локально образующийся в активированных нейтрофилах в концентрации около 100 мкМ и почти полностью превращающийся в хлорамины [Pero R. W., 1996].

-22-выводы.

1. Гипохлорит натрия и ИДЯ-дихлортаурин в умеренных концентрациях угнетают начальную агрегацию тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме в результате прямого действия на клетки. В обогащенной тромбоцитами плазме угнетение агрегации тромбоцитов наблюдается в диапазоне концентраций 500 - 2500 мкМ, на изолированных тромбоцитах - в диапазоне 10-50 мкМ.

2. Гипохлорит натрия и 1М,М-дихлортаурин в диапазоне концентраций 25 -100 мкМ окисляют поверхностные сульфгидрильные группы тромбоцитов, что является механизмом их антиагрегационного действия.

3. Липидный антиоксидант ионол не влияет на ингибирующий эффект гипо-хлорита натрия и КЫ-дихлортаурина на начальную агрегацию тромбоцитов и снижение уровня поверхностных тиолов, что свидетельствует о нерадикальном характере антитромбоцитарного действия этих соединений и об их прямом взаимодействии с поверхностными тиолами.

4. В условиях блокады Са2+-каналов уровень поверхностных тиолов тромбоцитов под влиянием гипохлорита натрия и Г^М-дихлортаурина в пределах концентрации 50 мкМ снижается в той же степени, что и без блокады, что свидетельствует об отсутствие модификации кальциевых каналов тромбоцитов.

5. Тиол-восстанавливающий реагент дитиотреитол не влияет на угнетение гипохлоритом натрия (15 мкМ) или К,1Ч-дихлортаурином (40 мкМ) начальной агрегации тромбоцитов, что исключает участие обратимой модификации (до дисульфидов) поверхностных тиолов в ингибировании агрегации тромбоцитов при действии этих соединений.

6. Гипохлорит натрия и Ы-хлорамины угнетают начальную агрегацию активированных изолированных тромбоцитов. Выраженное антиагрегацион-ное действие гипохлорита натрия, М,Ы-дихлортаурина, Ы-хлораланина и Ы-хлорфенилаланина проявляется при концентрациях 100 - 300 мкМ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мурина М. А., Савельева Е. Л., Рощупкин Д. И.. Окислительная модификация тромбоцитов гипохлоритом и биогенными хлораминами. «V международная конференция «Биоантиоксидант». М., 1998, стр. 155 - 156.

2. Мурина М. А., Аднорал Н. В., Рощупкин Д. И., Кравченко H.H., Савельева Е. Л., Сергиенко В. И. О защитном действии таурина и аминокислот при окислительном повреждении клеток крови гипохлоритом натрия. В кн.: V международная конференция «Биоантиоксидант». М., 1998, стр. 154- 155.

3. Мурина М. А., Рощупкин Д. И., Савельева Е. Л., Зверева М. В. Ингиби-рование агрегационной активности тромбоцитов при ковалентной модификации мембран биогенными хлораминами. В кн.: Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов. Воронеж. 1998; с. 162 - 166.

4. Мурина М. А., Аднорал Н. В., Савельева Е. Л., Сергиенко В. И. Противо-агрегационное действие хлораминовых производных аминокислот и таурина на тромбоциты. Материалы П Съезда Биофизиков России. М., 1999, Т. 1, стр. 260-261.

5. Мурина М. А., Трунилина H. Н., Аднорал Н. В., Чудина Н. А., Савельева Е.Л., Рощупкин Д.И. Структурная зависимость действия хлораминовых производных биогенных соединений на клетки крови. Материалы IV съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков "Молеку-лярно-клеточные основы функционирования биосистем." Минск, 2000, стр. 167.

6. Мурина М. А., Рощупкин Д. И., Чудина Н. А., Трунилина H. Н., Аднорал Н.В., Савельева Е. Л., Сергиенко В. И. Разработка антитромботического средства на основе биогенных хлораминов. Материалы Российского национального конгресса кардиологов "Кардиология, основанная на доказательствах". М., 2000, стр. 210-211.

7. Мурина М. А., Рощупкин Д. И., Чудина Н. А., Савельева Е. Л. Физико-химические основы противоагрегационного производного таурина и гипо-хлорита натрия на тромбоциты. Материалы Второго Российского конгресса по

патофизиологии "Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы." М., 2000, стр. 96 - 97.

8. Савельева Е. JL, Рощупкин Д. И. Антиагрегантное действие биогенных хлораминов, оцениваемое по угнетению начальной агрегации тромбоцитов. Материалы IV Всероссийского конгресса «Профессия и здоровье». М., 2005, стр. 584-585.

9. Савельева Е. Л., Рощупкин Д. И. Угнетение начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и биогенными хлораминами. Материалы Второй Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». М„ 2005, стр. 233.

10. Babizhayev М. A., Semiletov Yu. A., Lul'kin Yu. A., Sakina N. L., Savel'yeva E. L., Alimbarova L. I., Barinskii I. F.. Free-Radical Modulating and Immunostimulating Activities of the Novel Peptidomimetic L-Glutamyl-Histamine. Clinical and Experimental Immunology. 2005,139 (3): 447 - 57.

11. Babizhayev M. A., Semiletov Yu. A., Lul'kin Yu. A., Sakina N. L., Savel'yeva E. L., Alimbarova L. I., Barinskii I. F.. Three-Dementional Molecular Modeles, Free-Radical Modulating and Immun Cells Signaling Activities of the Novel Peptidomimetic L-Glutamyl-Histamine: Possible Immunostimulating Role. Peptides. 2005, 26 (4): 551 - 63.

12. Мурина M. А., Савельева E. JI., Рощупкин Д. И. Механизм действия биогенных хлораминов и гнпохлорита на начальную агрегацию тромбоцитов. Биофизика. 2006; 51 (2): 299 - 305.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савельева, Екатерина Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

Раздел I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Тромбоциты.

1.1. Строение тромбоцитов и их функции.

1. 2. Механизм активации тромбоцитов.

1. 3. Агрегация тромбоцитов.'.

2. Сульфгидрильные группы тромбоцитов и их роль в функционировании этих клеток.

2.1. Определение сульфгидрильных групп в тромбоцитах.

2. 2. Роль сульфгидрильных групп тромбоцитов в функционировании этих клеток.

3. Возможные пути угнетения агрегации тромбоцитов и антитром-боцитарные препараты, применяемые в клинике.

4. Гипохлорит натрия и 1Ч-хлорамины. Физико-химические свойства' этих соединений и их влияние на тромбоциты и другие компоненты крови.

Раздел II. Материалы и методы исследования.

1. Реактивы.

2. Получение гипохлорита натрия и ТЧ-хлораминопроизводных.

3. Получение тромбоцитов.

4. Определение сульфгидрильных групп тромбоцитов.

5. Определение количества активного хлора.

6. Регистрация начальной агрегации тромбоцитов.

7. Статистическая обработка результатов.

Раздел III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. Антиагрегационное действие гипохлорита натрия и 1Ч,]Ч-ди-хлорхлортаурина на тромбоциты.

1.1. Угнетение гипохлоритом натрия и ]Ч,1Ч-дихлортаурином начальной агрегации тромбоцитов в составе ОТП.

1.2. Угнетение гипохлоритом натрия и 1Ч,1Ч-дихлортаурином начальной агрегации тромбоцитов в изолированном виде;.

Глава 2. Модификация сульфгидрильных групп тромбоцитов продуктами миелопероксидазной реакции и роль разрушения этих групп в угнетении их начальной агрегации.

2.1. Модификация сульфгидрильных групп тромбоцитов, определяемых с помощью дитионитробензойной кислоты, продуктами миелопероксидазной реакции.

2. 1. 1. Количественное определение доступных сульфгидрильных групп тромбоцитов кролика с помощью дитионитробензойной кислоты.

2. 1. 2. Снижение ]Ч-этилмалеимидом уровня сульфгидрильных групп на поверхности тромбоцитов, определяемых с помощью, дитионитробензойной кислоты.

2.1.3. Влияние продуктов миелопероксидазной реакции на уровень сульфгидрильных групп тромбоцитов, определяемых с помощью дитионитробензойной кислоты.

2.1.4. Влияние гипохлорита натрия на уровень ДТНБ-определяемых сульфгидрильных групп тромбоцитов при его действии в ОТП.

2. 2. Влияние специфических 8Н-реагентов на начальную агрегацию тромбоцитов.

2.2.1. Начальная агрегация тромбоцитов под действием 1Ч-этилмалеи-мида.

2. 2. 1. Начальная агрегация тромбоцитов под действием дитионитробензойной кислотой.

2. 3. Некоторые аспекты в механизме действия гипохлорита натрия и 1Ч,1Ч-дихлортаурина на тромбоциты.

2. 3. 1. Действие гипохлорита натрия и NjN-дихлортаурина на тромбоциты в присутствии неспецифического антиоксиданта ионола.

2. 3. 2. Влияние гипохлорита натрия и 1Ч,]Ч-дихлортаурина на уровень ДТНБ-определяемых сульфгидрильных групп поверхности тромбоцитов при действии в условиях блокады их кальциевых каналов.

2. 3. 3. Влияние дисульфид-редуцирующего реагента дитиотреитола на угнетение гипохлоритом натрия или 1Ч,1Ч-дихлортаурином начальной агрегации тромбоцитов.

Глава III. Антиагрегационное действие продуктов миелопероксидазной реакции на активированные тромбоциты.

3. 1. Угнетение NjN-дихлортаурином начальной агрегации предварительно активированных тромбоцитов.

3. 2. Угнетение N-хлораланином и N-хлорфенилаланином начальной агрегации предварительно активированных тромбоцитов.

3. 3. Угнетение гипохлоритом натрия начальной агрегации предварительно активированных тромбоцитов.

3. 4. Угнетение N-этилмалеимидом начальной агрегации предварительно активированных тромбоцитов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм угнетения начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином"

При ряде сердечно-сосудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, инфаркт миокарда, болезни вен конечностей, облитерирую-щий эндоартериит и др.), диабете, хирургических вмешательствах и многих других заболеваниях повышенная • агрегационная активность тромбоцитов нередко становится причиной тромбозов [176, 33, 218, 211], последствия которых, как известно, могут оказаться самыми неблагоприятными для организма. Другая крайность в функциональном состоянии тромбоцитов, их пониженная агрегационная активность, представляет угрозу развития анемии, внутренних кровотечений, геморрагического синдрома. В связи с этим, привлекают внимание соединения, обладающие антиагрегационными свойствами. Среди таких соединений интересно выделить гипохлорит натрия и N-хлорамины [Мурина М. А., 2000]. Они являются естественными метаболитами организма: гипохлорит-анион (гипохлорная кислота) образуется в организме в активированных нейтрофилах в результате реакции, катализируемой миелопероксидазой, а N-хлорамины в ходе его взаимодействия с аминокислотами и пептидами [208]. Высвобождаясь из активированных нейтрофилов гипохлорит и биогенные хлорамины в крови могут изменять функциональную активность тромбоцитов. Поэтому изучать их антиагрега-ционное действие представляется интересным и важным. Актуален вопрос о возможности применения гипохлорита натрия и N-хлораминов в клинике в качестве лекарственных средств. В настоящее время гипохлорит натрия применяется внутривенно при некоторых острых интоксикациях [Sergienko V.l., 1989]. При этом наряду с детоксицирующим действием могут иметь место и побочные эффекты за счет его взаимодействия с клетками крови и компонентами плазмы. Хлорамины биогенного типа предложены как перспективные соединения для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцитами [18, 16]. Ведутся доклинические испытания некоторых из них [20]. Особый интерес вызывает производное таурина (2-аминоэтансульфоновая кислота, представляет собой продукт превращения цистеина) ЫДЧ-дихлортаурин, характеризующийся значительной собственной устойчивостью.

Антиагрегационное действие гипохлорита натрия и И-хлораминов проявляется благодаря «активному» хлору [24, 12]. Химически модифицируя плазматические мембраны тромбоцитов в целом, эти соединения угнетают конечную агрегацию при разных механизмах их активации (тромбин, коллаген, адреналин, АДФ и др.). Такое генерализованное ингибирование тромбоцитов, то есть ингибирование их агрегации в ответ на действие любого агониста, является важнейшим их достоинством как возможных антитром-боцитарных средств. Большинство препаратов, применяемых в клинике, характеризуются высокой специфичностью действия, и поэтому возможности их ингибирующего действия сильно ограничены. Однако до сих пор остается невыясненным механизм антитромбоцитарного действия гипохлорита натрия и Ы-хлораминов. Его расшифровка должна существенно облегчить решение проблемы о возможности клинического применения этих соединений. Здесь, в первую очередь, актуален вопрос о безопасности их взаимодействия с плазмой. Угнетение активности тромбоцитов при введении в кровь гипохлорита натрия или М-хлораминов может быть результатом первоначальной модификации ими плазмы с образованием продукта, обладающего антитром-боцитарными свойствами; понятно, что в этом случае возникает необходимость изучать воздействие этого продукта и на другие клетки, поскольку при его появлении в крови возможны негативные последствия для организма. Иначе говоря, нежелательное влияние гипохлорита натрия и Ы-хлораминов на клетки крови и организм в целом может не ограничиваться их прямым действием. Во-вторых, разработка нового антитромбоцитарного лекарственного препарата на основе Ы-хлораминов и внутривенное применение гипохлорита натрия в качестве детоксицирующего средства требует теоретического обоснования их фармакологического лечебного (ТМ-хлорамины) и побочного (гипохлорит натрия) действия на тромбоциты. Для понимания механизма антиагрегационного действия обсуждаемых продуктов миелопероксидаз-ной реакции на тромбоциты важно изучать не только их обычную конечную агрегацию (образование крупных агрегатов - Вот, в. V. Я., 1962), но и~ начальную (образование мелких агрегатов - Ргопуоую М. М., 1983).

В сосудистом русле в нормальных условиях постоянно образуются мелкие агрегаты, которые подвергаются самопроизвольному разрушению [51, 138]. При некоторых патологиях механизм такой спонтанной дезагрегации нарушается [51, 138, 139], и тогда из этих мелких агрегатов могут образовываться крупные агрегаты с последующей активацией системы свертывания крови под воздействием высвобождающихся из тромбоцитов биологически активных соединений (АДФ, серотонин, адреналин, тромбоксан А2 и мн. др.). Таким образом, наличие мелких тромбоцитарных агрегатов в крови может привести в итоге к тромбоэмболии и тромбозу магистральных сосудов;[51]. Исходя из этого, новые антитромбоцитарные препараты предпочтительнее разрабатывать на основе соединений, способных подавлять агрегационную активность тромбоцитах на ранней ее стадии. В настоящее время ни один из применяемых в клинике антитромбоцитарных препаратов не отвечает этому требованию. Такие популярные антиагреганты как производные тиенопири-диновых оснований (тиклопидин, клопидогрел) и аспирин наряду со своими достоинствами [157], имеют существенный недостаток — неспособность подавлять агрегационную активность тромбоцитов на ранних этапах их активации [138, 105]. В связи с этим изучение влияния Ы-хлораминов на начальную агрегацию тромбоцитов представляет особую важность для оценки эффективности их антиагрегантного действия.

В этой работе исследовалось влияние гипохлорита натрия и Ы,Ы-дихлор-таурина на начальную агрегацию тромбоцитов. Кроме того, нами изучалось действие на тромбоциты и некоторых других Ы-хлорпроизводных: Ы-хлор-аланина, Н-фенилхлораланина и Ы-хлортаурина. Мы приводим свидетельства в пользу того, что инактивация тромбоцитов под действием продуктов миелопероксидазной реакции наступает в результате разрушения сульфгидриль-ных групп их плазматических мембран.

- 9

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Савельева, Екатерина Леонидовна

выводы.

1. Гипохлорит натрия и Ы,Ы-дихлортаурин в умеренных концентрациях угнетают начальную агрегацию тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме в результате прямого действия на клетки. В обогащенной тромбоцитами плазме угнетение агрегации тромбоцитов наблюдается в диапазоне концентраций 500 - 2500 мкМ, на изолированных тромбоцитах - в диапазоне 10-50 мкМ.

2. Гипохлорит натрия и ^Ы-дихлортаурин в диапазоне концентраций 25 -100 мкМ окисляют поверхностные сульфгидрильные группы тромбоцитов, что является механизмом их антиагрегационного действия.

3. Липидный антиоксидант ионол не влияет на ингибирующий эффект гипо-хлорита натрия и ]М,]\[-дихлортаурина на начальную агрегацию тромбоцитов и снижение уровня поверхностных тиолов, что свидетельствует о нерадикальном характере антитромбоцитарного действия этих соединений и об их прямом взаимодействии с поверхностными тиолами. у I

4: В условиях блокады Са -каналов уровень поверхностных тиолов тромбоцитов под влиянием гипохлорита натрия и НЫ-дихлортаурина в пределах концентрации 50 мкМ снижается в той же степени, что и без блокады, что свидетельствует об отсутствие модификации кальциевых каналов тромбоцитов.

5. Тиол-восстанавливающий реагент дитиотреитол не влияет на угнетение гипохлоритом натрия (15 мкМ) или М,Ы-дихлортаурином (40 мкМ) начальной агрегации тромбоцитов, что исключает участие обратимой модификации (до дисульфидов) поверхностных тиолов в ингибировании агрегации тромбоцитов при действии этих соединений.

6. Гипохлорит натрия и Ы-хлорамины угнетают начальную агрегацию активированных тромбоцитов. Выраженное противоагрегационное действие гипохлорита натрия, 1Ч,]\[-дихлортаурина, И-хлораланина и ]ЧГ-хлорфенилала-нина проявляется при концентрациях 100 - 300 мкМ.

- 120

- 115 -Заключение.

В данной работе исследовалось' влияние на начальную агрегацию тромбоцитов N-хлораминов и гипохлорита натрия — естественных метаболитов организма, которые рассматриваются для клинического применения в качестве антитромбоцитарных препаратов и детоксицирующего средства. Прежде всего, выяснилось, что антиагрегационные эффекты гипохлорита натрия и ТЧДЧ-дихлортаурина на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазме при применении в сравнительно невысокой конечной концентрации 500 - 2500 мкМ проявляются благодаря их прямого действия на клетки (рис. 5): Такой результат говорит, с одной стороны, в пользу их безопасности (при модификации плазмы не образуются активные продукты) и, с другой стороны, об их избирательности по отношению к тромбоцитам. Последнее является важным достоинством Ы^-дихлортаурина. На современном этапе продолжаются поиски такого препарата, который сочетает максимальную способность к угнетению активности тромбоцитов с минимальным повреждением других компонентов крови и организма в целом. Количественная оценка этой избирательности (см. III. 1.) показала, что Ы,Ы-дихлортаурин на порядок эффективнее взаимодействует с тромбоцитами (в 17 раз), чем с плазмой.

Обнаружено, что гипохлорит натрия и NjN-дихлортурин при концентрации 25 - 100 мкМ, при которой происходит инактивация тромбоцитов, модифицируют их поверхностные сульфгидрильные группы, определяемые с помощью ДТНБ (рис. 15). Такая модификация, по-видимому, играет ведущую роль в их способности вызывать генерализованное угнетение начальной агрегации - N-ЭМ, разрушая тиолы поверхности тромбоцитов (рис. 14), угнетает их начальную агрегацию, и это угнетение не зависит от механизма активации (рис. 17).

В экспериментах по выяснению механизмов реализации эффектов гипохлорита натрия и Ы^-дихлортаурина удалось установить ряд фактов. Вопервых, с помощью липидного биоантиоксиданта ионола было выяснено, что исследуемые соединения действуют на сульфгидрильные группы поверхности тромбоцитов прямо, а не косвенно - через первоначальное^ повреждение липидного матрикса плазматических мембран (рис. 19). Нерадикальную природу имеет и механизм инактивации ими тромбоцитов (рис. 20). Можно предполагать, что в основе этого механизма лежит прямое взаимодействие гипохлорита натрия и Ы,Ы-дихлортаурина с поверхностными тиолами клеток. Во-вторых, обратимая модификация тиолов (с образованием дисульфидов) поверхности тромбоцитов не может рассматриваться в качестве возможной причины их генерализованного ингибирования при действии этих соединений - тиол-восстанавливающий реагент дитиотреитол не отменяет угнетение гипохлоритом натрия (15 мкМ) или ЫД^-дихлортаурином (40 мкМ) их начальной агрегации (рис. 22).

Гипохлорит натрия и ТЧДчГ-дихлортаурин при концентрации 50 мкМ заметно не расходуются на модификацию кальциевых каналов — в условиях их блокады эффекты снижения исследуемыми соединениями уровня поверхностных тиолов, определяемых с помощью ДТНБ, были такими же, как и без ее применения (рис. 21). По-видимому, разрушение этими соединениями тиолов на поверхности тромбоцитов не приводит к открытию потенциал-зависимых кальциевых каналов.

Гипохлорит натрия и Ы-хлорамины способны угнетать начальную агрегацию при действии на тромбоциты уже после их активации (рис. 24 — 27). В этом случае ослабление агрегационной активности клеток гипохлоритом натрия или Н,Ы-дихлортаурином требует применения на порядок более высокой их концентрации, чем при действии на нативные клетки. Аналогичная закономерность угнетения начальной агрегации в зависимости от состояния тромбоцитов наблюдалась и у М-этилмалеимида: агрегация предварительно активированных клеток угнетается им при более высокой концентрации (рис. 28 и таблица 6), нежели требуется для подобного угнетения ее в случае нативных клеток (рис. 17). Наши наблюдения говорят о том, что антиагрегационное действие исследуемых соединений на активированные тромбоциты, вероятно, должно быть опосредовано разрушением внутренних тиолов их плазматических мембран. По-видимому, ТМ-хлораминокислоты (ЪГ-хлорала-нин и ТчГ-хлорфенилаланин) легче проникают внутрь мембран тромбоцитов, чем гипохлорит натрия и Ы,К-дихлортаурин, и это определяет их более сильное антиагрегационное действие (рис. 25).

Научная новизна исследования. Установлено, что гипохлорит натрия и Ы,Ы-дихлортаурин, введенные в обогащенную тромбоцитами плазму, в диапазоне концентраций 500 - 2500 мкМ угнетают начальную агрегацию в результате прямого действия на клетки; образующиеся при этом продукты модификации плазмы неактивны, не обладают выраженным антиагрегацион-ным свойством. Показанные на изолированных тромбоцитах эффекты угнетения этими соединениями начальной агрегации проявляются в пределах концентрации, в которой они могут локально образовываться в крови в естественных условиях (около 100 мкМ).

Первичным механизмом действия гипохлорита натрия и Ы-хлораминов на тромбоциты является модификацияхульфгидрильных групп их поверхности. Инактивация тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия"и N,14-дихлортаурином, происходит в результате первоначального повреждения белков (а не липидов) их плазматических мембран вследствие прямого действия на сульфгидрильные группы поверхностных белков клеток с образованием кислородсодержащих продуктов необратимого окисления тиолов суль-феновой и сульфоновой кислот. При концентрации 50 мкМ, вызывающей модификацию тиолов поверхности тромбоцитов, гипохлорит натрия и Ы,Ы-ди-хлортаурин не модифицируют кальциевых каналов тромбоцитов.

Обнаружено, что гипохлорит натрия и М-хлорамины угнетают начальную агрегацию при действии на изолированные тромбоциты уже после их активации. Ы-хлораланин при концентрации 100 мкМ вызывает практически полный распад тромбоцитарных агрегатов.

Практическое значение работы. Во-первых, отсутствие у модифицированной М,М-дихлортаурином плазмы при его введении в ОТП признака биологической активности (антитромбоцитарного действия) снимает необходимость в дальнейшем исследовать ее влияние на другие клетки. То же самое можно сказать и относительно действия в крови гипохлорита натрия, который уже давно применяется при некоторых острых интоксикациях. Разрушение сульфгидрильных групп тромбоцитов как возможный первичный механизм антиагрегационного действия исследуемых соединений говорит в пользу безопасности их применения для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцитами: продукты таких реакций безвредны, поскольку образуются в организме и в естественных условиях (при метаболизме цистеина и других 8Н-содержащих соединений). Во-вторых, выявленные у 1Ч,Ы-дихлор-таурина и гипохлорита натрия механизмы модифицирующего действия позволяют теоретически обосновать их лечебный эффект как антитромбоцитарного препарата (ДХТ) и побочное действие на тромбоциты при применении в целях детоксикации (ГХН). В-третьих, важнейшим достоинством ТчГ-хлор-аминов как перспективных антитромбоцитарных средств является их способность угнетать агрегационную активность тромбоцитов в составе уже образованных мелких агрегатов. Обнаруженное дезагрегационное свойство Ы-хлор-аланина, проявляющееся в полной мере при концентрации, в которой он может локально вырабатываться при определенных условиях в организме (100 мкМ), характеризует его как перспективное антиагрегантное средство.

- 119

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савельева, Екатерина Леонидовна, Москва

1. Вышлов, Е. В. Сравнительная эффективность аспирина, тиклида и их комбинации у больных с острым инфарктом миокарда / Е. В. Вышлов, Е. В. Панфилова, В. А. Марков // Клин. Мед. 2000. - Т. 78. - № 1.-С. 37-39.

2. Говорова, Н. Ю. Особенности хемилюминесценции люминола, возбуждаемого при каталитическом действии миелопероксидазы- / Н. Ю. Говорова, Б. П. Шаронов, С. Н. Лызлова // Биохимия. 1987. — Т. 52. -№ 10. - С. 1670- 1676.

3. Глушков, С. И. Сравнительная оценка состояния системы глутатиона в различных органах и тканях при острых пероральных отравлениях дихлорэтаном / С. И. Глушков: дис. канд. мед. наук. 1998.

4. Духанин, A.C. Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов / A.C. Духанин, Ф.Р. Губаева // Эксп. и клиническая фармакология. 1998. - Т. 61. -№4. - С. 66-71.

5. Мазуров, А. В. Мембранные гликопротеиды в реакциях адгезии и агрегации тромбоцитов / А. В. Мазуров: дис. докт. мед. наук. М. — 1998. -216 с.

6. Мартынов А. К. Моделирование окислительной функции печени при гипербилирубинемии / А. К. Мартынов: автореф. дисс. канд. мед. наук. -М. 1985.-21 с.

7. Миронюк, Е.П. Экспериментальное исследование действия антагонистов кальция, производных алкилендиамина, на агрегацию тромбоцитов / Е. П. Миронюк: дис. канд. мед. наук. 1987. - 155 с.

8. Мурина, М. А. Физико-химические механизмы действия на тромбоциты хлораминовых производных биогенных соединений и гипохлорита натрия / М. А. Мурина: автореф. дис. докт. биол. наук. М. -2000. - 46 с.

9. Мурина, М. А. Противоагрегационное действие гипохлорита на тромбоциты / М. А. Мурина, В. Н. Кузнецов, Д. И. Рощупкин // Бюл. Экс-перим. Биологии и медицины. 1986. - Т. 102. - С. 676 -678.

10. Мурина, М. А. Прямое и косвенное противоагрегационное действие гипохлорита натрия на обогащенную тромбоцитами плазму / М. А. Мурина, В. И. Сергиенко, Д. И. Рощупкин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1989. - Т. 108. - № 12. - С. 702-704.

11. Мурина, М. А. Противотромботическая активность ^Ы-дихлортау-рина in vivo на модели тромбоза у мышей / М. А. Мурина, О. Д. Фесенко, В. И. Сергиенко, Н. А. Чудина, Д. И. Рощупкин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2002. - Т. 134. - № 7. - С. 44-47.

12. Панченко, Е. П. Ингибиторы НЬ/Ша рецепторов тромбоцитов — новое направление в антитромботической терапии / Е. П. Панченко // Терап. архив. 1997. - Т. 69. - № 9. - С. 66 - 71.

13. Ребров, А. П. Сравнительное изучение эффективности тиклида и аспирина у больных нестабильной стенокардией / А. П. Ребров, И. В. Воскобой // Терап. Архив. 2001. - Т. 73. - № 12. - С. 25 - 29.

14. Рощупкин, Д.И. Изменение малоуглового рассеяния света тромбоцитами при их активации и агрегации / Д. И. Рощупкин, В. В. Бержиц-кая, А. Ю. Соколов // Биофизика. 1998. - Т. 43. - С. 503-510:

15. Рощупкин, Д. И. Угнетение функций тромбоцитов биогенными хлор-аминами. / Д. И. Рощупкин, М. А. Мурина, Н. В. Аднорал, H. Н. Кравченко, В. И. Сергиенко // Физиология человека. 1998. — Т. 24. - С. 113-120.

16. Рощупкин, Д. И. Способ исследования начальной агрегации (варианты) и устройство для его осуществления (варианты) / Д. И. Рощупкин, А. Ю. Соколов // Официальный бюллетень комитета РФ по патентам и товарным знакам. Изобретения. 1996. - № 28. - С. 225.

17. Самаль, А. Б. N-этилмалеимид вызывает дезагрегацию тромбоцитов, агрегированных под действием АДФ и тромбина, и снижение уровня цитоплазматического кальция / А. Б. Самаль и Е. Н. Лойко // Биохимия. 2000. - Т. 65. - № 2. - С. 276 - 283.

18. Северина, И.С. Оксид азота. Роль растворимой гуанилатциклазы в механизмах его физиологических эффектов / И.С. Северина // Вопр. мед. химии. 2002. - Т. 48. - № 1. - С. 3.

19. Северина, И.С. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы полиаминами / И.С. Северина, Н.В. Пятакова, А.Ю. Щеголев // Биомед. химия. 2007. - Т. 53. - № 1. - С. 44 - 49.

20. Сергиенко, В. И. Молекулярно-клеточные механизмы действия гипо-хлорита натрия на тромбоциты и липопротеины / В. И. Сергиенко, М. А. Мурина, О. М. Панасенко, H. Н. Трунилина, С. А. Евгина, Р.

21. Айдыралиев, Д. И. Рощупкин // Вестник РАМН. 1995. - Т. 3. - С. 48 -53.

22. Стефанович, В. К вопросу о биохимическом механизме действия пен-токсифилина / Стефанович В. // Клиническое значение препарата трентал: сб. докл. симпозиума. — М. 1977. - С. 16 — 20.

23. Струкова, С.М. Роль тромбоцитов и сериновых протеиназ в сопряжении свертывания крови и воспаления / С.М. Струкова // Биохимия. -2004.-Т. 69.-№ 10.-С. 1067- 1081.

24. Торчинский, Ю. М. Сера в белках / Ю. М. Торчинский // М.: Наука. -1977.-302 с.

25. Трунилина, Н. Н. Модификация плазматической мембраны тромбоцитов и лейкоцитов и изменение их функций под влиянием гипохлорита натрия / Н. Н. Трунилина: дис. канд. мед. наук. М. - 1995. - 129 с.

26. Шаронов, Б. П. Антиокислительные свойства и деградация белков сыворотки активными формами кислорода (О2 ОС1 генерируемыми стимулированными нейтрофилами / Б. П. Шаронов, Н. Ю. Говорова, С. Н. Лызлова // Биохимия. 1988. - Т. 53. - № 5. - С. 816 — 825.

27. Элиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот и Д. Элиот.- М: Изд -во НИИ биомолек. химии РАМН. -1999. 372 с.

28. Akiba, S. Involvement of lipoxygenase pathway in doco-sapentaenoic acid-induced inhibittion of platelet aggregation / S. Akiba, T. Murata, K. Kitatani, T. Sato // Biol. Pharm. Bull. 2000. - Vol. 23. - № 11. - P. 1293- 1297.

29. Aledort, L. M. Inhibition of sulfhydryl-dependent platelet functions by penetrating and non-penetrating analogues of parachloromercuribenzene / L. M: Aledort, S. B. Troup, R.I. Weed // Blood. 1968. - Vol. 31. - № 4. -P. 471 -479.

30. Al-Mondhiry, H. Inhibition of platelet adhesion to collagen by sulfhydryl inhibitors / H. Al-Mondhiry, T.H. Spaet // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1970. Vol. 135.-№ 3.- P. 878 -882.

31. Ando, Y. Effect of storage on sulfhydryl and disulfide groups of human platelets / Y. Ando, M. Steiner, M. G. Baldini // Blood. 1974. - Vol. 43. - № l.-P. 121 - 129.

32. Ando, Y. Distribution of free sulfhydryl and disulfide groups among platelet membrane proteins / Y. Ando, M. Steiner // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - Vol. 419.-№1.-P. 51-62.

33. Ando, Y. Sulfhydryl and disulfide groups of platelet membranes. I. Determination of sulfhydryl groups / Y. Ando, M. Steiner // Biochim. Biophys. Acta. 1973.-Vol. 311. - № 1.- P. 26 - 37.

34. Ardlie, N. G. Adenosine diphosphate-induced platelet aggregation in suspensions of washed rabbit platelets / N. G. Ardlie, M. A. Packham, J. F. Mustard // Br. J. Haematol. 1970. - Vol. 19. - № 1. - P. 7 - 17.

35. J. S. Bennett // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115. - № 12. - P. 33633369.

36. Berkes, E. A. Anaphylactic and anaphylactoid reactions to aspirin and other NSAIDs / E. A. Berkes // Clin. Rev. Allergy. Immunol. 2003. -Vol. 24.-№2.-P. 137- 148.

37. Bertolini, A. Dual acting anti-inflammatory drugs: a reappraisal / A. Bertolini, A. Ottani, M. Sandrini // Pharmacol. Res. 2001. - Vol. 44. -№ 6. - P. 437 - 450.

38. Bologna, E. Circulating platelet activation in healthy subjects and in some pathological conditions. Method of study and results / E. Bologna, P. Traietti // Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1990. - Vol. 66. - № 4. - P. 343 -347.

39. Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal / G. V. Born // Nature. 1962. - Vol. 194. - P. 927 - 929.

40. Bornstein, P. Thrombospondins as matricellular modulators of cell function / P. Bornstein // J: Clin. Invest. 2001. - Vol. 107. - № 8. - P. 929 -934.

41. Boulos, C. Diffusion of peroxynitrite into the human platelet inhibits cyc-looxygenase via nitration of tyrosine residues / C. Boulos , H. Jiang , M. Balazy // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. - Vol. 293. - № 1. - P. 222 -229.

42. Butt, I. F. Synergistic interaction of epinephrine and calcium ionophore in platelet aggregation / I. F. Butt, S. A. Saeed, S. N. Waqar, M. Aslam // J. Ayub. Med. Coll. Abbotta-bad. 2005. - Vol. 17. - № 2. - P. 1 - 5.

43. Cattaneo, M. ADP receptors and clinical bleeding disorders / M. Cattaneo,

44. C. Gachet // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999. - Vol. 19. - № 10. -P. 2281 -2285.

45. Catella-Lawson, F. Vascular biology of thrombosis: platelet-vessel wall interactions and aspirin effects / F. Catella-Lawson // Neurology. — 2001.- Vol. 57 (5 Suppl 2). P. 5-7.

46. Cerecedo, D. Modification of actin, myosin and tubulin distribution during cytoplasmic granule movements associated with platelet adhesion /

47. D. Cerecedo, R. Stock , S. González, E. Reyes, R. Mondragón // Haema-tologica. 2002. - Vol. 87. -№ 11. - P. 1165 - 1176.

48. Cho, Y. S. The role of thiols in protecting against simultaneous toxicity of menadione to platelet plasma and intracellular membranes / Y. S. Cho, M. J. Kim, J. Y. Lee, J. H. Chung // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. - Vol. 280. - № 3. - P. 1335- 1340.

49. Ciuffetti, G. Clopidogrel: hemorheological effects in subjects with subclinical atherosclerosis / G. Ciuffetti, R. Lombardini, M. Pirro, G. Lupattelli, E.Mannarino // Clin. Hemorheol. Microcirc. 2001. - Vol. 25. - № 1. - P. 31-39.

50. Claria, J. Cyclooxygenase-2 biology / J. Claria // Curr. Pharm. Des. -2003. Vol. 9. -№ 27. - P. 2177 - 2190.

51. Clary, D.O. SNAPs, a family of NSF attachment proteins involved in intracellular membrane fusion in animals and yeast / D. O. Clary, I. C. Griff, J. E. Rothman // Cell. 1990. - Vol. 61. - № 4. - P. 709 - 721.

52. Dangelmaier, C. Potentiation of thromboxane A2-induced platelet secretion by Gi signaling through the phosphoinositide-3 kinase pathway / C. Dangelmaier , J. Jin , J. B. Smith, S. P. Kunapuli // Thromb. Haemost. -2001.-Vol. 85.-№ 2. P. 341 - 348.

53. Dean, W. L. Regulation of platelet plasma membrane Ca2+-ATPase by cAMP-dependent and tyrosine phosphorylation / W. L. Dean, D. Chen, P. C. Brandt, T. C. Vanaman // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - № 24. -P. 15113-15119.

54. Dopheide, S. M. Dynamic aspects of platelet adhesion under flow / S. M. Dopheide, C.L. Yap, S. P. Jackson // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. -2001. Vol. 28. - № 5-6. - P. 355-363.

55. Edlich, C. Structure and phosphatidylinositol-(3,4)-bisphosphate binding of the C-terminal PH domain of human pleckstrin / C. Edlich, G. Stier, B. Simon, M. Sattler, C. Muhle-Goll // Structure. 2005. - Vol. 13. - № 2. -P. 277 - 286.

56. Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups / G. L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82. - № 1. - p. 70 - 77.

57. English, D. Platelet-released phospholipids link haemostasis and angio-genesis / D. English, J. G. Garcia, D. N. Brindley // Cardiovasc. Res. -2001. Vol. 49. - № 3. - P. 588 - 599.

58. Enouf, J. Two different Ca2+ transport systems are associated with plasma and intracellular human platelet membranes / J. Enouf, R. Bredoux, N. Bourdeau, S. Levy-Toledano // J. Biol.Chem. 1987. - Vol. 262. - № 19. - P. 9293 - 9297.

59. Erin, D. S. Critical Role for Cholesterol in Lyn-mediated Tyrosine Phosphorylation of FceRI and Their Association with Detergent-resistant

60. Membranes / D. S. Erin, D. Holowka and B. Baird. // J. Cell. Biol. 1999. - Vol. 145. - № 4. - P. 877 - 887.

61. Essex, D; W. Protein disulphide isomerase mediates platelet aggregation and secretion / D. W. Essex, M. Li // Br J Haematol. 1999. - Vol. 104. -№3. - P. 448-454.

62. Feijge, M. A. Control of platelet activation by cyclic AMP turnover and cyclic nucleotide phosphodiesterase type-3 / M. A. Feijge, K. Ansink, K. Vanschoonbeek, J. W. Heemskerk // Biochem. Pharmacol. — 2004. — Vol. 67.-№8.-P. 1559- 1567.

63. Fitzgerald, D. J. Vascular biology of thrombosis: the role of platelet-vessel wall adhesion / D. J. Fitzgerald // Neurology. — 2001. — Vol. 57 (5 Suppl 2). P. 1 - 4.

64. Gachet, C. Platelet activation by ADP: the role of ADP antagonists / C. Gachet//Ann. Med. 2000. - Vol. 32 (Suppl 1). - P. 15 - 20.

65. Geiger, J. Inhibitors of platelet signal transduction as anti-aggregatory drugs / J. Geiger // Expert. Opin. Investig. Drugs. 2001. - Vol. 10. - № 5. - P. 865 - 890.

66. Rimbach // Br. J. Nutr. 2003. - Vol. 89. - № 5. - P. 607 - 616.

67. Hagiwara, A. Life-threatening subcutaneous hemorrhage following minor blunt trauma in an elderly patient taking ticlopidine and aspirin: a case report / A. Hagiwara, T. Matsuda, S. Shimazaki // Emerg Radiol. 2005. -Vol. 12.-№ 1-2.-P. 47-49.

68. Hamad, A. M. Aspirin-induced asthma: clinical aspects, pathogenesis and management / A. M. Hamad, A. M. Sutcliffe, A. J. Knox // Drugs. 2004. -Vol. 64. - №21. -P. 2417- 2432.

69. Han, P. Verapamil and collagen-induced platelet reactions-evidence for a role for intracellular calcium in platelet activation / P. Han, C. Boatwright, N. G. Ardlie // Thromb. Haemost. 1983. - Vol. 50. - № 2. - P. 537 - 540.

70. Harbury, C. B. Modification of platelet sulfhydryl groups. / C. B. Harbury, S. L. Schrier // Thromb. Diath. Haemorrh. 1974. - Vol. 31. - № 3. - P. 469 - 484.

71. Harfenist E. J. Effects of the cell adhesion peptide, Arg-Gly-Asp-Ser, on responses of washed platelets from humans, rabbits, and rats / E. J. Harfenist, M. A. Packham, J. F. Mustard // Blood. 1988. - Vol. 71. - № l.-P. 132- 136.

72. Harfenist, E. J. Measurement of fibrinogen concentrations in suspensions of washed rabbit and human platelets by radioimmunoassays / E. J. Harfenist, J. L. Wrana, M. A. Packham, J. F. Mustard // Thromb. Haemost. — 1985. Vol. 53. - № 1. - P. 110 - 115.

73. Harrison, M. J. The effect of sulphydryl and enzyme inhibitors on platelet aggregation in vitro / M. J. Harrison, P. R. Emmons, J. R. Mitchell // Thromb. Diath. Haemorrh. 1966. - Vol. 16. - № 1. - P. 122 - 133.

74. Hartwig, J. H. The platelet: form and function / J. H. Hartwig // Semin. Hematol. 2006. - Vol. 43 (1 Suppl 1). - P. 94 - 100.

75. Hayreh, S. S. Prevalent misconceptions about acute retinal vascular occlusive disorders / S. S. Hayreh // Prog. Retin. Eye Res. 2005. - Vol. 24. -M-P; 493 -519;

76. Hechler, B. The P2Y1 receptor is necessary for adenosine 5-diphosphate-induced platelet aggregation / B. Hechler, C. Leon, C. Vial, P. Vigne, C. Frelin, J. P. Cazenave, C. Gachet // Blood. 1998. - Vol. 92. - № 1. - P. 152 - 159.

77. Held, A. M. Ambiguity associated with use of singlet oxygen trapping agents in myeloperoxidase-catalyzed oxidations / A. M. Held, J. K. Hurst // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. - Vol. 81. - № 3. - P. 878 -885.

78. Ho, P. P. Biosynthesis of thromboxane B2: assay, isolation, and properties of the enzyme system in human platelets / P. P. Ho, C. P. Walters, H. R. Sullivan // Prostaglandins. 1976. - Vol. 12. - № 6. - P. 951 - 970.

79. Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation / S. P. Jackson // Blood. 2007. - Vol. 109. - № 12. - P. 5087 - 5095.

80. Jain, R. Protein recognition using synthetic surface-targeted agents / R. Jain, J. T. Ernst, O. Kutzki, H.S. Park, A. D. Hamilton // Mol. Divers. -2004. Vol. 8. - № 2. - P. 89 - 100.

81. Jantzen, H. M. Evidence for two distinct G-protein-coupled ADP receptors mediating platelet activation / H. M. Jantzen, L. Gousset, V. Bhaskar, D. Vincent, A. Tai, E. E. Reynolds, P. B. Conley // Thromb. Haemost. -1999.-Vol. 81. -№ 1. P. Ill - 117.

82. Jarvis, G. E. ADP can induce aggregation of human platelets via both P2Y(1) and P(2T) receptors / G. E. Jarvis, R. G. Humphries, M. J. Robertson, P. Leff// Br. J. Pharmacol. 2000. - Vol. 129. - № 2. - P. 275 - 282.

83. Jin, R. C. Endogenous mechanisms of inhibition of platelet function / R. C. Jin, B. Voetsch, J. Loscalzo // Microcirculation. 2005. - Vol. 12. - № 3. -P. 247 - 258.

84. Johnson, G. J. The critical role of myosin IIA in platelet internal contraction / G. J. Johnson, L. A. Leis, M. D. Krumwiede, J. G. White // J. Thromb. Haemost. 2007. - Vol. 5. - № 7. - P. 1516 - 1529.

85. Jurk, K. Platelets: physiology and biochemistry / K. Jurk, B. E. Kehrel // Semin. Thromb. Hemost. 2005. - Vol. 31. - № 4. - P. 381 - 392.

86. Kikura, M. Disaggregatory effects of prostaglandin El, amrinone and milrinone on platelet aggregation in human whole blood / M. Kikura, T.

87. Kosower, E. M. Glutathione. VII. Differentiation among substrates by the thiol-oxidizing agent, diamide / E. M. Kosower, W. Correa, B. J. Kinon, N. S. Kosower // Biochim. Biophys. Acta. 1972. - Vol. 264. - № 1. - P. 39 - 44.

88. Kotwani, A. Aspirin by virtue of its acidic property may act as teratogen in early chick embryo / A. Kotwani, V. L. Mehta, B. Iyengar // Indian J. Physiol. Pharmacol. 1995. - Vol. 39. - № 2. - P. 131 - 134.

89. Kozek-Langenecker, S. A. The effects of drugs used in anaesthesia on platelet membrane receptors and on platelet function / S. A. Kozek-Langenecker // Curr. Drug Targets. 2002. - Vol. 3. - № 3.- P. 247 - 258.

90. Kudo, I. Phospholipase A2 enzymes / I. Kudo, M. Murakami // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. - № 68 - 69. - P. 3 - 58.

91. Kumar, S. V. In vitro toxicity of mercury, cadmium, and arsenic to platelet aggregation: influence of adenylate cyclase and phosphodiesterase activity / S. V. Kumar, S. Bhattacharya // In. Vitr. Mol. Toxicol. 2000. - Vol. 13. - № 2. - P. 137- 144.

92. Leo, A. Networks in signal transduction: the role of adaptor proteins in platelet activation / A. Leo, B. Schraven // Platelets. 2000. - Vol. 11. - № 8. - P. 429 - 445.

93. Ley, K. Functions of selectins / K. Ley // Results Probl. Cell Differ. -'2001.-Vol. 33.-P. 177-200.

94. Linton, M. F. Cyclooxygenase-2 and atherosclerosis / M. F. Linton, S. Fazio // Curr. Opin. Lipidol. 2002. - Vol. 13. - № 5. - P. 497 - 504.

95. Loscalzo, J. Nitric oxide insufficiency, platelet activation, and arterial thrombosis. / J. Loscalzo // Circ. Res. 2001. - Vol. 88. - № 8. - P. 756 -762.

96. Ma, Y. Q. Platelet integrin alpha(IIb)beta(3): activation mechanisms / Y. Q. Ma, J. Qin, E. F. Plow // J. Thromb. Haemost. 2007. - Vol. 5. - № 7. -P. 1345- 1352.

97. Macfarlane, D. E. Inhibition by ADP of prostaglandin induced accumulation of cyclic AMP in intact human platelets / D. E. Macfarlane, D. C. Mills // J. Cyclic Nucleotide Res. 1981. - Vol. 7. - № 1. - P. 1 - 11.

98. Matsuno, H. Comparative antiplatelet effects of aspirin, vapiprost and GR144053, a GPIIb/IIIa antagonist, with a special reference to the role of platelet microaggregates / H. Matsuno, O. Kozawa, S. Nagashima, M.

99. Kanamaru, T. Uematsu // Br. J. Pharmacol. 1999. - Vol. 127. - № 5. - P. 1129- 1134.

100. Medina, P. J. Drug-associated thrombotic thrombocytopenic purpurahe-molytic uremic syndrome / P. J. Medina, J. M. Sipols, J. N. George // Curr. Opin. Hematol. -2001. Vol. 8. - № 5. - P. 286 - 293.

101. Michibayashi, T. Platelet aggregation and vasoconstriction related to platelet cyclooxygenase and 12-lipoxygenase pathways / T. Michibayashi // J. Atheroscler. Thromb. 2005. - Vol. 12. - № 3. - P. 154 - 162.

102. Mills, D. C. The control of platelet responsiveness by agents that influence cyclic AMP metabolism / D. C. Mills, J. B. Smith // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1972. -Vol.201.-P. 391- 399.

103. Miyamae, T. Calcium-induced platelet aggregation in washed platelets from guinea pigs / T. Miyamae, K. Oshima, T. Morikawa, M. Hagiwara // Pharmacology.- 1995. -Vol. 51. -№3. -P. 180- 185.

104. Mondoro, T. H. Active GPIIb-IIIa conformations that link ligand interaction with cytoskeletal reorganization / T. H. Mondoro, M. M. White, L. K. Jennings // Blood. 2000. - Vol. 96. - № 7. - P. 2487 - 2495.

105. Morris J. C. Kinetics of reection between aqueous chlorine and nitrogen compounds / J. C. Morris // In: Principles and applications of water chemistry. 1967. - P. 23-51.

106. Moussouttas, M. Combination antiplatelet agents in ischemic cerebrovascular disease / M. Moussouttas, N. Papamitsakis // Mt. Sinai J. Med. -2005. Vol. 72. - № 1. - P. 16 - 22.

107. Tokyo). 2002. - Vol. 131. - № 3. - P. 285 - 292.

108. Namazy, J; A. Sensitivity to nonsteroidal antiinflammatory drugs / J.A. Namazy, R. A. Simon // Ann. Allergy Asthma Immunol. 2002. - Vol. 89. - № 6. - P. 542-550.

109. Nurden, P. GPIIb-IIIa inhibitors / P. Nurden // Transfus. Clin. Biol. -2001.-Vol. 8. -№ 2. P. 114-122.

110. Offermanns, S. In vivo functions of heterotrimeric G-proteins: studies in Galpha-deficient mice / S. Offermanns // Oncogene. 2001. — Vol. 20. -№ 13.-P. 1635- 1642.

111. Offermanns, S. The role of heterotrimeric G proteins in platelet activation / S. Offermanns // Biol. Chem. 2000. - Vol. 381. - № 5 - 6. - P. 389 - 396.

112. Ozaki, Y. Detection of platelet aggregates with a particle counting method using light scattering / Y. Ozaki, K. Satoh, Y. Yatomi, T. Yamamoto, Y. Shirasawa, S. Kume // Anal. Biochem. 1994. - Vol. 218. - № 2. - P. 284 -294.

113. Packham, M. A. Platelet aggregation and adenosine diphosphate/adenosine triphosphate receptors: a historical perspective / M. A. Packham, J. F. Mustard // Semin. Thromb. Hemost. 2005. - Vol. 31. - № 2. - P. 129 -138.

114. Packham, M. A. Similarities and differences between rabbit and human platelet characteristics and functions / M. A. Packham, M. L. Rand, R. L. Kinlough-Rathbone // Comp. Biochem. Physiol. Comp. Physiol. 1992. -Vol. 103. -№ 1.-P. 35 -54.

115. Pages, C. Lysophosphatidic acid synthesis and release / C. Pages, M. F. Simon, P. Valet, J. S. Saulnier-Blache // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001. - Vol. 64. - № 1 - 4. - P. 1 - 10.

116. Patscheke, H. Sequential effects of the thiol-oxidizing agent, diamide, on human platelets / H. Patscheke, P. Worner // Thromb. Res. 1978. - Vol. 12.-№4.-P. 609-618.

117. Paul, B. Z. Molecular mechanism of thromboxane A(2)-induced platelet aggregation. Essential role for p2t(ac) and alpha(2a) receptors / B. Z. Paul, J. Jin, S. P. Kunapuli // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - № 41. - P. 29108-29114.

118. Pero, R. W. Hypochlorous acid / N-chloramines are naturally produced DNA repair inhibitors / R. W. Pero, Y. Sheng, A. Olsson, C. Bryngelsson, M. Lund-Pero // Carcinogenesis. 1996. - Vol. 17. - № 1. - P. 13 - 18.

119. Polgar, J. A critical role for N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein (NSF) in platelet granule secretion. / J. Polgar, G. L. Reed // Blood. -1999.-Vol. 94. -№4. P. 1313 - 1318.

120. Prutz, W. A. Hypochlorous acid interactions with thiols, nucleotides, DNA, and other biological substrates / W. A. Prutz // Arch. Biochem. Biophys. 1996. - Vol. 332. - P. 110 -120.

121. Puri, R. N. ADP-induced platelet aggregation and inhibition of adenylyl cyclase activity stimulated by prostaglandins: signal transduction mechanisms / R. N. Puri // Biochem. Pharmacol. 1999. - Vol. 57. - № 8. - P. 851 - 859.

122. Puri, R. N. Phospholipase A2: its role in ADP- and thrombin-induced platelet activation mechanisms / R. N. Puri // Int. J. Biochem. Cell Biol. -1998.-Vol. 30.-№ 10. P. 1107- 1122.

123. Qingqi, Z. Platelet membrane actin may be partially embedded in lipid bilayer and disulfide linked / Z. Qingqi, A. Stracher // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - Vol. 252. - № 2. - P. 407 -411.

124. Quinn, M. J. Ticlopidine and clopidogrel / M. J. Quinn, D. J. Fitzgerald // Circulation. 1999. - Vol. 100. - № 15. - P. 1667 - 1672.

125. Ramasamy, I. Inherited bleeding disorders: disorders of platelet adhesion and aggregation / I. Ramasamy // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2004. -Vol. 49. -№ l.-P. 1-35.

126. Reed, G. L. Platelet secretory mechanisms / G. L. Reed //Semin. Thromb. Hemost. 2004. - Vol. 30. - № 4. - P. 441 - 450.

127. Reed, G. L. Molecular mechanisms of platelet exocytosis: insights into the "secrete" life of thrombocytes / G. L. Reed, M. L. Fitzgerald, J. Polgar // Blood. 2000. - Vol. 96. - № 10: - P. 3334 - 3342.

128. Rendu, F. The platelet release reaction: granules' constituents, secretion and functions / F. Rendu, B. Brohard-Bohn // Platelets. 2001. - Vol. 12. -№5.-P. 261 -273.

129. Robey, F. A. Synthesis and use of a new spin-labeled analogue of ADP with platelet-aggregating activity / F. A. Robey, G. A. Jamieson, J. B. Hunt // J. Biol. Chem. 1979. -Vol. 254. - № 4. - P. 1114 - 1118.

130. Rosado, J. A. A role for the actin cytoskeleton in the initiation and maintenance of store-mediated calcium entry in human platelets / J. A. Rosado,

131. S. O. Sage // Trends. Cardiovasc. Med. 2000. - Vol. 10. - № 8. - P. 327 -332.

132. Sato, T. N-ethylmaleimide inhibits Ca2+ influx induced by collagen or arachidonate on rabbit platelets / T. Sato, T. Hashizume, T. Fujii. // Bio-chim. Biophys. Acta. 1987. -Vol. 928. - № 3. - P. 266 - 271.

133. Savi, P. Effect of aspirin on platelet desaggregation induced by SR121566, a potent GP-IIb/IIIa antagonist / P. Savi, A. Bernat, A. Lale, C. Roque, G. Zamboni, J. M. Herbert // Platelets. 2000. - Vol. 11. - № 1. - P. 43 - 48.

134. Sergienko, V. I. Electrochemical methods of detoxication for medical use / V. I. Sergienko, Yu. B. Vasiliev // Harwood Academic Publishers GmbH. 1989. - 54 p.

135. Sexton, D. J. Platelet glutathione transport: characteristics and evidence for regulation by intraplatelet thiol status / D. J. Sexton, B. Mutus // Biochem. Cell. Biol. 1995. - Vol. 73. - № 3 - 4. - P. 155 - 162.

136. Siess, W. Molecular mechanisms of platelet activation / W. Siess // Physiol. Rev. 1989.-Vol. 69.-№ l.-P. 58- 178.

137. Siess, W. Prostaglandin endoperoxide analogues stimulate phospholipase C and protein phosphorylation during platelet shape change / W. Siess, B.

138. Boehlig, P. C. Weber, E. G. Lapetina // Blood. 1985. - Vol. 65. - № 5. -P. 1141 - 1148.

139. Silk, S. T. Arachidonic acid releasing activity in platelet membranes: effects of sulfhydry 1-modifying reagents / S. T. Silk, K. T. Wong, A. J. Marcus //Biochemistry. 1981. -Vol. 20. - № 2. - P. 391 - 397.

140. Simon, C. G. Jr. Membrane-destabilizing properties of C2-ceramide may be responsible for its ability to inhibit platelet aggregation / C. G. Jr. Simon, A. R. Gear // Biochemistry. 1998. - Vol. 37. - № 7. - P. 2059 -2069.

141. Skurnik, Y. D. Ticlopidine-induced cholestatic heaptitis / Y. D. Skurnik, A. Tcherniak, K. Edlan , Z. Sthoeger // Ann. Pharmacother. — 2003. Vol. 37.-№3.-P. 371 -375.

142. Sloan, D. C. Translocation of pleckstrin requires its phosphorrylation and newly formed ligands / D. C. Sloan, P.Wang, X. Bao, R. J. Haslam // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - Vol. 293. - № 1. - P. 640 -646.

143. Sollner, T. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion / T. Sollner, S. W. Whiteheart, M. Brunner, H. Erdjument-Bromage, S. Geromanos, P. Tempst, J. E. Rothman // Nature. 1993. - Vol. 362. - № 6418. -P. 318-324.

144. Spangenberg, P. Changes in the distribution and organization of platelet actin induced by diamide and its functional consequences / P. Spangenberg, U. Till, S. Gschmeissner, N. Crawford // Br. J. Haematol. 1987. -Vol. 67. - № 4. - P. 443 - 450.

145. Stevenson, D. D. Aspirin and NSAID sensitivity / D. D. Stevenson // Immunol. Allergy Clin. North Am. 2004. - Vol. 24. - № 3. - P. 491 -505.

146. Stone, J. V. Sulfhydryl analogues of adenosine diphosphate: chemical synthesis and activity as platelet-aggregating agents / J. V. Stone, R. K. Singh, H. Horak, P. G. Barton // Can. J. Biochem. 1976. - Vol. 54. - № 6. - P. 529-533.

147. Thomas, E. L. Oxidation of bromide by the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Formation of bromamines / E. L. Thomas, P. M. Bozeman, M. M. Jefferson, C. C. King // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 2906 - 2913.

148. Thomas, G. The influence of glutathione and other thiols on human platelet aggregation / G. Thomas, V. A. Skrinska, F. V. Lucas // Thromb. Res. -1986. Vol. 44. - № 6. - P. 859 - 866.

149. Tigyi, G. Physiological responses to lysophosphatidic acid and related glycerol-phospholipids / G. Tigyi // Prostaglandins Other Lipid Mediat. -2001. Vol. 64. - № 1 - 4. - P. 47 - 62.

150. Troxler, M. Platelet function and antiplatelet therapy / M. Troxler, K. Dickinson, S. Homer-Vanniasinkam // Br. J. Surg. 2007. - Vol. 94. - № 6. - P. 674 - 682.

151. Urbano, L. A. Antiplatelet drugs in ischemic stroke prevention: from monotherapy to combined treatment / L. A. Urbano, J. Bogousslavsky // Cerebrovasc. Dis. 2004. - Vol. 17 (Suppl 1). - P. 74 - 80.

152. Zijlstra, C. M. de Wit, I. L. Bonta // Prostaglandins Leukot. Med. 1984. -Vol. 16.-№3.-P. 279-283.

153. Volker, C. Prenylcysteine analogs to study function of carboxylmethyl-ation in signal transduction / C. Volker, M. H. Pillinger, M. R. Philips, J. B. Stock // Methods Enzymol. 1995. - Vol. 250. - P. 216 - 25.

154. Walker, N. E. Desensitization for the management of clopidogrel hypersensitivity: initial clinical experience / N. E. Walker, M. B. Fasano, P. A. Horwitz // J. Invasive Cardiol. 2006. - Vol. 18. - № 7. - P. 341 - 344.

155. Weiss, S. J. Phagocyte-generated oxygen metabolites and cellular injury / S. J. Weiss, A. F. LoBuglio // Lab. Invest. 1982.-Vol. 47.-№l.- P. 5 - 18.

156. Weyrich, A. Platelets in atherothrombosis: new and evolving roles / A. Weyrich, F. Cipollone, A. Mezzetti, G. Zimmerman // Curr. Pharm. Des. -2007.-Vol. 13.-№ 16.-P. 1685 1691.

157. White, WB. Cardiovascular effects of the selective cyclooxygenase-2 inhibitors / W. B. White // Subcell. Biochem. 2007. - Vol. 42. - P. 145 - 158.

158. Yamada, K. Involvement of disulfide-sulfhydryl interaction in anti-platelet actions of KF4939 / K. Yamada, K. Kubo, K. Shuto, N. Nakamizo // Thromb. Res. 1985. - Vol. 38. -№ 1. - P. 61 - 69.

159. Yoshioka, A. Identification of Protein Kinase Calpha as an Essential, but Not Sufficient, Cytosolic Factor for Ca2+-induced alpha- and Densecore Granule Secretion in Platelets / A. Yoshioka, R. Shirakawa, H. Nishioka,

160. A. Tabuchi, T. Higashi, H. Ozaki, A.Yamamoto, T. Kita and H. Horiuchi // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276 (Issue 42). - P. 39379 - 39385.

161. Zbikowska, H. M. Response of human blood platelet membrane to sodium selenite / H. M. Zbikowska, K. Gwozdzinski, W. Wachowicz, T. Kraj-ewski // J. Physiol. Pharmacol. 1999. - Vol. 50. - № 3. - P. 455 - 462.

162. Zgliczynski, J. M. Chloramines as intermediates of oxidation reaction of amino acids by myeloperoxidase / J. M. Zgliczynski, T. Stelmaszynska, J. Domanski, W. Ostrowski // Biochim. Biophys. Acta. 1971. - Vol. 235. -№3.-P. 419-424.

Информация о работе

Савельева, Екатерина Леонидовна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Механизм угнетения начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы