Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека

Панасенко, Олег Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Научно-исследовательский институт физико-химической медицины

■ , ц ^ ^

На правах рукописи

ПАНАСЕНКО Олег Михайлович

ГИПОХЛОРИТ И ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Специальность: 03.00.02 - биофизика 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в отделе биофизики НИИ физико-химической медицины Минздрава России; в Институте медицинской физики и биофизики Лейпцигского университета (Германия); в Институте физиологической химии 1 Дюссельдорфского университета им. Генриха Гейне (Германия).

Научные консультанты: академик РАМН, профессор Владимиров Ю.А.,

доктор медицинских наук, профессор Сергиенко В.И.

Официальные оппоненты: академик РАМН, профессор Арчаков А.И.,

доктор биологических наук, профессор Ланкин В.З., доктор биологических наук, профессор Потапенко А.Я.,

Ведущее учреждение: Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится "28" декабря 1998 г. в Ю00 часов на заседании Специализированного Совета Д.084.66.01 при НИИ физико-химической медицины Минздрава России по адресу: 119828, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины Минздрава России

Автореферат разослан "27" ноября 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук

Мурина М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В 80-х годах на основании ряда экспериментальных фактов (Fogelman et al., 1980; Heinecke et al., 1984-1987; Esterbauer et al., 1987; Steinberg et al., 19811988) сформировалась научная гипотеза, согласно которой липопротеины (ЛП), являющиеся основной транспортной формой липидов в крови, претерпевают модификацию в результате интенсификации радикальных реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Такая модификация ЛП низкой плотности (ЛНП) приводит к тому, что они эффективно поглощаются клетками сосудистой стенки, трансформируя их в пенистые клетки, характеризующиеся избыточным содержанием холестерина и являющиеся важным признаком ранних стадий атеросклероза. В 1988 г. Avogaro с сотр. удалось впервые изолировать подфракцию окисленных ЛНП из крови человека. Однако, причины появления окисленных ЛП в крови оставались неизвестными. Среди обсуждаемых в литературе возможностей наиболее вероятной можно считать взаимодействие нативных ЛП с активными формами кислорода Г02-, Н202, 'ОН), которые продуцируются клетками сосудистой стенки (гладкомышечными, эндотепиапьными, макрофагами) при активации (Steinbrecher et al., 1984-1988; Hinsbergh et al., 1986, 1987; Heinecke et al., 1986; Parthasarathy eta!., 1986). С этой точки зрения особого внимания заслуживают моноциты и нейтрофилы. Во-первых, их содержание в крови весьма

велико (нейтрофилов - 2,8-4,5*10° в 1 л; моноцитов - 1,3-6,0*10® в 1 л). Во-вторых, эти клетки >

способны в результате активации фермента NADPH-оксидазы, согласно схеме, изображенной на рис. 1, генерировать не только активные формы кислорода, но и секретировать фермент - миелопероксидазу (МПО, донор: Н202-оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.7.), который катализирует образование сильного окислителя - хлорноватистой кислоты [HOCI) или ее ионизированной формы - гипохпорит-аниона (ОСГ) по реакции (Klebanoff and Dlark, 1978; Weiss et al„ 1982):

СГ + H* + H202-> HOCI + H20, (1)

Эднако известно (Каган с соавт., 1986; Клебанов с. соавт., 1988), что "02" и Н202 являются :лабыми окислителями и сами по себе не способны инициировать ПОЛ. 'ОН-радикал <резвычайно реактивен, но его участие в инициировании ПОЛ и модификации ЛП фагоцитами i ряде работ ставится под сомнение (Hiramatsu etal., 1987; Janzen et al., 1987; Cohen etal.,

NADPH оксидаза сод Миелопарокоидаза

0,-7-^0;->■ H,0„->|HOCI/OCi:

'2 С ^ ~ 1 2 2

NADPH NA OP

'О,

Рис. 1. Пути превращения активных форм кислорода в результате активации юйтрофилов или моноцитов (Edwards, 1994).

1988). 8 таком случае, принимая во внимание схему превращения активных форм кислоро; представленную на рис. 1, логично предположить, что важная роль в окислении ЛП присутствии фагоцитов может принадлежать гипохлориту. л

К началу работы в литературе отсутствовали данные о существовании окислительн деструкции ЛП крови гипохлоритом или в присутствии МПО. Однако имелись косвенн указания в пользу возможности такой модификации. Фермент МПО весьма стоек (Шафр; 1981), его содержание в нейтрофилах чрезвычайно велико: до 5% сухого веса клетки (Schi. and Kaminver, 1962). Более 20% фермента стимулированные нейтрофилы секретируют внеклеточную среду (Smith et al, 1985). Около трети всего кислорода, потребляемс нейтрофиламй при активации затрачивается на образование НОСЮСГ (Foote et al., 198 При взаимодействии гипохлорита с Н202 образуется синглетный кислород (см. рис. 1] инициатор ПОЛ (Ргуог, 1978). Было установлено (Kettle and Winterbourn, 1988), что определенных условиях "02" может служить наряду с Н202 субстратом для МПО. При эт образуется все тот же гипохпорит. НОС1/ОСГ модифицирует низкомолекулярм антиоксиданты в составе ЛП (Albrich et al., 1981), а также ряд ферментов (СОД, катала глутатионпероксидазу) и белков плазмы (церулоплазмин, трансферрин), обладают антиокислительной функцией (Aruoma and Halliwell, 1987; Шаронов с соавт,, 1988-199 Внутривенное введение экспериментальным животным метионина - эффективнс перехватчика гипохлорита - в условиях активации нейтрофилов крови предотвраща аккумуляцию продуктов ПОЛ в сыворотке и сердечной ткани (Prasad et al., 1991).

Итак, совокупность экспериментальных фактов, накопившихся к концу 80-х год< позволила нам предположить возможное участие гипохлорита, продуцируемого при аетиваи нейтрофилов или моноцитов по реакции, катализируемой МПО, в окислительн модификации ЛП крови человека.

Цель работы: изучить механизм модификации физико-химических свой* лилопротеинов крови человека гипохлоритом, выявить изменение основных биологичес» функций у таких ЛП и определить их возможную причастность к формированию рань проявлений атеросклеротического процесса.

Для достижения поставленной цели были сформулировали следующие задачи:

1. Исследовать закономерности окисления лилопротеинов клетками крс (нейтрофилами и моноцитами) и определить возможность активации этих клеток п взаимодействии с окисленными липопротеинами.

2. Провести всестороннее изучение модификации физико-химических свойств ЛП г их окислении гипохлоритом или в системе "миелопероксидаза + Нг02 + СР.

3. Выяснить, обладают ли ЛП, модифицированные гипохлоритом, теми свойства» которые характерны для ЛП при атеросклерозе: способностью аккумулировать холестери! клетках крови и стимулировать адгезию клеток крови к эндотелию.

4. Исследовать возможное участие нитрита в гипохлорит-индуцированном перекиси окислении липидов и в модификации ЛП гипохлоритом.

5. Исследовать кинетику и механизм реакции гипохлорита с ненасыщенными связями свободных жирных кислот и фосфолипидов.

6. На упрощенной модельной системе - фосфатидипхопиноеых липосомах - изучить механизм ПОЛ, индуцированного гипохлоритом.

Научная новизна работы. В диссертационной работе впервые подробно исследована кинетика взаимодействия гипохлорита с двойными связями свободных жирных кислот и жирнокислотных цепей фосфатмдилхолина. Показано, что основной реакцией гипохлорита с ненасыщенными жирнокислотными цепями является злектрофильное присоединение по двойной связи (по молекулярному механизму) со стехиометрическим соотношением, изменяющимся от 2 до 1 по мере увеличения общей концентрации двойных связей в пипосомах и числа двойных связей в одной жирнокислотной цепи. Основным продуктом зеакции является хлоргидрин. Предложен механизм взаимодействия гипохлорита с «насыщенными связями ацильных цепей фосфолилида в липидной фазе.

Впервые продемонстрировано, что гипохлорит, который образуется при активации гёйтрофилов или моноцитов по реакции, катализируемой МПО, помимо элекгрофипьного фисоединения по двойной связи индуцирует в ненасыщенном липиде радикальные реакции ЮЛ. Это приводит к образованию в фосфолипидных липосомах или ЛП первичных липопероксидов, диеновых конъюгатов), вторичных (ТБК-реактивных продуктов) и конечных флуоресцирующих) продуктов ПОЛ. Исследован механизм инициирования гипохлорит->посредованного ПОЛ. Показано, что стадия инициирования ПОЛ в; присутствии гипохлорита экзогенного или продуцируемого в системе "МПО + Н202 +■ СР) может быть реализована ¡лагодаря его реакции с органическими гидропероксидами, всегда присутствующими в ^котором количестве в ненасыщенном липиде. В ходе этой реакции образуются свободные >здикалы, вероятнее всего апкоксипьные, являющиеся эффективными инициаторами ПОЛ.

Впервые исследована роль ионов железа в гипохлорит-индуцированном ПОЛ. 'сггановлено, что гипохлорит реагирует с Ре2* с бимолекулярной константой скорости 114 ± 7 Т'с'1 {рН 7,2) с образованием свободных радикалов. Однако, ни Рег\ ни Яе3* не принимают частия в стадии инициирования гипохлорит-индуцированного ПОЛ, по крайней мере в словиях нашего эксперимента. Тем не менее, Регионы участвуют в разветвлении цепей кисления, стимулируя таким образом гипохлорит-индуцированное ПОЛ.

Изучено изменение физико-химических свойств ЛП под действием гипохлорита. 1оказано, что гипохлорит разрушает в ЛНП липидорастворимые антиокисданты: а-токоферол, аротиноиды. Это снижает резистентность ЛП к пероксидации. Сравнительный анализ оказал, что по эффективности перехватывать гипохлорит каротиноиды расположились в педующей последовательности: транс-ликопин к 5-цис-ликопин > а-каротин > р-каротин > эаксантин > а-криптоксантин > цис-2',3'-ангидролютеин > р-криптоксантин > транс-2',3'-нгидролютеин > лютеин.

С использованием метода ЭПР спиновых зондов и меток установлено, что гипохлорит, эоникая в поверхностный протеолипидный слой ЛНП, уменьшает подвижность и увеличивает

полярность ацильных цепей фосфолипидов вплоть до 12-ого С-атома, а также увеличива* долю белка с более подвижными ЭН-группами. Это сопровождается увеличение отрицательного потенциала поверхности ЯП.

Показано, что нитрит - физиологический метаболит "ЫО; продуцируемого клеткал крови и сосудистой стенки, реагирует с гипохлоритом с бимолекулярной константой скорос (7,4 ± 1,3)-10э М'с"1 (рН 7,2). В ходе этой реакции образуется реактивный короткоживущ! интермедиат, который эффективнее гипохлорита разрушает антиоксиданты (а-токоферол и каротин) в ЛНП; увеличивает чувствительность ЛНП к пероксидации; интенсивнее гипохлори инициирует ПОЛ в ЛНП. Помимо этого он модифицирует аполипопротеин-В, нитруя остат тирозина. Модифицированные таким образом ЛНП трансформируют макрофагальные клет в клетки, подобные пенистым.

Изменение физико-химических свойств ЯП приводит к нарушению их функц^ Предварительно окисленные ЛНП (в. результате автоокиспения или под действи< гипохлорита) эффективнее транспортируют холестерин в клетки, как содержащие (моноцит макрофаги), так и не содержащие (эритроциты) специфические рецепторы к Л Пероксидация лишает ЛВП холестерин-акцепторной функции. Оба факта способству! аккумуляции холестерина в клетках.

Гипохлорит в физиологических концентрациях стимулирует адгезию эритроцитов монослою эндотелиальных клеток и вызывает аккумуляцию холестерина е эндотелиоцит; воздействуя на эндотелий непосредственно или опосредованно через модификацию ЛНП.

ЯП, модифицированные гипохлоритом или в результате автоокисления, вызыва! активацию моноцитов и нейтрофилов, способствуя дополнительному образован! инициаторов свободнорадикальных реакций (в том числе гипохлорита), а значит дальнейшей интенсификации реакций ПОЛ.

Практическая значимость работы. Работа является фундаментальм исследованием. Тем не менее, отдельные ее положения имеют прямое практическ приложение. Так, было установлено, что диета, одновременно обогащенн липидорастворимым (а-токоферол) и водорастворимым (карнозин) антиоксидантаи обладает выраженным гипохолестеринэмическим эффектом при экспериментальн атеросклерозе, уменьшает степень поражения аорты, способствует снижению урое продуктов ПОЛ не только в сыворотке и апо-8-содержащих ЛП, но и предотвращу окисление последних на стадии синтеза в печени и может быть рекомендована р профилактики и лечения атеросклероза.

Экспериментальное обоснование участия гипохлорита,. образующегося в организ при активации нейтрофилов и моноцитов, в модификации физико-химических свойств крови, нарушении их функции и, как следствие, в формировании ранних стадий атеросклер< вносит существенный вклад в понимание теории атерогенеза, разработку сред! профилактики и лечения этого заболевания. Полученные в работе данные слу> теоретическим обоснованием использования антиоксидантов, перехватчиков гипохлорит;

ингибиторов МПО на определенных стадиях развития атеросклероза, а также других заболеваний, где активированные нейтрофилы и иные источники МПО играют существенную роль (ревматоидный артрит, воспалительные процессы и др.).

Показано, что ликопин, до сих пор известный как самый эффективный из каротиноидов тушитель синглетного кислорода, перехватчик свободных радикалов и ингибитор ПОЛ, оказался и наиболее эффективным перехватчиком гипохлорита и, исходя из этого, может быть рекомендован в качестве основы для создания нового класса антиокислительных фармакологических препаратов.

Использованные в работе модельные системы: изолированные нейтрофилы, "МПО + Н202 + СГ" или гипохлорит могут быть рекомендованы для внедрения в практику с целью разработки тестов, направленных на скрининг потенциальных перехватчиков гипохлорита или ингибиторов МПО.

Разработанный в диссертации методический подход регистрации остаточной концентрации гипохлорита по хемилюминесценции люминола может быть применен для изучения кинетических закономерностей реакций гипохлорита с другими физиологически важными молекулами или белок-липидными комплексами.

Продукты реакции гипохлорита с ненасыщенными липидами (хлоргидрины гпиколей), образующиеся от vivo, могут быть использованы в диагностических и прикладных биохимических исследованиях в качестве маркеров модификации липидной фазы ЯП и биомембран гипохпоритом. Их регистрация в ЛП или сосудистой стенке может послужить дополнительным критерием в диагностике ранних стадий атеросклероза.

В последнее время гипохлорит, полученный электрохимическим путем, используется внутривенно в клинике в качестве бактерицидного и детоксицирующего агента при перитонитах, остром панкреатите, тяжелых ожогах, отравлениях и других патологиях (Сергиенко с соавт., 1985-1995). Результаты проведенного в работе всестороннего исследования механизма взаимодействия гипохлорита с ЛП послужили теоретической основой оптимизации применения на практике метода непрямого электрохимического зкисления крови. Отдельные разделы диссертации вошли как составная часть в работу: 'Разработка и внедрение электрохимических методов детоксикации в медицине", удостоенную з 1996 г. премии Правительства Российской Федерации.

Некоторые разделы работы используются в учебном процессе на медико-эиологическом факультете РГМУ им. Н.И. Пирогова и на факультете фундаментальной иедицины МГУ им. М.В. Ломоносова, вошли в монографии Владимирова Ю.А. с соавт. Свободные радикалы в живых системах" (ВИНИТИ, Москва, 1991) и Жданова Р.И., Комарова VM. "Модельные и биологические мембраны в методе спиновых меток и зондов" (ВИНИТИ, Иосква, 1989) и могут быть использованы в научных исследованиях, проводимых в институтах зиохимического, биофизического, токсикологического и медико-биологического профиля.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: 4-м Всесоюзном :импозиуме по биохимии пипидов (Киев, 1983); 4-й Международной конференции

"Применение ЭПР-спектроскопии в молекулярной биологии и медицине" (Эберсвагн Германия, 1984); Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медициь (Звенигород, 1985, 1989, 1990, 1996; Одесса, 1986); 4-й Всесоюзной конференции патологии клетки (Москва, 1987); конференции научно-координационного совещан экспертов стран-членов СЭВ и СФРЮ "Биофизика мембран. Прикладные аспекты" (Моем 1987); 6-м Международном симпозиуме "ЭПР-спектроскопия в биохимии, молекулярн биологии и медицине" (Братислава, Словакия, 1988); заседании Координационного Сове проблемного научного центра по физико-химической медицине, биофизике и иммунолог (Конаково, 1988); Всесоюзной конференции "Кислородные радикалы в химии, биологии медицине" (Юрмала, 1989; Минск, 1992; Киев, 1995); Международной конференции нитроксильным радикалам (Новосибирск, 1989); 3-й Всесоюзной конференц "Биоантиоксидант" (Москва, 1989); 4-м Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 198 5-м Конгрессе Международного свободнорадикального научного общества (Пасаде! Калифорния, США, 1990); Всемирном конгрессе патофизиологов (Москва, 199 Международном симпозиуме "Кислородные радикалы" (Санкт-Петербург, 1991); Всесоюзн конференции "Электрохимические методы в медицине" (Дагомыс, 1991); Международн конференции по критическим аспектам свободных радикалов в химии, биохимии и медици (Вена, Австрия, 1993); 1- и 2-й Международных конференциях по кпиническ хемилюминесценции (Берлин, Германия, 1994, 1996); 8-м Международном симпозиу "Липопротеины и атеросклероз" (Дрезден, Германия, 1994); 5-, 6- 7- и 9-й Международн конференциях по липидам (Лейпциг, Германия, 1994, 1995, 1996, 1998); Международн конференции "Свободные радикалы в норме и патологии" (Киев, 1995); Европейском съез клеточных биологов (Гайдельберг, Германия, 1995); симпозиуме "Липопротеины атеросклероз" (Санкт-Петербург, 1995); Международной конференции "Окислительный crpei Молекулярные механизмы и патофизиологические последствия окислительного повреяеден мембран и липопротеинов" (Грац, Австрия, 1996); ежегодном съезде цитологов Герман (Галле, Германия, 1997); сьезде общества биохимиков и молекулярных биологоа Герман (Тюбинген, Германия, 1997); Международной конференции "Гипохлорит - метабог нейтрофилов" (Лейпциг, Германия, 1998); Международной конференции "Пероксида: биохимические и клинические аспекты" (Фрауенхимзее, Германия, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 72 научные работы центральных академических, медицинских и международных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо литературы, главы "Материалы и методы", трех глав с результатами эксперимент! заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на ст содержит 28 таблиц, проиллюстрирована 137 рисунками и схемами. Библиография включг 423 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

■ЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрены пути образования гипохлорита in vivo, его физихо-:имические свойства, реакции с физиологически важными соединениями, в том числе с ¡елками и липидами. Последний раздел обзора посвящен свойствам окисленных ЛП, озможным путям их появления в кровотоке и роли в развитии ранних стадий атеросклероза. 1аканчивается обзор постановкой цели и задач исследования.

ЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. ЛП выделяли из сыворотки крови человека методом реларатианого ультрацентрифугирования в растворах NaBr определенной плотности Jndgren, 1975), Нейтрофилы изолировали, принимая за основу методику, описанную Boyum 1968). Моноциты выделяли по методике Хейфец и Абалакина (1973) с некоторыми юдификациями. Эритроциты изолировали из свежей донорской крови путем 3-кратного ентрифугироеания в 10-кратном избытке 145 мМ (vlaCI, 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, ри 400 g в течение 10 мин. Гемоглобин и гаптоглобин выделяли из крови здоровых доноров о методикам, описанным соответственно Antonini and Brunori (1971) и Осиповым с соавт. I997). Многослойные липосомы формировали из фосфолипидоа или их смеси с жирными ^слотами (или холестерином) в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 145 мМ аС1, путем интенсивного механического перемешивания при комнатной температуре в гчение 30 с сухой пленки липидов, полученной выпариванием под вакуумом их раствора в юроформе. УЗ-липосомы получали при комнатной температуре путем ультразвуковой зработки многослойных липосом. Большие монопамелпярные везикулы формировали из ногоспойных липосом методом последовательной экструзии (Hope et а!., 1985). едропероксид линолевой кислоты получали ферментативно, окисляя линолевую кислоту в эисутствии липоксидазы (ФК 1.13.11.12) при рН 9.0 (Maiorino et al., 1990).

Автоокисление ЛП или липосом проводили путем их инкубации с доступом воздуха при >стоянном легком перемешивании в течение нескольких часов при 37°С. Для окисления в ютеме "Fe2* + аскорбат" липосомы инкубировали в присутствии 10 мкМ Fe2* и 0,8 мМ жорбата при 37°С. Модификацию ЛП или липосом гипохлоритом проводили путем их жубации в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 145 мМ NaCI, при комнатной мпературе или при 37°С. Для окисления ЛП в присутствии нейтрофилов или моноцитов етки (0,1-0,5 млн./мл) инкубировали с ЛП (0,17-0,25 мг фосфолипидов/мл) при 37°С в чение 3-3,5 ч в среде Хенкса (рН 7,4).

Условия проведения экспериментов. МПО (0,07-0,2 ед./мл) инкубировали с шосомами при комнатной температуре и постоянном перемешивании в среде, содержащей !-250 мкМ Н202, 145 мМ NaCI, 10 мМ фосфатного буфера (рН 6,0). Инкубацию заканчивали давлением 2 мМ бутилированного гидрокситолуола (ВНТ, ионол). Контрольные :перименты проводили в отсутствие одного из субстратов МПО (Н202 или СГ).

Гемоглобин (40 мкМ) преинкубировали с гипохлоритом 30 мин при 37°С в 10 мМ

фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 145 мМ №С1, затем добавляли ЛНП (конечн концентрация 0,4 мг белка/мл) и продолжали инкубацию в тех же условиях в течение 60 м Интенсивность окислительной модификации ЛНП оценивали по содержанию в них Т! реактивных продуктов (ТБКРП). ■ 1Г' '

Эритроциты инкубировали С ЛП в течение 4-5 при 37°С. Инкубационная ■ прс содержала 145 мМ ЫаС1, 10 мМ трис-НС!-буфер, рН 7,4, ЧСА (20 мг/мл), эритроциты -млн./мкл, ЛП (0,2-0,8 мг фосфолипидов/мл).

Моноциты инкубировали с ЛП при 37°С в течение 4 ч в среде 199, содержащей 5 об аутологичной сыворотки, ЛНП (0,4-0,7 мг фосфолипидов/мл), а также антибиоз (пенициллин -50 ед./мл и стрептомицин - 50 ед./мл).

Культуру ¿774.2 макрофагов (получена в ЕСАСС № 85011428) инкубировали с ЛНГ среде Хенкса в течение 2, 4 или 6 ч при 37°С. Конечная концентрация ЛНП - 0,2 мг белка/мл Обработку монослоев эндотелиальных клеток (получали в Институте диаб< университета г. Дюссельдорфа, Германия) гипохлоритом (25, 50 или 100 мкМ) проводил! среде ОМЕМ (модифицированная Дульбекко среда Игла) (рН 7,4) в атмосфере С02 (5%) течение 15 мин при 37°С. По окончании инкубации клетки промывали трижды средой ОМ (рН 7,4) и оставляли на 18 часов в этой среде в атмосфере С02 (5%) при 37°С. После эр монослои эндотелия использовали для исследования адгезии эритроцитов. Преинкубац монослоев эндотелиальных клеток (ЭК) с ЛНП осуществляли в аналогичных условия) течение 18 ч при 37°С. Концентрация ЛП в инкубационной среде составляла 0,15 мг белка/| По окончании инкубации клетки промывали трижды средой ОМЕМ, одну часть использовали для исследования адгезии эритроцитов, в другой определяли молы отношение холестерин/фосфолипиды.

Адгезию эритроцитов к монослою ЭК исследовали с использованием проточ! камеры (АгШпапп, 1995). Для этого ЭК, культивируемые на предметном стекле микроскоп течение 4-5 суток и прошедшие необходимую предварительную обработку гипохлоритом I ЛНП, модифицированными гипохлоритом (НОС1-ЛНП), помещали в проточную камеру, на I наслаивали 20 мкл суспензии эритроцитов в среде ОМЕМ (гематокрит 30%) и оставляли на мин в контакте с монослоем ЭК. Далее в течение 5 мин неадгезированные эритрощ смывали с эндотелия потоком среды ОМЕМ (рН 7,4, 37°С), подаваемым в камеру I постоянным давлением 0,2 Па. Количество эритроцитов, адгезированных к поверхно эндотелия, определяли при помощи системы изображения, включающей в себя микроско компьютерное обеспечение.

Перфузию печени кроликов контрольной и опытных групп проводили, не выделяя ее брюшной полости, по известной методике (Лопухин, 1971).

Методы анализа. В ЛП и липосомах определяли продукты ПОЛ: ТБК-реактив| продукты (Панасенко с соавт., 1996), гидропероксиды липидов (Е1-Баас1ап1 е{ а!., 19; диеновые конъюгаты (Панасенко с соавт., 1996), флюоресцирующие продукты (Я.в=360 нм, 430 нм) (Рапавепко е1 а)., 1994). Резистентность ЛНП к пероксидации определяли

методике Esterbauer et al. (1989). Общее число двойных связей в фосфолипиде оценивали иодометрически (Панасенко с соавт., 1996), а также методом 1Н-ЯМР на спектрометре АМХ-NMR (Bruker, Германия) при 300,13 МГц, используя для анализа резонансы при 5,33 м.д. (протоны при двойной связи -НС=СН-) и 2,78 м.д. (протоны бис-аллильной метипеновой группы =СН-СН2-СН=), Содержание фосфолипидов определяли по липидному фосфору (Vaskovsky et al., 1975), холестерина - энзиматически при помощи тест-набора (Sigma, США) или по реакции Либермана-Бурхарда (Abell et al., 1952). Эфиры холестерина анализировали методом ВЭЖХ на колонке 250x4 Nucleosil С<8, 5 мкм (Macherey-Nagel, ФРГ), детектируя при 210 нм (детектор Gilson UV-116). Каротиноиды и ксантофиллы определяли в экстрактах ЛНП методом ВЭЖХ на колонке Suplex рКЬ 100 (250 х 4,6 мм), 5 мкм (Supelco, Bellefonte, РА, США) с предколонкой Suplex рКЬ 1QQ (20 х 4,6 мм), 5 мкм (Supelco, Bellefonte, РА, США) (Stahl and Síes, 1994). p-Каротин анализировали на колонке 4,6x150 мм Capcell Рак Cis (Shiseido, Япония). Детектирование производили слектрофотометрически при 450 нм. Элюент - смесь метанол/ацетонитрил/2-пропанол (54/44/2 по об.). a-Токоферол определяли на той же колонке, используя флуоресцентный детектор (Merck-Hitachi, X. =290 нм, Яф =330 нм). Мобильная фаза - ацетонитрил/2-пропаиол (4/1 по об.). Скорость элюирования во всех :лучаях была 1 мл/мин. Нитрит и нитрат определяли с использованием реактива Грисса. Для определении нитрата его предварительно восстанавливали нитратредуктазой (Verdón et al., 1995). Хлорирующую активность МПО контролировали по методу, описанному Kettle and /Vinterbourn (1994), который основан на регистрации в присутствии 5-тио-2-нитробензойной сислоты хлорамина таурина, образующегося в реакции гипохлорита с таурином. Продукцию О/ моноцитами оценивали по восстановлению цитохрома С согласно методу (Babior et al., 1973). З-Нитротирозин в ЛНП определяли иммунохимически с применением моноклональных жтител (Panasenko et al., 1997). Электрофоретическую подвижность ЛП в 0,5% гело агарозы тределяли с использованием системы Paragon (Beckman, США). Собственную флуоресценцию ЛП измеряли на спекгрофлуориметре F-4000 (Hitachi, Япония) в 'льтрафиолетовой (Я., = 285 нм, Хф =340 в нм) и видимой (л, =360 нм, Хф =430 нм) областях :пектра. Продукты реакции гипохлорита с гидропероксидами регистрировали методом 'Н-ЯМР ia AMX-NMR-спектрометре (Bruker, Германия) при 300,13 МГц. Ре2*-индуцированную :емилюминесценцию изучали с помощью установки, блок-схема которой описана !падимировым и Арчаковым (1972). Люминол-зависимую хемилюминесценцию клеток и ипохлорита регистрировали на люминометре AutoLumat LB 935 (Berthotd, ФРГ) (Панасенко с оавт., 1995). Мономольную эмиссию 102 регистрировали в инфракрасной области (1270 нм) ри 37°С с использованием детектора на основе германиевого фотодиода, охлаждаемого до емпературы жидкого азота (Di Mascio et al., 1994). Кинетику быстрых реакций гипохлорита с итритом или с K«Fe(CN)6 регистрировали на спектрофотометре Sigma-2WS11 (Sigrna istrumente, Германия), снабженном специальной приставкой для осуществления метода становленной струи (stopped-flow).

Спектры ЭПР спинмеченых ПП регистрировали на радиоспектрометрах JES-FE2XG

(Jeol, Япония), E-4 (Vanan, США) или ER-420 (Bruker, ФРГ) при 20 или 37°С в режим мощность СВЧ-излучения 10 мВт, частота ВЧ-модуляции 100 кГц, амплитуда ВЧ-модулящ 0,1 мТ, скорость развертки магнитного поля 2,5 мТ/мин при постоянной времени 0,3 с. качестве спиновых зондов для исследования липидной фазы ЛП использова) парамагнитные аналоги стеариновой кислоты с радикальным фрагментом у 5-, 12- и 16-го i атома: 5-, 12- и 16-доксилсгеарат (Sigma, США), а также спиновый зонд С0, нитроксильнь фрагмент которого локализован в ЛП на поверхности в области полярных rpyi фосфолипидов. Структуру аполипопротеинов изучали с использованием спиновой метки -малеимидо-проксила (Sigma, США). Для определения потенциала поверхности частицы Г использовали парамагнитные ионы Мпг+, а также положительно заряженный спиновый зо! октадекан-7-спиро-2'-(М-оксил-4,,5',5'-триметил-Дэ-имидазолин)-триметиламмония метансул фонат (Борин с соавт., 1984).

Статистическую обработку данных производили с использованием t-критер! Стьюдента. На рисунках и в таблицах приведены рассчитанные средние арифметичесю значения измерений и их срсздние квадратичные ошибки.

ГЛАВА 3. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ПОЯВЛЕНИЯ ОКИСЛЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ В КРОВИ

Анализ данных литературы позволяет заключить, что помимо прямого поступлем окисленных липидов с пищей, может существовать по крайней мере еще две возможное появления в крови ЛП, модифицированных в результате пероксидации: 1) синтез и секрец! клетками печени наряду с нативными и окисленных ЛП очень низкой плотности (ЛОНГ 2) окислительная модификация ЛП в результате их взаимодействия с активными форма» кислорода, генерируемыми стимулированными клетками крови и сосудистой стенки.

3.1. Синтез и секреция окисленных липопротеинов клетками печени. Что касает первой из указанных выше причин, то в литературе до последнего времени отсутствова: прямые доказательства ее существования. Однако имелись косвенные данные, указывающ! на возможность синтеза и секреции клетками печени в условиях гиперхолестеринем! липопротеинов, содержащих липопероксиды (Ланкин с соавт., 1976-1980).

Содержание опытных кроликов на атерогенной диете в наших эксперимент сопровождалось выраженной гиперхолестеринемией по сравнению с кроликами контроль» группы. Морфометрический анализ показал, что 52,9±9,9% поверхности аорты подопытн! кроликов подвержены атеросклеротическому поражению. Одновременно увеличивало содержание продуктов ПОЛ в сыворотке (в 2 раза) и гомогенате печени (в 1,5 раза). Важны однако, является тот факт, что увеличение концентрации продуктов ПОЛ в значительн степени происходило именно в апо-В содержащих ЛП (в 60 раз, тогда как в сыворотке - толь в 2 раза).

Одна из главных функций клеток печени - синтез и секреция ЛОНП. Поскольку ПОЛ нарушает секрецию ЛП гепатоцитами (Dianzani et al., 1981), то вполне логично предположи что при гиперхолестеринемии, когда активируются процессы ПОЛ в печени, гепатоци должны синтезировать и сехретировать в кровь ЛП с повышенным содержани.

1Нпопероксидов. Для выяснения этого вопроса мы перфузировали печень кроликов, >пределяя в перфуэате, а также в изолированной из него фракции ЯП (е)<1,065 г/см3) удержание продуктов ПОЛ. Из табл. ,1 видно, что в перфузате подопытных кроликов »держание ТБКРП а 3,5 раза выше, чем в перфузате интактных кроликов. Анализ уровня |родуктов ПОЛ в изолированной из перфузата фракции ЛП показал, что кролики с тиментарным атеросклерозом содержат в ЛП, секретируемых печенью, в 2 раза больше [родуктов ПОЛ, чем кролики контрольной группы (табл. 1).

Таблица 1.

Содержание продуктов ПОЛ в перфузате и изолированных из него ЛП (с)<1,065 г/см3) кроликов онтрольной группы и. при экспериментальном атеросклерозе. Влияние диеты, обогащенной мтиоксидантами на уровень ТБКРП у экспериментальных животных.

Группа животных Перфузат, Липопротеины,

нмоль ТБКРП/г белка нмоль ТБКРП/г белка

Лнтактные кролики 4 ±3 53 ±24

Чтеросклероз 14 ±6 108 ±10

х-токоферол + карнозин 2 ± 1 20 ±6

- Таким образом,;! нам впервые удалось экспериментально подтвердить ранее ущестеовавшее предположение о том, что печень животных при атеросклерозе синтезирует секретирует ЛП с повышенным содержанием продуктов ПОЛ, то есть окисленные ЛП. Этот роцесс может играть важную роль в аккумуляции модифицированных ЛП в крови, юсобствуя развитию атеросклеротического перерождения клеток крови и сосудистой стенки.

Применение нами 30-дневного курса диеты, обогащенной антиоксидантами 1ИПидорастворимый а-токоферол и водорастворимый карнозин по 2,5 и 50 мг/кг в день ответственно) в составе кукурузного масла приводило к снижению содержания продуктов ОЛ в гомогенате печени, в сыворотке и особенно в апо-В-содержащих ЛП. Одновременно аблюдался гипохолестеринемический эффект с сокращением площади поражения аорты в 5-10 раз. Более того, присутствие в диете антиоксидантов достоверно снижало уровень юдукгов ПОЛ как в перфузате, так и в ЛП, секретируемых печенью в период ее 30-мин ¡рфузии (табл. 1). Эти результаты дают основание заключить, что диета, обогащенная ггиоксидантами, способствует снижению продуктов ПОЛ не только в сыворотке и апо-В-щержащих ЛП, но и предотвращает окисление последних на стадии синтеза в печени и эжет быть рекомендована для профилактики и лечения атеросклероза.

3.2. Окисление липопротеинов в кровотоке. Другой возможный путь появления исленных ЛП в крови - их окислительная модификация активными формами кислорода, нерируемыми стимулированными клетками крови и сосудистой стенки. Наше внимание ивлекли клетки, секретирующие при активации МПО: моноциты и нейтрофилы.

Инкубация как моноцитов, так и нейтрофипов в присутствии ЛНП приводила к

аккумуляции продуктов ПОЛ (табл. 2). Причем прирост ТБКРП был выражен в значитель большей степени, чем это можно было ожидать, исходя из предположения об отсутств взаимного влияния ЛНП и клеток в период инкубации. Видимо, окисление ЛНП при инкубац вызывает активацию моноцитов и нейтрофилов. Это, в свою очередь, сопровождает генерацией активных форм кислорода и способствует интенсификации процессов ПОЛ. ,.■■■:

Таблица

Накопление ТБКРП за время инкубации ЛНП в присутствии или в отсутствие моноцитов и нейтрофилов.

Инкубируемые компоненты ТБКРП, нмоль/л

до инкубации после инкубации

Моноциты 1 ±2 2 + 3

ЛНП 6±3 17±3

Моноциты + ЛНП 8 ± 3 40 ±3

Нейтрофилы 5 ± 3 11 ±3

ЛНП 14 ±3 28 ±4

Нейтрофилы + ЛНП 36±3 120x15

Примечание: Моноциты с ЛНП инкубировали 3 ч при 37°С в среде Хенкса, рН 7,4; ЛНП - О, мг фосфолипидов/мп; моноциты - 105 клеток/мл. Нейтрофилы с ЛНП инкубировали 3,5 ч г 37°С в среде Хенкса, рН 7,4; ЛНП - 0,25 мг фосфолипидов/мл; нейтрофилы - 2,5*105 клеток/к

Таблица

Влияние ингибиторов ПОЛ на накопление ТБКРП в среде инкубации моноцитов и нейтрофилов с ЛНП.

Ингибитор Накопление ТБКРП, %

Моноциты Нейтрофилы

Контроль 100 ±8 100 ± 8

Маннит (50 ммоль/л) 98 ±10 102+11

Десфероксамин (20 мкмоль/л) 62 ± 9 59 ± 8

ВНТ (50 мкмоль/л) 53 + 7 0±3

ЕОТА (10 мкмоль/л) 48 ±6 35 + 7

СОД (60 ед/мл) 33 ±6 53 ±9

Каталаза (300 ед/мл) 12 ±2 35 + 6

Примечание: За 100% принято содержание ТБКРП в контрольных образцах, инкубировав без добавок.

Чтобы прояснить механизм аккумуляции продуктов ПОЛ, мы в среду инкубации ЛН1 клетками добавляли различные агенты, так или иначе ингибирующие ПОЛ. Результг экспериментов показывают (табл. 3), что перехватчик 'ОН - маннит не оказывал замети

влияния на накопление ТБКРП за время инкубации как с моноцитами, так и с нейтрофилами. В то же время хелаторы ионов металлов переменной валентности - десфероксамин и EDTA, СОД (фермент, элиминирующий '02") и особенно каталаза (фермент, расщепляющий Н202) достоверно снижали накопление продуктов ПОП при инкубации ЛНП с клетками. Известный перехватчик свободных радикалов - ВНТ (ионол) полностью блокировал ПОЛ в присутствии нейтрофилов и значительно ингибировал его при инкубации ЛНП с моноцитами (табл. 3). Полученные результаты позволяют заключить, что активация моноцитов и нейтрофилов в присутствии ЛНП приводит к развитию процесса ПОЛ, протекающего по радикальному механизму, но без участия *ОН-радикала.

Принимая во внимание эти данные, а также схему превращения активных форм кислорода, изображенную на рис. 1, можно предположить, что важная роль в окислительной модификации ЛНП нейтрофилами и моноцитами принадлежит гипохлориту. В таком случае становится понятен сильный ингибирующий эффект со стороны каталазы, расщепляющей предшественник гипохлорита - H2Oj (рис. 1).

Ингибирующая роль СОД заключается в элиминировании '02', который, как известно (Kettle and Winterboum, 1988), является модулятором в синтезе гипохлорита, переводя неучаствующую в цикле хлорирования форму МПО (соединение II) в нативный фермент, способный вновь катализировать образование гипохлорита.

Как будет показано в разделе 4.5, десфероксамин и EDTA эффективно реагируют с гипохлоритом. Именно способностью перехватывать гипохлорит может быть обусловлен их ингибирующий эффект в отношении пероксидации ЛП моноцитами или нейтрофилами.

Таким образом, результаты ингибиторного анализа окисления ЛНП моноцитами или нейтрофилами могут быть полностью объяснены с позиции участия в этом процессе гипохлорита, образующегося по реакции (1), катализируемой ферментом МПО, которая секретируется этими клетками при активации.

3.3. Активация моноцитов и нейтрофилов окисленными липопротеинами. При инкубации моноцитов с ЛНП, имеющими разную степень окисления, было установлено: чем окисленнее изначально являлись ЛНП, тем больший прирост продуктов ПОЛ регистрировался после инкубации. Мы предположили, что более окисленные ЛНП вызывают бо'льшую активацию клеток, что приводит к более интенсивному накоплению ТБКРП в липиде. В связи с этим мы попытались выяснить способны ли ЛП, предварительно модифицированные гипохлоритом или в результате автоокисления, активировать нейтрофилы или моноциты и таким образом усугублять процесс ПОЛ и модификацию ЛП в крови.

Одной из ранних стадий активации клеток является так называемый кислородный взрыв, характеризующийся резким увеличением потребления кислорода клеткой (в 2-3 раза), секрецией активных форм кислорода и сопровождающийся увеличением интенсивности хемилюминесценции в присутствии люминола (Маянский и Маянский, 1985). Мы исследовали кинетику люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов человека и ее изменение после добавления к клеткам окисленных ЛНП. Было показано, что аетоокисленные ЛНП, ЛВП

и ЛОНП в отличие от нативных активируют нейтрофилы, вызывая значительн хемилюминесцентный ответ со стороны клеток. Аналогичный эффект демонстрировала ЛНП, обработанные гипохлоритом. Причем увеличение концентрации гипохлорй использованной в период предварительной модификации ЛНП, приводило к poi интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов.

Моноциты также активировались окисленными ЛНП. Это сопровождалось, в отличие нативных ЛНП, усиленной продукцией '02', которая полностью предотвращалась СОД, а так интенсивным хемилюминесцентным ответом клеток в присутствии люминола.

Таким образом, результаты данной главы позволяют заключить, что, с одной cropoi моноциты или нейтрофилы, секретирующие при активации МПО (фермент, котор катализирует образование гипохлорита ¡n vivo), могут явиться реальной причи» окислительной модификации ЛП в крови. С другой - ЛП, модифицированные гипохлорит или в результате автоокисления, вызывают активацию моноцитов' и нейтрофил способствуя образованию инициаторов радикальных реакций, а значит и дальнейи интенсификации реакций ПОЛ.

ГЛАВА 4. ГИПОХЛОРИТ-ИНДУЦИРОВАННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

4.1. Перекисное окисление ЛП крови, вызванное гипохлоритом. Спиновые зон С5, Си и Cíe - производные стеариновой кислоты с парамагнитным центром, локализованы соответственно у 5-, ;12- и 16-го С-атомов относительно карбоксильной группы, буд; растворенными в водной среде или встроенными в поверхностный фосфолипидный монос; ЛНП, окислялись гипохлоритом с одинаковой скоростью, несмотря на то, что многочислен литературные данные (Schreier-Muccillo et al., 1976; Гриффит и Джост, 1979) свидетельству О различной глубине (увеличивающейся в порядке Cs, С12 и Ci6) пофужения в липидную ф нитроксильного фрагмента зондов. Этот факт можно объяснить, если принять, 1 проникновение гипохлорита в область локализации спиновых зондов, то есть фосфолипидный монослой ЛНП, не является лимитирующей стадией регистрируемого на процесса окисления. На основании этого можно предположить, что НОС1/ОСГ спосо! реагировать и с другими функциональными группами, например, с ненасыщенными связя локализованными в поверхностном фосфолипидном моноспое липопротеинов.

Добавление гипохлорита в среду инкубации ЛНП приводило к аккумуляции первиш-(диеновых конъюгатов), вторичных (ТБКРП) и конечных (флуоресцитующих) продуктов П< На рис. 2 приведены зависимости содержания ТБКРП и флуоресцирующих продуктов концентрации гипохлорита. Увеличение концентрации гипохлорита сопровождается росл продуктов ПОЛ в ЛНП. Присутствие белка не обязательно для протекания реакций П1 поскольку аккумуляция продуктов ПОЛ была зарегистрирована не только в ЛП, но t суспензии изолированных из них липидов, а также в фосфолипидных липосомах.

1.0

3.5

Рис. 2. Содержание ТБК-реактивных продуктов (1) и интенсивность собственной флуоресценции (2) ЛНП через 1 час их инкубации в зависимости от концентрации гипохлорита.

0.0

0.5

t— 2.5

Среда инкубации; 145 мМ ЫаС1, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Концентрация ЛНП - 0,45 мг белка/мл. Температура 37°С. Длина волны возбуждения - 360 нм, испускания - 430 нм

0.0 0.5 1.0

Гипохлорит, мМ

Гипохлорит-индуцированное ПОЛ - радикальный процесс, поскольку было установлено, ■о аккумуляция ТБКРП в ЛНП полностью предотвращалась перехватчиком свободных здикалов - ВНТ.

Антиокислительный потенциал ЛНП в основном определяется содержанием в них тидорастворимых антиоксидантов: а-токоферола и различных каротиноидов (Síes et al., 392; Clevidence and Bien, 1993). Специально проведенные эксперименты показали, что уже ¡реэ считанные минуты инкубации гипохлорит приводил к значительной деструкции не >лько а-токоферола, но и всех каротиноидов, которые нам удалось зарегистрировать в ЛНП зтодом ВЭЖХ (рис. 3). Видимо, это явилось основной причиной снижения резистентности -1П к последующей их Сиг*-индуцированной пероксидации.

Из рис. 3 видно, что каротиноиды проявляли разную реактивность по отношению к похлориту. Наиболее эффективными оказались транс- и цис-изомеры ликопина, а также а- и «аротин. Интересно, что они составляют до 50% всех каротиноидов крови человека (Stahl id Síes, 1994). Распределение этих каротиноидов между основными классами ЛП таково, что долю ЛНП приходится 73% ликопина, 67% ß-каротина и 58% а-каротина (Clevidence and îri, 1993).

Оксикаротиноиды (ксантофиллы) в составе ЛНП менее эффективно реагировали с юхлоритом. Интересно, что их содержание в ЛНП невысоко. Так лишь 31% лютеина и эксантина находится в ЛНП, тогда как ЛВП содержат 53% этих оксикаротиноидов evidence and Bieri, 1993). Таким образом, ЛНП в основном содержат более эффективные рехватчики гипохлорита - ликопин, ß- и ■ а-каротин, а их окси-производные, хуже агирующие с гипохлоритом, в большей степени распределены между ЛОНП и ЛВП. Нельзя слючить, что такое распределение антиоксидантов среди классов ЛП в крови является »ультатом еотественной защитной реакции организма против окислительной модификации

П.

100

л ег

о X

1-о О.

Гипохлорит, мМ

Рис. 3. Зависимости содержания лютеина (7), р-крилтоксантина (2), а-каротина (3), цис-ликопина (4), транс-2',3'-ангидролютеина (5), р-каротина (6) и транс-ликопина (7) в ЛН от концентрации гипохлорита в среде инкубации. V

Среда инкубации: 145 мМ №С1, 100 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Концентрация ЛЬ - 0,6 мг белка/мл. Время инкубации - 10 мин, температура - 25°С. За 100% приня содержание каротиноидов в ЛНП, инкубированных в отсутствие гипохлорита.

О)

■О

а о г

с: о. м ш

100 200 Время, мин

Гипохлорит, мМ

Рис. 4 Рис. 5

Рис. 4. Кинетика накопления ТБК-реактивных продуктов в среде инкубации ЛОНП ( ЛНП (2) или ЛВП (3) в присутствии 1,44 мМ гипохлорита.

Среда инкубации: 145 мМ ЫаС1, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Концентрация Л01 - 0,26; ЛНП - 0,45; ЛВП - 0,43 мг белка/мл. Температура 37°С. 4 - контроль (в отсутств гипохлорита), одинаковый в пределах ошибки эксперимента для всех классоц ЛП.

Рис. 5, Содержание ТБК-реактивных продуктов в ЛОНП (1), ЛНП (2) или ЛВП (3) зависимости от концентрации гипохлорита в среде инкубации. Время инкубации 1 час, 37°

ЛОНП оказались наиболее подвержены НОС1/ОСГ-индуцированному ПОЛ. Во время инкубации с гипохлоритом максимальный уровень ТБКРП в них составил 6,2 мкмоль/г белка (рис. 4 и 5). В ЛНП максимально накапливалось 1,3 мкмоль ТБКРП/г белка. Меньше других окислялись ЛВП (максимальный уровень ТБКРП - 0,8 мшопь/г белка). ЛП окислялись не только под действием экзогенного гипохлорита, но и синтезируемого в присутствии системы 'МПО + Н202 + СГ, причем их реакционная способность изменялась в той же последовательности как и при взаимодействии с экзогенным гипохлоритом: ЛОНП > ЛНП > ПВП.

Резюмируя результаты данного раздела, необходимо отметить, что гипохлорит, проникая в липидную фазу ЛП, вызывает деградацию липидорасгворимых антиоксидантов, что приводит к снижению антиокислительного потенциала ЛП и активации в них радикальных эеакций ПОЛ. Об этом свидетельствует аккумуляция в ЛП основных молекулярных продуктов ЮЛ: первичных, вторичных и конечных. Таким прооксидантным эффектом обладает не только экзогенно добавленный к ЛП гипохлорит, но и система "МПО + Н202 + СГ, сатализирующая его образование.

4.2. Изменение физико-химических свойств ЛП в результате их пероксидации, <роматографическими методами (ТСХ и ВЭЖХ) было показано, что липиды всех классов ЛП в трисутствии гипохлорита подвергались значительной деградации, причем это касалось не ■ол'ько лилидов внешнего поверхностного монослоя (фосфолипмды и свободный холестерин), ю и нелолярных липидов (триглицериды и эфиры холестерина), локализованных в идрофобном ядре ЛП.

Используя парамагнитные аналоги стеариновой кислоты с нитроксильными фрагментами, расположенными на различном расстоянии от карбоксильной группы: С5, С)2, а также зонд Со, радикальный центр которого локализуется в ЛП в области полярных оловок фосфолипидов, мы методом ЭПР исследовали изменение физико-химических :войста липидной фазы ЛНП под действием гипохлорита на различном удалении от юверхности частицы ЛНП. По мере возрастания концентрации НОС1/ОСГ в инкубационной :реде (а значит и степени модификации ЛНП) наблюдалось увеличение времени корреляции !ращательной диффузии (г) зонда С0. Это свидетельствует об ограничении вращательной юдвижности нитроксильного фрагмента зонда С0, что обусловлено, по всей вероятности, ^мобилизацией под действием гипохлорита полярных групп фосфолипидов.

На рис. 6 приведены зависимости параметров упорядоченности (8) и гидрофобности Ь) зондов С5 и С« в ЛНП от концентрации гипохлорита в среде инкубации. Повышение онцентрации НОС1/ОСГ приводило к увеличению параметра в как в случае зонда С5 (рис. 6, О, так и С12 (рис. 6, б). Параллельно с ростом 5 наблюдалось снижение параметра идрофобности Л. Это свидетельствует о том, что НОС1/ОСГ-индуцированное окисление ЛНП одновременно приводит к снижению гидрофобности и увеличению упорядоченности кирнокислотных цепей зондов С5 и Сц, а значит и окружающих их фосфолипидов на уровне 52-й СН2-групп (то есть на глубине ~ 0,5-1,7 нм от поверхности частиц ЛНП). При

использовании зонда Ci6 также удалось зарегистрировать с ростом концентрации HOCI/OC увеличение параметра S и снижение параметра Ь. Однако, это проявлялось лишь пр концентрациях НОС1/ОСГ, превышающих 1 мМ. Достоверного изменения параметра тв случа зонда Ci6 обнаружено не было. Интересно, что качественно похожие изменения подвижности и полярности ацильных цепей фосфолипидов наблюдались и в автоокисленны ЛНП.

0.72

0.70

0.68

0.50

Гипохлорит, мМ

Рис. 6. Зависимость параметра упорядоченности (в) и параметра гидрофобности (/1) спиновых зондов С5 (а) и С« (б) в ЛНП, предварительно проинкубированных с гипохлоритом в течение 1 час при 37°С, от концентрации гипохлорита в среде инкубации.

Среда инкубации: 145 мМ ЫаС1,10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Концентрация зондо! Ю^М, ЛНП - 0,75 мг белка/мл. Температура регистрации спектров ЭПР - 20°С.

С целью изучения изменения структуры аполипопротеинов под действием гипохлорит в качестве спиновой метки использовали спинмеченый аналог малеимида - ! малеимидопроксил, ковалентно связывающийся с БН-группами белка. Спектр ЭПР ЛН1 меченых 3-малеимидопроксилом представляет собой суперпозицию двух сигналов: широког сигнала, обусловленного сильно иммобилизованным малеимидом, и узкого сигнала от слаб иммобилизованной на белке метки. Это свидетельствует о наличии в ЛНП двух популяций БН групп, обладающих большей и меньшей подвижностью. Обработка ЛНП гипохлоритом (равн как и их автоокисление) приводила к снижению доли сильно иммобилизованной спиново метки и возрастанию доли сигнала от метки, слабо связанной с белком. Оба указанных факт свидетельствуют об увеличении под действием гипохлорита (или в результате автоокислени! подвижности фрагментов аполипопротеинов, с которыми связана метка. Возможно, эт обусловлено частичной деградацией алолипопротеина-В и нарушением белок-липидног контакта в ЛНП при их окислительной модификации.

Важную информацию о физико-химических свойствах аполипопротеинов можн получить при изучении собственной флуоресценции ЛП. На рис. 7 приведено изменени

интенсивности флуоресценции ЛНП в УФ-области (Хка6=285 им, ХИСпуск=340 нм, условия флуоресценции триптофана) через 1 час инкубации в зависимости от концентрации гипохлорита. Видно, что увеличение содержания гипохлорита в среде инкубации приводит к значительному (более, чем в 20 раз) снижению флуоресценции ЛНП. Этот экспериментальный факт может быть следствием по крайней мере одного из трех событий: 1) прямого окисления флуорофора (триптофана) гипохлоритом; 2) увеличения в результате нарушения микроокружения флуорофора его доступности для тушителей (в качестве которых может выступать, например, вода); 3) индуктивно-резонансного переноса энергии с молекул флуорофора на молекулы, образующиеся в результате ПОЛ.

Рис. 7. Интенсивность флуоресценции ЛНП в УФ-диапазоне (возбуждение - 285 нм, испускание - 340 нм) через 1 час инкубации в зависимости от концентрации гипохлорита.

Среда инкубации: 145 мМ ЫаС1, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Концентрация ЛНП - 0,45 мг белка'мл. Температура 37°С.

Все перечисленные нарушения физико-химических свойств поверхностного протеолипидного слоя ЛНП могут иметь место. Действительно, известно, что гипохлорит разрушает триптофан в растворе (Говорова с соавт., 1988). Активация ПОЛ в присутствии гипохлорита с одной стороны приводит к увеличению полярности липидной фазы ЛНП (рис. 6) и, возможно, к увеличению проницаемости в ЛНП молекул воды - тушителей флуоресценции триптофана. С другой стороны, аккумулирующиеся в ЛНП продукты НОС1/ОСГ-индуцированного ПОЛ могут играть роль акцептора энергии при индуктивно-резонансном ее переносе с трилтофанилов.

Таким образом, методом спиновых меток и флуоресценции удалось показать, что гипохлорит приводит к значительному нарушению физико-химических свойств аполипопротеинов в ЛНП. Это проявляется в увеличении доли белка с более подвижными БН-группами, а также в деградации собственной флуоресценции ЛНП.

Для оценки потенциала поверхности ЛП мы использовали известный методический подход, основанный на применении положительно заряженного зонда, в качестве которого использовали положительно заряженный нитроксильный радикал или парамагнитные ионы Мп2\ Оцененный нами потенциал поверхности нативных ЛНП составил -17,7 мВ.

се

=Г .1 О) 7Т О 0) о.

о >»

200

100

0.5 1.0

Гипохлорит, мМ

Предварительная обработка ЛНП гипохлоритом или их автоокисление приводило увеличению отрицательного потенциала поверхности (по абсолютной величине).

Полученные результаты были подтверждены методом электрофореза в геле агароз На рис. 8 приведена зависимость элекгрофоретической подвижности ЯП от концентрац гипохлорита в среде инкубации. Видно, что с увеличением концентрации гипохлори относительная злектрофоретическая подвижность ЛП возрастает. Интересно отметить, ч НОС1/ОСГ-индуцированное изменение элекгрофоретической подвижности разных классов Л качественно совпадает с их способностью окисляться под действием гипохлорита (см. рис.' 5). Злектрофоретическая подвижность ЛВП, наиболее устойчивых к окислению гипохлоритс практически не изменяется под действием НОС1/ОСГ. Тогда как наиболее легко окисляем* ЛОНП свойственно более выраженное изменение элекгрофоретической подвижности

Рис. 8. Зависимост относительной электрофоре тической подвижности ЛОНП (?, ЛНП (2) и ЛВП (3 предварительно инкубированны 1 час при 37°С в присутстви гипохлорита, от концентраци гипохлорита в среде инкубации.

Среда инкубации: 10 м( фосфатный буфер, рН 7,4.

Таким образом, с использованием метода спиновых меток и зондов, а так электрофореза удалось показать, что гипохлорит нарушает физико-химические свойст липидной фазы ЛНП (уменьшение подвижности и увеличение полярности вплоть до 12-ого атома ацильной цепи); увеличивает долю белка с более подвижными SH-группами; приводи возрастанию отрицательного потенциала поверхности ЛП. Эти изменения качествен совпадают с таковыми, обнаруженными в автоокисленных ЛП.

4.3. Холестерин-транспортная функция окисленных липопротеинов. Соглас современным представлениям важная роль в образовании пенистых клеток, формируюи. липидные пятна на стенках кровеносных сосудов при развитии атеросклероза, наряду гладкомышечными клетками принадлежит моноцитам-макрофагам (Carpenter et al., 19! Kanazawa et al., 1995). Пенистые клетки содержат избыточное количество холестери! который в форме эфйров жирных кислот накапливается в цитоплазме в виде липидн

сравнению с другими классами ЛП.

Гипохлорит, мМ

вакуолей. Мы предположили, что к патологическому накоплению холестерина в клетках приводит изменение механизма взаимодействия ЯП с клеточной мембраной. Важным эвеном в нарушении этого процесса может оказаться модификация структуры ЯНП, основной функцией которых является доставка холестерина в клетки.

Для того чтобы выяснить, влияет ли окислительная модификация ЛНП на их холестерин-транспортную функцию, мы инкубировали моноциты, изолированные из крови здоровых доноров,; с нативными и автоокисленными ЛНП. Инкубация моноцитов с ЛНП приводила к увеличению в клетках содержания фосфолипидов и холестерина. При этом увеличение содержания фосфолипидов было небольшим и приблизительно одинаковым как при инкубации с нативными, так и окисленными ЛНП (в среднем для 5 опытов соответственно на 18,3±8,1% и 16,0±6,1% по отношению к клеткам, инкубированным в отсутствие ЛНП). Это увеличение содержания фосфолипидов можно объяснить фагоцитозом частиц ЛНП моноцитами в ходе инкубации.

Накопление холестерина клетками при их инкубации с ЛНП характеризовалось более значимыми цифрами: содержание стерина по отношению к клеткам, инкубированным без ПНП, возрастало в случае инкубации с неокисленными ЛНП в среднем на 99,6+12,4%, а при инкубации с автоокисленными ЛНП - на 166,2+23,5%, т.е. в опытах с окисленными ЛНП клетки накапливали существенно больше холестерина, чем в опытах с неокисленными ЛНП. Если предположить, что в период 4-ч инкубации с ЛНП не происходит заметного синтеза липидов в моноцитах, а клетки не обладают способностью различать и селективно фагоцитировать ЛНП ; увеличенным содержанием холестерина, то обнаруженная нами повышенная аккумуляция <олестерина в моноцитах может быть результатом прямого переноса стерина от ЛНП в иембраны клеток. Действительно, проведенные нами расчеты показали, что в случае «окисленных ЛНП практически весь холестерин поступает в клетки в результате эндоцитоза. Напротив, в случае окисленных ЛНП около половины холестерина переносится «посредственно с ЛНП на мембраны клеток без захвата частицы.

Если моноциты предварительно культивировали в течение 65 час, то такие клетки, 1риобретая свойства макрофагов, более эффективно аккумулировали холестерин при их инкубации с окисленными ЛНП, по сравнению со свежевыдепенными клетками.

При изучении взаимодействия ЛНП, модифицированных гипохлоритом,, с лакрофагальными клетками использовали культуру клеток 0744.2, которая обладает всеми :войствами, присущими макрофагам, в том числе и рецепторами как к нативным, так и к /юдифицированным ЛНП. На рис. 9 приведена зависимость аккумуляции холестерина в 1774.2-макрофагах от времени их инкубации с нативными ЛНП и ЛНП, предварительно лодифицированными гипохлоритом. Видно, что инкубация с нативными ЛНП приводила к юкоторой аккумуляции . холестерина в клетках. Однако, ЛНП, модифицированные ипохлоритом, вызывали достоверно более значительную аккумуляцию холестерина. Причем, ффект возрастал как с продолжительностью времени инкубации ЛНП с клетками, так и с величением концентрации гипохлорита в период предварительной модификации ЛНП

гипохлоритом. Эти результаты позволяют заключить, что модификация ЛНП гипохлорит приводит к усилению их способности транспортировать холестерин в клетки макрофагальнс типа подобно тому, как это было установлено для автоокисленных ЛНП.

Рис. 9. Аккумуляция холестер! в ^74.2-макрофагах в зависимости времени их инкубации с нативнь ЛНП (1) и ЛНП, предварител! модифицированными в присутствии мМ (2) и 0,3 мМ (3) гипохлорита.

2 4

Время, ч

Клетки (5-105) инкубировали ЛНП (конечная концентрация 0,2 белка/мл) в среде Хенкса при 37 Предварительную модификацию Я гипохлоритом проводили при 37°С течение 60 мин в 10 мМ фосфат) буфере (рН 7,4), содержащем 145 N301.

Известно, что эритроциты не содержат рецепторов к ЛП (Hui et al., 1981) и поэт« являются удобной моделью для исследования рецептор-независимого nocrynnei холестерина из ПП в клетку. С целью изучения переноса холестерина между ЛП эритроцитарной мембраной мы инкубировали эритроциты с нативными, предварител! окисленными ЛНП, ЛВП2 или ЛВП3, а также ЛП выделенными из крови больных ИБС. По< инкубации анализировали содержание холестерина и фосфопипидов в эритроцитах.

Основной результат, полученный в этих экспериментах, иллюстрирует рис. 10. В но[ ЛНП проявляют холестерин-донорные свойства в отношении клеток. Равновесие проце переноса холестерина смещено в сторону клеток. Однако чрезмерной аккумуля! холестерина в них не наблюдается, поскольку ЛВП активно акцептируют избыток xonecrepi с клеточной поверхности. Предварительно окисленные ЛНП (в результате автоокисления i под действием гипохлорита) эффективнее транспортируют холестерин в кле-Пороксидация лишает ЛВП холестерин-акцепторной функции. Оба факта способств аккумуляции холестерина в клетках. ИБС приводит к таким же нарушениям xonecref транспортной функции ЛП, как и ПОЛ, а именно холестерин легче покидает частицы ЛН хуже встраивается в комплексы ЛВП из клеток (рис. 10).

Полученный эффект можно объяснить, если предположить, что окисление липи сопровождается уменьшением эффективного объема гидрофобной области в липидной <$ ЛП. Для проверки этого предположения мы методом ЭПР исследовали распределе спинмеченого стероида - 3-доксил-андростана в суспензии нативных и окисленных Л Действительно, в результате окисления снижалось число участков связывания в ЛНП,

могли бы локализоваться гидрофобные молекулы зонда и, по-видимому, холестерина. Вследствие этого облегчается высвобождение холестерина из ЛНП и затрудняется его встраивание в ЛВП, чему должно способствовать также продемонстрированное ранее увеличение полярности липидной фазы и поверхностного потенциала в ЛНП как при их автоокислении, так и при гипохлорит-индуцированном ПОЛ (см. раздел 4.2).

Контроль

+11±3

—^ ( С __ ^ ;

Эритроцит -19

Пеоекисное окисление липидов

+27*4

Ишемическая болезнь сердиа

^ЛНП^)

+34 ±10

(

Эритроцит

Эритроцит . (g^

Рис. 10. Схема переноса холестерина между лилопротемнами и эритроцитами, влияние ПОЛ и ИБС. Цифрами указано изменение содержания холестерина (в %,"+" - увеличение,"-" - уменьшение) в эритроцитах после их инкубации с соответствующим классом липопротеинов.

4.4. Влияние гипохлорита и ЛНП, модифицированных гипохлоритом на адгезию клеток крови к эндотелию. Важную роль в развитии ранних стадий атеросклероза играет адгезия клеток крови к поверхности сосудов (Wu and Thiagarajan, 1996; McGorisk and Treasure, 1996). В связи с этим было исследовано влияние гипохлорита и ЛНП, предварительно модифицированных гипохлоритом, на адгезию клеток крови к эндотелиоцитам. В качестве

клеток использовали эритроциты, которые, с одной стороны, являются наиболее прост клеточной моделью, а с другой - их адгезия к поверхности сосуда играет немаловажную ро в формировании фиброзной бряшки (Климов, 1987).

15-Минутная преинкубация монослоя эндотелиальных клеток (ЭК) в присутствии мкМ HOCI/OCI" сопровождалась увеличением числа адгезированных эритроцитов в 2,4 раза сравнению с контролем. 50 мкМ НОСЮСГ повышали адгезию эритроцитов уже в 5,4 ра: Предварительная инкубация монослоя ЭК даже с нативными ЛНП приводила к увеличен! последующей адгезии эритроцитов к поверхности эндотелия в 3,7 раза по сравнению контролем, когда ЭК прёинкубировали в отсутствие ЛНП. ЛНП, преинкубированные с 50 и 2 мкМ НОО/ОСГ (НОС1-ЛНП), увеличивали число адгезированных эритроцитов в 2,7 и 5,6 ра по сравнению с нативными ЛНП соответственно.

Преинкубация ЭК с НОС1-ЛНП сопровождалась аккумуляцией холестерина в клетках мере роста концентрации HOCI/OCi" (до 250 мкМ) в среде его предварительной инкубации ЛНП. Причем, эффект аккумуляции холестерина изменялся параллельно с адгези эритроцитов к эндотелию. Об этом свидетельствует обнаруженная линейная зависимость высоким коэфициентом корреляции (R=0,98) между мольным соотношени< холестерин/фосфолипиды в ЭК и количеством адгезированных эритроцитов.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что гипохлор непосредственно или же опосредованно через модификацию ЛНП способен воздействова на ЭК, что приводит, с одной стороны, к повышенной адгезии клеток крови, в частное эритроцитов, на поверхности эндотелия, с другой - к аккумуляции холестерина эндотелиоцитах. Как то, так и другое является известным риск-фактором развития ранн стадий сердечно-сосудистых заболеваний, в частности атеросклероза.

4.5. Участие некоторых физиологически важных молекул в модификат липопротеинов гипохлоритом. В данном разделе рассмотрено влияние нитрш гемоглобина, холестерина и хелаторов Ре-ионов: десфероксамина и EDTA на гипохлор!, индуцированное ПОЛ и модификацию ЛП гипохлоритом.

Нитрит (N02') является одним из главных продуктов окислительного метаболизма NC продуцируемого многими клетками в результате работы фермента NO-синтазы (Marietta et г 1988). Уже более 100 лет известно, что N02" реагирует с HOCI (Toussaint, 1866), одна» механизм этой реакции точно не известен. Исследование нами кинетики реакции гипо;хлори . с нитритом методом остановленной струи показало, что при физиологических pH (7, бимолекулярная константа скорости реакции весьма высока и равна (7,4 ± 1,3)-103 ,М'1с Реакция протекает строго эквимолярно, сопровождается эквимолярным образована нитрата и описывается суммарным уравнением: v-

HOCI + NOj" -> СГ + Н*+ NO3" (2

Нами было установлено, что в действительности эта реакция имеет более сложный механи: с образованием реакционного интермедиата (предположительно Cl-N02 и/или CI-0-N=0). Эт интермедиат, несмотря на короткое время жизни, проникает в ЛНП, значительно эффективн

гипохлорита разрушает антиоксиданты (а-токоферол и р-каротин), увеличивая чувствительность ЛНП к пероксидации. На рис. 11 а и б приведены результаты сравнительного исследования влияния нитрита, г гипохлорита и их смеси на аккумуляцию ТБКРП в ЛНП и ЛОНП. Нитрит вызывал лишь незначительное ПОЛ в ЛП (кривые 1 на рис. 11а и б). В присутствии гипохлорита оба класса ЛП окислялись заметно сильнее (кривые 3). Однако, максимальная аккумуляция продуктов. ПОЛ наблюдалась в присутствии смеси НОС1/МОг' (кривые 2). Если ЛНП или ЛОНП добавляли в реакционную смесь непосредственно после смешивания НОС! и N02", то аккумуляция продуктов ПОЛ не регистрировалась вовсе (кривые 4). Это значит, что причиной активации ПОЛ в ЛП в присутствии смеси Н0С1/М02" является образование короткоживущего интермедиата - эффективного инициатора ПОЛ. Добавление в реакционную смесь перехватчика свободных радикалов - ВНТ значительно ингибировало аккумуляцию продуктов ПОЛ в ЛНП, свидетельствуя о радикальном механизме пероксидации ЛП в присутствии смеси НОО/МОг".

га г :£ о. а>

1 —

.{5

Ш и.

н 5 §

О 12 0 1 2

Концентрация, мМ

Рис. 11. Влияние нитрита и/или гипохлорита на аккумуляцию ТБК-реактивных продуктов ЮЛ в ЛОНП (а) или ЛНП (б).

Среда инкубации: 145 мМ ЫаС1, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. ЛОНП - 0,7 мг :олестерина/мл, ЛНП - 1,6 мг холестерина/мл. Время инкубации - 60 мин, температура 37°С. 'еагенты в порядке их добавления: 1 - ЛП + нитрит; 2 - ЛП + нитрит + гипохлорит; 3 - ЛП + ипохлорит; 4 - нитрит + гипохлорит + ЛП.

Помимо этого образующийся в реакции (2) интермедиат подобно пероксинитриту ОЫОО") модифицировал аполипопротеин-В в составе ЛНП, нитруя остатки тирозина с |бразованием 3-нитротирозина. Модифицированные таким образом ЛНП трансформировали гакрофагальные клетки в клетки, подобные пенистым. Поскольку нитрит является продуктом ревращения 'N0, продуцируемого клетками крови и сосудистой стенки, и может находиться епосредственно в местах образования гипохлорита в крови и стенке сосудов, то такая

модификация ЛНП представляется вполне реальной in vivo и может иметь существен»-значение в формировании ранних стадий атеросклероза.

In vivo инициатором ПОЛ в ЛП может служить высвобожденный из эритроцит гемоглобин (Paganga et al., 1992). Было показано, что взаимодействие гипохлорита гемоглобином приводит к увеличению способности последнего стимулировать ПОЛ в ЛН Вероятно, это происходит в результате образования продуктов окисления и деградай гемоглобина (метгемоглобина, феррилгемоглобина и ионов железа) - сильных прооксидант Галтоглобин - белок плазмы, образующий с гемоглобином прочные комплексы, эффектив ингибировал окислительную модификацию ЛНП, вызванную как нативным гемоглобином, та гемоглобином, предварительно модифицированным гипохлоритом.

При исследовании влияния хелаторов Fe-ионов: десфероксамина и EDTA гипохлорит-индуцированное ПОЛ было установлено, что оба соединения реагируют НОС1/ОСГ в мольном соотношении гипохлоригдесфероксамин (или гипохлорит:ЕОТ заметно превышающем эквимолярное (10:1 и 2:1 соответственно). Эксперименталь доказано, что именно этим (а не способностью хелатировать Fe-ионы) обусловг обнаруженный ингибирующий эффект со стороны десфероксамина и EDTA на HOCI/Oi индуцированное ПОЛ фосфолипидных мембран. Такой результат позволяет "усомнитьс; правомочности использования в ряде работ (см., например, Keith, 1993; Lelli et al., 19! десфероксамина и EDTA в качестве хелаторов Fe-ионов для однозначного доказательс участия этих ионов в механизме радикальных процессов, протекающих в среде,' содержаи НОС1/ОСГ-генерирующие системы (МПО, нейтрофилы, моноциты и т.п.). ■ ■J

Исследование нами влияния холестерина на гипохлорит-индуцированное П показало, что присутствие стерина в лилосомах из ненасыщенного фосфатидилхолу замедляло в них аккумуляцию продуктов ПОЛ. Экспериментально было продемонстрирова что гипохлорит реагирует с холестерином. Недавно Heinecke et al. (1994), Hazen et al. (199£ Can et al. (1996, 1997) показали, что при этом образуются смесь хлоргидриноа и разпичь окси-производных холестерина. Именно этим, в первую очередь, можно объяснить сниже> гипохлорит-индуцированной пероксидации фосфолипидов в липосомах, содержаи холестерин. Однако, нельзя полностью исключить, что, по крайней мере частич "антиоксидантный" эффект холестерина может быть обусловлен изменением физи химических свойств липидной фазы, в частности, снижением проницаемости фосфолипидн бислоя для молекул HOCI.

Так или иначе, но реакция гипохлорита с холестерином может иметь важ( биологическое значение, поскольку окси-производные холестерина, образующиеся в хс этой реакции, способны оказывать влияние на различные физиологические процессы частности, на синтез ДНК, функции клеток и их пролиферацию, на биосинтез холестери стимулировать атеросклеротическое поражение сосудов (Peng et al., 1991; Hwang, 1991).

ПАВА 5. МЕХАНИЗМ ГИПОХЛОРИТ-ИНДУЦИРОВАННОГО ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

Для более детального исследования механизма гипохлорит-индуцированного ПОЛ мы 1ростили изучаемую липидную систему и в дальнейших экспериментах использовали осфатидилхолиновые липосомы.

5.1. Гипохпорит-индуцированная аккумуляция продуктов ПОЛ в фосфолипидных нпосомах. На рис. 12 приведены полученные' нами кинетические кривые накопления леновых конъюгатов, гидропероксидов пипидов й ТБК-реактивных продуктов ПОЛ, а также леньшение числа двойных связей в фосфолипидных липосомах в процессе их инкубации с шохлоритом. Если липосомы инкубировали в отсутствие НОС1/ОСГ, то за 2 ч инкубации не зблюдали изменения как в содержании продуктов ПОЛ, так и числа двойных связей в лпосомах (данные не приведены). Однако, как видно из рис.- 12, инкубация лилосом с ОС1/ОСГ приводила к накоплению всех измеренных нами продуктов ПОЛ, аналогично тому, 1к это наблюдалось в ЛП (см. раздел 4.1). Причем основная часть продуктов накапливалась ке в первые 10 мин инкубации. В этот же промежуток времени наблюдалось и резкое леньшение числа двойных связей. Более длительные времена инкубации сопровождались мжением уровня накопившихся диеновых конъюгатов и ТБКРП.

20 -т-

■з §

■.я

X ю -о I

0 3

1 1

о -Ц-

Рис. 12. Кинетика накопления диеновых конъюгатов (ДК, 1), гидропероксидов пипидов ЮОН, 2), ТБК-реактивных продуктов (ТБКРП, 3) и уменьшения числа двойных связей (4) (% !Т начального содержания) в многослойных липосомах из яичного фосфатидилхолина, 1нкубированных в присутствии 1 мМ гипохлорита.

Среда инкубации: 145 мМ N801, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4; концентрация 1ипосом 2 мг/мл, температура 37°С.

Методом хемилюминесценции удалось подтвердить тот факт, что НОС1/ОСГ окисляет |пиды (Ц с образованием первичных продуктов ПОЛ пероксидной природы. Причем с еличением концентрации НОС1/ОСГ или времени инкубации пипидов с НОС1/ОСГ возрастает

содержание пипопероксидов (LOOH), которые при последующем добавлении в систему Ft разлагаются с образованием свободных радикалов:

♦Hoci W

L LOOH -> свободные радикалы (3)

Поскольку известно, что в физиологических условиях процесс ПОЛ с заметж скоростью протекает лишь в присутствии ионов металлов переменной валентности (Vladimin et al., 1980), то вполне логично предположить, что Ре2*-ионы могут играть важную роль разветвлении цепей HOCI/ОСГ-индуцированного ПОЛ, а реакции, описанные в предложена выше схеме (3) могут иметь место in vivo.

Сравнительное исследование кинетики пероксидации фосфолипидных липосо инкубированных е присутствии гипохлорита или в системе "Fe2* + аскорбат", показало, ч скорость образования продуктов ПОЛ, а также абсолютное значение их прироста бьи существенно выше в случае НОСЮСГ-индуцированного ПОЛ по сравнению с индукцией ПС в системе "Fe2* + аскорбат". Накопление продуктов ПОЛ происходило до тех пор, пока реакционной смеси присутствовал HOCI/OCI".

Радикальный механизм гипохлорит-индуцированного ПОЛ подтверждает тот факт, ч известные перехватчики свободных радикалов: ВНТ и а-токоферол ингибируют накоплен! ТБКРП в процессе инкубации липосом с HOCI/OCI". Достоверный эффект появлялся уже п[ концентрации 0,2 и 1,0 мкМ для ВНТ и а-токоферола соответственно, а 0,7 мкМ ВНТ и 10 мк а-токоферола полностью предотвращали НОСЮСГ-индуцированное ПОЛ.

5.2. Инициирование гипохлорит-индуцированного ПОЛ. ПОЛ как и люб; радикальная реакция имеет стадию инициирования. Из общих соображений можно ожидат что акт инициирования гипохлорит-индуцированного ПОЛ осуществляется в липидной ш водной фазах суспензии липосом. В водной фазе он может быть обусловлен реакцис HOCI/OCI' с Регионами, *02' или Н202, присутствие которых в инкубационной среде следовых количествах нельзя исключить полностью. Первые два при взаимодействии HOCI/OCI' образуют 'ОН-радикал (Candelas et al., 1993-1995; Осипов с соавт., 1993), а Н20: 102 (Held et al., 1978):

HOCI + H202 -» 102 + CI + H* + Н20. (4)

Оба - эффективные инициаторы ПОЛ. Если Н202, "02" или Fe-ионы действительно причастны инициированию ПОЛ в присутствии гипохлорита, то добавка Н202 или Fe2* в среду инкубащ липосом с HOCI/OCI" должна увеличивать, а предварительное введение СОД или каталазы снижать образование продуктов ПОЛ в пипосомах. Эксперименты показали, что ни одна i указанных добавок не влияла на выход продуктов ПОЛ в период инкубации липосом i яичного фосфатидилхолина с гипохлоритом. Это позволило исключить Н202, '02" и Fe-ионы i числа возможных инициаторов гипохлорит-индуцированного ПОЛ.

Поскольку гипохлорит натрия является относительно нестойким соединением склонен к реакции диспропорционирования, то в его водном растворе могут присутствовать качестве примеси соли кислородсодержащих кислот хлора: хлорит, хлорат и перхлор.

натрия (Ахметов, 1975). Эти соединения обладают окислительными свойствами (хотя и выраженными в меньшей степени, чем у гипохлорита), и априори нельзя исключить их возможное участие в реакциях ПОЛ. Однако, в контрольных экспериментах было показано, что хлорит, хлорат и перхлорат натрия не вызывали ПОЛ в фосфолипидных липосомах, а также не оказывали влияния на ПОЛ, индуцированное гипохлоритом.

Таким образом, анализ проведенных исследований позволяет заключить, что ни один из водорастворимых интермедиатов, которые могли бы образоваться или присутствовать в качестве примеси 8 среде инкубации липосом с гипохлоритом, не принимает участия в НОСЮСГ-индуцированном ПОЛ на стадии инициирования. Остается полагать, что стадия инициирования НОС1/ОСГ-индуцированного ПОЛ реализуется в липидной фазе.

В липидной фазе HOCI/OCI", во-первых, может непосредственно реагировать с одной или несколькими функциональными группами фосфолипида (фосфохолиновая группа, насыщенные и ненасыщенные связи ацильных цепей) с образованием промежуточных продуктов, претерпевающих впоследствии дальнейшие превращения через радикальную стадию. Во-вторых, инициатор ПОЛ может образовываться в результате взаимодействия HOCI/OCI" с одним из минорных компонентов, присутствующих в качестве примеси в инкубационной среде. На роль минорных компонентов в липидной фазе могут прежде всего претендовать продукты ПОЛ, которые всегда имеются в ненасыщенном липиде в том или ином количестве (Rice-Evans et al., 1996).

Рис. 13. Кинетические кривые взаимодействия гипохлорита с

многослойными , липосомами из яичного фосфатидилхолина (i n 5), DMPC (2) и из DMPO-ЛС, содержащих 250 мкМ пальмитиновой кислоты (3).

Остаточную концентрацию гипохлорита регистрировали методом хемйлюминес-ценции люминола. Кривая 5 - то же, что и 1, но получена- путем регистрации хлорированного ¡монохлордимедона (Kettle and Winterbourn, 1994).

Температура 37°С. Концентрация яичного фосфатидилхолина - 2 мг/мл, DMPC - 2,5 мМ. 4 - контроль в отсутствие липосом.

Исследование кинетики реакции гипохлорита с фосфатидилхолиновыми липосомами юказало, что концентрация HOCi/OCI" в инкубационной среде не изменялась в отсутствие 1ипосом (кривая 4, рис. 13) или, если в ней присутствовали липосомы из насыщенного фосфатидилхолина - 1,2-димиристоил-5п-глицеро-3-фосфохолина (DMPC-ЛС) (кривая 2, рис.

20 40

Время, МИН

13), или РМРС-ЛС + пальмитиновая кислота (кривая 3, рис. 13). Это говорит о том, чт НОС1/ОСГ не вступает в реакцию ни с карбоксильной, ни с фосфохолиновбй группой, ни насыщенной -СН2-СН2- связью. Однако, как видно из рис. 13 (кривая 1), если в инкубационнс смеси присутствовали липосомы из яичного фосфатидилхолина, то наблюдалась быстра убыль НОС1/ОСГ. Яичный фосфатидилхолин отличается от ОМРС наличием ненасыщеннь -НС=СН- связей. На основании этого можно полагать, что убыль гипохлорита в присутстви яичного фосфатидилхолина обусловлена его реакцией именно с двойными. связями. Эт полностью согласуется с результатами, полученными методами 1Н-ЯМР и иодометрии продемонстрированными в частности на рис. 12 (кривая 4).

Действительно, гипохлорит способен реагировать с двойной связью по реакции:

С1

>1 ' -НС=СН- + НОС1-»--НС-<^Н- (5)

ОН

с образованием хлоргидринов гликолей, которые в результате дегидрохлорированс превращаются в эпоксиды (Несмеянов и Несмеянов, 1974): -

-НС-СН-->- -НС-СН- ' (6)

он о

Эпоксиды же являются типичными продуктами ПОЛ, принимающими участие в развита свободнорадикальных реакций (Каган с соавт., 1986).

Детальное исследование кинетики взаимодействия гипохлорита с двойными связям свободных житных кислот (олеиновой, линолевой, линоленовой и арахидоновой) жирнокислотных цепей фосфатидилхолина (2-линолеоил-1-пальмитоил-5п-глицеро-3-фосф| холина, 2-олеоил-1-пальмитоил-зп-глицеро-3-фосфохолина и яичного фосфатидилхолина) составе липосом из ОМРС показано, что гипохлорит реагирует с -НС=СН- связями с стехиометрическим соотношением, изменяющимся от 2 до 1 по мере увеличения обще концентрации двойных связей в липосомах и числа двойных связей в одной жирнокислотнс цепи. Реакция идет по молекулярному механизму с образованием хлоргидрина согласи уравнению (5). Эпоксиды при этом не образуются. Это значит, что данная реакция вряд г может быть причиной инициирования свободнорадикального ПОЛ.

В ненасыщенном липиде всегда в том или ином количестве присутствуют продукты е! спонтанного окисления. Главным образом это первичные молекулярные продукт пероксидной природы: гидропероксиды, диалкил-, диацил-пероксиды и др. Помимо это возможно образование также целого ряда кислородсодержащих соединений: альдегидо кетонов, дающих окрашенный комплекс с ТБК (ТБК-реактивные продукты) и эпоксидс (оксиранов) (Владимиров и Арчаков, 1972; Каган с соавт., 1986). Чтобы выяснить, вступает г гипохлорит в реакцию с продуктами ПОЛ, мы регистрировали кинетику его убыли присутствии липосом из нативного яичного фосфатидилхолина и предварительно окисленно! до разной степени путем инкубации при 37°С.

Оказалось, что константа скорости этой реакции линейно возрастала с увеличением содержания гидропероксидов в липосомах. Такое увеличение скорости реакции может быть эбусловлено, с одной стороны, частичной деградацией липидной фазы липосом в результате 1ротекания реакций ПОЛ и, как следствие, увеличением доступности гипохлорита в область покализации ненасыщенных связей. С другой стороны, можно полагать, что НОС1/ОСГ способен вступать в. реакцию не только с двойными связями, но й с продуктами ПОЛ, эбразовавшимися при автоокислении липида.

Однако, бимолекулярная константа скорости образования хлоргидринов по реакции (5) цля нативных липосом (0,50 ± 0,03 М"1 с"1) не отличалась (в пределах ошибки эксперимента) от юнстанты, рассчитанной для окисленных липосом (к = 0,52 ± 0,03 М"1 с"1). Это значит, что :корость образования хлоргидринов в результате взаимодействия гипохлорита с двойными :вязями в нативных и окисленных липосомах одинакова, а увеличение расхода гипохлорита в экисленных липосомах обусловлено именно его реакцией с продуктами ПОЛ, эбразовавшимися в результате автоокисления фосфолипида.

В наших экспериментах гипохлориг реагировал с ТБКРП. Однако, по современным 1редставлениям эта реакция протекает без участия свободных радикалов по молекулярному леханизму и вряд ли может быть причиной инициирования ПОЛ (Winterbourn and Carr, 1993). Аз других продуктов ПОЛ, которые содержатся в ненасыщенном липиде, основными можно считать продукты пероксидной природы и эпоскиды. Мы попытались выяснить, с какими из зсновных кислородсодержащих функциональных групп способен реагировать гипохлорит. С >той целью органические пероксиды (трет-бутилгидропероксид, гидропероксид кумола, ди--рет-бутилпероксид, трет-бутилпербензоат и дибензоилпероксид) и эпоксиды (цис- и транс->,3-эпоксибутан, 5а,ба-элоксид холестерина, цис-9,10-зпоксистеариновая кислота) встраивали > липосомы из DMPC и изучали кинетику взаимодействия гипохлорита с этими соединениями, Сказалось, что только в случае липосом, содержащих гидропероксиды трет-бутила или :умола регистрировалась убыль НОС1/ОСГ, причем скорость убыли тем больше, чем выше юнцентрация гидропероксидов. Поскольку, как видно из рис. 13 (кривая 2), НОИ/ОСГ не iступает в реакцию с DMPC, то полученные результаты позволяют заключить, что гипохлорит )еагирует с гидроперокси-группой, но не вступает в реакцию с диалкип-, диацил-, алкил-ацил-юроксидами и элоксидами. Более того, реакция гипохлорита с гидропероксидами юпровождалась хемилюминесценцией, которая является важным признаком радикальных >еакций.

Присутствие гидропероксида трет-бутила, кумола или линолевой кислоты в липосомах |риводило к увеличению их окисляемости гипохлоритом. В таких липосомах после инкубации : гипохлоритом накапливалось достоверно больше продуктов ПОЛ по сравнению с !ипосомами, приготовленными из одного фосфатидилхолина (рис. 14). Причем эффект ависел от концентрации гидропероксида. По мере увеличения содержания гидропероксида 1Инолевой кислоты в липосомах увеличивался прирост ТБКРП (рис. 15). Диалкил-, диацил-, 1лкил-ацил-пер0ксиды и эпоксиды не проявляли подобного эффекта.

Гипохлорит, мМ Гидропероксид, нмоль/мг

Рис. 14 Рис. 15

Рис. 14. Зависимость аккумуляции ТБКРП в многослойных липосомах из соеЕ фосфатидилхолина, содержащих (?) и не содержащих (2) гидропероксид линолевой кислс от концентрации гипохлорита после 40 мин инкубации.

Среда инкубации: 145 мМ ЫаС1, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Температура 37 Концентрация липосом - 2 мг/мл. Содержание гидропероксида линолевой кислоть липосомах - 30,1 нмоль/мг фосфатидилхолина. Исходное содержание гидропероксидо фосфатидилхолине - 5,7 нмоль/мг.

Рис. 15. Зависимость аккумуляции ТБКРП в многослойных липосомах из сове фосфатидилхолина после 40 мин инкубации в присутствии (1) и в отсутствие (2) 200 I гипохлорита от концентрации встроенного в липосомы гидропероксида линолевой кислоть

Среда инкубации: 145 мМ ЫаС1, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Температура 3" Концентрация липосом - 2 мг/мл.

10 20 30 40 Гидропероксид, нмоль/мг

Рис. 16. Зависимость аккумул? ТБК-реактивных продуктов в липосома соевого фосфатидилхолина содержания в них гидроперокс линолевой кислоты.

Среда инкубации: 145 мМ ЫаС1 мМ фосфатный буфер, рН 6,0. липосомы (2 мг/мл) до инкубации; липосомы + МПО (3,5 мкг/мл) + Н202 ч< 35 мин инкубации при 25°С; 3 - 2, > отсутствие хлорида.

Для приближения условий эксперимента к физиологическим была использована мстема "МПО + Н202 + СГ", продуцирующая гипохлорит in vivo. На рис. 16 приведены 1езультаты анализа ТБКРП в липосомах, содержащих гидропероксид линолевой кислоты, до i после их инкубации в присутствии МПО. Когда липосомы инкубировали в системе "МПО + )202 + С Г, наблюдался очевидный прирост ТБКРП (кривая 2). Важно отметить, что прирост БКРП возрастал по мере увеличения содержания в липосомах гидропероксида линолевой ислоты. Поскольку в отсутствие одного из субстратов МПО (СГ) мы не наблюдали окисления inriocoM (кривая 3), можно полагать, что именно гипохлорит, продуцируемый в результате !иелопероксидазного катализа по реакции (1), является причиной активации ПОЛ. Данный ывод подтверждает и тот факт, что не только перехватчик свободных радикалов - ВНТ, но и нгибитор МПО - азид натрия, перехватчики гипохлорита - таурин и метионин предотвращали ккумуляцию продуктов ПОЛ в липосомах, содержащих гидропероксид линолевой кислоты, и нкубированных в присутствии системы "МПО + Н202 + СГ". Перехватчик "ОН-радикала -1аннит не влиял на этот процесс.

Резюмируя вышеизложенные результаты, можно отметить, что только адропероксидная группа способна реагировать с НОО/ОСГ. Реакция сопровождается емилюминесценцией и вызывает значительную аккумуляцию продуктов ПОЛ в юсфатидилхолиновых липосомах. Диалкил-, диацил-, алкил-ацил-пероксиды и эпоксиды не роявляют подобных эффектов.

Механизм реакции гипохлорита с гидропероксидной группой неизвестен. Можно редположить по крайней мере два пути протекания этой реакции. Во-первых, по аналогии с зроксидом водорода (см. реакцию (4)) реакция может идти с образованием '02:

HOC! + LOOH 102 *■ СГ + Н* + LOH (7)

торая возможность - это образование свободнорадикальных интермедиатов.

Синглетный кислород, как известно (Khan and Kasha, 1970; Kanofsky, 1989), обладает 5к называемой димольной эмиссией:

102 +102 202 + h V (634 и 703 нм) (8)

мономольной эмиссией:

102->02 + /IV (1270 HM), аорые могут быть зарегистрированы в виде сверхслабого свечения (хемилюминесценции) в (димой (красной) и инфракрасной областях спектра соответственно. Это значит, что ¡милюминесценция, обусловленная 102, во-первых, не должна существенно снижаться в жсутствии красного светофильтра (с пропусканием более 600 нм) между образцом и гтектором. Во-вторых, зависимость интегральной интенсивности свечения в красной области |ектра от концентрации гипохлорита в соответствии с уравнением (8) должна носить адратичный характер (в случае избытка гидропероксида). Наконец, известно, что время «ни 102 в -10 раз продолжительнее в 020, чем в НгО (Merket et al., 1972). Это значит, что |Мена Н20 на D20 должна приводить к увеличению интенсивности свечения примерно на грядок, если, конечно, хемилюминесценция обусловлена синглетным кислородом.

Однако, ожидаемые результаты не подтвердились экспериментально. Ход зависимое интенсивности свечения от концентрации гипохлорита, добавленного к тр< бутилгидроперокиду, значительно отличался от квадратичной. Красный фильтр сниж интенсивность свечения примерно в 100 раз, а замена воды на дейтерированную приводи даже к некоторому снижению интенсивности свечения. Более того, замена Н20 на 020 ни» не влияла на окисление пипосом гипохлоритом.

Используя хемилюминометр, снабженный детектором на основе германиевс фотодиода и позволяющий непосредственно детектировать излучение в инфракрасн области спектра (при 1270 нм), нам также не удалось зарегистрировать в случае реакц гипохлорита с органическим гидропероксидом мономольную эмиссию 102. Все указанн! выше экспериментальные факты позволяют исключить возможность синтеза 10г в реакции и дают основание заключить, что '02 не участвует в ПОЛ фосфатидилхолиновых липосом п действием гипохлорита.

Таблица

Структурные формулы, химические сдвиги и сравнительная интенсивность 1Н-ЯМР сигнал продуктов реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом в СОС1з-фазе

№ п/п Название продукта Структурная формула Химический сдвиг, м.д. Интенсивность сигнала, отн.ед

1 ди-трет-бутилпероксид (СНз)зС-О-О-С(СНзЬ 1,193 1,00

2 трет-бутилгипохлорит (СН3)зСОС1 1,220 0,41

3 трет-бутилгидропероксцд (СНз)зСООН : 1,245 • _*■* .

4 трет-бутанол (СНз)зСОН 1(252 0,52

5 Неидентиф. продукт 1,320 ' 0,02

6 Вода н2о 1,540 »**

7 хлористый трет-бутил (СНз)зСС1 1,600 0,005

8 Ацетон (СНз)2С=0 2,150 0,92

•Интенсивность сигнала ди-трет-бутилпйроксида принята за 1,00.

"Интенсивность сигналов трет-бутилгидропероксида и воды не указаны,, поскольку перв! является исходным соединением, а Н20 - примесь в 020.

Методом 'Н-ЯМР был исследован спектр продуктов, образующихся в реакц гипохлорита с органическим гидропероксидом, моделью которого служил тр< бутилгидропероксид. Для этого последний инкубировали с гипохлоритом в 020. Через 10 м инкубации гидрофобные продукты экстрагировали дейтерированным хлороформом. Зал регистрировали спектры 'Н-ЯМР 020- и С0С13-фаз. Все основные продукты бы идентифицированы, их химические сдвиги приведены в табл. 4. В качестве основн! продуктов в хлороформной фазе мы видим ди-трет-бутилпероксид, трет-бутилгилохлор| трет-бутанол и ацетон. Помимо этого в водной фазе присутствовали ацетат (1,90 м.д.) метанол (3,47 м.д.). Три последних продукта могут образоваться без участия свободн!

1дикапов в результате реакции Хока с последующим протеканием так называемой лоформной реакции (Becker et al., 1977).

Особого внимания заслуживает основной продукт реакции - ди-трет-бутилпероксид. Он i взаимодействует с гипохлоритом, является конечным продуктом и, на наш взгляд, может |разоваться лишь через радикальную стадию, а именно через алкоксильный или алкильный дикал, как представлено в схеме, изображенной на рис 17 (пути 1 и 2 соответственно).

+HOCI

(СНз)зСООН —>■ (сндроо___ (CH3)3COOC(CHs)

MOW

(СНз)3С- -••> (СНэ)3СС(СНз)з

Рис. 17. Предполагаемая схема участия трет-бутоксильного радикала - (СН3)эСО" - в акции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом. Пояснения - в тексте.

Предположим, что интермедиатом является алкильный (трет-бутильный) радикал, гда, во-первых, в результате рекомбинации двух трет-бутильных радикалов среди эдуктов должен обнаруживаться гексаметилэтан (путь 2-3 на рис. 17), 1Н-ЯМР сигнал горого, как было показано нами, имеет химический сдвиг 0,85 м.д. Во-вторых, выход ди-гт-бутилпероксида должен зависеть от концентрации кислорода в реакционной смеси (см. гь 2-4-8 на рис. 17). Оба факта экспериментально не подтвердились. В спектре 'Н-ЯМР :утствовал пик с химическим сдвигом 0,85 м.д. Варьирование концентрации 02 в акциониой смеси не привело к изменению выхода ди-трет-бутилпероксида. Видимо, путь 2 ic. 17) не реализуется на практике. Остается полагать, что в качестве радикального гермедиата в реакции гипохлорита с органическим гидропероксидом выступает соксильный (трет-бутоксильный) радикал, а рекомбинация двух таких радикалов приводит к зазоваиию ди-трет-бутилпероксида (путь 1-6 на рис. 17).

Через образование трет-бутоксильного радикала легко объяснить и появление другого )дукта реакции - трет-бутанола, например, по реакции (путь 1-5 на рис. 17):

(СНз)зС-О' + (СНзЬСООН (СНэ)зСОН + (СНз)зСОО-. з реакция вполне вероятна, поскольку образующийся пероксильный радикал значительно бильнее алкоксильного (Ргуог, 1986). Более того, рекомбинация двух трет-илпероксильных радикалов дает в качестве продукта именно ди-трет-бутилпероксид (путь -7 на рис. 17) (Howard and Ingold, 1968).

Наконец, последний из основных продуктов реакции - трет-бутилгипохлорит - может >азоваться как в результате прямого взаимодействия гипохлорита с трет-

бутилгидропероксидом или трет-бутанолом (Metzger, 1989), так и при действии тр бутоксильного радикала на HOCI или Cl2. Последние, как известно (Wiberg, 1985), в вод> растворе находятся в равновесии.

Механизм образования трет-бутоксильного радикала остается открытым. Один возможных путей - гомолитический разрыв О-О-связи в трет-бутилгиДропероксиде i действием гилохлорита. Другой - синтез нестойкого соединения (СНз)зСООС1 (как предлагалось в случае реакции с пероксидом водорода (Connick, 1947)) и последующий распад с образованием трет-бутоксильного радикала.

Так или иначе, но полученные результаты свидетельствуют о том, что реак: гипохлорита с органическим гидропероксидом протекает через стадию радикалообразован В пользу данного предположения говорят следующие экспериментальные факты. Во-перв эта реакция сопровождается хемилюминесценцией не в красной обрасти спектра, характерно для радикальных реакций. Во-вторых, стехиометрическое соотноше гилохлорит/гидропероксид заметно превышает эквимолярное. Наконец, аккумуляция ТБКР липосомах из яичного фосфатидилхолина, содержащих пероксид трет-бутила или линоле кислоты, в присутствии гипохлорита полностью подавлялась перехватчиком свобод! радикалов - ВНТ.

Таким образом, гипохлорит реагирует с органическим гидропероксидом образования синглетного кислорода. ' Реакция протекает через радикальные ста; вероятнее всего с образованием' алкоксильных радикалов, сопровождае хемилюминесценцией и вызывает аккумуляцию продуктов ПОЛ в ненасыщенном липиде.; дает основание полагать, что органические гидропероксиды, всегда присутствующи! некотором количестве в липидной фазе биологических мембран и липопротеинов in v могут играть роль того соединения, взаимодействие гипохлорита с которым приводу образованию источника свободных радикалов - инициаторов ПОЛ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На рис. 18 приведена схема, позволяющая на основании полученных в раб результатов объяснить взаимосвязь двух важных процессов: 1) образования окисленных Г крови и 2) активации моноцитов и нейтрофилов; а также возможную причастнс модифицированных гипохлоритом ЛП к проявлению ранних стадий атеросклероза.

ЛОНП с повышенным содержанием липопероксидов секретируются клетками печег трансформируются в окисленные ЛНП (путь 1 на рис. 18). Последние активируют монощ нейтрофилы, а возможно и другие клетки (путь 2). Стимулированные нейтрофилы и моноц секретируют МПО и продуцируют '02\ который под действием СОД дисмутирует до Н Поскольку физиологическая концентрация СГ весьма высока, то создаются все условия протекания реакции (1). Образующийся гипохлорит модифицирует нативные ЛП (путь Такой модификации способствуют нитрит (N02") и гемоглобин (Hb). Это приводи значительным изменениям физико-химических свойств ЛП: деградируют антиоксида! увеличивается чувствительность ЛП к окислительной модификации, аккумулируются прод)

кислительной деструкции липида и белка, изменяется структурная организация полипопротеинов и липидной фазы, увеличивается отрицательный заряд поверхности ЯП.

[йтрофилов и в проявлении ранних стадий атеросклероза. Пояснения в тексте.

Модифицированные таким образом ЛП способны:

- взаимодействуя с моноцитами-макрофагами (по рецептор-независимому пути или же рез рецепторы-мусорщики), вызывать в них усиленную аккумуляцию холестерина, ансформируя их в пенистые клетки - важный признак ранних стадий атеросклеротического оцесса (путь 4 на рис. 18);

- активировать моноциты и нейтрофилы, усугубляя протекание радикальных реакций )Л в их присутствии, и замыкать тем самым порочный круг образования в крови окисленных I (путь 2);

- повышать уровень холестерина в эндотелиоцитах (путь 5) и стимулировать адгезию к цотелию эритроцитов (путь 6), а возможно и других клеток крови, способствуя эросклеротическому поражению сосудов.

>1ВОДЫ:

1. Инкубация моноцитов и нейтрофилов крови человека с ЛНП приводит к эоксидации последних. Установлено, что инициирование перекисного окисления липидов шупированными нейтрофилами и моноцитами протекает по сеободнорадикапьному ханизму, но без участия 'ОН-радикала. Важная роль в инициировании ПОЛ может

принадлежать гипохлориту, образующемуся при активации этих клеток. Липопроте модифицированные гипохлоритом или в результате автоокисления, вызывают активе моноцитов и нейтрофилоа, способствуя образованию инициаторов радикальных реакц дальнейшей интенсификации ПОЛ.

2. На модели перфуэируемой печени кролика показано, что при эксперимента™ атеросклерозе гепатоциты секретируют модифицированные ЛП с повышенным содержа» продуктов ПОЛ. Применение диеты, обогащенной антиоксидантами, достоверно сни) уровень продуктов ПОЛ в гомогенате печени, перфузате и изолированных из него ЛП, а т приводило к уменьшению степени атеросклеротического поражения аорты.

3. Гипохлорит проникает в липидную фазу липопротеинов, вызывая при деградацию липидорастворимых антиоксидантов; снижение резистентности ЛНП к 1 индуцированной пероксидации; аккумуляцию первичных, вторичных и конечных прод) окисления липидов; нарушение физико-химических свойств лилидной фазы (уменьш подвижности и увеличение полярности вплоть до 12-ого С-атома ацильной цепи); увелич доли белка с более подвижными БН-группами; увеличение отрицательного потенц поверхности ЛП.

4. Окислительная модификация ЛП приводит к нарушению их холестерин-транспор функции. Предварительно окисленные ЛНП эффективнее транспортируют холестер клетки как содержащие, так и не содержащие специфические рецепторы к ЛП. Перем модификация лишает ЛВП холестерин-акцепторной функции. Оба факта способст аккумуляции холестерина в клетках. Аналогичные нарушения холестерин-транспор способности ЛП обнаружены у больных ишемической болезнью сердца.

5. Гипохлорит стимулирует адгезию эритроцитов к моноспою эндотелиальных кле вызывает аккумуляцию холестерина в зндотелиоцитах, воздействуя на эндот непосредственно или опосредованно через модификацию ЛНП.

6. Гипохлорит реагирует с нитритом с бимолекулярной константой ско[ (7,4 ± 1,3)«103 М"1с"1 (рН 7,2). В ходе этой реакции образуется реакционный интерме который значительно эффективнее гипохлорита разрушает антиоксиданты в увеличивает чувствительность ЛНП к Си2+-мндуцированному окислению; интенст гипохлорита инициирует ПОЛ в ЛНП, нитрует остатки тирозина. Модифицированные ^ образом ЛНП трансформируют макрофагальные клетки в клетки, подобные пенистым.

7. Основной реакцией гипохлорита с ненасыщенным и жирнокислотными це является электрофильное присоединение по двойной связи (по молекулярному механизи стехиометрическим соотношением, изменяющимся от 2 до 1 по мере увеличения о концентрации двойных связей в липосомах и числа двойных связей в одной жирнокисл! цепи. Продуктом реакции является хлоргидрин. Предложен механизм взаимодей гипохлорита с ненасыщенными связями ацильных цепей фосфатидилхолина в со липосом.

8. Электрофильное присоединение гипохлоригта по двойной связи в присутствии асыщенного липида сопровождается перекисным окислением пипидов. Установлено, что 1ия инициирования ПОЛ в присутствии гипохлорита может быть реализована благодаря

реакции с органическим гидропероксидом, которая протекает с образованием икальных интермедиатов, вероятно, алкоксильных радикалов.

9. Совокупность полученных результатов позволила предложить гипотезу, согласно •рой гипохлорит, образующийся при активации нейтрофилов и моноцитов, является ;нциальным модификатором ЛП in vivo и может играть ключевую роль в развитии ранних 1ий атеросклеротического поражения сосудов.

ЮВНЫЕ НАУЧНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: асенко О.М., Азизова O.A., Торховская Т.И., Дудаев В.А., Владимиров Ю.А. Изучение гоиндуцированных структурных изменений в липопротеидах плазмы человека методом ювых зондов. Биохимия, 1983,48, 1667-1673.

асенко О.М., Азизова O.A., Торховская Т.И., Дудаев В.А. Термотропные структурные зстройки в липопротеидах плазмы крови при ишемической болезни сердца. Бюл. ерим. биологии и медицины, 1984, 97, N 5, 558-561.

асенко О.М., Азизова O.A., Торховская Т.И., Дудаев В.А. Изучение особенностей ктурной организации липопротеидов плазмы крови больных ишемической болезнью ща методом спиновых зондов. Вопр. мед. химии, 1984, 30, N2 6,40-45. асенко О.М., Азизова O.A. Изучение методом спинового зонда термоиндуцированных ктурных изменений в липопротеидах плазмы человека в норме и при ишемической ¡зни сердца. Studia Biophysica, 1984,103,133-138.

iH М.Л., Кедик С.А., Володарский Л.Б., Швец В.И., Панасенко О.М., Азизова O.A. 1декан-7-спиро-2'(М-оксил-4,,5',5'-триметил-ЛЗ-имидазолин}овая кислота или ее овый эфир для изучения липид-белковых комплексов. Авт. Свид. СССР №1142474. изобр. СССР, 1985, № 8.

IH М.Л., Швец В.И., Панасенко О.М., Азизова O.A., Лукьянчикова И.А. Октадекан-7-о-2'{М-оксил-4',5',5'-триметил-ДЗ-имидазолин)-триметиламмония метансульфонат в гтве нитроксильного зонда для оценки изменения заряда липопротеидов. Авт. Сайд. Р №1174429. Бюл. изобр. СССР, 1985.

юенко О.М., Деев А.И., Деева И.Б., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Изучение методом звых зондов структурных изменений на различной глубине фосфолипидных мембран е их пероксидации. Биофизика, 1985, 30, 817-821.

iceHKO О.М., Борин М.Л., Азизова O.A., Арнольд К. Определение поверхностного заряда протеидов и его изменения при лерекисном окислении липидов. Биофизика, 1985, 30, )27.

сенко О.М., Азизова O.A. Способ определения липопротеидов. Авт. Свид. СССР 33434. Бюл. изобр. СССР, 1986, № 1.

10. Панасенко О.М., Азизова O.A., Борин М.Л., Арнольд К. Изучение поверхностного зар? липопротеидов плазмы при их аутоокислении. Бюл. эксперим. Биологии и медицины, 19 101, №1,24-26.

11. Панасенко О.М., Азизова О.А.;-Арнольд К., Борин М.Л. Изменение потенциала поверхно! липопротеидов плазмы при ишейичёской болезни сердца. Исследования с помош спиновых зондов. Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1986, 101, № 6, 690-693.

12. Panasenko О.М., Azizova O.A., Arnold К., Borin M.L. Alterations of surface charges of plas lipoproteins in ischemic heart diseaséJBiómed. Biochim. Acta, 1987, 46, 97-102.

13. Владимиров Ю.А., Панасенко O.M., Азизова O.A. Взаимодействие Fe(ll) с акцептора электрона, находящимися в лилидной фазе мембран и липопротеинов. Биол. мембран 1987,4,906-912.

14. Панасенко О.М., Борин М.Л., Азизова O.A. Сравнение структурной организаь поверхности липопротеидов и биологических мембран. Изв. АН СССР, сер. биол., 19 №6,837-846. ....

15. Панасенко О.М., , Вольнова. TÜB., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Перекисное окисле» липидов влияет на перенос холестерина между липопротеинами высокой плотное™ биомембранами. Биол. мембраны, 1987,4,1319-1324.

16. Панасенко О.Мм Вольнова. Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Перекисное окисле» липидов влияет на перенос, холестерина между липопротеинами низкой плотности биомембранами. Биол. мембраны, 1987, 4,875-881.

17. Krumbiegel M., Zschornig.O., Arnold К., Panasenko O.M., Vol'nova T.V., Azizova O.A., D< A.I., Herrmann К. Interaction of glycosaminoglycans with low density lipoproteins and liposon detected by altérations of surface potential. Chem. Phys. Lipids, 1988, 48, 83-89.

18. Вольнова T.B., Панасенко O.M., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Окисленные производи холестерина способствуют переносу стероида меизду модельными липопротеинами биологическими мембранами. Биол. мембраны, 1988,5,635-642.

19. Панасенко О.М., Ли Хо Ик , Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Влияние холестерина скорость восстановления спиновых зондов в липосомах ионами Fe(ll). Биол. мембра> 1988, 5, 872-877.

20. Панасенко О.М., Азизова O.A. Определение концентрации липопротеидов плазмь помощью спинового зонда. Биофизика, 1988, 33, 165.

21. Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Перекисное окисле» липидов - фактор, способствующий накоплению холестерина в клетках при атерогене Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1988,106, № 9, 277-280.

22. Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Изучение метод спиновых зондов изменений структуры на различной глубине липопротеинов низ! плотности после их пероксидации. Биол. мембраны, 1988, 5,1186-1191.

izova O.A., Panasersko О.И., Vol'nova T.V., Vladimirov Yu.A. Free radical lipid oxidation cts cholesterol transfer between lipoproteins and erythrocytes. Free Radio. Biol. Med., 1989, 51-257.

анасенко O.M. Сравнительное исследование восстановления спиновых зондов с иридиновым, оксазолидиновым и имидазолиновым фрагментами в липопротеинах овека аскорбатом. Рук. den. в ВИНИТИ 18.10.1989: № 6311-В89, 1989. Jdimirov Yu.A., Vol'nova T.V., Panasenko O.M., Azizova O.A. Free radical modification of proteins and cholesterol accumulation in cells upon atherosclerosis. Free Radio. Biol. Med.,

0, 9, Suppl.1,73.

эльнова T.B., Панасенко O.M., Заречнева H.B., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. екисная модификация липопротеинов низкой плотности приводит к рецептор-звисимой аккумуляции холестерина в моноцитах человека. Биол.мембраны, 1990, 7, ■148.

!насенко О.М. Применение метода спиновых зондов для измерения поверхностного !нциала, pH белок-липидных комплексов и объема везикул. Биофизика, 1990, 35, 536. zlov A.V., Panasenko О.М., Yegorov D.Y., Vol'nova T.V., Vladimirov Yu.A., Azizova,O.A. Dxidant properties of albumin during the oxidation of linolenic acid and low density iroteins in the presence of ferrous ions. Biomed. Sc/., 1991, 2, 530-535. nasenko O.M., Vol'nova T.V., Osipov A.N., Azizova O.A., Vladimirov Yu.A. Free-radical эration by monocytes and neutrophils: a possible cause of plasma lipoprotein modification. led. Sei., 1991, 2, 581-589.

nasenko O.M., Vol'nova T.V., Azizova O.A., Vladimirov Yu.A. Free radical modification of iroteins and cholesterol accumulation in celts upon atherosclerosis. Free Radio. Biol. Med., 1,10,137-148.

анасенко O.M., Евгина C.A., Сергиенко В.И. Взаимодействие электрохимически ученного гипохлорита натрия с липопротеинами крови человека. В кн.: ктрохимические методы в медицине. Ред. Лопухин Ю.М., Москва: НИИ ФХМ МЗ РФ,

1, 7-8.

жасенко О.М., Вольнова Т.В., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов ряет взаимодействие Fe(ll) с акцепторами электрона, локализованными в липидной з липопротеинов крови человека. Биол. мембраны, 1991, 8, 532-538. lasenko О.М., Azizova O.A., Vladimirov Yu.A. Peroxidation of blood lipoproteins and the ilopment of atherosclerosis. Soviet Medical Reviews. Section 8: Physicochemical Aspects of icine Reviews. Vol. 3, Part 3. Ed. Lopukhin Yu.M., N.Y.: Harwood Academic Publishers, !, 1-74.

ина C.A., Панасенко O.M., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление (протеинов крови человека, индуцированное гипохлорит-анионом. Биол. мембраны, !, 9, 946-953.

35. Панасенко О.М., Сдвигова А.Г., Сергиенко В.И., Лопухин Ю.М. Печень кролика г экспериментальном атеросклерозе секретирует окисленные липопротеины. Бюл. эксперI биологии и медицины, 1992,113, № 2, 143-144.

36. Zschornig О., Machill Н., Panasenko О.М., Volnova T.V., Arnold К., Azizova О.А. Influence polar polymers on the apoprotein region of human serum lipoproteins: an electron paramagns resonance (EPR) study. Gen. Physiol. Biophys., 1993, 12,113-124.

3?. Панасенко O.M., Евгина C.A., Сергиенко В.И. Исследование методом спиновых зон; изменения структуры липопротеинов крови человека под действием гипохлорита натр! Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1993, 116, №8, 153-155.

38. Панасенко О.М., Сергиенко В.И. Свободнорадикальная модификация липопротеинов крс и атеросклероз. Биол. мембраны, 1993,10, 341-382.

39. Панасенко О.М., Евгина С.А., Сергиенко В.И. Изучение способности гипохлорита проник; в липидную фазу липопротеинов крови человека. Бюл. эксперим. биологии и медицш 1993,115, №4, 358-360.

40. Панасенко О.М., Петренко Л.И., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И. Способ анал! модифицированных окислением липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови. Ai заявка №5042682 от 20.05.92. Полож. реш. от 26.04.93.

41. Сдвигова А.Г., Панасенко О.М., Лукьященко И.В., Сергиенко В.И., Лопухин Ю.М. Коррею. полиненасыщенными жирными кислотами в комплексе с антиоксидантами перекиси! окисления липопротеинов при экспериментальном атеросклерозе. Вопр. мед. химии, 19 39, № 2, 30-33.

42. Panasenko О.М., Evgina S.A., Driomina E.S., Sharov V.S., Sergienko V.I., Vladimirov Yt Oxidative modification of human blood lipoproteins due to hypochlorite, released by activa phagocytes: a possible mechanism of atherogenesis. Free Radio. Biol. Med., 1994,16,14.

43. Panasenko O.M., Evgina S.A., Aidyraliev R.K., Sergienko V.I., Vladimirov Yu.A. Peroxidation human blood lipoproteins induced by exogenous hypochlorite or hypochlorite generated in system of "myeloperoxidase + H202 + CP. Free Radio. Biol. Med., 1994,16, 143-148.

44. Panasenko O.M., Arnhold J. Peroxidation of human blood lipoproteins and phosphatidylchol liposomes induced by hypochlorous ecid. In: Advances in lipoprotein and atherosclerc research, diagnostics and treatment. Ed. Jaross W., Bergmann S., Hanefeld M., Dude H., Je Stuttgart-New York: Gustav Fischer Verlag, 1994, 70-73.

45. Panasenko O.M., Arnhold J., Schiller J., Arnold K., Sergienko V.I. Peroxidation of egg у phosphatidylcholine liposomes by hypochlorous acid. Biochim. Biophys. Acta, 1994, 1215, 2 266.

46. Якутова Э.Ш., Дремина E.C., Евгина C.A., Осипов А.Н., Шаров B.C., Панасенко О. Владимиров Ю.А. Образование свободных радикалов при взаимодействии гипохпорит; ионами железа (II). Биофизика, 1994, 39, 275-279.

-nhold J., Panasenko O.M., Schiller J., Vladimirov Yu.A., Arnold K. The action of hypochlorous d on phosphatidylcholine liposomes in dependence on the content of double bonds, lichiometry and NMR analysis. Chem. Phys. Lipids, 1995, 78, 55-64.

anasenko O.M., Amhold J., Sonntag K., Arnold K. International of lipid peroxidation by jochlorous acid produced by stimulated neutrophils. Europ. J. Cell Biol., 1995, Suppl.Vol., 48. anasenko O.M., Evgina S.A., Driomina E.S., Sharov V.S., Sergienko V.I., Vladimirov Yu.A. pochlorite induces lipid peroxidation in blood lipoproteins and phospholipid liposomes. Free die. Biol. Med., 1995,19, 133-140.

Момыналиев K.T., Панасенко O.M., Говорун B.M., Сергиенко В.И. Гипохлорит-дуцированная деструкция липидного компонента пипопротеинов крови человека. Биол. мбраны, 1995,12, 385-390.

анасенко О.М., Арнхольд Ю., Владимиров Ю.А., Арнольд К., Сергиенко В.И. Применение года хемилюминесценции в исследовании кинетики взаимодействия гипохлорита с сфатидилхолиновыми липосомами. Биофизика, 1995, 40,1234-1242. анасенко О.М., Евгина СЛ., Никитин С.В., Сергиенко В.И. Влияние гипохлорита на гктрические свойства поверхности липопротеинов крови человека. Биофизика, 1995, 40, 5-550. ""

анасенко О.М., Евгина С.А., Дремина Е.С., Шаров B.C., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А. пь Fe(ll) в перекисном окисленйи липидов липосомальных мембран, инициированном юхлоритом натрия. Биол. мембраны, 1995,12, 191-199.

анасенко О.М., Арнхольд Ю., Арнольд К., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А. Хелаторы job' железа: десфероксамин и ЭДТА ингибируют индуцированное гипохлоритом >екисное окисление фосфолипидных липосом, перехватывая HOCI/OCI". Биол. »браны, 1995,12, 294-302.

1анасенко О.М., Арнхольд Ю., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И. Взаимодействие охлорита с гидропероксидами и другими продуктами окисления фосфатидилхолиновых юсом. Биохимия, 1995, 60, 1419-1428.

эргиенко В.И., Мурина М.А., Панасенко О.М., Трунилина Н.Н., Евгина С.А., Айдыралиев Рощупкин Д.И. Молекулярные механизмы действия гипохлорита натрия на •мбоциты и липопротеины. Вестник РАМН, 1995, N2 3, 48-53.

nhold J., Panasenko О М., Schiller J., Arnold К., Vladimirov Yu.A., Sergienko V.I. Reaction of lochlorous acid with hydrogen peroxide and tert-butyl hydroperoxide. 1H-NMR Spectroscopy I chemiluminescence analyses. Z Naturforsch., 1996, 51c, 386-394.

эмыналиев K.T., Говорун B.M., Панасенко O.M., Сергиенко В.И. Участие холестерина в охлорит-индуцированном окислении холестерин-фосфатидилхолиновых липосом. Бюл. перим. биологии и медицины, 1996, № 5, 516-519.

1анасенко О.М., Арнхольд Ю., Арнольд К., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И. авнительное исследование кинетики пероксидации фосфолипидных липосом, 1уцированной гипохлоритом и в системе Fe(ll) + аскорбат. Биофизика, 1996, 41, 334-341.

60. Панасенко О.М., Арнхольд Ю. Механизм гипохлорит-индуцированного перекиснс окисления липидов фосфолипидных липосом. Биол. мембраны, 1996,13, 69-99.

61. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Сергиенко В.И., Арнольд К., Владимиров Ю Стехиометрия взаимодействия гипохлорита с ненасыщенными связями фосфатидилхоли и свободных жирных кислот в составе липосом. Биол. мембраны, 1996,13, 271-281.

62. Gorbatenkova Е.А., Artmann G.M., Panasenko О.М. Erythrocyte adhesion to endothelial ce activated by HOCI and HOCI-modified LDL. Bump. J. Cell Biol. , 1997, 72, 24,

63. Panasenko O.M.. Arnhold J., Vladimirov V.A., Arnold K., Sergienko V.I. Hypochlorite-induc peroxidation of egg yolk phosphatidylcholine is mediated by hydroperoxides. Free Rad. Re 1997,27,1-12.

64. Panasenko O.M., Schiller J., Arnhold J. Hypochlorous acid-induced effects on phospholipii Biol. ChemistryHoppe-Seyler., 1997, 378,79.

65. Panasenko O.M., Briviba K,, Klotz L.-O., Sies H. Oxidative modification and nitration of hum low-density lipoproteins by the reaction of hypochlorous acid with nitrite. Arch. Biochem. a Biophys., 1997, 343, 254-259.

66. Panasenko O.M. The mechanism of the hypochlorite-induced lipid peroxidation. BioFacto 1997, 6,181-190.

67. Panasenko O.M., Briviba K., Klotz L.-0., Sies H. Reaction of HOCI with nitrite causes li| peroxidation, loss of antioxidants, and nitration of tyrosine residues in human LDL. a Chemlstiy Hoppe-Seyler., 1997, 378, 79.

68. Осипов A.H., Брюханова Э.В., Вахрушева T.B., Панасенко O.M., Владимиров Ю.А. Влиян гипохлорита и перекиси водорода на способность гемоглобина стимулировать перекисн окисление липидов липопротеинов низкой плотности. Биофизика, 1997, 42,400-407.

69. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Сергиенко В.И. Влияние хлорита, хлората и перхлора натрия на гипохлорит-индуцированное перекисное окисление фосфолипидных липосс Биол. мембраны, 1997,14, 207-211.

70. Панасенко О.М., Арнхольд Ю„ Шиллер Ю. Гипохлорит взаимодействует с органическ гидропероксидом с образованием свободных радикалов, но не синглетного кислоро; инициируя перекисное окисление липидов. Биохимия, 1997, 62,1111-1121.

71. Панасенко О.М., Панасенко О.О., Бривиба К., Сис Г. Гипохлорит разрушает каротиноидь липопротеинах низкой плотности, снижая их резистентность к перекисной модификащ Биохимия, 1997, 62, 1332-1338.

72. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Сергиенко В.И. Влияние рН на перекисное окислен фосфолипидных липосом, индуцированное гипохлоритом. Биофизика, 1998, 43, 463-469.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Панасенко, Олег Михайлович

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Образование гипохлорита в организме

1.2. Физико-химические свойства хлорноватистой кислоты и гипохлорита

1.3. Роль модифицированных окислением липопротеинов крови в атерогенезе

Перекисное окисление липидов, липопротены и атеросклероз

Перекисная модификация липопротеинов

Пути появления окисленных липопротеинов в крови

1.4. Постановка цели и задач исследования

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы

2.2. Изолирование объектов исследования

2.3. Приготовление объектов исследования

2.4. Методы анализа

2.5. Флуоресцентные исследования

2.6. ЯМР-исследования

2.7. Хемилюминесценция

2.8. Метод остановленной струи

2.9. Метод ЭПР спиновых меток и зондов

2.10. Окислительная модификация липопротеинов и липосом

2.11. Инкубация липопротеинов и липосом с белками и клетками

2.12. Адгезия эритроцитов к эндотелию

2.13. Перфузия печени кроликов

2.14. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ПОЯВЛЕНИЯ ОКИСЛЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ

В КРОВИ

3.1. Синтез и секреция окисленных липопротеинов клетками печени

3.2. Окисление липопротеинов в кровотоке

3.2.1. Моноциты

3.2.2. Нейтрофилы

3.3. Активация моноцитов и нейтрофилов окисленными липопротеинами

Автоокисленные липопротеины

Липопротеины, модифицированные гипохлоритом

ГЛАВА 4. ГИПОХЛОРИТ-ИНДУЦИРОВАННАЯ МОДИФИКАЦИЯ

ЛИПОПРОТЕИНОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

4.1. Перекисное окисление липопротеинов крови, вызванное гипохлоритом

4.1.1. Способность гипохлорита проникать в липидную фазу липопротеинов

4.1.2. Аккумуляция продуктов ПОЛ в липопротеинах, обработанных гипохлоритом

4.1.3. Влияние перехватчика свободных радикалов - ионола (ВНТ) на гипохлорит-индуцированное окисление липопротеинов

4.1.4. Взаимодействие гипохлорита с антиоксидантами в составе липопротеинов

4.1.5. Снижение резистентности ЛНП к Си2*-индуцированной пероксидации под действием гипохлорита

4.1.6. Сравнительное исследование ПОЛ липопротеинов разных классов в присутствии экзогенного гипохлорита и образующегося в системе "миелопероксидаза+Н202+СГ"

4.2. Изменение физико-химических свойств липопротеинов в результате их пероксидации

4.2.1. Модификация структуры липопротеинов после автоокисления

Липидная фаза

Аполипопротеины

Белок-липидные взаимодействия

Изменение поверхностного заряда

4.2.2. Гипохпорит-индуцированная модификация структуры липопротеинов

Липидная фаза

Аполипопротеины

Изменение поверхностного заряда

4.3. Холестерин-транспортная функция окисленных липопротеинов

4.3.1. Влияние ПОЛ на перенос холестерина между липопротеинами и клетками, содержащими рецепторы к ЛП (на примере моноцитов и макрофагов)

Автоокисленные ЛНП

ЛНП, модифицированные гипохлоритом

4.3.2. Исследование переноса холестерина между липопротеинами и клетками, не содержащими рецепторов к ЛП (на примере эритроцитов)

Автоокисленные липопротеины

ЛНП, модифицированные гипохлоритом

4.3.3. Изменение холестерин-транспортной способности липопротеинов при ИБС

4.4. Влияние гипохлорита и ЛНП, модифицированных гипохлоритом на адгезию клеток крови к эндотелию

4.5. Участие некоторых физиологически важных молекул в модификации липопротеинов гипохлоритом

4.5.1. Участие нитрита в гипохлорит-индуцированной модификации липопротеинов

Исследование взаимодействия НОС1 с Ы02"

Разрушение антиоксидантов в ЛНП в присутствии смеси

Н0С1/М02"

Увеличение чувствительности ЛНП к пероксидации под действием смеси Н0С1/М02"

Интенсификация гипохлорит-индуцированного ПОЛ в ЛНП под действием Ы02"

Увеличение холестерин-транспортной способности ЛНП под действием Н0С1/1М02~

Образование 3-нитротирозина в ЛНП под действием Н0С1/1М02"

4.5.2. Влияние гипохлорита на способность гемоглобина окислять

4.5.3. Влияние хелаторов ионов железа на гипохлорит-индуцированное ПОЛ

4.5.4. Холестерин и гипохлорит-индуцированное ПОЛ

ГЛАВА 5. МЕХАНИЗМ ГИПОХЛОРИТ-ИНДУЦИРОВАННОГО ПЕРЕКИСНОГО

ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

5.1. Гипохлорит-индуцированная аккумуляция продуктов ПОЛ в фосфолипидных липосомах

5.1.1. Аккумуляция первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

Исчезновение двойных связей

5.1.2. Ре2*-индуцированная хемилюминесценция

5.1.3. Сравнение с системой 'Те2* + аскорбат"

5.1.4. Действие антиоксидантов

5.1.5. Влияние рН среды

5.1.6. Влияние хлорита, хлората и перхлората натрия на гипохлорит-индуцированное ПОЛ

5.2. Инициирование гипохлорит-индуцированного ПОЛ

5.2.1. Роль водорастворимых интермедиатов в инициировании гипохлорит-индуцированного ПОЛ

Пероксид водорода

Супероксидный анион-радикал

Ионы железа

5.2.2. Взаимодействие гипохлорита с функциональными группами фосфатидилхолина

5.2.3. Роль липид-связанных минорных компонентов в инициировании

ПОЛ, индуцированного гипохлоритом

Взаимодействие гипохлорита с продуктами ПОЛ фосфолипидных липосом

Взаимодействие гипохлорита с ТБК-реактивными продуктами

Взаимодействие гипохлорита с органическими пероксидами и эпоксидами

Хемилюминесценция, сопровождающая реакцию гипохлорита с гидропероксидами

Участие органических пероксидов и эпоксидов в гипохлорит-индуцированном ПОЛ

Роль гидропероксида линолевой кислоты в ПОЛ, инициированном системой "миелопероксидаза + Н202 + СГ

5.2.4. Механизм взаимодействия гипохлорита с органическими гидропероксидами

Синглетный кислород как возможный интермедиат в реакции гипохлорита с гидропероксидом

Образование свободных радикалов в реакции гипохлорита с гидропероксидом

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека"

Хлорноватистая кислота (HOCI) или ее ионизированная форма - гипохлорит-анион (ОСГ) образуются in vivo при стимуляции нейтрофилов или моноцитов-макрофагов [57,254,404]. Именно НОС1/ОСГ принадлежит основная антимикробная функция, которую выполняют нейтрофилы в организме [57,254].

Однако, вместе с тем следует иметь ввиду, что НОС1/ОСГ является чрезвычайно реакционным соединением. Так было установлено, что НОС1/ОСГ взаимодействует с липидами [385,416], нуклеиновыми кислотами [343,388,389], углеводами [342], аминокислотами [11,411] и белками, инактивируя многие ферменты [92,227,355,402], проявляет токсический эффект в отношении не только бактериальных клеток, но и фибробластов, эндотелиальных клеток, эритроцитов, тромбоцитов [147,148,176,317,356]. Можно полагать, что все эти эффекты способны вызывать in vivo неспецифическое повреждение клеток и белок-липидных комплексов, в частности липопротеинов (ЛП) крови, находящихся в непосредственной близости от стимулированных нейтрофилов и моноцитов (очаги воспаления и т.п.).

ЛП плазмы крови являются основной транспортной формой липидов в организме человека и животных [37]. В настоящее время известно, что окислительная модификация ЛП - важный риск-фактор возникновения ряда патологических состояний, в частности атеросклероза [109,170,211]. Одна из вероятных причин образования окисленных ЛП в крови - взаимодействие нативных ЛП с активными формами кислорода (*02", Н202, *ОН), генерируемыми активированными нейтрофилами и моноцитами-макрофагами [33,109,170,221].

Исследованиями последних лет установлено, что супероксидный анион-радикал (*02") и пероксид водорода (Н202) сами по себе являются малоэффективными окислителями липидов [29,33]. Результаты работ [221,316,340] дают основание полагать, что гидроксильный радикал ('ОН), образующийся при взаимодействии этих продуктов с ионами металлов переменной валентности, не принимает участия в реакции окисления ЛП нейтрофилами и фагоцитами. В этом случае можно предположить, что окислительная модификация ЛП осуществляется в результате взаимодействия последних с гипохлоритом, который образуется в реакции, катализируемой ферментом нейтрофилов и моноцитов -миелопероксидазой (МПО), и является сильным окислителем.

К началу работы в литературе отсутствовали данные о существовании окислительной деструкции ЛП крови гипохлоритом или в присутствии МПО. Однако имелись косвенные указания в пользу возможности такой модификации. Фермент МПО весьма стоек [77], его содержание в нейтрофилах чрезвычайно велико: до 5% сухого веса клетки [347]. Более 20% фермента стимулированные нейтрофилы секретируют во внеклеточную среду [359]. Около трети всего кислорода, потребляемого нейтрофилами при активации затрачивается на образование НОС1/ОСГ [182]. При взаимодействии гипохлорита с Н2Ог образуется синглетный кислород - инициатор перекисного окисления липидов (ПОЛ) [328]. Было установлено [145,251], что в определенных условиях "Ог" может служить наряду с Н202 субстратом для МПО. При этом образуется все тот же гипохлорит. HOCI/OCI" модифицирует низкомолекулярные антиоксиданты в составе ЛП [84], а также ряд ферментов (СОД, каталазу, глутатионпероксидазу) и белков плазмы (церулоплазмин, трансферрин), обладающих антиокислительной функцией [13,75,92,355]. Внутривенное введение экспериментальным животным метионина - эффективного перехватчика гипохлорита - в условиях активации нейтрофилов крови предотвращало аккумуляцию продуктов ПОЛ в сыворотке и сердечной ткани [325].

Известно, что HOCI/OCI" способен реагировать со многими ксенобиотиками с образованием интермедиатов свободнорадикальной природы [111,213,242,250,360,390]. Это дает основание полагать, что HOCI/OCI" может являться потенциальным инициатором свободнорадикальных реакций ПОЛ.

Действительно, Sepe и Clark [349,350] показали, что экзогенный HOCI/OCI", а также продуцируемый в системе "МПО + Н202 + CP или в присутствии стимулированных нейтрофилов, вызывал лизис липосом из ненасыщенного фосфатидилхолина. Эффект отсутствовал, если липосомы были сформированы из насыщенного фосфолипида (дипальмитоилфосфатидилхолина) или же, если в среду инкубации были добавлены липидорастворимые антиоксиданты: а-токоферол или р-каротин. Эти результаты послужили косвенным указанием на то, что HOCI/OCI" по свободнорадикальному механизму реагирует с ненасыщенными связями фосфатидилхолина, возможно, инициируя реакции ПОЛ.

Итак, совокупность экспериментальных фактов, накопившихся к концу 80-х годов, позволила нам предположить возможное участие гипохлорита, продуцируемого при активации нейтрофилов или моноцитов по реакции, катализируемой МПО, в окислительной модификации ЛП крови человека.

В связи с этим в работе была поставлена цель: изучить механизм модификации физико-химических свойств липопротеинов крови человека гипохлоритом, выявить изменение основных биологических функций у таких ЛП и определить их возможную причастность к формированию ранних проявлений атеросклеротического процесса.

Научная новизна работы. В диссертационной работе впервые подробно исследована кинетика взаимодействия гипохлорита с двойными связями свободных жирных кислот и жирнокислотных цепей фосфатидилхолина. Показано, что основной реакцией гипохлорита с ненасыщенными жирнокислотными цепями является электрофильное присоединение по двойной связи (по молекулярному механизму) со стехиометрическим соотношением, изменяющимся от 2 до 1 по мере увеличения общей концентрации двойных связей в липосомах и числа двойных связей в одной жирнокислотной цепи. Основным продуктом реакции является хлоргидрин. Предложен механизм взаимодействия гипохлорита с ненасыщенными связями ацильных цепей фосфолипида в липидной фазе.

Впервые продемонстрировано, что гипохлорит, который образуется при активации нейтрофилов или моноцитов по реакции, катализируемой МПО, помимо электрофильного присоединения по двойной связи индуцирует в ненасыщенном липиде радикальные реакции ПОЛ. Это приводит к образованию в фосфолипидных липосомах или ЛП первичных (липопероксидов, диеновых конъюгатов), вторичных (ТБК-реактивных продуктов) и конечных (флуоресцирующих) продуктов ПОЛ. Исследован механизм инициирования гипохлорит-опосредованного ПОЛ. Показано, что стадия инициирования ПОЛ в присутствии гипохлорита (экзогенного или продуцируемого в системе "МПО + Н2О2 + СП') может быть реализована благодаря его реакции с органическими гидропероксидами, всегда присутствующими в некотором количестве в ненасыщенном липиде. В ходе этой реакции образуются свободные радикалы, вероятнее всего алкоксильные, являющиеся эффективными инициаторами ПОЛ.

Впервые исследована роль ионов железа в гипохлорит-индуцированном ПОЛ. Установлено, что гипохлорит реагирует с ?е2+ с бимолекулярной константой скорости 114 ± 7 М*1с1 (рН 7,2) с образованием свободных радикалов. Однако, ни Ре2+, ни Ре3+ не принимают участия в стадии инициирования гипохлорит-индуцированного ПОЛ, по крайней мере в условиях нашего эксперимента. Тем не менее, Ре2+-ионы участвуют в разветвлении цепей окисления, стимулируя таким образом гипохлорит-индуцированное ПОЛ.

Подробно изучено изменение физико-химических свойств ЛП под действием гипохлорита. Показано, что гипохлорит разрушает в ЛНП липидорастворимые антиоксиданты: а-токоферол, каротиноиды и ксантофиллы. Это снижает резистентность ЛП к пероксидации. Сравнительный анализ показал, что по эффективности перехватывать гипохлорит каротиноиды и ксантофиллы расположились в следующей последовательности: транс-ликопин « 5-цис-ликопин > а-каротин > р-каротин > зеаксантин > а-криптоксантин > цис-2',3'-ангидролютеин > р-криптоксантин > транс-2',3'-ангидролютеин > лютеин.

С использованием метода ЭПР спиновых зондов и меток впервые установлено, что гипохлорит, проникая в поверхностный протеолипидный слой ЛНП, уменьшает подвижность и увеличивает полярность ацильных цепей фосфолипидов вплоть до 12-ого С-атома, а также увеличивает долю белка с более подвижными БН-группами. Это сопровождается увеличением отрицательного потенциала поверхности ЛП.

Показано, что нитрит - физиологический метаболит 'N0, продуцируемого клетками крови и сосудистой стенки, реагирует с гипохлоритом с бимолекулярной константой скорости (7,4 ± 1,3)»103 М"1с"1 (рН 7,2). В ходе этой реакции образуется реактивный короткоживущий интермедиат, который эффективнее гипохлорита разрушает антиоксиданты (а-токоферол и (3-каротин) в ЛНП; увеличивает чувствительность ЛНП к пероксидации; интенсивнее гипохлорита инициирует ПОЛ в ЛНП. Помимо этого он модифицирует аполипопротеин-В, нитруя остатки тирозина. Модифицированные таким образом ЛНП трансформируют макрофагальные клетки в клетки, подобные пенистым.

Изменение физико-химических свойств ЛП приводит к нарушению их функции. Предварительно окисленные ЛНП (в результате автоокисления или под действием гипохлорита) эффективнее транспортируют холестерин в клетки, как содержащие (моноциты, макрофаги), так и не содержащие (эритроциты) специфические рецепторы к ЛП. Пероксидация лишает ЛВП холестерин-акцепторной функции. Оба факта способствуют аккумуляции холестерина в клетках.

Гипохлорит в физиологических концентрациях стимулирует адгезию эритроцитов к монослою эндотелиальных клеток и вызывает аккумуляцию холестерина в эндотелиоцитах, воздействуя на эндотелий непосредственно или опосредованно через модификацию ЛНП.

ЛП, модифицированные гипохлоритом или в результате автоокисления, вызывают активацию моноцитов и нейтрофилов, способствуя дополнительному образованию инициаторов свободнорадикальных реакций (в том числе гипохлорита), а значит и дальнейшей интенсификации реакций ПОЛ.

Практическая значимость работы. Работа является фундаментальным исследованием. Тем не менее, отдельные ее положения имеют прямое практическое приложение. Так, было установлено, что диета, одновременно обогащенная липидорастворимым (а-токоферол) и водорастворимым (карнозин) антиоксидантами, обладает выраженным гипохолестеринэмическим эффектом при экспериментальном атеросклерозе, уменьшает степень поражения аорты, способствует снижению уровня продуктов ПОЛ не только в сыворотке и апо-В-содержащих ЛП, но и предотвращает окисление последних на стадии синтеза в печени и может быть рекомендована для профилактики и лечения атеросклероза.

Экспериментальное обоснование участия гипохлорита, образующегося в организме при активации нейтрофилов и моноцитов, в модификации физико-химических свойств ЛП крови, нарушении их функции и, как следствие, в формировании ранних стадий атеросклероза вносит существенный вклад в понимание теории атерогенеза, разработку средств профилактики и лечения этого заболевания. Полученные в работе данные служат теоретическим обоснованием использования антиоксидантов, перехватчиков гипохлорита и ингибиторов МПО на определенных стадиях развития атеросклероза, а также других заболеваний, где активированные нейтрофилы и иные источники МПО играют существенную роль (ревматоидный артрит, воспалительные процессы и др.).

Разработанный в диссертации методический подход регистрации остаточной концентрации гипохпорита по хемилюминесценции люминола может быть применен для изучения кинетических закономерностей реакций гипохпорита с другими физиологически важными молекулами или белок-липидными комплексами.

Продукты реакции гипохпорита с ненасыщенными липидами (хлоргидрины гликолей), образующиеся in vivo, могут быть использованы в диагностических и прикладных биохимических исследованиях в качестве маркеров модификации липидной фазы ЛП и биомембран гипохлоритом. Их регистрация в ЛП или сосудистой стенке может послужить дополнительным критерием в диагностике ранних стадий атеросклероза.

В последнее время гипохлорит, полученный электрохимическим путем, используется внутривенно в клинике в качестве бактерицидного и детоксицирующего агента при перитонитах, остром панкреатите, тяжелых ожогах, отравлениях и других патологиях (Сергиенко с соавт., 1985-1995). Результаты проведенного в работе всестороннего исследования механизма взаимодействия гипохпорита с ЛП послужили теоретической основой оптимизации применения на практике метода непрямого электрохимического окисления крови. Отдельные разделы диссертации вошли как составная часть в работу: "Разработка и внедрение электрохимических методов детоксикации в медицине", удостоенную в 1996 г. премии Правительства Российской Федерации.

Представляемая работа выполнялась в отделе биофизики (руководитель - академик РАМН, проф. Ю.А. Владимиров) НИИ физико-химической медицины (директор - академик РАМН, проф. Ю.М. Лопухин), главным образом в лаборатории экспериментальной гемосорбции и окислительных методов детоксикации (зав. док. мед. наук, проф. В.И. Сергиенко). Более ранние исследования по изучению свойств автоокисленных ЛП были проведены в лаборатории биофизических основ патологии (зав. док. биол. наук, проф. O.A. Азизова). Механизм гипохлорит-индуцированного ПОЛ фосфолипидных липосом (глава 5) в основном исследовался в Институте медицинской физики и биофизики Университета г. Лейпцига (Германия, директор института - проф. К. Arnold). Результаты, представленные в разделе 4.5.1., были получены в Институте физиологической химии 1 Университета г. Дюссельдорфа (Германия, директор института - проф. Н. Sies).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Панасенко, Олег Михайлович

выводы

1. Инкубация моноцитов и нейтрофилов крови человека с ЛНП приводит к перокоидации последних. Установлено, что инициирование перекисного окисления липидов стимулированными нейтрофилами и моноцитами протекает по свободнорадикальному механизму, но без участия 'ОН-радикала. Важная роль в инициировании ПОЛ может принадлежать гипохлориту, образующемуся при активации этих клеток. Липопротеины, модифицированные гипохпоритом или в результате автоокисления, вызывают активацию моноцитов и нейтрофилов, способствуя образованию инициаторов радикальных реакций и дальнейшей интенсификации ПОЛ.

2. На модели перфузируемой печени кролика показано, что при экспериментальном атеросклерозе гепатоциты секретируют модифицированные ЛП с повышенным содержанием продуктов ПОЛ. Применение диеты, обогащенной антиоксидантами, достоверно снижало уровень продуктов ПОЛ в гомогенате печени, перфузате и изолированных из него ЛП, а также приводило к уменьшению степени атеросклеротического поражения аорты.

3. Гипохлорит проникает в липидную фазу липопротеинов, вызывая при этом деградацию липидорастворимых антиоксидантов; снижение резистентности ЛНП к Си2+-индуцированной пероксидации; аккумуляцию первичных, вторичных и конечных продуктов окисления липидов; нарушение физико-химических свойств липидной фазы (уменьшение подвижности и увеличение полярности вплоть до 12-ого С-атома ацильной цепи); увеличение доли белка с более подвижными БН-группами; увеличение отрицательного потенциала поверхности Л П.

4. Окислительная модификация ЛП приводит к нарушению их холестерин-транспортной функции. Предварительно окисленные ЛНП эффективнее транспортируют холестерин в клетки как содержащие, так и не содержащие специфические рецепторы к ЛП. Перекисная модификация лишает ЛВП холестерин-акцепторной функции. Оба факта способствуют аккумуляции холестерина в клетках. Аналогичные нарушения холестерин-транспортной способности ЛП обнаружены у больных ИБС.

5. Гипохлорит стимулирует адгезию эритроцитов к монослою эндотелиальных клеток и вызывает аккумуляцию холестерина в эндотелиоцитах, воздействуя на эндотелий непосредственно или опосредованно через модификацию ЛНП.

6. Гипохлорит реагирует с нитритом с бимолекулярной константой скорости (7,4 + 1,3)'103 М"1с"1 (рН 7,2). В ходе этой реакции образуется реакционный интермедиат, который значительно эффективнее гипохлорита разрушает антиоксиданты в ЛНП; увеличивает чувствительность ЛНП к Си2+-индуцированному окислению; интенсивнее гипохлорита инициирует ПОЛ в ЛНП, нитрует остатки тирозина. Модифицированные таким образом ЛНП трансформируют макрофагальные клетки в клетки, подобные пенистым.

7. Основной реакцией гипохлорита с ненасыщенными жирнокислотными цепями является электрофильное присоединение по двойной связи (по молекулярному механизму) со стехиометрическим соотношением, изменяющимся от 2 до 1 по мере увеличения общей концентрации двойных связей в липосомах и числа двойных связей в одной жирнокислотной цепи. Продуктом реакции является хпоргидрин. Предложен механизм взаимодействия гипохлорита с ненасыщенными связями ацильных цепей фосфатидилхолина в составе липосом.

8. Электрофильное присоединение гипохлорита по двойной связи в присутствии ненасыщенного липида сопровождается перекисным окислением липидов. Установлено, что стадия инициирования ПОЛ в присутствии гипохлорита может быть реализована благодаря его реакции с органическим гидропероксидом, которая протекает с образованием радикальных интермедиатов, вероятно, алкоксильных радикалов.

9. Совокупность полученных результатов позволила предложить гипотезу, согласно которой гипохлорит, образующийся при активации нейтрофилов и моноцитов, является потенциальным модификатором ЛП in vivo и может играть ключевую роль в развитии ранних стадий атероскперотического поражения сосудов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Во второй половине 80-х годов на основании ряда экспериментальных фактов [64,94,179,212,215,305,338,375] сформировалась научная гипотеза [64,210,240], согласно которой липопротеины крови, модифицированные в результате окислительных процессов, причастны, а возможно, играют определяющую роль в развитии ранних стадий атеросклеротического поражения сосудов. Однако, причина появления окисленных ЯП в крови оставалась неизвестной. Среди обсуждаемых в литературе возможностей наиболее вероятной можно было считать взаимодействие нативных ЯП с активными формами кислорода, продуцируемыми в определенных условиях клетками сосудистой стенки и крови [191,212,217-221,318,331,366,367]. Ключевая роль в модификации ЯП клетками отводилась супероксиду ('02") [212,221,366].

Вместе с тем известно, что как "02", так и Н2О2, образующийся в результате дисмутации *02":

•02- + -02" +4Н+ 2Н202, являются слабыми окислителями и сами по себе не способны инициировать реакции ПОЛ [29,33]. В таком случае окислительная роль может принадлежать 'ОН-радикалу или НОС1/ОСГ. Первый образуется при реакции *02" или Н202 с ионами металлов переменной валентности (см. схему на рис. 1). Второй синтезируется по реакции:

СГ + Н+ + Н202 -> HOCI + Н20, (1) катализируемой ферментом миелопероксидазой (МПО, донор: Н202-оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.7.). *ОН-радикал чрезвычайно активен и является эффективным инициатором свободнорадикальных реакций, но его участие в инициировании ПОЛ фагоцитами в ряде работ ставится под сомнение [221,234], в частности, из-за неспецифичности ловушек, использованных при детектировании [116,138,139].

Гипохлорит же является сильным окислителем. Он реагирует с многими биологически важными соединениями (белки, липиды, нуклеиновые кислоты, полисахариды и т. д.) [11,92,227,342,343,355,385,388,389,402,411,416]. Причем, зачастую реакции с его участием сопровождаются образованием свободнорадикальных интермедиатов [111,213,242,250,360,390].

Учитывая эти обстоятельства, мы сфокусировали наше внимание на клетках -моноцитах и нейтрофилах, содержащих и секретирующих при активации фермент -миелопероксидазу, катализирующий образование гипохлорита по реакции (1).

В экспериментах in vitro было продемонстрировано, что даже в отсутствие активатора клеток инкубация ЛНП с моноцитами (3 ч, 37°С) или нейтрофилами (3,5 ч, 37°С) вызывала аккумуляцию в ЛНП продуктов ПОЛ. Если моноциты инкубировали с ЛНП, которые имели разную степень окисления (содержали разное количество ТБКРП), то чем окисленнее изначально были ЛНП, тем больший прирост продуктов ПОЛ регистрировался после инкубации. Мы предположили, что окисленные ЛНП стимулируют клетки, способствуя таким образом дальнейшей окислительной модификации ЛНП.

Действительно, в специально проведенных экспериментах было показано, что липопротеины, модифицированные гипохлоритом или в результате автоокисления, вызывали активацию моноцитов и нейтрофилов, которая сопровождалась усиленной продукцией *Ог" и повышенным хемилюминесцентным ответом клеток.

Таким образом, с одной стороны, моноциты и нейтрофилы - клетки, содержащие миелопероксидазу - вызывают окислительную модификацию ЛНП, с другой - окисленные ЛНП являются причиной активации фагоцитов, то есть способствуют генерации клетками не только активных форм кислорода, но и миелопероксидазы, а значит и образованию гипохлорита во внеклеточной среде. Это, несомненно, должно усугублять окислительную модификацию ЛНП.

На модели перфузируемой печени кролика нами впервые была продемонстрирована другая возможность появления окисленных ЛП в крови, а именно, секреция гепатоцитами в условиях гиперхолестеринемии липопротеинов с повышенным содержанием продуктов ПОЛ. Оказалось, что в перфузате печени кроликов с алиментарным атеросклерозом содержание продуктов ПОЛ было в ~3 раза выше, чем в перфузате печени интактных кроликов. Более того, анализ содержания продуктов ПОЛ в изолированной из перфузата фракции липопротеинов (с1 < 1,065 г/см3) показал, что кролики с экспериментальным атеросклерозом содержат в ЛП, секретируемых печенью, в ~2 раза больше продуктов ПОЛ, чем кролики интактной группы. Это значит, что перекисное окисление липидов при атеросклерозе способно вмешиваться в изменение физико-химических свойств ЛП еще на стадии их синтеза и секреции клетками печени.

Важным является тот факт, что применение в диете полиненасыщенных жирных кислот в комплексе одновременно с водо- (карнозин) и липидорастворимыми (а-токоферол) антиоксидантами достоверно снижало уровень продуктов ПОЛ как в гомогенате печени, так и в секретируемых ЛП. Это сопровождалось уменьшением степени поражения аорты и снижением холестерина в сыворотке.

Выявленные нами пути появления окисленных ЛП в кровотоке можно резюмировать при помощи схемы, изображенной на рис. 134. Во-первых, в результате активации ПОЛ в печени при гиперхолестеринемии гепатоциты синтезируют и секретируют ЛОНП с повышенным содержанием липопероксидов (путь 1 на рис. 134). Это приводит к появлению в крови окисленных ЛОНП, а значит, и окисленных ЛНП (путь 2). Окисленные ЛНП стимулируют моноциты (или нейтрофилы) - путь 3. Стимуляция клеток сопровождается генерацией активных форм кислорода и секрецией МПО во внеклеточную среду.

Находящиеся в непосредственной близости с моноцитами или нейтрофилами нативные ЛП подвергаются окислительной модификации (путь 4).

Рис. 134. Пути появления окисленных липопротеинов в крови. Пояснения в тексте.

Проведенный нами ингибиторный анализ с использованием перехватчика *ОН-радикала - маннита; хелаторов Ре-ионов - десфероксамина и ЕОТА; СОД и каталазы -ферментов, элиминирующих "02" и Н202, соответственно; а также перехватчика радикалов -ВНТ показал, что процесс инициирования ПОЛ в липопротеинах стимулированными нейтрофилами и моноцитами протекает по свободнорадикальному механизму, но без участия *ОН-радикала. Поскольку *02" и Н202 сами по себе не участвуют в инициировании ПОЛ фагоцитами [33,185], то важная роль в окислительной модификации ЛП может принадлежать гипохлориту, продуцируемому этими клетками при активации.

Действительно, первые же наши эксперименты продемонстрировали, что гипохлорит, добавленный в среду инкубации ЛП крови человека вызывает аккумуляцию в них продуктов ПОЛ: ТБК-реактивных и флуоресцирующих. Несколько позже 81е1таз2упзка с соавт. [369] подтвердили это, зарегистрировав аккумуляцию ТБК-реактивных продуктов и диеновых конъюгатов в ЛНП под действием гипохлорита. Проведенный нами сравнительный анализ показал, что более подвержены гипохлорит-индуцированному ПОЛ оказались атерогенные ЛП: ЛНП и особенно ЛОНП. Менее других окислялись ЛВП. 4 т

Капилляры

Аналогичный эффект мы наблюдали при исследовании уровня ТБК-реакгивных продуктов в ЛП после их инкубации в системе "МПО + Н202 + СП. Окисление ЛП в данной системе было обусловлено именно функционированием МПО, поскольку в отсутствие одного из ее субстратов (а именно, СГ) эффект полностью отсутствовал. При этом реакционная способность ЛП, как и в случае экзогенного гипохлорита, уменьшалась в последовательности: ЛОНП > ЛНП > ЛВП.

С целью исследования механизма гипохлорит-индуцированного ПОЛ жирнокислотных цепей липида мы упростили изучаемую систему и использовали в исследованиях липосомы из фосфатидилхолина. Инкубация гипохлорита с липосомами из яичного фосфатидилхолина приводила к аккумуляции традиционных молекулярных продуктов ПОЛ: гидропероксидов, диеновых конъюгатов и ТБК-реактивных продуктов. Это сопровождалось снижением числа двойных связей в фосфолипиде.

Процесс гипохлорит-индуцированной пероксидации как ЛП, так и фосфатидилхолиновых липосом протекал с участием свободных радикалов, поскольку эффективно тормозился перехватчиками свободных радикалов (а-токоферолом и ВНТ).

Как известно, каждая свободнорадикальная реакция имеет стадию инициирования. Из общих соображений можно предположить, что стадия инициирования осуществляется в водной или липидной фазе суспензии липосом. В водной фазе акт инициирования может быть обусловлен реакцией гипохлорита с Н202, *02" или ионами металлов переменной валентности, которые могут образоваться или присутствовать в среде инкубации в виде примеси. Что касается липидной фазы, то здесь акт инициирования может быть обусловлен взаимодействием гипохлорита с функциональными группами фосфатидилхолина (полярной фосфохолиновой группировкой, а также насыщенными и ненасыщенными связями ацильных цепей) или с минорными компонентами, в первую очередь с продуктами ПОЛ, которые всегда присутствуют в ненасыщенном липиде в том или ином количестве.

Проведенные исследования показали, что инициирование гипохлорит-индуцированного ПОЛ не обусловлено его взаимодействием с водорастворимыми низкомолекулярными соединениями: Н202, *02", 102, в том числе оксихлоратами: ОС12", ОСЬ", ОСЦ", которые могли бы образоваться или присутствовать в реакционной среде в качестве примеси. Гипохлорит реагировал с Ре2+ с бимолекулярной константой скорости 114 ± 7 М"1с"1 (рН 7,2). Однако, ни Ре2+, ни Ре3+ не принимали участия в стадии инициирования гипохлорит-индуцированного ПОЛ. Вместе с тем, методом хемилюминесценции были получены результаты, свидетельствующие об участии Регионов в разветвлении цепей окисления гипохлорит-индуцированного ПОЛ.

Гипохлорит не вступал в реакцию с фосфохолиновой и карбоксильной группами, а также с насыщенными связями ацильных цепей, но реагировал с -НС=СН- связями. Методом люминол-зависимой хемилюминесценции была исследована кинетика взаимодействия гипохлорита с двойными связями свободных жирных кислот (олеиновой, линолевой, линоленовой и арахидоновой) и жирнокислотных цепей фосфатидилхолина (1РРС, ОРРС и яичного фосфатидилхолина) в составе липосом из ОМРС. Оказалось, что НОС1/ОСГ реагирует с -НС=СН- связями со стехиометрическим соотношением, изменяющимся от 2 до 1 по мере увеличения общей концентрации двойных связей в липосомах и числа двойных связей в одной жирнокислотной цепи. Методом 1Н-ЯМР было установлено, что продуктом реакции является хлоргидрин:

С1

-НС=СН- + НОС1 -НС-СН- (6)

ОН

По современным представлениям данная реакция протекает по механизму электрофильного присоединения по двойной связи без участия свободных радикалов и не может служить источником активатора свободнорадикальных реакций ПОЛ.

При исследовании кинетики реакции гипохлорита с липосомами, предварительно окисленными до разной степени, было установлено, что гипохлорит реагирует с продуктами ПОЛ. Действительно, как было показано нами (раздел 5.2.3, а также [25]), а позднее и другими авторами [412], гипохлорит эффективно реагирует с альдегидами, в том числе с малоновым диальдегидом - важным продуктом ПОЛ. Однако, до сих пор не были получены данные, указывающие на возможность образования в реакции гипохлорита с альдегидами свободнорадикальных интермедиатов. Реакция, по всей вероятности, идет по молекулярному механизму с окислением альдегида до соответствующей кислоты.

Из других продуктов ПОЛ, которые содержатся в ненасыщенном липиде, основными можно считать продукты пероксидной природы: гидропероксиды, диалкилпероксиды, диацилпероксиды и др. Мы попытались выяснить, с какими из основных кислородсодержащих функциональных групп способен реагировать гипохлорит. С этой целью органические пероксиды (трет-бутилгидропероксид, гидропероксид кумола, ди-трет-бутилпероксид, трет-бутилпербензоат, дибензоилпероксид), а также эпоксиды (цис-9,10-эпоскистеариновая кислота, 5а,6а-эпоксид холестерина, транс- и цис-2,3-эпоксибутан) встраивали в липосомы из ОМРС и исследовали кинетику их реакции с гипохлоритом. Оказалось, что из всех перечисленных выше функциональных групп лишь гидропероксидная группа реагировала с гипохлоритом (как в растворе, так и в составе липосом).

Инкубация гипохлорита с липосомами, содержащими ненасыщенные -НС=СН- связи, а также гидропероксид трет-бутила, кумола или линолевой кислоты приводила к дополнительной аккумуляции продуктов ПОЛ в липосомах. Дополнительный прирост продуктов ПОЛ наблюдался и в липосомах, содержащих гидропероксид линолевой кислоты и инкубированных в системе "МПО + Н202 + СП. Такой прирост ТБКРП полностью блокировался перехватчиком свободных радикалов - ВНТ, а также перехватчиками гипохпорита - метионином и таурином, ингибировался ингибитором МПО - азидом, но не перехватчиком 'ОН - маннитом. Использование в подобном эксперименте всех других пероксидов и эпоксидов не приводило к дополнительной аккумуляции продуктов ПОЛ в присутствии гипохлорита по сравнению с контрольным экспериментом. Это значит, что из всех исследованных кислородсодержащих органических соединений лишь гидропероксидная группа реагирует с гипохлоритом, что приводит к аккумуляции в ненасыщенном липиде продуктов ПОЛ. Достоверный эффект обнаруживался при концентрации гидропероксида 2,5-30 нмоль/мг липида. Интересно отметить, что по данным разных авторов содержание гидропероксидов в нативных свежевыделенных ЛНП, зарегистрированное разными методами, варьирует в пределах 10-20 нмоль/мг ЛНП [334,166,167,223,306].

Механизм реакции гипохлорита с гидропероксидной группой до сих пор не был известен. Здесь можно предположить по крайней мере две возможности. Во-первых, по аналогии с гидропероксидом водорода реакция может протекать с образованием синглетного кислорода. Во-вторых, нельзя исключить, что в результате этой реакции синтезируются свободнорадикальные интермедиаты.

102 + юн + н++сг

НОС1 + юон свободные радикалы (КО")

Следствием обеих реакций может явиться инициация процессов ПОЛ.

В специально проведенной серии экспериментов было установлено, что синглетный кислород не образуется в реакции гипохлорита с гидропероксидом. Основным продуктом реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом является ди-трет-бутилпероксид. На наш взгляд, его образование возможно объяснить лишь через стадию радикалообразования. А именно, через образование алкоксильного радикала. Это предположение хорошо подтверждается результатами работы [129], авторы которой методом спиновых ловушек зарегистрировали образование алкильных, пероксильных и особенно алкоксильных радикалов в среде инкубации трет-бутилгидропероксида с человеческими полиморфноядерными лейкоцитами или в системе "МПО + Н202 + СП. Образование радикальных аддуктов ингибировалось азидом - ингибитором МПО. Полиморфноядерные лейкоциты с пониженным содержанием МПО продуцировали лишь 20-30% радикальных интермедиатов по сравнению с нормальными клетками.

Итак, полученные результаты можно резюмировать при помощи схемы, изображенной на рис. 135. Стадия инициирования гипохлорит-индуцированного ПОЛ может быть реализована благодаря реакции гипохлорита, продуцируемого при активации нейтрофилов (или моноцитов), с органическими гидропероксидами (1ООН), которая протекает с образованием свободнорадикальных интермедиатов (но не синглетного кислорода), вероятнее всего алкоксильных радикалов - эффективных инициаторов ПОЛ.

Нейтрофил

V1 щ nadph-^Н оксидаза СОД мпо +LOOH

02 —H¿02 —^HOCI —LO

СГ пол

Рис. 135. Схема инициирования гипохлорит-опосредованного перекисного окисления липидов нейтрофилами.

Однако, in vivo гидропероксидные группы локализованы в гидрофобной углеводородной области липидной фазы по месту нахождения ненасыщенных связей ацильных цепей. Способен ли водорастворимый гипохлорит проникать в липидную фазу ЛП и биомембран? Используя спинмеченые аналоги стеариновой кислоты, мы показали, что гипохлорит проникает по крайней мере в поверхностный фосфолипидный слой ЛНП, окисляя с одинаковой скоростью радикальные фрагменты спиновых зондов, локализованные на различном удалении от поверхности частицы ЛНП. Вероятно, это одна из причин обнаруженной нами высокой эффективности гипохлорита в отношении инициирования ПОЛ в ЛП.

Проникая в поверхностный протеолипидный слой ЛП, гипохлорит реагирует с локализованными там антиоксидантами: а-токоферолом, a также каротиноидами и ксантофиллами. Сравнительное исследование способности каротиноидов и ксантофиллов реагировать в составе ЛНП с гипохлоритом, проведенное методом ВЭЖХ, показало, что гипохлорит был более реакционен по отношению к каротиноидам нежели к их окси-производным (ксантофиллам). По эффективности перехватывать гипохлорит каротиноиды расположились в следующей последовательности: транс-ликопин « 5-цис-ликопин > а-каротин > p-каротин > зеаксантин > а-криптоксантин > цис-2',3'-ангидролютеин > р-криптоксантин > транс-2',3'-ангидролютеин > лютеин. Итак, ликопин, до сих пор известный как самый эффективный из каротиноидов тушитель синглетного кислорода [357], перехватчик свободных радикалов [294] и ингибитор ПОЛ [167] оказался и наиболее эффективным перехватчиком гипохлорита.

Деструкция антиоксидантов снижала резистентность ЛП к свободнорадикальным реакциям ПОЛ. Это приводило, с одной стороны, к аккумуляции первичных (диеновых конъюгатов), вторичных (альдегидной природы, реагирующих с ТБК) и конечных (флуоресцирующих) продуктов окисления липидов; с другой - сопровождалось нарушением физико-химических свойств липидной фазы (уменьшением подвижности и увеличением полярности вплоть до 12-ого С-атома ацильной цепи); увеличением доли белка с более подвижными БН-группами; увеличением отрицательного потенциала поверхности ЛП. Причем, эти изменения качественно совпадали с таковыми, обнаруженными в автоокисленных (в результате инкубации при 37°С с доступом воздуха) ЛП.

Такая модификация физико-химических свойств и структурной организации ЛП не может не привести к нарушению механизма взаимодействия их с клеточной поверхностью, а значит и к изменению их липид-транспортной функции. Используя в качестве модели культуру макрофагальных клеток и774.2, было показано, что ЛНП, предварительно модифицированные гипохлоритом, вызывали значительно более выраженную аккумуляцию холестерина в этих клетках по сравнению с нативными ЛНП. Эффект возрастал с увеличением концентрации гипохпорита в период модификации ЛНП.

В экспериментах с моноцитами крови человека было показано, что в результате 4-ч инкубации с нативными или окисленными ЛНП в клетках увеличивалось содержание как фосфолипидов, так и холестерина. Увеличение содержания фосфолипидов в обоих случаях было небольшим и примерно одинаковым: на 18,3 ± 8,1 и 16,0 ± 6,1% соответственно; содержание холестерина возрастало в среднем на 99,6 ± 12,4 и 166,2 + 23,5% после инкубации с нативными и окисленными ЛНП соответственно (по отношению к клеткам, инкубированным без ЛНП). Инкубация с нативными или окисленными ЛНП моноцитов, предварительно культивированных в течение 65 ч, приводила к более выраженной аккумуляции холестерина по сравнению со свежевыделенными моноцитами. Расчеты показали, что при инкубации с окисленными ЛНП по крайней мере половина холестерина, накапливающегося в моноцитах, поступала в клетки в результате прямого, неопосредованного эндоцитозом переноса стерина из ЛНП в клеточную мембрану.

Удобной моделью для изучения такого неспецифического переноса холестерина из ЛП в клетку может служить эритроцит, поскольку его плазматическая мембрана не содержит рецепторов к ЛП. Изучая перенос холестерина между ЛП и эритроцитами, нам удалось показать, что нативные ЛНП проявляют холестерин-донорные свойства в отношении эритроцитов. Однако, предварительно окисленные ЛНП (гипохлоритом или же автоокисленные) более интенсивно транспортировали холестерин в клетки. Эффект возрастал по мере увеличения степени окисления ЛНП. Инкубация эритроцитов с ЛВП (как ЛВП2, так и ЛВП3), напротив, вызывала снижение уровня холестерина в клетках. Предварительное окисление как ЛВП2, так и ЛВП3 приводило к угнетению их холестерин-акцепторной способности.

Итак, перекисная модификация ЛП сопровождается, с одной стороны, интенсификацией переноса холестерина из ЛНП в клетки, а с другой - практически полностью блокирует холестерин-акцепторную способность ЛВП. Оба факта способствуют аккумуляции холестерина в клетках.

Интересно, что ЛП, изолированные из крови больных ИБС, проявляли эффект, подобный окисленным ЛП, а именно, холестерин легче покидал частицы ЛНП и хуже встраивался в комплексы ЛВП. Данный эффект можно объяснить, если предположить, что перекисная модификация ЛНП и ЛВП, имеющая место при атеросклерозе, сопровождается уменьшением эффективного объема гидрофобной области в липидной фазе, подобно тому, как это наблюдалось в случае липидной фазы липосом [21].

Реальность такого предположения подтверждают наши эксперименты по изучению распределения спинмеченого стероида - 3-доксиландростана между водной и липидной фазой в суспензии нативных и окисленных ЛНП. Оказалось, что в результате окисления снижается число участков связывания в ЛНП, где могли бы локализоваться гидрофобные молекулы зонда и, по-видимому, стерина. Вследствие этого облегчается высвобождение холестерина из ЛНП и затрудняется его встраивание в ЛВП. Этому должно способствовать также обнаруженное нами увеличение полярности липидной фазы и поверхностного потенциала в ЛП как при автоокислении, так и в результате окисления гипохлоритом.

Таким образом, свободнорадикальная модификация ЛП приводит к усилению аккумуляции холестерина в клетках как содержащих (моноциты, макрофаги), так и несодержащих (эритроциты) специфические рецепторы к Л П. При этом заметную роль может играть прямой, неопосредованный эндоцитозом перенос холестерина из частиц ЛНП в плазматическую мембрану. Вероятно, такое неспецифическое поступление холестерина в моноциты-макрофаги может иметь важное значение в формировании пенистых клеток и развитии атеросклеротического поражения сосудов.

Известно, что окисленные ЛНП являются хемоаттрактантами для клеток крови [288], вызывают экспрессию адгезионных молекул [127,140], стимулируя таким образом адгезию лейкоцитов [267,270,271], нейтрофилов [270] и других клеток к эндотелию. Адгезия же клеток крови к поверхности сосудов - важный признак развития ранних стадий сердечнососудистых заболеваний, в частности атеросклероза [37,287,418]. В связи с этим было исследовано влияние гипохлорита и ЛНП, предварительно модифицированных в присутствии различных концентраций НОС1/ОСГ, на адгезию клеток крови к эндотелию. В качестве клеток использовали эритроциты человека, которые, с одной стороны, являются наиболее простой клеточной моделью, а с другой - их адгезия к поверхности сосуда играет немаловажную роль в формировании фиброзной бляшки [35].

Преинкубация монослоя эндотелиальных клеток (ЭК) в присутствии НОС1/ОСГ вызывала увеличение адгезии эритроцитов на поверхности эндотелия по мере роста концентрации НОС1/ОСГ (вплоть до 50 мкМ). Преинкубация ЭК с НОС1-ЛНП (вплоть до 250 мкМ НОС1/ОСГ в период модификации ЛНП) вызывала увеличение, во-первых, мольного отношения ХС/ФЛ в ЭК, во-вторых, увеличивала последующую адгезию эритроцитов к эндотелию. НОС1/ОСГ в концентрации выше 50 мкМ или НОС1-ЛНП, модифицированные в присутствии 500 мкМ НОС1/ОСГ, оказывали цитотоксический эффект на ЭК и приводили к снижению как мольного отношения ХС/ФЛ в ЭК, так и адгезии эритроцитов к эндотелию. Полученные результаты позволяют заключить, что НОС1/ОСГ в физиологических концентрациях стимулирует адгезию клеток крови к эндотелию и вызывает аккумуляцию холестерина в ЭК сосудистой стенки, воздействуя на эндотелий непосредственно или опосредованно через модификацию ЛНП. Оба эффекта могут играть существенную роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний.

Можно предположить, что в основе действия гипохлорита и НОС1-ЛНП на эндотелий лежат свободнорадикальные реакции ПОЛ, поскольку известно, что перехватчики свободных радикалов предотвращают окисление ЛНП [127,286] (в том числе и гипохлоритом (см. раздел 4.1.3)), экспрессию адгезионных молекул [140], адгезию клеток крови к эндотелию [173]. С данным предположением хорошо согласуются результаты работы [270], где было показано, что НОС1-ЛНП повышали адгезию лейкоцитов к эндотелию, причем, обнаруженный эффект зависел от содержания продуктов ПОЛ в ЛНП, но не от степени окисления белка.

В ходе исследований нами было обнаружено, что ряд физиологически важных соединений может повлиять на гипохлорит-индуцированную модификацию ЛП или активацию ПОЛ. Так методом остановленной струи было показано, что гипохлорит реагирует с нитритом (основным физиологическим метаболитом 'N0, продуцируемым многими клетками) с бимолекулярной константой скорости (7,4 ± 1,3)*103 М"1с"1 (рН 7,2). В ходе этой реакции образуется чрезвычайно реакционный интермедиат. Этот интермедиат, несмотря на короткое время жизни, проникает в ЛНП, значительно эффективнее гипохлорита разрушает антиоксиданты (а-токоферол и p-каротин); увеличивает чувствительность ЛНП к Си2+-индуцированному окислению; интенсивнее гипохлорита инициирует ПОЛ в ЛНП. Помимо этого он подобно пероксинитриту модифицирует апо-В, нитруя остатки тирозина с образованием 3-нитротирозина. Модифицированные таким образом ЛНП трансформируют макрофагальные клетки в клетки, подобные пенистым.

Поскольку нитрит является продуктом превращения 'N0, продуцируемого клетками крови и сосудистой стенки, и может находиться непосредственно в местах образования гипохлорита в крови, то такая модификация ЛНП представляется вполне реальной in vivo.

Недавно методом иммуногистохимического анализа 3-нитротирозин был обнаружен в местах атеросклеротического повреждения аорты человека [106]. Более того, авторы работы [266] обнаружили чрезвычайно высокое содержание 3-нитротирозина в ЛНП, изолированных из атеросклеротической бляшки больных атеросклерозом, превышающее таковое для ЛНП плазмы здоровых доноров в ~100 раз. Однако, авторы указанных работ однозначно связывали образование 3-нитротирозина in vivo с синтезом в кровотоке пероксинитрита (ONOO-). Наши результаты позволяют утверждать, что 3-нитротирозин может образовываться без участия пероксинитрита, в результате реакции гипохлорита с нитритом. Это предположение нашло подтверждение в недавних работах Eiserich с соавт. [164,165], которые показали, что интермедиатом является хлористый нитрил (Cl-N02), способный нитровать, хлорировать и димеризовать производные фенола. Он может образовываться не только в реакции экзогенного гипохлорита с нитритом, но и продуцироваться миелопероксидазой или нейтрофилами в присутствии нитрита.

Известно, что гемоглобин стимулирует окисление ЛП [309]. Гипохлорит реагирует с гемоглобином с образованием метгемоглобина и феррилгемоглобина, которые являются более сильными оксидантами по сравнению с гемоглобином [80].

Действительно, как было показано в разделе 4.5.2, взаимодействие гипохлорита с гемоглобином приводит к увеличению способности последнего стимулировать перекисное окисление липидов в ЛНП. Гаптоглобин - белок плазмы, образующий с гемоглобином прочные комплексы, одинаково эффективно ингибировал окислительную модификацию ЛНП, вызванную как нативным, так и модифицированным гипохлоритом гемоглобином. Эритроциту

Рис. 136. Пути появление в крови окисленных ЛП; их роль в активации моноцитов и нейтрофилов и в проявлении ранних стадий атеросклеротического процесса. Пояснения в тексте.

При выяснении роли ионов железа в гипохлорит-индуцированном окислении липосом было установлено, что хелаторы ионов железа: десфероксамин и ЕРТА реагируют с гипохлоритом в мольном соотношении, заметно превышающем эквимолярное (10:1 и 2:1 соответственно), блокируя таким образом (а не в результате связывания Ре-ионов) перекисное окисление липидов, индуцированное гипохлоритом. Это значит, что десфероксамин и ЕйТА не могут быть использованы в качестве хелаторов Ре-ионов для однозначного доказательства участия этих ионов в реакциях, протекающих в среде, содержащей НОСЮСГ-генерирующие системы (миелопероксидазу, нейтрофилы, моноциты и т.п.).

На рис. 136 приведена схема, позволяющая на основании полученных в работе результатов объяснить, с одной стороны, взаимосвязь двух важных процессов: 1) образования окисленных ЛП в крови и 2) активации моноцитов и нейтрофилов; а с другой -возможную причастность модифицированных гипохлоритом ЛП к проявлению ранних стадий атеросклероза.

ЛОНП с повышенным содержанием липопероксидов секретируются клетками печени и трансформируются в окисленные ЛНП (путь 1 на рис. 136). Последние активируют моноциты, нейтрофилы, а возможно и другие клетки (путь 2). Стимулированные нейтрофилы и моноциты секретируют МПО и продуцируют *02". Последний, благодаря действию СОД, дисмутирует до Н202. Поскольку физиологическая концентрация СГ весьма высока, то создаются все условия для протекания реакции:

МПО

СГ+Н++Н202 Н0С1 + Н20, (1)

Образующийся гипохлорит модифицирует нативные ЛП (путь 3). Такой модификации способствуют нитрит (1Ч02") и гемоглобин (НЬ). Это приводит к значительным изменениям физико-химических свойств ЛП: деградируют антиоксиданты, увеличивается чувствительность ЛП к окислительной модификации, аккумулируются продукты окисления липидов и белка, изменяется структурная организация аполипопротеинов и липидной фазы, увеличивается отрицательный заряд поверхности ЛП. На рис. 137 приведена схема, суммирующая обнаруженное нами изменение химического состава, модификации структуры липидной и белковой фаз и нарушения функции липопротеинов под действием гипохлорита.

Модифицированные таким образом ЛП способны:

- с одной стороны, взаимодействуя с моноцитами-макрофагами (по рецептор-независимому пути или же через рецепторы-мусорщики), вызывать в них усиленную аккумуляцию холестерина, трансформируя их в пенистые клетки - важный признак ранних стадий атеросклеротического процесса (путь 4 на рис. 136);

Уменьшение подвижности ацильныхцепей фосфолипидов

Увеличение полярности липидной фазы

Увеличение доли белка с более подвижными БН-груп-пами

Увеличение отрицательного потенциала поверхности

Деструкция аминокислотных остатков в белке

О £] е sz s 20 О ч и < -О сг лип

HOCI/OCI t к s =г

S 0 S Ct

О ^ К О ш -у Гидропероксиды ROOH липидов

Диеновые -ч конъюгаты ТБК-реактивные ® продукты

R-C-H RR'-C=N-R'

Шиффовы основания

Хлоргидрины -НС-СН НО CI

Деструкция антиоксидантов

Окисление холестерина

НАРУШЕНИЕ ФУНКЦИИ V i

Нрушение Активация транспорта фагоцитов липида

Стимул адгезии клеток к эндотелию

Рис. 137. Схема модификации химического состава, структуры и функции ЛНП гипохлоритом.

- с другой стороны, активировать моноциты и нейтрофилы, усугубляя протекание свободнорадикальных реакций ПОЛ в их присутствии, и замыкать тем самым порочный круг образования в крови окисленных ЛП (путь 2);

- повышать уровень холестерина в эндотелиоцитах (путь 5) и стимулировать адгезию к эндотелию эритроцитов (путь 6), а возможно и других клеток крови, способствуя атеросклеротическому поражению сосудов.

В заключение необходимо обратить внимание на результаты, опубликованные в самое последнее время и подтверждающие нашу гипотезу об участии липопротеинов, модифицированных гипохлоритом, в атерогенезе. Прежде всего следует отметить, что при атеросклерозе как в клинике, так и в эксперименте, с одной стороны, была зарегистрирована гиперактивность нейтрофилов [32,253], повышенная продукция и секреция миелопероксидазы в кровоток [296,393]. С другой - стимулирование фагоцитов in vivo вызывало активацию ПОЛ в плазме, усиление пролиферации клеток в интиме аорты и способствовало развитию атеросклероза [192]. Более того, активная МПО была обнаружена в сосудах и других тканях человека, подвергнутых атеросклеротическому поражению [152,281].

На модели изолированного сердца морской свинки было показано, что продуцированный нейтрофилами гипохлорит вызывал дисфункцию работающего сердца. Перехватчик гипохлорита - таурин предотвращал нейтрофил-зависимый эффект гипохлорита [332,333]. Подобный эффект проявлял и другой перехватчик гипохлорита -метионин [99,325].

Использование моноклональных антител к НОС1-ЛНП позволило зарегистрировать в артерии больных атеросклерозом достоверно повышенное количество белка, модифицированного HOCI. Узнаваемые эпитопы преимущественно были ассоциированы с клетками (моноцитами-макрофагами, гладкомышечными и эндотелиальными) и по молекулярной массе совпадали с апо-В, модифицированным гипохлоритом in vitro [203,280].

З-Хлортирозин - специфический маркер белка, модифицированного гипохлоритом, был обнаружен в атеросклеротически поврежденной ткани. Его количество превышало в 6 раз таковое, зарегистрированное в неповрежденной интиме аорты. В ЛНП, изолированных из интимы аорты больных атеросклерозом, содержание 3-хлортирозина было в 30 раз выше, чем в ЛНП, циркулирующих в крови здоровых доноров [207,208].

Наконец, в работе, опубликованной совсем недавно [417], было показано, что ЛНП, модифицированные гипохлоритом, способны индуцировать и усиливать реактивность фагоцитов, стимулируя, в частности, синтез хемокинов моноцитами и хемотаксис нейтрофилов, в результате чего усиливается инфильтрация лейкоцитов - важный этап в развитии ранних стадий атеросклероза.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Панасенко, Олег Михайлович, Москва

1. Ахметов Н.С. Неорганическая химия. Москва: Высшая школа, 1975, 304-311.

2. Барсель В.А., Корочкин И.М., Архипова Г.В., Сальников М.И., Матвеева С.А., Олферьев А.М. Коррекция некоторых биохимических нарушений липидного обмена у больных атеросклерозом с помощью антиоксиданта дибунола. Изв. АН СССР. Сер. Биол., 1988, № 1, 75-85.

3. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов. Патологич. физиол. и эксперим. терапия, 1989, 105, № 6, 674-677.

4. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. Москва: Наука, 1972.

5. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. Москва: Наука, 1980.

6. Владимиров Ю.А., Панасенко О.М., Азизова O.A. Взаимодействие Fe(ll) с акцепторами электрона, находящимися в липидной фазе мембран и липопротеинов. Биол.мембраны, 1987, 4, 906-912.

7. Воскресенский О.Н. Свободнорадикальное окисление, антиоксиданты и атеросклероз. Кардиология, 1981, 21, №6, 118-123.

8. Гаффни Б.Дж. Некоторые полезные советы для расчетов параметров упорядоченности спиновых меток на основе жирных кислот и фосфолипидов в мембранах. Теория и применение. Москва: Мир, 1979, 613-617.

9. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Влияние низкомолекулярных соединений на хемилюминесценцию люминола, обусловленную действием продуктов миелопероксидазного катализа и экзогенного гипохлорита. Биохимия, 1988, 53, 20252032.

10. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н. Окислительное повреждение эритроцитов миелопероксидазой. Защитное действие сывороточных белков. Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1989, 107, 428-430.

11. Горбатенкова Е.А., Науменко К.В., Сергиенко В.И. Свойства производных каталазы и пероксидазы, образованных при непрямом электрохимическом окислении. В кн.: Электрохимические методы в медицине. Москва: НИИ ФХМ МЗ РСФСР, 1991, 5-6.

12. Гриффит О., Джост П. Липидные спиновые метки в биологических мембранах. В кн.: Метод спиновых меток. Теория и применение. Москва: Мир, 1979, 489-569.

13. Гуткин Д.В., Петрович Ю.А. Активность антиоксидантных ферментов миокарда при его ишемии. Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1982, № 1, 33-35.

14. Давиденкова Е.Ф., Шафран М.Г. Атеросклероз и процесс перекисного окисления липидов. Вестн. АМН СССР, 1989, № 3, 10-18.

15. Давиденкова Е.Ф., Шафран М.Г. Миелопероксидаза нейтрофилов крови и ее возможное участие в процессах перекисного окисления липидов при атеросклерозе. Клин, мед.,1989, 67, № 6, 56-58.

16. Давиденкова Е.Ф., Шафран М.Г., Векслер Б.М. Показатели перекисного окисления липидов крови при наследственном предрасположении к атеросклерозу. Клин, мед.,1990, 68, №2, 34-38.

17. Двали Л.К., Шенгелия М.Г., Царцидзе М.А., Ломсадзе В.А. Количественное изменение нейтральных липидов и их перекисей при экспериментальном карциногенезе и атеросклерозе. Сообщения АН ГССР, 1983, 110, №2, 385-388.

18. Девяткина Т.А. Влияние ионола на развитие экспериментального атеросклероза. Докл. АН СССР, 1978, 242, 449-452.

19. Деев А.И., Добрецов Г.Е., Арнхольд Ю., Владимиров Ю.А. Уменьшение площади поверхности фосфолипидных мембран при перекисном окислении липидов. Биол. мембраны, 1989, 6, 1227-1231.

20. Деев А.И., Осис Ю.Г., Формазюк В.Е., Владимиров Ю.А., Лпнкин В.З. Увеличение содержания воды в липидной фазе липопротеидов при перекисном окислении. Биофизика, 1983, 28, 629-631.

21. Добрецов Г.Е., Спирин М.М., Кузнецов A.C., Попов A.B. Пространственная организация липопротеидов низкой плотности аорты человека (изучение с помощью флуоресцентных зондов). Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1983, № 10, 45-47.

22. Дудаев В.А., Аббуд А., Иванов A.C. Влияние полиненасыщенных жирных кислот на функциональные свойства тромбоцитов и перекисное окисление липидов у больных ишемической болезнью сердца. Кардиология, 1987, 27, № 6, 79-83.

23. Евгина С.А., Панасенко О.М., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липопротеинов крови человека, индуцированное гипохлорит-анионом. Биол.мембраны, 1992, 9, 946-953.

24. Зелиг И. Анизотропное движение в жидкокристаллических структурах. В кн.: Метод спиновых меток. Теория и применение. Москва: Мир, 1979, 404-443.

25. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. Москва: Наука, 1981.

26. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. Москва: Наука, 1982, 5-13.

27. Каган В.Е., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. Итоги науки и техники ВИНИТИ. Биофизика, 1986, 18, 5-135.

28. Калмыкова В.И. Содержание липидов и перекисей жирных кислот в крови и интиме аорты в норме и при атеросклорозе. Терапевтич. архив, 1970, № 11, 43-48.

29. КейтсМ. Техника липидологии. Москва: Мир, 1975.

30. Клебанов Г.И. Влияние перекисного окисления липидов и холестерина на структуру и функционирование мембран и липопротеидов. Автореф. дисс. докт. биол. наук, Москва, 2 МОЛГМИ, 1991.

31. Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., Бенов Л.Ц., Рибаров С.Р. Инициирование перекисного окисления липидов мембран липосом активированными полиморфноядерными лейкоцитами крови. Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1988, 105, № 6, 674-677.

32. Клебанов Г.И., Крейнина М.В. Активация полиморфноядерных лейкоцитов крови больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда. В сборнике научных трудов конференции "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине". Рига, 1988, 132-152.

33. Климов А.Н. Атеросклероз. В кн.: Превентивная кардиология. Москва: Медицина, 1987, 239-316.

34. Климов А.Н. Дислипопротеидемии и ишемическая болезнь сердца. Ред. Чазов Е.И., Климов А.Н. Москва: Медицина, 1980, 10-25.

35. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. Санкт-Петербург: Питер. 1995.

36. Козлов Ю.Н., Моравский А.П., Пурмаль А.П., Шувалов В.Ф. О природе и механизме возникновения свободных радикалов в процессах окисления "П(Ш)ЭДТА и Fe(CN)64" хлорноватистой кислотой. Журнал физич. химии, 1981, 55, 764-766.

37. Корочкин И.М., Клебанов Г.И., Чукаева И.И., Александров A.A., Туркменова Э.Н., Арутюнов Г.А. Хемилюминесценция лейкоцитарной массы в диагностике острого инфаркта миокарда. Терапевтич. архив, 1984, № 8, 29-31.

38. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. Москва: Наука, 1976.

39. Ланкин В.З. Перекиси липидов и атеросклероз. Гипотеза: роль холестерина и свободнорадикального перекисного окисления липидов в изменении свойств клеточных мембран при гиперхолестеринемии и атеросклерозе. Кардиология, 1980, 20, № 8, 42-48.

40. Ланкин В.З. Ферментативная регуляция метаболизма липопероксидов и структурнофункциональные перестройки биомембран в норме и при патологических состояниях. Автореферат дисс. на соиск. уч. степ. докт. биол. наук, Москва, 1985.

41. Панкин В.З., Гуревич С.М., Котелевцева Н.В., Тихазе А.К., Герасимова E.H. Роль перекисей липидов в патогенезе атеросклероза. Детоксикация липоперекисей глутатион-пероксидазной системой в аорте. Вопр. мед. химии, 1976, 22, № 3, 392-395.

42. Панкин В.З., Закирова А.Н., Касаткина Л.В., Котелевцева Н.В., Ахметова Б.Х., Титов В.Н. Перекиси липидов и атеросклероз. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в крови больных ишемической болезни сердца. Кардиология, 1979, 19, № 10, 69-72.

43. Панкин В.З., Котелевцева Н.В, Тихазе А.К., Титов В.Н., Герасимова E.H. Увеличение содержания перекисей липидов в крови и аортах кроликов с экспериментальным атеросклерозом. Вопр. мед. химии, 1976, 22, № 4, 513-517.

44. Панкин В.З., Тихазе А.К. Активность глутатион-пероксидазы II в крови млекопитающих при гиперхолестеринемии. Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1980, № 5, 554-556.

45. Панкин В.З., Тихазе А.К., Котелевцева Н.В. Перекиси липидов и атеросклероз. Кардиология, 1976, № 2, 23-30.

46. Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия. Москва, 1971, 314-315.

47. Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Коган Э.М. Холестериноз. Москва: Медицина, 1983.

48. Лопухин Ю.М., Владимиров Ю.А., Молоденков М.Н., Клебанов Г.И., Сергиенко В.И., Торховская Т.И., Чеснокова Я.М., Наумов A.B., Максимов В.А., Шерстнев М.П.

49. Хемилюминесценция липопротеидов сыворотки крови, выделенных ультрацентрифугированием и осаждением в присутствии гепарина и кальция. Вопр. мед. химии, 1983, 29, № 1, 116-120.

50. Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И., Клебанов Г.И., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция апо-В-содержащих липопротеидов при экспериментальной гиперхолестеринемии у кроликов. Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1982, 93, №4, 101-102.

51. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. Москва: Наука, 1986, 20-71.

52. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1985.

53. Момыналиев К.Т., Панасенко О.М., Говорун В.М., Сергиенко В.И. Гипохлорит-индуцированная деструкция липидного компонента липопротеинов крови человека. Биол.мембраны, 1995, 12, 385-390.

54. Моррисет Дж. Применение спиновых меток для исследования структуры и функции ферментов. В кн.: Метод спиновых меток. Теория и применение. Москва: Мир, 1979, 298-366.

55. Несмеянов А.Н., Несмеянов H.A. Начала органической химии. Москва: Химия. 1974, 1, 249.

56. Несмеянов А.Н., Несмеянов H.A. Начала органической химии. Москва: Химия. 1974, 2, 506.

57. Осипов А.Н., Брюханова Э.В., Вахрушева Т.В., Панасенко О.М., Владимиров Ю.А. Влияние гипохлорита и перекиси водорода на способность гемоглобина стимулировать перекисное окисление липидов липопротеинов низкой плотности. Биофизика, 1997, 42, 400-407.

58. Панасенко О.М., Борин М.Л., Азизова O.A., Арнольд К. Определение поверхностного заряда липопротеидов и его изменения при перекисном окислении липидов. Биофизика, 1985, 30, 822-827.

59. Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов фактор, способствующий накоплению холестерина в клетках при атерогенезе. Бюл.эксперим.биол. и мед., 1988, 106, N 9, 277-280.

60. Панасенко О.М., Деев А.И., Деева И.Б., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Изучение методом спиновых зондов структурных изменений на различной глубине фосфолипидных мембран после их пероксидации. Биофизика, 1985, 30, 817-821.

61. Панасенко О.М., Евгина С.А., Сергиенко В.И. Взаимодействие электрохимически полученного гипохлорита натрия с липопротеинами крови человека. В кн.: Электрохимические методы в медицине. Москва: НИИ ФХМ МЗ РСФСР, 1991, 7-8.

62. Паркер Ч.В. Медиаторы:высвобождение и функции. В кн.: Иммунология. Ред. Пол У. Москва: Мир, 1989, 3, 173-179.

63. Розанцев Э.Г. Свободные иминоксильные радикалы. Москва, 1970, 83.

64. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии. Москва: Мир, 1981, 3, 1171-1173.

65. Формазюк В.Е., Осис Ю.Г., Деев А.И., Ланкин В.З., Владимиров ЮА., Вихерт A.M. Влияние перекисного окисления липидов на структуру сывороточных липопротеидов. Биохимия, 1983, 48, 331-338.

66. Хейфец Л.В., Абалакин В.А. Изолирование клеток крови в градиенте плотности Фиколл-Верографин. Лаб. дело, 1973, № 10, 579-581.

67. Часовникова Л.В., Формазюк В.Е., Сергиенко В.И., Кокряков В.Н. Взаимодействие миелопероксидазы и дефензинов с монослоями липидов. Биохимия, 1992, 57, 97-102.

68. Черный В.В., Стожкова И.Н., Мирский В.М., Ястребова Т.Н., Соколов B.C. Изменение свойств липидного бислоя под действием гипохлорита натрия. II. Исследование действия гипохлорита натрия на модельные липидные системы. Биол. мембраны, 1992, 9, 66-73.

69. Шаронов Б.П., Чурилова И.В. Окисление супероксиддисмутазы гипохлоритом. Появление изомеров, обладающих каталитической активностью. Докл. АН СССР, 1990, 314, 1500-1502.

70. Шатилина Л.В., Баллюзек М.Ф., Гуревич B.C. Некоторые показатели перекисного окисления липидов тромбоцитов у больных ишемической болезнью сердца. Вопр. мед химии, 1988, 34, №2, 59-61.

71. Шафран М.Г. Миелопероксидаза нейтрофильных грпнулоцитов. Успехи соврем, биол., 1981, 92, № 6, 365-379.

72. Шпекитер И.О. Роль модифицированных липопротеидов в атерогенезе. Вопр. мед. химии, 1987, 33, № 4, 2-8.

73. Якутова Э.Ш., Дремина Е.С., Евгина С.А., Осипов А.Н., Шаров B.C., Панасенко О.М., Владимиров Ю.А. Образование свободных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа (II). Биофизика, 1994, 39, 275-279.

74. Якутова Э.Ш., Осипов А.Н., Костенко О.В., Арнхольд Ю., Арнольд К., Владимиров Ю.А. Взаимодействие гипохлорита с оксигемоглобином приводит к освобождению железа в каталитически активной форме. Биофизика, 1992, 37, 1021-1028.

75. Abell L.L., Levy В.В., Brodie В.В., Kendall F.E. A simolified method for the estimation of total cholesterol in serum and demonstration of its specificity. J.Biol.Chem., 1952, 195, 357-366.

76. Akanmu D., Cecchini R., Aruoma O.I., Halliwell B. The antioxidant action of ergothioneine. Arch.Biochem.Biophys., 1991, 288, 10-16.

77. Alaiz M., Beppu M., Ohishi K., Kikugawa K. Modification of delipidated apoprotein B of low density lipoprotein by lipid oxidation products in relation to macrophage scavenger receptor binding. Biol.Pharm.Bull., 1994, 17, 51-57.

78. Albrich J.M., McCarthy C.A., Hurst J. Biological reactivity of hypochlorous acid: Implications for microbicidal mechanisms of leucocyte myeloperoxidase. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1981, 78, 210-214.

79. Anbar M., Taube H. The exchange of hypochlorite and of hypobromite ions with water. J.Am.Chem.Soc., 1958, 80, 1073-1077.

80. Antonini E., Brunori M. Hemoglobin and mioglobin in their reactions with ligands. AmsterdamLondon: North-Holand Publish. Comp., 1971.

81. Arnhold J., Hammerschmidt S., Arnold K. Role of functional groups of human plasma and luminol in scavenging of NaOCI and neutrophil-derived hypochlorous acid. Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1097, 145-151.

82. Arnhold J., Hammerschmidt S., Wagner M., Mueller S., Arnold K., Grimm E. On the action of hypochlorite on human serum albumin. Biomed.Biochim.Acta, 1990, 49, 991-997.

83. Arnhold J., Mueller S., Arnold K., Grimm E. Chemiluminescence intensities and spectra of luminol oxidation by sodium hypochlorite in the presence of hydrogen peroxide. J.Biolumin.Chemilumin., 1991, 6, 189-192.

84. Arnhold J., MuellerS., Arnold K., Sonntag K. Mechanisms of inhibition of chemiluminescence in the oxidation of luminol by sodium hypochlorite. J.Biolumin.Chemilumin., 1993, 6, 307-313.

85. Arnhold J., Wiegel D., Richter O., Hammerschmidt S., Arnold K., Krumbiegel M. Modification of low density lipoproteins by sodium hypochlorite. Biomed.Biochim.Acta, 1991, 50, 967-973.

86. Aruoma O.I., Halliwell B. Action of hypochlorous acid on the antioxidant protective enzymes superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase. Biochem.J., 1987, 248, 973-976.

87. Aruoma O.I., Laughton M.J., Halliwell B. Carnosine, homocarnosine and anserine: could they act as antioxidants in vivo? Biochem. J., 1989, 264, 863-869.

88. Avogaro P., Bon Bittolo G., Cazzolato G. Presence of a modified low density lipoprotein in human. Arteriosclerosis, 1988, 8, 79-87.

89. Awtrey A.D., Connick R.E. The absorption spectra of l2, I3", I", I03", S4062- and S2032". Heat of the reaction l3 = l2 + I". J.Am.Chem.Soc., 1951, 73, 1842-1843.

90. Babior B.M., Kipnes R.S., Curnutte J. The production by leukocytes of superoxide. A potential bactericidal agent. J.Clin.Invest., 1973, 52, 741-744.

91. Backer J.M., Dawidowicz E.A. Mechanism of cholesterol exchange between phospholipid vesicles. Biochemistry, 1981, 20, 3805-3810.

92. Bagchi D., Das D.K., Engelman R.M., Prasad M.R., Subramanian R. Polymorphonuclear leucocytes as potential source of free radicals in the ischaemic-reperfused myocardium. Eur.Heart J., 1990, 11, 800-813.

93. Bangham A.D., De Cier J., Greville G.D. Osmotic properties and waterpermability of phospholipid liquid crystals. Chem.Phys.Lipids, 1967, 1, 225-246.

94. Barenghi L., Bradamante S., Giudici G.A., Vergani C. NMR analysis of low-density lipoprotein oxidatively-modified in vitro. Free Radic.Res.Commun., 1990, 8, 175-183.

95. Beckman J.S. Oxidative damage and tyrosine nitration from peroxynitrite. Chem.Res. Toxicol., 1996, 9, 836-844.

96. Beckman J.S., Beckman T.W., Chen J., Marshall P.A., Freeman B.A. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc.Natl.Acad.Sci.il.S.A., 1990, 87, 1620-1624.

97. Beckman J.S., Ischiropoulos H., Zhu L., van der Woerd M., Smith C., Chen J., Harrison J., Martin J.C., Tsai M. Kinetics of superoxide dismutase- and iron-catalyzed nitration of phenolics by peroxynitrite. Arch.Biochem.Biophys., 1992, 298, 438-445.

98. Beckmann J.S., Ye Y.Z., Anderson P.G., Chen J., Accavitti M.A., Tarpey M.M., White C.R. Extensive nitration of protein tyrosines in human atherosclerosis detected by immunohistochemistry. Biol.Chem.Hoppe Seyler, 1994, 375, 81-88.

99. Bekkenist R.J., De Boer J.E.G., Plat H., Wever R. The halide complexes of myeloperoxidase and the mechanism of halogenation reactions. Biochim.Biophys.Acta, 1980, 613, 337-348.

100. Bellavite P. The superoxide-forming enzymatic system of phagocytes. Free Radic.Biol.Med., 1988, 4, 225-261.

101. Berliner J.A., Heinecke J.W. The role of oxidized lipoproteins in atherogenesis. Free Radic.Biol. Med, 1996, 20, 707-727.

102. Bernofsky C. Nucleotide chloramines and neutrophil-mediated cytotoxicity. FASEB J., 1991, 5, 295-300.

103. Bernofsky C., O'Dea S.W. Nucleotide modification, a radical mechanism of oxidative toxicity. Free Radic.Res.Commun., 1986, 2, 129-136.

104. Blackburn W.D.J., Chatham W.W. HOCI production by human neutrophils activated by surface-associated IgG: requirement for influx of extracellular calcium. J.Leukoc.Biol., 1994, 55, 793-797.

105. Bottu G. The effect of quenchers on the chemiluminescence of luminol and lucigenin. J.Biolumin. Chemilumin., 1989, 3, 59-65.

106. Bradamante S., Barenghi L., Giudici G.A., Vergani C. Free radicals promote modifications in plasma high-density lipoprotein: nuclear magnetic resonance analysis. Free Radic.Biol.Med., 1992, 12, 193-203.

107. Britigan B.E., Edeker B.L. Pseudomonas and neutrophil products modify transferrin and lactoferrin to create conditions that favor hydroxyl radical formation. J.Clin.Invest., 1991, 88, 1092-1102.

108. Brown M.S., Goldstein J.L. Lipoprotein metabolism in the macrophage: Implications for cholesterol in atherosclerosis. Ann.Rev.Biochem., 1983, 52, 223-261.

109. Bruch R.C., Thayer W.S. Differential effect oflipid peroxidation on membrane fluidity as determined by electron spin resonance probes. Biochim.Biophys.Acta, 1983, 733, 216-221.

110. Burnstein M., Scholink H.R., Morfin R. Rapid nethod for the isolation of lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. J.Lipid Res., 1970, 11, 583-595.

111. Camejo G., Hurt E., Romano M. Properties of lipoprotein complexes isolated by affinity chromatography from hyman aorta. Biochim.Biophys.Acta, 1985, 44, 389-401.

112. Candeias L.P., Patel K.B., Stratford M.R., Wardman P. Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the meutrophil-derived species superoxide anion and hypochlorous acid. FEBSLett., 1993, 333, 151-153.

113. Candeias L.P., Stratford M.R., Wardman P. Formation of hydroxyl radicals on reaction of hypochlorous acid with ferrocyanide, a model iron(ll) complex. Free Radic.Res., 1994, 20, 241249.

114. Carpenter K.L., Brabbs C.E., Mitchinson M.J. Oxygen radicals and atherosclerosis. Klin. Wochenschr., 1991, 69, 1039-1045.

115. Carr A.C., van den Berg J.J., Winterbourn C.C. Chlorination of cholesterol in cell membranes by hypochlorous acid. Arch.Biochem.Biophys., 1996, 332, 63-69.

116. Carr A.C., Winterbourn C.C., Blunt J.W., Phillips A.J., Abell A.D. Nuclear magnetic resonance characterization of 6-alpha-chloro-5-beta-cholestane-3-beta,5-diol formed from the reaction of hypochlorous acid with cholesterol. Lipids, 1997, 32, 363-367.

117. Catapano A.L. Antioxidant effect of flavonoids. Angiology., 1997, 48, 39-44.

118. Cathcart M.K., Morel D.W., Chisholm G.M. Monocytes and neutrophiles oxidize low densitylipoprotein, making it cytotoxic. J.Leukocyte Biol., 1985, 38, 341-350.

119. Chamulitrat W., Cohen M.S., Mason R.P. Free radical formation from organic hydroperoxides in isolated human polymorphonuclear neutrophils. Free Radic.Biol.Med, 1991, 11, 439-445.

120. Chatham W.W., Blackburn W.D.,Jr. Fixation of C3 to IgG attenuates neutrophil HOCI generation and collagenase activation. J.Immunol., 1993, 151, 949-958.

121. Chatham W.W., Turkiewicz A., Blackburn W.D.J. Determinants of neutrophil HOCI generation: ligand-dependent responses and the role of surface adhesion. J.Leukoc.Biol., 1994, 56, 654-660.

122. Chupukcharoen N., Komaratat P., Wilairat P. Effect of vitamin E deficiency on the distribution of cholesterol in plasma lipoproteins and the activity of cholesterol 7a-hydroxylase in rabbit liver. J.Nutr., 1985, 115, 468-472/

123. Clark R.A., Pearson D.W. Inactivation of transferrin iron binding capacity by the neutrophil myeloperoxidase system. J.Biol.Chem., 1989, 264, 9420-9427.

124. Clark R.A., Szot S. Chemotactic factor inactivation by stimulated human neutriphils mediated by myeloperoxidase-catalyzed methionine oxidation. J.Immunol., 1981, 128, 1507-1513.

125. Clevidance B.A., Morton R.E., West G., Dusek D.M., Hoff H.F. Cholesterol esterification in macrophages. Stimulation by lipoproteins containing apo B isolated from human aortas. Arteriosclerosis, 1984, 4, 196-207.

126. Clevidence B.A., Bieri J.G. Association of carotenoids with human plasma lipoproteins. Methods Enzymol., 1993, 214, 33-46.

127. Cohen M.S., Britigan B.E., Hassett D.J., Rosen G.M. Do humans neutrophils form hydroxyl radical? Evaluation of an unresolved controversy. Free Radic.Biol.Med, 1988, 5, 81-88.

128. Cohen M.S., Britigan B.E., Hassett D.J., Rosen G.M. Phagocytes, 02 reduction, and hydroxyl radical. Rev.lnfect.Dis., 1988, 10, 1088-1096.

129. Conger J.D. Endothelial regulation of vascular tone. Hosp.Pract.Off.Ed., 1994, 29, 117-125.

130. Connick R.C. The interaction of hydrogen peroxide and hypochlorous acid in acidic solutions containing chloride ion. J.Am.Chem.Soc., 1947, 69, 1509-1514.

131. Couderc R., Bonneau C., Tissot M., Bailleul S., Roch Arveiller M., Giroud J.P. Effects of plasma lipoproteins on the production of superoxide anion by human polymorphonuclearleukocytes in vitro. Biofactors, 1997, 6, 157-163.

132. Crow J.P., Spruell C., Chen J., Gunn C., Ischlropoulos H., Tsai M., Smith C.D., Radi R., Koppenol W.H., Beckman J.S. On the pH-dependent yield of hydroxyl radical products from peroxynitrite. Free Radic.Biol.Med, 1994, 16, 331-338.

133. Cuperus R.A., Muijsers A.O., Wever R. The superoxide dismutase activity of myeloperoxidase; formation of compound III. Biochim.Biophys.Acta, 1986, 871, 78-84.

134. Dai J., Meij J.T.A., Padua R., Panagia V. Depression of cardiac sarcolemmal phospholipase-D activity by oxidant-induced thiol modification. Circ.Res., 1992, 71, 970-977.

135. Dallegri F., Ballestrero A., Frumento G., Patrone F. Erythrocyte lysis by PMA-triggered neutrophil polymorphonuclears: evidence for an hypochlorous acid-dependent process. Immunology, 1985, 55, 639-645.

136. Dallegri F., Ballestrero A., Ottonello L., Patrone F. Platelets as inhibitory cells in neutrophil-mediated cytolysis. J.Lab.Clin.Med., 1989, 114, 502-509.

137. Darley Usmar V.M., Hersey A., Garland L.G. A method for the comparative assessment of antioxidants as peroxyl radical acavengers. Biochem.Pharmacol., 1989, 38, 1465-1469.

138. Darley Usmar V.M., Lelchuk R., O'Leary V.J., Knowles M., Rogers M.V., Severn A. Oxidation of low-density lipoprotein and macrophage derived foam cells. Biochem.Soc.Trans., 1990, 18, 1064-1066.

139. Dash S., Sen S., Behera D. High neutrophil myeloperoxidase activity in smokers. Blood, 1991, 77, 1619.

140. Daugherty A., Dunn J.L., Rateri D.L., Heinecke J.W. Myeloperoxidase, a catalyst for lipoprotein oxidation, is expressed in human atherosclerotic lesions. J.Clin.Invest., 1994, 94, 437-444.

141. Daugherty A., Schonfeld G. Role of lipoproteins in the initiation and development of atherosclerosis. Pharmacol.Then, 1985, 31, 237-255.

142. Daugherty A., Zweifel B.S., Sobel B.E., Schonfeld G. Isolation of low density lipoprotein from atherosclerotic vascular tissue of Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits Arteriosclerosis, 1988, 8, 768-777.

143. Daugherty A., Zweifel B.S., Sobel B.E., Schonfeld G. Modified LDL in vascular tissue of WHHL rabbits. Arteriosclerosis, 1987, 7, 527a.

144. Davies J.M., Horwitz D.A., Davies K.J. Potential roles of hypochlorous acid and N-chloroamines in collagen breakdown by phagocytic cells in synovitis. Free Radic.Biol.Med., 1993, 15, 637-643.

145. Denicola A., Freeman B.A., Trujillo M., Radi R. Peroxynitrite reaction with carbon dioxide/bicarbonate: kinetics and influence on peroxynitrite-mediated oxidations. Arch.Biochem.Biophys., 1996, 333, 49-58.

146. Di Mascio P., Bechara E.J., Medeiros M.H., Briviba K., Sies H. Singlet molecular oxygenproduction in the reaction of peroxynitrite with hydrogen peroxide. FEBS Lett., 1994, 355, 287289.

147. Dianzani M.U., Poli G., Gravela E., Chiarpotto E., Albano E. Influence of lipid peroxidation on lipoprotein secretion by isolated hepatocytes. Lipids, 1981, 16, 823-829.

148. Dieber-Rotheneder M., Puhl H., Waeg G., Striegl G., Esterbauer H. Effect of oral supplementation with D-alpha-tocopherol on the vitamin E content of human low density lipoproteins and resistance to oxidation. J.Lipid Res., 1991, 32, 1325-1332.

149. Driomina E.S., Polnikov I.G., Sharov V.S., Azizova O.A., Vladimirov Yu.A. The chemiluminescence assay of lipid peroxidation products in human blood plasma lipoproteins. Free Radic.Res., 1994, 20, 279-288.

150. Driomina E.S., Sharov V.S., Vladimirov Yu.A. Fe2+-induced lipid peroxidation in liposomes. The role of sulface Fe2+ concentration in awitching of the reaction from acceleration to decay. Free Radic.Biol.Med., 1993, 15, 239-247.

151. Edwards S.W. Biochemistry and physiology of the neutrophil. Cambridge:Cambridge University press, 1994, 1-293.

152. Eiserich J.P., Hristova M., Cross C.E., Jones A.D., Freeman B.A., Halliwell B., Van der Vliet A. Formation of nitric oxide-derived inflammatory oxidants by myeloperoxidase in neutrophils. Nature, 1998, 391, 393-397.

153. El-Saadani M., Esterbauer H., El-Sayed M., Goher M., Nassar A.Y., Jürgens G. A spectrophotometric assay for lipid peroxides in serum lipoproteins using a commercially available reagent. J.Lipid Res., 1989, 30, 627-630.

154. Esterbauer H., Gebicki J., Puhl H., Jürgens G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic.Biol.Med, 1992, 13, 341-390.

155. Esterbauer H., Jürgens G., Quehenberger O., Koller E. Autooxidation of human low-density lipoproteins: Loss of polyunsaturated fatty acids and vitamin E, and generation of aldehydes. J.Lipid Res., 1987, 28, 495-509.

156. Esterbauer H., Puhl H., Dieber Rotheneder M., Waeg G., Rabl H. Effect of antioxidants on oxidative modification of LDL. Ann.Med, 1991, 23, 573-581.

157. Esterbauer H., Ramos P. Chemistry and pathophysiology of oxidation of LDL. Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol., 1996, 127, 31-64.

158. Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic.Biol.Med., 1991, 11, 81-128.

159. Esterbauer HM Striegl G., Puhl H., Rotheneder M. Continuous monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoprotein. Free Rad.Res.Comms., 1989, 6, 67-75.

160. Ferns G.A., Forster L., Stewart Lee A., Nourooz Zadeh J., Anggard E.E. Probucol inhibits mononuclear cell adhesion to vascular endothelium in the cholesterol-fed rabbit. Atherosclerosis, 1993, 100, 171-181.

161. Fielding C.J. The origin and properties of free cholesterol potential gradients in plasma, and their relation to atherogenesis. J.Lipid Res., 1984, 25, 1624-1628.

162. Fliss H., Menard M. Hypochlorous acid-induced mobilization of zinc from metalloproteins. Arch.Biochem.Biophys., 1991, 287, 175-179.

163. Fliss H., Menard M., Desai M. Hypochlorous acid mobilizes cellular zinc. Ca n.J. Physiol. Pharmacol., 1991, 69, 1686-1691.

164. Floris R., Wever R. Reaction of myeloperoxidase with its product HOCI. Eur.J.Biochem., 1992, 207, 697-702.

165. Fogelman A.M., Hokom M.M., Haberland M.E., Tanaka R.D., Edwards P.A. Lipoprotein regulation of cholesterol metabolism in macrophages derived from human monocytes. J.Biol.Chem., 1982, 257, 14081-14086.

166. Fogelman A.M., Shechter I., Scager J., Hokom M., Child J.S., Edwaeds P.A. Malondialdehyde alteration of low-density lipoproteins leads to cholesteryl ester accumulation in human monocyte-macrophages. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1980, 77, 2214-2218.

167. Folch J., Lees M., Shoane-Stanley F.M. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J.Biol.Chem., 1957, 226, 497-509.

168. Fong L.G., Parthasarathy S., Witztum J.L., Steinberg D. Nonenzymatic oxidative cleavage of peptide bonds in apolprotein B100. J.Lipid Res., 1987, 28, 1466-1477.

169. Foote C.S., Goyne Т.Е., Lehrer R.J. Assesment of chlorination by human neutrophils. Nature, 1983, 301, 715-716.

170. Frankel E.N. Secondary products of lipid peroxidation. Chem.Phys.Lipids, 1987, 44, 73-85.

171. Fujimoto Y., Kondo Y., Nakajima M., Takai S., Sakuma S., Fujita T. Stimulation of hrostaglandin synthesis in rabbit gastric antral mucosal slices by desferrioxamine in vitro. Biochem.lnt., 1991, 24, 33-42.

172. Garner В., Dean R.T., Jessup W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independent of superoxide production. Biochem.J., 1994, 301, 421428.

173. George J.W. Halides and oxyhalides of the elements of groups Vb and Vib. Progress in Inorg. Chem., 1960, 2, 33-107.

174. Gmelins Handbuch. Der Anorganischen Chemie. Chlor. Berlin: Verlag Chemie G.M.B.H.,1927, 6, 424-441.

175. Goldstein J.L., Brown M.S. Lipoprotein receptors, cholesterol metabolism, and atherosclerosis. Arch.Path., 1975, 99, 181-184.

176. Goldstein J.L., Brown M.S. The low-density lipoprotein pathway and its relation to atherosclerosis. Ann.Rev.Biochem., 1977, 46, 897-930.

177. Gorog P., Kakkar V.V. Increased uptake of monocyte-treated low density lipoproteins by aortic endothelium in vivo. Atherosclerosis, 1987, 65, 99-107.

178. Gorog P., Semeria F.J., Gorog D.A. Activation of the phagocytic system increases intimal proliferation in hypercholesterolemic rabbits. Atherosclerosis, 1994, 111, 47-53.

179. Gotto A.M. Structural and functional aspects of HDL and LDL: Influences of apolipoproteins. Atheroscler.Rev., 1988, 17, 39-50.

180. Granger D.L., Taintor R.R., Boockvar K.S., Hibbs J.B. Measurement of nitrate and nitrite in biological samples using nitrate reductase and Griss reaction. Methods Enzymol., 1996, 268, 142-151.

181. Grisham M.B., Jefferson M.M., Thomas E.L. Role of monochloramine in the oxidation of erythrocyte hemoglobin by stimulated neutrophils. J.Biol.Chem., 1984, 259, 6757-6765.

182. Haberland M.E., Fogelman A.M., Edwaeds P.A. Specificity of receptor-mediated recognition of malondialdehyde modified low-density lipoproteins. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1982, 79, 1712-1716.

183. Harman D. Atherosclerosis: a hypothesis concerning the initiating steps in pathogenesis. J.Geront., 1957, 12, 199-202.

184. Harrison J.E. The functional mechanism of myeloperoxidase. In: Cancer Enzymology. Eds. Schultz J., Cameron B.F. New York: Academic Press, 1976, 305-317.

185. Harrison J.E., Schultz J. Studies on the chlorinating activity of myeloperoxidase. J.Biol.Chem., 1976, 251, 1371-1374.

186. Hartley A., Davies M., Rice Evans C. Desferrioxamine as a lipid chain-breaking antioxidant in sickle erythrocyte membranes. FEBS Lett., 1990, 264, 145-148.

187. Hartung H.P., Kladetzky R.G., Melnik B., Hennerici M. Stimulation of the scavenger receptor on monocytes-macrophages evokes release of arachidonic acid metabolites and reduced oxygen species. Lab.Invest., 1986, 55, 209-216.

188. Havel R. Lipid transport function of lipoproteins in blood plasma. Am.J.Physiol., 1987, 253, Pt. 1, E1-E2.

189. Hazell L.J., Arnold L., Flowers D., Waeg G., Malle E., Stocker R. Presence of hypochlorite-modified proteins in human atherosclerotic lesions. J.Clin.Invest., 1996, 97, 1535-1544.

190. Hazell L.J., Stocker R. Alpha-tocopherol does not inhibit hypochlorite-induced oxidation of apolipoprotein B-100 of low-density lipoprotein. FEBS Lett., 1997, 414, 541-544.

191. Hazell L.J., Stocker R. Oxidation of low-density lipoprotein with hypochlorite causestransformation of the lipoprotein into a high-uptake form for macrophages. Biochem.J., 1993, 290, 165-172.

192. Hazell L.J., van den Berg J.J., Stocker R. Oxidation of low-density lipoprotein by hypochlorite causes aggregation that is mediated by modification of lysine residues rather than lipid oxidation. Biochem.J., 1994, 302, 297-304.

193. Hazen S.L., Heinecke J.W. 3-Chlorotyrosine, a specific marker of myeloperoxidase-catalyzed oxidation, is markedly elevated in low density lipoprotein isolated from human atherosclerotic intima. J.Clin.Invest., 1997, 99, 2075-2081.

194. Heinecke J.W. Free radical modification of low-density lipoprotein: Mechanisms and biological consequences. Free Radic.Biol.Med., 1987, 3, 65-73.

195. Heinecke J.W. Mechanisms of oxidative damage of low density lipoprotein in human atherosclerosis. Curr.Opin.Lipidol., 1997, 8, 268-274.

196. Heinecke J.W., Baker L., Rosen H., Chait A. Superoxide-mediated modification of low density lipoprotein by arterial smooth muscle cells. J.Clin.Invest., 1986, 77, 757-761.

197. Heinecke J.W., Li W., Daehnke H.L., Goldstein J.A. Dityrosine, a specific marker of oxidation, is synthesized by the myeloperoxidase-hydrogen peroxide system of human neutrophils and macrophages. J.Biol.Chem., 1993, 268, 4069-4077.

198. Heinecke J.W., Rosen H., Chait A. Iron and copper promote modification of low density lipoprotein by human arterial smooth muscle cells in culture. J.Clin.Invest., 1984, 74, 18901894.

199. Held A.M., Halko D.J., Hurst J.K. Mechanisms of chlorine oxidation of hydrogen peroxide. J. Am. Chem. Soc., 1978, 100, 5732-5740.

200. Hennig B., Chow C.K. Lipid peroxidation and endothelial cell injury: implications in atherosclerosis. Free Radic.Biol.Med., 1988, 4, 99-106.

201. Hinsbergh V.W.M. Biologic generation and metabolic effect of oxidized lipoproteins. Agents and Actions, 1987, 22, 349-350.

202. Hinsbergh V.W.M., Scheffer M., Havekes L., Kempen H.J.M. Role of endothelial cells and their products in the modification of low-density lipoproteins. Biochim.Biophys.Acta, 1986, 878, 49-64.

203. Hiramatsu K., Chait A., Biermann E.L. The effect of concanavalin A-stimulated mononuclear cells on low density lipoprotein receptor activity of cultured fibroblasts. Proc.Soc.Exp.Biol, and Med., 1985, 180, 9-16.

204. Hiramatsu K., Rosen H., Heinecke J.W., Wolfbaur G., Chait A. Superoxide initiates oxidation of low density lipoprotein by human monocytes. Arteriosclerosis, 1987, 7, 55-60.

205. Hoff H.F., Gaubatz J.W. Isolation, purification and characterization of a lipoprotein containing apo B from the human aorta. Atherosclerosis, 1982, 42, 273-297.

206. Hogg N., Rice Evans C., Darley Usmar V., Wilson M.T., Paganga G., Bourne L. The role of lipid hydroperoxides in the myoglobin-dependent oxidation of LDL. Arch.Biochem.Biophys., 1994, 314, 39-44.

207. Hoogland H., Dekker H.L., Riel C., Kuilenburg A., Muijsers A.O., Wever R. A steady-state study on the formation of II and III of myeloperoxidase. Biochim.Biophys.Acta, 1988, 955, 337345.

208. Howard J.A., Ingold K.U. The self-reaction of sec-butylperoxy radicals. Conformation of the Russell mechanism. J.A.Chem.Soc., 1968, 90, 1056-1058.

209. Hu M.L., Louie S., Cross C.E., Motchnik P., Halliwell B. Antioxidant protection against hypochlorous acid in human plasma. J.Lab.Clin.Med., 1993,121, 257-262.

210. Hughes M.N., Nicklin H.G. The chemistry of pernitrites. Pat 1. Kinetics of decomposition of pernitrous acid. J.Chem.Soc., 1968, A, 450-452.

211. Hui D.Y., Noel G.J., Harmony J.A. Binding of plasma low density lipoproteins to erithrocytes. Biochim.Biophys.Acta, 1981, 664, 513-526.

212. Hwang P.L. Biological activities of oxygenated sterols physiological and pathological implications. Bioessays, 1991, 13, 583-589.

213. Ischiropoulos H., Zhu L., Chen J., Tsai M., Martin J.C., Smith C.D., Beckman J.S. Peroxynitrite-mediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase. Arch.Biochem.Biophys., 1992, 298, 431-437.

214. Iwamoto H., Kobayashi T., Hasegawa E., Morita Y. Reaction of human myeloperoxidase with hydrogen peroxide and its true catalase activity. J.Biochem., 1987, 101, 1407-1412.

215. Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury. Free Radic.Biol.Med., 1990, 9, 515-540.

216. Janzen E.G., Jandrisits L.T., Barber D.L. Studies on the origin of the hydroxyl spin adduct of

217. DMPO produced from the stimulation of neutrophils by phorbol-12-myristate-13-acetate. Free Radie.Res.Commun., 1987,4, 115-123.

218. Jasin H.E. Oxidative modification of inflammatory synovial fluid immunoglobulin G. Inflammation, 1993, 17, 167-181.

219. Jessup W., Rankin S.M., De Whalley C.V., Hoult J.R.S., Scott J., Leake D.S. a-Tocopherol consumption during low-density lipoprotein oxidation. Biochem.J., 1990, 265, 399-405.

220. Jialal I., Freeman D.A., Grundy S.M. Varying susceptibility of different low density lipoproteins to oxidative modification. Arterioscler.Thromb., 1991, 11, 482-488.

221. Johnson D.W., Margerum D.W. Non-metal redox kinetics: a reexamination of the mechanism of the reaction between hypochlorite and nitrite ions. Inorg.Chem., 1991, 30, 48454851.

222. Jougasaki M., Kugiyama K., Saito Y., Nakao K., Imura H., Yasue H. Suppression of endothelin-1 secretion by lysophosphatidylcholine in oxidized low density lipoprotein in cultured vascular endothelial cells. Circ.Res., 1992, 71, 614-619.

223. Jürgens G., Hoff H.F., Chisolm G.M., Esterbauer H. Modification of human serum low density lipoprotein by oxidation characterization and pathophysiological implications. Chem.Phys.Lipids, 1987, 45, 315-336.

224. Kalant N., McCormick S., Parniak M.A. Effects of copper and histidine on oxidative modification of low density lipoprotein and its subsequent binding to collagen. Arterioscler.Thromb., 1991, 11, 1322-1329.

225. Kalyanaraman B., Sohnle P.G. Generation of free radical intermediates from foreign compounds by neutrophil-derived oxidants. J.CIin.lnvest., 1985, 75, 1618-1622.

226. Kanazawa T., Izawa M., Kaneko H., Onodera K., Matoki H., Oike Y., Senyang L. Comparison among lipid constituents in native LDL, ultra-water-soluble LDL, and vessel wall, and their significance in atherosclerosis. Exp.Mol.Pathol., 1987, 47, 166-174.

227. Kanazawa T., Yu S., Osanai T., Uemura T., Onodera K., Metoki H., Oike Y. Transformation of cultured human monocytes by peroxidized low-density lipoprotein. Pathobiology, 1995, 63, 143-147.

228. Kanofsky J.R. Singlet oxygen production by biological systems. Chem.-Biol. Interact., 1989, 70, 1-28.

229. Kanofsky J.R. Singlet oxygen production by chloroperoxidase-hydrogen peroxide-halide systems. J.Biol.Chem., 1984, 259, 5596-5600.

230. Keith F. Oxygen free radicals in cardiac transplantation. J.Card.Surg., 1993, 8, 245-248.

231. Kettle A.J., Winterbourn C.C. Assays for the chlorination activity of myeloperoxidase. Methods Enzymol., 1994, 233, 502-512.

232. Kettle A.J., Winterbourn C.C. Mechanism of inhibition of myeloperoxidase by antiinflammatory drugs. Biochem.Pharmacol., 1991, 41, 1485-1492.

233. Kettle A.J., Winterbourn C.C. Oxidation of hydroquinone by myeloperoxidase. Mechanism of stimulation by benzoquinone. J.Biol.Chem., 1992, 267, 8319-8324.

234. Kettle A.J., Winterbourn C.C. Superoxide modulates the activity of myeloperoxidase and optimizes the production of hypochlorous acid. Biochem.J., 1988, 252, 529-536.

235. Khan A.U., Kasha M. Chemiluminescence arising from simultaneous transitions in pairs of singlet oxygen molecules. J.Am.Chem.Soc., 1970, 92, 3293-3300.

236. Kienbaum P., Braun M., Hohlfeld T., Weber A.A., Sarbia M., Schror K. Antiatherosclerotic effects of oral naftidrofuryl in cholesterol-fed rabbits involve inhibition of neutrophil function. J.Cardiovasc.Pharmacol., 1995, 25, 774-781.

237. Klebanoff S.J., Clark R.A. The neutrophil: Function and clinical disorders. Amsterdam: Elsevier-North Holland, 1978.

238. Knipping G., Rotheneder M., Striegl G., Esterbauer H. Antioxidants and resistance against oxidation of porcine LDL subtractions. J.Lipid Res., 1990, 31, 1965-1972.

239. Koller E., Quehenberger O., Jürgens G., Wolfbeis O.S., Esterbauer H. Investigation of human plasma low density lipoprotein by three-dimensional fluorescence spectroscopy. FEBS Lett., 1986, 198, 229-234.

240. Koppenol W.H. The centennial of the Fenton reaction. Free Radic.Biol.Med, 1993, 15, 645651.

241. Koppenol W.H., Kissner R., Beckman J.S. Syntheses of peroxynitrite: to go with the flow or on solid grounds? Methods Enzymoi, 1996, 269, 296-302.

242. Kukreja R.C., Weaver A.B., Hess M.L. Sarcolemmal Na+-K+-ATPase: inactivation by neutrophil-derived free radicals and oxidants. Am.J.Physiol., 1990, 259, H1330-H1336.

243. Kukreja R.C., Weaver A.B., Hess M.L. Stimulated human neutrophils damage cardiac sarcoplasmic reticulum function by generation of oxidants. Biochim.Biophys.Acta, 1989, 990, 198-205.

244. Laemmli U.K., Farve M. Maturation of the head of bacteriophage T4. J.Mol.Biol., 1973, 80, 575-599.

245. Laggner P., Kostner G.M. Thermotropic changes in the surface structure of lipoprotein B from human-plasma low-density lipoproteins. Eur.J.Biochem., 1978, 84, 227-232.

246. Ledwozyw A., Michalak J., Stepien A., Kadziolka A. The relationship between plasmatriglycerides, cholesterol, total lipids and lipid peroxidation products during human atherosclerosis. Clinica.Chimica.Acta, 1986,155, 275-284.

247. Leeuwenburgh C., Hardy M.M., Hazen S.L., Wagner P., Oh ishi S., Steinbrecher U.P., Heinecke J.W. Reactive nitrogen intermediates promote low density lipoprotein oxidation in human atherosclerotic intima. J.Biol.Chem., 1997, 272, 1433-1436.

248. Lehr H.A., Hubner C„ Nolte D„ Finckh B., Beisiegel U., Kohlschutter A., Messmer K. Oxidatively modified human low-density lipoprotein stimulates leukocyte adherence to the microvascular endothelium in vivo. Res.Exp.Med Berl., 1991, 191, 85-90.

249. Lelli J.L.J., Pradhan S., Cobb L.M. Prevention of postischemic injury in immature intestine by deferoxamine. J.Surg.Res., 1993, 54, 34-38.

250. Lenz M.L., Hughes H., Mitchell J.R., Via D.P., Guyton J.R., Taylor A.A., Gotto A.M.J., Smith C.V. Lipid hydroperoxy and hydroxy derivatives in copper-catalyzed oxidation of low density lipoprotein. J.Lipid Res., 1990, 31, 1043-1050.

251. Liao L., Aw T.Y., Kvietys P.R., Granger D.N. Oxidized LDL-induced microvascular dysfunction. Dependence on oxidation procedure. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol., 1995, 15, 2305-2311.

252. Liao L., Granger D.N. Modulation of oxidized low-density lipoprotein-induced microvascular dysfunction by nitric oxide. Am.J.Physiol., 1995, 268, H1643-H1650.

253. Lindgren F.T. Preparative ultracentrifugal laboratory procedures and suggestions for lipoprotein analysis. In: Analisis of lipids and lipoproteins, Ed. Perkins E.G., Champaign (111.): Amer. Oil. Chemists' Soc., 1975, 204-224.

254. Lister M.W., Rosenblum P. The oxidation of nitrite and iodate ions by hypochlorite ions. Can.J.Chem., 1961, 39, 1645-1651.

255. Long C.A., Bielski B.H.J. Rate of reaction of superoxide radical with chloride-containing species. J.Phys.Chem., 1980, 84, 555-557.

256. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem., 1951, 193, 265-275.

257. Ludwig P.W., Hunninghake D.B., Hoidal J.R. Increased leucocyte oxidative metabolism in hyperlipoproteinaemia. Lancet, 1982, 2, 348-350.

258. Lund-Katz S., Hammerschlag B., Phillips M.C. Kinetics and mechanism of free cholesterol exchange between human serum high- and low-density lipoproteins. Biochemistry, 1982, 21, 2964-2969.

259. Luyt D.K., Richards G.A., Roode H., Dowdeswell R.J., van Rensburg A.J., Reinach S.G. Thalassemia: lung function with reference to iron studies and reactive oxidant status. Pediatr.Hematol.Oncol., 1993, 10, 13-23.

260. Maiorino M., Gregolin C., Ursini F. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Methods Enzymol., 1990, 186, 448-457.

261. Malle E., Hazell L., Stocker R., Sattler W., Esterbauer H., Waeg G. Immunologie detection and measurement of hypochlorite-modified LDL with specific monoclonal antibodies. Arterioscler. Thromb. Vasc.Biol., 1995, 15, 982-989.

262. Malle E., Woenckhaus C., Waeg G., Esterbauer H., Grone E.F., Grone H.J. Immunological evidence for hypochlorite-modified proteins in human kidney. Am.J.Pathol., 1997, 150, 603615.

263. Marietta M.A., Yoon P.S., lyenger R., Leaf C.D., Wishok J.S. Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry, 1988, 27, 87068711.

264. Mashino T., Fridovich I. Reactions of hypochlorite with catalase. Biochim.Biophys.Acta, 1988, 956, 63-69.

265. Matheson N.R., Travis J. Differential effects of oxidizing agents on human plasma ar proteinase inhibitor and human neutrophil myeloperoxidase. Biochemistry, 1985, 24, 19411945.

266. Matsuoka T., Kato M., Kako K.J. Effect of oxidants on Na+,K+-ATPase and its reversal. Basic.Res.Cardiol., 1990, 85, 330-341.

267. Matz J., Andersson T.L., Ferns G.A., Anggard E.E. Dietary vitamin E increases the resistance to lipoprotein oxidation and attenuates endothelial dysfunction in the cholesterol-fed rabbit. Atherosclerosis, 1994, 110, 241-249.

268. McGorisk G.M., Treasure C.B. Endothelial dysfunction in coronary heart disease. Curr. Opin. Cardiol., 1996, 11, 341 -350.

269. McMurray H.F., Parthasarathy S., Steinberg D. Oxidatively modified low density lipoprotein is a chemoattractant for human T lymphocytes. J.Clin.Invest., 1993, 92, 1004-1008.

270. Mehlhorn P.J., Packer L. Membrane surface potential measurements with amphiphilic spin labels. Methods Enzymol., 1979, 56, 515-526.

271. Menasche P., Antebi H., Alcindor L.G., Teiger E., Perez G., Giudicelli Y., Nordmann R., Piwnica A. Iron chelation by deferoxamine inhibits lipid peroxidation during cardiopulmonary bypass in humans. Circulation, 1990, 82, IV390-IV396.

272. Merkel P.B., Nilsson R., Kearns D.R. Deuterium effects on singlet oxygen lifetimes in solutions. A new test of singlet oxygen reactions. J.Am.Chem.Soc., 1972, 94, 1030-1031.

273. Metzger J.O. Herstellung (Erzeugung) von Radikalen durch homolytische Spaltung vonC.H-Bindungen mit Radikalen. In: Houben-Weyl. Methoden der Organischen Chemie. 4. Auflage, Bd. E19a, C-Radikale, Georg-Thieme Verlag, Stuttgart-New York, 1989, 60-145.

274. Michaelis J., Vissers M.C., Winterbourn C.C. Different effects of hypochlorous acid on human neutrophil metalloproteinases: activation of collagenase and inactivation of collagenase and gelatinase. Arch.Biochem.Biophys., 1992, 292, 555-562.

275. Miller N.J., Sampson J., Candeias L.P., Bramley P.M., Rice-Evans C.A. Antioxidant activitiesof carotenes and xanthophylls. FEBS Lett., 1996, 384, 240-242.

276. Monboisse J.C., Borel J.P. Oxidative damage to collagen. EXS, 1992, 62, 323-327.

277. Moncada S., Higgs E.A. Endogenous nitric oxide: physiology, pathology and clinical relevance. Eur.J.CIin.lmvest., 1991, 21, 361-374.

278. Morris J.C. The acid ionization constant of HOCI from 5 to 35°C. J.Phys.Chem., 1966, 70, 3798-3805.

279. Morrisett J.D., Jackson R.L., Gotto A.M. Lipid-protein interactions in the plasma lipoproteins. Biochim.Biophys.Acta, 1977, 472, 93-133.

280. Motchnik P.A., Frei B., Ames B.N. Measurement of antioxidants in human blood plasma. Methods EnzymoL, 1994, 234, 269-279.

281. Mowri H., Ohkuma S., Takano T. Monoclonal DLRIa/104G antibody recognizing peroxidized lipoproteins in atherosclerotic lesions. Biochim.Biophys.Acta, 1988, 963, 208-214.

282. Myant N.B. The catabolism of low-density lipoprotein by the LDL-receptor-lysosomal system. In: Lysosomes: Biology and Pathology. 1984, 7, 261-296.

283. Nakamori K., Koyama I., Nakamura T., Yoshida T., Umeda M., Inoue K. Effectiveness of taurine in protecting biomembrane against oxidant. Chem.Pharm.Bull.Tokyo., 1990, 38, 31163119.

284. Okabe H., Yamamoto T., Kita M. et al. Lipid peroxides in ageing and atherosclerosis. J. Clin. Chem. Clin.Biochem., 1981, 19, 789-790.

285. O'Leary V.J., Darley Usmar V.M., Russell L.J., Stone D. Pro-oxidant effects of lipoxygenase-derived peroxides on the copper-initiated oxidation of low-density lipoprotein. Biochem.J., 1992, 282, 631-634.

286. Ontko J.A. Physical and chemical changes in isolated chylomicrons: Prevention by EDTA. J.Lipid Res., 1970, 11, 367-375.

287. Packard C.J., Shepherd J. Low-density lipoprotein receptor pathway in man: Its role in regulating plasma low-density lipoprotein levels. Atheroscler.Rev., 1983,11, 29-63.

288. Paganga G., Rice Evans C., Rule R., Leake D. The interaction between ruptured erythrocytes and low-density lipoproteins. FEBS Lett., 1992, 303, 154-158.

289. Palmer R.M. The L-arginine: nitric oxide pathway. Curr.Opin.Nephrol.Hypertens., 1993, 2, 122-128.

290. Palozza P., Krinsky N.I. Antioxidant effects of carotenoids in vivo and in vitro: an overview.

291. Methods Enzymol., 1992, 213, 403-420.

292. Panasenko O.M., Arnhold J., Vladimirov Yu.A., Arnold K., Sergienko V.I. Hypochlorite-induced peroxidation of egg yolk phosphatidylcholine is mediated by hydroperoxides. Free Rad.Res., 1997, 27, 1-12.

293. Panasenko O.M., Briviba K., Klotz L.-O., Sies H. Oxidative modification and nitration of human low-density lipoproteins by the reaction of hypochlorous acid with nitrite. Arch.Biochem.and Biophys., 1997, 343, 254-259.

294. Panasenko O.M., Evgina S.A., Driomina E.S., Sharov V.S., Sergienko V.I., Vladimirov Yu.A. Hypochlorite induces lipid peroxidation in blood lipoproteins and phospholipid liposomes. Free Radic.Biol.Med., 1995, 19, 133-140.

295. Panasenko O.M., Vol'nova T.V., Osipov A.N., Azizova O.A., Vladimirov Yu.A. Free-radical generation by monocytes and neutrophils: a possible cause of plasma lipoprotein modification. Biomed.Sci., 1991, 2, 581-589.

296. Papa L.R., McCauley P.T. Hypochlorite-serum reaction products inhibit porcine vascular endothelial cell growth in culture. Artery, 1985,13, 50-60.

297. Parthasarathy S., Printz D.S., Boyd D., Joy L., Steinberg D. Macrophage oxidation of low density lipoprotein generates a modified from recognized by the scavenger receptor. Arteriosclerosis, 1986, 6, 505-510.

298. Peng S.K., Hu B., Morin R.J. Angiotoxicity and atherogenicity of cholesterol oxides. J.Clin.Lab.Anal., 1991, 5, 144-152.

299. Penner M.H., Osuga D.T., Meares C.F., Feeney R.E. The interaction of anions with native and phenylglyoxal-modified human serum transferrin. Arch.Biochem.Biophys., 1987, 252, 714.

300. Peppin G.J., Weiss S.J. Activation of the endogenous metalloproteinase, gelatinase, by triggered human neutrophils. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1986, 83, 4322-4326.

301. Plane F., Kerr P., Bruckdorfer K.R., Jacobs M. Inhibition of endothelium-dependent relaxation by oxidized low-density lipoproteins. Biochem.Soc.Trans., 1990, 18, 1177-1178.

302. Pownall H.J., Massey J.B., Sparrow J.T., Gotto A.M. Lipid-protein interactions and lipoprotein reassembly. In: Plasma Lipoproteins. Ed. A.M.Gotto. New York: Elsevier, 1987, 95127.

303. Prasad K., Kapoor R., Kalra J. Methionine in protection of hemorrhagic shock: role of oxygen free radicals and hypochlorous acid. Circ. Shock, 1992, 36, 265-276.

304. Price C.C., Sears C.A. Nitryl chloride as a nitrating agent. J.Am.Chem.Soc., 1953, 75, 32763277.

305. Pryor W.A. Oxy-radicals and related species: Their formation, lifetimes, and reactions. Annu.Rev.Physiol., 1986, 48, 657-667.

306. Pryor W.A. The formation of free radicals and the consequences of their reactions in vivo. Photochem.Photobiol., 1978, 28, 787-801.

307. Puhl H., Waeg G., Esterbauer H. Methods to determine oxidation of low-density lipoproteins. Methods Enzymol., 1994, 233, 425-441.

308. Ramezanian M.S., Padmaja S., Koppenol W.H. Nitration and hydroxylation of phenolic compaunds by peroxynitrite. Chem.Res.Toxicol., 1996, 9, 232-240.

309. Rankin S.M., Leake D.S. The modification of low-density lipoproteins by macrophages in relation to atherosclerosis. Biochem.Soc.Trans., 1987, 15, 485-486.

310. Raschke P., Brcker B.F., Leipert B., Schwartz L.M., Zahler S., Gerlach E. Postischemic dysfunction of the heart induced by small numbers of neutrophils via formation of hypochlorous acid. Bas.Res.Cardiol., 1993, 88, 321-339.

311. Raschke P., Massoudy P., Brcker B.F. Taurine protects the heart from neutrophil-induced reperfusion injury. Free Radic.Biol.Med., 1995, 19, 461-471.

312. Rice-Evans C., Leake D., Bruckdorfer K.R., Diplock A.T. Practical approaches to low density lipoprotein oxidation: whys, wherefores and pitfalls. Free Radic.Res., 1996, 25, 285-311.

313. Rider L.G., Niedel J.C. Diacylglycerol accumulation and superoxide anion production in stimulated human neutrophils. J.Biol.Chem., 1987, 262, 5603-5608.

314. Ryu B.H., Mao F.W., Lou P., Gutman R.L., Greenspan P. Cholesteryl ester accumulation in macrophages treated with oxidized low density lipoprotein. Biosci.Biotechnol.Biochem., 1995, 59, 1619-1622.

315. Saari H., Sorsa T., Lindy O., Suomalainen K., Halinen S., Konttinen Y.T. Reactive oxygen species as regulators of human neutrophil and fibroblast interstitial collagenases. Int.J.Tissue React., 1992, 14, 113-120.

316. Salmon S., Maziere C., Theron L., Beucler J., Ayraulz-Jarrier M., Goldstein S., Plonovski J. Immunological detection of low-density lipoproteins modified by malondialdehyde in vitro or in vivo. Biochim.Biophys.Acta, 1987, 920, 215-220.

317. Salmon S., Maziere J.C., Santus R., Morliere P. A mechanistic study of the interaction of UVB radiations with human serum lipoproteins. Biochim.Biophys.Acta, 1991, 1086, 1-6.

318. Scaccini C., Jialal I. LDL modification by activated polymorphonuclear leukocytes: a cellular model of mild oxidative stress. Free Radic.Biol.Med, 1994, 16, 49-55.

319. Schiller J., Arnhold J., Arnold K. Action of hypochlorous acid on polymeric components of260cartilage. Use of 13C-NMR spectroscopy. Z.Naturforsch., 1995, 50c, 721-728.

320. Schiller J., Arnhold J., Grunder W., Arnold K. The action of hypochlorous acid on polymeric components of cartilage. Biol.Chem.Hoppe Seyler, 1994, 375, 167-172.

321. Schraufstatter I., Hyslop P.A., Jackson J.H., Cochrane C.G. Oxidant-induced DNA damage of target cells. J.CIin.lnvest, 1988, 82, 1040-1050.

322. Schraufstatter I.U., Browne K., Harris A., Hyslop P.A., Jackson J.H., Quehenberger O., Cochrane C.G. Mechanisms of hypochlorite injury of target cells. J.CIin.lnvest., 1990, 85, 554562.

323. Schreier-Muccillo S., Marsh D., Smith I.C.P. Monitoring the permeability profile of lipid membranes with spin probes. Arch.Biochem.Biophys., 1976,172, 1-11.

324. Schuh J., Fairclough G.F., Haschemeyer R.H. Oxygen-mediated hererogeneity of apo-low-density lipoprotein. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1978, 75, 3173-3177.

325. Schultz Y., Kaminver K. Myeloperoxidase of the leukocyte of normal human blood. Content and localization. Arch.Biochem., 1962, 96, 465-467.

326. Seeverens H.J., Tijhuis G.J., Ruijs G.J., Kazzaz B.A., Kauffmann R.H. Dialysis associated mucormycosis and desferrioxamine treatment: a case report with review of the role of oxygen radicals. Neth.J.Med., 1992, 41, 275-279.

327. Sepe S.M., Clark R.A. Oxidant membrane injury by the neutrophil myeloperoxidase system.

328. Characterization of a liposome model and injury by myeloperoxidase, hydrogen peroxide, and halides. J.Immunol., 1985, 134, 1888-1895.

329. Sepe S.M., Clark R.A. Oxidant membrane injury by the neutrophil myeloperoxidase system.

330. Injury by stimulated neutrophils and protection by lipid-soluble antioxidants. J.Immunol., 1985, 134, 1896-1901.

331. Shaish A., Daugherty A., O'Sullivan F., Schonfeld G., Heinecke J.W. Beta-carotene inhibits atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits. J.CIin.lnvest., 1995, 96, 2075-2082.

332. Sharonov B.P., Churilova I.V. Inactivation and oxidative modification of Cu,Zn superoxide dismutase by stimulated neutrophils: the appearance of new catalytically active structures. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 189, 1129-1135.

333. Sharonov B.P., Govorova N.I., Lyzlova S.N. A comparative study of serum proteins ability to scavenge active oxygen species: "02". and OCI". Biochem.lnt., 1988, 17, 783-790.

334. Sharonov B.P., Govorova N.I., Lyzlova S.N. Carnosine as a potential scavenger of oxidants generated by stimulated neutrophils. Biochem.lnt., 1990, 21, 61-68.

335. Sharonov B.P., Govorova N.I., Lyzlova S.N. Serum protein degradation by hypochlorite. Biochem.lnt., 1989, 19, 27-35.

336. Sies H., de Groot H. Role of reactive oxygen species in cell toxicity. Toxicol.Lett., 1992, 6465 Spec No, 547-551.

337. Sies H., Stahl W., Sundquist A.R. Antioxidant functions of vitamins. Vitamins E and C, beta261carotene, and othercarotenoids. Ann.N.Y.Acad.Sei., 1992, 669, 7-20.

338. Simon B.C., Cunningham L.D., Cohen R.A. Oxidized low density lipoproteins cause contraction and inhibit endothelium-dependent relaxation in the pig coronary artery. J.Clin.Invest., 1990, 86, 75-79.

339. Smith R.J., Speziale S.C., Bowman B.J. Properties of interleukin-1 as a complete secretogen for human neutrophils. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1985, 130, 1233-1240.

340. Soriani M., Mazzuca S., Quaresima V., Minetti M. Oxidation of desferrioxamine to nitroxide free radical by activated human neutrophils. Free Radic.Biol.Med., 1993,14, 589-599.

341. Spady D.K., Huettinger M., Bilheimer D.W., Dietschy J.M. Role of receptor-independent low density lipoprotein transport in the maintenance of tissue cholesterol balance in the normal and WHHL rabbit. J.Lipid Res., 1987, 28, 32-41.

342. Srivastava S.K., Lai A.K., Ansari N.H. Defense system of red blood sells against oxidative damage. In: Red blood cell and lens metabolism. Ed. Srivastava S.K., New York: Elsevier,1986, 123-127.

343. Stahl W., Sies H. Separation of geometrical isomers of beta-carotene and lycopene. Methods Enzymol., 1994, 234, 388-400.

344. Stark J.A., Henderson A.R. In vitro effect of elastase and cathepsin G from human neutrophils on creatine kinase and lactate dehydrogenase isoenzymes. Clin.Chem., 1993, 39, 986-992.

345. Steinbrecher U.P. Oxidation of human low density lipoprotein results in derivatization of lysine residues of apolipoprotein B by lipid peroxide decomposition products. J.Biol.Chem.,1987, 262, 3603-3608.

346. Steinbrecher U.P. Role of superoxide in endothelial-cell modification of low-density lipoproteins. Biochim.Biophys.Acta, 1988, 959, 20-30.

347. Steinbrecher U.P., Witztum J.L., Parthasarathy S., Steinberg D. Decrease in reactive amino grups during oxidation or endothelial cell modification of LDL. Arteriosclerosis, 1987, 7, 135143.

348. Stelmaszynska T., Kukovetz E., Egger G., Schaur R.J. Possible involvement of myeloperoxidase in lipid peroxidation. Int.J.Biochem., 1992, 24, 121-128.

349. Stocker R., Bowry V.W., Frei B. Ubiquinol-10 protects human low density lipoprotein more efficiently against lipid peroxidation than does alpha-tocopherol. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1991, 88, 1646-1650.

350. Stocker R., Peterhans E. Antioxidant properties of conjugated bilirubin and biliverdin: biologically relevant scavenging of hypochlorous acid. Free Radic.Res.Commun., 1989, 6, 57262

351. Sulyok S., Bar-Pollak Z., Feher E., Kemenes I., Feher J. Liver lipid peroxidation induced by cholesterol and its treatment with a dihydroquinoline-type free radical scavenger in rabbits. Acta Physiol.Hung., 1984, 64, 437-442.

352. Suzuki S., Kaneko M., Chapman D.C., Dhalla N.S. Alterations in cardiac contractile proteins due to oxygen free radicals. Biochim.Biophys.Acta, 1991, 1074, 95-100.

353. Swern D„ Billen G.N., FindleyT.W., Scanlan J.T. J.Am.Chem.Soc., 1945, 67, 1786-1789.

354. Szczeklik A., Gryglewski R.J. Low density lipoproteins (LDL) are carriers for lipid peroxides and inhibit prostacyclin (PGI2) biosyntesis in arteries. Artery, 1980, 7, 488-495.

355. Takahashi M., Ikeda H., Sato E.F., Akimaru K., Edamatsu R., Inoue M., Utsumi K. Stimulus-specific enhancement of luminol chemiluminescence in neutrophils by phosphatidylserine liposomes. Arch.Biochem.Biophys., 1992, 298, 43-48.

356. Takahashi M., Yui Y., Yasumoto H., Aoyama T., Morishita H., Hattori R., Kawai C. Lipoproteins are inhibitors of endothelium-dependent relaxation of rabbit aorta. Am.J.Physiol., 1990, 258, H1-H8.

357. Takahashi R., Edashige K., Sato E.F., Inoue M., Matsuno T., Utsumi K. Luminol chemiluminescence and active oxygen generation by activated neutrophils. Arch.Biochem.Biophys., 1991, 285, 325-330.

358. Tamir S., deRojas Walker T., Wishnok J.S., Tannenbaum S.R. DNA damage and genotoxicity by nitric oxide. Methods Enzymol., 1996, 269, 230-243.

359. Tanner F.C., Boulanger C.M., LuscherT.F. Endothelium-derived nitric oxide, endothelin, and platelet vessel wall interaction: alterations in hypercholesterolemia and atherosclerosis. Semin. Thromb.Hemost., 1993, 19, 167-175.

360. Terada L.S., Beehler C.J., Banerjee A., Brown J.M., Grosso M.A., Harken A.H., McCord J.M., Repine J.E. Hyperoxia and self- or neutrophil-generated 02 metabolites inactivate xanthine oxidase. J.Appl.Physiol., 1988, 65, 2349-2353.

361. Thomas M.J., Smith S., Pang J.A. The use of water-soluble radical scavengers to detect hydroxyl radical formation by polymorphonuclear leukocytes. Free Radic.Res.Commun., 1991, 12-13 Pt1, 53-57.

362. Toussaint H. Verhalten der Chlorsäure und ihre Analyse. Annalen der Chemie und Pharmacie, 1866, 137, 114-117.

363. Van den Berg J.J., Winterbourn C.C., Kuypers F.A. Hypochlorous acid-mediated modification of cholesterol and phospholipid: analysis of reaction products by gaschromatography-mass spectrometry. J.Lipid Res., 1993, 34, 2005-2012.

364. Van der Vliet A., Hu M.L., O'Neill C.A., Cross C.E., Halliwell B. Interactions of human blood plasma with hydrogen peroxide and hypochlorous acid. J.Lab.Clin.Med, 1994, 124, 701-707.

365. Van Hinsbergh V.W.M., Scheffer M., Havekes L., Kempen H.J.M. Role of endothelial cells and their products in the modification of low-density lipoproteins. Biochim.Biophys.Acta, 1986, 878, 49-64.

366. Van Rensburg C.E., Van Staden A.M., Anderson R. Inactivation of poly (ADP-ribose) polymerase by hypochlorous acid. Free Radic.Biol.Med., 1991, 11, 285-291.

367. Van Rensburg C.E., Van Staden A.M., Anderson R., Van Rensburg E.J. Hypochlorous acid potentiates hydrogen peroxide-mediated DNA-strand breaks in human mononuclear leucocytes. Mutat.Res., 1992, 265, 255-261.

368. Van Zyl J.M., Basson K., Kriegler A., Van der Walt B.J. Activation of chlorpromazine by the myeloperoxidase system of the human neutrophil. Biochem.Pharmacol., 1990, 40, 947-954.

369. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.J., Vasendin J.M. A universal reagent for phospholipid anasysis. J.Chromatogr., 1975, 114, 129-141.

370. Venge P., Foucard T., Henriksen J. Serum levels of lactoferrin, lysozyme and myeloperoxidase in normal, infection-prone and leukemic children. Clin.Chim.Acta, 1984, 136, №213, 121-130.

371. Vissers M.C., Fantone J.C. Inhibition of hypochlorous acid-mediated reactions by desferrioxamine. Implications for the mechanism of cellular injury by neutrophils. Free Radic.Biol.Med., 1990, 8, 331-337.

372. Vissers M.C., Winterbourn C.C. Myeloperoxidase-dependent oxidative inactivation of neutrophil neutral proteinases and microbicidal enzymes. Biochem.J., 1987, 245, 277-280.

373. Vissers M.C., Winterbourn C.C. Oxidation of intracellular glutathione after exposure of human red blood cells to hypochlorous acid. Biochem.J., 1995, 307, 57-62.

374. Vissers M.C., Winterbourn C.C. Oxidative damage to fibronectin. I. The effects of the neutrophil myeloperoxidase system and HOCI. Arch.Biochem.Biophys., 1991, 285, 53-59.

375. Vladimirov Yu.A., Olenev V.I., Suslova T.B., Cheremisina Z.P. Lipid peroxidation in mitochondrial membrane. Adv. Lipid Res., 1980, 17, 173-249.

376. Vogt W., Hesse D. Oxidants generated by the myeloperoxidase-halide system activate thefifth component of human complement, C5. Immunobiology, 1994, 192, 1-9.

377. Weiss S.J. Neutrophil-mediated methemoglobin formation in the erythrocyte. The role of superoxide and hydrogen peroxide. J.Biol.Chem., 1982, 257, 2947-2953.

378. Weiss S.J., Klein R., Slivka A., Wei M. Chlorination of taurine by human neutrophils: Evidence for hypochlorous acid generated. J.Clin.Invest., 1982, 70, 598-607.

379. Weiss S.J., LoBuglio A.F. Biology of disease. Phagocyte-generated oxygen metabolites and cellular injury. Lab.lnvest., 1982, 47, 5-18.

380. Weiss S.J., Peppin G., Ortiz X., Ragsdale C., Test S.T. Oxidative autoactivation of latent collagenase by human neutrophils. Science, 1985, 227, 747-749.

381. Weiss S.J., Slivka A. Monocyte and granulocyte-mediated tumor cell destruction. A role for the hydrogen peroxide-myeloperoxidase-chloride system. J.Clin.Invest., 1982, 69, 255-262.

382. Wiberg N. Lehrbuch der Anorganische Chemie. Berlin-New York: Walter de Gruyter. 1985, 422-425.

383. Wieland E., Brandes A., Armstrong V.W., Oellerich M. Oxidative modification of low density lipoproteins by human polymorphonuclear leukocytes. Eur.J.CIin.Chem.Clin. Biochem., 1993, 31, 725-731.

384. Williams D.L.H. Nitrosation, Cambridge: Cambridge University Press, 1988.

385. Wink D.A., Grisham M.B., Mitchell J.B., Ford P.C. Direct and indirect effects of nitric oxide in chemical reactions relevant to biology. Methods Enzymol., 1996, 268, 12-31.

386. Winterbourn C.C. Comparative reactivities of various biological compounds with myeloperoxidase-hydrogen peroxide-chloride, and similarity of the oxidant to hypochlorite. Biochim. Biophys. A eta, 1985, 840, 204-210.

387. Winterbourn C.C., Carr A.C. Myeloperoxidase-dependent loss of malondialdehyde: a limitation for detecting neutrophil-mediated lipid peroxidation. Arch.Biochem.Biophys., 1993, 302, 461-467.

388. Winterbourn C.C., Garcia R.C., Segal A.W. Production of the superoxide adduct of myeloperoxidase (compound III) by stimulated human neutrophils and its reactivity with hydrogen peroxide and chloride. Biochem.J., 1985, 228, 583-592.

389. Winterbourn C.C., Molloy A.L. Susceptibilities of lactoferrin and transferrin to myeloperoxidase-dependent loss of iron-binding capacity. Biochem.J., 1988, 250, 613-616.

390. Winterbourn C.C., Monteiro H.P., Galilee C.F. Ferritin-dependent lipid peroxidation by stimulated neutrophils: inhibition by myeloperoxidase-derived hypochlorous acid but not by endogenous lactoferrin. Biochim.Biophys.Acta, 1990, 1055, 179-185.

391. Winterbourn C.C., van den Berg J.J., Roitman E., Kuypers F.A. Chlorohydrin formation from unsaturated fatty acids reacted with hypochlorous acid. Arch.Biochem.Biophys., 1992, 296, 547-555.

392. Woenckhaus C., Kaufmann A., Bussfeld D., Gemsa D., Sprenger H., Grone H.J. Hypochlorite-modified LDL: chemotactic potential and chemokine induction in human monocytes. Clin.Immunol.Immunopathol., 1998, 86, 27-33.

393. Wu K.K., Thiagarajan P. Role of endothelium in thrombosis and hemostasis. Annu.Rev.Med, 1996, 47, 315-331.

394. Yla-Herttuia S., Jaakkola O., Ehnholm C., Tikkanen M.J., Solakivi T., Sarkiojo T., Nikkari T. Characterization of two lipoproteins containing apolipoproteins B and E from lesion-free human aortic intima. J.Lipid Res., 1988, 29, 563-572.

395. Yu L.W., Latriano L., Duncan S., Hartwick R.A., Witz G. High-performance liquid chromatography analysis of the thiobarbituric acid adducts of malondialdehyde and trans, frans-muconaldehyde. Anal.Biochem., 1986,156, 326-330.

396. Zgliczynsky J.M., Stelmaszynska T., Domanski J., Ostrowski W. Chloramines as intermediates of oxidation reaction of amino acids by myeloperoxidase. Biochim.Biophys.Acta, 1971, 235, 419-424.

397. Zhang H., Yang Y., Steinbrecher U.P. Structural requirements for the binding of modified proteins to the scavenger receptor of macrophages. J.Biol.Chem., 1993, 268, 5535-5542.

398. Zweier J.L., Kuppusamy P., Lutty G.A. Measurement of endothelial cell free radical generation: Evidence for a central mechanism of free radical injury in postischemic tissues. Proc. Nat. A cad. Sci. USA, 1988, 85, 4046-4050.

Информация о работе

Панасенко, Олег Михайлович
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.02

Диссертация

Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Панасенко, Олег Михайлович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека"

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Панасенко, Олег Михайлович

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Панасенко, Олег Михайлович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика