Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гаптоглобина на свободно-радикальные реакции гемоглобина

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние гаптоглобина на свободно-радикальные реакции гемоглобина"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи р Г г 0'1 УДК 577.354.722: (546.215+546.133/642)

БРЮХАНОВА ЭВЕЛИНА ВАЛЕРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ГАПТОГЛОБИНА НА СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ

ГЕМОГЛОБИНА

Специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена на кафедре биофизики Российскс Государственного Медицинского.Университета.

Научный руководитель: академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор Ю.А.. Владимиров

Научный консультант:. кандидат биологических наук

А.Я. Осипов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

О.А. Азизова доктор медицинских наук В.И. Сороковой

Ведущая организация: НИИ Детской Гематологии КЗ

Российской Федерации

Защита диссертации состоится "¿ах? " 1994 г. на заседа1

специализированного ученого совета К.084.14.04 в Российс* Государственном Медицинском Университете по адресу: 11786 Москва, Островитянова,1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российскс Государственного Медицинского Университета

Автореферат разослан "_" 1994 г.

Ученый секретарь Совета, кандидат1 медицинских наук

И.В.Буромский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ.

Актуальность теми. Хорошо известно, что образование ободных радикалов в биологических системах почти всегда оисходит при участии ионов железа или других металлов ременной валентности (Hallxwell В. et al.,1984; Gutteridge et al.,1986). Около 70% железа в организме человека держится в гемоглобине и миоглобине. В норме гемоглобин ходится внутри эритроцитов, где высокая концентрация рментов, препятствующих образованию свободных радикалов 'avies M.J. et al.,1988). При гемолизе эритроцитов моглобин может попадать в кровяное русло и являться :точником каталитически активного железа. Так, ионы железа 'Гут участвовать в реакции Фентона - разлагать перекись 'дорода с образованием гидроксильного радикала:

Fe2+ + Н2О2 ----> Fe3 + + ОН- 4 ОН-

Однако было показано, что железо в нативном :сигемоглобине каталитически неактивно (Giulivi С. et .,1990). Но в организме образуются такие сильные мслители, как перекись водорода и гипохлорная кислота, ■торая продуцируется активированными нейтрофилами (Wallace J. et al., 1982; Weis S.J.,1986). Перекись водорода, похлорная кислота, органические гидроперекиси липидов гут модифицировать оксигемоглобин с образованием более акционноспособных соединений - феррил- и

рферрилгемоглобина (Giulivi С. et al.,1990). Избыток ислителей по сравнению с оксигемоглобином может приводить деградации гемовой молекулы и высвобождению железа utteridge J.М.С.,1986; Якутова Э.Ш. и соавт.,1992). одукты модификации гемоглобина окислителями способны зывать перекисное окисление липидов липопротеинов крови teinbrecher U.P. et al.,1990), липидов биомембран adrzadeh S.M.H. et al.,1984; Kanner J. et al.,1985;) и угих важных биомолекул организма, являясь причиной зникновения и развития различных заболеваний. Так, рекисное окисление липидов липопротеинов низкой плотности иводит к развитию атеросклероза (Панасенко О.М. и авт.,1993), а в головном мозге интерстициальный гемоглобин жет быть причиной энцефалического воспаления.

Для удаления свободного гемоглобина из кровяного русл служит белок - галтоглобин, образующий стабильный комплекс ним (Putnam F.W.,1975; Bowman В.Н. et al.,1988). Определена уровня гаптоглобина в плазме крови может иметь больше диагностическое значение, так как концентрация гаптоглобин снижается при гемолитических состояниях организма, пр заболеваниях печени и увеличивается при неопластически заболеваниях, воспалении (Pintera J.,1971; Shim В.S.,1973) Кроме того, связывание гемоглобина гаптоглобином, возможно предотвращает участие гемоглобина в свободно-радика.льнь: реакциях организма (Gutteridge J.M.С.,1987).

Цель п задачи исследования. Цель работы - изучит влияние гаптоглобина на способность нативного модифицированного окислителями гемоглобина участвовать свободно-радикальных процессах - разлагать перекись водород с образованием свободных радикалов и окислять липид: липопротеинов низкой плотности. Основные задач исследования:

1.Спектрофотометрическим, хроматографическим, хемилюмине центным методами охарактеризовать фракции плазмы кроЕ человека, определяющие Н2О2 - зависимую хемилюминесценцию связывающие свободный гемоглобин.

2. Изучить влияние перекиси водорода и гипохлорита н способность гемоглобина окислять липиды ЛНП и разлагат перекись водорода с образованием свободных радикалов.

3. Изучить влияние гаптоглобина на способность нативного модифицированного окислителями гемоглобина разлагать Н2О2 образованием свободных радикалов и стимулировать перекиснс окисление липидов ЛНП.

Научная новизна. Впервые для измерения гемоглобин связывающей способности плазмы, концентрацк

внеэритроцитарного гемоглобина в нативной плазме применил методы хемилюминесценции, гель-хроматографии, спектрс фотометрии. Было определено, что гемоглобинсвязывающе способность (НЬВС) равна 7 8-82 мг гемоглобина, концентрация гемоглобина 1,Ъ-1,6 мг на 100 мл нативне плазмы. Полученные величины согласуются с данныд. литературы.

Для исследования влияния гаптоглобина на свободнс радикальные реакции с участием гемоглобина были использоваь

роды, не применявшиеся ранее. Используя метод Н2О2-зисимой хемилюминесценции, исследовали влияние

тгоглобина на способность гемоглобина разлагать перекись порода с образованием свободных радикалов. Было выяснено, э гаптоглобин уменьшает количество радикалов, образующихся л разложении перекиси водорода гемоглобином. Методом элиза ТБК-реактивных продуктов было показано, что лтоглобин ингибирует на 94% перекисное окислении лопротеинов, стимулированное гемоглобином. При этом эбодно-радикальные реакции с участием гемоглобина птоглобин ингибирует эффективнее, чем сывороточный ьбумин.

Было обнаружено изменение под действием окислителей 7О2 и Н0С1) способности гемоглобина разлагать перекись порода радикальным путем и стимулировать перекисное деление липидов Л!Ш: окислительная модификация гемоглобина вводила к увеличению активности гемоглобина в реакции цикального разложения перекиси водорода и способности даглобина окислять липиды 'липопротеинов низкой плотности.

Практическая значимость работы. Методические подходы по мерению гемоглобинсвязывающей способности плазмы и нцентрации внеэритроцитарного гемоглобина могут быть именены в практической медицине, т.к. уровни гаптоглобина гемоглобина в плазме являются важными клиническими казателями.

Результаты работы по стимуляции гемоглобином ПОЛ попротеинов могут быть использованы в научных следованиях, посвященным проблемам патогенеза атеро-лероза. Выявлена ингибирующая способность гемоглобин-я^ынятптпртч2___6ртт]<-д ЛДПТ1П-П прбина на свободно-радикальные акции гемоглобина. Гаптоглобин может стать новым епаратом антиоксидантного действия г ...

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 чатные работы.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены обсуждены на Международной конференции по клинической милюминесценции (Берлин, апрель 1994 г.); на симпозиуме " ислительный стресс и повреждение тканей. Роль свободно-дикальных процессов в патологии легких" (НИИ Пульмонологии

МЗ и МП РФ, Москва, июнь 1994 г.); на заседаниях кафед биофизики РГМУ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введени обзора литературы (2 главы), методической част экспериментальной части с обсуждением результатов (3 главы заключения, выводов, списка использованной литератур включающего 99 источников. В диссертации содержится рисунков и 1 таблица.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзор литературы.

В обзоре литературы рассмотрены следующие вопросы:

1. Гемоглобин - катализатор свободно-радикальных реакций организме.

В главе анализируются данные о роли гемоглобина в свободн радикальных патологиях организма. Рассмотрены вопро стимуляции гемоглобином ПОЛ, образования высокореакционн соединений в результате взаимодейтвия гемоглобина перекисью водорода, органическими гидроперекисям гипохлоритом.

2. ГаптоглоОин.

Приводятся' данные по структуре и функции гаптоглобинов организме, формированию гаптоглобин-гемоглобиново

комплекса.

Материалы и методы исследования.

Плазму и гемоглобин получали из крови здоровых доноро Гемоглобин выделяли по Ап*;оп1п1 Е. а!.(1971

концентрацию измеряли спектрофотометрически, использ коэффициент молярной экстинкции Е4]_5= 125000 см~^ (на

гем). Гаптоглобин, смешанный тип, был предоставл кооперативом "Микрофлора" при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевског гемоглобинсвязывающая способность составила 0,2 гемоглобина на 1 мг белка. Липопротеины выделяли сыворотки крови методом препаративного ультр центрифугирования по Ыпс1дгеп Е. Т. (1975), концентраи определяли по содержанию в них белка, который измеря микробиуретовым методом.

]'ель-хроматографическое разделение плазмы проводилось хроматографичсской системе 1ЖВ (Швеция) на геле Сефарс

/CL. Фракции объемом 1 мл собирали с помощью коллектора акций для дальнейшего анализа. Измерения хемилюминесценции вводили на хемилюммнометре LKB-1251 (Швеция) при давлении в образцы люммнола и перекиси водорода. Измерения гической плотности проводили на спектрофотометре Beckman -7 (США) .

Продукты ПОЛ определяли по реакции с ТЕК (Каган и авт.,1986). Содержание ТБК-реактивных продуктов в образцах ражали через эквивалентное количество МДА - нмольМДА/мг лка ЛНП. Молярный коэффициент экстинкции комплекса МДА с К при 532 нм считали равным 1,56 х 10^ см~^.

Результаты и обсуждение.

ава X. Изучение гемоглобинсвязывающей способности плазмы ловека методами гель-хроматография, хемилюминесценции и ектрофотометрии.

работе A.B. Козлова и соавт.(1990) методом гель-оматографического разделения плазмы на геле Сефадекс G-150 ло показано, что за Н202-зависимую хемилюминесценцию азмы крови человека ответственен гемоглобин, связанный с лтоглобином. Но в работе не была точно определена пекулярная масса Нр-НЬ комплекса, так как он элюировался в ободном объеме колонки. Поэтому нами был использован для ль-хроматографического разделения плазмы гель Сефароза ■/CL, позволяющий более точно определить молекулярную массу лков, определяющих Н202~зависимую хемилюминесценцию плазмы >ови. Для этого было проведено гель-хроматографическое зделение плазмы на геле Сефароза 4B/CL. В каждой фракции ша измерена оптическая плотность при 280 нм и тенсивность XJ1 после добавления Н2О2.

>ивая 1 на рис.1 показывает зависимость А28О от обьема ;юции. Принимая во внимание данные калибровки колонки, мы гределили, что во фракциях 58-68 (высокомолекулярные ¡акции, ВМФ) - первый максимум на кривой, элюируются белки молекулярной массой от 600 до 4 00 кДа, а во фракциях 10-8 9 [изкомолекулярные фракции, НМФ) - второй максимум на >ивой, элюируются белки с молекулярной массой от 380 до 30 (а. Спектрсфотометрические данные были сопоставлены с 1нными хемилюминесценции. Кривая 2 (рис.1) представляет

зависимость интенсивности ХЛ (при добавлении к 0,5 мл каждс фракции 0,028 мМ люминола и 1 мМ перекиси водорода) с обьема элюции.

«

Ю 0.

и

о „ О 0. V

Я л в 0 с о

.75 .5 0 .26 .00 75 50 25

О.ОО

ВМФ

ПМФ

рис.1

40 45 50 55 вО 65 70 75 80 85 90 95 100 Объем элюции,мл

Профили элюции плазмы крови после гель-хроматсарафии на геле Сефароза 4В/а

1- Оптическая плотность при 280 нм 2~ Интенсивность ХЛ, отн, ед. Элю&нт 20 мМ фосфатный буфер, рН 7,4

Наибольшая интенсивность хемилюминесценции наблюдается г фракциях, соответствующих элюции белков с молекулярнс массой от 4 00 до 600 кДа. Максимум ХЛ соответствует < фракции, в которой элюируются белки с молекулярной массс 450 кДа. Интенсивность ХЛ белков с молекулярной массой 3( 380 кДа низкая. Было проведено гель-хроматографическс разделение раствора гемоглобина и показано, что свободш гемоглобин (Мг=64,5 кДа) без плазмы элюируется низкомолекулярных фракциях с максимумом элюции в 84 фракции Таким образом, Н202~зависимая ХЛ высокомалекулярш фракций плазмы определяется белками, имеющими молекулярн; массу 4 50 кДа.

1тывая результаты работы Козлова А. и соавт.(1990), мы гдположили, что в высокомолекулярных фракциях может жироваться гемоглобин, связанный с высокомолекулярным 1ком плазмы - гаптоглобином. Для того, чтобы проверить это ;длоложение, добавляли к 0,25 мл плазмы возрастающие щентрации гемоглобина (3-60 мкМ) и затем проводили зматографическое разделение смеси на колонке с гелем Е>ароза 4В/СЬ. В каждой фракции измеряли оптическую этность при 414 нм, по которой принято судить о количестве 4сглобина. Были построены зависимости максимальной рической плотности при 414 нм в ВМФ и НМФ плазмы от -щентрации добавленного к плазме гемоглобина (рис 2) .

0.00

0.20

0.15

о.т

а.

с

0.05

N ы

0.00 О

о ю го зо 40 50 ео 70

Концентрация гемоглобина,(в мкМ тема)

рис.*

Зависимость оптической плотности при 414 нм в высокомолекулярных и низкомолекулярных фракциях плазмы от концентрации добавленного НЬ

1 - франции элюции связанного НЬ (ВМФ)

2 - фракции элюции свободного НЬ (НМФ)

блюдается рост оптической плотности в полосе Соре в сокомолекулярных фракциях плазмы (ВМФ) (кривая 1) с еличением концентрации добавленного гемоглобина. Рост тической плотности в высокомолекулярных фракциях почти нейный при концентрации добавленного гемоглобина до 10 мкм кривая 1 выходит на плато при концентрациях гемоглобина лыие 22,5 мкМ. С другой стороны, в диапазоне концентраций моглобина 3-10 мкМ, оптическая плотность во фракциях,

соответствующих элюции свободного гемоглобина, низкая. Эт можно объяснить тем, что весь добавленный к плазь гемоглобин связывается высокомолекулярным белком плазмы гаптоглобином. При добавлении к плазме больших концентрат^ гемоглобина, наблюдается рост кривой 2, а кривая 1 выхолена плато. При сравнении кривых 1 и 2 из рис. 2 можно видеть что гемоглобин добавленный к плазме крови, связываетс белками высокомолекулярных фракций и только после насыщена их гемоглобином, последний появляется в плазме в несвязаннс форме в низкомолекулярных фракциях (НМФ).

Таким образом, гемоглобин, добавленный в плазму связывается высокомолекулярными белками плазмы и элюируетс в составе высокомолекулярного белкового комплекса (вероятнс Нр-НЬ). Нр-НЬ комплекс определяет Н202~зависимУю * высокомолекулярных фракций плазмы и имеет молекулярную масс -450 кДа.

Основываясь на концентрационной зависимости, мы рассчита! гемоглобин-связываюшую способность плазмы. Для этого бш произведены следующие расчеты.

а) Были выбраны пять концентраций (с, мкМ) добавленного плазме гемоглобина (15 мкМ; 22,5 мкМ; 30 мкМ; 45 мкМ; 60 мр - конечные концентрации гемоглобина в пробе), при которь некоторое количество его остается несвязанным и элюируется НМФ.

б) Была рассчитана концентрация гемоглобина, который осталс несвязанным (I:, мкМ) . Чтобы рассчитать эту величину, быт проведено гель-хроматографическое разделение раствор гемоглобина известной концентрации ([НЬС]) и измерен максимальная оптическая плотность при 414 нм во фракция элюции гемоглобина (Ань)• Затем был рассчитан форм-фактс ( [НЬС]/Аль) . Было проведено три гель-хроматографическу разделения гемоглобина и выбрана средняя величина [НЬс]/Ань Также была измерена максимальная оптическая плотность пр 414 нм в НМФ плазмы (Апл) при добавлении к ней выбраннь концентраций гемоглобина. Концентрации несвязанно! гемоглобина из пробы (плазма плюс гемоглобин) быт рассчитаны согласно формуле: f = ( [НЬс]/Ань )х АПл-

в) Концентрации связанного гемоглобина (г, мкМ) бых рассчитаны как разница между концентрациями добавленног

логлобина (с, мкМ) и концентрациями несвязанного логлобина (f, мкМ).

лользуя " метод линейной регрессии, была построена зисимость насыщения гаптоглобина гемоглобином в двойных эатных координатах. На рис. 3 представлена зависимость 1/г 1/с. Уравнение прямой имеет вид : У = 0,405 х X + 0,041.

1/с

рис.3

Зависимость 1/г параметра от 1/с параметра

г - концентрация связанного НЬ в образце (в мкМ гема) с- концентрация НЬ, добавленного в образец (в мкМ гема)

уравнению линейной регрессии можно определить ксимальную концентрацию гемоглобина, которая может быть язана плазмой. При добавлении к плазме бесконечно больших нцентраций гемоглобина величина (1/с) -> 0. Подставив есто X в уравнение 0, определяем, что 1/г = 0,041 мкМ~1 и г = 24 мкМ. Учитывая фактор разбавления, эта величина ставит 48 мкМ (по гему) или 780 мг гемоглобина моглобин-связывающая способность на 1 литр плазмы.

Таким образом, учитывая результаты 3-х экспериментов, моглобинсвязывающая способность плазмы (НЬВС) равна 78-82 гемоглобина на 100 мл плазмы. Полученная величина ответствует литературным данным (Shim B.-S. et al.,984), гласно которым в норме НЬВС составляет 60-250 мг моглобина на 100 мл плазмы.

Для изучения гемоглобинсвязьшающей способности плаз был также применен метод хемилюминесценции. Измерялась Н2О зависимая хемилюминесценция фракций плазмы при добавлении ней различных концентраций гемоглобина. Сходные результа были получены при использовании спектрофотометрическо анализа. На рис.4 представлена зависимость максимальн интенсивности Н2О2-зависимой хемилюминесценции

высокомолекулярых и низкомолекулярных фракциях плазмы концентрации добавленного к плазме гемоглобина.

Концентрация гемоглобина,(в мкМ гема)

рис.4

Зависимость максимальной интенсивности ХЛ а высокомолекулярных и низкомолекулярных фракциях плазмы от концентрации добавленного НЬ

1 - фракции эпюции связанного НЬ (ВМФ)

2 - фракции эпюции свободного НЬ (НМФ)

Видно, что при добавлении к плазме гемоглобина концентрациях 3-4 5 мкМ, возрастает интенсивность ХЛ высокомолекулярных фракциях. Однако, во фракциях элюц свободного гемоглобина (НМФ) не наблюдается рос интенсивности ХЛ при низких концентрациях добавленно гемоглобина (3-15 мкМ) . Но ХЛ в НМФ линейно возрастает п добавлении к плазме концентраций гемоглобина 'больше 15 мк Кривые из рис. 2 и 4 , полученные при применен спектрофотометрического и хемилюминесцентного анализ похожи, но не идентичны. Одно из возможных объяснений это

южет быть различие каталитической активности свободного и гвязанного гемоглобина. Хемилюминесцентный анализ был фименен для расчета концентрации внеэритроцитарного гемоглобина в плазме. Для этого были выбраны пять ;онцентраций добавленного к плазме гемоглобина (3 мкМ; 5 «сМ; 7 мкМ; 8,5 мкМ; 10 мкМ), при которых весь добавленный к глазмс гемоглобин связывался гаптоглобином. Об этом :видетельствуют низкие значения ХЛ во фракциях элюции :вободного гемоглобина. Была построена зависимость максимальной интенсивности ХЛ во фракциях элюции Нр-НЬ сомплекса (ВМФ) от концентрации добавленного гемоглобина. Зависимость представлена на рис. 5 и имеет линейный сарактер. Уравнение прямой имеет вид: У = 10,5 х X + 5,2.

Концентрация добавленного lib, (в мкМ гема)

рис.5

Зависимость максимальной интенсивности ХЛ во фракциях элюции Нр-НЬ комплекса ( ВМФ) от концентрации добавленного к плазме НЬ

Сонцентрации добавленного гемоглобина равной 0 мкМ :оответствует интенсивность ХЛ высокомолекулярных фракций штивной плазмы. Вероятно, эту хемилюминесценцию определяет гемоглобин, связанный с гаптоглобином плазмы. Концентрацию гемоглобина в Нр-НЬ комплексе (С о) нативной плазмы можно рассчитать по уравнению для прямой из рис. 5 при Y=0 Со = ),98 мкМ (по гему), учитывая фактор разбавления.

Итак, концентрация внеэритроцитарного гемоглобина в нативной ллазме равна 0,9-1,0 мкМ (по тему) на 1 литр или 1,5-1,6 мг на 100 мл плазмы. Зная гемоглобинсвязывающую способность плазмы и количество гемоглобина в плазме можно оценить насыщенность гаптоглобина плазмы гемоглобином: Gq/НЬВС - 1,9-2%. Эта величина согласуется с литературными данными (Shim B.-S. et al., 1984).

Глава II Изучение каталитических свойств Нр-НЬ комплекса в реакции с перекисью водорода методом хемилюминесценции.

Изучали влияние гаптоглобина на Н2О2- зависимук хемилюминесценцию нативного гемоглобина. Для этого измеряла Н2О2- зависимую хемилюминесценцию нативного гемоглобина (h мкМ в пробе) и хемилюминесценцию гемоглобина при добавление к нему гаптоглобина. Можно предположить, что количество радикалов, образующихся при взаимодействии гемоглобина с перекисью водорода, пропорционально светосумме XJI за полное время кинетики. Поэтому была измерена светосумма XJI за ЗС минут. Зависимость величины светосуммы хемшноминесценциь гемоглобина от концентрации гаптоглобина приведена на рис. 6.

Кривая 1 представляет процесс тушения XJI нативногс гемоглобина гаптоглобином. Видно, что при добавление гаптоглобина уменьшается светосумма XJI гемоглобина и, вероятно, уменьшается количество радикалов, образующихся i системе. Возможно, гаптоглобин образуя с гемоглобином комплекс, удаляет часть каталитически активного гемоглобина из реакции. Однако тушение хемилюминесценции может быть обусловлено также конкуренцией белков с люминолом з; радикалы. Таким образом, тушение гаптоглобином Н2О2" зависимой хемилюминесценции гемоглобина можно объяснить конкуренцией между гаптоглобином и люминолом за радикалы, образующиеся в реакции НЬ с Н2О2. Чтобы проверить этс предположение, в изучаемую систему вместо гаптоглобина мь добавляли сывороточный альбумин (концентрация по белку былг равна концентрации гаптоглобина). Кривая 2 на рис.( представляет процесс тушения XJ1 нативного гемоглобина альбумином. Видно, что при добавлении альбумина i гемоглобину также уменьшается светосумма XJ1 гемоглобина. Известно, что альбумин является ингибитором свободно-

О 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

Концентрация белка, мг/мл

рис.6

Тушение зависимой ХЛ нашивного НЬ (0,5 цМ)

гаптоглобином и альбумином

1 - НЬ + Нр

2 - НЬ + Альбумин

При измерении ХЛ в образец добавляли

0.7 мМ Нг02 и 0,028 мМ люминола

¡дикальных реакций, прежде всего за счет перехвата щроксильных радикалов (НаШмеИ В. , 1988) и, возможно, ¡язывания ионов железа (Kozlov А. et а1., 1991). хнако, гаптоглобин эффективнее альбумина в ингибировании ;акции гемоглобина с Н2О2. Вероятно, ингибирующее влияние штоглобина имеет специфический характер, обусловленный Зразованием Нр-НЬ комплекса.

Представляло интерес сравнить влияние Н2О2 и Н0С1 на юсобность гемоглобина разлагать перекись водорода с Зразованием свободных радикалов. Гемоглобин (8 мкМ) нсубировали с различными концентрациями Н0С1 (0,02 мМ - 1,3 1) или Н2О2 (0,02 мМ - 3,2 мМ) в течение 2-х часов при )мнатной температуре, а затем измеряли кинетику ХЛ при >бавлении люминола (0,028 мМ) и перекиси водорода (0,2 мМ) . >ичем, в случае прсинкубации гемоглобина с гипохлоритом, т добавлении в образец люминола не наблюдалось вспышки ХЛ, 'о свидетельствовало о расходовании гипохлорита в 1кубационной системе. Можно оценить количество радикалов,

образующихся в хемилюминесцентной системе, при взаимодейсвии продуктов окислительной модификации гемоглобина с перекисью водорода. Для этого была измерена светосумма ХЛ за полное время кинетики. Полученные данные представлены на рис. 7.

о *

И

<и

К Е-1

О

Р? X

ПЗ

Я >>

О О

н 0) я о

6000 Г-

5000

'»ООО

зооо

2000

юоо

Рис.7

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 Концентрация окислителей,мМ

Влияние окислителей на способность НЬ разлагать Н^О, с образованием радикалов

1 - НЬ (8 \хМ) инкубировали с НОС/

2 - НЬ (8 \хМ) инкубировали с Н2Ог

При измерении ХЛ в образец добавляли 0.2 мм НгО, и о.огв мМлюминопа

На кривой 1 отложены значения светосуммы ХЛ гемоглобина, модифицированного различными концентрациями гипохлорита. Не кривой 2 представлены аналогичные данные для перекист* водорода. Можно видеть, что повышение концентрации гипохлорита в инкубационной среде до 0, 64 мМ (в 8 0 ра; больше молярной концентрации гемоглобина) приводит ъ увеличению количества свободных радикалов, образующихся прг-взаимодейсвии продуктов окислительной модификации гемоглобина с перекисью водорода. Но дальнейшее увеличение концентрации гипохлорита в инкубационной среде (1,3 мМ) приводит к уменьшению светосуммы ХЛ модифицированногс гемоглобина. Вероятно, этот эффект связан со значительные модификационным повреждением гемопротеина.

эи преинкубации гемоглобина с перекисью водорода, зетосумма ХЛ модифицированного гемоглобина увеличивается до лределенной концентрации окислителя (0,4 мМ) , затем кривая выходит на плато, а при концентрации 3,2 мМ наблюдается >деньшение светосуммьг ХЛ.

Итак, из представленных данных видно, что преинкубация эмоглобина с окислителями (Н 2 О 2 или Н0С1) приводит к зеличешда каталитической активности НЬ в реакции с Н2О2. эи этом в результате окислительной модификации гемоглобина лпохлоритом образуются более реакционноспособные оединения, чем в случае модификации гемопротеина перекисью одорода. Другими словами, преинкубация гемоглобина с эрекисью водорода не приводит к такому уровню окислительной одификации гемопротеина, как это 'происходит в случае с лпохлоритом.

На следующем этапе работы изучали влияние гаптоглобина и льбумина на Н202~зависимую хемилюминесценцию гемоглобина, эдифицированного Н2О2 и Н0С1.

Концентрация белка, мг/мл

рис.8

Тушение гаптогпобином и альбумином Н20 - зависимой ХЛ НЬ, модифицированного НОС!

НЬ ( 0,5 инкубировали с НОСI (11 цЛ/ ; затем добавляли Нр(1) ипч альбумин (2)

При измерении ХУ7 в образец добавляли О, 7 мМ НгО, и 0,02В мм люминопа

Первоначально, гемоглобин (0,5 мкМ в пробе) инкубировали < НОС1 (11 мкМ в пробе) в течении 50 минут при комнатно1 температуре. Затем была измерена светосумма ХЛ за 30 мину контроля (гемоглобин + гипохлорит) и образцов - к контрол! добавляли гаптоглобин или альбумин. Полученные данньк представлены на рис. 8.

Кривая 1 - представляет процесс тушения ХЛ модифицированное гемоглобина гаптоглобином.

Кривая 2 - представляет процесс тушения ХЛ альбумином. Видно, что гаптоглобин эффективно ингибирует свободно радикальное разложение перекиси водорода модифицировании гемоглобином. Причем, разница между влиянием гаптоглобина ] альбумина в случае модифицированного гемоглобина больше, че] при тушении белками ХЛ нативного гемоглобина (рис. б) .

Интересно было изучить тушение гаптоглобином альбумином ХЛ гемоглобина, преинкубированного с перекись: водорода

Гемоглобин (0,5 мкМ в пробе) инкубировали с перекись: водорода (200 мкМ в пробе) 50 минут при комнатно температуре. Затем изучали влияние гаптоглобина и альбумин на Н202~зависимую ХЛ гемоглобина, модифицированног перекисью водорода. Для этого были сделаны измерени аналогичные вышеприведенным при модификации гемоглобин гипохлоритом. Рассмотрим кривые на рис. 9.

Кривая 1 - тушение ХЛ модифицированного гемоглобин гаптоглобином. Кривая 2 - тушение ХЛ модифицированног гемоглобина альбумином. Данные, представленные на это рисунке, как и в случае модификации гемоглобина гипохлорито свидетельствует о том, что тушение ХЛ модифицированног гемоглобина происходит не только за счет перехвата радикало белком, но также, возможно, за счет связывания поврежденног гемоглобина гаптоглобином.

Концентрация белка, мг/мл

рис.9

Тушение гаптоглабином и альбумином

Н30.г- зависимой ХЛ НЬ, модифицированного НгО2.

НЬ (0,5 \íM) инкубировали с Н,0, ( 200 ц/И ) затем добавляли Нр (1) или альбумин (2)

При измерении ХЛ в образец добавляли 0,7 мМ Н,0, и 0,028 мМ люминопа

Таким образом, гаптоглобин одинаково эффективно нгибирует Н2О2-зависимую ХЛ как нативного гемоглобина, так гемоглобина, проинкубированного с избытком окислителей, ричем в этих реакциях гемоглобина гаптоглобин эффективнее льбумина более чем на 30 %, что позволяет сделать вывод о пецифичности влияния гаптоглобина на свободно-радикальные эакции гемоглобина.

лава III Влияние перекиси водорода и гипохлорита на пособность гемоглобина стимулировать перекисное окисление ипидов лилопротекнов низкой плотности.

Первоначально, мы хотели выяснить как изменяется рооксидантная активность гемоглобина, лреинкубированного с кислителями, в отношении лилидов ЛНП.

емоглобин инкубировали 0,5 часа при 37°С с буфером или кислителями (Н2О2 или НОС1), затем добавляли ЛНП и после 1 аса инкубации при 37°С измеряли содержание ТВК-реактивиых родуктов. Также проводили контроль окисляемости ЛНП за

время инкубации (1ч) и при проведении ТБК-теста. Данньг эксперимента приведены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние Н,Ог и НОС1 на способность гемоглобина стимулировать ПО липидов ЛНП

(Рштты имолъ МП У! И1 6иЬ Л№(

ПНП + буфер 0,8 ± 0,1

НЬ + ЛНП 6 ± 0,2

{НЬ + НОСЦ200[М )} + ЛНП 12,9 ± 0,13

{нь + на(Я)ОцМ); + ЛНП 12,2 ± 0,2

Концентрация НЬ во всех образцах была 20 шМ (по гему) концентрвция ЛНП 0,4 мг белка/мл

Можно видеть, что нативный гемоглобин стимулирует перекиснс окисление липидов ЛНП. В то же время, преинкубаци гемоглобина с Н2О2 или Н0С1 приводит к увеличению в 2 раз содержания ТБК-реактивных продуктов (МДА) в липопротеина низкой плотности. Причем, при одинаковых концентрация перекиси водорода и гипохлорита образуются приблизительн равные количества ТБКРП.

Представляло интерес изучить зависимость накоплена ТБКРП в ЛНП от концентрации окислителей при инкубащ/ последних с гемоглобином. Для этого гемоглобин инкубирoвaJ с различными концентрациями перекиси водорода ш гипохлорита. Затем проводили окисление липопротеинов низке плотности нативным и модифицированным гемоглобином измеряли накопление ТБК-реактивных продуктов. На рис.] представлены зависимости накопления МДА от концентрации Н2С и Н0С1 при инкубации последних с гемоглобином. Можно видеть что повышение концентрации перекиси водорода приводит повышению содержания ТБК-реактивных продуктов во все диапазоне исследуемых концентраций. Однако в случае НОС] увеличение концентраций ТБКРП наблюдается только в диапазо!

■0,2 мМ, дальнейшее повышение концентрации гипохлорита вводит к снижению концентрации МДА в пробе.

Концентрация Н,0,, мМ Концентрация ЮС1,мМ рис. 10

Накопление ТБК-рвактивных продуктов при окислении ЛНП гемоглобином, преинкубированным с окислителями

НЬ(20уМ ) инкубировали с Н202 (1) или НОСI (2) затем окисляли ЛНП (0,4мгбелка/мл)

5Лученные результаты можно обьяснить таким образом, что заимодействие гемоглобина с Н2О2 и/или Н0С1 приводит к Зразованию высокореакционных интермедиатов, возможно, фрил- или перферрил-НЬ и в дальнейшем к появлению юбодного железа (Наге1 Б. et а!., 1988; ОгиИ^г С. et ..,1990), причем все эти продукты являются эффективными эооксидантами. Снижение концентрации ТБКРП при повышении жцентрации гипохлорита выше 0,2 мМ, вероятно, связано с ;м, что Н0С1 может сильнее окислять гемоглобин до зодуктов, обладающих меньшим прооксидантным действием в ^ношении липидов ЛНП.

Представляло интерес изучить влияние гемоглобин-зязывающего белка гаптоглобина на способность гемоглобина ¡дуцировать реакции ПОЛ в ЛНП. Для этого в инкубационную зеду, содержащую нативный или модифицированный гипохлоритом ;моглобин добавляли гаптоглобин (0,4; 0,7 мг/мл). В

качестве контроля на неспецифическое ингибирование ПОЛ бы. использован сывороточный альбумин в той же концентраци! (0,4; 0,7 мг/мл), что и гаптоглобин. Затем проводил] окисление ЛНП. Результаты этого эксперимента представлены н. рис.11.

рис.11

Влияние гзптоглобина и альбумина на накопление ТБК- реактивных продуктов в ЛНП при их окислении нашивным и модифицированным НЬ

К НЬ (10 цМ ) добавляли гаптоглобин (1) или альбумин (2)

и окисляли ЛНП (0,4 мг белка/мл)

Контроль содержал натианый НЬиЛНП

3- НЬ (10цм; инкубировали с HOCI ( 200 цЩ

затем добавляли гаптоглобин и окисляли ЛНП

Контроль содержал модифицированный НЬ и ЛНП

Концентрация белка Ц 0,4 мг/мл Г] 0,7 иг/мп

Можно видеть, что гаптоглобин эффективно ингибируе окисление ЛНП, стимулированное нативным гемоглобином. В т же время альбумин оказался гораздо менее эффективным, че гаптоглобин. Ингибирукяций эффект альбумина на ПОЛ ЛНП може объясняться лишь неспедифическим связыванием ионов железа которые высвобождаются из гемоглобина в ходе процесса ПО (Gutteridge J.M.C.,1987; Kozlov A. et al.,1991). Кроме того, из рис.11 можно видеть, что гаптоглоби одинаково эффективно ингибирует ПОЛ ЛНП, стимулируемое ка нативным НЬ, так и НЬ, модифицированным гипохлоритом.

Таким образом, можно сказать следующее. Взаимодействи гемоглобина с гипохлоритом и перекисью водорода приводит увеличению способности гемоглобина окислять липиды ЛНП

пьным ингибирующим эффектом на ПОЛ, стимулируемое моглобином, обладает галтоглобин. Причем его действие фективно, как в случае нативного, так и модифицированного похлоритом гемоглобина.

ВЫВОДЫ.

Показано, что Н202~Эависимук> хемилюминесценцию высокомолекулярных акций плазмы определяю® белки, образующие комплекс (Молекулярная зса~450 кДА.) с гемоглобином.

Методами гель-хроматографии на Сефарозе 4B/CL, спектрофотометрам па измерена гемоглобинсвязывающая способность плазмы (НЪВС). Она зтавила 78 - 82 мг гемоглобина на 100 мл плазмы. По результатам иерений Н202-Зависимой хемилюминесценции плазмы крови человека была енена концентрация внеэритроцитарного гемоглобина в плазме. Она

ставила - 1,5-1,6 мг на 100 мл. На основе этих данных насыщенность

1

тгоглобина плазмы внеэритроцитарным гемоглобином оказалась равной 9-2%.

Было показано, что количество свободных радикалов, образующихся в акции HgOg и гемоглобина, увеличивается после преинкубации следнего с перекисью водорода или гипохлоритом. Причем эффект аохлорига оказался в 10 раз больше.

Выло показано, что способность гемоглобина стимулировать перекисное исление липидов ЛНП увеличивается более чем в 2 раза после его еинкубации с перекисью водорода или гипохлоритом.

Показано, что гаптоглобин эффективно ингибирует свободно-дикальные реакции (ПОЛ и разложение перекиси водорода), ициировакные как нативным, так и модифицированным окислителями Ж5 глобином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. E.V. Brukhanova, A.N. Osipov, Yu.A. Vladimirov.

udy of Hemoglobin-Binding Property of Human Plasma// Physical emical Biology & Medicine, 1993, V.l, № 2, P.115-121.

2. Osipov A.N., Brukhanova E.V., Vladimirov Yu.A. Investigation catalytic properties of haemoglobin-haptoglobin complex by means of

emiluminescence.// Abstarcts of International Conference on Clinical emilumenescence (Berlin, April,1994).