Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гаптоглобин сыворотки крови кур в онтогенезе: методы его выделения и очистки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гаптоглобин сыворотки крови кур в онтогенезе: методы его выделения и очистки"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ имени К.И.СКРЯБИНА

ГАПТОГЛОБИН СЫВОРОТКИ КРОВИ КУР В ОНТОГЕНЕЗЕ; МЕТОДЫ ЕГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ.

03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

СИЛЬВЕСТРОВА Ирина Генриховна

Москва 1997

Работа выполнена в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РСФСР,

доктор биологических наук, профессор Малахов А. Г.

Официальные оппоненты .-доктор биологических наук,

профессор Ермаков В.В.

кандидат биологических наук старший научный сотрудник Ярёменко И.И.

Ведущая организацияМосковский государственный ^

университет прикладной биотехнологии

Защита состоится " и «т ш ¿¿й 1997 г.в 7 часов на заседании диссертационного совета Д 120.36.05 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Московской государственной академии "ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина

(109472,Москва,ул.Академика Скрябина,23.Тел.377-93-83)

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке академии

Автореферат разослан " 1997 г.

Ученый секретарь ujj^^-O^V^

диссертационного совета Сафонов H.A.

Размнохено на ротапринта 1UU экз., зах. г. Типография "РОТЭДЗ", шяснищая, 35.

I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность гемы.Гаптоглобин (Hp) - or гликопротеид глобули-новой фракции белков сыворотки крови.Основная функция гаптоглобина в организме связана с его способностью образовывать с гемоглобином, высвобождающимся при разрушении эритроцитов, прочный комплекс. Образующийся Нр-НЬ комплекс уже не проникает через почечный фильтр,а удаляется иа плазмы в органы ретикулозндотелиальной системы, главным образом в печень,где претерпевает превращения в би-лирубиновом цикле (Nyman М.,1959; Akaiwa S.,1976,Javid J.,1978). Таким образом,образование гаптоглобин-гемоглобинового комплекса является необходимым этапом в процессе катаболизма гемоглобина,а также обеспечивает сохранение в организме железа (Успенская В.Д., 1970;Putnam F.W.,1984).Установлено,что концентрация гаптоглобина в сыворотке крови зависит от физиологического состояния организма и может значительно изменяться при различных патологиях.Поэтому его определение может иметь дифференциально-диагностическое, а также прогностическое значение.(Eaton J.W. е.a.,1982;Warkentin D.L.е.а. ,1987; Antila Н.е.а.,1990; Skinner J.6..Roberts L.,1994). Значительные успехи,достигнутые в области изучения данного белка, касаются в основном,гаптоглобина сыворотки крови человека.Имеющиеся в литературе данные о гемоглобинсвязывающем белке у животных весьма ограничены. Существовании Hp в сыворотке крови птиц в течении долгого времени отрицалось,а единичные сообщения зарубежных авторов носят фрагментарный характер ( Musquera S.e.a.,1977;1979; Delers F.,е.а. ,1984;1986).Информация о химическом составе белка практически полностью отсутствует.Физико-химические и биологические характеристики белка не определены.Остается совершенно неизученным вопрос о динамике содержания Hp в онтогенезе у птицы.

Разработка методов исследования и определение физиологических нормативов,а также изучение ряда физико-химических и биологических свойств гаптоглобина позволит расширить сферу применения этого биохимического показателя и открывает новые возможности для получения биологически активных препаратов и их применения в ветеринарии.

Цель и задачи исследований.Основной целью настоящей работы было углубленное исследование некоторых функциональных - и биохимических особенностей гаптоглобина из сыворотки крови кур.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1)Изучить возрастную динамику содержания гаптоглобина в сыворотке крови кур;

2)Разработать способ выделения и очистки и получить препарат гаптоглобина,свободный от белковых и низкомолекулярных примесей;

3)Определить химический состав белка,а также изучить некоторые его физико-химические и биологические свойства.

Научная новизна работы.Нами была установлена возрастная зависимость содержания гаптоглобина в сыворотке крови кур.

Впервые получен гомогенный препарат гаптоглобина из сыворотки крови кур.Внесены модификации в метод выделения гаптоглобина и определения его фенотипов.

Впервые изучены физико-химические и структурные характеристики исследуемого белка.Определены молекулярная масса и субъединичный состав, изоэлектрическая точка, максимум пероксидазной активности в зависимости от pri среды и температуры, термостабильность , аминокислотный и углеводный состав белка.Показано влияние различных факторов на образование и свойства гаптоглобин-гемогло-бинового комплекса.

.Теоретическое и практическое значение работы.Данные по количественному содержанию гаптоглобина в сыворотке крови кур могут быть использованы как нормативы в лабораторной практике.

На основе результатов исследования разработан модифицированный метод выделения и очистки гаптоглобина из сыворотки крови кур,который может быть использован для получения чистого препарата белка с целью изучения структуры,свойств и применения в качестве диагностического препарата в лабораторной практике.

Научные результаты внедрены на кафедре органической и биологической химии и используются при чтении лекций и проведении лабо-раторно-практических занятий по темам:"Структура и функция белков крови" и "Метаболизм гемоглобина".Результаты работы использованы в методических указаниях "Методы современной биохимии" - М. .-Моск. вет. акад. ,1987. и " Выделение и очистка гаптоглобина из сыворотки крови кур" - М.:Моск.вет.акад.,1990.

Подученные данные вносят существенный вклад в наши познания о структурных особенностях белка и расширяют наши представления о путях эволюционного преобразования молекулы гаптоглобина,а также открывают перспективу целенаправленного изучения гаптоглобинов сельскохозяйственных животных и птицы.

Апробация работы.Основные положения диссертационной работы докладывались на:Научных конференциях МВА,Москва,1987 - 1990 гг.; на заседании Московского отделения биохимического общества АН СССР,Москва,МВА,март,1988;на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа",Киев, сентябрь 1989 г.;на кафедральном и межкафедральном совещаниях сотрудников МВА.

Структура и объем диссертации.Работа состоит из введения,обзора литературы,собственных исследований,обсуждения результатов, выводов,сведений о практическом использовании результатов исследований, рекомендаций по использованию научных выводов,списка литературы, приложения.Диссертация содержит 157 страниц машинописного текста,включая 13 таблиц,24 рисунка и 3 фотографии.Список литературы состоит из 279 работ (71 отечественных и 208 зарубежных авторов).

Публикации работы.По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных работ,в которых отражены ее основные положения.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования проводились на базе кафедры органической и биологической химии Московской ветеринарной академии им.К.И.Скрябина и ГППЗ "Горки-2" Московской области.

Материалом для исследований служила сыворотка крови кур породы белый леггорн кросса "Беларусь-Э" в возрасте от 1 до 540 дней.Для исследований отбирали клинически здоровых птиц в количестве 15 голов каждой возрастной группы.Кровь у цыплят до месячного возраста брали из яремной вены при декалитации,а у птицу более старших возрастных групп - из подкрыльцовой вены.Для получения сыворотки кровь инкубировали при t 37°С в течение 1-2 часов и отделяли от форменных элементов центрифугированием в день взятия крови при 3000 об/мин - 20 минут.В работе использовали только свежеприготовленную сыворотку без следов гемолиза.Для получения препарата гаптоглобина использовали кровь от кур 8-10 месячного возраста, убой производили в условиях птицефабрики.

2.1.1.Определение концентрации и фенотипов гаптоглобина в сыворотке крови кур.

Количественное определение гаптоглобина проводили перокси-

дазным методом ( Connell,Smith,1959; Owen е.a.,1960),используя в качестве субстрата 0,03 М раствор гваякола в 0,2 М ацетатном буфере, рН=4,0;в качестве окислителя - 0,04 н раствор Н2О2- Препарат гемоглобина получали из свежей крови по методу Drabkin (1949),используя в качестве антикоагулянта 3,8 2-ный раствор цитрата натрия. Концентрацию гемоглобина определяли гемоглобинцианидным методом при Х=540 нм.Для определении пероксидазной активности образовавшегося Нр-НЬ комплекса готовили 0,05 ± 0,004 мМ раствор метге-моглобина по методу Owen е.а. (1960).

Концентрацию гаптоглобина рассчитывали по калибровочному графику, построенному на основании средней гемоглобинсвязывавдей активности сыворотки.(Owen е.а.,1960).

Фенотипы гаптоглобина определяли методом диск-электрофоре за в вертикальном блоке 4,75 %-ном полиакриламидном геле по Linke R. (1984) в нашей модификации.Гемоглобинсвязыващую фракцию идентифицировали раствором бензидина солянокислого.

2.1.2.Методы выделения и очистки гаптоглобина.

Выделение гаптоглобина из сыворотки крови кур проводили по методу H.Hamaguchi (1969) в нашей модификации.Исходный материал, сыворотку крови без следов гемолиза,подвергали фракционному высаливанию сульфатом аммония (40-61% насыщения).Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 минут.Фракции белков, полученные осаждением при 551 и 61 X насыщении (NH4)2S04,растворяли в минимальном объёме 0,02 М фосфатного буфера рН=?,2 и подвергали диализу против того же буфера,взятого в 20-ти кратном объёме в течение 48 часов.Диализат концентрировали при помощи полиэти-ленгликоля и наносили на хроматографическую колонку,заполненную ионообменным сефадексом DEAE-A-50 (20x300 мм).Элюирование белка с колонки проводили в ступенчатом градиенте концентрации фосфатного буфера (0,02 М;0,08 М;0,11 М;0,2М) рН=7,2.0тбор фракций по 10 мл производили автоматическим круговым коллектором,постоянную скорость элюирования, 25-30 мл/смг-час,поддерживали при помощи перистальтического насоса.Во всех фракциях определяли гемоглобинсвя-зываюшую способность.Фракции белкового пика.элюированного 0,11 М фосфатным буфером,объединяли и после концентрирования использовали в дальнейшей работе.Окончательную очистку белка проводили гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-150 (50x1000 мм).Белок элю-ировали 0,11 М фосфатным буфером рН=7,2 со скоростью 1 мл/см2-час.

Фракции второго пика,обладавшие гемоглобиновязыващей способностью, объединяли и диализовали против дистиллированной воды 48 часов.

Все операции по выделению и очистке белка проводили при 4°С.

Концентрацию бедка на всех стадиях выделения и очистки определяли спектрофотометрическим методом поглощению при Х=280 нм и Х=260 нм (Дарбе,1989);в препаратах белка - красителем Coomassie 8BG-250 по методу Bradford М.М.(1976).

Гомогенность полученного препарата проверяли методом электрофореза в 7,5 г-ном полиакриламидном геле (Davis В.J.,1964).

2.1.3.Методы исследования гаптоглобина

Молекулярную массу гаптоглобина определяли гель-фильтрацией на сефадексе G-200 на колонке размером 20x500 мм (Остерман.,1985; Dugglely R.,1994) и методом диск-электрофореза в 12 Ж-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по Laemmli U.K.(1970).

Разделение на а- и ß-полипептидные цепи молекулы гаптоглобина проводили по Shim В. S.е.а. (1971).

Иаоэлектрическую точку белка определяли методом изоэлектро-фокусирования в, ПААГе по Delincee H..Radola В.J.(1978).Righetti P.G..Gianajza E. (1980).

N-концевую аминокислоту определяли методом дансилирования (Девени Т.,Герцей Я.,1976;Дарбре А.,1989).

Наличие углеводов в очищенных препаратах белка определяли окрашиванием реактивом Шиффа в пластине геля по,методу Zacharius R.M.e.a.(1969).

Анализ углеводного состава гаптоглобина был проведен с использованием газо-жидкостного хроматографа 5701 A ("Hewlett-Packard", USA) метилгликозид-триметилсилидьным методом (Zanetta J.R., е.а.,1972).

Аминокислотный состав' белка определяли на аминокислотном анализаторе ААА-881 ("Microtechna",Чехия).Образцы белка гидроли-зовали в вакууме 6 N HCl в течение 24 часов при 110°С.Аминокислоты разделялись на колонках Ostion LGKS 0803 (0,8x62 см) и Ostion LGKS 0802 (0,7x6 см) в цитратном буфере и обнаруживались с помощью нингидринового реагента.Интенсивность окраски определяли колориметрически при Л=370.Стандартом для расчетов служила стандартная смесь аминокислот (до 100 нМ). • -

Определение влияния температуры,pH и химического состава

б.

среды на пероксидазную активность гаптоглобин-гемоглобинового комплекса проводили:!)используя растворы гваякола с рН=2 - 8 при температуре 37°С;2)путем инкубации белков при оптимальном значении рН при Ь = 37° * 55°С в течение 30,60,90,120 минут;3)добавле-нием в инкубационную смесь 505,№2504, (ШОгЗО,!, N338407, мочевины и тритона Х-100.Активность нативного комплекса принимали за 100 % Зависимость образования Нр-НЬ комплекса от рН и состава среды определяли методом гель-фильтрации.Из лиофилизированного препарата гаптоглобина готовили 0,5%-ные растворы на буфере ТРИС-НС1 (0,05 М ; рН=6 * 8) и в 0,05 М ацетатном буфере (рН = 2,0 * 6,0); препарат гаптоглобина инкубировали в течение часа при комнатной температуре в присутствии испытуемого реагента. Затем в инкубационную смесь вносили 0,05 мМ раствор Ме1НЬ и оставляли на 30 минут при 37°С. Подготовленную реакционную смесь наносили на колонку с сефадексом 6-200.Белок злюировали 2%-ным раствором ЫзС1.Фракции анализировали на присутствие гемсодержащих компонентов , измеряя поглощение при А=415 нм.Идентификация Нр-НЬ комплекса проводилась методом электрофореза в ПААГе.а также путем сравнения пероксидаз-ной активности.

Все полученные данные обработаны с использованием метода вариационной статистики (ЛакинДЭЭО).

2.2.Результаты собственных исследований 2.2.1.Содержание гаптоглобина в онтогенезе Гаптоглобин относится к наименее изученным белкам сыворотки крови.Для определения функций и особенностей метаболизма белка в организме,большое значение имеют его количественные и качественные изменения в онтогенезе.Эти данные необходимы как с общебиологической и теоретической точки зрения., так и важны для практического использования.

Наш впервые изучена динамика содержания гаптоглобина у кур в разные возрастные периоды.Анализ содержания гаптоглобина проводили с учетом физиологических и возрастных особенностей организма птицы.Результаты исследований представлены в таблице 1,иэ которой видно,что наиболее выраженные изменения концентрации гемоглобин-связывающего белка отмечались у птицы в возрасте 10,150 и 240 дней,то есть в периоды роста,начала яйцекладки и интенсивной яйцекладки. Установленная низкая концентрация гаптоглобина в течение первых десяти дней жизни цыплят,по нашему мнению,может быть связана с процессами адаптации к посгзмриональной жизни,в течение

которых продолжается дифференцировка тканей,развитие функциональной деятельности паренхиматозных органов.Отмеченные высокие концентрации гаптоглобина в период интенсивной продуктивности,возможно, связаны с активной деятельностью желез внутренней секреции.

Таблица 1.

Содержание гаптоглобина в сыворотке крови кур в онтогенезе

1 1 | Возраст,| 1 ДНИ | 1 1 Hp,г/л М ± т I Нр,относит.% от| общего белка | 1 Общий белок,г/л | М ± m |

1 1 1 1 1 0,33 + 0,01 1,28 | 25,70 + 2,01 |

1 ю | 0,26 ± 0,013* 0,8* | 33,70 + 1,15* |

1 30 1 0,467 0,011* 1,26* | 37,20 + 0,8* |

1 60 | 0,559 + 0,021* 1,343 | 41,60 4 2,7 |

1 90 1 0,623 + 0,018* 1,363 | 45,70 + 3,4 |

| 120 | 0,775 + 0,026* 1,548* | 50,05 ± 1.7 !

1 150 | 1,012 ± 0,031* 1,779* | 56,86 + 2,1 I

1 180 | 0,921 + 0,02* 1,69 1 54,50 ± 2,6 |

| 210 | 1,133 ± 0,12* 1,97* | 57,47 + 4,8 |

1 240 j 1,469 + 0,14* 2,48* | 61,03 4 5,0 |

| 270 | 1,265 4 0,07 1,94 | 65,15 4 3,3 |

| 360 | 1,368 4 0,2 1,95 | 70,00 4 3,8 |

| 540 | 1 . .. 1 0,982 4 0,13* 1,54* | 1 63,72 + 2,4* | г

* - Р < 0,05 ; п = 15 Нами был определен в составе ос-глобулиновой фракции сыворотки однокомпонентный вариант гемоглобинсвязыващего белка,подобный Нр типа 1-1 человека.На злектрофореграмме при окрашивании хромоген-ными красителями он проявлялся в виде единственной фракции,незначительно отличаясь по электрофоретической подвижности от свободного гемоглобина. В ряде случаев однокомпонентные варианты белка мигрировали к аноду с различной скоростью.

2.2.2.Характеристика полученного препарата,метода выделения и очистки.

Результаты очистки гаптоглобина из сыворотки крови кур представлены в таблице 2.Как следует из данных таблицы,фракционирование сульфатом аммония позволило отделить значительную часть

балластных белков,но сопровождалось заметными потерями гаптогло-бина. Наибольшую очистку давала ионообменная хроматография, однако, злектрофоретичес кий анализ показал,что гемоглобинсвязываюшэя фракция была гетерогенна по своему составу и содержала примеси других белков.Поэтому для окончательной очистки белкового препарата была использована гель-фильтрация на сефадексе 5-150.

Таблица Z.

Очистка гаптоглобина из сыворотки крови кур

(......... 1 • IСтадии очистки!Общий 1 (Общий Нр,мг 1 1 1 НЬ-связ.|Степень|Выход |

I (объём,мл|белок,мг способ. ¡очистки) % 1

! 1 1 мг/мг 1 1 1

1 1 1 | 1 I белка 1 1 1 I 1 1

1 |Сыворотка 200 10800 173,2 0,016 1 100 |

^акционирова-

ние (NH4)2SO4

1(0,55 - 0,61

|насыщения) 30 301,73 115,35 0,38 23,75 68 1

|Ионообменная

|хроматография

|на DEAE-A-50 300 151,41 105,99 0,7 44 61,2 I

|Гель-фильтрация

|на G-150 1......... 350 93,53 90,75 0,97 60,6 52,4 |

Гомогенность полученного препарата проверяли электрофорезом в ПААГе.При окрашивании белка Соотпазз1е ВВЗ-250,а также реактивом Шиффа было показано,что белок мигрирует как одна полоса с небольшой электрофоретической подвижностью.

2.2.3.Определение молекулярной массы и субъединичного состава молекулы гаптоглобина.

Молекулярная масса гаптоглобина,определенная методом гель-фильтрации составила 68940 ± 260 Оа,а по данным электрофореза в ПААГе в присутствии БОЭ равна 33800 ± 475 Оа.После предварительной обработки препарата белка в-меркаптоэтанолом,установлено присутствие на злекгрофореграмме двух компонентов с различной молекулярной массой: для а -полипептида = 27400 ± 260 Оа;для « -6800 ± 320 Ба.Результаты по определению молекулярной массы ука-

ванными методами дают основание заключить,что Нр имеет олигомер-ную структуру и состоит из двух типов полипептидных цепей.

Выделенный нами белок является гликопротеидом.на что указы-

гивом Шиффа после окисления периодатом.

При анализе субъединичной структуры белка также установлено, что углеводы связаны только с в-полипептидной цепью.

Нами определены две различных М-концевые аминокислоты .-валин для й -полипептида и глицин - для р.

При определении изоэлектрической точки нативного белка и Нр-НЬ комплекса получены результаты: р1 (Нр) = 4,22 ± 0,019 и р1 (Нр-НЬ) =5,51 ± 0,054.

2.2.4.Химический состав гаптоглобина.

Аминокислотный состав гаптоглобина приведен в таблице 3. Сравнение собственных результатов аминокислотного анализа с литературными показало,что Нр сыворотки крови кур содержит больше аспарагиновой и глутаминовой кислот,а также валина и глицина. Всего в составе молекулы белка определен 531 аминокислотный остаток.

Показано,что выделенный белок является гликопротеидом и по свое),(у качественному составу не отличается от молекул гаптоглобина других видов.Но,в отличии,от них содержит всего 13,46 % углеводов. Данные анализа представлены в таблице 4.

Одним из основных факторов,оказывающим влияние на процесс межмолекулярного взаимодействия между белками, является видовая принадлежность белка. Впервые установлено,что Нр кур обладает специфической функциональной активностью не только по отношению к НЬ своего вида,но и способен взаимодействовать с гемоглобинами других эволюционно близких видов животных.Как показали наши исследования, во всех случаях образование комплекса сопровождалось увеличением лероксидазной активности НЬ и составило:для НЬ кур - 43,34%,гуся -50,02 X,индейки - 48,03 Х;черепахи - 20 % и лягушки - 17,64

При изучении рН зависимости пероксидазной активности комп-1екса гаптоглобина с гемоглобином кур отмечено, что максимум активности приходится на рН = 4,25 ± 0,06,а образование комплекса 5ыло возможно в диапазоне рН от 3,5 до 5. (рис.1,2).

Установлено,что сильное ингибирующее воздействие на актив-юсть комплекса,а также и на сам процесс комплексообразования

вает окрашивание белковой полосы при электрофорезе в ПААГе реак-

2.2.5.Изучение влияния различных факторов на образование и свойства Нр-НЬ комплекса.

4

<

| |остат.в молекуле | белка | белка

J_I_I.

| ЬуБ 36 0,545 6,98 |

| Шэ 15 0,227 3,131 |

1 Аге 14 0,2121 3,309 |

1 Аэр 68 1,029 11,74 |

| ТИг 32 0,4841 4,897 |

| Бег 41 0,6211 5,404 |

| 61и 59 0,8939 11,532 |

| Рго 27 0,4091 3,968 |

1 Б1у 48 0,7271 4,145 |

I А1а 39 0,5908 4,195 |

1 1/2.СуБ 15 0,2271 2,34 |

| Уа1 45 0,6818 6,75 |

| Ме1 7 0,1060 1,378 |

| Не 25 0,3787 4,28 |

| Ьеа 31 0,4697 5,308 |

1 Туг 10 0,1516 2,469 |

| РЬе 9 0,1316 2,004 |

1 Тгр 1 10 0,1513 2,818 | 1

Таблица 4

Углеводный состав молекулы гаптоглобина

1 | Углеводы 1 | 1 1 I мкмоль/мг белка | %. на сухое вещество | 1 1 1

1 | Ы-ацетилкейраминовая 0, 1038 3,2 |

| кислота

| Галактоза о, 1222 2,2 I

| Манноза 0, 1588 2,86 |

| Ы-ацетилглюкозамин 0, 2109 5,0 |

| Фукоза | О, 011 0,2 | |

Таблица 3

Аминокислотный состав гаптоглобина сыворотки крови кур

( | I--1--1

Аминокислота [Кол-во аминокисл.I мкмоль/мг I г/100 г

п е Р

о а

к к 500-

с т

и и

Д в

а н

з о

н с а т

я ь 100-

единиц \=470 нм

Рис.1.Зависимость пероксидазной активности Нр-НЬ комплекса от рН

V элюата.мл

Рис.2.Влияние рН на образование Нр-НЬ комплекса, (гель-фильтрация на Б-200).

12345678 рН

оказывают БОБ,Ыа^ЗО^мочевина;при этом эффект,оказываемый БОБ носит необратимый характер.Присутствие в среде №4)2504 вызывает снижение пероксидазной активности комплекса,но при этом не оказывая существенного влияния на процесс межмолекулярного взаимодействия. Активаторами процесса взаимодействия белков служат ИагЕ^Оу, ЫН4С1.(рис.3).

С,моль/л

Рис.3.Влияние состава среды на пероксидазную активность Нр-НЬ комплекса.

Определение температурного режима функциональной активности Нр показало,что образование комплекса возможно в температурном режиме от 37° до 50°С,а препарат гаптоглобина в достаточной степени сохранял гемоглобинсвязывавдую способность даже после продолжительной инкубации при 50°С.На пероксидазную активность,т.е. на стабильность Нр-НЬ комплекса температурный фактор оказывает влияние в большей степени.Так,при инкубации образцов при 1=37° и 45°С в течение 120 минут активность комплекса менялась незначительно, при повышении температуры до 45° к концу Еторого часа ин-

кубации сыворотка сохраняла 851,а препарат Нр - 95% от исходной активности.При дальнейшем повышении температуры пероксидазная активность комплекса составляла соответственно 40 и 51% (при 50°С); 27 и 34 % - при 55°С.Температурный оптимум пероксидазной активности комплекса препарата гаптоглобина с гемоглобином кур составил от 40° до 45°С.

ВЫВОДЫ

1.Показано,что в сыворотке крови кур в онтогенезе происходят достоверные изменения концентрации гаптоглобина,которые связаны с физиологическим состоянием организма.

2.Установлено,что минимальная концентрация гаптоглобина в сыворотке крови была у суточных и десятидневных цыплят.С возрастом происходило,достоверное повышение концентрации Нр,достигая максимальных значений в период интенсивной яйцекладки,а с завершением продуктивного периода отмечалось некоторое снижение его концентрации. Полученные данные о количественных изменениях гаптоглобина дают теоретическое обоснование к применению этого показателя в лабораторной и клинической диагностике.

3.Усовершенствование метода диск-электрофореза в полиакрила-мидном геле дало возможность идентифицировать гемоглобинсвязываю-щую фракцию в сыворотке крови кур,а также определить истинный фенотип белка.выявлен однокомпонентный вариант белка,мигрирующий в зоне «-глобулинов с относительно невысокой подвижностью.

4. Предложен модифицированный способ получения гаптоглобина из сыворотки крови кур.позволяющей получать очищенный в 60 раз гомогенный препарат белка с сохранением его физико-химических и биологических свойств.Способ многократно испытан в лабораторных условиях с положительным результатом.

5.Показано,что гаптоглобин,подученный предложенным способом, мигрирует при электрофорезе в полиакриламидном геле в виде одной полосы и по своей химической природе является гликопротеидом.

6.При анализе субъединичной структуры белка с использованием метода диск-злектрофореза в редуцирующих условиях и гель-фильтрации установлено:

а) молекула гаптоглобина является тетрамером и состоит из двух типов полипептидных цепей й и с,обладающих различной элект-рофоретическай подвижностью.полипептиды посредством дисульфидных связей связаны между собой в димеры а(3,которые объединены в целую молекулу путем нековалентного взаимодействия;

б) молекулярная масса нативной молекулы белка составляет 68900 ± 820 Da,а входящих в ее состав а- и в- полипептидов соответственно 6800 ± 320 и 27400 ± 260 Da;

в) N-концевыми аминокислотами являются для «-цепи - валин и глицин для 3-полипептида;

г) изоэлектрическая точка для Hp равна 4,22 ± 0,019;а для Нр-НЬ комплекса pi =5,51 ± 0,054.

7.Изучен химический состав белка: а) показано,что выделенный белок является гликопротеидом и содержит 13,46 Z углеводов:N-aце-тилнейраминовую кислоту, N-ацетилглюкозамин,галактозу,маннозу,фу-козу;

б) определен аминокислотный состав.Установлено,что молекула содержит 531 аминокислотный остаток,при этом отмечено высокое содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот,валина и глицина.

Данные по химическому составу гаптоглобина из сыворотки крови кур получены впервые и могут быть использованы в сравнительной биохимии сельскохозяйственных животных.

8.В результате изучения физико-химических и биологических свойств гаптоглобина установлено:

а) полученный препарат белка обладал специфической функциональной активностью "in vitro" по отношению к гемоглобину кур,гуся, индейки, черепахи, а также лягушки и карпа,при этом отмечалось увеличение пероксидазной активности гемоглобина;

б) максимум пероксидазной активности образовавшегося Нр-НЬ кур наблюдался при рН = 4,25 ± 0,06, а образование его комплекса было возможно при рН = 3,5 * 5,0 ;

в) пероксидазная активность Нр-НЬ комплекса зависит от температуры и времени инкубации¡максимум пероксидазной активности Нр-НЬ комплекса был при температуре 40 - 45°С,а взаимодействие Hp с НЬ возможно при температуре от 37° до 50°С;

г)что SDS,Na2S04,мочевина препятствуют образованию Нр-НЬ комплекса,снижая сродство гаптоглобина к гемоглобину,а также значительно уменьшают его пероксидазную активность;в то время как добавление (NH4)2S04 вызывает снижение активности,но при этом не оказывая существенного влияния на образование Нр-НЬ комплекса;

д) что присутствие в среде Na2B407,NH4Cl оказывает положи^ тельное воздействие на активность комплекса,а также способствует его образованию;

е) что растворы солей:NaCl,KCl,не угнетают образование комплекса и в незначительной степени влияют на пероксидазную активность последнего.

9.Проведенные исследования расширяют представления о химическом составе и физико-химических и биологических свойствах гаптоглобина, препаративных и аналитических методах исследования белка, а также о возможных путях преобразования молекулы в ходе эволюции.

Сведения о практическом использовании научных результатов.

Научные результаты внедрены на кафедре органической и биологической химии МГАВМиБ и изданы методические рекомендации :

1."Методы современной биохимии" //А.Г.Малахов,Н.А.Шугам,И.Г.Силь-вестрова,Л.В.Валова,О.И.Курдуманова, В.А.Лукичева.- М.:Моск.вет. акад.им.К.И.Скрябина. - 1987.- 40 с.

2.Малахов А.Г.,Сильвестрова И.Г.Выделение и очистка гаптоглобина -из сыворотки крови кур. - М.: Моск. вет. акад.им. К.И.Скрябина.-1990. - 34 с.

Модифицирован способ определения фенотипов гаптоглобина методом электрофореза в полиакриламидном геле (удостоверение на рационализаторское предложение N 94 от 18.03.87 г.).

Научные результаты используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по темам:"Структура и функция белков крови","Метаболизм гемоглобина".

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1.Данные по количественному содержанию гаптоглобина в сыворотке крови кур в онтогенезе могут быть использованы как нормативы в лабораторной практике.

2.Модифицированная методика выделения и очистки гаптоглобина может быть рекомендована для получения чистого препарата этого белка с целью изучения структуры,свойств и применения в качестве диагностического препарата.

3.Полученные результаты могут явиться базовыми при разработке методик выделения и очистки гаптоглобина сыворотки крови других видов животных и птицы.

4.Результаты исследований по изучению физико-химических и биологических свойств гаптоглобина кур рекомендуется использовать в научно-исследовательской работе по сравнительной и эволюционной биохимии животных,а также включить в учебный процесс зооветеринарных вузов и факультетов.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Сильвестрова И.Г. Изучение физико-химических свойств молекулы гаптоглобина из сыворотки крови кур //Тез.докл.Всес.симпозиума "Биохимия с.-х.животных и продовольственная программа".- Киев.- 1989.- С.131.

2.Малахов А.Г..Сильвестрова И.Г.Выделение и очистка гаптоглобина из сыворотки крови кур.Методические указания.-М.:Моск.вет. акад.им.К.И.Скрябина,1989.- 34 с.

3.Сильвестрова И.Г.Влияние различных факторов на образование и свойства гаптоглобин-гемоглобиновых комплексов //Проблемы ветеринарной биологии: Сб.науч.тр. / Моск.вет.акад. им.К.И.Скрябина.-1990. - С.126 - 129.

4.Сильвестрова И.Г. Гаптоглобин сыворотки крови кур. / Моск. вет.акад.им.К.И.Скрябина.-М.,1990.-8 е.- Деп.в ВНИИТЭИагропром.: серия Птицеводство (биологические основы).- 1990.N 363 ВС-90. Опубл.1991. - N 2. - С.8.

Б.Малахов А.Г..Сильвестрова И.Г.Химический состав и строение молекулы гаптоглобина сыворотки крови кур /Моск.гос.акад.вет.мед. и биотех.им.К.И.Скрябина.- М.,1996.- 8с.- Деп.в НИИТЭИагропром. - N 163, ВС - 96.Рукопись аннотирована в 7.1 выпуске БД НИИТЭИаг-ропрома за 1996 г.