Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гаптоглобина на активность простагландин Н-синтетазы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние гаптоглобина на активность простагландин Н-синтетазы"

КАЗАХСКИМ ГОСУДЛга'ВЕШШ! НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.АЛЬ-ЗАРЛВД

^ ^ ® 0 На правах рукописи

2 1 НДР 19Я4

, уда 577.II2.e53

МУРЗАГАЛИЕВА АЛИЯ ТАУАСИХОВНА ВЛИЯНИЕ ГАПТОГЛОБИНА НА АКТИВНОСТЬ НГОСГАГЛАДДИН Н-СИНГЕГАЗ.Ч 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

. диссертации на ""искание ученой степени кандидата биологических Наук

АЛМАТЫ 1994

Райоть выполнена в Институте экспериментальной биологии HAU PK и Мэжфакультетской лаборатории молекулярной биологии и биооргани-часксй химии им.А.Н.Белозерского ШУ(г.Москва).

Научные руководители: доктор биологических наук

Р.У.Бейсембаева

доктор химических наук А.Т.Мевх

Официальный оппоненты: доктор биологических наук

■О.В.Есырев

кандидат химических наук Г.А.Бектенова

Будущая организация: Институт молекулярной биологии

и биохимии им.Ы.А.Айтхожина HAH Республики Казахстан

Защита состоится 1994г. в /t"^ часов на заседа-

нии специализированного совета KI4/A.0I.I3 по защите диссертации на соискшшэ ученой степени кандидата биологических наук при биологическом факультета Казахского государственного национального университета им. Аль-Фараби.

г.Алматы.пр.Аль-Фараби,71, С диссертацией ыбжно ознакомиться в библиотеке биологического факультета КазГУ им.Аль-Фараби.

Автореферат разослан Ji op^ß^oo^jus. 1994г.

Ученый секретарь

специализированного совета q

кандидат биологических наук Т.И.Шалахыетова

Актуальность проблемы. Важную роль я функционировании многих физиологических процессов в клетках организма кгрштг внутриклеточные регуляторы. Препстявителпми его го класса веществ являются простягландины (ГС), физиологически активные производные полине-настенных жирных кислот. Эти соединения обладап1' широким спектром биологической активности. Их роль ярко проявляется в регуляции иммуногенеза, репродуктивной, сердечно-сосудистой, нервной систем. Поэтому от концентрации простагландинов в большей степени зависит функционирование различных систем яизнеделтельгости оргшитз^п. Регуляция уровня простагландинов осуществляется специальным м«хп-ниэмом контроля их синтеза в клетке. Активное участие в функционировании этого механизма должны принимать эндогенные регуляторы проствгла.ндинсинтеэпрущей системы. На существование подобных регуляторов указывают м-. .->1 ,. 1965; п«ва1 'Л ,-] , 1989; 51г1ск1ппЛ еь ах , 1990. Было установлено, что в рмниотическоИ жидкости человека присутствуют два фактора, один из которых активирует, а другой ингибирует синтез простагландинов. Три фактора, влияющие на синтез ПЗЕ^, ГС?.? , ГС1г, найдены в пернтопалмЫ! жидкости человека.

В настоящее время проводятся интенсивные исследования рпдегенных ингибиторов синтеза простогландинов, которые найдены в с*мы* различных жидкостях организма. Однако не выяснена их природа, механизм действия, неизвестно являются ли ингибитор« из рьяных ниточников подобными по структуре, активности ч црханияму их действия. Пока лишь для сыворотки крови установлено, что оо ингибн-торная активность связана с гликопротевдом гаптоглобшюм, действие которого направлено на клччепой фермент пелиферментной системы, ответственной за синтез простагландинов, нроетаглондин II-синтетазу (ГСН-синтетозу).

В связи с этим-изучение эндогенных ингибиторов синтеза прое-тагландинов, механизма их действия представляет кек тсоротичег-кий, так и практический интерес.

Цель и задачи исследовмтя. Целью настоящей роботы явилось выявление эндогенного ингибитора РСН-синтетазы в клетках везикулярных желез барана, установление его природы и моханипмя действия.

Для достижения поставленной цели необходимо было реиить следующие задачи:

I. Выяснить присутствует ли в цитозоле клеток везикулярных

келсо оврй'чл ингибитор скоростьлимитирующего фермента синтеза прсстагдвн.циноз РСН-синтетааы и уетгноьить природу этого ингибитора.

К. Нилсм'ть ипгибирует ли гаптогдаоин РСН-синтетааную и пер-•т-кои^азнуп лк'гиьности фермента.

Иеип-.понать влияние гаптоглобина на скорость РСН-синтетааноА ь пс.;счс.чдлз,йЬ реакции в аалисимости от концентрации и времени пропигпО'С'ЯЦ-'И белка с ГСН-синтетааой.

4, Изучить кинетические характеристики ингибирования РС.Н-синте-тааы гяптоглобг.иом в аависидости от концентрации субстратов: ара-;:?1ЛОнаюй кислоты, рдреиалина, перекиси водорода и кофактора гемина.

5. Исследовать соьместное влияние на РСН-скнтотазу акаогенных ¡'аспирин, бруч»;н) и эндогенного (гаптоглобин) ингибиторов.

пк^П'лая новизна_. В работе впервые показано, что в цитоволв к-ет">ь неаикулярных желез барана присутствует ингибитор ключевого ^орме.мт» сшиогзн лроатаглпццинов РСН-синтетазы. Ингибирующая способность цитг,злля связана р. основном с гликопротеидом гаптоглобином. • ;а "сно!>гип;и изу»ешя кинетических характеристик установлено, .что "•[гкч'икгщ^я РСЧ-сиктетапи гаптоглобином протекает обратимо, разви-"пртгя мт гфсмепи и миисм? от концентрации ингибитора в среде. н|>куо'ую, «то иьг'пбирукупвр деИс.'пие гьптоглобина проявляется как в

!.ч;лНО" ГО;-СИ1 ПОТОЧНОЙ, Та К !! ЛС-роКГИДвЗНОЙ реПКЦИИ ферМЙНТЙ.

Тгяретг.мр.зкое и практическое значение работы. Работа имеет тео-ргтич&ское цивченке для чсследоааний.ло выяснению механизмов регу-чяц:;и синтеза гростагландинов - биологических регуляторов широкого спрмтуа д,г.1:огаия к представляет интерес для специалистов, работавши* р области энтюлигии, биологии клетки, физиологически активных сойцнненнй. Результаты проведенных исследований дают представление п отэюжмоу пути и механизм» андогенного контроля концентрации-простагландим'п посредством регуляции активности ключевого фермента биоснтеза ртиу биорегуляторов - простагландин Н-синтетазы. По-питйнле молекулярных механизмов регуляции ферментов синтеза простаг .рандинов позволит наЯти аффективные пути регуляции действия прос-таглвидимов. Знание природы и механизма действия активаторов и ингибиторов ферментов шкет привести к открытия лекарственных препаратов, способных бороться с различными патологиями.

Апробация габотн. Результаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Москва, 19ВД), на республиканской научной конференции "Актуальные проблемы

физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), на конференции биохимиков Средней Азии и Кпзахстрна (Тшчкент, 1991), на ХУ международном биохимическом конгрессе (Израиль, 1991).

Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в U печатных рвботах, полный перечень которых приведен в конца автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация изложено на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литератур», материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Работа содержит 21 рисунок, 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 162 публикации, из них зарубежных IP2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основным материалом для получения препаратов гаптоглобина тужила сыворотка крови овец. Гсптоглобин .выделял" из сыворотки двумл методами! осведением сульфатом аммония и препаративным электрофорезом; аффинной хроматографией но гемоглобии-сефорозе и гель-фильтра-цчей на G-200. Для приготовления аффинного сорбента для выделения гаптоглобина использовали софарозу, пктиьированную бромциалсм или А(1~сефпрозу, Но которой в качестве лиганда иммобилизовали метгемо-глобин курицы. Гомогенность получанного препарата гаптоглобина определяли: I) иммунодиффудией на агаре против антисыворотки, полученной сотрудниками лаборатории биохимии ИЭБ АН РК к препарату гаптоглобина овцы; 2) по его электрофоретической подвижности в 1% лоли-акриламидном геле. Источником получения PGIi-синтетазн различной степени.очистки являлись везикулярные железы барана, которые собирали на Алма-Атинском мясокомбинате, быстро замораживали в жг ~т азоте и затем хранили при -20°С в холодильной камере. FGH-синтетазу выделяли как описано ( Van der Ondina et al , 1977).

Реакция, катализируемая PGiT-синтетвзоЙ, является многосубстратной, двухсерийной. Возможна детекция как суммарной (циклооксигеназ-пая + пероксидазияя), так и отдельно пороксидазиой активности. Субстратами PGil-синтетазной реакции являются арахидоновая кислота, кислород, донор электронов и требуется присутствие гемина в качестве кофактора. В пероксидвзной реакции вместо арахидоновой кислоты используется перекись водорода.

Для определения активности PGH-синтетазы использовали следующие методы:

I) суммарную PGH-оинтетаэную активность сол-чбилипироввинного

препарата фермента определяли спектрофотометрически при длине волны 460 нм как начальную скорость накопления окисленной форма адреналина ( ста ^ а! , 1979) с использованием спектрофотометра " иреоога от-чий " и " йЫшай^и ". Измерение ферментативной активности проводили в спектрофотометрической кювете объемом 3,0 ил, содержащей буфер, субстраты, гемин и фермент. Реакцию иницировали добавлением арахидоновой кислоты;

2) измерений пероксидазнай активности фермента проводили аналогично, как в случав НЗН-синтетазной активности, но реакцию иницировали добавлением перекиси водорода;

3) суммарную ферментативную активность микросоыальных фракций РСН-синтетазы оценивали по начальной спорости уменьшения концентрации кислорода в вакрытой полярографической ячейке с использованием олектрода Кларка и полярографа Р-7е (ЧСФР). В состав реакционной смеси входили аликвоты микросоыальных фракций везикулярных желез барана, субстраты и гемин.

Фермент инкубировали при 20°С с компонентами реакционной смеси или ингибиторами в зависимости от конкретных условий проведения эксперимента. Отбирали аликвоты во времени и измеряли остаточную активность.

Содержание белка определяли по методу Яоури ( ьоигу ек а! , 1951) и по поглощению растворов белка при 260 нм.

Кинетические данные анализировали графически в координатах Лай-нуивера-Берка (двойные обратные координаты).

Первичные клетки везикулярных желез барана получали из свежезамороженных желез и желез с различным сроком хранения после замораживания в жидком азоте. Железы промывали средой Хэнкса или средой 199 и подвергали трипсинолиэу. Определение общего количества жизнеспособных клеток проводили в камере Горяева после инкубации клеток с раствором трипанового синего. Для получения цитоволя клетки подвергали изотоническому шоку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гаптоглобин - эндогенный ингибитор РСН-синтетавы ь цитозоле

клеток везикулярных желез барана.

I. Получение цитоволя клеток везикулярных мелез барана и исследование его влияния на активность РСН-синтетааы.РСН-синтетаза внутриклеточный мембранносвязанный фермент. Регуляция его активности может осуществляться, в частности, различными факторами цитоао-

б

йя. В связи о этим поставлена задача выяснить присутствуют ли в составе цитозоля клеток везикулярных желез барака регуляторы активности PGH-синтетазы. Источником для получения цитозоля служили первич-йые клетки везикулярных желез барана, которые выделяли из свежепо-Лученных желез и желез, хранившихся 12-14 месяцев при -20°С. Замороженные железы оттаивали в физиологическом растворе при 4 С в течение ночи. Железы очищали от жира, промывали средой Хэнкса и измельчали. Затем заливали этой же средой, содержащей трипсин (0,£6$). Через 40 мин инкубаири при 37°С отделяли супернатант. Анализ его йод световым микроскопом указал на наличие клеток в случае как ин-•гактных желез, так и желез размороженных. Количество клеток, полученных от интактных желез значительно выше и составляет 6-10 млн/мл раствора, а из размороженных - 3-4 млн/мл раствора. Лизисом клеток дистиллированной водой в течение ночи получали раствор, содержащий цитозоль.

Далее исследовали влияние цитозольного раствора (концентрация белка 2,4 мг/мл) на пероксицазную активность солгобилизированного препарата PGH-синтетазы. Из данных рис.1 видно, что в присутствии цитозоля активность PGH-синтетазы снижается. Степень инактивации фермента зависит от времени инкубации его с ингибиторами, и концентрации последнего._________________^__

•Рис.1. Зависимость пероксидаз-ной активности PGH-синтетазы (АЙ) от времени инкубации с разными количествами цитозоля. Белок в пробах цитозоля (мг/мл) : I -0,2 - 0,048, 3 - 0,095. Условия определения активности: 20 мМ фосфатный буфер pH 7,4, адреналин ^ I мМ, гемин - 1,9 _^ *ин Midi, перекись водорода - I мМ

Итак, в цитоэоле клеток веэикулярынх желез барана присутствует ингибитор скоростьлимитиругацего фермента синтеза простагландинов PGH-синтетазы.

2. Идентификация гаптоглобина как эндогенного ингибитора PGH-синтетазы в цитозоле клеток вбзикулярных уелез барана. Для изучения цитозольного фактора, ингибиругацвго PGH-синтетаэу, необходимо было прежде всего выяснить его природу. Из данных литерату-

б .. • ры известно ( fiasu , 1989; Marshall 1977), что вндогенные ингибитора синтеза простаглаццинов могут быть белками или липидаыи. 1»ы предположили, что способность ци то золя ингибировать синтез простагландинов может быть как в случае сыворотки крови связана о гаптоглобином. Так как не было Известно, присутствует лигалтогло-бин в цитоаоле клеток везикулярных желеэ барана, требовалось выяснить этот вопрос. Повтому провели исследование наличия гаптоглоби-на в составе цитовольных белков клеток везикулярных желез барана,

Специфическим свойством, гаптоглабина является его способность быстро связывать гемоглобин в стабильный комплекс, Этот комплекс также как и гемоглобин проявляется на электрофореграммах специфическими красителями (бенаидином, толидином), но отличается от гемоглобина по электрофоретичесюй подвижности и характеризуется более высокой пероксидазной активностью. Следует отметить, что из всех сывороточных белков только для гептоглобина характерно свойство образовывать о гемоглобином подобный комплекс. На атом свойстве гептоглобина основаны методы era идентификации в различных биологических жидкостях. Выли исследованы вдектрофоретические свойства цито-ьольных белков в присутствии и отсутствии метгемоглобина. На рио.2 представлены электрофореграммы цитоаоля (а, в) и смеси цитозоля о метгемогдобином (в). На фореграмме геля о .бенаидином проявляются кроме метгемоглобина новые полосы,' которые отсутствуют в случае цитоаоля без метгемоглобина (в) и совпадают по подвижности о контролем - комплексом Нр-Нв (д). Это указывает, что при добавлении дето золя к метгемоглобину образуется Нр-Нв комплекс» Следовательно,-в цитоьоле клеток везикулярных желез барана присутствует гаптоглобин. Этот вывод подтверждается также результатами, полученными при исследовании влияния цитобольного раствора на пероксадазную. активность метгемоглобина. Цитовольный рйотвор не проявляет иероксидав-ной активности. Однако при добавлении его к метгемоглобину перонси-дазная активность последнего увеличивается вдвое (1,6 усл.ед. до 3.2 усл.ед.). Это возможно лишь после связывания метгемоглобина & комплекс с гаптоглобином.

Итак, в цитоаоле клеток вевикулярных иелее барана присутствует белок, связывающий метгеыоглобин в комплекс, обладающий повышенной пероксидазной активностью по сравнении о метгемоглобинои, Т.е. гаптоглобин.

Для выяснения роли галтоглобина в способностицртозоля ингибировать PGH-синтетазу сравнили'влияние на активность фермента» исходного цитозоля, цитозоля после удаления галтоглобина И наделен-

ного ид ци то золя гаптоглобинй»

Жге?^ Рио.2. Электрофоретическое дока-Л'ЗД'С^О -г® 1«' • ' аательство присутствия гаптогло-

бина в цитозола «леток везикулярных желез барана! а, в - цитоэоль, о - путозоль + метгемоглобин, д - гаптогйобин + метгемоглобин (контроль), е -цитоволь после инкубации о метНв-сефароэой + метгемоглобин, -белок, элпировенный 6 М мочевиной с мет-Нв-сефаровы +метгемоглобин, а - окрашивание вмидочерным, в •~f -бенэидином.

1976), что из всего многообразия сывороточных белков только гаптоглобин связывается о Нв-сефарооой, образуя прочный комплекс, разрушающийся В М мочевиной или 5 И гуани-динхлоридом. Это свойство гаЛтоглОбина бЬло использовано нами для его выделения иа цитоволя. Смесь ци то вол я и метНв-сефароаы инкубировали 2 часа в 0,05 М фосфатном буфера рН 6,0 при постоянном перемешивании. Затем сорбент отделяли от раствора, промывали 0,05 М фосфатным буфером рН 8,0 до полного исчезновения поглощения при 280 нм. Белки, овязавшиеся С матНв-сефароаой и .элюант 8 Н мочевиной исследовали электрофорезом а 1% полиакриламидном геле» На рис.2 представлены Полученные елвктрофореграммы.

' Таблица I

Влияние на пероксидавную активность РОН-синтетазЫ ци то золя и его компонентов! разделенных аффинной хроматографией на МатНв-сефаровв

-V-

Известно { Рошпег«п1п|$

Компонент, добавленный к РбН-синтетазе

Концентрация белка (мг/мл) й реакционной смеси

Пероксидаоная активность РСН-синтетазы {% от исходной)

Без добавок Цитоеоль

Цитоэоль после инкубами с матнв-оефарозой .

Гаптоглобин, тзделвиный из ЦИТОвОля ■

Ш

0,080

100

й

100 93

8 .

Анализ белка, полученного аффинной хроматографией на метНв-се-фароае показал, что он проявляет.специфическое свойство гемоглобина - свяеывать гемоглобин в прочный комплекс.

Далее было исследовано влияние компонентов цитозоля на перокси-дазную активность РСН-синтетазы. Из данных таблицы I видно, что инкубация ГСН-синтетазы с цитозольным раствором приводит к снижении перокскдазной актизкости фермента. После удаления гаптоглобина аффинной хроматографией из цитозоля, последний практически теряет способность ингибировать фермент. Свойство же ингибировать РСН-син-тетазу сохраняется у вьделенного из цитозоля гаптоглобина. Следовательно, гоптоглобин является одним из компонентов цитозоля, ответственным за его свойство ингибировать Р(ЗН-синтетазу.

Таким образом, и^тозоль везикулярных желез барана содержит вн-догенный ингибитор РСН-синтетазы. На основании полученных данных можно утверждать, что ингибиторная активность в основном овязана о гликопротеидом гаптоглобином.

Влияние различных Факторов на процесс инактивации ' .

РОН-синтетазы гаптоглобином

Зависимость эффективности ингибирования РОН-синтетазы от удельной активности фермента. При сравнительном анализе отепени ингибирования препаратов РСН-синтетаэы (солюбилизированные препараты о различной удельной активноотью) установлено, что более активный фермент инактивируется в большей степени. Так, при добавлении гаптоглобина овцы к свежеполученному препарату РбН-синтетазы с удельной активностью 3,3 4 10 моль/мин * мг по адреналину через 15. мин инкубации при 20°С происходит его ингибирование на 4ОЙ.- Однако втОТ же препарат РОН-синтетазы, инактивированный выдерживанием при 4°С в течение 3 суток (удельная активность 0,7'Ю"4 моль/мин'мг) не ин-гибируется при инкубации о тем же количеством гаптоглобина в идентичных условиях.

Весьма вероятно, что молекула фермента с более нивкой удельной активностью отличается По своей конформации от активного фермента. Это может обусловливать изменения в участках» на которые влияет - гаптоглобин.

Исследование влияния видовой специфичности на свойства гаптоглобина ингибировать РСН-синтетаз,У. Для выяснения вопроса о влиянии видовой специфичности гаптоглобина на его способность ингибировать РвН-синтетазу мы провели сравнительное исследование Инактивации РСН-синтетазы гаптоглобином овцы и лошади. Полученные ре-

аультаты показали, рис.3,что зависимости ингибирования активности РСН-синтетазы от концентрации ингибитора и времени инкубации оказались практически одинаковыми для гликопротеидов указанных видов животных. Следовательно, можно предполагать, что характеры влияния гаптоглобинов овцы и лошади на активность РСН-синтетазы подобны.

Рис.3. Зависимость степени ингибирования РСН-синтетазы гапто-глобином овцы (I) и лошади (2) от времени инкубации фермента с галтоглобином (а) и концентрации■ гаптоглобина (б). Условия определения активности: 20 мМ фосфатный буфер рН 7,2, арахидоновая кислота - 1,7 мМ, адреналин - 0,94 мМ, гемин -1,88 мкм. Концентрация гаптоглобина овда (I) - 0,857 мг/мл,

лошади (2) - 0,928 мг/мл.

■ . . . К1 •

Ранее было установлено (Бёйсембаева, Абилова, 1986), что гапто-глобины разных видов млекопитащих отличаются по иммунокроссреактив-ности и антигенной валентности- против антител к гаптоглобину овцы. Причем, наибольшее различие по иммунологическим характеристикам проявляют именно гаптоглобины оецы и лошади. Несмотря на значительные различия по иммунологическим характеристикам гаптоглобины овцы и лошади по своим свойствам инактивировать РСН-синтетазу везикулярных яелез барана практически не отличаются.

На основании полученных данных можно, видимо, считать, что ви-гаптоглобина не влияет на степень ингибирования

Кинетические гарактеристики ингибиуювания РСН-синтетазы гаптоглобином

Реакция, катализируемая РСН-синтетазой, является двухстадийной. Первая стадия ото циклоокенгеняонпя реакция, вторая - пероксидазнан. Обе активности характерны для одной молекулы фермента.

Впипнио гаптогдобина нп начальную скорость превращения адреналина в ацренохром в ходе РСН-синтотазной реакции. При действии ингибитора на фермент может снижаться либо скорость ферментативной реакции, либо выход конечного продукта, либо оба фактора одновременно. Анализ кинетических кривых скорости реакции, катализируемых ГСН-синтетазой показывает, что после инкубации препарата К!Н-синтетазы с гаптоглобином снижается скорость окисления адреналина. С увеличением количества галтоглобина в реакционной среде выход адренохрома снижается.

Экспериментальное доказательство инактивации гаптоглобином пер-оксиднз.ной активности РбН-скнтетазы. Приведенные выше результаты показали, что гаптоглобнн ингибирует полную РСН-синтетазную активность. Из данных исследования влияния цитозоля клеток и его компонентов на РСН-синтетазу с использованием перекиси водорода в качестве субстрата следует, что гаптоглобин также снижает скорость восстанрвления перекиси водорода, катализируемого ферментом. Следовательно, гаптоглобин может ингибировать пероксидазнуп активность ГСН-синтетазы. Для доказательства этого было исследовано влияние гаптоглобина на пероксидазную активность РСН-синтетазы, предварительно лишенной цик-лооксигеназной активности взаимодействием с аспирином. Микросомы везикулярных яелеэ барана (4,3 мг/мл) инкубировали с аспирином (Б в течение 40 мин при 4°С. Такая процедура приводит к необратимой • потере способности фермента трансформировать арахидоновую кислоту в присутствии донора электрона в РСН^. Действительно, микросомы.везикулярных желез барана после инкубации с аспирином утрачивали цикло-оксигеназную активность, но их пероксидазнан активность сохранялась (табл.2). Далее микросомы промывали 0,05 М трис-НС1 буфером рН 7,5 для удаления избытка ингибитора. Промытые микросомы солюбилизировали и определяли в них ферментативные активности с использованием в качестве субстратов арахидоновой кислоты и перекиси водорода. Затем модифицированный аспирином фермент инкубировали с гаптоглобином. При этом происходило снижение пероксидазной активности ГСН-синтетьзы. Зти результаты можно рассматривать как первое прямое

'Доказательство того, что' галто глобин иш*ибпрует пероксидазную пи-тивность РСН-синтетазы.

Таблица 2

Влияние гелтоглобина на активность ИЗН-синтетазы

Т

Ферментативная актнсность________

Источник ферментативной

активность ¡полная РСН-синтетаз?- пероксидазнг,.!

___1нал_1____

Микросомы (МКС) .100

МКС, еолюбилизированные после инкубации с аспирином 4,1 ТОО

Солюбилиэированные И\С, ингибированные аспирином, после инкубации с гаптогло-

бином 0 67

Данные, полученные при исследовании зависимости перо'ксидазпой реакции модифицированной РСН-синтетазы от концентрации перекиси водорода также доказывают инактивацию пероисидазной активности фермента гаптоглобином.

-к

-г -I

?ис.4. Зависимость начальной скорости пероксидчзнс.й реакции РСН-синтетазы, модифицированной аспирином от концентрации перекиси водорода (2,4 - В,0 Ю^М): I - контроль бо:> гаитогло-бина; 2 - инкубация форунитл с гаптоглобином (1,6 мг/га;, 20 мин, 20°С.

Условия определения активности: 50 мГЛ трис-НС1 буфеп рН 8,0, адреналин - I мМ, гемин - 1,56 мкМ,-

ЙЪ рис.4» видночто -инкубация с гаптоглобином солюбиливироввнных ■КШрВййМ» с предварительно заимгибиров^шой циклооксигенаэной ах-•гушос^ь,, приводит к снижении скорости реакций восстановления пе-

6

рекиси ю до рода, катализируемой РОН-синтетазоЙ. Б то же время константа Михазлиса не изменяется. Следовательно, гаптоглобин не влияет на сродство модифицированной РСН-синтетаэы к субстрату - перекиси водорода и яьлйется по отношению к нему неконкурентным ингибитором. Подтверждением инактивации гапто глобином пероксидазной активности РСН-синтетезы являются также ниже приведенные результаты исследования зависимости активности фермента от концентрации субстратов и ингибитора, времени инкубсции фермента с ингибитором.

Влияние гяптоглобина на активность РСН-синтетазы в зависимости от времени прединк.убации его с ферментом при разних концентрациях ингибитора. Пак было сказано вше, суммарная и пероксидазная активности фермента могут быть определены независимо. Поэтому вначале была исследована кинетика ингибирования гаптоглобином РСН-синтегиз-ной с арахидоновой кислотой с качестве субстрата и пероксидазной активности с перекисью водорода в качестве субстрата в зависимости от времени инкубации ф» опта с ингибитором при разных концентраци-

ях последнего.

rfd!*№•"* -г • .....

А%

1D0

ВО

60

20

А%

100

■ 80

60

10

го

го

Мил

Рис.5а). Зависимость РСН-синте-тазной активности фермента от времени прединкубации его с разними концентрациями гаптоглобина (М-10-6): I - 0, 2 - I,В, 3 - 3,6, <1 - 5,4.

<Р ¿0 .иаи.

б). Зависимость пероксидазноЙ активности фермента от времени предиикубации его с разными кон- > центрациями гаптоглобина (М'10~^) ? I - 0, 2 - 0,52, 3 - 1,05, 4 - 1,56, Б - 2,1.

Условия определения активности: Щ кМ фосфатный буфер рН 7,2, адреналин - ТмМ, гемин - 1,3 мкМ, арахидоновая кислота - 0,1 мЫ, перекись водорода - 1,68 кМ.

i

РСН-еинтетазу инкубировал!! с равными. количествами гаптоглобина ь течение 30 мин. Через определенные промежутки времени инкубации отбирали аликвоты для измерения остаточной ГСН-синтетаэноЯ и перокси-дазной активности. Анализ зависимости изменения хода ферментативной реакции в присутствии гаптоглобина показал (рис.5 а,б), что степень инактивации РбН-синтетазн зависит' от концентрации ингибитора я среде и развивается во времени. Из рис.5 а,б видно, что зависимости инги-бирования РСН-синтетазной и пероксидазной реакции фермента гаптоглобином' от времени несколько отличаются. Потеря пероксидазной активности Р(ЗН-синтетазы достигает максимального значения на 12-14 минута инкубации, тогда как полная активность фермента гораздо быстрее - на 1-5 минуте.

Доказательство обратимости ингибирования Н?Н-синтетазы.гапто: глобином. Характеры зависимости ингибирования РСН-синтетазы от времени при разных концентрациях ингибитора позволяют предполагать, что гаптоглобин является обратимым ингибитором. Дальнейшие исследования действительно подтвердили это, К 5 мл раствора' микросоч в 50 мМ трис-НС1 буфера рН 0,0, содержащим 10 мг белха, добавили 1,5 Мл раствора гаптоглобина (3 мг белка) и инкубировали 20 мин при 20°С.. Суммарная активность РСН-синтетазы при этом снижалась на ЗОЙ от исходной. Ингибитор из реакционной среды удаляли осаждением мик-росом центрифугированием при 42000 об/мин 1,5 часа и гфошвки их 0,05 мМ трис-НС1 буфером. После удаления ингибитора 8Ш- активности фермента восстанавливалась. В параллельном опыте исследовали инактивации фермента аспирином, который мэобратимо ингибирувт РСН-син-татазу. В этом случав после существенного уменьшения концентрации аспирина в реакционной среде путем разбавления восстановления РСН-синтетазной активности не наблюдается.

Полученные результаты подтверждают вывод об обратимости ингибирования гаптоглобином РСМ-синтетазы, вытекакчий из анализа кинетических: кривых инактивации фермента гаптоглсбином в зависимости от времени инкубации и концентрации последнего.

Исследование характера влияния гаптоглобина на активность РСН-зинтетвзы по отношению к субстратам реакции. Для выяснения механизма ингибирования РСН-синтетазы гаптоглобином представляет интерес определение кинетических характеристик данного процз?.са. Одним из факторов, регулирующих скорость биохимических процессов являются концентрация субстратов. В связи с этим были проведены исследования зависимости скоростей г?роксидазной и РСН-синтетазноп реакции

от гомцчнгргщии субстратов фермента, инкубированного с гаптоглобином. Г.опученнк'з зависимости начальной скорости накопления продукта .реакции о.пренохрома от концентрации арахидоиовой кислоты (РСН-синтвтдоипя реакция) и перекиси водорода (пероксидазная реакция) представлены на рис.'б.а, 7,а в координатам ЛаРнуивера-Барка. Результаты исследования показывают, что ингибирование гаптоглобином PGH-синтатазы по отношению к арахидоновой кислоте и перекиси водорода подобно и в обеих случаях протекает неконкурентно. Значение константы Михаэлиса остается постоянным и не изменяется с увеличением концентрации ингибитора. При проведении ингибиторного анализа важно!; является количественная оценка способности ингибитора по ртмолеиип к ферменту, т.е. определение константы ингибиропчния Кд . О этой цялью исследована зависимость скорости ферментативной реакции при постоянны* концентрациях фермента от концентрации ингибитора. Экспериментальные данные представлены в координатах . vjax/ .. vmox > где vmax " Vff»it ~ максимальные скорости в отсутствие и присутствии ингибитора (рис.6,б,7,б). Величина К рассчитана как тангенс угла наклона прямой этой зависимости. Константы ингибиро-вания PGH-синтетаэы гаптоглобином по отношению к арахидоновой кис-лото и перекиси водорода соответственно равны 1,9*10~®М и 0,75*10"® М. Аналогично были исследованы зависимости начальной скорости,накопления продукта реакции адренохрома в ходе PGH-синтетазной и пер-оксидазной реакции от концентрации другого субстрата - адреналина. ¡1 в отом случае инкубация PGH-синтотазы с гаптоглобином приводит ?. изменению максимальных скоростей реакции , тогда как кон-

станты Михаэлиса (Км) остается б4з гэмонемиИ. Следовательно, гапто-. глобин по отношению к адреналину является неконкурентным ингибитором, то есть но влияет на сродство фермента к-донору электрона. Такая зависимость наблюдается кяк в случае РСН-еиитегазной, так и пероксндазной реакции форме! ¡г*,

Исходя из полученных длимых можно предположить, что ингибирование PGH-синтетаэы гаптоглобином является результатом взаимодействия двух белков - ингибитора и фермента. Возможно, что взаимодействие гяптоглсбина с ферментом осуществляется вне -активного центра и изменяет католическое действие PCtI-синтетазм вследстсие .влияния на.конформацип ее молекулы, т.е. непрямого воздействия на активный Центр фермента. Неконкурентный тип ингибирования по отношению к субстратам ферментативной реакции показывает отсутствие лолной конкуронции между га^-л'яобином и субстратами PGH-синтетаз-няй и явроксидаэной реакции за контактныЛ участок.

4

Рис.б,а. Зависимость РСН-синтетазной активности

от концентрации арахидоновой кислоты ври разных

концентрациях гаптоглобина (М-Ю-6):

I - 0, 2 - 1,6, 3 - 3,6, 4 - 5,4. Время предин-

кубации 25 мин, 25°С.

Арахидоновая кислота - (О,023-0,125мМ).

Рис.7,а. Зависимость пероксидазной активности РвН-синтетазы от концентрации перекиси водорода при разных концентрациях гаптоглобина^-10 ): I - 0, 2 - 0,52, 3 - 1,05, 4 - 1,56, 5 - 2,1. • Время щтадинкубации 25 мин, 25°С. Перекись водорода - (0,15-1,58кМ).

Условия определения активности: 20мМ фосфатный буфер рН 7,2, • адреналин - 1мМ, гемин - 1,3мк14.

6,6 7,6 - графическое: определение константы ингибирования ('К,)РСН-синтетазы гаптоглобином по отношению к арахидоновой кислоте и перекиси водорода.

Таким образом, данные кинетических исследований фермента дают основание предполагать существование регуляторного (аллостеричес-кого) центра на поверхности молекулы РСН-синтетазы.

Совместное влияние гаптоглобина и нестероидных противовоспали-тельных препаратов (аспирин, бр.уфен) на активность РСН-синтетазы. Информативным подходом для установления характера взаимодействия ингибитора с РСН-синтетазой является исследование одновременного влияния двух ингибиторов, относящихся к различным классам с разными механизмами их действия на фермент. Гаптоглобин, как показано выше обратимый ингибитор РСН-синтетазы, инактивирует как РСН-синтетазную, так и пероксидазную активности фермента. Нестероидные противовоспалительные препараты (аспирин, бруфен) ингибируют лишь циклооксиге-назную активность РСН-синтетазы, Аспирин медленно необратимо взаимодействует г. ферментом, а бруфен быстро и обратимо.

В связи с этим поставлена задача выяснить как влияет на активность РСН-синтетазы гаптоглобин в присутствии экзогенных ингибиторов (аспирина, бруфена). Вначале было изучено раздельное влияние на активность РСН-синтетазы разных концентраций гаптоглобина и аспирина и выбранй условия, при которых фермент инактивируется на 30-40?. В первой серии экспериментов исследовали ингибирование РСН-синтетазы аспирином после прединкубации фермента с разными концентрациями гаптоглобина. Фермент инкубировали с гаптоглобином в течение 5 ми^ затем вносили в среду прединкубации аспирин. Через Определенные промежутки времени определяли остаточную активность спектрофотометричес-ким методом. Полученные результаты показывают, что в присутствии в реакционном растворе двух ингибитбров (гаптоглобин, аспирин) степень инактивации фермента несколько выше, чем в случае одного из них. . Так, в случае аспирина степень ингибировалия РСН-синтетазы через 15 мин инкубации составляет 5С$, после инкубации с гаптоглобином -.40$, а при совместном влиянии - 60-65%. Увеличение степени ингибирования РСН-синтетаэы может быть обусловлено существованием аддитивности действия двух ингибиторов. Отсутствие полной аддитивности, видимо, связано с тем, что гаптоглобин затрудняет доступность центра связывания для аспирина. ..''

Далее было исследовано совместное влияние гаптоглобина и бруфена на активность РС!Н-синтетазы. В этом случае были исследованы зависимости начальной скорости накопления адренохрока в ходе РСН-синтетаз-нсй реакции от концентрации арахидоновой кислоты (0,037-0,23 мМ): 1) исходной РСН-синтетазы, 2) фермента, инкубированного с гаптоглоби-

ном, 3) с бруфеном, 4) по'сле инкубации о гаптоглобином и друфено!.: Экспериментально наблюдаемые зависимости скорости РСН-синтетазной реакции от концентрации арахидоновой кислоты в присутствии и отсутствии ингибиторов представлены на рис.8 в координатах Лайнуиве-ра-Берка. Анализ полученных данных показывает, что после инкубации РСН-синтетаэы одновременно с гаптоглобином и бруфеном степень инактивации фермента выше, чем в случае одного гаптоглобина.

Рис.8, Зависимость РСН-синтетазной активности фермента от концентрации, арахидоновой кислоты (0,03? - 0,23 мМ) в отсутствие и присутствии ингибиторов»

I - РвН-синтетаза, 2 - РОН-синтетаза + гаптоглобин (1,6 мг/мл),

3 - РОН-синтотаза+гаптоглобин (1,6 мг/мл) + бруфан (2,5* Ю^М),

4 - РСН-синтетаза +• бруфен (г^'Ю^М).

Условия определения активности} 60 м!,1 трио-НС1 буфер рН 8,0, гэмин - 1,56 мкН, адреналин - I мМ, 20°0.

Следовательно, в данном случае также имеет место аддитивность действия двух ингибиторов. Однако полной аддитивности на наблюдается, такяэ как при инкубации РСН-синтетаэы о гаптоглобином и аспирином, Еолез того, степень инактивации фермента только бруфеном, оказывается шсколько йьмо, чзм при совместном влиянии бруфена и гаптоглобина. .

Итак, йри соемаотно-м ддйотаии гаптоглобина и экзогенных ингибиторов (аспирина, бруфена) их инактивирувдее влияние складывают-

ся. Отсутствие полной аддитивности может происходить из-за того, что взаимодействие с высокомолекулярным гаптоглобином стерйчески затрудняет доступность центра связывания для аспирина и бруфена.

Для ответа на вопрос существует ли аддитивность действия гапто-глобина и экзогенных ингибиторов исследовали влияние гаптоглобина на активность фермента, предварительно инкубированного о аспирином (0,5 М исходная концентрация) в течение 40 мин. При этом активность фермента снижалась до 50$. Затем в инкубационную смесь вносили разные концентрации гаптоглобина (0,3, 0,6, 0,9 мг/мл) инкубировали еще 20 мин и измеряли остаточную активность. Одновременно определяли активность ГСН-синтетазы, инкубированной с аспирином в течение. 60 минут. Из полученных данных следует, что степень ингибированил фермента, инкубированного вначале с аспирином, затем с гаптоглобином выше, чем при действии одного ингибитора. Так, в случае только аспирина, активность фермента снижалась на 5(Й, а при инкубации с разными концентрациями гаптоглобина (0,3, 0,6, 0,9 мг/мл) - на 30, 35 и 40£, а при их совместном действии - 60, 80 и 85«. При добавлении к раствору РСН-синтетазы аспирина происходит необратимая потеря активности фермента из-за ингибирования циклооксигеназной активности. При этом концентрация активного фермента в реакционной смеси уменьшается. Так как гаптоглобин оказывает инги'биругащее влияние на обе активности фермента (циклооксигеназная, пероксидазная), то остаточная активность инактивируется данным белком. Поэтому при предварительной инкубации фермента вначале с аспирином, а затем с гаптоглобином, ингибирущее влияние аспирина и гаптоглобина складываются. Сравнение уровня инактивации Р(ЗН-синтетазы, полученных в двух сериях опытов показывает, что в случае инкубации фермента'вначале с гаптоглобином, а ватем с аспирином РСЗН-синтетаза ингибирует-ся в меньшей степени например, на 60 и 85$. Это может бы'гь обусловлено тем, что высокомолекулярный гаптоглобин связываясь с ферментом стерически затрудняет взаимодействие активного центра РШ-синтегазы с аспирином. Для проверки этого предположения провели исследование влияния разных концентраций аспирина на активность РСН-синтетазы, предварительно ваингибированной гаптоглобином.. Фермент инкубировали с гаптоглобином в. течение 30 минут. Была выбрана кйн-цэнтрация гаптоглобина, при которой активность РСН-синтетазы снижалась не 30$. Затем к ферменту добавляли разные концентрации аспирина, инкубиробали еще 40 минут и остаточную РШ-синтетаэную ак-

тиеность спектрофотоцвтриЧаским методом. Результаты анализа представлены в таблица 3,

Таблица 3

Ингибиторы

Активность фермента <1 в % от исходной

РСН-синтетааа без ингибитора РбН-синтетаза, инкубированная с аспирином (МЧСГ3):

1.Й5 ¿,5

РСН-синтетаза, инкубированная

с гаптоглобиноы (0,71-мг/мл)

РСН-синтйтаза, инкубированная о гаптоглобиноы (0,71 мг/мл),

затем с аспирином (М'ЮЬ

0.5 1,25 Й,5

100

27 18 10

70

47 27 18

' Итак, в присутствии гаптоглобина й аспирина имеет место аддитивность действия двух ингибиторов. Однако, степень ингибирования зависит от последовательности действия ингибиторов, В случае предварительной инкубации с гаптоглобином она нижа. Предполагается, что это обусловлено стеричасхим блокированием гаптоглобином активного Центра молекулы фермента.

■ •• ВЫВОДЫ

1. Показано, что в цитозола клеток ваэикулярньпс желез барана присутствует ингибитор ключевого фермента биЬсинтеза простагланди-нов РСН-синтатазы»

2. Установлено, что ингибиторная активность цитозоля везикулярных желез барана связана в основном с гликопротеидом гаптоглобином.

3. Показано, что ннгибируэдае Действие гаптоглобина проявляется как в полной РСН-сннтзтазной, так и пероксидазной реакции фер-изнта, инактивация РСН-синтетязы является обратимой, неконкурентной по отноааняп к субстратам фермента.

4. Показано, что гаптоглобин яиляется специфическим ингибитором пзрохсидазной активности РбН-синтетазы.

5. Выпалено, что при совместном влиянии нестероидлык'противовоспалительных препаратов (аспирин,бруфан) и гаптоглобина наблюдается аддитивность действия двух ингибиторов на РСН-синтетазную активность.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССШ'АЦИИ

1. Исаева Г.М., Бейсембаева Р.У., Мурзагалиева А.Т. Гаптоглобин -- потенциальный регулятор репродуктивной функции животных. // Тез. докл.Всесоюзн.нонф.- Пущино, Москва. - 1988.С.45.

2. Beieentaeva R.U., Mursagaliova А.Т., Dzhumalieva L.M., Shoikonov Т.Е., Mevkh А.Т. Identification of haptoglobin as on endogenous inhibitor of prostaglandin ll-eynthctaoe in tho oytocol fraction of primary cello.from eheep vesicular elands. // FEBS,. - 1990.V.269.K.I.P.125-127.

3. Мурзагалиева А.Т., Бейсембаева Р.У., Игумнова Н.Д., Мевх А.Т. Влияние гаптоглобина на простагландин Н-синтетазу везикулярных желез барана. // Биохимия. - 1990.Т.55.Вып.5.С.791-795.

4. Мурзагалиева А.Т,, Бейсембаева Р.У., Влияние гаптоглобина на свойства простагландин Н-синтетазы везикулярных желез барана. // В кн. "Изменчивость продуктивных качеств при совершенствовании стад".Алма-"Ата. - 1990.С.86-95,

5. Бейсембаева Р.У., Мурзагалиева А.Т., Джумалиева Л.М., Шайкенов Т.Е., Мевх А.Т. Идентификация гаптоглобина как эндогенного ингибитора простагландин Н-синтетазы в цитозоле клеток везикулярных желез барана.

// Биохимия. - 1990.Т.55.Вып. 12.С.2261-2267.

6. Бейсембаева Р.У., Мурзагалиева А.Т., Мевх А.Т. Гаптоглобин - эндогенный ингибитор простагландин Н-синтетазЫ. // Тез.докл.конф.биохимиков Средней Азии и Казахстана.-.Ташкент.- I99I.C.87,

7. Mevkti А.Т,, Verfolomeev C.D., Belsembaeva R.U., Mursagalieva А.Т., .Dzhu-maliova L.H., Igumnova N.D. Tho regulation of.the prostaglandin H-eynthe-taee activity by haptoglobin fron primary cell.of eheep vooicular glands.^ . // I5th International Congress of Biochemistry. - Jerusalem,1вгво1.1991.P.51 8. Мурзагалиева A.T., Бейсембаева Р.У., Игумнова Н.Д., Мевх А.Т.

О механизме ингибированйя простагландин Н-синтетазы гаптоглобином. // Известия HAH PK, сер.биологическая. - 1993.№6.

Ыырзагалиева Алия Тауасиховна ШТ0ШЕШШ1Н, ПРОСТАГЛАВДИН Н-СШГЕТАЗАГА ЭСНР1

Просгаглацдин Н-синтетаза(РСН-синтетаза) нлетканьщ iiaiHReri ueu-браналармен байдашсты фермент больш есептзлвд! капе оргшшамдв прое-тагландиндврд1ц цурылуына жауапты полиферментгЬс жуйего жатади. Ол арахидон цшцылыныц простагландин Н-ца eici саталыд айнаулы ни at где катализд!и цызиет атдарып, eui турл1: циклооксигеназалиц жане перов-сидазалыц эренет кврсетед!. Ka3ipri уацытта гаптоглобин PGH-синтета-заньщ imiti эндоганд!к ыелшерти реттеуш! заттардьщ Öipeyi дел саналады. Б!зд1ц зврттвулер1и!зд1н натижесхнде гаптоглобин цошцарлардыц Keöipoii* веэихулальщ бездвр^1ц клеткаларыныц 1ш1ндог1 суйыцта болатыны жене ол PGH-синтетаза фермент1нщ цизмэтгн цитозолдш. кемегшвн тш;еуго жауапты екенх аныцталды. Сонымен катар гаптоглобин ферментт1ц жалпы же не пероксидазалыц apexeTin до тежейт!ндШг1 дэлелдендх. РСН-синтета-за ферментШц acepiHin тежелу1 гаптоглобинн!ц сынаган суйыцтагы цою-лыгына байланисты болумен цатар, тексеру уакртиниц уэацтыгына да тау-елд! ехенх аныдталды. Сонымен 61з гаптоглобин PGH-синтетазага ете жыл-даи а сер етат1н хане acepi тез цайтатын тежегш екенхн аныцтадыц. PGH-синтетазаныц гаптоглобин мен тежелухнщ кинетикалыц сипаттамасын зерттеген кезде, сол ферментт!ц цасиетМц гаптоглобин мен тежолу£ геминн!ч цосымша ocepiueH де, немеса басца доспандыларыен салыстыр-ганда да, ешцандай бэсеввс!з »YpexiHi белг1л! болды.

Mursagalleva Alia Tauasikhovna

THE EFFECT OF HAPTOGLOBIN ON THE PROSTAGLANDIN Н-йУНТПЕТАИЕ ACTIVITY

Prostaglandin H-synthetase (PGH-synthetase) Is tho Intercellular membrane bound enzyme oi' the polyenzyme system responsible for the prostaglandin synthesis in organism. It catalyses arachldonlc acid tuo-step conversion to prostaglandin-H and has tv;o kinds of activity: Cyclooxigenase and peroxidase. The endogenous regulation of the PGH-synthetase activity is part of the mechanism responsible for the prostaglandin lf.vel control in organism. Prostaglandins are the bioregulators which p&rt in many vital processes, How one of the endogenous PGH-synthetace inhibitor is considered to be glycoprotein haptoglobin. We have shown that it s a component of the sheep vehicular gland intercellular fluid and probably participates in the ondogci.oun regulation of the PG1I-synthetase activity. The haptoglobin has been proved to inhibit either total or peroxidase activity of the euayrae. The PGH-synthutaise inacti-vation is developed during the time. The degree of the enzytn. Inactivatlon Jependu on 1 nliibltor concentration in the medium. The Kinetic i«üft£,ur>.nente

of inhibition of PGU-synthetase by haptoglobin indicated the enzyme' inacti-vation being noncompetitive in relation to all the PGH-synthetase Bubatrates or hernia coiactor.