Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика гаптоглобина овец

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бейсембаева, Роза Ултубаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ И

СВОЙСТВАХ ГАПТОГЛОБИНА МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

ГЛАВА П МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА Ш БИОХИМИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ И ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГАПТОГЛОБИНА У ОВЕЦ В ОНТОГЕНЕЗЕ. 102 Ш.1. Гаптоглобин составная часть белков сыворотки крови в течение всего периода онтогенеза у овец.

Ш.2. Биохимический полиморфизм гаптоглобина у овец а) Различные формы гаптоглобина овец и их плодов. б) Частота встречаемости разных типов гаптоглобина.

Ш.З. Изменения концентрации гаптоглобина в онтогенезе у овец.

ГЛАВА ТУ ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ГАПТОГЛОБИНА ОВЕЦ.

1УЛ. Выделение и очистка гаптоглобина.

1У.2. Четвертичная структура и некоторые физикохимические характеристики гаптоглобина. а) Субъединичный состав молекулы гаптоглобина овец. б) Полипептидный состав молекулы гаптоглобина в) Физико-химические характеристики молекул гаптоглобина г) Выделение и частичная характеристика ос - и р -полипептидов. д) Характеристика структуры молекулы гапто-глобина овцы. е) Процессы ассоциации и диссоциации в молекуле гаптоглобина овцы.

ГЛАВА У ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГАПТОГЛОБИНА С ГЕМОГЛОБИНОМ. 168 УЛ. Видовая специфичность белков в реакции взаимодействия гаптоглобина с гемоглобином. а) Влияние видовой специфичности гаптоглобина на образование и свойства Нр-Нъ-комплекса. б) Взаимодействие гаптоглобина овец с гемогло-бинами разных видов млекопитающих.

У.2. Полипептид гаптоглобина овцы, ответственный за связывание гемоглобина.

У.З. Влияние различных факторов на образование и свойства Hp-Hb-комплекса. а) Ионы, детергенты и другие соединения, изменяющие состав среды. б) Влияние pH. в) Конформация и свойства молекулы гемоглобина и гаптоглобина. г) Зависимость пероксидазной активности НрС-метНь-комплекса от концентрации субстратов: перекиси водорода и гваякола.

У.4. Влияние гаптоглобина на структуру и свойства гемоглобина в комплексе Hp-Hb

ГЛАВА УТ ВЛИЯНИЕ ГАПТОГЛОБИНА НА ПРОЦЕССЫ РАЗВИТИЯ,

СОЗРЕВАНИЯ И ОВУЛЯЦИИ ФОЛЛИКУЛ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ 227 а) Влияние простагландина Р2(Х и гонадотропина СЖК на концентрацию гаптоглобина в крови овец.

У1.2. Влияние гаптоглобина на степень овуляции у млекопитающих.

ГЛАВА УН. К ВОПРОСУ ОБ ЭВОЛЮЦИИ ГАПТОГЛОБИНА.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная характеристика гаптоглобина овец"

Актуальность проблемы. Важной биохимической системой, в которой происходят сложнейшие обменные процессы организма, является сыворотка крови. В настоящее время в ее составе установлено около 200 различных белков. Эти сывороточные белки участвуют в многочисленных биохимических реакциях организма, что в значительной мере определяется их физико-химической гетерогенностью. Выяснение функции каждого из них, структуры и свойств их молекул позволит лучше понять сложные процессы, обеспечивающие поддержание жизнедеятельности организма. Одним из представителей сывороточных белков является гаптоглобин - объект изучения настоящей работы. Гаптоглобин это гликопротеид, входящий в состав -глобулиновой фракции, впервые обнаруженный в 1938 году. Интенсивные исследования гаптоглобина человека дают в настоящее время представление о его структуре, свойствах и метаболизме. Установлено, что гаптоглобин входит в состав белков "активной фазы" сыворотки крови,и его концентрация изменяется при патологиях. Однако до сих пор еще не известна функция гаптоглобина в организме. Нет никаких данных о становлении гаптоглобина в онтогенезе млекопитающих. Не исследованы структура и свойства этого гликопротеида многих видов позвоночных, в том числе и сельскохозяйственных животных. Изучение этих вопросов представляет как теоретический, так и практический интерес и является необходимым для определения видовых особенностей гаптоглобина, понимания эволюции его молекулы, для выяснения значения белка в организме млекопитающих.

Цель работы. В настоящей работе была поставлена задача дать структурно-функциональную характеристику гаптоглобина овцы. Для ее решения необходимо было

- охарактеризовать структуру и свойства молекулы гаптоглобина овцы;

- изучить становление этого белка в онтогенезе овец;

- установить, какие варианты гаптоглобина встречаются у овец и их плодов;

- исследовать гемоглобинсвязывающую способность гаптоглобина овец и плодов, влияние различных факторов на образование и свойства комплекса Нр-НЪ ;

- исследовать влияние гаптоглобина на процессы суперовуляции у млекопитающих;

- выяснить,как влияют гормоны на концентрацию гаптоглобина в сыворотке крови овец.

Научная новизна и практическая ценность. В работе впервые найдено, что у овец существуют три основных варианта гаптоглобина (НрА, НрВ и НрС), в плодный период синтезируется фетальный тип этого гликопротеида, который заменяется на дефинитивный при рождении. Показано, что синтез гаптоглобина начинается на ранних стадиях плодного периода развития,и во внутриутробный период онтогенеза животного концентрация его изменяется немонотонно . Установлено, что молекулы всех вариантов гаптоглобина овец состоят из двух типов полипептидных цепей <х и р , связанных в димер о1р посредством Б-э-связей; НрА является тетрамером, а НрС -смесью полимеров, различающихся по числу ар -димеров. Отмечено, что гаптоглобин овцы не проявляет внутривидовой специфичности и образует прочные комплексы с гемоглобинами разных видов млекопитающих. Установлено, что гаптоглобин, связывая гемоглобин в комплекс Нр-НЪ , стабилизирует и активирует его молекулу и вызывает изменение ее структуры. Выявлены зависимости взаимодействия гаптоглобина овцы с гемоглобином и свойств комплекса Нр-Нъ от состава и рН среды. Обнаружено, что додецилсульфат натрия, мочевина и сульфат-ион инактивируют Нр-НЬ-комплекс, а тетраборат-анион активизирует его, влияние этих соединений обусловлено их взаимодействием с молекулами белка. Найдено, что простаг-ландин не изменяет в норме количества гаптоглобина в сыворотке крови овцы, а при повышенных концентрациях, свидетельствующих о патологии, снижает его. Следовательно, уровень гаптоглобина может служить тестом эффективности действия лекарственных препаратов на организм млекопитающего.

Предложена схема влияния гаптоглобина на количество эстраднола во время развития, созревания и овуляции фолликулярных клеток. Обнаружено, что гаптоглобин увеличивает степень суперовуляции у мышей, вызываемой гонадотропином сыворотки жеребой кобылы. Эти результаты могут иметь практическое значение при создании банка ценных генотипов и при исследованиях по трансплантации зигот млекопитающих.

Результаты, полученные в работе, позволяют дать характеристику структуры и свойств гаптоглобина овцы, его становления в процессе развития животного, предположить возможность участия этого гликопротеида в регуляции концентрации эстрадиола в период развития, созревания и овуляции фолликулярных клеток.

Г Л А В A I

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ И СВОЙСТВАХ ГАПТОГЛОБИНА МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Гаптоглобин (Hp) - гликопротеид глобулиновой фракции сывороточных белков был открыт в 1938 году Полоновским и Жейли ( Polonovsky , Jayle , 1938). В настоящее время установлено его присутствие в сыворотке крови человека ( Polonovsky , Jayle , 1938), домашних и диких животных ( Rean , 1971 ; Travis , Sanders, 1972; Richter , 1973; Meier et al. , 1980), птиц ( Mus quera , Planas , 1977; Musquera et al. , 1979), черепах и рыб ( Schwan -tes , Tondо , 1969; Ипатов, Лукьяненко, 1979). Концентрация гаптоглобина в норме у разных видов млекопитающих значительно различается (мг%): человек 100-300, кролик 90-100, крыса 6090, лошадь 19-117, овца, корова, коза, телята, соответственно 8,9-10,7, 0,13-0,17, 0,65, 0,195-0,234 ( Arronz et al., 1972; Harvey, 1976; Поспелова, Родионов, 1970). Отмечены индивидуальные вариации уровня гаптоглобина в крови, не зависящие ни от возраста, ни от пола, например, у собак он колеблется от 14 до 252 мг%, у кошек - в пределах 31-216 мг%. Некоторые индивиды позвоночных характеризуются полным отсутствием этого гликопротеида (Алимова, 1968). Хотя причины агаптоглобинемии до конца не выяснены, можно уверенно говорить, что она не является результатом неспособности организма к биосинтезу гаптоглобина. Подтверждением является следующий факт: после инъекции турпентина, вызывающего асептическое воспаление, уровень гаптоглобина становился высоким даже у животных, у которых в норме его не могли определить ( Goodger , 1972).

Гаптоглобин найден впервые в плазме крови позвоночных.

Исследования других внеклеточных жидкостей организма показали, что этот белок в незначительной концентрации содержится в молозиве и в моче свиней, в моче человека, только в случае Hpl-I, а в аналогичной жидкости коровы его найти не удалось (Richter } Х973). Отсутствие гаптоглобина в молозиве, в моче коровы и человека с Нр2-2, вероятно, обусловлено молекулярной структурой белка. Хинтон и др. ( Hinton et al. , 1980) указали на присутствие гаптоглобина и в желчи, частично или полностью насыщенного гемоглобином, вследствии того, что туда переносится часть Hp-Hb-комплекса, поглощенного гепатоцитами. При гемолитической анемии у человека и анемий, вызванных у собак и 1фыс ацетилфенилгидразином, общее железо в желчи увеличивается в 4-10 раз. Видимо, в этих условиях растет количество поступающего в желчь Нр-Нъ-комплекса.

Биохимический полиморфизм гаптоглобина

Гаптоглобин встречается у позвоночных в виде различных молекулярных форм. Впервые это было установлено в 1946 году Жейли и Жудасом ( Jayle , Judas , 1946), которые нашли у человека два его варианта, различающиеся по молекулярной массе и способности связывать гемоглобин. В настоящее время известны три основных (Hpl-I, Нр2-1 и Нр2-2) и около 20 редких типов гаптоглобина человека. Hpl-I является монодисперсным белком, а Нр2-1 и Нр2-2 циркулируют в крови в виде системы полимеров. На электрофореграмме Нр2-1 проявляется 5-6 компонентов, один из которых подобен по подвижности Hpl-I, а Нр2-2 - около 810 полос (Smithies , 1955; Харрис, 1970). Редкие варианты гаптоглобина отличаются от основных числом компонентов и интенсивностью полос на электрофореграмме или структурой одной из субъединиц. Предполагается, что они являются продуктами дополнительных аллелей, присутствующих у индивидов. Например, Нр Джонсон характеризуется большим количеством компонентов и, возможно, будет модификацией варианта Нр2-1; молекула Нр Марбурга содержит модифицированную р-цепь, что обусловило его отличие от других типов гаптоглобина по свойству связывать гемоглобин ( Харрис, 1970).

У многих видов животных найдено только по одному типу этого гликопротеида. Например, у лошади, собаки, крысы и кролика описаны лишь однокомпонентные варианты, подобные Нр1-1 человека. Хотя у свиней установлено восемь генетически обусловленных типов гаптоглобина, однако исследован только однокомпонентный, что связано с более высокой частотой его встречаемости. У серебристо-черных и красных лисиц и цыплят найдено по два, у рыб - три варианта гаптоглобина (Серов и др., 1973; ЗЪаЪаИпа , 1977; Ипатов, Лукьяненко, 1979).

Природа наследственного полиморфизма установлена лишь для гаптоглобина человека. Она стала понятна после выяснения тонкой структуры молекул разных его вариантов. Результаты исследования полипептидного состава Нр1-1, Нр2-1 и Нр2-2 позволили выявить интересные закономерности и причины полиморфизма. Так, оказалось, что три варианта гаптоглобина человека различаются лишь структурой одного из двух полипептидов, входящих в состав их молекул; найдено два типа этой цепи - и Ър2о1 . На основании данных, полученных при исследовании структуры Нр1-1, Нр2-1 и Нр2-2, был сделан вывод, что биосинтез а-полипептида определяется двумя генами -Нр-'-01 и Нр^а . Причем ген Нр"'-01' существует в виде двух аллелей - Нр^'Рос и Нр13* , а ген Нр^л является результатом почти полной дупликации гена Нр"®"а . Такой аллель мог возникнуть в результате реципрокной транслокации, происходящей между двумя гомологичными генами и встречающейся в популяции с небольшой, но заметной частотой. Другой причиной появления аллеля Нр^а может быть неравный кроссинговер. Это обычный процесс, происходящий между хроматидами гомологичных хромосом во время их конъюгации в мейозе, который помогает объяснить, наг пример,характерные структурные аномалии, обнаруженные у определенной группы редких вариантов гемоглобина "Лепоре"

Алимова, 1968; Харрис, 1970; Успенская, I97I;Malchy et al. ,

Т rt

1973). Таким образом, существуют два аллеля гена Нр , в и 2« результате их дупликации мы получаем три аллеля гена Нр -Нр2(рр )а } Hp2(SS)0t и Нр**^ ; сочетание этих пяти аллелей дает 15 возможных вариантов гаптоглобина, которые уже найдены у человека (Алимова, 1968; Ray , 1970).

Что касается полиморфизма гаптоглобина других видов позвоночных» пока данных, позволяющих конкретно говорить о его генетической природе, нет.

Гаптоглобин - это генетически обусловленный гликопротеид, варианты которого передаются по наследству (Bundschuch,Falk , 1963; Алимова, I968;Kirk , 1968;Ray , 1970). У человека наследование типов гаптоглобина происходит по отцовской линии. На этом даже основаны методы экспертизы для установления спорного отцовства (Göhler ,Bundschuch , 1962;Bundschuch , Falk , 1963; Лазуренко, 1963; Черкавский, 1973).

Характеристика молекулы гаптоглобина

Гаптоглобин представляет собой сложный белок, который состоит из белковой и углеводной частей. Содержание, углеводов в его молекуле довольно высокое, около 20%. Исключением является гаптоглобин кур, в молекулу которого входит не более 7?о углеводов ( Delers et al. , 1983).

Анализ о. - и р -цепей показал, что углеводы связаны в гаптоглобине большинства видов млекопитающих лишь с р-полипептидом. Только в гаптоглобине козы и собаки они обнаружены и в составе а-цепи (Travis et al. , 1975; Kurosky et al,,I979). Оказалось, что а-цепь гаптоглобина собаки содержит 3% нейтральных гексоз и 3% сиаловых кислот.

Углеводный состав гаптоглобина исследован у ограниченного числа видов позвоночных. Установлено, что в его молекулу входят сиаловая кислота, галактоза, гексозамин, фукоза, глю-козамин,и -ацетилнейраминовая кислота. В гаптоглобине собаки найдена еще манноза, которая отсутствует в белке человека, кролика и крысы. Наиболее похожи по углеводному составу молекулы гаптоглобина человека и крысы ( Lombart et al. , 1965 а; Чудиновских, Будовская, 1966; Cheftel et.al, , 1971).

Роль углеводов в проявлении различных свойств и (функционировании молекулы этого гликопротеида еще не выяснена. Установлено только, что последовательное удаление их не изменяет гемоглобинсвязыващей способности гаптоглобина ( bowe , Ashwell, 1982). Также известно, что гаптоглобин может выступать ингибитором реакции гемагглютинации вируса гриппа. Причем f> -цепь, которая связана с углеводами, является более сильным ингибитором, чем нативная молекула ( Dobryszyska , Lisowska ? 1966). Предполагается, что углеводы важны для катаболизма гаптоглобина. На мембранах гепатоцитов имеются рецепторы, специфические для того или иного углевода, который становится концевым в молекуле гаптоглобина после удаления сиаловой кислоты, чаще всего это галактоза (Dobryszyska et al.,I98I).

В таблице I приведены данные анализа аминокислотного состава молекул гаптоглобина разных видов млекопитающих. Сравнительный анализ указывает на их различия, например, в гаптоглобине лошади меньше аланина и тирозина, собаки - ниже содержание аргинина и треонина, выше - валина и метиони-на, кролика - пролина, валина и лизина меньше, а тирозина -больше.

Молекулы гаптоглобина разных видов позвоночных отличаются также по молекулярным массам, изоэлектрическим точкам, коэффициентам экстинкции при 280 нм (табл.2).

Рассмотрим полипептидный состав молекул гаптоглобина разных видов позвоночных и отметим их сходства и различия.

Молекулы Hpl-I, Нр2-1 и Нр2-2 человека распадаются на два класса продуктов при восстановительном расщеплении ди-сульфидных связей с последующим алкилированием: л- с высокой, р- с медленной электрофоретической подвижностью. Множественность полос Нр2-1 и Нр2-2 на электрофореграмме после такой обработки полностью исчезает (Smithies et.al. , 1966; Waks et.al. , 1967; 1968; Gordon et al. , 1968).

У трех основных типов гаптоглобина человека f -полипептиды оказались идентичными по аминокислотной последовательности; встречаются лишь редкие варианты, характеризующиеся мутацией в р-цепи, например,Нр2-1 "Велевуе" (Javid , 1967). В то же время отмечается существование трех вариантов а. -полипептида -hplPoL, hplSa. Hhp2ot (Алимова, 1968; Ray , 1970; Успенская, 1971).

В настоящее время известны полные аминокислотные последовательности всех трех а-цепей и р-цепи гаптоглобина человека. Полипептиды hp 1 Pot и hplSct состоят из 83 аминокис

Аминокислотный состав гаптоглобинов млекопитающих, (г на 100 г белка). Аминокислота \ \ Нр 1-1 ! Нр 2-1 ! Нр 2-2 ' 1- ;Собака ! Кролик ! Крысы 1 Лошадь

С1оагес et а1., 1963 } ЬощЪагсЧ е1; а1., 19656 !Белостоцкий и !др. 1973

Аспарагиновая кислота 9,27 9,33 9,26 8,94 8,33 8,11 7,98

Треонин 4,36 4,35 4,29 3,97 4,45 5,41 5,11

Серии 3,36 3,35 3,32 3,14 4,63 4,69 4,83 плутаминовая кислота 9,90 9,74 9,82 10,37 10,11 11,53 9,71

Пролин 4,02 4,12 4,06 4,17 3,26 4,26 4,02

Глицин 2,65 2,85 2,96 3,08 2,37 2,87 3,30

Алании 3,43 3,50 3,43 3,98 3,68 4,10 2,61

Полуцистин 2,13 1,52 1,64 1,99 1,47

Валин 6,20 6,10 6,14 7,19 5,09 5,31 6,44

Метионин 1,05 1,06 1,08 1,93 1,14 1,84

Изолейцин 3,32 3, 36 3,35 3,07 3,42 3,24 2,77

Лейцин 6,30 5,93 5,74 5,95 6,41 6,45 5,51

Тирозин 4,95 5,55 5,90 5,38 5,94 4,70 2,90

Фенилаланин 2,64 2,33 2,08 3,12 3,74 3,56 3,80

Лизин 8,16 8,10 8,08 7,96 6,37 8,22 7,31

Гистидин 3,00 3,04 3,06 2,97 2,99 2,77 2,32

Аргинин 2,26 2,20 2,22 1,45 3,72 4,01 2,61

Триптофан 2,96 2,99 2,99 2,74 2,20 2,98

Таблица 2.

Физико-химические константы молекул гаптоглобинов разных видов млекопитающих.

Гаптоглобин !Молекулярная! ! масса •! f | t pl i т s20?w | D20°,W o1 % ,280 ! Литературный ! источник f

Человека Нр I-I 105900 4,034,24 4,1 I. 16 Lombart et al. ,19656 Dobryszyska , Krawczyk , 1979

Собаки 105900 81000 4,9 4,8 4,06 4,9 I. 16 Dobryszyska et al. 1969a; Успенская и др., 1967

Кролика 70000 3,9 3,8 I, 16 Lombart et al. , 19656

Лошади 71000 4,0 4,0 Велостоцкий и др., 1973

Свиньи 96000 4,034,4 4,46 5,0 Lockhart et al.„ 1972 Dobryszyska et al« ,1977

Крупного рогатого скота 96000 I. 91 Richter , 1973

Кур 62000 68000 4,55 3,9 Delers et al. , 1983

Крысы 60000 4,0 3,9 I Д8 Lombart et al. , 1965 6 лот каждая и различаются между собой лишь одной аминокислотой - лизин в 54 положении BhplFa. заменен yhplSa на остаток глутаминовой кислоты; hp2 а является продуктом слияния двух пептидов hplFa HhplSa с утратой в месте соединения 12 (или 13) остатков с С-конца одной цепи и 12 (или II) остатков си -конца другой ( Smith et al. , 1962; Connell , Dixon, 1962; Connell et al. , 1966; Black , Dixon , 1968; Black et.al. , 1970). a - и p -полипептиды гаптоглобина человека связаны дисульфидными мостиками в димеры , которые объединяются в целые молекулы также посредством S-S связей ( Lisowska , Dobryszyska , 1967; Gordon et.al. , 1968).

Гаптоглобины других видов позвоночных по своей структуре несколько отличаются от белка человека. Среди них наиболее подобным по своим свойствам гаптоглобину человека оказался белок свиньи ( Успенская и др., I967;Fraser , Smith ,1971; Lockhart et al. , 1972; Белостоцкий и др., 1973; Lee et al^ 1974; Travis et al. , 1975; Chung , Smith, 1976; Kurosky et al. , 1979). а- и p-полипептиды в молекуле гаптоглобина свиньи связаны прочно, не наблюдается диссоциации при разбавлении раствора даже до концентрации ниже 0,5 мг/мл при 25°, рН 5,5, а также в отсутствии реагентов, разрывающих ди-сульфидные связи. Следовательно, как между полипептидами, так и ap-димерами существуют ss мостики ( Fraser , Smith , 1971; Lockhart et al. , 1972; Chung , Smith , 1976).

Молекула гаптоглобина собаки легко диссоциирует до ди-меров в присутствии мочевины, додецилсульфата натрия, а димеры распадаются до а - и р -полипептидов лишь после расщепления S-S связей (Успенская и др., 1967; Kurosky et al. , 1979). Аминоконец а-цепи гаптоглобина собаки частично блокирован (на 60%) из-за циклизации N-концевого глутаминово-го остатка. Степень циклизации увеличивается до 80% у очищенных препаратов а-полипептида.

Гаптоглобины кролика и крысы подобны по своим полипептидным структурам Hpl-I человека. Однако пока нет единого мнения относительно структуры этого белка щюлика. Так, Ли и др. ( Lee et al., 1974) отмечают отсутствие межцепочечных дисульфидных связей в целой молекуле гаптоглобина кролика, а Куроски и др. (Kurosky et.al* , 1979) не могли обнаружить ее диссоциации в отсутствии восстанавливающих агентов в диссоциирующих условиях. Гаптоглобин крысы в присутствии мочевины и додецилсульфата натрия мигрирует даже медленнее, чем подобный ему по структуре Hpl-I человека. Вероятно, это результат процесса агрегации, который доказывается наличием диффузного компонента на электрофореграмме (Kurosky et al. j 1979).

Гаптоглобин козы проявляется на электрофореграмме как серия полимеров, в этом он похож на Нр2-2 человека. После восстановительного расщепления многополосность исчезает и на фореграмме видны лишь два компонента, которые соответствуют а- и р-цепям молекулы. Медленно движущаяся цепь подобна по подвижности р-полипептиду, а быстродвижущаяся - проявляет подвижность промежуточную между hpla и hp2a гаптоглобина человека.

Недавно описаны некоторые характеристики гаптоглобина кур. Оказалось, что белок этого вида позвоночных содержит всего одну полипептидную цепь в своей молекуле ( Delers et al., 1983).

Аминокислотные составы а- и р-цепей однокомпонентных Hpl-I человека, гаптоглобина свиньи, собаки и полимерного гаптоглобина козы даны в таблице 3.

Из этой таблицы видно, что ос-цепи Hpl-I, гаптоглобина свиньи и собаки наиболее похожи по аминокислотному составу, в а-полипептиде полимерного гаптоглобина козы на 42 остатка больше, чем вЬрЧо. s но на 17 остатков меньше по сравнению с Ьр2а -полипептидом Нр2-2, который состоит из 142 аминокислот. Что касается р-полипептида, то в гапто-глобине животных он оказался на 40-60 остатков длиннее,чем р-цепь Hpl-I человека.

В таблице 4 представлены физико-химические константы для а- и р-цепей гаптоглобинов млекопитающих.

На основании данных молекулярных масс и аминокислотного состава Hpl-I, гаптоглобина свиньи, ролика, крысы и собаки и их^.полипептидов. установлено, что молекулы этого белка указанных видов позвоночных состоят из двух а - и двух р-цепей. Причем. а- и р-цепи образуют димеры посредством дисульфидных связей, которые объединены в целую молекулу S-S мостиками между а-полипептидами разных димеров. Лишь в гаптоглобине собаки не найдены эти S-S связи, а для гаптоглобина кролика, как отмечалось выше, имеются противоречивые данные по ним ( Cloarec et al. , I963;Lombart et al. , 1965 б; Dobryszyska et al. , 1969 a; Cheftel et al. , 1971; Malchy , Dixon , 1973; Lee et-al. , 1974; Kurosky et al., 1979). Малхи и Диксон (Malchy , Dixon , 1973) предложили, а Куроски и др. (Kurosky et.al., 1980) дополнили модель для структуры молекулы Hpl-I человека (рис.1). Данная модель, видимо, подходит и для молекул однокомпонентного гаптоглобина других видов млекопитающих.

Относительно причин многокомпонентности молекул Нр2-1 и

Таблица 3.

Аминокислотный состав а- и р -цепей гаптоглобина (число остатков на моль белка)

Аминокислота |Нр1-1 I) | Нр козы*^ Я) Нр свиньи Нр собаки^ * ! а [ 1 Р 1 Р 1 | а а.

Лизин 20 8,3 24 9 26 7 8,0

Гистидин 9 2,2 5 3 5 3 3,0

Аргинин 4-5 2,0 10 4 4 2 1,0

Ш-цистин 5,0

Цистеиновая кислота 5,0 3,5 5,1 2,3 3,0

Аспарагиновая кислота 28 13,9 33 15 40 10 8-9

Треонин 16 3,2 16 8 22 8 6,0

Серин 18 2,2 23 II 16 2 3,0

Глутаминовая кислота 26-27 9,7 44 12 28 II 13-14

Пролин 10-11 7,4 13 6 14 7 7,0

Глицин 19 7,0 31 II 26 7 6,0

Алании 21 4,9 21 9 19 5 3,0

Валин 17-18 8,3 25 12 22 8 8,0

Метионин 4,0 0 5 0 I

Изолейцин 8-9 2,8 10 5 14 I 2

Лейцин 21 3,2 15 10 28 3 4

Тирозин II 4,5 15 5 10 5 4

Фенилаланин 8,9 0 8 3 9 0 I

Триптофан I

Всего 254 83,1 298 125,3 308 79 83

I)Кигозку et а1. , 1976а; 2) Тгау±в et а1., 1975; 3)Ргазег »ЭтИй , 1971; 4)Киговку et а1. , 1979.

Таблица 4

Физико-химические константы а-и р-цепей гаптоглобина разных видов млекопитающих

Источник j Молекулярная масса !иодержание углеводов, в % ! j Ссылка j а< ! a ! А f 1 Р f 1 I * 1 ß>

Человек 8900 17000 40000 нет 18,6 1,2,3

Коза 13500х 18200 31600 24-30 16-20 4 5

Корова 17350 29000 нет 5

Свинья 14250 44850 нет 5

Собака III00 29400 6** 6

Кролик 9300 33300 23 3

Крыса 9300 30600 28,9 3

Овца 16850 13000 26000 35600 37000 26,6 4 7 х молекулярная масса сх-цепи Hp козы без углеводов; хх по 3% нейтральных гексоз и сиаловых кислют.

I) Smithies et al., 1966; 2)Connell et al. , 1966; 3) Cheftel ,Moretti , 1966; 4) Travis et al. , 1975; 5) Busby, Travis , 1978; 6)Kurosky et al. , 1979; 7) Marty , Moretti , 1976.

Hp2-2 при электрофорезе было высказано много предположений (Allison et al., 1959; Black et al. , 1970). Лишь Фуллер и др. (Fuller et al., 1973), выделившие пять последующих компонентов Нр2-1 и Нр2-2 и определившие их молекулярные массы и аминокислотные составы, смогли однозначно решить этот вопрос. Они делают вывод, что каждый полимер в Нр2-1 и Нр2-2 отличается от предыдущего на ар -димер. Аналогичный сно пяа3nuh

СНОСНО I СНО 105 I 173 190 219 п я I—lJi-1—I—|-1—|-1-1 С 6-цепь

1 23 46 50 80 £ 130 LS~SJ 'S'S'1 J I ? * ff I ■ С <* - цепь s 72 83 I rs-sn 72 83 „ I С 34 ¿1 1 C Л"ЦеПЬ

2*Lj«J±bS±±i«c »-WBb нет мет мет мет

Рис Л. Модель структуры молекулы Hpl-I человека. СНО указывают углеводы, связанные с АСН ( Kurosky et-ay980). результат получен Хупером и Пиакокком ( Hooper , Peacock , 1976) при исследовании субъединичного состава полимеров Нр2-1. Молекулу Нр2-2 можно записать как { и-? ) п , а Нр2-1 ( ol1 ji )2(о1й£ )п , где.п равно 3,4,5 и т.д. (Fuller et al., 1973; Hooper , Peacock , 1976).

Множественность молекулярных форм Нр2-1 и Нр2-2 человека оказалась обусловленной присутствием в их молекулах дуплици-рованной hp2 а. -цепи. Причины полимерности гаптоглобинов других видов млекопитающих пока не выяснены. Предположение, что в гаптоглобине козы она обусловлена наличием в его молекуле полипептида,подобного hp2<x , не подтверждается. Так, исследование триптического гидролизата л-цепи полимерного гап-тоглобина козы методом пептидных карт и сопоставление полученных результатов с данными аминокислотного анализа показали, что этот полипептид не содержит повторов, как hp2oi ( Travis et al., I975;Busby , Travis, 1978).

Взаимодействие гаптоглобина с гемоглобином

Специфическим свойством гаптоглобина является его способность связывать гемоглобин в комплекс. Это взаимодействие является быстрой и сложной реакцией между двумя высокоспецифическими белками, в результате которой образуется стабильный комплекс. Она сопровождается тушением флуоресценции ароматических аминокислот молекулы гаптоглобина группой гема о гемоглобина; эффективный радиус тушения около 42 A (Nagel , Gibson , 1967). Максимальное тушение флуоресценции достигается при молярном соотношении двух белков равном 1:1. Таким образом, при стехиометрическом связывании образуется комплекс, содержащий по одной молекуле гаптоглобина и гемоглобина ( Hagel,Gibson , 1967: Waks et al., 1968;Andrew , Pastewka , 1970; Peacock et al. , 1970; Emes et al. , 1976).

При избытке гаптоглобина в реакционном растворе присутствуют насыщенный комплекс ( Hba2 р 2~^Р°У2 ^ и полУкомплекс (Hb ар -Нр«2р2 ), а при избытке гемоглобина только насыщенный (Hamaguchi ,Sasazuki , 1967; Pastewka et al., 1975).

Гаптоглобины всех видов позвоночных, независимо от наличия s-s -связей между димерами, взаимодействуют с гемоглобином. Это указывает на то, что для образования Нр-Нь-комп-лекса не требуется предварительной диссоциации его молекулы до димеров. Вероятно, активные центры, ответственные за связывание гемоглобина, находятся на ее поверхности. В то же время, образование промежуточного комплекса Hbop -Нрсу2 позволяет предполагать, что реактивной единицей гемоглобина могут быть димеры. Доказательство последнего получено при кинетических исследованиях реакции. Оказалось, что скорость реакции взаимодействия двух белков не увеличивается линейно с ростом концентрации гемоглобина в растворе, а,наоборот, замедляется. Например, при ее увеличении в 32 раза константа скорости второго порядка уменьшается в пять раз ( Nagel , Gibson , 1967). Известно (Иржак, 1975), что при низкой концентрации молекула гемоглобина легко диссоциирует до диме-ров, при высокой - процент димеров в растворе понижается. Подтверждением того, что активными единицами гемоглобина являются димеры, служат также результаты, полученные при изучении взаимодействия гаптоглобина с его разными формами. Сравнительное исследование скорости образования комплекса оксигемоглобина и дезоксигемоглобина человека с гаптоглоби-ном показало, что она прямо пропорциональна их константам диссоциации. Так, константа диссоциации оксигемоглобина человека равна 2,42 х 10""%, цианметгемоглобина - 2,4хЮ-4М. Эти формы гемоглобина связываются с гаптоглобином в течение нескольких секунд, а для дезоксигемоглобина ( К ис = -7

1,68 х 10 М) реакция протекает несколько часов (Uagel , Gibson , 1971; Tsapies et.al. , 19786). Бенеш и flp.(Benesch et al. , 1976) нашли, что гемоглобин с поперечными ковалентными связями, введенными с помощью 2-нор-2-формилпири-■ доксаль-5-фосфата, взаимодействует с гаптоглобином подобно псевдодимерам, и только один его димер реагирует с одним связывающим центром гаптоглобина. Итак, гемоглобин, имеющий повышенную тенденцию к диссоциации до димеров, проявляет более высокое сродство к гаптоглобину. Следовательно,скорость образования комплекса Нр-Нь будет лимитироваться диссоциацией молекулы гемоглобина до димеров (Hagel ,Gibson , 1971; Benesch et.al. , I976;Tsapies et al. , 19786).

Теоретически молекула гемоглобина может дать три разных димера - л л , рр и ар (Antonini et al. , I967;Stephen et . al., 1976). Результаты исследования комплекса методами се-диментационного анализа, иммунохимии и по содержанию гема показали, что молекула гаптоглобина связывает и а- , и р-полипептид гемоглобина (Hamaguchi » 1969; Hamaguchi et al., 1971; Kawamura et.al. , 1972a,б). Например, насыщенный и промежуточный комплексы реагируют с антисыворотками как против целой молекулы гемоглобина, так и против антител к п -меркурипроизводным его субъединиц. Поскольку эти цепи не обладают перекрестной иммунореактивностью, то такая реакцион-носпособность с антителами к субъединицам подтверждает, что обе цепи молекулы гемоглобина входят в состав комплексов ( Kawamura et-al. , 1972 а,б). Причем л-полипептид гемоглобина проявляет высокое сродство к гаптоглобину, а р-цепь -очень низкое, если вообще взаимодействует с ним ( Nagel » Gibson, 1967, 1971; Chiancone et al. , 1968, Pavlicek , Jaenicke, 1971; Terpsta , Smith , 1976). Например, не найдено комплекса гаптоглобина с аномальным гемоглобином (НьН), молекула которого состоит из четырех р-цепей ( Hagel , Ranney, 1964). Подтверждением различной реакционноспособ-ности а- и р-субъединиц гемоглобина служат результаты, полученные при исследовании степени тушения флуоресценции гаптоглобина этими полипептидами. Так, в присутствии ct-цепи флуоресценция гаптоглобина снижается почти на 55%, а ji-цепи практически не изменяется ( Hagel , Gibson, 1967,

1971; Chiancone et al. > 1968). Однако при большом избытке

-цеш гемоглобина в реакционном растворе его комплекс с гаптоглобином (Hp-р ) все-таки обнаруживается, то есть в этом случае взаимодействие р-полипептида с гаптоглобином имеет место ( Cbiancone et al. , 1968; Nagel , Gibson ,1971). Возможной причиной низкой реакционноспособности ß-цепи гемоглобина может быть недоступность участка, ответственного за взаимодействие с гаптоглобином, так как иммобилизация увеличивает его реактивность и ß -сефароза эффективно реагирует с радиоиодированным гаптоглобином подобно л-сефа-розе. Кривые связывания в обоих случаях оказались идентичными и одинаково отличались от кривых для Нь-сефарозы; половина максимального количества гаптоглобина связывается лишь при десятикратном избытке л-сефарозы и ^-сефарозы, по сравнению с Hb-сефарозой. Иммобилизация, вероятно, вызывает изменение конформации ^-цепи гемоглобина, что делает доступным его активный участок, блокированный в растворимом препарате ( Kazim , Atassi , 1980).

Грир и др. ( Greer et al. , 1981) считают, что ß-полипептид гемоглобина в комплексе Hp-Hb находится в тесном контакте с ß-цепью гаптоглобина, так как они могут связываться (на 30-50%) перекрестно I,5-дифтор-2,4-динитробензи-лом. Этот реагент является очень маленькой и подвижной молекулой, два атома фтора, замещающиеся во время реакции, нао ходятся на расстоянии 4,8 А. Поэтому остатки в ß-цепи гаптоглобина и 6-полипептиде гемоглобина, взаимодействующие с г о ним, должны быть расположены в комплексе ближе, чем 5 А.

Данное расстояние немного больше минимального вандерваальсовского контактного расстояния между двумя несвязанными о атомами боковых цепей, равного примерно 3,5 А. Таким образом, нельзя говорить о принципиальной неспособности р-цепи гемоглобина связывать гаптоглобин, поскольку образование комплекса ^-Нр наблюдается для ^-сефарозы и протекает при очень большом молярном избытке растворимого препарата р -цепи.

Несмотря на то, что во взаимодействии двух белков участвуют только нековалентные связи, комплекс Нр-Нъ очень стабильный. Это указывает на широкую область контакта между ними. Для связывания гемоглобина с гаптоглобином необходима предварительная диссоциация его молекулы до димеров. При этом происходит изменение конформации молекулы гемоглобина, которое приводит к образованию активной формы или делает доступным гаптоглобинсвязывающее место. Следовательно, участок, ответственный за взаимодействие с гаптоглобином, может располагаться в контактной области между димерами гемоглобина. Действительно, контактная область в молекуле гемоглобина служит основной для образования Нр-Нъ -комплекса (Nagel , Gibson , 1967, I97I;Alfsen et al. , I970;Makinen et al. , 1972; Reichlin et al. , I974;Tsapics et al. , 1978a) .

Большое значение для стабильности комплекса и скорости реакции имеет также взаимодействие между а - и £ -цепями гемоглобина. Хотя субъединицы гемоглобина, каждая в отдельности, могут связываться с гаптоглобином, ар димеры проявляют более высокое сродство к нему. Например, тушение флуоресценции гаптоглобина искусственной смесью (а+р ) на 30% ниже, чем нативной молекулой гемоглобина, а а -цепью на 25% ниже, чем смесью ( & + р ). В комплексе Нр-Нь контакт между л - и р -полипептидами сохраняется и становится даже более прочным, чем в гемоглобине. Вероятно, под влиянием гаптоглобина появляется даже неблагоприятный контакт между модифицированными л- и р -цепями гемоглобина. Установлено, что п -хлормеркурипроизводные а - и £ -полипептидов не связываются вардимер, но они взаимодействуют с гаптоглобином и образуют комплекс. Гаптоглобин реагирует также и с выделенными глобиновыми цепями апогемоглобина (апоНъ ) л и f . При этом в реакционном растворе присутствует комплекс Нр-апоНь , тогда как cl- и / -цепи сами не образуют апогемоглобина ( Wake ,Beychock , 1974; Hwang ,Greer , 1980).

Молекула гаптоглобина содержит два участка, с каждым из которых связывается один димер гемоглобина ( Makinen et al., I972;Hever et al. , 1972). Эти гемоглобиневязываю-щие центры проявляют разную чувствительность к нагреванию. Один менее чувствителен к температуре и может быть восстановлен кислородом, второй после тепловой обработки при 56° претерпевает, очевидно, более существенные изменения и не регенерируется кислородом ( Hever , 1979, 1974, 1977).

У гаптоглобина человека главная роль в реакции взаимодействия с гемоглобином принадлежит р -цепи (Н-цепи)

Shim et al. , 1965; Gordon , Beam , 1966; Vallette et al., 1981). К такому выводу пришли на основании результатов исследования гемоглобиневязывающей способности выделенных л - и р -цепей гаптоглобина человека, а также по иммунологической реакции Нр-НЪ -комплекса с антисыворотками, полученными против а - и £ -полипептидов. Причем, р -цепи гаптоглобина могут связываться в комплекс с гемоглобином

J5 —НЪ , который реагирует с л-полипептидом с образованием полного комплекса Hp-Hb . По данным Осада и Добрижиска (Osada , Dobryszyska , 1978),этот полипептид проявляет 15% гемоглобиневязывающей способности по сравнению с исходной молекулой.

Много различных предположений выдвигалось относительно функциональных групп гаптоглобина и гемоглобина, участвующих в образовании Нр-НЬ -комплекса, например, реагирование аминогруппы гаптоглобина ( Shinoda , 1965), тирозиновых и триптофановых групп гемоглобина (Kalous , Pavlicek ,1966, Dobryszyska et al. , 19696; Dobryszyska , Вес , 1971). Использование метода химической модификации позволило окончательно выяснить этот вопрос. Так, никакого ингибирования реакции не происходит после модификации сульфгидрильных, амино- и карбоксильных групп в молекулах обоих белков ( Jaenicke»Pavlicek , 1970; Lockhart ,Smith , 1971; Chiao,Bezkorovainy , I972;Rogard ,Waks , 1977). Однако образование комплекса полностью ингибируется при тринитрофе-нилировании или ацетилировании N -ацетилимидазолом гидро-ксильных групп тирозиновых остатков гаптоглобина (Dobryszyska ,Вес , 1971;Dobryszyska ,Osada , 1973), а также при модификации имидазольных групп гистидиновых остатков гемоглобина (Jaenicke ,Pavlicek , 1970). Условия реакции модификации достаточно мягкие, и они не вызывают никаких нарушений пространственной конфигурации макромолекул. Поэтому потеря реакционноспособности не обусловлена какими-то кон-формационными изменениями в молекулах этих белков, а является результатом блокирования функциональных групп, ответственных за эту реакцию. Казим и Атасси (Kazim ,Attassi , 1981) нашли, что в л-цепи гемоглобина участок, ответственный за связывание гаптоглобина, расположен в области 121135 аминокислотных остатков. На этом участке имеется только один остаток гистидина, гис-122. Предполагается, что за связывание с гаптоглобином в «.-цепи гемоглобина ответственен гистидин-122.

Таким образом, комплекс Нр-Нb образуется в результате взаимодействия имидазольных групп гистидиновых остатков гемоглобина и функциональных групп тирозиновых остатков гаптоглобина.

Видовая специфичность в реакции взаимодействия гаптоглобина с гемоглобином

Свойство гаптоглобина связывать гемоглобин сохранилось в процессе длительной эволюции. Это взаимодействие наблюдается не только между белками одного и того же вида, но и разных видов позвоночных. Так, гаптоглобин человека, собаки и лошади связывается с гемоглобином лягушки, мыши, собаки, кролика, коровы, козы, овцы, обезьяны, человека, цыплят и лошади ( Андреева и др., 19736; Reichlin et al. , 1974). Однако гаптоглобины цыплят и черепахи проявляют внутривидовую специфичность и взаимодействуют только со своим гемоглобином, цыплят и черепах, соответственно ( Schwarites > Tondo > 1967; Musquera et al. , 1979).

Стехиометрический характер Hp-Hb -комплекса не зависит от видовой специфичности белков, участвующих в реакции. Например, девять насыщенных, перекрестно образованных комплексов гаптоглобина и гемоглобина человека, лошади и собаки содержат по одному молю каждого белка ( Андреева и др., 19736)

Образование комплекса гемоглобинами разных видов с гаптоглобином человека, лошади и собаки, видимо, обусловлено тем, что гаптоглобинсвязывающие области в их молекулах почти не отличаются. Этим участком может быть, вероятнее всего, контактная область между димерами гемоглобина, которая включает 10 остатков л-цепи и 9 остатков £ -цепи. Из всех исследованных гемоглобинов только в «.-цепи гемоглобина карпа изменились два из 10 контактных аминокислотных остатка ( Cohen et al. > 1973; Reichlin et al. > 1974).

Влияние видовой специфичности гемоглобина проявляется прежде всего в его сродстве к гаптоглобину. Оказывается, что гемоглобины овцы, козы, человека, 1фолика, цыплят и черепахи ассоциируют с гаптоглобином человека с константой ту т ассоциации (К&) больше, чем ЮМ , северных леопардовых лягушек с Ка равным 4,6хЮ^М~^, у гемоглобина карпа Ка еще меньше. Это выражается в полной неспособности гемоглобина карпа участвовать в реакции конкурентного замещения с гемо-глобинами других видов ( Reichlin et al. , 1974).

Гемоглобины различаются и по скорости образования Нр-НЪ-комплекса. Например, константа скорости связывания (Ксвяз) гаптоглобина с гемоглобином человека равна 0,93х10~%~^ с-^, кролика - 0,89 х I0-5M-1 с"1, овцы - 2,71 х Ю"^"1 с"1, черепахи - 0,18 х леопардовой лягушки

0,08 х I05MI с"1 ( Reichlin et al. , 1974). Такое отличие Ксвяз гемоглобинов разных видов с гаптоглобином человека, видимо, обусловлено разной скоростью диссоциации их молекул до димеров. Гемоглобины овцы и козы диссоциируют до димеров легче и связывают гаптоглобин с высокой скоростью, а гемоглобин черепахи медленнее распадается до димеров и имеет низкую скорость образования комплекса Нр-Нъ .

Предполагается, что гемоглобины разных видов связываются с гаптоглобином человека неидентичным способом. Это следует из данных, полученных при сравнении спектров дугового дихроизма комплексов Нр2-1 человека с гемоглобинами, содержащими железо в разном лигандном состоянии. Так, комплексы Нр2-1 с оксигемоглобином и дезоксигемоглобином человека, 1фолика и мыши имеют идентичные спектры кругового дихроизма, что указывает на их эквивалентные^ конформационные структуры. В то время как для комплекса гемоглобина крупного рогатого скота, лошади, морской свинки и крысы при потере лиганда спектр кругового дихроизма изменяется. Следовательно, в этом случае комплексы Нь02~Нр2-1 и Нь-Нр2-1 имеют разные валентные состояния гемового железа. Видовая специфичность гемоглобина выражается, очевидно, также в том, что структура комплекса гаптоглобина человека с гемоглобином крупного рогатого скота и лошади зависит от последовательности смешения реагентов, а с гемоглобином человека нет. ( Makinen et al. , 1972). Так, при молярном отношении гаптоглобина и гемоглобина,равном 2:1,в реакционном растворе наряду с насыщенным комплексом Нр-НЬ присутствует полукомплекс, структура которого в случае гемоглобина крупного рогатого скота зависит от молярного соотношения двух белков в начальный момент реакции. При добавлении гемоглобина к гаптоглобину образуется полукомплекс Hbg—»Hp, в котором молекула гаптоглобина связана с четырьмя димерами гемоглобина, а при обратном порядке смешения реагентов - полукомплекс Нр—»Hbg» где гаптоглобин связан с двумя тетраме-рами гемоглобина (схема I) (Pavlicek »Jaenicke , 1971; Yang »Przybylsky , 1973; Pastewka et al. , 1975). Подтверждением димерной структуры гемоглобина в полукомплексе Hb£—-Hp будет более низкое поглощение его раствора в видимой области, чем полукомплекса Нр—так как известно, ар I ар - Нр - ар I ар нь2 - Нр аз = Ир = Ы ар ПН ар

Нр — Нь2

Схема I. что интенсивность поглощения растворов тетрамеров гемоглобина значительно выше, чем его димеров ( ИсМсЗ-а et а1. , 1971).

Зависимость структуры комплекса от порядка смешения реагентов может быть связана с тем, что в первом случае в начальный момент реакции в растворе присутствует очень низкая концентрация гемоглобина, способствующая диссоциации его молекулы до димеров, которые и связываются с гаптогло-бином ( Ноп1оп е-Ь.а1. » 1971; исМ<1а е-Ь. а1. , 1971). Также возможно вторичное расщепление тетрамеров гемоглобина избытком гаптоглобина ( РауИсек , ^епл.ске , 1971). Во втором случае концентрация гемоглобина в реакционном растворе в начальный момент реакции достаточно высокая, что препятствует диссоциации его молекулы и они связываются с гапто-глобином в виде тетрамеров.

Эти полукомплексы различаются по своим характеристикам. Полукомплекс НЪ2—»Нр оказался более стабилен, чем Нр— Вероятно, димеры гемоглобина на поверхности молекулы гаптоглобина стабилизируют полукомплекс НЪ2—-Нр в такой степени, что диссоциация его почти невозможна ( Рау11сек > Ка1оив , 1973). Полукомплекс Нр—»Щ^ проявляет более высокую пероксидазную активность, чем Нь£—-Нр. Причиной тому может быть различие их структур, так как активности насыщенных ( НЬс^^ - ) и промежуточных (Нь<х^ -Нро^^) комплексов, отличающихся по составу, практически одинаковы. В комплексе Нр—НЬ^ могут осуществляться значительные контакты с димерами гемоглобина, связанных в виде тетрамеров, что оказывается важным для его пероксидазной активности ( Кауттига е* а1. , 19726; РауЦсек , Ка1оиБ , 1973).

Хотя структура комплекса гаптоглобина с гемоглобином человека не изменяется при разной последовательности смешения реагентов, физико-химические свойства его зависят от способа получения ( Мак:1пеп , Коп » 1972; Буогапкоуа > РауИсек , 1981).

Влияние видовой специфичности гаптоглобина на образование и свойства комплекса Нр-Нъ пока не исследовано, однако вполне вероятно, что оно имеет место. Как отмечалось выше, для гаптоглобина цыплят и черепахи характерна внутривидовая специфичность.

Взаимное влияние гаптоглобина и гемоглобина в комплексе

Свойства комплекса Нр-Нъ отличаются от характеристик исходных белков, возможно, из-за взаимного влияния молекул гемоглобина и гаптоглобина друг на друга. Так, комплекс Нр-Нь проявляет более высокое сродство к кислороду, чем гемоглобин. Это характерно как для промежуточного, так и для насыщенного комплекса даже при низком парциальном давлении кислорода. Следовательно, гаптоглобин оказывает существенное влияние на основное физиологическое свойство гемоглобина -способность связывать и переносить кислород. Увеличение сродства гемоглобина к кислороду может быть результат того, что после связывания с гаптоглобином исчезает как гомотроп-ное, так и гетеротропное взаимодействие гемоглобина и лиган-Да ( Antonini » 1967; Chiancone et. al. , 1973). Здесь, видимо, играет роль и то, что изолированные цепи гемоглобина проявляют в 20-30 раз большую активность в сродстве к кислороду, чем его тетрамеры ( Antonini et al. » 1972). Причем это не является следствием простой активации молекулы гемоглобина гаптоглобином, так как несмотря на значительно более высокую кислородевязывающую способность комплекса, он совсем не проявляет свойства переносить кислород и у него полностью отсутствует эффект Бора iuagel > Wittenberg ; 1965; Hamaguchi et al. » 1971). В общей форме эффект Бора рассматривается как влияние pH среды на взаимодействие атома железа в молекулах дыхательных пигментов с различными лигандами - 0g» СО, иО, зависимость окисления Ге2+ до Fe^+ от pH (Ир— жак, 1975). За эффект Бора в молекуле гемоглобина, в основном ответственны С-концевой гистидин ji -полипептида и НВ?-группа а-цепи. Отсутствие эффекта Бора у комплекса Нр-Нъ Макинен и Бун ( Makinen , Kon , 1971) объясняют подобием конформации гемоглобина, связанного с гаптоглобином, дезо-ксиконформации. Известно (Иржак, 1975), что в дезоксигемо-глобине рК концевого гистидина ^-цепи поднимается благодаря связыванию водорода с карбоксильной группой, и его вклад в эффект Бора минимален.

Гаптоглобин оказывает также стабилизирующее влияние на молекулу гемоглобина, который является кислотолабильным белком. Гемоглобин денатурирован на 50% уже при рН 4, а в составе комплекса Нр-Нъ в отсутствии избытка гаптоглобина, только при рН 2 (Кашашига е* а1. , 19726). Степень денатурации гемоглобина в комплексе при избытке гаптоглобина в реакционном растворе снижается. Например, в присутствии 30-1фат-ного избытка гаптоглобина даже при рН 2,8 она полностью от- -сутствует. Такое увеличение стабильности гемоглобина после связывания с гаптоглобином обусловлено, прежде всего, природой функциональных групп его молекулы, участвующих в образовании комплекса Нр-Нъ . Денатурация гемоглобина при кислых значениях рН включает выделение кислотосвязывающих групп, особенно гистидиновых остатков. Выше отмечалось, что имида-зольные группы гистидина в гемоглобине ответственны за взаимодействие с гаптоглобином. Следовательно, в комплексе кис-лотосвязывающие группы гемоглобина маскируются, что и препятствует денатурации ( Макз.пеп , Коп , 1971; 10шатига et а1», 19726; Бавагик! et а1. , 1973, 1974).

Увеличение стабильности гемоглобина может быть также следствием изменения конформации молекулы после связывания с гаптоглобином ( Кллпига е-Ь а1. , 1976).

Под влиянием гаптоглобина снижается чувствительность молекулы гемоглобина к действию протеаз: катепсина и пепсина при кислом рН, трипсина и папаина при нейтральном рН. Увеличение устойчивости гемоглобина против катепсина и пепсина, вероятно, результат стабилизирующего влияния гаптоглобина, так как уменьшается степень денатурации и не все пептидные связи в молекуле гемоглобина оказываются доступными для протеолиза этими ферментами. Причины снижения протеолитического действия трипсина обусловлены тем, что комплекс Нр-Нъ проявляет ингибирующее воздействие на этот энзим, а относительно папаина они пока не ясны ( Ба-Ъо е1; а1., 1973).

Гаптоглобин изменяет и пероксидазные свойства гемоглобина. При идентичной концентрации тема активность комплекса примерно в 10 раз выше, чем гемоглобина, особенно в области низких значение рН (Кактатига et а1. , 19726; База -гик1 et а1., 1973, 1974). Это оказалось характерным для гликопротеида не всех видов позвоночных. Гаптоглобин кур, хотя и связывает гемоглобин в комплекс, однако не изменяет его пероксидазной активности (Бе1егз et а1. , 1983). Одной из возможных причин увеличения активности при низких значениях рН, является стабилизация молекулы гемоглобина гап-тоглобином, которая приводит к увеличению его устойчивости против кислотной денатурации. Другим фактором может быть изменение после образования комплекса пространственной структуры белковой части молекулы гемоглобина, окружающей гем, и реактивности гема С ¥/акв et а1, , 1968; МакГпеп et а1. , 1972).

Образование комплекса Нр-Нъ приводит к увеличению прочности связи между железом и гистидином в молекуле гемоглобина, видимо, вследствие изменения конформации белкового окружения гемовой части ( РауИсек , Ка1оиа , 1973).

Комплекс Нр-апоНъ не связывает совсем гем, а при добавлении четырех эквивалентов гема к молекуле апоНъ происходит его восстановление до гемоглобина. Предполагается, что под влиянием гаптоглобина как бы "замораживается" конформация молекулы апогемоглобина ( Waks , ВеусЬоск , 1974).

Электронная структура простетической группы гема в комплексе Нр-Нь существенно отличается от структуры гема гемоглобина (Makinen > Kon, 1971). На изменение структуры гемоглобина указывают также результаты исследований Дво-ранковой и Павличека (övorankova »Pavlicek > 1981), которые установили, что в Нр-Нь -комплексе происходит переход его молекулы из R-структуры в ^-структуру.

Существенное влияние гаптоглобин оказывает и на иммуно-химические свойства гемоглобина (javid »Pettis > 1975). Так, комплементсвязывающая способность комплекса Нр-Нъо2 выше, чем оксигемоглобина, хотя последний служит антигеном. Однако это не является результатом появления новых "центров" антигенности в гемоглобине, несмотря на то, что образование комплекса сопровождается изменением конформации его молекулы ( Андреева и др., 1971; Cohen et al. , 1973; Tsunoo et. al., 1973a, 1974). Доказательством будет различная реакцион-носпособность комплекса и гемоглобина против антител, индуцированных как самим гемоглобином человека, так и его комплексами с гаптоглобином человека и кролика. Наиболее высокую комплементсвязывающую способность проявляет комплекс Hb -Нрчел, затем Hb -НрКР0-™1*, а самую низкую гемоглобин человека ( Cohen et al. 1973; Tsunoo et al. , 1973 a,6 ;1974; Sasazuki et al ., 1974). Это уменьшение комплементсвязываю-щей способности в ряду Нъ -Нрчел, Hb-Hp1^0"™1^, гемоглобин может быть обусловлено и, соответственно, объяснено тремя причинами: во-первых, молекулярным размером и формой молекулы. Как известно, молекулярная масса гемоглобина равна 68000, Hb-Hp^™1™ - 138000, а размер наиболее высокомолекулярного комплекса Нь-Нрчеловек достигает 700000. Во-вторых, различным числом антигенных валентностей, что, однако применимо лишь для объяснения различий в преципитируе-мости гемоглобина и комплекса Нр-Нь , образованного Нр2-1 и Нр2-2 человека, но не гаптоглобином ролика и Hpl-I. В-тре-тьих,, гаптоглобин может играть определенную роль в образовании большой решетки в реакции взаимодействия гемоглобина с антителами к нему и способствует уменьшению числа гидрофильных групп в молекуле гемоглобина и снижению его растворимости, что ведет к преципитации.

Связывание гемоглобина с гаптоглобином приводит также к увеличению его иммуногенности ( Sato et al. » 1973; Tsunoo et.al. , 1973 а,б, 1974). Установлено, что только при введении большого количества гемоглобина человека кроликам можно получить высокий титр антител. Это обусловлено слабой анти-генностью гемоглобина, которую трудно объяснить на основе структурных свойств. Возможными причинами могут быть, во-первых, гомология и структурное подобие гемоглобина кролика и человека, во-вторых, легкость его разрушения катепсинами. Как уже отмечалось, гемоглобин в составе комплекса Нр-Нь оказывается более устойчивым к действию протеаз. Вероятно, это является другой причиной более высокой иммуногенности гемоглобина, связанного в комплекс. Молекула гаптоглобина кролика не служит антигеном для них, даже если он связан с гемоглобином человека, полученные антитела не реагируют с ним ( Tsunoo et al. , 1974).

Влияние гемоглобина на структуру и свойства гаптоглобина изучено пока недостаточно. Однако можно предполагать, что связывание с гемоглобином вызывает изменение свойств и структуры гаптоглобина. Так, после образования комплекса Нр-НЪ некоторые антигенные детерминанты гаптоглобина блокируются ( Korngold , 1965; Ehnholm , 1969). Одновременно появляется новый детерминант ( Kino et al., 1980). На изменение конформации молекулы гаптоглобина под влиянием гемоглобина указывает следующее. Известно, что 20-40% гаптоглобина катаболизируется через комплекс Нр-НЪ, для которого на гепатоцитах найден специфический рецептор. Этот рецептор узнает только молекулу гаптоглобина, связанного в комплекс, т.е. в определенном конформационном состоянии, которое, видимо, достигается под влиянием гемоглобина ( Kino et al. , 1980; Lowe ,Ashwell , 1982).

Гаптоглобин - род природного антитела к гемоглобину.

Образование Hp-Hb-комплекса является одной из реакций между молекулами функционально отличных белков, которая имеет важное физиологическое значение. Другими примерами таких межмолекулярных белок-белковых взаимодействий могут быть связывание антител с антигеном, ферментов с ингибиторами белковой природы и т.д. Сравнительное исследование механизмов этих реакций, структуры и свойств комплексов позволяет обнаружить некоторое сходство между взаимодействием гаптоглобина с гемоглобином и реакцией связывания антител с антигеном ( Malchy , Dixon , 1970). Так, гемоглобин находится в основном в эритроцитах и лишь при гемолизе выделяется в плазму, где циркулирует гаптоглобин, и становится для него как бы чужеродным белком. Гаптоглобин, связывая гемоглобин, ведет себя подобно антителам к нему, т.е. гаптоглобин можно рассматривать как род природного антитела к гемоглобину.

Hpl-I и однокомпонентные гаптоглобины млекопитающих оказались также похожими по некоторым своим свойствам и структуре иммуноглобулину (3^ й). Молекула гаптоглобина подобно тетрамер и состоит из двух легких ( а ) и двух тяжелых (р ) цепей, а также бивалентна по отношению к гемоглобину (Ма1с]ау ,Б1хоп , 1970). Спектры поглощения комплексов гаптоглобина и антител с оксигемоглобином идентичны в Сорет и видимой области. Как гаптоглобин, так и антитело, связывая гемоглобин, увеличивают его сродство к кислороду (Баоагик! е1; а1, 1974).

Наряду со сходными признаками гаптоглобин и иммуноглобулин по ряду характеристик отличаются. Прежде всего разным расположением места их синтеза (печень и лимфоидные ткани, соответственно) и по некоторым физико-химическим константам для целых молекул и полипептидов (например, по изоэлектри-ческим точкам и относительным молекулярным массам легких цепей). Различаются также по некоторым свойствам их ассоциаты с гемоглобином. Комплекс антитела с оксигемоглобином (Ат-Нг^) после образования сразу выпадает в осадок, легко диссоциирует при кислом значении рН, а комплекс Нр-Нь02 остается в растворенном состоянии, стабилен в широком диапазоне рН. Хотя сродство к кислороду обоих комплексов выше, чем гемоглобина, однако большой трехмерный комплекс гемоглобина с антителом частично еще сохраняет способность переносить кислород, а для комплекса Нр-Нь02 это свойство совсем не характерно. Гаптоглобин увеличивает пероксидазную активность гемоглобина, а антитела нет (Заэагик! е-Ьа1. , 1973). Такое различие между двумя комплексами, вероятно, результат того, что влияние гаптоглобина на структурное окружение гема молекулы гемоглобина оказывается более эффективным, чем иммуноглобулина (Ната^сЪ! , 1969; Ната^сМ е« а1. , №1).

Гаптоглобин, связывая гемоглобин, стабилизирует ее молекулу и защищает от денатурации при кислых значениях рН, специфические антитела не проявляют такого влияния ( Тзипоо еЪ а1.,1974). Например, в комплексе Нр-Нь лишь при рН 2 наблюдается денатурация 50% гемоглобина, а в комплексе Ат-Нъ уже при рН 3,4 его денатурировано более 50%. Это обусловлено тем, что механизмы образования указанных комплексов отличаются. Гаптоглобин связывается с гемоглобином через функциональные группы его гистидиновых остатков, протонирование которых обычно приводит к денатурации, а специфические антитела при образовании комплекса не маскируют эти группы. В комплексе Нр-НъО^ димерная структура гемоглобина, а в комплексе Ат-Нъ0^ она тетрамерная.

Места связывания гаптоглобина и антител на молекуле гемоглобина различаются. Гаптоглобин, комплексируясь с гемоглобином, не препятствует его взаимодействию с антителами и даже увеличивает комплементсвязывающую способность, а антитела не проявляют такого влияния (СоЪеп et а1, 1973; Тзипоо е-Ь, а1., 19736, 1974).

Иммунохимические свойства гаптоглобина

Гаптоглобин служит примером того, что замена даже одной аминокислоты в молекуле вызывает изменение иммунохимических характеристик белка. Исследование кроссреактивности разных типов гаптоглобина человека с антителами к ним указало на возможность иммунохимической идентификации не только вариантов гаптоглобина, различающихся значительно по структуре, например, Нр1-1 и Нр2-2, но и Нр1р - I? от Нр1Б - ,

Гвсударстщц» библиотека с с с. р им. в. и. -Лепил» отличающихся лишь одной аминокислотой в а -цепи ( УаНе-^е et а1.» 1979).

В настоящее время в молекуле гаптоглобина человека найдено восемь антигенных определителей, которые подразделяются на четыре группы - А, В, С и Б .Не исключается также возможность существования других детерминант у нормальных типов гаптоглобина. Новые детерминанты могут быть найдены и в молекулах редких анормальных вариантов этого белка.

Антигенные детерминанты С являются специфическими для определенного генетического типа гаптоглобина и установлены лишь у полимерных вариантов Нр2-1 и Нр2-2. Детерминанты А, В и Б найдены в молекулах всех трех основных вариантов гаптоглобина человека. Они могут быть разделены на две подгруппы: а) определители, активные и после связывания с гемоглобином, б) гемоглобинчувствительные детерминанты, которые не определяются в комплексе Нр-НЬ . Определители А обнаруживаются на молекуле гаптоглобина и его Нр-Нъ-комплек-се, а В и Б оказались гемоглобинчувствительными. Например, детерминанты В определяются в Нр1-1, Нр2-1 и Нр2-2, но не найдены в комплексе Нр1-1-Нь . После связывания Нр2-1 и Нр2-2 с гемоглобином реакция с детерминантами группы В еще сохраняется, однако она значительно слабее. Это указывает на то, что гемоглобин блокирует эту группу антигенных определителей. В Нр1-1 центр, где расположены детерминанты В, закрывается гемоглобином полностью, а в Нр2-1 и Нр2-2 благодаря поверхностной конфигурации молекул этих вариантов гаптоглобина он блокируется лишь частично (Когг^оДД»1963; Е1т1]о1т , 1969).

Рассмотрим возможное месторасположение детерминант А,

В, С и ц на молекуле гаптоглобина человека. Так, р-цепь гаптоглобина человека содержит участок, ответственный за связывание гемоглобина. Вероятно, гемоглобинчувствительные детерминанты В и б располагаются на этом полипептиде, детерминанты А, не теряющие своей реакционноспособности при связывании гаптоглобина с гемоглобином - на а-цепи. Детерминанты С, найденные лишь в Нр2-1 и Нр2-2, находятся на пептиде «1, входящего в состав только йр2 а -цепи. Так как варианты гаптоглобина человека различаются структурой только с*.-цепи, можно предполагать, что антигенные детерминанты, специфические для НрВ?-1Р или НрБз-Бз , расположены на этом полипептиде (Лаухс! , 1967;Е1т1зо1га , 1969).

Джевид и Фурман иау1<1 , РиЪгтап, 1971) провели сравнительное исследование антигенной структуры гаптоглобинов человека и пяти других приматов и представили антигенную модель для них. Число детерминант в гаптоглобине приматов оказалось меньше, чем в гаптоглобине человека и находится в соответствии с эволюционным расстоянием приматов от человека. В Нр2-2 и Нр2-1 найдено 8 детерминант, Нр1-1 - 7, гаптоглобине шимпанзе - 6, гиббона - 5, резуса - 3, бабуина - 2. Причем, в молекулах гаптоглобина всех исследованных приматов присутствуют гемоглобинчувствительные детерминанты.

Антигенные модели гаптоглобинов других видов позвоночных пока не установлены.

Место связывания антител на молекуле гаптоглобина отличается от центра, ответственного за образование Нр-Нь-комп-лекса. Однако эти два участка перекрываются в области содержания триптофана (Ка1;п1к , БоЬгузгузка , 1978).

Метаболизм гаптоглобина

Синтез гаптоглобина происходит в основном в печени, а именно, в центральных отделах его долек ( Alper et al. » 1965; Успенская, 1970; Волкова и др., 1977). В бесклеточной системе печени крысы протекает биосинтез этого гликопротеи-да. Установлено, что в присутствии фосфоенолпирувата и пи-руваткиназы включение меченных аминокислот в молекулу гаптоглобина увеличивается, а АТФ и Mg^+ - уменьшается. Включение метки в гаптоглобин также выше при использовании клеток печени от животных с воспалительной реакцией (bïoretti » Allias , 1971).

Биосинтез гаптоглобина возможен также в тканях, входящих в состав ретикулоэндотелиальной системы ^селезенка, лимфатические узлы, тимус) и связанных с процессами метаболизма гемоглобина. Гаптоглобин, синтезированный в этих тканях, осаждается там и выделяется из них только тогда, когда снижается его уровень в плазме (Wada et al. , 1970).

Интенсивность биосинтеза гликопротеида зависит от множества факторов. Например, гидрокортизон и инсулин ускоряют синтез гаптоглобина в системе клеток печени in vitro (Hooper et al., 1981). Модуляторами биосинтеза гаптоглобина могут быть также вещества, которые участвуют в локальных реакциях воспаления. Так, после инъекции турпентина крысам уровень гликопротеида в крови увеличивается в 10 раз и составляет 1% общего количества белка цитозоля, в то время как у необработанных животных - 0,1%. Такое изменение концентрации гаптоглобина в плазме обусловлено стимуляцией гепа-тического синтеза гликопротеида и быстрым транспортом его из клеток печени. Максимальная стимуляция биосинтеза гапто-глобина наблюдается через 4 часа после инъекции турпентина, и в течение 20-72 часов сохраняется высокий уровень белка в плазме ÍBaglia et al., 1981).

Концентрация гаптоглобина в крови изменяется также при наличии патологии (Heilman , 1977), введении веществ, вызывающих активацию макрофагов (Palmer ,Schneler , 1976; Timsit et al. » 1978), различных стероидов (Barbosa et al., 1971;Gordon »Limaos , 1979), эндотоксинов (Knynszyn-ski ,Burger , I97I;Kampschmidt , Upchurch , 1974), после облучения (Поспелова, Тууль, 1968; Hayakawa et al. , 1976). Это связано с изменением обменных процессов в организме, что влияет на скорость биосинтеза гаптоглобина или на скорость его катаболизма. В каждом конкретном случае имеются свои стимуляторы. Например, предполагается, что в увеличении уровня гаптоглобина после облучения важную роль играет надпочечная активность i. Hayakawa et al. , 1976). Низкая концентрация гаптоглобина при гемолитических болезнях -результат ускорения его утилизации благодаря образованию комплекса Нр-НЬ (Herschko , 1975; Быстрова, 1976). Уровень гаптоглобина в плазме после инфузии гемоглобина возвращается до половинного начального значения в течение 36 часов, до исходного - через 6-10 дней ( Noyes , Garby , 1967).

Буроски и др. ( Kurosky et al. , 1980) предположили, что гаптоглобин, подобно белкам класса сериновых протеаз, синтезируется в виде предшественника, который затем превращается в активную форму. Исследования биосинтеза гаптоглобина в бесклеточной системе, содержащей кроличьи ретикуло-циты, с использованием препаратов м-РНК гаптоглобина из печени крысы ( Haugen et al.» 1981) или кролика (chow et al,, 1983) подтверждают это предположение. Во всех случаях обнаружен лишь один полипептид, для м-РНК гаптоглобина крысы с молекулярной массой 38000, а кролика - 41000. Он реагировал с антисыворотками,полученными против а - и ^-цепей и нативного гаптоглобина. Расщепление полипептида трипсином или бромцианом приводило к образованию пептидов, которые связывались с антителами либо к а-, либо к J3-полипептиду. Последовательный анализ продуктов трансляции показал, что в полипептиде имеется "препептид", состоящий из 18 аминокислот, вслед за ним сразу следует а-цепь ( chow et al. , 1983). Итак, гаптоглобин синтезируется in ViV0 в виде полипептида-предшественника, содержащего "препептид" из 18 аминокислот. Этот одноцепочный предшественник подвергается затем пострансляционному протеолизу, в результате которого отщепляется "препептид" и образуются а- и ^-цепи нативного гаптоглобина.

Как распределяется гликопротеид, синтезированный в организме, в разных отделах, органах и тканях, пока не ясно. Кавамура и др. (Kawamura et.al. , 1979) установили, что гаптоглобин, меченный i I25( Hp-г125), введенный в ушную вену кроликов, обнаруживается во внутри- и внеклеточном пространствах; равновесие между этими отделами достигается через 24 часа после инъекции белка. Причем, для разных титрс пов гаптоглобина найдены различные значения уровня Нр-1 тор; в этих отделах. Так, после инъекции -Hpl-I во внесо-судистом пространстве находят 59,8% общей радиоактивности,

TOR а в случае Нр2-2 только 37,1$.При одновременном введении Hpl-I и Нр2-2, меченных противоположными изотопами

I и I , во внесосудистом пространстве во время равновесия нашли 54,1% и 34,8% общей активности каждого изотопа, соответственно. Метаболическое поведение, полупериод жизни, конфигурация кривых плазмы и тела для гаптоглобинов, меченных I и1 131 подобны и поэтому такое различие в распределении, видимо, обусловлено свойствами разных вариантов гаптоглобина. Белок во внесосудистом пространстве появляется прежде всего благодаря капиллярной проницаемости молекул, которая зависит в основном от их размеров. Молекулярные массы Нр2-2 значительно выше, чем Hpl-I. Следовательно, более высокий процент Hpl-I во внесосудистом пространстве может быть из-за меньших размеров его молекулы.

Исследование разных внеклеточных жидкостей показало, что гаптоглобин присутствует в основном в сыворотке крови, у некоторых видов млекопитающих он обнаружен также в молозиве, в моче ( Richter , 1974),в виде Нр-НЪ-комплекса, в желчи (Hinton et.al. , 1980).

В настоящее время известны два пути, по которым протекает катаболизм гаптоглобина. Во-первых, через Нр-Нь-комп-лекс. Этим способом утилизируется 20-40% гликопротеида, который связывается гемоглобином, выделяемым во время нормального внутрисосудистого гемолиза. Связывание гаптоглобина с гемоглобином ускоряет его утилизацию, так как полупериод жизни комплекса Нр-НЪ значительно меньше, чем гаптоглобина. Для Hpl-I человека он равен 2,3 дня, Нр2-2 - 2,4 дня (Kawamura et al. , 1979), гаптоглобина свиньи - 5,5 дней, кролика - 3,5 дней, собаки - 2,4 дня, крысы - 19 часов (Dobryszyska et al. , 1979). Для комплексов Hp-Hb гаптоглобина человека полупериод жизни равен 9-30 минут, кролика - 30 минут, крысы - 25 минут ( Wada et al. , 1970; Kawamura et alJ979). При концентрации комплекса 0,5-1,5 мг на 100 г веса тела скорость его удаления из циркуляции постоянна. После увеличения уровня комплекса выше этого предела она замедляется ( Kino et-al. , 1980).

Комплекс Hp-Hb аккумулируется в основном в печени, а именно, в его паренхимальных клетках (Bissel et al. , 1972; Kino et al. , 1980; Ohsiro , Nakajima , 1981). Местом аккумуляции и разрушения комплекса у млекопитающих некоторые исследователи указывают клетки Купфера ( Murray et al. , 1961; Engler et al. , 1967) с постепенным переходом в гепа-тоциты ( Wada et. al. , 1970). Добрижиска и др. ( Dobrys -zyska et al. 1982) предполагают, что у цыплят гаптоглобин катаболизируется частично в гепатоцитах, частично в клетках Купфера.

На мембранах гепатоцитов печени найден рецептор, специфический для комплекса Hp-Hb. Предполагается, что он узнает молекулу гаптоглобина в определенном конформационном состоянии, которое достигается лишь при связывании его с гемоглобином (Kino et.al. , 1980;Lowe ,Ashwell , 1982). Этот рецептор отличается от тех, которые специфичны для отдельных углеводных остатков и углеводы не играют никакой роли ни в образовании, ни в определении, ни в связывании Нр-Нъ- комплекса с ним. В экстрактах ацетонового порошка печени определен эндогенный ингибитор, который, очевидно, участвует в быстрой диссоциации комплекса Hp-Hb от рецептора и играет регуляторную роль в его катаболизме (Lowe ,Ashwell , 1982).

Второй путь - это общий способ катаболизма гликопротеидов плазмы, механизм которого описан Ошвелем и Морелем (Ashwell , Morell , 1974). По нему утилизируется оставшийся после катаболизма по первому пути гаптоглобин. Вначале происходит отщепление сиаловой кислоты от молекулы гаптоглобина. Асиалогаптоглобин обладает высоким сродством к специфическому рецептору на мембранах гепатоцитов и удаляется быстро из циркуляции. Оказалось, что у различных позвоночных эти рецепторы специфичны к разным углеводам (Dobryszy-ska et al. , 1982). У млекопитающих это в основном рецептор для галактозы, у цыплят - агалактогаптоглобина, у лягушек одинаковое сродство гепатических рецепторов к производным гаптоглобина с концевой галактозой, маннозой, N -ацетилглюкозамином, у рыб - к асиалогалактопроизводным гаптоглобина. В гаптоглобине человека деасиалирование открывает невосстановленную галактозу, которая становится концевой и обеспечивает связывание молекулы белка с гепатоцитами. Установлено, что с I г печени связывается 36 pmol асиалогап-тоглобина (Hooper et al. , 1981).

Гемоглобин препятствует взаимодействию асиалогаптогло-бина с рецепторами на гепатоцитах. Вероятно, в присутствии гемоглобина происходят структурные перестройки молекулы асиалогаптоглобина или появляются стерические трудности. Все это приводит к маскированию концевой галактозы, ответственной за узнавание и связывание асиалогаптоглобина специфическим рецептором (Peg©1, et al. s 1981).

Исходя из вышесказанного, можно утверждать, что в процессе катаболизма гаптоглобина участвуют два рода рецепторов, находящихся на мембранах паренхимальных клеток печени: специфический рецептор для комплекса Hp-Hb(Kino et al. »

1980) и рецептор, ответственный за узнавание и связывание асиалогаптоглобина. У человека это, видимо, галактозоспеци-фический рецептор (Kawasaki ,Ashwell , 1976).

Механизм деградации гаптоглобина в обоих случаях еще до конца не выяснен. Известно (Успенская, 1970) лишь, что комплекс Нр-Нъ является субстратом фермента гемальфаметенилокси-геназы. Возможно, что важную роль в катаболизме гаптоглобина играют лизосомальные ферменты. Так, после инкубации с препаратами тритосомы печени на полиакриламидном геле не видны фракции белка. Это указывает на расщепление его молекулы до низкомолекулярных продуктов ( Rostworowska , 1978). Лимет и др. (Limet et al. , 1982) нашли, что комплекс Нр-Нь будет в большей степени обнаруживаться в пределах ли-зосомы и лишь небольшое его количество находят в желчи. Причем скорость деградации гликопротеида не зависит от его чувствительности к протеолизу, а основное значение имеет скорость подхода его к месту катаболизма ( Rostworowska , 1978).

Роль гаптоглобина в организме.

Функциональное значение гаптоглобина в организме пока до конца не установлено. В настоящее время считается, что он активно участвует в защитных реакциях организма. Например, связывая гемоглобин, гаптоглобин предотвращает "утечку" ге-минового железа из организма, так как из-за большой молекулярной массы комплекс не проходит через фильтры почечных клубочков. При этом роль гаптоглобина не сводится к простому механическому связыванию гемоглобина. Естественный путь утилизации гемопротеида требует этапа образования комплекса

Нр-Нь , который служит одним из физиологических субстратов гемальфаметенилоксигеназы - фермента катаболизма гемоглобина. Связывая гемоглобин в комплекс, гаптоглобин тем самым обеспечивает возможность быстрого ферментативного разрушения гема в конечном счете до желчных пигментов, которые выводятся из организма, а железо геминовых групп вновь поступает в метаболический фонд и используется при синтезе новых молекул гемоглобина (негзсйко , 1975; Быстрова, 1976).

Итак, гаптоглобин участвует в процессах катаболизма гемоглобина и гема. Кроме того, гаптоглобин влияет на межорганное распределение гемоглобина, свободный гемоглобин обнаруживается в почках, а комплекс Нр-Нъ в печени ( Ака1чуа е-Ь.а1. , 1976).

Исследования последних лет показывают, что роль гапто-глобина в защитных реакциях организма не ограничивается лишь участием в сохранении железа гемоглобина. Этот глико-протеид оказывается в числе компонентов, обеспечивающих протекание и других важных для организма процессов. Например, комплекс Нр-НЪ проявляет стимулирующий эффект на биосинтез коллагена, основного белка соединительной ткани С УШагб. е1;.а1., 1974). Гаптоглобин способен ингибировать реакцию гемагглютинации вируса гриппа (БоЪгузгузка ,Ыз<жзка , 1966;ь1зошзка »БоЪгузгузка , 1967). Он является также одним из эндогенных ингибиторов простагландинсинтетазного ферментативного комплекса,и влияние его направлено в основном на циклооксигеназный компонент. Таким образом, гаптоглобин может регулировать количество или пропорции эндогенных продуктов простагландинсинтетазного комплекса ( БеЬу е-Ъ.а!., 1978; Баее«! е* а1., 1978;Кеп<1а11 et а1. , 1979,

1980). Лукас и другие { Lucas et al., 1980) указывают на взаимосвязь концентрации гаптоглобина и простагландина в организме и возможность применения этого природного продукта крови для уменьшения эндогенного синтеза гормона.

Итон и др. (Eaton et al. , 1982) предположили, что гап-тоглобин проявляет бактериостатические свойства, поскольку он препятствует утилизации железа гемоглобина разными патогенными бактериями и тем самым ингибирует их рост и размножение.

Гаптоглобин входит в состав белков "активной фазы",концентрация его в норме постоянная, а при патологиях изменяется (Heilman , 1977). Так, при атеросклерозе, гемолитических анемиях, интраваскулярном гемолизе, гепатоцеллюлярных расстройствах уровень гаптоглобина в сыворотке крови снижается вплоть до нерегистрируемых величин (Турченко и др., 1970; Гугешашвили и др., I972;Heilman , 1977; Белостоцкий и др., 1980). В таких же случаях, как воспалительные процессы, травмы, инфекционные заболевания, лейкемия, ревматизм, ишемическая болезнь сердца, различные опухоли, лучевая болезнь и т.д.,наблюдается резкое возрастание его уровня (Поспелова, Тууль, 1968; Родионов и др., 1969, 1970; Мель-ничук, 1971; Прохуровская, Мовшович, 1972; Васыгова, Лорие, 1974; Волкова и др., 1977; Child et.al. , 1977;Heilman , 1977).

Причиной роста или уменьшения количества гаптоглобина в сыворотке крови, вероятно, будет изменение скорости его биосинтеза или катаболизма. Например, резкое снижение концентрации гаптоглобина при гемолитических анемиях происходит из-за ускорения его утилизации, так как в сыворотке повышается концентрация гемоглобина, который быстро связывает гаптоглобин в комплекс и выводит из циркуляции. Как отмечали выше,комплекс Нр-НЬ утилизируется намного быстрее, чем свободный гликопротеид. Обычно в норме около половины циркулирующего гаптоглобина восстанавливается ежедневно и более половины этого восстановленного количества связано с нормальным катаболизмом гемоглобина плазмы. У человека в норме гаптоглобин способен связывать от 50 до 150 мг гемоглобина на 100 мл сыворотки (Herschko , 1975). В гемолитическом же состоянии фракционный катаболизм этого белка увеличивается благодаря высокой концентрации гемоглобина, выделяемого в плазму. Однако абсолютное количество гаптоглобина, катаболизируемого в день, не изменяется значительно, так как скорость синтеза его ограничена (Herschko , 1975; Быстрова, 1976). Поэтому при гемолитических процессах в сыворотке наблюдается снижение концентрации гликопротеида вплоть до нерегистрируемых величин и увеличение содержания комплекса Hp-Hb . Следовательно, по количеству свободного и связанного в комплекс гаптоглобина можно определить степень гемолиза. По уровню гаптоглобина можно также количественно охарактеризовать процесс разрушения эритроцитов, поскольку существует корреляция между продолжительностью жизни эритроцитов и концентрацией этого белка. Например, в случаях, когда средняя продолжительность жизни эритроцитов составляет около 45 дней (нормально 120 дней),отмечается агаптогло-бинемия {Nyman et.al. , 1959; Баранова, Галстян, 1980). Таким образом, содержание гаптоглобина в крови может служить показателем гемолитического процесса. Уровень его является также важным тестом при процессах переливания крови, снижение концентрации гаптоглобина до 50-70 мг на 100 мл сыворотки служит явным признаком гемолитического криза.

В последние годы проводятся обширные исследования эффективности гаптоглобинотерапии при гемолитических анемиях. Установлено, что после использования терапии гаптоглобином в 80,4% случаев у человека и 100% у кроликов предотвращается гемоглобинурия (ohshirо et- al., 1978, 1979, 1980). Введение в кровяное русло гаптоглобина предотвращает выделение через почки части гемоглобина, поступившего в плазму при . гемолизе эритроцитов, тем самым предохраняется нарушение функции почек. При редких повторениях процесса разрушения эритроцитов для больных гемолитической анемией гаптоглобино-терапия может оказаться полезной. Однако при многократно повторяющемся процессе разрушения эритроцитов in vivo будет происходить значительное накопление железа в органах (ге-мосидероз), что может привести к летальному исходу.

Снижение уровня гаптоглобина при гепатоцеллюлярных расстройствах может быть вызвано двумя причинами. Во-первых, вследствие повреждения клеток печени, так как местом синтеза гаптоглобина является именно этот орган, и найдена прямая корреляция между степенью повреждения клеток печени и его концентрацией (Замчий, Жеребцов, 1971; Heilman , 1977), второй причиной может быть гемолитический процесс, часто сопровождающий заболевания печени. Полупериод распада гаптоглобина значительно короче, чем других сывороточных белков печеночного происхождения, поэтому содержание его в крови наиболее динамично отражает функциональное состояние печени и имеет неоспоримое значение в диагностике (Турчен-ко и др., 1970).

Наиболее вероятной причиной увеличения уровня гаптогло-бина при патологиях будет стимуляция его синтеза различными гуморальными веществами, освобождаемыми при этом. Например, серомукоидные белки, выделяемые из поврежденных тканей при инфекциях и воспалениях влияют на биосинтез гли-копротеида ( Hayakawa et al. , 1974, 1976; Heilman , 1977). Активатором синтеза многих белков, в том числе и гаптогло-бина, может быть также эндогенный лейкоцитарный медиатор (ЛЭМ) ( Karopschmidt , Upchurch , 1974). Так, у врыс инъекция ЛЭМ приводит к увеличению концентрации гаптоглобина, степень которого зависит от дозы введенного медиатора. Предполагается, что влияние ЛЭМ на синтез белков носит косвенный характер. Он играет как бы промежуточную роль, вызывая образование и выделение гуморальных факторов, являющихся истинными активаторами процессов биосинтеза этих биологических макромолекул.

Подобное косвенное влияние, видимо, оказывают также БЦЖ и силикагель, инъекция которых увеличивает концентрацию гаптоглобина в сыворотке. Введение этих веществ обычно стимулирует активность макрофагов,и можно предположить прямую зависимость между уровнем гаптоглобина и фагоцитарной активностью. Такая корреляция, вероятно»связана с тем, что медиаторы, освобождаемые в процессе фагоцитоза, являются веществами, способными контролировать уровень гаптоглобина (Palmer , Schneler , 1976).

Какое значение имеет увеличение концентрации гаптоглобина при патологиях, какую активность проявляет гликопро-теид, механизм участия гаптоглобина в этих процессах, пока не установлены. Предполагается, что гаптоглобин может проявлять иммунорегуляторную активность. Например, при пересадке чужеродной ткани мышам в 1фови реципиентов уже через две недели после операции наблюдается резкое увеличение уровня гаптоглобина. Вариации в количестве гаптоглоби-на могут зависеть от продолжительности "вживления" чужеродной ткани. Это указывает на возможную иммунорегуляторную активность гаптоглобина (Hayakav/a et al. , 1976).

Взаимосвязь между гаптоглобином и иммунным статусом организма предполагается и Прокопом, Келлером, Монтагом (Prokop »Köhler > 1977а; Montag > 1982) на основании открытого ими гаптоглобин-стрептококкового отношения. Оказывается, что сыворотка 1фови человека проявляет агглютинирующую активность против стрептококков группы g , несущих Т-4 антигены ( prokop > Köhler , 1977а, Köhler et al. , 1977;Köhler ,Prokop , 1978;Montag , 1982). Наиболее сильная агглютинирующая активность наблюдается у сывороток, содержащих Нр2-2 и Нр2-1 (продукты гена Нр2а), а сыворотки с Hpl-I такой активности не проявляли, а наоборот, выступали как блокирующие антитела ( Köhler 5 Prokop , 1977; Montag et al. , 1979). Позже было установлено, что агглютинирующим веществом является гаптоглобин ( prokop , Köhler , 1978а; Montag et al. , 1979). Такой же диморфизм по способности агглютинировать стрептококки, несущие Т-4 антигены, проявляют и гаптоглобины животных ( Prokop et al. , 1977; Köhler et .al. , 1978; Meier et al. , 1980). Добавление гемоглобина не изменяет агглютинирующей активности гаптоглобина ( Prokop , Köhler , 1978а). На основании этих исследований было предположено, что гаптоглобин имеет определенное значение для иммунного статуса организма ( Montag ,1982).

Причем вероятно, существует взаимосвязь между уровнем иммунитета организма и типами гаптоглобина, так как индивиды с разными вариантами этого белка различаются по своему иммунитету. Найдено, что лица с геном Нр^а проявляют большой иммунитет после стандартной иммунизации против тифа, чем

1а индивиды, несущие ген Hp (Hirayama et al. , 1975; Kaden et al., 1979). Кроме того, обнаружена взаимосвязь между устойчивостью организма к заболеваниям и типами гаптоглобина. Например, у лиц с Hpl-I в 3-4 раза чаще встречается лейкемия, чем с Нр2-2 ( Peacock, et al. , 1966). Подобная зависимость установлена также и для вирусной инфекции и ряда заболеваний печени. Оказалось, что в группе больных с хроническим гепатитом и циррозом печени частота встречаемости Hpl-I на 10% выше, чем в нормальной популяции. Риск заболеть циррозом печени для лиц с Нр2-2 в 5-9 раз ниже, чем с Hpl-I. Эпидемиологические и морфологические исследования различных популяций людей показали, что безалкогольный цирроз печени чаще встречается у жителей Африки и Средней Азии, где основной тип гаптоглобина - Hpl-I, чем у народностей Европы и Америки, где распространен Нр2-2 ( Hirayama et al. , 1975; Schimmelpfenning et al., 1979). Логинов и др. (1980) считают, что такую взаимосвязь между типами гаптоглобина и развитием хронических заболеваний не следует искать в плане этиологии болезни печени. Возможно, что она обусловлена ролью гаптоглобина в иммунных реакциях организма. Так, Прокоп и Келлер ( Prokop , Köhler , 19786) предполагают, что гаптоглобин может проявлять антителоподобную функцию.

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что гаптоглобин является очень интересным и подходящим объектом для изучения значения и роли белков, отличных от иммуноглобулинов, в защитных реакциях организма, выяснения механизма физиологически важных белок-белковых взаимодействий, исследований в области молекулярной патологии, клинической биохимии, биоорганической химии. Однако хорошо изучены структура и свойства лишь гаптоглобина человека. Сведения, имеющиеся по этому гликопротеиду других видов позвоночных, в том числе и сельскохозяйственных животных, позволяли дать только частичную характеристику их молекул. В то же время сопоставление этих данных указывает на ви-доспецифические отличия гаптоглобина различных позвоночных. Что касается функции его в организме, то этот вопрос все еще остается открытым.

Целью данной работы явилось исследование структуры, свойств и функции гаптоглобина овцы, изучение становления этого белка в ее онтогенезе. Полученные данные позволят выяснить, в какие периоды развития животного гаптоглобин входит в состав сывороточных белков, дать его структурно-функциональную характеристику. К моменту начала работы не было точно известно:присутствует ли гаптоглобин в сыворотке 1фови овец в норме. Предполагалось, что он появляется там лишь при воспалительных процессах ( Goodger > 1972; jarret , 1972).

59

ГЛАВА П.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основным материалом исследований служила сыворотка крови овец. В работе проанализировано сывороток крови от 1200 голов овец разных пород, 439 плодов каракульских овец 130-140 дневного возраста, 30 плодов курдючных овец эдиль-баевского типа 45-120 дневного возраста, 26 плодов овец 1фоссбредного типа 60-130 дневного возраста.

Сыворотка крови.

Кровь отбирали из яремной вены овец и инкубировали при 37°С 2-3 часа, затем отделяли сыворотку от тромба и центрифугировали ее при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученную сыворотку хранили при 4°С неделю или при - Ю°С два месяца. Замороженные сыворотки после оттаивания сразу использовали.

Для выделения гаптоглобина использовали сыворотку 1фови овец, полученную во время забоя животных.

Гемоглобин.

Кровь отбирали из яремной вены овцы в пробирки, содержащие раствор цитрата натрия, центрифугировали 1р.мин при., 3000 об/мин. Осевшие эритроциты отделяли от плазмы и промывали 5-6 раз физиологическим раствором. Затем к эритроцитам добавляли дистилированную воду и оставляли на ночь при комнатной температуре для лизиса. Через 20 часов раствор центрифугировали (3000 об/мин, 30 мин), строму отделяли и определяли концентрацию раствора гемоглобина.

Аналогично получали растворы гемоглобина из свежей крови лошади, коровы, мыши, человека, плодов и ягнят овец.

Растворы гемоглобина хранили при 4°С месяц или при

-Ю°С 3-4 месяца.

Определение концентрации гемоглобина.

Цианметгемоглобиновый метод ( Старостин, Черковский, 1961). К 0,5 мл раствора гемоглобина добавляли 5 мл трансформационного раствора, через 30 минут измеряли (трижды) поглощение смеси при 540 нм на - спектрофотометре против трансформационного раствора. Концентрацию гемоглобина рассчитывали по формуле: {'652 ' а ' А5Ч0 кНь — йгде 1,652 - единица пересчета из мМолей в %, а -степень разведения, А5Ч0 - поглощение при 540 нм, II - фактор поглощения для цианметгемоглобина.

Трансформационный раствор - I г ЯвНСЮ^ , 0,05 г КСИГ, 0,3 г К^[Ре(С1Т)6] растворяли в дистилированной воде, после полного растворения общий объем доводили до 1000 мл водой.

Спектрофотометрический метод. Концентрацию раствора гемоглобина определяли по поглощению при 540 нм, используя коэффициент экстинции А = 9,061 ( Оетеп et а1. ,1960).

Электрофорез в полиакриламидном геле (Маурер, 1971).

Аналитический электрофорез в полиакриламидном геле проводили на приборе фирмы "Реанал", Венгрия, для вертикального электрофореза.

Все реактивы были фирмы "Реанал", Венгрия.

Электрофорез проводили в 1% полиакриламидном геле в следующих условиях: а) гелевый буфер - 0,38М трис-НС1 , рН 8,9; электродный буфер - 0,05 М трис - 0,035 М глицин, рН 8,3; 4 ма на I трубку геля; 4°С; б) гелевый буфер - 0,07 М трис-НС1, рН 7,9; электродный буфер - 0,0082 М трис - 0,03 М барбитуровая кислота, рН 7,1; 4 ма на I трубку геля; 18°С.

В качестве метки использовали бромфеноловый синий.

Проявление электрофореграмм проводили следующими растворами красителей: а) для окрашивания на белки - 0,1% раствор амидочерного 10В в 10% уксусной кислоте; 0,1% раствор кумасси голубого в 12,5% трихлоруксусной кислоте; б) для специфического окрашивания Нр-Нъ-комплекса использовали 1% раствор бензидина в 10% уксусной кислоте, к которому перед использованием добавляли перекись водорода (на 100 мл раствора I мл 30% перекиси водорода).

Определение вариантов гаптоглобина в сыворотке крови овец.

Тип гаптоглобина в сыворотке крови овец определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле.

К 0,1 мл сыворотки добавляли 0,03 мл 0,05 мМ раствора метНъ . Смесь инкубировали 30 минут при 37°С, затем подвергали электрофорезу в 7% полиакриламидном геле рН 8,3. После окончания электрофореза гели удаляли из трубочек и помещали в пробирки, содержащие 1% раствор бензидина в 1С% уксусной кислоте и 0,03% перекись водорода. Через 10 минут на гелях проявляются синие полосы, это гемсодержащие компоненты: комплекс Нр-метНЪ и метгемоглобин (рис.9, стр. 110). Интенсивность окраски быстро падает. Для стабилизации окраски гели промывали несколько раз дистилированной водой, затем погружали в пробирки, содержащие 0,001% раствор амидочерного на I час. После такой обработки окраска гелей сохраняется долго (10-12 месяцев) ( Singh , 1967).

Исследование частоты встречаемости типов гаптоглобина.

Для определения частоты встречаемости вариантов гаптоглобина у овец разных пород методом электрофореза проанализирована сыворотка крови от 9.61 голов овец; из них: казахская тонкорунная - 148, линкольн - 43, каракульская - 439, курдючная, эдильбаевского типа - 30, тяньшаньская - 18, помеси Fj - Л х Кт - 136, Тн х Кт - 40, Л х Тн х Кт - 165 голов овец; 439 плодов каракульских овец 130-140 дней развития, 30 плодов курдючных овец эдильбаевского типа 45-120-дневного возраста, 26 плодов овец 1фоссбредного типа 60-135 дневного возраста. Полученные результаты представлены в таблицах 6,7 на стр.122,123.

Генетическую частоту встречаемости рассчитывали по формуле Гарди-Вайнберга.

Статистическую обработку результатов проводили по Стьюденту.

Определение пероксидазной активности.

Пероксидазную активность Hp-Hb -комплекса, гемоглобина и его производных определяли пероксидазно-гваяколовым методом по методике Оуэна и др. ( Owen et al. > I960), либо Коннелла и Смитиса ( Connell » Smithies > 1959).

Исходные растворы ( Owen et al. > I960).

Гваяколовый реагент. (0,03 - 0,001 М) 1,86 г гваякола растворяли в 400 мл воды содержащей 50 мл ледяной уксусной кислоты, pH раствора доводили до 4,0 с помощью I М раствора едкого натра. Общий объем доводили до 500 мл водой.

При исследовании влияния pH на пероксидазную активность комплекса Нр-метНь и метгемоглобина были использованы растворы гваякола с рН в диапазоне от 3,4 до 8,0.

Раствор метгемоглобина (0,05 - 0,004 мМ). К водному раствору гемоглобина (3,3 г/л) добавляли равный объем 0,4 мМ раствора феррицианида калия. Полученный раствор метгемоглобина разбавляли до 0,05 -0,004^мМ концентрации. Для метгемоглобина человека этот раствор дает следующие значения поглощения: 578 нм - 0,219, 562 нм - 0,218, 542 нм - 0,335.

Концентрация раствора метгемоглобина определялась также цианметгемоглобиновым методом.

Раствор метгемоглобина хранили при -4° один месяц, при - 10° - 3-4 месяца.

Перекись водорода. Концентрированный раствор перекиси водорода разбавляли водой до 0,04 - 0,001 н непосредственно перед использованием.

Концентрацию исходного раствора перекиси водорода ежемесячно устанавливали методом перманганометрии.

Подготовка пробы для измерения пероксидазной активности Нр-Нь -комплекса. К 0,5 мл сыворотки крови добавляли 0,5 мл 0,05 мМ раствора метгемоглобина. Реакционную смесь инкубировали при 37°С 30 минут, затем измеряли пероксидазную активность раствора.

Аналогично готовили реакционную смесь из растворов гомогенного препарата гаптоглобина.

Подготовка пробы гемоглобина и его производных для измерения пероксидазной активности. К 0,5 мл раствора гемоглобина или его производных добавляли 0,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия. Этот раствор использовали как контрольный.

Измерение пероксидазной активности по методике Коннелла и Смитиса ( Connell , Smithies , 1959). 0,1 мл реакционной смеси, состоящей из равных количеств сыворотки и 0,05 мМ метНь , вносили в пробирки, содержащие 1,4 мл гваяколо-вого реактива и термостатированные при 20°С. Затем добавляли 1,5 мл 0,04 н раствора перекиси водорода. Содержимое пробирок сразу переносили в кювету спектрофотометра. Измерение поглощения при 470 нм начинали через 30 секунд после добавления перекиси водорода и продолжали в течение 10 минут, определяя поглощение раствора через каждые 30 секунд. По полученным данным строили график зависимости поглощения раствора при 470 нм от времени (рис.2).

Пероксидазную активность рассчитывали по тангенсу угла наклона на графике в начальный момент реакции. За единицу активности принимали скорость превращения гваякола в тетра-гваякол в присутствии Нр-Нъ -комплекса в начальный момент реакции.

Определение пероксидазной активности по методу Оуэна и др. ( Owen et al. , I960). 0,1 мл реакционной смеси, содержащей равные количества сыворотки и метНь , вносили в пробирки, содержащие 1,4 мл гваяколового реагента и термостатированные при 20°С. Затем к реакционному раствору добавляли 1,5 мл 0,04 н раствора перекиси водорода. Через 10 минут измеряли поглощение раствора при 470 нм на спектрофотометре против дистилированной воды. За единицу активности принимали поглощение при 470 нм, равное 0,001.

Рис.2 Изменение поглощения раствора гваякола при 470 нм при окислении перекисью водорода в присутствии Нр-Нъ -комплекса в зависимости от времени.

Концентрация гаптоглобина.

Концентрацию гаптоглобина в сыворотке крови выражали в виде гемоглобиневязывающей способности (мг%), т.е. количества гемоглобина, которое связывается гаптоглобином, содержащимся в 100 мл сыворотки.

Для определения концентрации гаптоглобина измеряли пе-роксидазную активность смеси равных количеств анализируемой сыворотки и стандартного раствора метгемоглобина. По калибровочному графику (рис.4) находили гемоглобинсвязывающую способность сыворотки.

В некоторых случаях концентрацию гаптоглобина выражали в виде единиц пероксидазной активности, рассчитанной на I мл сыворотки.

Концентрацию гаптоглобина в растворе определяли по его поглощению при 280 нм, принимая = 14 ( Marty , Моretti , 1976)

Определение гемоглобинсвязывающей способности сыворотки.

В 10 пробирок, содержащих по I мл сыворотки,добавляли увеличивающее количество 0,05 мМ раствора метгемоглобина (от 0,1 до I мл). Общий объем доводили до 2 мл 0,9% раствором хлористого натрия. Смеси инкубировали 30 минут при 37°С, затем измеряли пероксидазную активность. Из полученных значений вычитали величины активности растворов, содержащих увеличивающиеся количества метНъ (от 0,1 до I мл) и I мл 0,9% хлористого натрия, которые определяли параллельно. По этим данным строили график зависимости активности от количества метгемоглобина (рис.3). Точка инфлексии на графике соответствует количеству метгемоглобина, которое необходимо для связывания всего гаптоглобина, содержащегося в I мл сыворотки. На основании этого рассчитывали гемоглобинсвязываю-щую способность сыворотки.

Калибровочный график.

В пробирки, содержащие 0,5 мл 0,05 мМ метНь , вносили увеличивающиеся количества сыворотки (от 0,1 до I мл) с известной гемоглобинсвязывающей способностью. Общий объем доводили до 1,5 мл раствором 0,9% хлористого натрия. Через 30 минут инкубации при 37°С измеряли перексидазную активность растворов. По полученным значениям строили график зависимости пероксидазной активности от гемоглобинсвязывающей спо

Рис.3. График для определения гемоглобинсвязывающей способности сыворотки крови овец, а - точка насыщения метгемоглобином всего гаптоглобина, содержащегося в I мл сыворотки. собности сыворотки (рис.4).

Калибровочные графики строили для каждого вновь, приготовленного раствора метгемоглобина.

Определение активности трипсина.

Активность трипсина измеряли по гидролизу этилового эфира N -бензол- Ь -аргинина (БАЭЭ). За ходом реакции следили по измерению поглощения при 253 нм на спектрофотометре СФ-4А.

В кювету (толщина слоя I см) помещали 3 мл 10~% раствора БАЭЭ в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,8. Добавляли 0,02 мл 1% раствора трипсина в 10~% соляной кислоте, содержащей рис.4. Калибровочный график для определения гемоглобин связывающей способности сыворотки крови.

0,05 М Са2+ и перемешивали. Измерение оптической плотности начинали с 30-й секунды и проводили в течение 5 минут с интервалами 30 секунд, против контрольного раствора без фермента.

Активность трипсина рассчитывали по формуле:

53/мин * *000 • 5 мг термента в 4 мл

Иммобилизация трипсина на сефарозе.

50 мл отстоявшей сефарозы 4В ("Сигма", США) промывали последовательно 2,5 л 0,1 М уксусной кислоты, 2,5 л 0,1% бикарбоната натрия, 2,5 л воды. Затем промытую сефарозу обрабатывали в течение 2 часов при комнатной температуре перйодатом натрия. Свежеприготовленную окисленную сефарозу суспендировали в 100 мл 0,1 М боратного буфера рН 8,5, содержащего 150 мг трипсина. Суспензию перемешивали 40 минут при комнатной температуре, затем трижды с интервалами в 20 минут прибавляли по 15 мг боргидрида натрия. Гель промывали водой до исчезновения поглощения при 280 нм. Количество иммобилизованного трипсина рассчитывали по разнице поглощения в исходном растворе и промывных водах. I мл хорошо отстоявшейся сефарозы содержал 2,3 мг трипсина.

Активность иммобилизованного трипсина.

Активность иммобилизованного трипсина определяли по гидролизу этилового эфира N -бензоил- L -аргинина. За ходом гидролиза следили по изменению поглощения при 253 нм.

К I мл отстоявшейся трипсин-сефарозы добавляли равный объем 0,05 М фосфатного буфера, pH 7,8. Смесь перемешивали и добавляли I мл раствора БАЭЭ. Через 5 минут реакцию останавливали, отфильтровывая трипсин-сефарозу. Затем измеряли поглощение раствора при 253 нм и рассчитывали активность иммобилизованного трипсина. Она равна 574 единицы.

Параллельно определяли активность растворимого препарата трипсина, использованного для иммобилизации на сефарозу. Она оказалась равной 1575 единиц.

Влияние мочевины на активность трипсин-сефарозы.

Трипсин-сефарозу инкубировали в 8 М мочевине 5-30 минут при 18°С, затем определяли активность иммобилизованного фермента как указано выше. Активность равна активности исходной трипсин-сефарозы.

Иммобилизация трипсина на карбоксиметилцеллюлозе.

Березин и др., 1976).

Гидразид карбоксиметилцеллюлозы. 6,7 г Ш-целлюлозы ("Реанал", Венгрия) суспендировали в 300 мл 1% метанольного раствора НС1 и кипятили 40 минут. Продукт отделяли и высушивали. 2 г полученного эфира Ш-целлюлозы суспендировали в 330 мл абсолютного метанола с 1,7 г гидразин-гидрата и перемешивали 2-3 дня при 38°С. Продукт центрифугировали, промывали метанолом и сушили.

Азид Ш-целлюлозы. К суспензии 6,25 г гидразида Ш-целлюлозы в 940 мл 2% соляной кислоты добавляли при перемешивании и охлаждении до 2°С 57 мл 3% раствора нитрата натрия в воде. Через 20 минут после добавления образовавшийся азид отфильтровывали, промывали ледяной водой до нейтральной реакции и затем эфиром. Выход 6 г азида Ш-целлюлозы.

Трипсин, иммобилизованный на Ш-целлюлозе. 6 г азида Ш-целлюлозы суспендировали в 100 мл 0,05 М боратного буфера рН 8,7, охлаждали до 2°С и добавляли при перемешивании раствор 1,5 г трипсина в 100 мл того же буферного раствора. Через 1,5 часа перемешивания на холоду продукт отделяли центрифугированием, промывали 0,001 М соляной кислотой (4 х 200 мл), водой (4 х 200 мл), 0,5 М бикарбонатом натрия (3 х 200 мл), I М хлористым натрием (3 х 200 мл). Последние две операции повторяли дважды, затем смолу промывали водой (4 х 200 мл). Препарат высушивали. Выход 5,8 г. Получен препарат иммобилизованного трипсина, в котором с I г Ш-целлюлозы связалось 43 мг трипсина.

Иммобилизация гемоглобина на Ш-целлюлозу.

Для иммобилизации гемоглобина Ш-целлюлозу активировали азидным методом, как указано выше для получения трипсин-Шцеллюлозы. Получен препарат, в котором с I г сухой БМ-цел-люлозы связалось II мг гемоглобина.

Иммобилизация гемоглобина на целлюлозу.

25 г целлюлозы (РЖ) , рцггак , ГДР) промывали последовательно 1,5 л 0,1 М раствора уксусной кислоты, 1,5 л 1% бикарбоната натрия и 1,5 л воды. Промытую целлюлозу переносили в стакан, прибавляли 200 мл 0,25 М перйодата натрия и суспензию перемешивали 4 часа в темноте на магнитной мешалке. Затем целлюлозу отфильтровывали и промывали 1,5 л воды.

Свежеокисленную целлюлозу суспендировали в 100 мл 0,05 М боратного буфера рН 8,5, содержащего 200 мг гемоглобина, смесь перемешивали 5 часов при 18°С. Затем трижды порциями по 25 мг прибавляли боргидрид натрия с интервалами по 20 минут. Через 20 минут после добавления третьей порции восстановителя целлюлозу отфильтровывали и промывали водой до исчезновения поглощения при 540 нм в промывных водах.

С I г целлюлозы связалось 2,5-4 мг гемоглобина.

Количество гемоглобина,связанного со смолой,рассчитывали двумя способами: I) по разнице в поглощении при 540 нм исходного раствора, фильтрата и промывных вод; 2) по количеству связанного гема.

Определение количества связанного гема. ( вгипог1 et а1. , 1977).

400 мг полимер-Нь промыли и суспендировали в 5 мл воды, добавили Юмкл 2% раствора к^[Ре(СП)^] • После перемешивания в течение нескольких минут суспензию подкислили 0,1 н соляной кислотой до рН 2. Гем экстрагировали 3 мл метил-этилкетона до тех пор пока смола не становилась совершенно белой. Измеряли оптическую плотность экстракта при 380 нм на спектрофотометре.

Стандартный раствор гема получили, добавляя 5 мг гемоглобина предварительно отдиализованного против воды, к 500 мг смолы и обрабатывали, как указано выше.

Контрольный раствор для спектрофотометра получили как стандартный раствор, только не добавляя гемоглобина.

Определение пероксидазной активности Нъ -целлюлозы.

К 0,2 мг хорошо отстоявшейся Hb -целлюлозы добавляли 2,8 мл раствора гваякола и 3 мл 0,04 н раствора перекиси водорода. Через 10 минут после добавления перекиси водорода суспензию фильтровали и измеряли поглощение раствора при 470 нм.

Аналогично измеряли активность смеси 0,2 мл хорошо отстоявшейся целлюлозы и 0,1 мл 0,1% раствора гемоглобина.

Определение пероксидазной активности Нр-Нъ - целлюлозы.

0,3 мл хорошо отстоявшейся Hb-целлюлозы центрифугировали, смолу суспендировали в I мл 0,1 М боратного буфера pH 7,0 и смешивали с I мл сыворотки крови овец. Смесь инкубировали при 37°С 30 минут. Затем отбирали 0,1 мл и вносили в пробирки, содержащие 1,4 мл гваякола. К суспензии добавляли 1,5 мл 0,04 н раствора перекиси водорода. Через 10 минут смолу отфильтровывали и измеряли интенсивность поглощения фильтрата при 470 нм. За единицу активности принимали поглощение раствора при 470 нм, равное 0,001. Ацилирование е -аминогрупп лизина молекулы гапто-глобина малеиновым ангидридом ( Butler et. al. , 1969). В 3 мл раствора НрС 10 мг вносили 25 мг малеинового ангидрида порциями по 5 мг. Реакцию проводили при 0°, рН раствора поддерживали равным 8,5-9,0 с помощью I М едкого натра. Каждую порцию малеинового ангидрида добавляли с интервалами 10 минут. По окончании реакции раствор тщательно диа- • лизовали против дистилированной воды в течение 2 суток. 0 введении малеиновых групп в молекулу гаптоглобина судили по характерному изменению спектра в области 250-300 нм (рис.5). Полученные препараты малеинил-НрС исследовали электрофорезом.

Рис.5. Спектр в ультрафиолетовой области а) НрС, б) малеинил-НрС.

Выделение и очистка гаптоглобина.

В основу была положена методика выделения гаптоглобина из сыворотки крови собаки (Успенская и др., 1968). I. Фракционное осаждение сульфатом аммония. К 100 мл свежеприготовленной, негемолизированной сыворотки добавляли 61,3 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Через 30 минут осадок, состоящий в основном из ^-глобулинов, отделяли центрифугированием в течение 30 минут при 5000 об/мин и отбрасывали. В надосадочной жидкости концентрацию сульфата аммония увеличивали от 0,38 насыщения до0,48 насыщения, добавляя сухой сульфат аммония (из расчета 5,59 г на 100 мл жидкости). Раствор оставляли на 30 минут при комнатной температуре, затем осадок отделяли центрифугированием и вновь отбрасывали. В супернатанте концентрацию сульфата аммония доводили до 0,55 насыщения, прибавляя по 4,29 г сухого сульфата аммония на каждые 100 мл растворами оставляли на ночь в холодильнике. Осадок, состоящий в основном из гаптоглобина, отделяли центрифугированием, промывали растворами сульфата аммония 0,57 затем 0,60 насыщения 8-10 раз. На этом этапе очистки препарат гаптоглобина частично очищается от примесей альбумина и белков, растворимых в этих условиях. Далее осадок растворяли в минимальном количестве воды, диализовали : против воды в течение двух-трех суток и подвергали дальнейшей обработке. Выход гаптоглобина на этой стадии составляет 62% от исходного количества.

2. Гельфильтрация на сефадексе Г-200.

В работе использовали сефадекс Г-200 с размерами частиц около 40-120 мк, фирмы ЛКБ, Швеция.

110 мг препарата гаптоглобина растворяли в 7 мл воды, наносили на верх колонки (100 х 3 см), заполненной сефадек-сом Г-200 и уравновешенной 0,1 М вероналовым буфером. Элю-цию проводили 0,1 М вероналовым буфером, рН 8,6, содержащим

0,05 М хлористый натрий. Гельфильтрацию проводили при 4°С. Фракции белков собирали на автоматическом коллекторе сбора проб ХК0В-1. Скорость элюции 15-18 мл/час. Объем каждой фракции 5-6 мл. Эти фракции анализировали на содержание белка по поглощению при 280 нм на спектрофотометре СФ-4А и на гаптоглобин по пероксидазной активности смеси 0,1 мл элюата и 0,1 мл стандартного раствора метгемоглобина. Фракции, содержащие гаптоглобин, объединяли, концентрировали, диализовали и исследовали на гомогенность. На рисунке 17 (стр.136 ) представлен график элюции, полученный цри гель-фильтрации препарата НрС. Выход белка составил 55% от количества нанесенного препарата гаптоглобина.

Электрофорез в полиаьфиламидном геле показал, что в препарате гаптоглобина еще содержатся примесные белки, поэтому его подвергали дальнейшей очистке методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозой.

3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.

Подготовку ионообменника и заполнение колонки проводили по методу, описанному Гинодманом (1964). Выла использована ДЭАЭ-целлюлоза фирмы "Реанал", Венгрия.

200-250 мг белка, после очистки гельфильтрацией наносили на колонку, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой и уравновешенную 0,05 М трис-НС1 буфером рН 8,0. Элюцию проводили 0,05 М трис-НС1 буфером рН 8,0 с градиентом хлористого натрия от нулевой до I М концентрации. Объем сосуда смешения 1000 мл. Скорость элюции 20 мл/час. Фракции анализировали на содержание белка по поглощению цри 280 нм на спектрофотометре СФ-4А и на гаптоглобин по пероксидазной активности смеси 0,1 мл фракции с 0,1 мл стандартного раствора метНь. На рисунке 18 (стр.137) представлены графики элюции. Выход составил 52% от нанесенного количества белка.

Гомогенность препаратов гаптоглобина на всех стадиях выделения и очистки определяли электрофорезом в 7% полиакрил амидном геле.

Общий выход гаптоглобина составляет 17,7% от количества белка, содержащегося в сыворотке.

4. Препаративный электрофорез.

Очистку препаратов гаптоглобина плодов овец проводили препаративным электрофорезом в 7% полиакриламидном геле в условиях, используемых для аналитических исследований.

5. Очистка препаратов гаптоглобина аффинной хроматографией.

Препарат гаптоглобина, полученный после фракционного осаждения сульфатом аммония, растворяли в 0,1 М боратном буфере pH 8,2. Раствор диализовали против буфера, содержащего 2 М хлористый натрий в течение 20 часов, затем вносили промытую боратным буфером Hb-целлюлозу. Суспензию перемешивали 2 часа при Ю°С на магнитной мешалке. Затем сорбент отделяли центрифугированием (3000 об/мин, 15 минут) и промывали 2% раствором хлористого натрия до полного исчезновения в фильтрах поглощения при 280 нм. Полученную Нр-Hb-целлюлозу суспендировали в растворе 8 М мочевины и суспензию перемешивали I час при 1б°С. Далее раствор отделяли центрифугированием. Обработку сорбента повторяли 2 раза. Супернатанты, содержащие гаптоглобин, объединяли, диализовали против воды и концентрировали. Полученный препарат содержал около Ь% примеси, который при электрофорезе, рН 8,3, движется значительно быстрее гаптоглобина.

Характеристика молекулы гаптоглобина.

1. Исследование четвертичной структуры.

Препарат гаптоглобина инкубировали в присутствии 8 М мочевины и подвергали электрофорезу в 7% полиакриламидном геле.

Исследовали также влияние 1% додецилсульфата натрия, тепловой обработки, ацилирования £ -КЕ^-групп гаптоглобина малеиновым ангидридом на электрофоретическую подвижность его молекулы.

2. Полипептидный состав молекулы гаптоглобина.

Для установления вариантов полипептидов, составляющих молекулу гаптоглобина овец, исследовали ее поведение при электрофорезе после инкубации в присутствии 8 М мочевины и 1% 2-меркаптоэтанола, 1% додецилсульфата натрия и 1% 2-мер-каптоэтанола.

3. Исследование молекулы гаптоглобина методом скоростной седиментации ( Боуэн, 1973).

Определение коэффициента седиментации. Исследование седиментации проводили на ультрацентрифуге марки MOM 3170 (Венгрия) при скорости вращения ротора 50000 об/мин в одно-секторных алюминиевых ячейках. Картину седиментации фиксировали, фотографируя на пленку через определенные интервалы времени от момента вращения с заданной скоростью. На се-диментограммах измеряли расстояние дх от середины каждого пика до индексной прямой и строили график зависимости уЬ = 'Ид(а-^г-) от времени, где а и с параметры ультрацентрифуги, равные соответственно 7,30 и 2,086 (рис.6). Из этого графика находили значение аЦь , соответствующее выбранному интервалу времени,и рассчитывали коэффициент седиментации по формуле: си1 • 60 ■ дЬ где с» -угловая скорость в радианах в секунду. Рис.6 . График зависимости Рдь от времени для расчета коэффициента седиментации.

Влияние мочевины на седиментацию гаптоглобина.

Раствор 0,4% НрС, содержащий 8 М мочевину, инкубировали 2 часа при 37°С. Затем исследовали методом скоростной седиментации в полиамидных ячейках с искусственной границей при скорости 45000 об/мин. Расчет коэффициента седиментации проводили с учетом вязкости и плотности раствора мочевины по формуле: где ¿i -значение коэффициента седиментации, найденное в опыте; з. - значение коэффициента седиментации рассчитанное с учетом вязкости и плотности раствора мочевины; -вязкость раствора мочевины; р'-плотность воды; р"-плотность раствора мочевины.

Исследовано также влияние б М мочевины на седиментацию НрА гаптоглобина плодов овец.

4. Определение относительной молекулярной массы гаптоглобина.

Относительную молекулярную массу НрА и НрС определяли методом гельфильтрации ( Andrews , 1965). Использовали колонки (2,5x50 см), заполненные сефадексом Г-200. Элюирую-щий буфер - 0,05 М трис-HCI pH 7,5, содержащий 0,1 М хлористый калий. Скорость протекания буфера через колонку 1518 мл/час. Определяли свободный объем колонки и объем элю-ции для исследуемого белка ( V0 и V соответственно). Рассчитывали отношение -^f . Из калибровочного графика зависимос

Vo ти от логарифма относительной молекулярной массы, построенной для стандартных белков, определяли относительную молекулярную массу для исследуемого белка (рис.7).

Для определения свободного объема колонки использовали декстран голубой, полисахарид с относительной молекулярной массой равной 2000000.

Калибровочный график строили по данным, полученным для следующих стандартных белков: рибонуклеаза - относительная молекулярная масса равна I27Q0s трипсин - 23800, сывороточный альбумин - 70000, ^-глобулин - 160000 (рис.7).

Аналогично определили относительную молекулярную массу HpI плодов овец.

5. Аминокислотный состав молекул разных вариантов гаптоглобина.

Аминокислотный состав гаптоглобина определяли на аминокислотном анализаторе типа Hd -1200 AAA (Чехословакия).

Подготовка пробы. Водные растворы гаптоглобина диали-зовали тщательно против бидистилированной воды в течение трех суток, постоянно меняя воду. Затем препарат белка высушивали в вакуум-эксикаторе над КОН. Этот процесс проводили до тех пор, пока вес препаратов не стал, постоянным. Точные навески белка (НрС - 6 мг, НрА - 2 мг, HpI - 3 мг, Нр2 - 6 мг) помещали в ампулы и заливали 100 кратным избытком перегнанной 6 н соляной кислоты. Ампулы продували азотом в течение 15 минут, затем запаивали под вакуумом. Гидролиз проводили 24 часа при Ю5°С, гидролизаты переносили в бюксы, соляную кислоту удаляли упариванием в вакуум-эксикаторе над КОН, добавляя несколько раз небольшие количества бидистилированной воды. Сухой остаток растворяли в буферном растворе рН 2,0 и анализировали на аминокислотном анализаторе. Параллельно проводили анализ аминокислотного состава смеси точных количеств стандартных аминокислот.

Результаты трех параллельных измерений обработаны статистически и представлены в граммах на 100 г гаптоглобина в таблице 5.

2.2 v % \л

2.0 16 и и \2 \з •

10 1 \нрс \?и г чнрс \нрс , . \ 1дм.6.

0 1 5 4 5678910 ~

Рис.7. Калибровочный график зависимости объема элюции белков при гельфильтрации через колонку, заполненную сефадексом Г-100, от логарифма молекулярной массы. I - рибонуклеаза, 2 - трипсин, 3 -альбумин, 4 - )(-глобулин.

6. Исследование гаптоглобина плодов овец методом пептидных карт.

Подготовка пробы. 5 мг Нр1 инкубировали в присутствии 8 М мочевины при 37°С 2 часа. К раствору белка прибавляли дитиотреитол из расчета 6,5 мг дитиотреитола на 10 мг белка. Реакционную смесь инкубировали 2 часа при 37 С. Далее проводили алкилирование БН-групп, прибавляя в раствор белка 3-х кратный избыток (по сравнению с количеством добавленного дитиотреитола) йодацетамида,и смесь оставляли на 30 минут при 37°С. Раствор белка тщательно диализовали, белок осаждали на холоду ацетоном. Осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,8.

Гидролиз молекулы гаптоглобина трипсином. К раствору, содержащему 5 мг воссталовленного и алкотированного Нр1 добавляли трипсин, иммобилизованный на сефарозе (трипсин -субстратное отношение равно 1:10). Смесь инкубировали 24 часа при 37°С. Затем трипсин-сефарозу отфильтровывали, гид-ролизат анализировали методом пептидных карт на тонком слое целлюлозы.

Оптимальное время гидролиза с помощью трипсин-сефарозы определяли в отдельном опыте, проведенном на альбумине. К раствору I% альбумина добавляли трипсин-сефарозу (фермент субстратное отношение равно 1:10). Через определенные интервалы времени определяли концентрацию свободных аминогрупп с помощью нингидринового реактива. Для этого 0,1 мл реакционного раствора отбирали из смеси, удаляли трипсин-сефарозу центрифугированием, затем к раствору добавляли 0,5 мл раствора нингидрина в ацетатном буфере рН 4,0. Раствор инкубировали на кипящей водяной бане 10 минут, затем добавляли 3 мл 50% этилового спирта и измеряли поглощение раствора при 570 нм на спектрофотометре. Было установлено, что время полного гидролиза альбумина трипсин-сефарозой равно 24 часам.

Получение пептидных карт. Были использованы тонкослойные пластины целлюлозы, приготовленные в лаборатории, которые хранили в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием.

Тонкослойные пластины получали из целлюлозы фирмы СЬетаро1 (Чехословакия) на стеклянных пластинах размером 13x18 см. Толщина слоя 0,3 - 0,4 см.

Высоковольтный электрофорез. Гидролизат белка наносили на край пластины, отступая от каждого края по I см. Электрофорез проводили в пиридин-ацетатном буфере рН 5,6 (пиридин: уксусная кислота:вода. - 2:1:200), в течение 45 минут при напряжении 45 в/см. В качестве контакта использовали бумажные мостики. Для предотвращения нагревания аппарат охлаждали. После окончания электрофореза пластины сушили и далее подвергали хроматографии.

Хроматография. Восходящую хроматографию проводили в направлении перпендикулярном направлению электрофореза в системе бу.танол-уксусная кислота-вода (4:1:5) в течение 1,5 часа. Затем пластины сушили в течение 20 минут при 60°С.

Высушенные пластины проявляли, опрыскивая их 0,25% раствором нингидрина в ацетоне. Затем пластины оставляли на ночь в темном месте. Пептиды проявляются в виде 1фасновато-фиолетовых пятен различной интенсивности на белом фоне.

Аналогично исследовали молекулу Нр2 плодов овец.

7. Исследование НрС методом пептидных карт.

Подготовка пробы была аналогична тому, которую использовали для Нр1 и Нр2.

Гидролиз трипсином. К раствору, содержащему 10 мг восстановленного и алкилированного НрС, добавляли раствор трип

Я 2+ сина в 10 М соляной кислоте, содержащий 0,05 М Са , (фермент - субстратное отношение равно 1:50). Активность использованного препарата трипсина равна 3673 единиц.

Гидролиз проводили в течение 8 часов при 37°С. Затем фермент инактивировали подкислением раствора до рН 3,0. Далее гидролизат исследовали методом пептидных карт.

Оптимальное время гидролиза определяли в отдельном опыте, проведенном для НрС. Для этого через определенные интервалы времени из реакционного раствора отбирали по 0,1 мл и определяли концентрацию свободных аминогрупп, как указано выше нингидриновым методом.

Получение пептидных карт. Анализ трипсинового гидролиза-та НрС методом пептидных карт также проводили на тонком слое целлюлозы. Размер пластин 13x18 см. Условия электрофореза такие же как при анализе триптических гидролизатов Нр1 и Нр2.

Восходящую хроматографию проводили в системе бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5).

Характеристика а-и р-полипептидов гаптоглобина.

I. Определение молекулярной массы а.- и ^-полипептидов.

Молекулярные массы полипептидов гаптоглобина определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. За основу принята методика, предложенная Шапиро и др. (Shapi.ro е-Ь, а1. > 1966).

I мг гаптоглобина инкубировали в присутствии додецилсульфата натрия и 2-меркаптоэтанола 2 часа при 37°С. Затем наносили на верх гелевых трубочек. Электродный раствор содержал 1% додецилсульфата натрия. Электрофорез проводили в присутствии додецилсульфата натрия. После окончания электрофореза гели удаляли из трубочек и окрашивали 0,1% раствором амидошварца 10В в 10% уксусной кислоте. После тщательного отмывания гелей 7% уксусной кислотой определяли электрофоре-тическую подвижность белковых компонентов, которые видны на геле как синие полоски. Из калибровочного графика зависимоети электрофоретической подвижности белка при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия от логарифма молекулярного веса его молекулы определяли относительные молекулярные массы а- и р-полипептидов (рис.8).

Калибровочный график строили на основании данных, полученных для следующих белков: гемоглобин - 15500 ( в присутствии детергента молекула Нъ диссоциирует до субъединиц с молекулярным весом 15500), трипсин - 23800, химотрипсиноген - 25000, пепсин - 35000, алкогольдегидрогеназа - 40000 (рис.8).

Рис.8. Калибровочный график зависимости подвижности белков при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия от логарифма молекулярной массы. I - алкогольдегидрогеназа, 2 - пепсин, 3 - химотрипсиноген, 4 - трипсин, 5 - гемоглобин.

2. Разделение молекулы НрС на полипептидные цепи.

НрС (20 мг) инкубировали в присутствии 8 М мочевины 2 часа при 20°С, раствор диализовали против 0,05 М фосфатного буфера рН 8,6, содержащего 8 М мочевину, в течение 18 часов. К реакционной смеси добавляли дитиотреитол (650-кратный молярный избыток по сравнению с количеством белка), затем инкубировали 6 часов при 37°С. Далее в раствор вносили йодацетамид (3-х щэатный молярный избыток по отношению к количеству дитиотреитола) и оставляли при 37°С на ночь. Затем раствор диализовали против 0,05 М фосфатного буфера рН 8,6 в течение 20 часов и наносили на колонку (.1x20 см), заполненную сефадексом Г-75. Элюцию проводили I М уксусной кислотой. Фракции анализировали на белок по поглощению при 280 нм. На рисунке 28 (гл.1У, стр.156) представлен полученный график элюции. Фракции, содержащие белок, объединяли, каждый компонент отдельно, концентрировали и диализовали против 0,05 М фосфатного буфера рН 7,8.

Диализ проводили в специальных бензоилированных диализных трубках фирмы "Сигма", которые пропускают лишь молекулы с относительной молекулярной массой не больше 2000.

Каждую фракцию анализировали электрофорезом в полиащш-ламидном геле.

3. Анализ а - и р-полипептидов методом пептидных карт.

Ферментативный гидролиз. К раствору 5 мг а-цепи НрС в

0,05 М фосфатном буфере рН 7,8 добавили трипсин, иммобилизованный на КМ-целлюлозе (фермент - субстратное отношение равно 1:10). Смесь инкубировали при 37°С 24 часа, затем трипсин-КМ-целлюлозу отфильтровывали, промывали несколько раз фосфатным буфером. Гидролизат и промывные воды объединяли и анализировали методом пептидных карт на тонком слое силикагеля.

Аналогично проводили ферментативный гидролиз трипсин-БМ-целлюлозой ^-полипептида НрС.

Получение пептидных карт. Были использованы пластины Силуфол УФ-250, 150x150 см, фирмы Kavalier , Чехословакия.

0,1 мл гидролизата а-цепи наносили на край пластины на расстоянии 2 см от края. Электрофорез проводили в аммо-нийно-бикарбонатном буфере pH 6,9 в течение 1,5 часа при напряжении 36 в/см. Аппарат постоянно охлаждали для предупреждения перегрева пластин. После окончания электрофореза пластины высушивали.

Восходящую хроматографию проводили в направлении перпендикулярном электрофорезу в системе бутанол-уксусная кислота - вода (4:1:5) в течение 40 минут. Пластину высушивали и опрыскивали 0,25% раствором нингидрина в ацетоне и оставляли на 24 часа в темноте. На рисунке 29 (глЛУ, стр.158) представлены полученные пептидные карты.

Аналогично анализировали триптический гидролизат р -полипептида.

4. Исследование гемоглобинсвязывающей способности а- и р-полипептидов НрС. а) Влияние л- и р-цепей на пероксидазную активность метгемоглобина.

К 0,2 мл раствора, содержащего I мг ß-цепи, добавляли равный объем 0,05 мМ метгемоглобина. Через 30 минут инкубации при 37°С определяли пероксидазную активность раствора по методу Оуэна ( Оетеп et а1. , 1960).

Аналогично определяли влияние & -цепи на пероксидазную активность стандартного раствора метгемоглобина.

Параллельно определяли пероксидазную активность раствора, содержащего равные объемы 0,05 мМ метгемоглобина и 0,9% хлористого натрия. б) Сродство а- и р-полипептидов к НЪ-целлюлозе. I мл раствора, содержащего 10 мг восстановленного и ал-килированного НрС, диализовали против 0,1 мМ фосфатного буфера рН 7,5 и добавляли 3 мл хорошо отстоявшейся НЬ-целлю-лозы в этом же буферном растворе. Суспензию хорошо перемешивали 2 часа при 20°С в присутствии 2% этиленгликоля, затем центрифугировали (3000 об/мин, 15 минут). Супернатант отделяли, смолу промывали 0,1 М фосфатным буфером рН 7,5, содержащим этиленгликоль,до полного исчезновения поглощения при 280 нм в фильтратах. Супернатант и промывные воды объединяли, концентрировали, диализовали против дистилированной воды и исследовали электрофорезом в полиакриламидном геле.

Смолу обрабатывали 8 М мочевиной I час при перемешивании на магнитной мешалке при 20°. Суспензию центрифугировали, супернатант отделяли, а сорбент вновь обрабатывали 8 М мочевиной. Обработку смолы мочевиной повторяли еще 2-3 раза. Все растворы, полученные после обработки смолы 8 М мочевиной, объединяли, диализовали тщательно против воды, концентрировали и вновь диализовали против воды. Полученные препараты анализировали электрофорезом в 7% полиакриламидном геле.

Исследование взаимодействия гаптоглобина овцы с гемоглобином

1. Влияние видовой специфичности гемоглобина на образование комплекса НрС-метНъ .

К 0,1 мл свежеприготовленной сыворотки 1фови овцы, содержащей НрС (56 мг%), добавляли 0,03 мл 0,05 мМ раствора метНь овцы. Через 30 минут инкубации при 37°С смесь анализировали электрофорезом в 7% полиакриламидном геле на присутствие Нр-Нъ -комплекса (см.определение варианта гаптоглобина) .

Аналогично исследовали смеси сыворотки щюви овцы с мет-гемоглобином лошади, коровы, мыши, человека, а также смеси сыворотки крови плодов овец и 0,1% раствора Нр2 с метгемо-глобинами указанных видов млекопитающих.

2. Перокоддазная активность Нр-Нъ -комплекса, образованного гаптоглобином овец с гемоглобинами разных видов млекопитающих.

0,2 мл сыворотки крови овцы, содержащей НрС (56 мг%), инкубировали с равным объемом 0,05 мМ раствора метгемогло-бина овцы 30 минут при 37°. Затем определяли пероксидазную активность по методу Оуэна и др. (Owen et al. , i960).

Также определяли пероксидазную активность смеси сыворотки крови овцы с метгемоглобином лошади, коровы, человека и мыши, смеси сыворотки щюви плода овцы и 0,1% раствора Нр2 с метгемоглобинами указанных видов млекопитающих.

Параллельно измеряли пероксидазную активность метгемо-глобина овцы, человека, лошади, коровы и мыши.

3. Взаимодействие гаптоглобина овцы с разными вариантами гемоглобина.

Реакционную смесь, состоящую из равных количеств сыворотки овцы (56 мг% НрС) и 0,05 мМ метНЪА, инкубировали при 37° в течение 30 минут. Затем ее анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле и на пероксидазную активность по методу Коннелла и Смитиса (СоппеИ ,Зщ11;Мез , 1959).

Аналогично исследовали смеси сыворотки крови овцы с метгемоглобином 60-дневного плода, суточного, месячного и двухмесячного ягненка и метНъАВ, а также смеси Нр2 с вышеуказанными метгемоглобинами.

4. Взаимодействие НрС с Нь-целлюлозой.

10 мл хорошо отстоявшейся Нь-целлюлозы смешали с 2 мл 1,1% раствора частично очищенного гаптоглобина в 0,05 М ацетатном буфере рН 5,0, содержащем хлористый натрий. Суспензию инкубировали при 20° в течение 5 часов, затем центрифугировали, сорбент отделяли и промывали 2 М раствором хлористого натрия, содержащего 4% этиленгликоль, до исчезновения поглощения при 280 нм. В фильтратах и промывных водах определяли гемоглобиневязывающую способность и концентрацию белка.

Исследовали также взаимодействие НрС с НЬ-целлюлозой при рН 8,3 в трис-глициновом. буфере.

Гаптоглобинсвязывающую способность Ш-целлюлозы исследовали в 0,05 М боратном буфере рН 7,5 и 8,7, как указано выше для Нъ-целлюлозы.

5. Взаимодействие гаптоглобина с денатурированным метгемоглобином.

Спектральная характеристика реакции. К 0,3 мл 0,062 мМ метгемоглобина добавляли I мл формиатного буфера рН 3,5. Общий объем доводили до 2,5 мл 0,9% хлористым натрием. Через час инкубации при 18° сканировали спектр против 0,9% раствора хлористого натрия.

0,3 мл 0,062 мМ метгемоглобина инкубировали с I мл формиатного буфера рН 3,5 один час при 18°. Затем в раствор добавляли 0,4 мг НрС в 1,2 мл 0,9% хлористого натрия. Через 30 минут инкубации при 37° сканировали спектр против физиологического раствора (0,9% хлористый натрий).

К 0,3 мл 0,062 мМ метНь после'инкубации с I мл формиатного буфера рН 3,5 в течение часа при 18° добавили 0,1 мл сыворотки, содержащей НрС (156 мг%). Через 30 минут инкубации сканировали спектр против 0,9% раствора хлористого натрия.

Сканирование спектра во всех опытах проводили на спектрофотометре "Спекорд".

Пероксидазная активность. К I мл 0,062 мМ метНь добавляли 5 мл формиатного буфера рН 3,5. Смесь инкубировали при 18° в течение 49 часов. Через I, 4, 20 и 42 часа-отбирали две пробы по 0,6 мл. К одной добавляли 0,1 мл сыворотки (НъСС 156 мг%), ко второй 0,1 мл 0,9% хлористого натрия. Через 30 минут инкубации при 37° определяли пероксидазную активность растворов. Полученные результаты представлены на рис. 47 , стр. 225 .

Исследование влияния различных факторов на гемоглобинсвязывающую способность гаптоглобина и свойства комплекса Нр-НЬ

I. Влияние состава среды на пероксидазную активность, а) К 0,75 мл 0,4% раствора НрС добавляли равный объем 0,2 М раствора триса и оставляли на один час при 18°. Затем в реакционный раствор вносили 0,75 мл 0,05 мМ метгемоглоби-на, инкубировали его при 37° в течение 30 минут и определяли пероксидазную активность реакционной смеси.

Аналогично исследовали влияние на пероксидазную активность комплекса НрС-метКЬ соединений, указанных в таблицах 17 и 18.

В случае мочевины, сульфата аммония, сульфата натрия, тетрабората натрия и додецилсульфата натрия исследование проводили при разных концентрациях этих соединений в растворе.

Одновременно определяли влияние указанных соединений на пероксидазную активность метгемоглобина. б) 0,6 мл 0,4% раствора НрС инкубировали 30 минут при 37° с равным объемом 0,05 мМ метНь . Затем в реакционную смесь вносили додецилсульфат натрия до конечной концентрации равной 2 мМ. Через час инкубации при 18° измеряли пероксидазную активность раствора.

Также измеряли пероксидазную активность комплекса НрС-метНь в присутствии 0,2 М додецилсульфата натрия.

2. Влияние анионов и катионов на взаимодействие НрС с метгемоглобином

К I мл 0,4% НрС добавляли такой же объем 0,2 М сульфата натрия, смесь выдерживали один час при 18°, затем вносили 0,75 мл 0,4% раствора гемоглобина. Реакционную смесь через 30 минут инкубации при 37° анализировали методом электрофореза и гельфильтрацией.

Электрофорез проводили в 7% полиакриламидном геле, pH 8,3, с последующей окраской на гемсодержащие белки 1% раствором бензидина.

Гельфильтрацию проводили на колонке (I х 20 см), заполненной сефадексом Г-200. I мл реакционного раствора наносили на верх колонки, элюцию проводили 2% раствором хлористого натрия. Элюаты анализировали на присутствие гемсодержа-щих белков, измеряя поглощение при 415 нм на спектрофотометре " Carl Zeiss , Jena ", ГДР. На хроматограмме видно два гемсодержащих компонента. Фракции , соответствующие каждому из них, объединяли, диализовали и анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле. В первом пике элюируется Нр-НЬ-комплекс, во втором несвязанный гемоглобин. По площади пиков рассчитывали концентрацию каждого гемсодержащего компонента.

Методом электрофореза и гельфильтрации исследовали также влияние тетрабората натрия, сульфата аммония на взаимодействие гаптоглобина овцы с гемоглобином.

3. Влияние рН на пероксидазную активность.

Комплекс НрС-метНъ . 2 мл сыворотки, содержащей НрС (156 мг%. , НЪСС. .)-,•-инкубировали с равным объемом 0,05 мМ метгемоглобина при 37° в течение 30 минут. Затем измеряли пероксидазную активность раствора, используя в качестве субстрата (донора водорода) 0,01 М растворы гваякола, значение рН которых находилось в области от 3,4 до 8,0.

Аналогично исследовали влияние рН на пероксидазную активность комплекса НрС с метгемоглобином человека и коровы.

Метгемоглобин. Пероксидазную активность раствора, содержащего 0,5 мл 0,05 мМ метгемоглобина и 0,5 мл 0,9% хлористого натрия, измеряли, используя растворы гваякола с рН в диапазоне от 3,4 до 8,0.

4. Влияние рН на гемоглобиневязывающую способность НрС.

Концентрация НрС-НЬ02 -комплекса. К 2 мл 0,4% раствора НрС, инкубированного при рН 4,0 (0,05 М ацетатный буфер рН 4,0), добавляли 0,5 мл 0,4% оксигемоглобина. Через 30 минут инкубации при 37° смесь подвергали гельфильтрации на колонке (1x20 см), заполненной сефадексом Г-200. Фракции анализировали по поглощению при 415 нм и по площади пиков определяли концентрацию гемсодержащих компонентов (НъО^ и НрС-НЬО^).

Методом гельфильтрации исследовали также смеси, оксигемоглобина с НрС, инкубированным при значениях рН в области от 4,0 до 8,5 (рН 4,0 - 6,5 - 0,05 М ацетатный буфер; рН 6,0 - 8,5 - 0,05 М трис-НС1 буфер).

Пероксидазная активность. Препараты НрС инкубировали при значениях рН от 2,8 до 10,9, затем добавляли равный объем 0,05 мМ метгемоглобина. Через 30 минут инкубации при 37° измеряли пероксидазную активность по методике Оуэна.

5. Спектральная характеристика комплекса НрС-метНЪ . а) К 0,2 мг НрС в 0,8 мл физиологического раствора добавляли 0,3 мл 0,062 мМ метгемоглобина. Общий объем доводили до 2,5 мл 0,9% хлористым натрием. Смесь инкубировали при 37° в течение 30 минут, рН раствора 7,5, затем оставляли на один час при 18° и сканировали спектр против 0,9% хлористого натрия и раствора метгемоглобина.

Для приготовления раствора метгемоглобина, против которого сканировали спектр, к 0,3 мл 0,062 мМ метНЬ добавляли 2,2 мл 0,9% хлористого натрия. б) 0,2 мг НрС в 0,8 мл 0,9% хлористого натрия инкубировали с 0,3 мл 0,062 мМ метНЬ 30 минут при 37°, затем в раствор вносили I мл формиатного буфера рН 3,5. Общий объем доводили до 2,5 мл физиологическим раствором. Спектр сканировали через час инкубации при 18° против физиологического раствора. в) 0,1 мл сыворотки (156 мг% НъСС) смешивали с 0,3 мл 0,062 мМ метНЪ , инкубировали 30 минут при 37°. Затем добавляли I мл формиатного буфера рН 3,5, смесь оставляли на один час при 18° и сканировали спектр против 0,9% хлористого натрия. г) Аналогично исследовали влияние рН 3,5 на спектр смеси, содержащей сыворотку с низкой концентраций гаптоглобина

9 мг% НьСС) и метгемоглобин.' ;

6. Зависимость пероксидазной активности комплекса

Нр-НЪ от концентрации гваякола.

НрС-метНЪ -комплекс получали как указано выше.

Приготовили растворы гваякола рН 4,0 разной концентрации (от 0,25 до 100 мМ ) .

Пероксидазную активность комплекса НрС-метНЪ измеряли по методу Коннелла и Смитиса, используя растворы гваякола разной концентрации и 0,04 н перекись водорода.

Также исследовали влияние концентрации гваякола на пероксидазную активность комплекса в присутствии 0,033 М тет-рабората натрия и 0,3 М сульфата натрия.

7. Влияние концентрации перекиси водорода на пероксидазную активность комплекса НрС-метНЪ .

НрС-метНъ -комплекс получали, как указано выше. Прямо перед анализом готовили растворы перекиси водорода разной концентрации (от 0,005 М до 0,08 М). Пероксидазную активность определяли по методу Коннелла и Смитиса.

8. Влияние кислорода воздуха на спектр комплекса-и ньо0 с. •

К 0,4 мг НрС в 1,2 мл 0,9% хлористого натрия добавили 0,2 мл 0,1 Л оксигемоглобина. Смесь инкубировали при 37° в течение 30 минут. Общий объем доводили до 2,5 мл 0,9% хлористым натрием. Через один и 24 часа инкубации при 4° сканировали спектр против 0,9% хлористого натрия.

0,2 мл 0,1 мМ раствора оксигемоглобина смешали с 2,3 мл хлористого натрия. Через час и 24 часа инкубации при 4° сканировали спектр против 0,9% хлористого натрия.

Аналогично исследовали влияние инкубации при 4° в течение 24 часов на спектр комплекса НрС-метНъ и метгемоглобина.

Исследование изменения концентрации гаптоглобина в сыворотке крови овцы и плодов в процессе развития.

Опыт I. Исследование проведено на 30 плодах курдючных овец эдильбаевского типа 45,55,60,75,90, 105 и 120 дней развития. В каждом возрасте анализировали сыворотку от 3-5 плодов.

Для получения эмбрионов и плодов овцематки были осеменены спермой баранов-производителей этой же породы. При достижении намеченного дня суягности для извлечения плодов овцам делали операцию кесарева сечения. Кровь от плодов набирали из пуповины, выдерживали 3 часа при 37°С, сыворотку отделяли центри<|угированием (15 мин, 3000 об/мин). Полученную сыворотку хранили при 4°С.

Содержание гаптоглобина выражали в виде гемоглобинсвязы-вающей способности сыворотки.

Для определения гемоглобиневязывающей способности сыворотки использовали 0,05 мМ - 0,004 мМ раствор метгемоглобина овец. Полученные результаты представлены на рисунке 13 (стр.127глава Ш).

Опыт 2. Исследование проведено на 26 плодах овец кросс-бредной породы 60,75,90,105,110,120 и 135 дней развития. Для получения точно датированных плодов применяли искусственное осеменение спермой баранов-производителей этой же породы. По достижении намеченного дня суягности овец забивали. Кровь от плодов набирали из пуповины, инкубировали 3 часа при 37°С, сыворотку отделяли центри<|угированием 13000 об/мин, 15 мин). Полученную сыворотку хранили при 4°С.

Исследование проводили, используя 0,05 ± 0,004 мМ растворы метНь F 60-дневного плода овец и НъА взрослых овец.

Полученные результаты представлены в виде диаграммы на рисунке 14 ( стр.129 , глава Ш).

В период проведения опытов каждая овцематка получала грубых кормов (сено разнотравье) - 2 кг в день, концентрированных кормов (ячменная дерть) - 500 г в день. Соль и воду овцы получали вдоволь.

Исследование становления гаптоглобиновой системы в пост-натальный период проведено на 69 ягнятах в возрасте от одних суток до 12 месяцев, помесей Fj казахской тонкорунной породы с породой линкольн в возрасте один день, I, 1,5, 2, 4 и 8 месяцев. В каждом возрасте исследовали сыворотку от 6-9 ягнят. Учитывались результаты только здоровых животных, что устанавливалось при забое животного.

Полученные результаты представлены на рис.13 (стр.127, глава Ш).

Пероксидазную активность определяли по методике Коннел-ла и Смитиса (Connell , Smithies , 1959). За единицу активности принимали скорость накопления тетрагваякола (окрашенный продукт окисления гваякола).

Статистическую обработку результатов проводили по Стью-денту.

Во всех сыворотках плодов обоих опытов, овец и ягнят определяли тип гаптоглобина методом электрофореза в полиакри-ламидном геле.

Влияние различных веществ на концентрацию гаптоглобина в сыворотке крови овец

I. Простагландин.

Овцам (14 животных) подкожно инъецировали по I мл раствора простагландина ( 0,25 мг/мл, фирмы Спофа, Чехословакия). Через определенные интервалы времени из яремной вены отбирали кровь, получали сыворотку и в ней определяли концентрацию гаптоглобина, которую выражали в единицах перок-сидазной активности, рассчитанной на I мл сыворотки. Результаты представлены в виде графиков (рис.48 ). Для каждого животного строили отдельные графики, учитывая индивидуальные различия в реакции животных на инъекцию простагландина.

2. Гонадотропин сыворотки жеребой кобылы.

Овцам (15 голов) вводили внутримышечно по 0,6 мл раствора сыворотки жеребой кобылы (СЖК)с биологической активностью 240 мыш.ед. Через определенные интервалы времени из яремной вены овец отбирали кровь, получали сыворотку и определяли в ней концентрацию гаптоглобина, которую выражали в единицах пероксидазной активности на I мл сыворотки.

Аналогично исследовали изменение концентрации гаптоглобина в сыворотке крови 16 голов овец после инъекции 12 мл СЖК с биологической активностью 160 мыш.ед. и в сыворотке крови 15 голов овец после инъекции 8 мл СЖК с биологической активностью 180 мыш.ед.

Препараты СЖК с активностью 180 и 240 мыш.ед. получены сотрудниками Института экспериментальной биологии АН КазССР.

СЖК с активностью 160 мыш.ед. - препарат "Prosoían"фирмы "Дессау", ГДР.

Исследование влияния гаптоглобина и альбумина на степень суперовуляции у млекопитающих.

I. Суперовуляция у мышей под влиянием гонадотропина СЖК

Абелев и др., 1974).

Мышам (25 животных) внутримышечно вводили по 10 инт.ед. гонадотропина сыворотки жеребой кобылы (СЖК). Через 46-48 часов подкожно инъецировали по 40 ед. хориогонина и сразу подсаживали к самцам. Через 16-18 часов животных, у которых находили копуляционные пробки,быстро умервщляли путем разрыва костного мозга, отделяли яйцевод от матки и яичника и помещали в чашку Петри с изотоническим раствором. Из ампу-ловидной трубки каждого яйцевода выделяли слизистый комок, в котором находились яйцеклетки и переносили в другую чашку Петри с изотоническим раствором. Затем этот клубок слизи обрабатывали гиаларунидазой, через несколько минут яйцеклетки освобождались от слизи и фолликулярных клеток и становились хорошо заметными. После этого подсчитывали число яйцеклеток под световым ми1фосколом МБС-9. Результаты представлены в таблице 20.

2. Исследование влияния гаптоглобина на степень суперовуляции

Группе мышей (25 животных) внутримышечно вводили по 10 инт.ед. СЖК. Одновременно внутрибрюшинно инъецировали 0,4 мг HpG (10280 ед.акт/мг белка) в 0,2 мл 0,9% хлористого натрия. Далее продолжали аналогично опыту по суперовуляции под влиянием гонадотропина СЖК (табл.20).

Также исследовали влияние 0,2 мг, 0,6 мг НрС (2000 и 6000 ед. относительной пероксидазной активности).

3. Исследование влияния альбумина на степень суперовуляции

Группе мышей (25 животных) внутримышечно вводили по 10 инт.ед. СЖК. Одновременно внутрибрюшинно инъецировали 0,4 мг альбумина человека в 0,2 мл 0,9% хлористого натрия. Далее весь опыт продолжали, как указано выше, при исследовании суперовуляции под влиянием гонадотропина СЖК.

Аналогично исследовали влияние 2 мг альбумина на число яйцеклеток (таблица 20).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бейсембаева, Роза Ултубаевна

256 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что гаптоглобин является постоянным компонентом сыворотки крови овцы и синтезируется в ее организме в утробный и постнатальный период.

2. Обнаружено, что концентрация гаптоглобина в процессе развития овец изменяется в сыворотке крови животного немо :-нотонно.

3. У овец найдены три основных варианта гаптоглобина (НрА, НрВ и НрС), которые отличаются по числу множественных форм. У плодов овец установлен фетальный вариант гаптоглобина, отличающийся от белка взрослых животных по аминокислотному составу, электрофоретической подвижности, физико-химическим характеристикам. Частота встречаемости этих типов гаптоглобина у разных пород овец различается.

4. Гаптоглобин овец по некоторым характеристикам подобен гаптоглобину человека (три основные формы, два типа полипептидных цепей в молекуле, полимерная форма, взаимодействие с гемоглобинами разных видов млекопитающих), по другим отличается (рН максимальной пероксидазной активности комплекса Нр-Нъ, различная причина образования полимеров).

5. Получены гомогенные препараты гаптоглобина овцы и их плодов; исследована четвертичная структура и дана физико-химическая характеристика молекул разных вариантов гаптоглобина и их полипептидных цепей.

6. Установлено, что молекулы гаптоглобина овец и их плодов состоят из двух типов полипептидов - а и р , которые отличаются по молекулярной массе, а - и £-цепи связаны в димеры посредством дисульфидных связей, а димеры объединены в целую молекулу в результате нековалентного взаимодействия, в основном,за счет ионных и водородных связей.

7. Показано, что молекула НрА является тетрамером, а НрС представляет собой смесь полимеров, отличающихся по числу ар -димеров и в общем виде их можно записать как () где п = 2,4,5 и т.д. Множественность форм НрС обусловлена образованием полимеров разной молекулярной массы, которое не связано с наличием в его молекуле дуплицированной полипептидной цепи, подобной 1ар2а Нр2-2 человека.

8. Обнаружено, что участок, ответственный за связывание гемоглобина, расположен на р -цепи молекулы гаптоглобина овцы.

9. Установлено, что гаптоглобин овцы и его плода не проявляет внутривидовой специфичности и взаимодействует с гемоглобинами разных видов млекопитающих. Найдено, что пе-роксидазные свойства образованных при этом комплексов Нр-Нъ отличаются, зависят от рН, состава среды и прямо пропорциональны активности гемоглобина. Степень увеличения активности метгемоглобина разных видов позвоночных после их связывания с гаптоглобином овцы в комплекс Нр-Нъ различна и определяется стабильностью ее молекулы.

10. Установлено, что додецилсульфат натрия и мочевина ингибируют гемоглобинсвязывающую способность гаптоглобина и пероксидазную активность комплекса Нр-Нъ . Влияние детергента обусловлено тем, что он связывается с катионными местами на молекулах гаптоглобина и гемоглобина и денатурирует их. Воздействие его необратимое. Инактивация мочевиной является следствием того, что она разрушает контактные связи мелщу гаптоглобином и гемоглобином в комплексе.

11. Исследовало влияние катионов и анионов на свойства Нр-Нъ-комплекса. Наиболее эффективными оказались ионы сульфата и тетрабората. Сульфат-анион ингибирует, а тетраборат -анион - активирует комплекс. Влияние этих анионов обусловлено экранированием электростатического взаимодействия между молекулами гаптоглобина и гемоглобина.

12. Установлено, что гаптоглобин, связывая гемоглобин, в прочный комплекс, изменяет структуру его молекулы, стабилизирует и активирует ее. В результате увеличивается пе-роксидазная активность, стабильность против кислотной денатурации и окислительного действия кислорода воздуха.

13. Показано, что гаптоглобин способен связывать в прочный комплекс и метгемоглобин, денатурированный при рН 3,5. При этом частично восстанавливается структурная целостность и пероксидазная активность метгемоглобина.

14. Найдено, что пероксидазная активность комплекса гаптоглобина овцы с метгемоглобиноми разных видов млекопитающих имеет максимальное значение при рН 4,3, которое отличается от оптимума рН для активности комплексов Нр-Нь, образованных гаптоглобинами других видов позвоночных, Указано на существование видовой специфичности гаптоглобина, проявляющееся в его влиянии на свойства гемоглобина.

15. Обнаружено, что при наличии патологии у овец уровень гаптоглобина в сыворотке крови увеличивается, снижение активности процесса приводит к его уменьшению. Отмечено, что гаптоглобин может служить тестом физиологического состояния организма животного.

16. Установлено, что гаптоглобин увеличивает степень суперовуляции у мышей, вызываемой гонадотропином сыворотки жеребой кобылы. Предлагается схема, объясняющая рост числа овулировавших фолликул под влиянием гаптоглобина. Предположено, что гаптоглобин принимает активное участие в регуляции концентрации эстраднола при развитии, созревании и овуляции фолликулярных клеток.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бейсембаева, Роза Ултубаевна, Алма-Ата

1. Ажгихин И.С., Лакин K.M., Макаров В.А. В кн. "Простаглан-дины" под ред. И.С.Ажгихина, М., Медицина. 1978.

2. Алексеева A.M., Фенина Е.П. 0 возможности образования сывороточного гаптоглобина у новорожденных. Вопр.мед.химии, 1968, т.14, в.З, с.252-255.

3. Алимова М.М. Генотипы и фенотипы гаптоглобина. Генетика, 1968, т.4, № 8, с.165-179.

4. Андреева А.П., Белостоцкий В.М., Розенберг Г.Я. Сравнительное изучение пероксидазной активности комплексов мет- и оксигемаглобина с гаптоглобином. Вопр.мед.химии, 1973 а, т.19, № 4, с.378-380.

5. Андреева А.П., Белостоцкий В.М., Розенберг Г.Я. Отсутствие влияния видовой специфичности гаптоглобинов на пероксидазные свойства гаптоглобин-гемоглобиновых комплексов. Докл.АН СССР, 1973 б, т.208, № 5, с.1226-1227.

6. Андреева А.П., Левина A.A., Белостоцкий В.М., Шлимак В.М., Розенберг Г.Я. Влияние гаптоглобина на иммунохимические свойства гемоглобина. Бюл.эксперим.биол. и мед., 1971, т.72, № 2, с.58-61.

7. Баранова И.Н., Галстян К.С. Определение гаптоглобина в сыворотке крови у больных после протезирования митрального клапана. Лабор.дело, 1980, № 6, с.339-340.

8. Белостоцкий В.М., Андреева А.П., Шлимак В.И., Розенберг Г.Я. Выделение и свойства гаптоглобина сыворотки крови лошади.

9. Биохимия, 1973, т.38, № 4, с.733-737.

10. Белостоцкий В.М., Плющ О.П., Токарев Ю.Н. Распределение фенотипов гаптоглобина в семьях больных гемофилией. Пробл. гематол. и переливания крови, 1980, т.25, № 3, с.57-58.

11. Березин И.В. и др. В кн. Иммобилизованные ферменты, т.1, с.78, 84, I59-I6I, под.ред.проф. И.В.Березина, д.х.н. К.Мартине ка, изд.МГУ, 1976.

12. Боголюбский С.Н. Внутриутробное формирование и развитие телосложения у мериносов и прекосов. Тр. ин-та морфологии животных им.А.Н.Северцева. АН СССР. 1959, вып.23.

13. Боуэн Т. В кн. Введение в ультрацентрифугирование, под. ред. В.О.Шпикитера, изд.Мир, М., 1973, с.58.

14. Быстрова И.М. Гемопексин, его функция и диагностическое значение. Пробл.гематол. и переливания крови, 1976, т.21, № б, с.28-33.

15. Васыгова Н.Ф., Лорие Ю.И. Диагностическое значение определения активности . церулоплазмина и содержания гаптоглобина у больных лимфогрануломатозом. Вестн.Акад.мед.наук, СССР, 1974, № 12, с.20-24.

16. Волкова З.И., Кайнова А.С., Балабанова P.M. Гаптоглобин и церулоплазмин при системной склеродермии. Вопр.мед.химии, 1977, т.23, в.З, с.294-297.

17. Гинодман JI.M.B кн.Современные методы в биохимии, т.1, с. под.ред.Ореховича В.Н., М., изд.Медицина, 1974.

18. Гугешашвили Ш.И., Анасашвили А.Ц., Джангулашвили З.С. К вопросу содержания гаптоглобина и церулоплазмина в сыворотке крови больных атеросклерозом. Сабраме медицина, 1972, № 4, с.20-22.

19. Жизневекая Г.Я. Проблемы молекулярной эволюции белков на примере гемоглобина и цитохромов. Успехи соврем.биологии,1980, т.89, вып.1, с.3-17.

20. Ноли М. В кн. Физическая химия денатурации белков, под. ред. чл.-корр. АН СССР М.В.Волькенштейна, изд.Мир, М., 1968, с.304.

21. Замчий A.A., Жеребцов Л.А. К вопросу о содержании гаптоглобина при циррозах печени. Лабор.дело, 1973, № II, с.651-653.

22. Ипатов В.В., Лукъяненко В.И. Сывороточные белки рыб: гетерогенность, структура и функции. Успехи соврем.биологии, 1979, т.88, вып.14, с.104-124.

23. Иржак Л.И. В кн. Гемоглобины и их свойства. М., Наука, 1975, с.41-55.

24. Коржуев П.А. 0 соотношении между особенностями крови и скелета в индивидуальном развитии сельскохозяйственных животных. -Тр. ин-та морфологии животных им.А.Н.Северцева, 1957, вып.22, с.47-52.

25. Кричевская A.A., Лукаш А.И., Карташева Л.Р. Ассоциация мочевины с белками при ее низких концентрациях. Биохимия, 1973, т.38, вып.4, с.700-706.

26. Лазуренко И.С. Судебно-медицинское значение типов гаптоглобина. Дисс.канд.мед.наук, 1965, М.

27. Ледяева Е.М. Гистогенез печени овцы в эмбриональный и плодный периоды развития. Физиология, морфология и биохимия с/х животных. - Сб. Ленинградского вет.ин-та, 1973, вып.33, с.252-258.

28. Логинов A.C., Крель П.Е., Гинтер Г.К. Частота фенотипов гаптоглобина у больных с хронически активными заболеваниями печени. Терапев.архив, 1980, т.52, № 7, с.43-46.

29. Маурер Г. В кн.Диск-электрофорез, изд.Мир, М., 1971.

30. Мельничук В.И. Содержание сывороточного гаптоглобина у больных в различные периоды ишемической болезни сердца. Здра-вохранение Белоруссии, 1971, № 9, с.22-23.

31. Плахотников А.Г. Полиморфизм гаптоглобина и трансферрина у трех пород свиней. Цитология и генетика, 1976, т.10, № 4, с.353-356.

32. Поспелова A.B., Родионов В.М. Гаптоглобины сыворотки крови, их свойства, структура и обмен. Успехи биол.химии, 1970, т.II, с.128-148.

33. Поспелова A.B., Тууль Л.И. Изменение концентрации гаптоглобина в сыворотке крови собак и крыс при лучевой болезни. -Радиобиология, 1968, т.8, вып.2, с.220-223.

34. Прохуровская З.Я., Мовшович Б.Л. Методика и диагностическое значение определения гаптоглобина. Лабор.дело, 1972, № 6, с.333-335.

35. Родионов В.М., Поспелова A.B., Решетко Ю.П., Кулакова Т.Г.ф

36. Обмен гаптоглобина при асептическом воспалении. Вопр.мед.химии, 1970, т.16, вып.1, с.95-98.

37. Родионов В.М., Поспелова A.B., Тууль А.П., Кулакова Т.Г. Период полужизни и распределение Нр в организме при лучевой болезни. Вопр.мед.химии, 1969, т.15, вып.З, с.251.

38. Серов О.Л., Хлебодарова Т.М., Закиян С.М. Электрофоретичес-кие варианты гаптоглобина плазмы крови у серебристо-черных и красных лисиц. Генетика, 1973, т.9, № II, с.79-81.

39. Старостин H.H., Черковский И.Н. Качественное и количественное определение гаптоглобинов крови человека. Лабор.дело, 1966, № 4, с.200-202.

40. Степанов В.М. Эволюция белков. Журнал Всесоюзного хим. общества им.Д.И.Менделеева, 1980, т.25, № 3, с.323-331.

41. Троицкая O.B. Сравнительное исследование миоглобинов человека и некоторых животных. Автореф.дисс. на соискание уч. степени канд.биол.наук. М., 1969.

42. Турченко Е.И., Блинова А.И., Сенчило Е.А. Изменение содержания гаптоглобина при гемолитической анемии после спленэкто-мии. Пробл.гематол. и переливания крови, 1970, т.15, № 12, с.10-15.

43. Успенская В.Д. 0 месте синтеза и катаболизма гаптоглобина и его роли в обмене гемоглобина. Вопр.мед.химии, 1970, т.16, № 3, с.227-240.

44. Успенская В.Д. Гаптоглобин, строение и функция связывания гемоглобина. Успехи соврем.биол., 1971, т.71, вып.1, с.43-66.

45. Успенская В.Д., Плескова М.В., Неделяева М.И. Метод выделения больших количеств гаптоглобина из крови собаки. Вопр.мед. химии, 1968, т.14, вып.З, с.324-329.

46. Харрис Г. В кн. Основы биохимической генетики человека. -изд.Мир, М., 1970, с.79-100.

47. Хиппель П., Шлейх Т. Влияние нейтральных солей на структуру и конформационную стабильность макромолекул в растворе. -В кн.Структура и стабильность биологических макромолекул в растворе. Изд.Мир, М., 1973, с.320-478.

48. Чагиров И.А., Дьяченко О.В., Мальченко A.C. Рост и развитие плодов эдильбаевских овец. В кн. Тр. ин-та экспериментальной биологии АН КазССР. Изд.Наука, Алма-Ата, 1980, т.14, с.I17-124.

49. Черкавский И.Н. Об уровне гаптоглобина в 1фови различных отделов сосудистого русла трупа. Судебно-мед.экспертиза, 1973, т.16, № I, с.30-31.

50. Чудиновских A.B., Будовская Н.Г. Содержание углеводных компонентов в сывороточном белке (гаптоглобине) собаки.

51. Вопр,мед,химии, 1966, т,П, №5, с.53Э.

52. Akaiwa S.,Higo Y.»Nakajima H. Studies on hemoglobin metabolism. 1. Role of haptoglobin in the organ distribution of hemoglobin in vivo.-Proc.Japan Acad., 1976, v.52,N8,p.457-460.

53. Alfsen A.,Chiancone E.,Wyman J.,Antonini E. Studies on the reaction of haptoglobin with hemoglobin and hemoglobin chains.11. Kinetics of complex formation.-Biochim.et biophys. acta,1970, v.200, N1, p.76.

54. Allison A.C. Genetic control of human haptoglobin synthesis. -Nature, 1959, v.183, N4671, p.1312-1314.

55. Alper C.A.,Davis A.E. Plasma proteins.-Ann.Rev.Clin.Bi-ochem. 1980, N1, N.Y.C.R. p.357-370.

56. Alper G.A.,Peters J.H.,Birtch A.G.,Garden P.H. Haptoglobin synthesis.1.In vivo studies of the production of haptoglobin, fibrinogen and j'-globulin by canine liver. -J.Clin. In-vestig.,1965, v.44, N4, p.574-581.

57. Andrews P.C. The gel-filtration behaviour of protein related to their molecular weights over a wide range.-Biochem. J., 1965, v.96, p.595.

58. Andrew P.C.,Pastewka J.et al. Haptoglobin-hemoglobin interaction sioichiometry.-Biochemistry, 1970,v.9,N11, p.227.

59. Antonini E. Hemoglobin and its reaction with ligands.The alpha-beta dimer appears to be the important unit in hemoglobin function.-Science,1967,v.158,N3807, p.1417-1425.

60. Antonini E.»Anderson N.M.,Brunori M. Properties of the product of partial photodissociation of carbon monoxidehemoglobin«-J.Biol.Chem.,1972,v.247,N1,P.319-321.

61. Arcoleo J.P.,Greer J. Hemoglobin binding site and its relationship to the serine protease-like active site of haptoglobin.—J.Biol.Chem.1982,v.257,N17,p.10063-10068.

62. Arronz H.,Teresa G.,Recio J.M.,Plaus J. Serum haptoglobin in some domestic mammals.-Rev.esp.fisiol.1972,v.28,N1,p. 73-78.

63. Ashwell G.,Morell A.G. The role of surface carbohydrates in the hepatic recognition and transport of circulating glycoproteins.-In book Advances in Enzymology,Ed.Meister A., v.41,p.99-128,Willey,Uew York,1974.

64. Baglia F.A.,Kwang S.Y/.,Puller G.M.Haptoglobin biosynthesis in rats.Immunological identification of polysomes synthesizing haptoglobin and quantitation of haptoglobin in the cytoplasm of liver cells.-Biochim.et biophys.acta,1981,v.696, Fl,p.107-113.

65. Baird D.T.,Swanston Pan A., McNeilly A.S.Relationship between LH,FSH and prolactin concentration and the secretion of androgens and estrogens by the preovulatory follicle in the ewe.-Biol.of Reprod.,1981,v.24,p.1013-1025.

66. Barbosa J.,Seal U.S.,Doe R.P.Effects of anabolic steroids of haptoglobin,orosomucoid,plasminogen,transferrin,ceru-loplasmin, a-antitrypsin, ^-glucouronidasa and total serum proteins.-J.Clin.Endocrinol.and Metabol.,1971,v.33,N3,p.388-399.

67. Barnet D.R.,Lee Tong-Ho,Bowman B.H. Amino acid sequence of the carboxyl terminal octapeptide of human jJ-chain.-Nature 1970,v.2255236,p.938-939.

68. Bedirian K.If. ,Baver R.D.Follicular development,oocyte maturation and ovulation in gonadotropin-treated prepuberal calves.-Can.J.Animal Sei., 1975,v.55, N2, p.193-199.

69. Benesch R.E.,Ikeda J.,Benesch R. Reaction of haptoglobin with hemoglobin covalently cross-linked between the clj>-dimers.-J.Biol.Chem.19T6, v.251, N2, p.456-470.

70. Bergstrand C.G.,Cxar B.,Tarucoski P.H. Serum haptoglobin in infancy.-Scand.J.Clin.Investig.,1961,v.13,N4,p.576-582.

71. Bertmand G. UHT.no Methods of Biochem.Analysis.-v.1,p.385,1959.

72. Bissel D.M.,Hammaker L.,Schmid R. Hemoglobin and erythrocyte catabolism in rat liver. The separate role of parenchymal and sinusoidal cells.-Blood 1972,v.40, N6,p.812-822.

73. Black J.A.,Chan C.P.,Hew C.L.,Dixon P.H. Gene action in the human haptoglobin,111. Isolation of the a-chains as single gene products. Isolation,molecular weight and amino acids composition of a-and p-chains.-Can.J.Biochem.,1970, v.48, p.123-132.

74. Black J.A.,Dixon G.H. Amido-acid sequence of alpha chains of human haptoglobins.-Nature(London),1968, v.218,p.736-741.

75. Brunori M.,Giardina B.,Condos S.,Falcioni G.,Antonini E. Properties of trout hemoglobin covalently bound to a solid matrix.-Biochim.et biophys.acta,1977, 494, 426-432.

76. Busby W.H.,Travis J.C. Structure and evolution of artio-dactila haptoglobins.-Compar.Biochem.and Physiol., 1978, v.60, N4, p.389-396.

77. Butler P.J.G.,Harris J.P.»Hartley B.S.,Leberman R.The use of maleic anhydride for revérsible blocking of amino-groupe in polypeptide chains.-Biochem.J.,1969,v.112,p.679.

78. Cheftel R.J.,Moretti J.,Sur la structure des haptoglobins humaines.-Comp.Rend.Acad.Sci.,Paris,1966,v.D 262,p.1982 -1984.

79. Cheftel R. J. ,Pamaudean M.A.,Moretti J. ,Bourrillon R. Composition aminoacids et groupments terminas: des chaines et de l'haptoglobine de Lapin.-Comp.Rend.Acad.Sci.,1971,v.D 272, N26,p.3360-3362.

80. Chiancone E.,Alfsen A.,Ioppolo C.,Vecehini P. Studies on the reaction of haptoglobin with haemoglobin and haemoglobin chains.1.Stoichiometry and affinity.-J.Molec.Biol.,1968,v.34, N2,p.347-356.

81. Chiancone E.,Antonini E.,Brunori M.,Alfsen A.,Lavialle P. Kinetics of the reaction between oxygen and haemoglobin bound to haptoglobin.-Biochem.,J.,1973,v.133,N1,p.205-207.

82. Chiao M.F.,Bezkorovainy A.1972.Interaction of modified haptoglobin with hemoglobin.-Biochim.et biophys.acta,1972, v.263,N1,p.60-69.

83. Child J.A.,Roberts B.E.,Illingworth S.,Cooper E.H. Acute phase reactant proteins in chronic leukaemie.-Biomed.Express, 1977,v.27,N5,p.188-190.

84. Chow V.,Murray R.K.,Dixon J.D.,Kurosky A. Biosynthesis of rabbit haptoglobin:chemical evidence for a single chain precursor.-PEBS Letters,1983,v.153,N2,p.275-279.

85. Chung W.P.,Smith D.B.Characterisation of tryptic peptides from porcine haptoglobin light chains and an aminoacid sequence.-Can.J.Biochem.,1976,v.54,N1,p.93-98.

86. Cloarec L.,Moretti J,,Rafelson M. Composition chimique de l1 haptoglobine huraaine.-Corapt.Rend.Acad,Sci.,1963,v.257, N4, p. 983-985.

87. Cohen D.P.,Noble R.W.,Reichlin M. Comparative binding studies of the hemoglobin, -haptoglobin and hemoglobin-anti-hemoglobin reactions.-Bioch emis try,1973,v.12,N19,p.3744-3751.

88. Connell G.E.,Dixon G.H.Subdivision of the three common haptoglobin types based on "hidden" differences.-Nature, 1962,v.193,N 4814,p.505-506.

89. Connell G.E.»Smithies 0. Human haptoglobins.Estimation and purification.-Biochem.J.,1959,v.72,p.115-129.

90. Connell G.E.»Smithies 0.,Dixon G.H. Gene action in the human haptoglobins.11.Isolation and physical characterisation of alpha-polypeptide chains.-J.Molec.Biol.,1966,v.21,p.225-229.

91. Dayhoff M.O., .McLaughlin P. J.,Barker W.C. ,Hunt L.T.Evolution of sequences within protein superfamilies.-Naturwis-senshaften,1975,v.62,Heft 4,s.154-161.

92. Deby C.,Van Caneghem P.,Bacq Z.M. Arachidonate induced hypotension and haptoglobin plasma level in the rabbit.-Bi-ochem.Pharmacol.1978,v.27,N4,p.613-615.

93. Delers P.,Musquera S.,Domingo M. ,Lombart C.Characterization of a chicken hemoglobin-binding proteinra novel haptoglobin. -Compar. Biochem.and physiol.,1983,v.A74,N3,p.745-748.

94. Dobryszyska W.,Bec I. Effect of modification on physi-cochemical and biological properties of haptoglobin.111.Antigenic reactivity of haptoglobin with bloced tyrosineof tryptophan residues.-Biochim.et biophys.acta,1971,v.243» H2,p.178-186.

95. Dobryszyska W.,Elwin D.H.,Kukral J.C. Isolation and chemical composition of canine haptoglobin.-Biochim.et biophys. acta,1969,v.175,N1,p.220-222.

96. Dobryszyska W.,Krawczyk E.Microheterogeneity of mammalian haptoglobin in isoelectric focusing.-Compar.Biochem. and. Phisiol., 1979,v.62B,N1,p.111-4-13.

97. Dobryszyska W.»Lisowska E. Effect of degradation on the chemical and biological properties of haptoglobin.1.Products of tryptic digestion.-Biochim.et biophys.acta,1966,v.121,HI, p.42-50.

98. Dobryszyska Yf.,0sada J.Effect of modification on physi-cochemical and biological properties of haptoglobin.-Acta biochim.pol.1973, v. 20, IT2, p. 145-152.

99. Dobryszyska V/. ,0sada J.Hybridisation of human and porcine haptoglobins.-Int.J.Bioch em.,1977,v.8,N7,p.511-515.

100. Dobryszyska W.,0sada J.,Charazyczewcki J. Hepatic binding of modified glycoproteins in some species of verter-brates.-Compar.Biochem.and Physiol.,1982,v.71B,N3 ,p.259-263.

101. Dobryszyska W.,0sada J.,Woyton M. Metabolic studies on hybrid haptoglobin.-Int.J.Biochem.,1979,v.10,N1,p.75-79.

102. Dobryszyska W.,Pusztai A.,Kukral J.C. Reactivity of tyrosine and tryptophan residue in haptoglobin.-Biochim.et biophys.acta, 1 969,v.175,N2,p.271-281.

103. Dobryszyska W.»Wozniak M.,Krawczyk E.,Furmaniack-Kazimi-erczan E.,Carbohydrate-mediated catabolism of mammalian haptoglobin and haptoglobin-hemoglobin complex in the chicken.-Int.

104. J.Biochem.,1981,v.13,N6,p.739-743.

105. Dvorankovâ B.,Pavlicek Z.The conformation changes of haemoglobin on its haptoglobin.-Collect.Czechosl.Chem.Communs., 1981,v.46,N5,p.1288-1295.

106. Eaton J.W.,Brandt P.,Mahoney J.P.,James T.,Lee Ir.Haptoglobins natural bacteriostat.-Science,1982,v.215,p.691-692.

107. Ehrholm C. Immunological studies on the haptoglobin subgroups in man.University of Helsinki,1969,15p.

108. Ernes A.K.,Lather A.L.,Martin J.A.,Milligan P.A.Studies on the binding of hemoglobin by haptoglobin using electrophocu-sing and gradient electrophoresis.-Biochim.et biophys.acta, 1976,v.420,N1,p.57-68.

109. Engler R.,Moretti J.,Jayle M.P. Catabolisme du complexe haptoglobin-hemoglobine.-Bull.Soc.chim.biol.,1967,v.49,p.263-272.

110. Peger J.,Durant C.,Dumont J.P.,Agneray J.,Engler R.De-minution de la captation par l'hepatocyte isole de rat de l'asialo-haptoglobine aprec combinaison avec 1'hemoglobine.-Compt.Rend.Acad.Sci.Paris,1981,v.292,Serie 111,N17,p.983-986.

111. Fraser J.H.,Smith D.B. Studies on porcine haptoglobine and its complex with human haptoglobin,-Can.J.Biochem.,1971, v.49,N2,p.141-147.

112. Fuller G.M.,Rasco M.A., McCombs M.L.,Barnett D.R.»Bowman B.H. Subunit composition of haptoglobin 2-2 polymers.-Biochemistry,1975,v.12,N2,p.253-258.

113. Galatius-Jensen F.The Haptoglobins.A genetical study, thesis,Copenhagen,1960.

114. Geoh G.C.,Morgan E.H. Albumin and transferrin synthesis during development in the rat.-Biochem.J.,1974,v.144,N2,p.215.224.

115. Gitlin D.,Boesman M. Fetus-specific serum proteins in several mammals and their relation to human a-fetoprotein. -Compar.Biochem.and Physiol.,1967,v.21,p.327-336.

116. Gohler W. ,Bundschuch G. Zwei offenbar genetisch bedig-te Haptoglobin-phenotypen in either sippl.-Z.artzliche For-tbildung,1962,Heft 14,s.767.

117. Goodger B.H. Preliminary characterization of the bovine polymeric Hb-binding protein and comparison of some properties with human haptoglobins.-Austral.J.Exptl.Biol.and Med. Sci.,1972,v.50,FI,p.11-20.

118. Gordon S.,Bearn A.G. Hemoglobin binding capacity of isolated haptoglobin polypeptide chains.-Proc.Soc.Exptl.Biol, and Med.,1966,v.21,N3,p.846-850.

119. Gordon S.,Cleve H.,Beam A.G. An improved method of preparing haptoglobin polypeptide chains using guanidine hydrochloride.-Proc.Soc.Exptl.Biol.and Med.,1968,v.127,N1,p.52-59.

120. Gordon A.H.,Limaos E.A.Effects of bacterial endotoxin and corticosteroids and plasma concentrations of <x2-macroglo-bulin,haptoglobin and fibrinogen in rats.-Brit.J.Exptl.Pathol. ,1979,v.60,N4,p.434-440.

121. Greer J. Moder for haptoglobin heavy chains based upon structural homology.-Proc.Hat.Acad.Sci.USA,1980,v.77,N6,p. 3393-3396.

122. Greer J.,Liao Wei-Duan Lin,Brown W.E. Haptoglobin-he-moglobin complex.-J.Biol.Chem.,1981,v.256,N16,p.8771-8774.

123. Hamaguchi H. Purification and some properties of the three common genetic types of haptoglobin and the hemoglobin-haptoglobin complexes.-Amer. J.Human Genetics, 1969,v.21 ,N5 , p.440-456.

124. Hamaguchi H.,Isomoto A.,Miyake J.,NakaJiraa H. Some spectral properties of the human hemoglobin-haptoglobin complex. -Biochemistry,1971,v.10,p.1741-1745.

125. Hamaguchi H. ,SasazuIci T. Control of haptoglobin metabolism. 111 .Purification of the hemoglobin-haptoglobin 1-1 type. -Proc.Jap.Acad.1967,v.43,p.332-337.

126. Hammerberg B.,Brett J.,Kitchen H. Ontogenesis hemoglobin of sheep.-Ann.N.Y.Acad.Sei.,1974,v.241,p.642-681.

127. Hanset R.,Ansay H. Le polymorphisme des haptoglobines dans deux races porcines beiges.-Ann.med.Veterin.1966,v.110, N1,p.56-70.

128. Harvey J.W., Quantitative determination of normal horse, cat,and dog haptoglobins.-Theriogenology,1976,v.6,N2-3,p.133-138.

129. Haugen T.H.,Hanley J.M.,Hoath E.C. A novel mode of a biosynthese of a liver secretory glycoprotein.-J.Biol.Chem.,1981, v.256,N3,p.1055-1057.

130. Haykawa J.J.,Tsuchiya T. Haptoglobin levels in plasma of irradiated mice.-Radiat.Res.,1974,v.57,N2,p.239-245.

131. Haykawa J.J.,Tsuchiya T.,Dey T. Plasma haptoglobin levels and radiation chimeras in raice.-Radiat.Res.,1976,v.66,N2,p. 384-392.

132. Heilman E. Das Haptoglobin beil verschiedenen Erkrankungen.-Polia hematol.,1977,v.104,N5,s.608-618.

133. Herschko C. The fate of circulation haemoglobin.-Brit.J. Haematol.,1975,v.29,N2,p.189-204.

134. Hever Ö. The effect of inactivation of sera on the peroxydase activity of haptoglobin-hemoglobin complex.-Experiential 973, v. 29,N8,p. 1023-1024.

135. Hever O.The effect of oxygen on the hemoglobin binding capacity of haptoglobins.-Experientia,1974,v.30,Fl2,p.1373-1374.

136. Hever 0.Hemoglobin binding capacity of heat incubated sera of different haptoglobin subtypes.-Experientia,1977,v. 33,N5,p.599-600.

137. Hever 0.,Vadasz G.,Hollo T.,Csaki P. Determination of haptoglobin levels in implical cord blood of newborns.Haptoglobin types of maternal and umbilical cord blood poirs.-Biol.Neonate,1972,v.20,N3-4,p•24 5-25 2.

138. Hinton R.H.,Dobrota M.,Mullock B.M. Haptoglobin-media-ted transfer of haemoglobin from serum into bile.-PEBS Letters, 1980,v.112,N 2,p.247-250.

139. Hirayama C.,Nakamura H.,Koga S. Serum haptoglobin type and liver cirrohosis.-Humangenetic,1975,v.28,N2,p.139-146.

140. Hirshfeld J.V.,Lunell N.0. Serum protein synthesis in fetus haptoglobins and group-specific components.-Nature, 1962,v.196,N 4860,p.1220.

141. Honlon S.,Nagel G. ,Boyd R. et al. The dissociation", of bovine hemoglobin at acid pH.-Biochim.et biophys.acta,1971,v. 229,N2,p.359-367.

142. Hooper D.C.,Peacock A.C. Determination of the subunit composition of haptoglobin 2-1 polymers using quantitative densitometry of polyacrylamide gels.-J.Biol.Chem.,1976,v.251, N 19,p.5845-5851.

143. Hooper D.C.,Steer C.J.»Dinarello C.A.,Peacock A.C. Haptoglobin and albumin synthesis in isolated rat hepatocytes.

144. Response to potential mediators of the acute-phase reaction -Biochim.et biophys.acta,1981,v.653,N1,p.118-129.

145. Hwang P.K.,Greer J. Interaction between hemoglobin sub-units in the hemoglobin-haptoglobin complex.-J.Biol.Chem.,1980,v.255,N7,p.338-341.

146. Jaenicke R.,Pavlicek Z. On the nature of the hemoglobin-haptoglobin interaction.-Z.Naturforsch.,1970,b.25,N11, p.1272-1277.

147. Jarret J.G. A polymeric form of hemoglobin binding protein in sheep following metabolic and hormonal disturbance.-Aust.J.Biol.Sci.,1972,v.25,N5,p.941-948.

148. Javid J. Hp 2-1 Bellevue,Hp p-chain mutant.-Proc.Nat. Acad.Sci.USA,1967,N57,p.920-924.

149. Javid J.,Fuhrman M.N. Structural markers of haptoglobin in man and in the nonhuman primates.-Amer.J.Human Genet.,1971, v.23,p.496-506.

150. Javid J.,Liang J.C. The hemoglobin-haptoglobin bond.1. Dissociation of the complex and recovery of the native haptoglobin in an affinity chromatography system.-J.Lab.and Clin. Med.,1973,v.82,N6,p.991-1002.

151. Javid J.,Pettis P.K. The modification of hemoglobin-an-tihemoglobin reaction by haptoglobin.-J.Lab.and Clin.Med., 1975,v.86,N5,p.775-784.

152. Javid J.,Yingling W. Immunogenetics of human haptoglobins. 1 .Antigenic structure of normal haptoglobin phenotypes. -J.Clin.Investig.,1967,v.47,N10,p.2290-2296.

153. Jayly M-F.,Judas 0. Formule glycoproteidique du plasma sanquin.-Helv.Chim.Acta,1946,v.29,p.1310.

154. Jellinck P.H.»Fletcher R.M. Peroxidase catalyzed conjugation of ( 4-^c) estradiol with albumin and thiols .-Can. J, Biochem.,1970,v.48,N11,p. 1192-1198.

155. Kaden J.,Groth J.,Geserick G.»Kaden К.,Gretel Mara M., May G.,Scholz D. Haptoglobintyp und Neirentransplantation.-Dtsch.Gesendheitswesen,1979,v.34,N50,p.2511-2514.

156. Kahlich-Koenner D.M.,Weippl G. Haptoglobin gruppen beim Neugeborenen.-Klin.Wochenschr.,1960,v.72,s.674-676.

157. Kalous V.,Pavlicek Z. Interaction of haptoglobin with hemoglobin.-Biochim.et biophys.acta,1965,v.111,N1,p.337-338.

158. Kalous V.,Pavlicek Z. A contribution to the study of haptoglobin-haemoglobin interaction.-Collect.Czechose Chem. Communs.,1966,v.31,N2,p.695-702.

159. Kampschmidt R.F.Upchirch H. Effect of leukocytic endogenous mediator on plasma fibrinogen and haptoglobin.-Proc. Soc.Exptl.Biol.and Med.,1974,v.146,N3,p.904-907.

160. Kandier J.,Leopold L. Die Ausbildung der Haptoglobinty-pen in Sauglingsalter.-Klin.Wochenschr.,1963,v.41,s.1082-1083.

161. Katnic J.,Dobryszyska W. Effect of modification on physico-chemical and biological properties of haptoglobins.Reaction with N-bromosuccinimide and 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide.-Acta biochim.pol.,1978,v.25,N4,p.325-332.

162. Kawamura K.,Kagiyuma S.,0gawa A.,Yanase T.The reaction unit of haemoglobin in haemoglobin-haptoglobin complex formation. -Biochim. et biophys.acta,1972,v.285,N1,p.15-21.

163. Kawamura K.,Kagiyama S.,0gawa A.,Yanase T.Kinetics of Peroxydase activity,absorbtion spectra and oxygen affinity of human hemoglobin-haptoglobin 1-1 Complex.-Biochim.et biophys .acta,1972,B.285,N1,p.22-27.

164. Kawamura K.,Ogawa A.,Tachibana N. ,Ohokubo H.,Shibata K., Yakasi T. Type-dependent difference in the metabolism of human haptoglobin.-Jap.J.Hum.Genet.Tashiyaki Yanase.,1979,v.24, N2,p.85-94.

165. Kawasaki T.,Ashwell G. Chemical and physical properties of the hepatic membrane protein that specifically binds asia-lloglycoproteins.-J.Biol.Chem.,1976,v.261,p.1296-1302.

166. Kazim A.L.,Atassi Z. Haemoglobin binding with haptoglobin. Unequivocal demonstration that the p-chains of human haemoglobin bind to haptoglobin.-Biochem.J.,1980,v.185,N1,p. 285-287.

167. Kazim A.L.,Atassi Z. Hemoglobin -binding with haptoglobin. Localization of the haptoglobin-binding size on the <t-chain of human haptoglobin.-Biochem.J.,1981,v.197,N2,p.507-510.

168. Katz S.,Shaw M.E.,Chillog S.,Miller J.E. Protein-ionic detergent interaction.Volume and electrophoretic changes produced by sodium dodecyl sulfate reaction with bovine serumalbumin.-J.Biol.chem.,1972,v.247,p.5228-5233.

169. Kendall P.D.A.,Butt N.M.,Saeed S.A.,Collier H.O.J. Differential effects of haptoglobin and albumin on the oxigena-tion of arachidonic acid during prostaglandin biosynthesis.-Biochem.Soc.Trans.,1980,v.8,N1,p.78-80.

170. Kendal P.A.,Saeed S.A.,Collier H.O.J. Identification of endogenous inhibitor of prostaglandin synthetase with haptoglobin and albumin.-Biochem.Soc.Trans., 1979,v. 7,N3., p.543-545

171. Kimura H.,Yamato S.,Murachi T. Different susceptibilities to intracellular proteases of hemoglobin and hemoglobin- haptoglobin complex.-Physiol.Chem.and Phys.,1976,v.8,N2,p.101-106.

172. Kino K.,Tsunoo H.,Higa Y.,Takami M.»Hamaguchi H.,Naka-jima H. Hemoglobin-haptoglobin receptor in rat liver plasma membrane.-J.Biol.Chem.,1980, v.255, N2,p.9615-9620.

173. Kirk R.L. The haptoglobin groups in man.Basel (Swizer-land).-N.Y.Karger, 77p., Monographs in human genetics, 1968, v.4.

174. Klebanoff S.J.,Segal S.J. The inactivation of estradiol by peroxidase.-J.Biol.Chem.1960, v.235,Fl, p.52-55.

175. Knyszynski A.,Burger M. Increase of haptoglobin concentration in mouse serum by endotoxin and by serum factor.-Experientia,1971,v.27, N7, p.838-839.

176. Kodama M. »Hashimoto K.,Matsuura P. Studies on the haptoglobin in cell.IV. Binding behavior of haptoglobin with hemoglobin.-Bull.Jap.S oc.S ci.Pish.,1976,v.42,N8,p.857-861.

177. Köhler W.,Prokop 0. Haptoglobintyp und G-Streptokokken. Dtsch.Gesundheitwesen,1977, v.32,p.248.

178. Köhler W.»Prokop 0. Relationship between haptoglobin and streptococcus pyogenes T-4 antigens.- Nature,1978,v. 271, p.373.

179. Köhler W.,Prokop 0.,Güther E.,Hiepe Th. Befunde bei Ziegen und Shafen beweisen die antikörperähnliche Punktionen der Haptoglobine.-Mh.Vet.Med.,1978, v.33, s.187-188.

180. Köhler W.,Prokop 0.,Uhlenbruck G. Zur Agglutinin-Natur der menschlichen Haptoglobin gegenüber Streptokokken mit den T-4 Antigen.-Naturwissenshaften,1977,v.64,p.585.

181. Komoriya K.»Hoshina K.,0htsu A.,Saito N.,Kurozumi S., Naruchi T.,Hashimoto Y.,Mizuno K.»Yamamoto S. Inhibition of prostaglandin synthesizing enzymes by haptoglobin and plasma of rats with inflamation.-Jap.J.Pharmacol.,1980,v.30,p. 899-904.

182. Korngold L. Antigenic differences among human haptoglobins .-Int.Arch.Allerg.f1963,v.23»P•268-280.

183. Komgold L. The effect of hemoglobin on the haptoglobin -antihaptoglobin reaction.-Immunochemistry, 1965 ,v.2,p. 103106.

184. Kurosky A.,Barnet D.R.,Rasco M.,Lee Т.Н.,Bowman B.H.Evi-dence of homology between the jJ-chain of human haptoglobin and the chymotrypsin family of serine protease.-Biochem.Genetics ,1974,v.11,N4,p.279-293.

185. Kurosky A.,Hay K.E.,Bowman B.H. Canine haptoglobine:a unique haptoglobin subunit arrangement.-Compar.Biochem.and Physiol.1979,v.B62,N4,p.339-344.

186. Kurosky A.,Hay R.E.,Kim H.H.,Touchstone B.,Rasco M.A., Bowman B.H. Characterisation of the cyanogen bromide fragments of ^-chains of human haptoglobin.-Biochemistry,1976, v.15,N24,p.5326-5336.

187. Makinen M.W. ,Kon H.Circular dichroism and electron paramagnetic resonance of the haptoglobin-hemoglobin complex. Biochemistry,1971,v.10,N1,p.43-52.

188. Makinen M.W.,Milstein J.B.,Kon H.Specificity of interaction of haptoglobin with mammalian hemoglobin.-Biochemistry, 1972,v.11,H21,p.3851-3860.

189. Malchy B.,Dixon G.H. The resemblance of the combination of human haptoglobin and double haemoglobin-molecules to an antigen-antibody reaction.-Can.J.Biochem.1970,v.48,N2,p.192.

190. Malchy B.,Dixon G.H. Studies on the interchain dissulfides of human haptoglobins.-Can.J.Biochem.,1973,v.51,N3,p. 249-264.

191. Malchy B.,Rorstad 0.,Dixon G.H. The half molecule of haptoglobin studies on the product obtained by the selective cleavage of a haptoglobin disulfide.-Can.J.Biochem.,1973,v.51,H3, p.265-273.

192. Manwell C.,Ann Baker C.M. in books Molecular biology and the origin of species.Heterosis,protein polymorphism and animal breeding.Univ.Washington.Press.1970.

193. Marty G.,Moretti J. Purification and structure of sheep haptoglobin.-FEBS Letters,1976,v.66,N1,p.137-141.

194. Meier P.,Seidel B.,Geserick G.,Luther P.,Patzelt D. Haptoglobin typisierung von serumproben ausgewahter Saugetieren mittels starkegelelectrophorese.-Monatsch.Veterinarmed.1980, B.35,N16,8.617-620.

195. Mitchel M.D.,Brennecke S.P.,Denning-Kendal P.A.,Gibson W.J.Dc.,Saeed S.A.»Collier H.O.J. Comparison between the abilities of various human and ovine plasmas to inhibit prostaglandin synthesis.-Prostaglandin and Med.1981,v.6,N5,p.495 -501.

196. Montag Th.Zru den Beziehungen Zwischenden Haptoglobinen und dem Immunsystem.-Dtsch.gesundheitswesen,1982,v.37,N5,s. 230-234.

197. Montag Th.,Geserick G.,Priem P. Beziehungen zwischen dem Haptoglobintyp und Antistreptolysintiter menschliher serumproben. -Dtsch. Gesundheitswesen, 1979, v. 34 ,p. 921.

198. Moretti J.,Allias S. Biosynthese de 1'haptoglobine par un systeme accellulaire de foie de rat.-Compt.Rend.Acad.Sci. 1971,v.C272,N23,p.1906-1908.

199. Moretti J.,Donatti R. Preparation et properties de 1' haptoglobine de mouton.-Compt.Rend.Acad.Sci(Paris),1973,v.D 277,N7,p.677-680.

200. Mucchielli A. Estrogen binding properties of a hapto-globin-hemoglobin complex isolated from human fetus.-J.Steroid.Biochem. 1982, v. 16,N6,p.71 3-71 6.

201. Murray R.K.,Connel G.E.,Pert J.H. The role of haptoglobin in the clearance and distribution of extracorpuscular hemoglobin.-Blood,1961,v.17,p.45-5 3.

202. Musquera S.,Lorabart C.,Jayle M.P. Identification of haptoglobin in chicken serum and specificity of the chicken haptoglobin-hemoglobin complex formation.-Compar.Biochem. and Physiol.1979,v.62B,N3,p.241-244.

203. Musquera S.,Planas J. Haptoglobins of some galliformes birds.-Poultry Sci.,1977,v.56,p.1777-1781.

204. Nagel R.L.,Gibson Q.H.Kinetic and mechanism of complex formation between hemoglobin and haptoglobin.-J.Biol.Chem., 1967,v.242,N15,p.3428-3434.

205. Nagel R.L.,Gibson Q.H. The binding of hemoglobin to haptoglobin and its relation to subunit dissociation of he-moglobin.-J.Biol.Chem.,1971,v.246,N1,p.69-73.

206. Nagel R.L.,Gibson Q.H. The hemoglobin-haptoglobin reaction as a probe of hemoglobin conformation.-Biochem.and Bi-pphys.Res.Communs,1972,v.48,N4,p.95 9-966.

207. Nagel R.L.,Ranney H.M. Haptoglobin binding capacity of certain abnormal hemoglobins.-Science,1964,v.144,N3621,p. 1014-1015.

208. Nagel R.L.,Wittenberg J.B. Oxygen equilibria of the hemoglobin-haptoglobin complex.-Biochim.et biophys.acta,1965, v.100,N1,p.286-289.

209. Nayak N.C.,Mital J. The dynamics of a-fetoprotein and albumin synthesis in human and rat liver during normal ontogeny.-Amer. J.Pathol. ,1 977,v.86 ,N2,p.359-374.

210. Noyes W.D.,Garby L. Rate of haptoglobin in synthesis in normal man.Determinations by the return to normal levels following hemoglobin infussion.-Scand.J.Clin.and Lab.Investig., 1967,v.20,N1,p.33-38.

211. Nyman M.,Gydell K. ,N6sslin B. Haptoglobin und erythroki> netik.-Scand.J.Clin, and Lab.Investig.,1959,v.4,p.82-87.

212. Nelson C.A. The binding of detergents to proteins.I.The maximum amounts of dodecyl sulfate bound to proteins and the resistance to binding of several proteins.-J.Biol.Chem.,1971 v.246,p.3895-3901.

213. Ohsihro T.,Kosaki G. Clinical study of haptoglobin therapy for prevention of hemoglobinuria,-Med.J.Osaka Univ.1979 v.19, N1, p.151-161.

214. Ohshiro T.,Mikai K.,Kosaki G. Prevention of hemoglobinuria by administration of haptoglobin.-Res.Exptl.Med.1980,v. 177,N1, p.1-12.

215. Ohshiro T.,Kosaki G.,Punakoshi S. Haptoglobin therapy: Effect on prevention and treatment of hemoglobinuria.-Med. J.Osaka Univ.1978,v.29, N3-4,p.269-270.

216. Ohshiro S*,Nakajima H. Studies on hemoglobin metabolism. VII. Intrahepatocellular site of the incorporation of heme and globin moiety of hemoglobin-haptoglobin after intravenous administration to rats.-Proc.Japan.Acad.1981, v.57, Ser.B., p.222-227.

217. Osada J.,Dobryszyska W. Isolation of antihaptoglobin antibodies by affinity chromatography.-Immunochemistry,1978,v. 15, N8, p.591-593.

218. Owen J.A.»Better F.C.,Hoban J. Simple method for the determination of serum haptoglobin.-J.Clin.Pathol. 1960, v.13, p.163-171.

219. Palmer W.G.,Schneler R.L. Association between macrophage activity and serum haptoglobines levels.-Biomed.Express. 1976, v.25,N3,p.88-90.

220. Pant H.C.»Hopkinson C.R.H.»Pitzpatric R.J. Concentration of oestradiol,progesterone,luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone in the jugular venos plasma of ewes during the oestrus cycle.-J.Endocrinology,1977,v.73, N2, p.247-255.

221. Pastewka J.V.,Hess А.Т.,Peacock A.C. Hemoglobin binding by isolated polymeric proteins from human haptoglobin types2.1 and 2-2.Some suggested polymer subunit compositions.-Biochim. et biophys.acta,1975,v.386,N2,p.530-537.

222. Pavlicek Z.,Janicke R. On the mechanism of hemoglobin-haptoglobin complex formation.-Eur. J.Biochem. ,1976,v. 18,N3, p.305-312.

223. Pavlicek Z.,Kalous V. Changes of blood haptoglobin in acid media.-J.Polym.Sei.C.,1967,N16,p.1061-1068.

224. Pavlicek Z.,Kalous V. A contribution to the study of two complexes of haemoglobin with haptoglobin.-Collect.Ôze-chosl.Chem.Communs,1973,v.38,N12,p.3675-3684.

225. Peacock A.C. Serum haptoglobin type and leukemia:An association with possible etiological significance.-J.Nat.Cancer Inst .,1916,v.36,N4,p.631-639.

226. Peacock A.C.»Pastewka J.V.,Reed R.A. et al.Haptoglobin-hemoglobin interaction stoichiometry.-Biochemistry,1970,v.9, N11,p.2275-2279.

227. Polonovsky M.,Jayle M.F. Existance dans le plasma sanguin d'une substance activant l'action peroxydasique de L' hemoglobine.-Compt.Rend.Soc.Biol.(Paris),1938,v.129,p.457-459.

228. Porto E.»Moretti J. Perturbation du dosage de l'hapto-globine dans le serum de mouton en reation inflammatiere»-Compt.Rend.Acad.Sei.,1971,v.D 272,N4,p.643.

229. Prokop Ô.,Köhler W. Menschlicher Haptoglobintyp und Gr-Streptokokken.-Acta biol.et med.german,1977 ,v.36,K11.

230. Prokop ÖV,Köhler V/., Untersuchungen zu den Beziehungen zwischen Haptoglobintyp und Streptokokken der Gruppe G.Relationship between Haptoglobin Types and Group G-Streptococ-ci.-Z.Immun.Forsch.,1977 ,v.153,N5,p.457-564.

231. Prokop Ö.,Köhler W. Erhaltung der Streptokokken Aktivität von Haptoglobin nach Hämoglobin Zuzatz.-Folia haematol. (DDR),1978,v.105,N3,s.367-369.

232. Prokop Ö.,Köhler W.Haptoglobins and antibody like proteins . -Z . Immun . Forsch 1 978b v . 1 54 , N4 , s . 407-408 .

233. Prokop Ö.,Köhler W.,Geserick G. Zur Frage der Gültigkeit der Haptoglobin/G-Streptokokken-Beziehungen bei nichtmenschlichen Serum.-Acta biol.et med.German,,1977,v.36,s.1499

234. Raam S.,Rewis G.P.,Cohen J.L. Immunological characteristics of a peroxidase proteins in human neonatal cord serum.-Clin.chim.acta.,1977,v.79,N3,p.533-539.

235. Ray A.K. Genetics of haptoglobins study at family and population level with reference to ahaptoglobinemie.-Drucke-rig,Bronder,offset,N.Y.Rotterdam,1970.

236. Rean F. L'haptoglobine etude de sec complexes avec l'hemoglobine chez le rat.-Compt.Rend.Soc.Biol.1970(1971),v.164, N6,1221-1224.

237. Reichlin M.,Cohen D.P.,Noble R.W.,Kuang M.W. Immunological, biochemical and comparative studies of the haemoglobin -haptoglobin reaction.-J.chim.phys.et phys.chim.biol.1974,v. 71,N7-8,p.999-1006.

238. Richter H. Haptoglobin bei Haussäugetieren.I Mitt.Untersuchungen über die qualitativen.Eigenschaften tierisher Haptoglobine.-Arch.exp.Veterinarmed,1973,v.27,N1,s.89-114.

239. Richter H. Haptoglobin bei HausSaugetieren.111.Der Hap-toglobin-Gehalt im Blut Plasma und Serum von wiederkauren und Schweinen unter Verschidenen physiologischen Bedingungen .-Arch.exp.Ve t erinärmed.1974,v.28,N4,s.505-519.

240. Richter H. Haptoglobin bei Haussäugetieren.IV.Mitt.Experimentelle Becin flussung dee Haptoglobinspiegels.-Arch.exp. Veterinarmed.,1975,v.29,N2,p.217-230.

241. Richter H.,Wagner D. Haptoglobin bei Hauseaugetieren.11 Mitt.Quantitativen Haptoglobin-bestimmungen in Blutplasma und serum unter verwandung verschiedenen Methoden.-Arch.exp.Ve-terinarmed.1974,v.28,M,s.4 91-5 03.

242. Rogard M.,Waks M. Studies on haemoglobintryptophanyl contact residues in the haptoglobin complex.-Eur.J.Biochem. 1977,v.77,N2,p.367-373.

243. Rossi Fanelli M.R.,Amiconi G.,Antonini E. Properties of human immobilized in sepharose 4B.-Eur.J.Biochem.1978,92,1, 252-256.

244. Rostwerowska B.Degradation and inactivation of cerulo-plasmin and haptoglobin by rat liver lysosomes and some other proteinases.-Folia histochem.et cytochem., 1978,v. 16,lT2,p.78-88.

245. Roy R.K.,Batter J.D.,Sakar S. Characterization of the2+

246. Ca -regulatory complex of chick embryonic muscules polymorphism of tropomyosin on adult and embryonic fibers.-Bi-ochim.Biophys.Res.Coramun.,1976,v.70,N1,p.28-36.

247. Saeed S.A.,Kendall P.A.,McDonald-Gibson W.J.,Collier H.O.J. Haptoglobin concentration and the activity of an endogenous inhibitor of prostaglandinsynthetase in blood plasma or serum.-Biochem.Soc.Trans.1978,v.6,U6,p.1166-1169.

248. Salas-Valdes A.,Leon-Campos J. Polyacrilamide gel ele-ctrophoretic pattern of umbilical cord and maternal sera.-Arch.lnvestig.Med.(Mex).,1979,v.10,H4,p.163-176.

249. Sasazuki T.,Tsunoo H.,Nakajima H. Studies on haptoglobin. VI.Effect of antihemoglobin antibody on the peroxidase activity and acid denaturation of hemoglobin.-Proc.Jap. Acad. 1973, v.49, N5, p.358-361.

250. Sasazuki T.,Tsunoo H.»Nakajima H.,Imai K. Interaction of human hemoglobin with haptoglobin or antihemoglobin antibody. J.Biol.Chem. 1974, v.249, N8, p.2441-2446.

251. Sato H.»Sasazuki T.,Tsunoo H.»Nakajima H. Studies on haptoglobin.IX.Effect of haptoglobin on hydrolysis of hemoglobin by some proteases.- Proc,Jap.Acad.,1973,v.49, N7, p.549-554.

252. Schimmelpfenning W.»Geserick G.»Malucsek S.,Steppuhn S.» Wermke W. ,V/an R. »Neuendorf M. Haptoglobintypen und chronischen Lebererkrankungen.-Dtsch.Gesundwesen.,1979,v.34, N42,s.2086-2088.

253. Schulz G.E. Protein-Differenzierung:Entwicklung neuartiger Proteine im Laufe der Evolution.-Angew.Chem.,1981, v.93, N2, s.143-151.

254. Schwantes A.R.»Tondo C.V. Prelimäry data on haptoglobin in veterbrates.-Recta Bras.Pesq.med.Biol., 1969, v.2, N2, p. 105-108.

255. Shabalina A. Polymorphism of haptoglobin in chicken.-Anim.Blood Groups and Biochem.Genet.,1977,v.8,Suppl. N1, p. 23-26.

256. Shapiro A.L.,Vinuela E.,Maizel I.V.Ir. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS Polyacrylamide gels.-Biochim.and Biophys.Res.Communs.,1967, v.28, N5, p.815-820.

257. Shim B.C.,Jin K.S.,Cleve H. Immunologic of reactivity of haptoglobin Marburg evidence for a beta-chain mutation.-Proc. Soc.Exp:tl.Biol.and Med. 1967,v. 126,N1,p.221-224.

258. Shim B«S.,Yoon C.S.,0h Sae-Kun,Lee T.H.,Kang Yoon-Se.Studies on swine and canine serum haptoglobins.-Biochim.et bio-phys.acta,1971,v.243,F1,p.123-136.

259. Shinoda T. The role of amino group in the formation of hemoglobin-haptoglobin complex.-J.Biochem.1965,v.57,N1,p.100-102.

260. Singh P.J. A revised staining procedure for haptoglobins. -Vox Sanguinis,1967,v.12,N1,p.78-79.

261. Smith H.,Edman P.,Owen J.A. U-terminal aminoacids of human haptoglobinrNature,1962,v.193,N1812,p.98-99•

262. Smithies 0. Zone electrophoresis in starch gells:Group variation in the serum protein at normal human adults.-Biochem. J.1955,v.61 ,p.629-641.

263. Smithies 0.,Connell G.E.,Dixon G.H. Gene action in the human haptoglobins.I.Dissociation into constituent polypeptide chains.-J.Molec.Biol.1966,v.21,p.213-224.

264. Stephan H.C.,Johnson M.L.,Ackers G.K. Kinetics of deo-xyhemoglobin subunit dissociation determined by haptoglobin binding estimation of the equilibrium constant from forward and reverse rates.-Biochemistry,1976,v.15,N3,p.654-660.

265. Terpsta P.A.,Smith D.B. The reaction between hemoglobin a-subunits and haptoglobin.-Can.J.Biochem.1976,v.54,N11,p. 1011-1015.

266. Testart J.,Kann G.,Saumand J.,Thibier M. Oestradiol17J!>, progesterone, PSH, LH in prepuberal calves induced to superovulate.-J.Reprod•and Pert.,1977,v.51,N2,p.329-336.

267. Timsit J.,Aminot A.,Lechat P. The influence of antiinflammatory compounds on some effects of BCG in the rat.-Arch, int.pharmacodyn.et therapy,1978,v.235,N2,p.271-279.

268. Toivanen P.D.,Rossi T.,Hirvonen T. The concentration of Gc-globulin and transferrin in human fetal and infant sera.-Scand.J.Haematol.1969, v.16, p.113-118.

269. Travis J.C.,Garza J.»Sanders B.G. Structural characterization of polymeric haptoglobin from goats.-Compar.Biochem. and Physiol.1975, v.B51,FI, p.93-97.

270. Travis J.C.,Sanders B.C. Haptoglobin evolution polymeric forms of Hp in the bovidae and cervidae Families.-J.Exp. Zool.1972, v.180, N1, p.141-148.

271. Tsapis A.,Mihoesco C.,Alfsen A.,Beuzard Y.»Rosa Y. Protein-protein interaction possible location of hemoglobin-haptoglobin contacts.-Biochem.and Biophys.Res.Communs,1978a, v.80, N2, p.319-326.

272. Tsapis A.,Thillet J.,Rosa J. Studies on the subunit dissociation of deoxyhemoglobin using hemoglobin-haptoglo-bin interaction.-Biochem.and Biophys.Res.Communs,1978b,v. 85, N1, p.511-516.

273. Tsunoo H.,Sasazuki T.,Nakajima H. Studies on haptoglobin. VII. The binding site of hemoglobin for haptoglobin and reactivity of hemoglobin-haptoglobin complex with antihemo-globin antibody.-Proc.Jap.Acad.1973a,v.49,N5,p.362-366.

274. Tsunoo H.,Sasazuki T.,Nakajima H. Studies on haptoglobin.VIII.Effect of haptoglobin on immunogenecity of hemoglobin. -Proc.Jap.Acad.1973b,v.49, N7, p.545-549.

275. Tsunoo H.,Sasazuki T.,Sato H,,Nakajima H. Effect of haptoglobin on immunological activity of hemoglobin.- Immunoche-mistry, 1974, v.11, N10,p.673-679.

276. Uchida H.,Heystek J.»Klapper M.H. Effect of structural perturbation of the ligand-binding properties of human methe-moglobulin A.-J.Biol.Chem. 1971,v.246, N22, p.6843-6848.

277. Vallett.e I.,Pointis J.,Kondean Y. ,Waks M. ,Engler R. Is immunochemical determination of haptoglobin phenotype dependent ? Clin.Chim.acta 1979, v.99,N1,p.1-6.

278. Vallette I.,Waks M.»Weijman J.C.,Arceleo J.P.,Greer J. Haptoglobin heavy and light chains. Structural properties reasembly and formation of minicomplex with hemoglobin.- J. Biol.Chem. 1981, v.256, N2,p.672-679.

279. Villard A.,Lombart C.,Borel J.B.,Jayle M.P. Influence de 1'haptoglobine et de son complexe avec 1'hemoglobine "in vitro" sur la biosynthese du collagene.-Pathol.Biologie, 1974,v.22, N8, p.741-742.

280. Wada T.,0hara H.,Watanable K.,Runoszita H.,Nishio H. Haptoglobin synthesis in reticuloendothelial tissues.- J. Reticuloendotal.Soc. 1970a,v.8, N3, p.195-207.

281. Wada T.O.,Chara H.,Watanable R.,Kinoshita H.,Yachi A. Autoradiographic study on the site of uptake of the hapto-globin-hemoglobin complex. J.Reticuloendothelial Soc. 1970, v.80, p.185-193.

282. Waks M.,Alfsen A. Structural studies of haptoglobin. 11.Reversible dissociation into subunit of Hp1-1 and Hp2-2 Arch.Biochem.and Biophys. 1968, v.123, N1, p.133-144.

283. Waks M.,Alfsen A.,Cittonova N. Structure of subunit haptoglobins.-Biochem.and Biophys.Res.Communs,1967,v.27,N6,p.693.699.

284. Waks M. »Alfsen A.»Schweiger S.,Mayer A.Structural studies of haptoglobin.111.Interactions with hemoglobin.-Arch. Biochem.and Biophys.1968,v.132,N1,p.268.

285. Waks M.,Beychok S.Induced conformational states in human apohemoglobin on binding conformational states in human apohemoglobin as a probe of frozen structure.-Biochemistry, 1974,v.13,N1,p.15-22.

286. Waks M.,Rogard M.,Cittanova N.The association equlibri-um between haptoglobin and apohemoglobin.-Biochem.and Biophys .Res.Communs,1978,v.80,N1,p.252-25 8.

287. Wheeller A.G.,Baird D.T.,Land R.B.,Scaramuzzi R.Z.Seasonal variation in oestrus,the secretion of oestrogen and progesterone and LH levels before ovulation in the ewe.-J. Reprod.and Fert.,1977,v.51,N2,p.427-432.

288. Woods K.R.,Yudowitz B.S.,Engler R.L. Development of serum haptoglobins in man.-Proc.Soc.Exptl.Biol.and Med.1961, v.107,N3,p.616-619.

289. Yang A.J.,Przybylsky M. The raicroheterogenecity of human haptoglobin and its complex with hemoglobin.-Can.J.Bio-ch.,1973,v.51,N5,p.597-605.

290. Yang A.J.,Yingling W.Immunogenetics of human haptoglobins. 1.The antigenic structure of normal haptoglobin pheno-types.-J.Clin.Investig.,1968,v.47,N10,p.2290-2296.

291. Young S.N.,Curson G. Neonatal human caeruloplasmin.-Bi-ochim.et biophys.acta,1974,v.336,p.306-308.

292. Zirkovsky V.Specific fetal serum proteins of thirteen mammalian species.-Compar.Biochem.and Physiol.1975,v.51B, p.87-91.