Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка и исследование аденозиндезаминазы из пяти отделов мозга крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Очистка и исследование аденозиндезаминазы из пяти отделов мозга крупного рогатого скота"

о :: ' 0 V. '

вдиошьная академия шк республики армения институт биохимии им. г.х.еунятнна

Ка правах рукописи

АНГОНЯН. АЛВАРД АДИБЕКОБНА

очистка и исследование аденозивдезаминазы из

ши одаюа мозга, крупного рогатого, скота

Ч-.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН —1996

Работа выполнена в лаборатории нуклеотвдов и нуклеозидов Института биохимии HAH Армении (директор - академик HAH Армении, профессор А.А.Галоян)

Научные руководители:

доктор биологических наук С.С.Марданян

кандидат биологических наук С.Г.Шароян

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Э.С.Геворкян

кандидат биологических наук А.С.Боядеян

Ведущая организация: Ереванский государственный медицинский

университет им. М.Гераци

Защита состоится "3 " ¿Ъ'1/1&££.1Э95 г. ь/^f—часоь на заседании специализированного совета 042 при Институт» биохимии HAH Армении по адресу: 375014, Ереван - 14, ул. П.Севака, 5/1.

Автореферат разослан "'/ " //Q^f^-1996 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохиши HAH Армении.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук, профессор (¿'л-i

А^А.Симонян

- I-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Аденозиндезаминаэа (АДА -аденозин амино-щролаза, М 3.5.4.4), являясь узловым ферментом пуриновога обмена, 1тализирует необратимое гидролитическое дезаминирование (дезокси)аде-¡зина с образованием эквимолярных количеств (дезокси)иноэина и ам-гака. Этот фермент участвует в регуляции уровня аммиака и аденозина тканях. Аденозин является регулятором кровотока в мозгу, почках, пе-5ни, сердца; нейроыодулятором пуринэргических нервов, регулирующим ресинаптическое ингибирование и аденилатциклазу. В мозгу аденозин асииряет сосуды, ответственен за понижение мембранной проницаемости

за высвобождения глутамата и аспартата из нервных окончаний, аенозин также регулирует липолиз и гликогенолиэ, повышает чувствитель-ость инсулин-зависимого транспорта глюкозы и пр... Таким образом АДА, частвуя в метаболизме и, следовательно, в регуляции уровня физиоло-ически столь активного субстрата, играет важную роль в сохранении ормального статуса живого организма.

АДА присутствует почти во всех клетках млекопитающих» Наследственный дефицит фермента связан с болезнью (или является ее причиной) ост-о-комбинированного иммунодефицита. Отмечено также отклонение от норы активности фермента при синдроме приобретенного иммунодефицита, 'ост уровня АДА приводит к острой лимфобласгической лейкемии, а также : наследственным видам гемолитической анемии. При некоторых болезнях :ечени у людей активность АДА. в сыворотке крови повышена, но на ранней :тадии рана наблюдается ингибирование фермента. Активность АДА пониже-га в случаях умственной отсталости. Понижение уровня аденозинаак-:ивного регулятора кровотока, в присутствии повышенной концентрации ЩА,-приводит'к подавлению явления гиперемии. При ишемии мозга потен-деальную терапевтическую значимость имеет дезоксигсоформицин, который зезко подавляет активность .АДА, тем самым поднимая уровень аденозина.

В некоторых тканях млекопитагацих выяснены кинетические свойства, молекулярная структура и каталитический механизм действия АДА..Фермент валяется хорошим объектом для исследования каталитической функции в присутствии прочно связывающихся ингибиторов. Эти■ингибиторы в отдельности или комбинированные с другими лекарственными средствами .применяются как антиметаболические, антинеопластические и антибиотические агенты, что имеет важное значение для медицины и фармакологии.

Таким образом очевидно, что изучение. АДА, структуры ее активного центра, закономерностей регулировании ее активности' различными агентами является одним.из перспективных подходов к пониманию физиологии некоторых патологических состояний.организма.

- г- .

Цель и задачи исследования. Цель® -настоящей работы являлось сравнительное исследование АДА. из пяти отделов мозга крупного рогатого скота и определение роли некоторых аминокислотных остатков в функционировании фешента. Для этого перед нами били поставлены следующие задачи:

1. ввделение я очистка АДА из пяти отделов мозга (белое и серое вещество больших полушарий, мозжечок, продолговатый мозг и аденогипофиз);

2. сравнительное изучение физико-химических и каталитических свойств фермента из этих тканей; 3. изучение влияния ионов двухвалентных металлов на активность АДА; 4. выявление ценности SE-групп, триптофана и гистидина для каталитической функция АДА.

Научная новизна и практическая, .значимость. В настоящей работе впер-еыо ввделена, очищена и изучена АДА из пяти отделов головного мозга крупного рогатого скота.

Из пяти исследованных металлов только ионы меди ингибируют активность АДА и это ингибирование необратимо.

SK -связывающие соединения на ингибируот фермент.

Химическая модификация остатков гистидина в присутствии диэтилпи-рокарбоната приводит к потере активности АДА из мозговой ткани.

Впервые показано, что модификация остатков триптофана в присутствии и фотоокислением в присутствии ТХЭ приводит к ингибированию активности АДА. .Из 6 модифицируемых остатков триптофана 2 важны для активности и, по-видимому, расположены в активном центре.

Полученные результаты имеют теоретическое значение для углубления представлений о гипотетической структуре активного центра к о функциональных группах АДА, ииещих важное значение в ферментативном катализе. Практическое значение для биохимических исследований имеют разработанные методы выделения и очистки ДЦА из нервных тканей, а также изучение роли ванных для активности групп с использованием методов химической модификации.

Аггробапня работы. Работа апробирована на Ученом совете Института биохимии HAH РА и представлена на Всесоюзном семинаре "Препаративная масштабируемая хроматография биологически активных веществ и альтернативные методы" (СаНКТ-Петербург, 1991), на 15-th Biennial Meeting of the International Society for Neurochenistry (Kyoto. Japan. 1995).

По материалам диссертации представлена к опубликованию одна и опубликованы дае статьи, .опубликовано 2 тезиса.

Структура в объем работы. Диссертация написана на 78 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, обсуждения и обобщения результатов, быводоб - списке, сктедаурц, сосгсяцей кз 120 наименований научных публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на-препаратах-АДА., пяти отделов мозга крупного рогатого скота.

Спектральные и кинетические измерения проводили на регистрирующих спектрофотометрах "Эресогс! "Зресогс! М-40 " (Германия), в юоветах с длиной оптического пути 5 или 10 мм, при 25 С.

Флуоресцентные измерения проводили на спектрофяуориыетре мрр- 44А фирмы " Регк1а-Е1пег " (СНА), в прямоугольных кварцевых, кюветах с длиной оптического пути 10 мм..

Активность АДА оценивали по количеству аммиака или инозина, образующихся в ходе ферментативной реакции. Аммиак определяли.с использованием ортофталевого альдегида в качестве флуоресцентной метки (Би^юага, Оуата, 1981) и колориметрически по методу Чаней и Марбах. (сьапеу, Маг-ЪаоЬ, 1961) в опытах с применением реагентов, существенна влияющих на флуоресценцию (ионы металлов, тиоловые реагенты и.др.). Инкубационная смесь в 0,8 мл 40 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, содержала 10-20 мкг белка, 100-200 мкМ аденозина. Реакцию начинали добавлением субстрата, инкубацию проводили в течение 10 мин при ЗТ С. При- флуориыетрическом методе определения реакции останавливали добавлением 0,5 мл 96 %-ного этанола, при колориметрическом методе — добавлением I мл фенола.

При спектрофотометричееком определении ферментативной- активности, количество образовавшегося инозина оценивали по разности коэффицентов миллимолярной экстинкции аденозина и инозина,^¿265 = иУ^см"^.

-Удельнуи активность фермента выражали в- мкыолях аммиака или инозина образовавшегося за I мин на I мг белка, '

Содержание белна определяли по методу Бредфорд (ВгайГогй, 1976).

Число -групп определяли-по методу Бойера (Воуег, 1954), измеряя прирост оптической плотности, щит. ^50 нм при титровании белкового раствора, п-хлормеркурибензоатом.

Химическую модификацию остатков гастидина.АДА. с помощью ДЭПК проводили согласно процедуре,- описанной Мелхиор и Фарней (Ме1сЫог, УаЬтаеу, 1970).

Химическую модификацию остатков триптофана- в присутствии н-бромсук-цинимида проводили по методу Спанде'и Виткопа СЭрапае, та^кор, 1967) в модификации Саркисовой и Марданян (Саркисова, Марданян, 1967). Титрование натизного фермента проводили в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, денатурированного - в 10 мЫ ацетатном буфере» рЫ.4,5, содержащем 8 'А мочевину. К раствору белка добавляли порциями по 10-20-мкл 0,5 мЫ раствора 1ГВЭ ¡г через 3 мин регистрировали- спектр поглащения в области 230-330 км... Из- падения поглащения пси: 260 нм по .формуле- из. работы .

(Spande, Witkop, 1967) вычисляли чисд.0 ыодифицироваачых триптофан. Процедуру добавления реагента продолжали пока наблюдалось падение поглощения.

Фотоокисление в присутствии трихлорэтанолд проводад^ согласно.цро-цедуре, описанной Толме и др. ( Toulme' et al.', 1984). Фотореакци®*ЛДА с ТХЭ проводили при 25 С в камере спектрофлуор^ыетра. с предельно открытой щелью падающего луча при длине волны облужирцего света 290 км, которая обеспечивает фотореакцию ТХЭ с триптофаном при сохранении, ин-тактности других аминокислотных остатков. Облучаемая реакционная cmscj в 10 мМ какодилатном буфере, рН 7,4, содержала 10 «кМ раствора АДА и 70 мМ ТХЗ. Ежечасно отбирали аликвоты и измеряли активность, поглощение при 280 нм и флуоресценцию. Перед измерением флуоресценции ьробу разбавляли в 15 раз в->10 мЫ фосфатном буфере, рН 7,4,для исключения тушащего эффекта ТХЭ. Бее параметры облучаемого образца соотносили с параметрами контрольного, инкубируемого в аналогичных условиях, цо р темноте.

Число существенных для каталитической активности остатков триптофана определяли по методу в изложении Кларке ( Clarke., 1987).

Электрофорез в 7 Й-ноы ДААГ осуществляли по методу Дэвиса (Davie , 1964) и в 10 %-ном ЛААГ в присутствии Na-DS „ По методу Вебера и Ос-борна (Weber, ОвТюгп, 1969).

результаты исследований И их обсувдение

Выделение и очистка АДА из пяти отделов мозга крупного рогатого скота. Имеется множество работ~по Исследованию биохимических,'физико-химических и иммунных свойств высокоочищенных препаратов АДА из разных органов и тканей, но очень ыало исследований проведено на АДА, очищенной из ыозга млекопитающих. Из больших полушарий мозга быка АДА была получена в гомогенном виде и исследована Палладиным и соавт. (Палладии, 1967),'а такта Дупвди и соавт. (Lupidi et al., 1992), из цельного мозга крысы - Сентелесом и соавт. (Centelles et al., 1988).

В настоящей работе впервые цредпринята попытка очистить и сравнить фермент из разных отделов ыовга крупного рогатого скота. Для этого соответствующий отдел ыозга (обычно в опыт брали 200 .г ткани) измельчали скальпелем, гомогенизировали в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, (буфер А) в гомогенизаторе FX-I .в-лечение 2 мин и центрифугировали, при. 6000 об/ыин в течение 70 мин. -.Белковую фракцию, обладающую АДА активностью, получали из надоса^ояшрй,жидкости, используя фракционирование сульфатом аммония (30-60 •%) и .ионсэбкеннув хроматографию на ДЭАЗ-целлимзе. Далее белок очищали, -дриаеняя гель-фильтрацию концен-

.■рирсванного препарата на сефадексах G-IOO и G-200.

На рис. I приведены типичные профили элюции, полученные в результате гель-фильтрации, построенные как по белку, так и по активности, {роме основного пика активности наблюдалось два высокомолекулярных :ика (рис. 1а). После того, как была показана способность этих фракций переходить при повторной гель-фильтрации в основную, ниэкомоле-*улярную форму, ими в дальнейшем пренебрегали. При гель-фильтрации на сефадексе G-200 препарата из аденогипофиза (рис. 16) АДА активность элюируется в виде двух, сравнимых по интенсивности пиков, обозначенных на рисунке ВИ и Ш (соответственно, высокомолекулярная и ь-изкомолекулярная). При повторной гель-фильтрации взаимопревращаемость этих двух фракций не наблвдалась.

Для элюции белков с ДЭАЭ-целлплозы использовали линейный градиент концентраций KCl от 20 до 200 мМ. в буфере. Фракции,, обладающие АДА активностью, эявируются в широком диапазоне концентраций KCl- от 90 до.130 мМ. Франции с ферментативной активностью объединяли, концентрировали на небольшой колонке с ДЭАЭ-целлюлозой и пропускали через колонку с сефадексом G-I00 (Ш фракцию аденогипофиза - через колонку с сефадексом G-20Q). На этой стадии, белковые пики и пики активности не совпадали, что свидетельствовало о недостаточной степени очистки фермента. Дальнейшей очистке были подвергнуты только препараты из серого и белого вещества.

На рис. 2 приведены диаграммы элщии этих препаратов после повторной ионообменной хроматографии и гель-фильтрации-. Как видим, пики диаграмм по белку и по активности совпадают; При этом, по обоим критериям фермент состоит из двух фракций. К сожалению, недостаточное разрешение этих фракций не позволяет разделить и исследовать их в отдельности.

В процессе очистки максимум УФ поглощение из более коротковолнового положения смещается к положению при 278 нм с плечом при 290 нм, характерном для остатков триптофана. - .

При электрофорезе очищенных препаратов АДА из белого и серого вещества мозга в 7 %-нш ПААГ получены три белковые полосы, обладающие ферментативной активностью (рис. 3). Аналогичные данные были получены ранее для фермента.из эритроцитов человека (Daddona et al-, 1977).

Исследование свойств АДА. Из диаграмм элщии по активности, полученных в процессе гель-фильтрации на колонке с сефадекссм о-100 (для ВМ из гипофиза - с сефадексом G-200), калиброванной с использованием стандартных белковг оценена приблизительная молекулярная масса.АДА из всех пяти отделов мозга. Для- фермента,из белого вещества, мозжечка и продолговатого мозга она была равна-40 кДаг из. серого вещества - ЗОкДа

Объём элюата, мл

Объём элюата, мл

Рис. I. Гель-фильтрация та сефадексе G-200 фракций с АДА активностью, сконцентрированных-сульфатом аммония или абсорбцией на ДЭАЭ-целлвлозе: а - из белого вещества мозга (аналогичные диаграммы получены для серого вещества, мозяечка и продолговатого мозга); б — из аденогипофиэа. Кривые представляют соответственно: I - диаграммы по белку (поглощение при 280 нм); 2 - диаграммы по АДА-активности (в относительных единицах). Сефадекс урав-. новешен с буфером А, содержащим 0,1 Ы KCl.

Объём элюата, мл

Ис. 2. Гель-фильтрация очищенного препарата АДА из белого (та же картина получена для белка из серого) Еещества мозга на ко. лонке с сефадексом <5-200: I - по АДА-активности (относит», единицы); 2 - по белку (А^).

Рис. 3. Эяектрофореграмма очищенного препарата АДА из белого (то

же — из серого) вещества мозга в 7 % ПААГ. I - гель окрашен по белку (сканирование пропускания света при 525 нм); 2 - ак-. тивность АДА определена в экстрактах 2.мм слоя неокрашенного геля, относительные единицы.

грмент из аденогипофиза представлен в виде двух молекулярных форм молекулярными массами 280 кДа (ВМ-фракция) и 40 кДа (Ш-фракция). ричем, удельная активность и максимальная скорость катализа ВМ-фрак-т в несколько раз выше соответствующих величин НМ-фракции.

Электрофорез препаратов АДА из серого и белого вещества в при-/тствии 0,1 % БЗ-тГа выявил две близко расположенные белковые поло-а, соответствующие молекулярным'массам 38 и 33,1 кДа (рис. 4). Это огласуется с данными по гель-фильтрации на последней стадии очисти (рис. 2). Полученные результаты позволяют заключить, что АДА из озга представлена низкомолекулярной формой.и при этом гетерогенна по олекулярной массе. Наблюдаемая гетерогенность не является следствием еградации белковой молекулы в ходе очистки, поскольку аналогичные езультаты были получены в экспериментах с использованием на стадии омогенизации ингибитора протеаз, фенилметилсульфонилфторида, в коечной концентраций 0,5 мМ.

68 кДа 45 кДа 13 кДа.

I I I

ас. 4. Электрофореграмма очищенного препарата АДА из белого (то же -из серого) вещества мозга в 10 % ПААГ в присутствии 1Е - Яа. Стрелками указаны подвижности стандартных белков: адренодоксин, 13 кДа, овальбумин, 45 кДа, сывороточный альбумин, 66 кДа.

Таблица I

Некоторые кинетические и физико-химические параметры аденоэиндезаминаэы из пяти

отделов мозга

Источник фермента Активность в гомогенате, Молекулярная Кп, Выход, мг/100 г

нмоль/мин на I г ткани масса, кДа мкМ исходной ткани

I. Серое■вещество 320 30 90 2

а. Белое вещество 400 40 100 5

3. Продолговатый мозг 360 40 170 4

4. Мозжечок 340 40 105. 11

5. Ддеиогйпофиз •

ВМ фракция • 280 65 5

НМ фракция - 40 70 5

Концентрация субстрата 400 мкМ-

Зависимость скорости дезаыинирования аденозина от его концентра-[ во всех случаях подчинялась закону Михаэли с а-Ме нте к (кривые не гводятся).

В наших исследованиях молярный коэффицент экстинкции АДА из серо-и белого вещества больших полушарий, расчитанный из уравнения [берта-Бера, равен 4,ЗхГ04 Н~ см .

В таблице I обобщены некоторые данные, характеризующие препараты

выделенные из пяти регионов мозга крупного рогатого скота. Из лицы видно, что существенных различий в ферментативной активности 'омогенатах разных регионов мозга нет. Наибольшее значение Ка наб-ается для препарата из продолговатого.мозга - 170 мкМ, для препа-ов из гипофиза эта величина в 2-3 раза меньпе. Для фермента из альных отделов мозга величина Ки близка к 100 мкМ. Было исследовано влияние рН (в интервале от 6,0 до 9,6) и"состава ера на активность АДА из всех пяти регионов мозга. Оказалось, что явность АДА близка к максимальной в широком диапазоне рН - от 7,0 В,5. Только фермент из серого вещества активен в более узком диа-оне рН: 7,2-7,8. Из трех использованных буферов (фосфатного, кки-эл-НИ, борагного) наиболее благоприятным для АДА оказался фое-чый. При одних и тех же значениях рН активность АДА в иывдазол-нС1 эре вдвое меньше, чем в фосфатном.

Влияние ионов двухвалентных металлов на активность АДА. Дня этих гов фермент предварительно диалиэовали в течение 5 ч против 10 мМ эсфатного буфера, содержащего I мМ ЭДТА, затем - против "чистого" гра. Для определения влияния ионов металла на ферментативную ак-юсть фермент преинкубировали в присутствии 10-кратного молярного гтка иона металла в течение 10 мин. Затем ферментативную реакцию шали добавлением субстрата. Из пяти' использованных металлов

Со^+) только ионы меди существенно влияли на ак-юсть АДА из всех пяти регионов мозга.

1а рис. 5 приведена зависимость ингибирования активности фермен-юнами меди из белого вещества мозга. Продолжительная инкубация в утствия избытка меди приводит к полной потере активности АДА, при-ингабирование носит необратимый характер. Об ингибируицеы влиянии в меди на активность АДА из желтка'куриного яйца и фибробластных сом человека было известно из работ Де Боек и др. (Ле Воеск et а1., ) и Линдлей и др. (ЫшИеу е* а!., 1993). Механизм этого ингиби-ния не нашел объяснение ни в -одной из этих работ. Поскольку доение дитиотрейтола в наших опытах не приводит к реактивации фер-а, следовательно причиной наблюдаемого ингибирования не ягляется

- La -

.образование меркаптида. Наблвдаемое предотвращение инактивации при • преинкубации фермента с.дитиолом можно объяснить его взаимодействием с ионами меди, что и приводит-к кажущейся "защите" фермента. Это предположение подверадается в опытах с варьированием концентраций Cu2+ и дитиотреитола. Если фермент преинкубировали в присутствии меньших по сравнению с Си2+ концентраций тиолового реагента, то он выполнял свою "защитную" роль частично и наблвдалась корреляция между его концентрацией и степенью сохранения активности фермента.

Исходя из рентгеноструктурных.данных работы Вильсона и соавт. (Wilson et al., .1991), где в активном центре ышиной АДА обнаружено несколько тистидинов, мы считаем, что причиной ингибирования активности АД ионами меди является образование комплекса меди с одним или несколькими остатками гистидина, координированными к атому Zu, ввиду значительного доминирования по отношению к согласно

ряду активности ионов металлов Ирвинга-Вильямса.

.100--

»A

>0 е< и о S а х ь

а ■<

50

20 40 60 мин

Рис. 5. Временная зависимость ингибирования АДА из белого вещества ионами меди при молярном соотношении медь/белок: ,10 (кривая I), 50(2), 200(3). Концентрация фермента - 0,5 мкМ. Справа указана активность .АДА после I часа инкубирования в присутствии ионов указанных метадмв.

■ - 13 -

Влияние SH--связывающих реагентов на активность АДА. В ранних рабо-IX Вольфенден и соавт. (Wolfenden et al., 1968) и Ронка и соавт.(Воп-1 et al.t 1967) наблодали ингибирование активности АДА ртутьсодержа-пли реагентами. Авторами был сделан вывод о важности остатков цистеи-1 для каталитической функции АДА. Но результаты других работ указывают t несущественность SH-грулп для каталитической активности фермента Малышева и др. , 1964).

Кы исследовали влияние дисульфэдных и ртутьсодержащих веществ на ¡тивность АДА из 4 .(кроме аденогипофиза) регионов мозга. Обработка ¡рмента в течение 2 часов более, чем 100-кратным молярным избытком .Т и/или реагента Элямана не приводила к'изменению активности. Ана->гичная обработка АДА производными меркурибензоата - п-гидроксимер-чзибензоат, п-хлормеркурибензоат и п-гидроксимеркурифенилсульфокис-¡та, приводила лкзь к незначительному снижению активности (на 10-25^), •о указывает на отсутствие SH-групп, важных для активности фермента сривые не приводятся).

Количество SH-групп, как в нативном, так и в денатурированном 8 М ¡чэвиной очищенных препаратах из СБ и БВ, определенное методом спек-¡офотометрического титрования, было равно двум.

Полученные нами данные о несущественности SH-групп для каталитичес-¡й функции АДА из мозговой ткани согласуются с данными, полученными шыяевой и соавт. (Малышева и др., 1964) для фермента из больших по-тяарий мозга быка, а такте с данными рентгеноструктурного анализа для шиного фермента (Wilson et al., 1991). В работе Вильсона показано, ю из 5 цистеинов молекулы мышиной АДА•сравнительно близко располо-¡нный к активному центру Су в-262 экранирован от него другими амино-гслотными остатками.-

Химическая модификация остатков гистидина и .активность АДА. В недав-tx исследованиях сравнение аминокислотной последовательности аденозин-зденилатдезаминаз из различных источников, выведенной из нуклеотидноа »следовательности соответствующих кДНК, позволило Чангу и соавт.(Chang

al., 1991) выявить эволщионно консервативные и,, возможно, сущест-¡нные для катализа реакции дезаминирования адешиювых соединений 4 шнокислотных остатка: His-214, Суа-262, Asp-295, Asp-296. А в работе гльсона Cyilson et а1-. 1991) было показано, что ключевую роль для »талитической активности АДА должны играть остатки Авр-295, Ш.з-239, ■у-217 и координировала к атому Zn His-15, Hio-17, Ш.о-214, т.е. в !ещихся в литературе сообщениях наиболее общим результатом является iscine остатков гистидина в образовании активного центра АДА из различие тканей (Chans et al., 1991, 'Ш-Scn ßt ai.,IS91", Bhauadk e. al.,1923)

S

x.

ъ

о

л t* о о se m s ь а

0,4 а « m 0,4

0,3 • X ь о 0,3

0,2 * л Е-о о д 0,2

0,1 x № 3 6« 4 0,1

4 8 12 16 ¡ДЭШ]/ [АДА}

Ю 20 30 мин

Рис. 6. Активность АДА из продолговатого мозга при модификации диэтилпирокарбонатом: а - зависимость активности от отношения [ЩМ]/ [фермент} , концентрация АДА - 2 мкМ, i время преинкубирования•фермента с реагентом - 10 мин; б - зависимость активности фермента от. времени обработки реагентом при молярном соотношении [ДЭПК]/[АДА] - 5. .

Мы изучали влияние ДЭПК на активность АДА. Этот химический модификатор известен как реагент, избирательно взаимодействующий с гистиди-ном. На рис. ба и б. представлены, соответственно, концентрационная и временная зависимости активности АДА. из продолговатого мозга в присутствии ДЭПК. Аналогичные зависимости получены для фермента из СВ, БВ и мозжечка. Как представлено на рисунке, наблюдается резкое падение ак-тлвности АДА из разных- отделов мозга при модификации остатков гисти-дина в присутствии ДЭПК, что находится в хорошем согласии с литературными данными.

Химическая модификация остатков тоттойанз АДА. Влияние HBS на активность АДА. В качестве модификатора триптофаноЕых остатков в наших исследованиях был использован NBS. При титровании очищенных препаратов АДА из ЕЗ и СВ мозга возрастающими концентрациями ïTES наблюдается падение поглощения при 280 ну и возрастание при 260 т. Зти спектральные изменения отражают окисление триптофана в оксииндольное производное в результате проведенной обработки. Падение поглощения при 260 нм использовали дал оценки числа окисленных тряптофанов на молекулу белка.

счеты показали, что в денатурирующих условиях (50 мМ ацетатный бур, рН 4,5, 8 И мочевина) нвэ приводит к окислению б остатков трипто-ка на один моль АДА из БВ. При модификации остатков триптофана в ус-виях, обеспечивающих сохранение нативного состояния белка (К-фосфат-й буфер, рН 7,4) на одну молекулу нативной АДА из БВ и СБ ыодифици-ются 5 и 6 остатков триптофана соответственно (рис. 7, кривые 2 и 3) литературных данных известно, что.АДА эритроцитов человека содер-т 4 остатка триптофана (Байона et а!., 1984). На рис. 7, кривая I демонстрирует падение скорости реакции дезами-рования аденозина в результате КВЗ-обработки фермента из СВ в К-фос-гном буфере, рН 7,4. Модификация остатков триптофана в этих условиях гибирует активность АДА- Аналогичные кривые получены для препара-в АДА из БВ, мозжечка.и продолговатого мозга.

ности фермента яз серого вещества (в процентах от исходной); 2 - числа модифицированных остатков триптофана на моль фермен та из СВ, и 3 - из БВ. Концентрация АДА - 0,4 ыкМ.

Модификация остатков триптофана тоидторэтанодш. Чтобы убедиться, что остатки триптофана могут быть ответственны за радение активности АДА, мы использовали независимый,4 более селективный метод модификации остатков триптофана - фотоокисление в присутствии ТХЭ при облучении светом 290 нм.'Эта реакция приводит к образованию ковалентной связи между остатками триптофана и ТХЭ, но не влияет на другие аминокислоты • (ТоиХте ег а1 1984).' Облучение раствора АДА. в течение 5,5 часов в присутствии 70 ыМ ТХЭ приводило к потере ферментативной активности на 45 %. При этом наблюдалось синхронное падение интенсивности триптофа-новой флуоресценции. Кривые приведены на рис. 8а и б. В контрольном опыте было показано, что используемая концентрация ТХЭ без облучения не влияет на исследуемую активность. Инкубировакиэ не продолжали, так как происходила дезактивация контрольного образца.

Применение двух независимых методов модификации остатков триптофана с использованием НВЗ и ТХЭ продемонстрировало важность этой аминокислота для ферментативной активности АДА из мо'зга. ■

.■ис. В. 5отоокислэние 10 мкМ АДА в присутствии 70 мМ ТХЭ: а - зависимость от времени облучения светом 290 нм активности и б - ин-

тенсивности триптофановой флуоресценции аликвот облученного

препарата.

I 2 3 4 5 час

1 2 3 4 5 час

определение числа существенных рдя активности АЛЛ остатков трипто-ана-. - Выиеизяоженнке данные свидетельствуют о важности триптофановых статков для активности АДА. Экстраполяция начальных наклонов графиков ависимости активности от числа модифицированных остатков на ось абс-исс, позволяет оценить число остатков триптофана, необходимых для ка-ализа ферментативной реакции. В нативных условиях модификация 5(и 6) статков триптофана значительно ингибирует скорость дезаминирования денозина. При этом, результаты экстраполяции показали, что число суверенных остатков триптофана равно примерно 2,3 на моль фермента.

Для более точного определения числа каталитически существенных ос-атков триптофана в АДА был применен графический метод расчета, разра-отанный Тзои, согласно которому число существенных остатков оценивает-я приведением к линейности зависимости остаточной активности фермен-а в степени, обратной варьируемому числу существенных остатков, от пела модифицированных остатков.

>ис. 9. Определение числа существенных для активности остатков триптофана с использованием графического метода Тэои: зависимость остаточной активности (А/До) АДА из СЗ в степени, обратной числу существенных остатков, 1,' от числа модифицированных остатков триптофана, п, построена при 1=1 (кривая I)., 2(2) и 3(3). Зависимость оказалась линейной при 1=2. Аналогичная картина получена для фермента 1<з БВ.

- Ib -

На рис. 9 приведены кривые этой завксшости для'активности АДА кз СБ. Аналогичные кривые получены также для ЕВ., Число модифицируемых остатков триптофана в АДА при условии сохранения нативяости, в которых проводился данный опыт, равно 5<шш 6) (см. рис. 6). Зависимости построены для значений i(число существенных для активности модифицированных остатков), равных 1,2 и 3. Как видно из рисунка, при значениях; i =1 и i =3 получаются кривые; с выракенкой- Противоположно изогнутой кривизной. Линейность наблюдается для 1 =2, то есть подворядаются результаты экстраполяции, указывающие на то, что для катализа реакции дезами-нированкя аденозина существенную роль играют два остатка триптофана АДА.

Исследование "влияния TIBS на активность АДА; Имеющиеся в литературе данные сравнительно ранних исследований методом тушения флуоресценции, давали возможность косвенного, непрямого заключения о близком расположении остатков триптофана к активному центру АДА. (Кш-z e-t al., 1985, Philips et si 1985). Более поздние цитированные выше исследования с применением рентгеноструктурного анализа и конструирования модели активного центра ферментов, дезаыинируюцих адениловые соединения, не отмечали наличие вблизи активного центра этой аминокислоты.

С целью выяснения функции и локализации важных для активности АДА остатков триптофана были проведены следующие кинетические исследования.

В одной серии опытов мы сравнивали зависимость от концентрации субстрата' скорости ферментативной реакции АДА нативного и частично дезактивированного в присутствии B3S . Результаты компьютерной обработки этих данных с использованием программы "Enzfit " показали, что при модификации происходит изменение (уменьшение) как Km, так и Ушах ферментативной реакции, т.е. ингибирование активности АДА происходит по смешанному механизму (см. рис. 10).

В другой серии опытов сравнивали зависимость активности фермента от концентрации ггвз при двух ретмах добавления реагента. Падение активности при обычном режиме, когда фермент преиннубировали с реагентом до добавления субстрата, сравнивали с опытами, в которых субстрат и реагент вносили в реакционную смесь одновременно. Представленные на рис.11 результаты свидетельствуют о "защитном" эффекте субстрата:'наличие субстрата в среде приводит к появлению фазы запаздывания в ходе дезактивации. '

Результаты наших исследований подверждают выводы, полученные ранее при флуоресцентных исследованиях. Исходя из характера изменений кинетических параметров ферментативной реакции, а также учитывая "защитный" гффект субстрата при модификации, можно предположить, что два сущест— зенных остатка триптофана находятся, если и не в. субстрат-связующем

Рис. 10

Рис. II

10 20 30 40 [ЕВ Б] / [АДА]

Рис. 10. Графики двойных обратных величин зависимости скорости реакции дезаминировангаз аденозина от концентрации субстрата ферментом из СВ нативнсй (I) и модифицированной ЕБЭ (2). Молярное соотношение [иве] / [АДА] - 7.

Рис. II. Зависимость активности АДА из БВ от молярного отношен:«

[явз]/[АДА] яри разных режимах проведения реакции: I - субстрат добавляли после 3-х минутной преинкубации фермента с тгвз; 2 - субстрат и таэ добавляли к ферменту одновременно. Концентрация фермента - 0,4 мкМ. Аналогичная картина получена для фермента из СБ.

месте, то, по крайной мере, вблизи активного центра АДД из мозговой ткани. Мы считаем также, что остатки триптофана, не обнаруживаясь вблизи активного центра в кристаллическом препарате АДА, возможно, вовлекаются в катализируемую ферментом реакцию переноса протона, как это описано для некоторых ферментов ( Ыи в* аЗ,, 1994, Марданян и др., 1995).

ВЫВОДЫ

1. Дденозиндезаминаза впервые выделена и очищена в отдельности из белого и серого вещества больших полушарий мозга, мозжечка, продолговатого мозга и аденогипофиза крупного рогатого скота.

2. Сравнительное исследование физико-химичзских и каталитических свойств фермента показало, что:

а) в сером и белом веществе, мозжечке и продолговатом мозге фермент представлен только низкомолекулярной формой £30 кДа - в первой ткани и 40 кДа - в остальных трёх), а в аденогипофизе фермент представлен в двух, сравнимых по суммарной активности, молекулярных фордах: ниакомолекулярной (40 кДа) и высокомолекулярной (280 кДа);

б) наибольшее значение Кт (170 мкМ) наблюдается для препарата из продолговатого мозга, для препаратов из аденогипофиза этот параметр в 2-3 раза меньше, в остальных отделах находится вблизи 100 мкМ -величины, характерной для АДА из других тканей.

3. Из пяти использованных тпощ металлов ,

только ионы меди были способны необратимо ингибировать АДА из пяти исследованных отделов мозга. Предпологается, что причиной этого ин-гибирования является взаимодействие с остатками гистидина, координированными к

4. Титрование тиоловыми реагентами выявило наличие двух ЗК-групп на ыоЛь АДА из белого и серого вещества и показало, что зн-группы не важны для активности фермента из белого и серого вещества, мозжечка и продолговатого мозга (аденогипофиз не исследован).

5. Использованием метода химической модификации диэтйлпирокарбонатом получено прямое свидетельство важности остатков гистидина для активности АДА, что подтверждает изиестные из литературы результаты модельных и рентгеноструктурных исследований.

с. Исследование с применением методов химической модификации к-бром-сукцкниувдом и фотоокислением в присутствии трихлорэтанола пока-

зало, что для активности АДА важны два из б модифицированных остатков триптофана и, что важные для активности остатки триптофана, вероятно, находятся вблизи (или в) субстрат-связывающем центре фермента.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шароян С.Г., Антонян А.А., Марданян С.С. Получение Аденозин и АМР-дезаминаз из головного мозга крупного рогатого скота // Тез. докл. Всесоюзного семинара "Препаративная масштабируемая хроматография биологически активных веществ и альтернативные методы". -Санкт-Петербург, 1991.

2. Шароян С.Г., Антонян А.А., Марданян С.С. Выделение, очистка и сравнительное изучение свойств аденозивдезаминазы из пяти отделов мозга крупного рогатого скота // Биохимия. - 1994. - Т. 59, № 2. - С. 239-245.

3. Sharoyan S,G., Antonian А.А., Mardanian S.S., The study of Trp ■ and its Significanse for activity of Adenosine Deaminase from

cattle Brain // Proceedings of the 15-th Biennial Heeting of

International Society for Neurocheraistry, Kyoto, Japan, 1995.

4. Антонян А.А., Марданян С.С., Шароян С.Г.■Аминокислотные остатки, участвующие в проявлении активности аденозиндезаминазы из мозга крупного рогатого скота // Нейрохимия. - 1995. - Т. 12, Был. 4. - С. 40-46-

м

Подписано к печати 26.02.96г. Формат бум. 60x84 I/I6 1,0 п. л.

Зак.Ю Тираж 70__

Типография АрмСХА ул.Терянэ 74

itficnr ЬЧДЪГЦЧПГ Ú'jUUímiíb nnatlb ¿МЛ ршъшзгь

лтгпямлБштшгь iracrnwa t¡4 itsuansnwrc

U iT ij n ф ni. if

Ипа^Ъ аЪс^атГ ¡jinjnp brj¿hpaji|np «¡"UaunLliji nL^brifi ifbb Ц^ишцЪцЬр^ ии^миЦ OL qnp2 ntlblbkb I bpk»риф»*.Ъ П1ЦЬ1Ь ^ «ib^níj«-

щпчфс^ /Ш11/ вЛ£ша4к1 ^ t nnu^áJiV-

шпшЫ[«Ъ; ^Ьр^ЬХиф >[щ|51{ш{[иГ{|иЦш11 к Цшишц^в^ íaiial(ni.pjni.lilibpft 1ииГЬ1Гшаш1{ш1| nLutiLiTlifflU^nLßjnL^i'tib[i[i gnLjg ЬЪ шЦЬц, np qnp2 к uu¡[iaiiili bjni¡¿hpn¡.d, щ^ЬцЬ^пиГ к lipl{apui4nLfc ni.qhr|nllT 5bpJb1«nt litipliujuigi}«k t дшЬранГщЫ^пцjap ákn4 /30 kZ)o.4 qnp2 tijnLßnLii, 40 kDa* iTjniu bpbjnti//, [iul{ шцЫ/п^щп^^ть!"4 bplint ¡/щЫ^пц. jMp ¿Íin44 дшЬрш/п^ЬЦпц. jup /40 kZW к ршрДрши'пцЬЦщ.ишр /280 кЯл/i Kn-fr luiíbWbi iup<>bj /170 ьГЦ1Г/ ni/j¡) bpl¿u¡iui{ni.\i nLribuji JbpifbüaQ, u¡u ЬЪи^п^рц^ шцЬЪп^щп^^ ibpilbtenuWnL^^bpc /70 itlfi/i tfjnuu puirf^WjbpnLif Km-Q fc 1Û0 ill^lí-fi umitluibntU, updbj, ирр fbnL-

t oíJL 1 jnLu4uifTjhp¡i J{i\i¿ u [dJ "ülmmnarmb ^'H^h.^j»_

IfLq bpl^u^bbi líbumifjfi {тЪЪЬр^д / Mg2*, Сиг\ Ma2*, Za \ Со1" / líjiujli ¡inVbbp^j b\i ЕйцтЪвЦ оЛя^шр^Ь^прЬЪ цЪЦОЬ^ tiL^bi^i

шг^ЬЪпц^ЪцЬин^Ъш^р;

ft,nlB,Jt1'lJ пЬищЬЪшЪЬ(1п4 a^mpnuiÍQ шц^лшЦ к ^ор2 'Ujn.Lpbpfi iTn^ U'Ul-ntil Ji íbiju t pbpb^ bpl|iiL SH-fcnLitgí SH-iySphnQ 1(иркпр ¿ЬЪ ЧПР2 к ^jntjlbpji, OLribr^Jnl^Ji к Ьр1рири4п».Ъ пиг^Ьц^ Шй-|» шЦшЩгир j«i\i

SiuJuip; -í

tpbl4bpnkall,pr1'li-anlt gЬш4.ш"и ¿kimJmjuiTiuij iTbgnqji l^puiiuíuuTp ш-BjoignLg^l t li^U-ji ш1{ш[ч(п1.£}j«li Snu/up í(iua[ir(|ili|i «ЛладлрцЪЬр^ Цш-pb4npnug jllL^Qj

//-ppnJuntli3|iÍJj4J{iqnlí sfiífeliiuVi <5kmi|>i)|uJiuli к optsi"? tP^lni^ libp-liujjni.^JBup Snunogu|ir^ugiieXi ifhpni\ljbpn4 q^únuif npábpQ gnLjg b\i ui4bi, яр 6 aptwuenSuity iHaiignpi^bpJig U'>U-[i ш^и^пь?¿тЪ íui-

lîmp ^мркпр Ь"и ljpl{in.utilrpo'U}l HMÍb'liuij'ü SmJuiVuiliu'Uni.p.iiiiiIp , qra^nLiI á\i SbpiíbWj» итрииршт-Цицпц ЦЬЪирпХши? l{aiiГ "Upa i/nuNultiujgriLiJ'í