Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кислые медьсодержащие белки гловного мозга млекопитающих. Их очистные свойства

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кислые медьсодержащие белки гловного мозга млекопитающих. Их очистные свойства"

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЯНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

МИКАЕЛЯН МАРИАМ ВАРДКЕСОННА

УДК 577.112.083

КИСЛЫЕ МЕДЬСОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ШЕШШТАПЦИХ. ИХ ОЧИСГ ' СВОЙСТВА

03.00.04 - ШОХИМИ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук _

%

Ереван - 1988

Работа выполнена в лаборатории физической- химии белков Института биохимии Академии наук Армянской ССР (директор Института - академик АН Арм.ССР Галоян A.A.)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Налбандян P.M.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Хачатрян Г. С.

доктор биологических наук, профессор Оганесян С.С.

Ведущая организация - кафедра биохимии Ереванского Госуниверситета.

Защита диссертации состоится " /б" 1988 г.

в (V ак> часов на заседании специализированного совета (Д 005.15.01) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН Арм. ССР (375044, Ереван, ул.П.Севака 5/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Арм.ССР.. •"■

Авторе&айнННЕн "/3" ъи&Л.- 1988 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук,

профессор А.А.Симонян

:а.>.. ".гг..:ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.. РАБОТЫ

Стл^ . |

жссерт,1Ц'.:^»ктуальность темы> за последние десятилетия накопилось . много данных об участии меди во многих функциях организма, и в частности, ее значения в центральной нервной системе. Установлено, что нарушения в различных звеньях метаболизма меди приводят к развитию тяжелых патологий нервной системы. В связи с этим возникала необходимость детального изучения особенностей метаболизма меди в нервной системе. Установлено, что большая часть меди мозга находится в связанном состоянии и входит в состав ряда ферментов, участвующих в окислительно-восстановительных процессах. Однако описанные до настоящего времени медьсодержащие ферменты мозга объясняют лишь незначительную часть общего содержания меди в мозговой ткани, что предполагает наличие в мозгу других, еще не шявленных медьсодержащих белков, не обладающих ферментативными активностями.

В 1977 г. из мозга быка впервые был выделен медьсодержащий белок, названный нейрокупреином, который не обладал какой-либо ферментативной активностью (бко5.} е£ оЛ.} 1377]. Содержание меди в нейрокупреине объясняет более 30% общей меди растворимой фракции мозга быка. Однако локализация, распространенность и функции этого белка еще не изучены. До настоящего времени не выявлены другие медьсодержащие белки, находящиеся в растворимой фракции экстрактов мозга-, обнаружение которых позволило бы объяснить остальную часть.общей меди мозга.

Цель и задача исследования. Исходя из этого, перед нами была поставлена задача: разработать удобный метод быстрого выделения и очистки йейрокупреина из мозга различных млекопитающих, сравнить их физико-химические и антигенные свойства. В задачу наших исследований входило также использование иммунологических подходов для выявления субклеточной локализации нейрокупреина и анализа содержания белка в хродаффинных гранулах. В ходе очистки нейрокупреина нами было обнаружено, что в экстрактах мозга помимо нейрокупреина имеется еще одна медьсодержащая фракция. В связи с этим в задачу данного исследования входила также целенаправленная очистка медьсодержащего белка из данной фракции.

Научная новизна и практическая ценность. В результате

проведенных исследований разработана новая методика получения нейрокупреина из мозга, успешно использованная для очистки этого белка из мозга различных млекопитающих, в том числе, человека. Впервые получены кроличьи антитела к белку из мозга быка, которые позволили установить субклеточную локализацию нейрокупреина, антигенную идентичность нейрокупреинов, полученных из мозга различных млекопитающих, а также из хромаффин-ных гранул медуллы надпочечников быка. Впервые выделен новый кислый медьсодержащий белок и изучены его основные физико-химические свойства. Получены апоформы обоих белков и осуществлена реконструкция нейрокупреина и нового кислого медьсодержащего белка с помощью С^-тионеина из печени кролика. На основании изученных свойств медьсодержащих белков мозга выдвинуты предположения об их физиологической'роли и ожидаемого фармакологического эффекта при лечении ряда психических заболеваний, связанных с нарушением обмена меда.

Публикация и апробация работы. Основное содержание диссертации изложено в 9 печатных работах. Материалы работы докладывались на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Ш Республиканской научной сессии по вопросам биофизики, посвященной 60-летию образования СССР (Ереван, 1982), IX Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы (Ереван, 1983), ХУ конференции ФЕБО (Брюссель, 1983) и на 1У Республиканской молодежной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию Великого Октября (Ереван, 1987).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Первая глава диссертации, обзор литературы, в котором рассматриваются данные о фармакологических эффектах комплексов меди, в особенности цри лечении ряда нервных и психических заболеваний. Во второй части обзора рассматриваются имеющиеся данные о физико-химических свойствах медьсодержащего белка, нейрокупреина, изолированного из мозга быка. Вторая глава диссертации посвящена материалам и методам исследования. В третьей главе приводятся результаты исследования. В последней главе излагается обсуждение полученных результатов.

Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 5 таблиц. Библиография включает

108 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Метода исследования

Содержание белка определяли по Лоури и сотр. (Loivty 0., tt cd.., 1351). Содержание меда в белковых препаратах определяли методом атомной абсорбции на приборе "AAS - 1а также химическим методом, основанном на спектрофотометрическом определении окрашенных комплексов меди со специфическим реагентом -тетраэтилтиурамдисульфвдом по Матсуба и Такахаши (Mais¿¿/д. J., Touba.h-A's Iii J-, WD). Сульфгидрильнне группы белковых препаратов определяли с помощью реагента Эллмана (SicLt&k. J., iinoUa-y Содержание триптофана в очищенных белках определяли с помощью N-бромсукцинимида по методу Спанде и Виткопа (Span-<к Т., Wltjlop &■, 196П

О гомогенности белковых препаратов судили по форме элщи-онной диаграммы, полученной в ходе гель-фильтрации через сверхтонкие сефадексы на последних стадиях очистки, а также на основании электрофоретического критерия при аналитическом электрофорезе в 10% полиакриламидном геле (ПААГ).

Аминокислотный состав белков анализировали на автоматическом анализаторе- "HU^c-hi" после гидролиза белковых образцов в 6N HCl в течение 24, 48 и 72 часов при 105°С в вакууме.

Молекулярный вес белков определяли методом электрофореза в 10% ПААГ по Веберу и Осборну /1, -/369)

и с помощью г ель-фильтрации по Эндрюсу {/{гьсСхем/s 13 6 5j. Кроме этих методов молекулярную массу оттянивали также на основе аминокислотного состава белка.

Изоэлектрическую точку определяли методом изоэлектрофокусирования после растворения белка в 2,2% растворе амфолинов с интервалом pH 3-10 на приборе фирмы "LKB".

Спектры ЭПР в виде первой производной регистрировали в 3 мм трубках из плавленного кварца при темпёратуре -160°С на приборе "Е-4" фирмы "V^it-ivru". Оптические спектры регистрировали на спектрофотометре 'Ъескпг&п." при 20°С.

Для получения антител к нейрокупреину использовали белок-

из мозга быка, гомогенный в 105? ПААГ. 0,5 мг нейрокупреша в 0,5 мл 0,9$ HcoCl смешивали с 0,5 мл полного адьюванта Фрейн-да и полученную суспензию вводили кроликам подкожно. Далее 4 инъекции, каждая с интервалом 7 дней, проводились с той же концентрацией белка в неполном адъюванте Фрейнда. После 4-не-дельного перерыва кроликам вводили 0,5 мг белка в 0,9$ NeuCt без адьюванта. Кровь брали на 9 день после последней инъекции. Сыворотку собирали и фракции иммуноглобулинов G- очищали фракционированием сульфатом аммония и ДЭАЭ-целлюлозной хроматографией по методу Леви и Собера (Levy Hv Soieb Н.} 1$£0},

Иммунохимические анализы белковых препаратов проводили методами шшуноднффузш и иммуноэлактрофореза в 1,2% агарозе по методу Ухтердони [Oadb-Uxlcxy 'О'.,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработанная нами методика позволила выделить одновременно два кислых медьсодержащих белка из мозга в высокоочщцен-ном состоянии: нейрокупреин и ранее не очищенный белок, свойства которых были изучены в диссертации. Разработанная методика была применена для получения медьсодержащих белков из мозга различных млекопитающих: нейрокупреин был очищен из мозга быка, кролика, овод, свиньи, а также человека, а новый кислый медьсодержащий белок - из мозга человека и быка.

Для каждого выделения брали I кг сырой ткани цельного мозга и гомогенизировали в 3 л раствора сульфата аммония 25$ насыщения, рН которого доводили до- 6,0 10% раствором аммиака. Гомогенат центрифугировали при 10000 ^ в течение 30 мин и к надосадочному раствору- добавляли сульфат аммония до полного насыщения. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием в тех же условиях, растворяли в воде (600 мл) и диализовали против 0,2М Wx.CZ (20 л) в течение 24 часов для удаления ка-техоламинов. Затем диализ продолжали против 0,01М Мд,-ацетат-ного буфера, рН 6,0 (40 л) в течение 24 часов. Диализат центрифугировали при 10000j в течение часа и надосадочный раствор наносили на колонку с целлюлозой DE-52, уравновешенной 0.0IM ацетатным буфером, рН 6,0. Колонку промывали линейным градиентом ацетатного буфера (0,01-0,Ш) и кислую фракцию белков элю-

ировали 0,5М буфером. Эту фракцию далее подвергали гель-фильтрации через колонку с сефадексом Сг-75, средний (рис.1а). Медьсодержащую фракцию, соответствующую более низкой молекулярной массе, собирали и после ее концентрирования на колонке с целлюлозой ОЕ-52 подвергали гель-фильтрации через колонку с сефадексом &-50, сверхтонкий (рисЛб). На этой стадии очистки на элюционной диаграмме наблюдаются два пика. Першй пик соответствует новому кислому медьсодержащему белку, имеющему молекулярную массу 15 кД, а второй - нейрокупреину (молекулярная масса 10 кД). Эти фракции собирали отдельно и после их концентрирования вновь подвергали гель-фильтрации через колонку с сефадексом & -50, сверхтонкий (рис.2а). Элюционные диаграммы на этой стадии, полученные для обоих белков, представлены одним симметричным пиком, свидетельствующим о гомогенности белков. Это подтверждается также наличием только одной белковой полосы при электрофорезе нейрокупреина и нового кислого белка в 10$ ПААГ (рис.26,в).

По описанной выше методике очистки удается получить приблизительно 45-50 мг нейрокупреина и 35-40 мг нового кислого медьсодержащего белка в электрофоретически гомогенном состоянии из I кг свежей мозговой ткани быка-, однако выход обоих белков из мозга человека был вдвое больше по сравнению с мозгом животных. В то' же время содержание каждого из этих белков на I кг ткани мозга у изученных животных было примерно одинаковым.

Во время аналитического, электрофореза оба белка мигрируют с маркером - броьфеноловым синим, что позволяет 'отнести их к классу так называемых "крайне кислых" белков. Действительно, их изоэлектрическая точка, определенная методом изоэлектрофо-кусирования, приводит к величине 3,5.

Апоформы нейрокупреина и нового кислого медьсодержащего белка получали добавлением диэтилдитиокарбамата (10"%) к растворам холобелков в их окисленном состоянии. Для удаления избытка диэтилдитиокарбамата и- его комплекса с медью смесь хро-матографировали на колонке с целлюлозой ОЕ-52. Отсутствие меди в апобелках подтверждалось исчезновением сигнала ЭПР, а также методом химического анализа меди.

ю го 50 ^о Объем, мл

Рис.1. Очистка кислой медьсодержащей фракции из мозга.

а) гель-фильтрация через сефадекс й-75 (средний).

б) гель-фильтрация через сефадекс & -50 (сверхтонкий).

Г- I тиз».«

Рис.2. Элкционные диаграмм нейрокупреина (---) и

нового кислого белка (—г) (а). Электрофореграм-ш нейрокупреина (б) и нового кислого белка (в).

Изучены физико-химические свойства нейрокупреинов,, полученных из мозга различных млекопитающих и нового медьсодержащего белка. Молекулярные массы белков, оцененные методом гель-фильтрации и электрофореза, оказались близкими к 15 кД (дои нового кислого медьсодержащего белка) и 10 кД для нейрокупреи-нов, полученных из мозга различных млекопитающих. Электрофоре-тическое определение молекулярных масс белков в присутствии додецилсульфата натрия, мочевины и меркаптоэтанола приводит к образованию одной белковой полосы. Исходя из этих данных можно считать, что полученные белки состоят из одной полипептидной цепи.

Результаты по исследованию содержания меди в гомогенных препаратах белков методами атомно-абсорбционной спектроскопии и химического анализа, а также определением интегральной интенсивности спектров Э11Р окисленных белков приводят к величине 0,8-0,9 атома меди на моль белка в расчете на молекулярную массу 10 кД (нейрокупреин) и 15 кД (новый белок). Описанная методика очистки приводила к препаратам белков, в которых медь находилась преимущественно в окисленном состоянии, т.е. была ЭПР-детектируемой. Она может быть полностью восстановлена добавлением дитионита или аскорбата. Далее было показано, что восстановленные белки не аутооксидабельны, одаако их окисление может быть достигнуто, например, обработкой феррициани-дом. Неаутооксидабеяыюсть меди в обоих белках является некоторым доказательством отсутствия у них оксидазной активности.

Оптический спектр поглощения нейрокупрешга характеризуется двумя максимумами: широкой, но слабой по интенсивности полосой поглощения в видимой области при 600 им, обусловленной наличием двухвалентной меда, и интенсивным максимумом в УФ-областя, локализованном при 260 нм (рис.3). Молярный коэффициент экстинкции полосы при 600 нм оказался равным около

Эта полоса обусловлена переходом в электронной оболочке Са2+, поскольку она имеет низкий коэффициент экстинкции и исчезает при восстановлении. Удаление меди, подобно ее восстановлению, приводит к исчезновению спектра поглощения в видимой области, не влияя на максимум поглощения в УФ-области.

Длина волны, нм.

Рис.З. Оптические спектры нейрокупреина (I) и нового кислого медьсодержащего белка (2)-в УФ-области.

- 10 -

Оптический спектр поглощения нового медьсодержащего белка также характеризуется двумя максимумами поглощения. В видимой области наблвдается широкая полоса поглощения при 620 ни, с коэффициентом экстинкции 10Ш-1см-1, которая, как и в случае нейрокупреина, обусловлена наличием двухвалентной меди в белке (при восстановлении или удалении меда эта полоса поглощения исчезает). Оптический спектр поглощения в УФ-области характеризуется наличием тонкой структуры фенилаланиновых остатков с максимумом поглощения при 278 нм. Эта структура не наблвдалась в шсокоочищенных препаратах нейрокупреина вследствие низкого содержания в нем фенилаланина (рис.3).

Анализ аминокислотных составов кислых медьсодержащих белков показывает (таблица I), что белок с молекулярной массой 15 кД, как и нейрокупреин, богат дикарбоновыми кислотами. Количество фенилаланина в этом белке 2,5 раза выше, чем в нейро-купреине. В отличие от нейрокупреина, он содержит два остатка хщстеина, более обогащен гистидином и некоторыми другими аминокислотами.

При сравнительном изучении магнитных свойств нейрокупреина и нового кислого белка обнаруживается значительное сходство. Они оба обнаруживает сигнал ЭПР, типичный для медьсодержащих белков с медью типа 2 ("несиняя" медь). Высокопольная часть их спектра ЗПР характеризуется наличием суперсверхтонкой структуры, что указывает на связь меди с атомами азота (рис.4а). На интенсивность и форму сигнала Я1Р сильно влияет изменение рН среда. Однако в широком диапазоне .рН (от 2,0 до 12,0) обнаруживалась полная обратимость наблюдаешх изменений, что указывает на обратимость процессов протонизации-депротонизации ли-гандов меди в белках (рис.46). Из этих фактов можно сделать вывод о значительном сходстве окружения меди в обоих белках, хотя локализация основного максимума в видимой области и его молярная экстинкция у нового кислого белка и нейрокупреина различаются, что, вообще говоря, означает, что окружение меди в этих белках по крайней мере не полностью идентично.

При исследовании взаимодействия нейрокупреина с катехол-аминами было показано, что все полученные нейрокупреины способны взаимодействовать с катехоламинами как связывая их, так и

- и -

Н, эрстед

Н, эрстед

Рис.4. Спектры ЭПР нейрокупреина и нового кислого белка.

а) часть спектра ЭПР обоих белков в высокопольной области (рН 6,0).

б) Изменение ЭПР-спектров в зависимости от рН:

I - рН 3,5; 2 - рН 8,5; 3 - после приведения к рН 6,0.

Таблица I

Сравнение аминокислотных составов нейрокупреина и нового кислого медьсодержащего белка из мозга

Аминокислоты Ближайшие целочисленные значения

Нейрокупреин Новый кислый белок

I. Асп 14 20

2. Тре 4 4

3. Сер 4 4

4. Глу 25 18

5. Гли 8 5

6. Ала 6 6

7. Цис 0 2

8. Вал 4 6

9. Мет I 2

10. Иле з 3

II. Лей •4 8

12. Тир I I

13. Фен 2 5

14. Лиз 3 7

15. Гис I 3

16. Арг I 2

17. Трп I I

входя с ними в окислительно-восстановительную реакцию. Добавление адреналина к раствору белка в его окисленном состоянии. приводило к уменьшению интенсивности сигнала ЭПР (рис.5), что свидетельствует о восстановлении меди белка адреналином. Параллельно прослеживалось образование окрашенного в красный цвет продукта реакции окисления адреналина - адренохроыа. Титрование окисленного белка адреналином при рН 6,0 показало, что I моль адреналина окисляется 2 молями белка. Образовавшийся адренохром был стабилен, а нейрокупреин не аутооксидабелён. Таким образом, эта реакция носит стехиометрический характер. Эта стехиометрия является еще одаим доказательством наличия только одного атома меди в нейрокупрсинах. При взаимодействии

4- б

Время, мин

Рис.5. Кинетика восстановления меда окисленного нейрокупреина (1,8x10"%) адреналином (0,8x10 M) при pli 6,0.

- 14 -

восстановленного белка с адренохромом наблюдается обратное явление: происходит восстановление адренохрома и окисление нейрокупреина. Однако в этом случае при окислении меди белка происходит модификация ее окружения, что в конечном итоге приводит к удалению меди из белка. Изучение окислительно-восстановительных реакций нейрокупреина с адреналином и адренохро-мом дает основание предположить, что белок может участвовать в процессах детоксификации, связывая избыток катехолаышов, образовавшихся при нарушениях их обмена или при дефиците меди, а также удаляя адренохром.

Таким образом, сравнительное рассмотрение основных характеристик полученных препаратов нейрокупреина из мозга различных животных и человека позволяет придти к заключению, что. все они имеют практически аналогичные физико-химические свойства. Дальнейшие доказательства идентичности нейрокупреинов из мозга различных млекопитающих были получены при изучении их антигенных свойств. Оказалось, что антитела к нейрокупреи-. ну быка дают кросс-реакцию с нейрокупреинами, полученными из шзга других млекопитающих, указывая на идентичность антигенной детерминанты нейрокупреинов (рис.6а). Характерно, что удаление меди не приводит -к изменению антигенных свойств белка. Тем самым можно считать доказанным, что медь не вносит вклада в антигенную детерминанту нейрокупреина. Используя иммунный тест, была исследована локализация нейрокупреина в субклеточных фракциях мозга. Субклеточные фракции изолировали из мозга кролика по методу Виттакера и сотр. (\К/1г'Ма.1иг 1/.) гЬ о1 Среди 5 исследованных фракций (сшаптосомальная, митохондри-альная, ядерная, микросомная и цитозольная) нейрокупреин был обнаружен только в цитоэольной и синаптосомальной фракциях.

Новый кислый медьсодержащий белок не обнаруживал иммуно-преципитации с антителами к нейрокупреину. Тем самым можно заключить, что антигенная детерминанта этих белков различна. Можно также утверждать, что новый белок не является продуктом деградации нейрокупреина, поскольку его молекулярная масса выше, чем у нейрокупреина.

Еще в 1981 г. было показано наличие крайне кислого медьсодержащего белка (ККБ) в хромаффинных гранулах медуллы надпо-

О

® ®

®

• а

1

2

б

Рис.6, (а) - Иммунодиффузия нейрокупреинов, полученных из различных источников. I - человек> 2 - свинья, 3 - овца, 4 - кроетк. В центральной лунке нанесены антитела к нейрокупреину. (б) - Иммуноэлектрофорез мембранного (I) и растворимого (2) ККБ из гранул. Антитела, полученные к нейрокупреину, нанесены в центральную канавку.

- 16 -

чечников быка {ЬгСдогуа-п. et сЛ^ Получены две

формы белка: растворимая и мембранная. Сравнительное изучение физико-химических свойств нейрокупреина и растворимого белка показало идентичность этих белков по многим свойствам (молекулярная масса, изоэлектрическая точка, содержание меди, аминокислотный состав, оптические и магнитные свойства и т.д.). Идентичность этих белков получила дальнейшее подтверждение в иммунологических результатах: как выяснилось ККБ из гранул дает реакцию преципитации с антителами к нейрокупреину. Установлена антигенная идентичность не только нейрокупреина с растворимым ККБ из гранул, но также с мембранной-формой этого белка (рис.66), которая отличается от растворимой -формы по молекулярной массе (12 кД) и аминокислотному составу. Сравнение аминокислотных составов мембранного и растворимого белков показало, что мембранный белок содержит на 17- аминокислотных остатков больше, чем растворимый, причем 60$ этих аминокислот гидрофоб-ны. Если бы эти аминокислоты, которые составляют 20% от обще- • го содержания аминокислот, были распределены "случайным" образом вдоль "первичной структуры, то антигенные свойства этих белков скорее всего были бы различными. Однако, как установлено, различия в аминокислотных составах не'влияют на антигенные свойства мембранного и растворимого белков. Из этих данных сделано предположение, что мембранный белок.отличается от растворимого ККБ гидрофобным-пептидом, который удлиняет", пептидную цепь, не влияя на его антигенные свойства.

Хотя из этих данных можно сделать вывод, что нейрокупре-ин, содержащийся в синаптосомальной фракции мозга, также ассо-цирован с везикулами синалтосом, однако его роль в цитозольной фракции значительно менее понятна. Можно, однако, предположить, что он представляет "резервный" фонд нейрокупреина, который включается в синаптосомальные везикулы по мере их истощения.

Исследована реконструкция апоформы нового медьсодержащего белка и апонейрокупреина. С этой целью 3x10""% растворы белков инкубировали в течение 2 ч с 3x10""% раствором Си.21" при комнатной температуре. Белки далее освобождали от избытка металла хроматографией на ДЭЛЭ-целлюлозе. При этих условиях достигалась црактически полная реконструкция как апонейрокупреина, так и

апофорш кислого белка. Обнаружено, что реконструкции апобел--ков можно также легко достичь их инкубацией с Си- -тионеином, полученным из печени кролика. Этот белок играет важную роль в депонировании некоторых жизненно важных металлов, таких как Си}Ъгъ и детоксификации чужеродных тяжелых металлов. В организме металлотионеины играют также роль донора металлов %кя метаялзависишх белков и ферментов М., Ccú/ъ 198 2).

Нами показано, что при инкубации апонейрокупреина и апофорш кислого белка с Си. -тионеином, содержащим. 6 атомов меди на молекулу, происходит перенос меди от £'а-тионеина к белкам мозга. Важно отметить, что перенос меди осуществляется при сте-хиометрических соотношениях апобелков и Си. -тионеина (ЗхЮ~%/10~%), в то время как при'использовании для реконструкции ионов меда требуется значительно более высокие концентрации меди. После реконструкции восстанавливаются как оптические, так и магнитные свойства обоих кислых медьсодержащих белков. Таким образом, апофорш этих белков, образовавшихся в условиях иг vivo при дефиците меда, могут быть реконструированы при их взаимодействии с медьсодержащими металлотионеинами.

Сравнительное изучение физико-химических и антигенных свойств нейрокупреина и нового кислого медьсодержащего белка из мозга показало, что наряду со значительным сходством в свойствах между ниш наблюдаются определенные различия. Мы предлагаем называть зтот белок нейрокупреином 2. Суммарное содержание обоих белков в мозгу объясняет примерно 80% меди растворимой фракции мозга, и они объясняют почти всю медь, связанную с крайне кислой фракцией мозга.

Изучение окислительно-восстановительных реакций нейрокупреина с катехоламинами дает основание предположить, что он может выступать в роли буферной системы, способной связывать и тем сашм нейтрализовать избыточные .количества дофамина, если они образуются в мозгу. Таким образом их роль в мозгу может состоять в обратном связывании катехоламиновых нейромедиаторов, благодаря которому может предотвращаться развитие гиперчувстви-телыюсти. Поскольку повышение содержания дофамина является следствием отсутствия или понижения активности ряда медьсодержащих ферментов, участвувдих в обмене катехоламинов, то нейро-

купреин может компенсировать эффект понижения активности этих ферментов.

Было также показано, что нейрокупреин обладает вазодилля-тационным свойством в отношении мозговых сосудов (Мирзоян С. и сотр., 1983). Поэтому понижение содержания нейрокупреина может привести к развитию спастических состояний мозговых сосудов и гипоксии мозга.

С другой стороны, необходимо допустить, что нейрокупреин вовлекается в поддержание гомеостаза меда в мозгу, поскольку в алоформе способен выступать как хелатор меди по отношению к ряду медьсодержащих ферментов, в частности, к дофамин-19 -моно-оксигеназе ( М &.гко5ь1&/ъ et Уже' одно это свойство

нейрокупреина позволяет предположить его существенную роль в регуляции активности медьсодержащих ферментов. Наиболее простым путем регуляции металлсодержащих ферментов является влияние на содержание в них металла, поскольку металл (и в частности, медь) входит в активный центр металлоферментов. Насыщение их металлом приводит к максимальной активации и, наоборот, удаление металла сопровождается резким падением активности металлоферментов. Даже если ограничиться ролью нейрокупреина как ингибитора дофамин-/-монооксигеназы,' то и тогда очевидно его значение в регуляции содержания дофамина и других катехол-аминов в мозгу. Если, однако, учесть аналогичные взаимодействия нейрокупреина с другими медьсодержащими ферментами (ли-зилоксидаза, диаминоксидаза и т.д.), то становится очевидной фундаментальная роль нейрокупреина не только как участника гомеостаза меди, но также как регулятора активности медьсодержащих ферментов, вовлеченных в осуществление многообразных функ-,ций организма (биосинтез'катехоламгоюв, регуляция эластичности кровеносных сосудов, защита от повреждения супероксидными радикалами и т.д.).

Исходя из описанных функций нейрокупреина, можно предположить возможный фармакологический эффект белка при лечении, шизофрении и некоторых психических заболеваний, связанных с нарушением метаболизма меди или катехоламинов. Предполагается, что шизофрения развивается, когда при повышении содержания дофамина концентрация нейрокупреина понижена. Так как высокое

- 19 -

содержание дофамина объясняется пониженной активностью медьсодержащих ферментов, участвующих в его метаболизме, то вве- . дение дополнительных количеств нейрокупрёина, вероятно, может предотвращать эффекты инактивации этих ферментов.

Предполагаемые преимущества применения нейрокупрёина при определенных психических нарушениях заключаются в том, что он, во-первых, способен нейтрализовать избыточные количества кате-холаминов и тем самым снять галлюцинаторные явления и развитие гиперчувствительности. Во-вторых, нейрокупреин может увеличивать количество меди в мозгу, дефицит которой приводит к накоплению дофамина и катехоламиновых нейромедиаторов.

Относительно физиологической роли нейрокупрёина 2 в настоящее время вряд ли можно выдвинуть обоснованные предположения. Тем не менее, не исключено, что этот белок может обладать всеми теми физиологическими свойствами, что и нейрокупреин 1.

Еще один аспект возможного' значения нейрокупреинов состоит в следующем. Известно, что удаление металла из металлофер-ментов, в частности меди из медьсодержащих ферментов, в условиях £|г vivo ведет к значительному снижению полупериода их жизни. Иначе говоря, в апоформе медьзависимые ферменты значительно более чувствительны к воздействию внутриклеточных про-теаз, следовательно, быстрее деградируют, чем холоформы. Поэтому нейрокупреины можно рассматривать как эндогенные факторы, регулирующие время жизни медьсодержащих ферментов. При осуществлении этой фунюдог нейрокупреины должны находиться в определенных взаимоотношениях с металлотионеинами, являвшимися основ-, ными депо меди в организме.. Как показано в работе, Сьь-тионеи-ны могут быть использованы ¿a vitto для переноса меди на оба нейрокупреина, однако перенос меди в обратном направлении не происходит. Следовательно, медь способна переходить только от: Са-тионеина к апонейрокупреинам, а не от нейрокупреина к апо-тионеину. Хотя эта реакция наблюдалась нами üv мitto¿ однако оба белка (нейрокупреин и металлотионеин) найдены в цитозоль-ной фракции, поэтому не исключено, что взаимодействие между ними происходит также иг vivo.

вывода

1. Разработана новая методика получения нейрокупреина из мозга различных млекопитающих (быка, свиньи, овцы, кролика,

а также человека). Определены его молекулярная масса, содержание меда, изоэлектрическая точка, аминокислотный состав. Изучены его магнитные свойства и влияние рЕ1 на окружение меди в белке. Установлено, что содержание нейрокупреина в мозгу человека в 2,5 раза превосходит содержание этого белка в мозгу других животных. Изучено взаимодействие нейрокупреина с адреналином. Показано, что окисленный нейрокупреин стехиометрически восстанавливается адреналином.

2. Получены антитела к нейрокупреину и показана идентичность нейрокупреинов, полученных из различных источников по их физико-химическим и антигенным свойствам. Установлена его локализация в синалтосомальной и цитозольной фракциях. Показана также антигенная идентичность нейрокупреина и крайне кислых белков, полученных из растворимой и мембранной фракций гранул медуллы надпочечников быка.

3. Осуществлена реконструкция нейрокупреина инкубацией апобелка с медьсодержащими металлотионеинами, полученными из печени. Показано, что после реконструкции полностью восстанавливаются оптические -и магнитные свойства нейрокупреина.

4. Выделен новый крайне кислый.медьсодержащий белок из растворимой фракции экстрактов мозга быка и человека. Определены его молекулярная масса, содержание меди, аминокислотный состав. Изучены его оптические и магнитные свойства. Исследовано влияние рН на ЭПР-спектри белка и показана обратимость изменений окружения меди в белке в широком диапазоне рН.

5. Получена апоформа нового медьсодержащего белка и осуществлена его реконструкция при помощи-Си/-тионеина. Показано полное восстановление оптических и магнитных свойств белка после реконструкции. Установлено, что по своим антигенным и-некоторым физико-химическим свойствам новый медьсодержащий белок отличен от нейрокупреина, а суммарное содержание меди в обоих белках составляет около 80-90$ от общего содержания меди растворимой фракции мозга.■

- 21 -

6. На основании изученных свойств этих белков выдвинуты предположения об их возможной физиологической роли.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Микаелян М.В., Налбандян P.M. Антигенные свойства нейро-купрекков из различных источников. - Тезисы I Всесоюзного биофизического съезда, Москва, 1982, прил. к 1У тому (2643), с.5." /

2. Микаелян М.В. Об идентичности свойств'нейрокупреинов из мозга различных животных. - Тезисы IX Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы, Ереван, 1983, с.70-71.

3. Мирзоян С.А., Налбандян P.M., Мдркарян В.М., Микаелян М.В. Влияние нейрокупреина на мозговое кровообращение. - Кровообращение, 1983, т.16, Jp I, с.3-6.

4. Микаелян М.В. Локализация нейрокуггреина в клетке. - Тезисы 1У Республиканской молодежной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию Великого Октября, Ереван, 1987, с.28.

5» Mikaelyan M.V., Grigoryan N.A., Nalbandyan R.M. Soluble and membraneous forms of a novel copper-containing protein from chromaffin granules. - Abstracts of the 12th International Congress of Biochemistry, Australia, 1982, p.326.

6. Grigoryan N.A., Mikaelyan M.V., Gasparyan VlK., Nalbandyan R.M. Properties of an extremely acidic copper-containing proteins from chromaffin granules. - Abstracts of the 15th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Brussels, 1983, p.218..

7- Mikaelyan M.V., Nalbandyan R.M. Neurocuprein from human brain. - Neurochem.Int.y 1985, v.7, N?, p.1073-1078.

8. Markossian K.A., Paitian N.A., Mikaelyan M.V., Nalbandyan R.M. On the physiological role of neurocuprein: aponeuro-cuprein is an inhibitor of dopamine B-monooxygenase. -Biochem.Biophys.Res.Commun., 1986, v.138, N1, p.1-8.

9. Mikaelyan M.V., Grigoryan N.A., Nalbandyan R.M. Similarities of physico-chemical and antigenic properties of neu-rocupreins and extremely acidic copper proteins from chromaffin granules. - Biochim.Biophys.Acta, 1987, v.924, N3, P.5^8-555.