Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, физико-химическая характеристика и идентификация новой группы кислоторастворимых белков головного мозга млекопитающих

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение, физико-химическая характеристика и идентификация новой группы кислоторастворимых белков головного мозга млекопитающих"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

СКЛАДЧИКСВА Галина Юрьевна

ВЫДЕЛЕНИЕ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВОЙ ГРУППЫ КИСЛОТОРАСТВОТИМИХ БЕЛКОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЛЕКШИТАЩИХ.

Специальность 03.00.04 - биохимия.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1994

Работа выполнена в лаборатории биополимеров Отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИ® им. Б.П.Константинова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

М.И.Мосевицгаш.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук.

профессор С.Я.Френкель, .

кандидат биологических наук, ст.науч.сотр. В.П.Гончарова.

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН.

Защита диссертаций состоится " 9 " шня 1934 г. в ^ час. на заседании специализированного Совета К.063.57.09 по присуждении ученой степени кандидата биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9, биоло-го-почвенньй факультет ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке СПбГУ.

Автореферат разослан " У " мая 1994 г.

Ученый секретарь

специализированного Совета А.Г.Марков.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование молекулярных основ деятельности мозга является одним из ведущих и перспективных направлений современной нейробиологии. Значительное внимание при этом уделяется белкам, поскольку они, являясь объектами многообразных форм регуляции функционирования нервных клеток, в свою очередь, выполняют различные регуляторные фушсции и играют тжтег образом важную роль в интеграции всех процессов, протекающих в мозге. Особый интерес вызывают белки, определяющие характерные особенности функционирования мозга, т.е. нейроспецифические белки. Эти белки вовлечены в процессы, протекающие только в нервной ткани: синтез и обмен нейромедиаторов, статическая передала нервного импульса и т.д. Кроме топ, нейроспецифические белки выполняют . детоскелетную роль и транспортную функцию, которые в нервных клетках приобретают особое значение' в связи со специфической морфологией клеток, позволяющей осуществлять их функции.

Большее значение уделяется поиску новых нейроспецифнческих белков (Аксенова и др., 1985; Гончарова и др., 1987; ßlenny st.al.. -»939; Geddest et.al., 1990; Donato et.al., 1990; Sano et.al., 1989). Их выявление расширяет возможности для понимания молекулярных механизмов осуществления специфических функций отдельными нервными клетками и всей нервной системой в цело:,*. Изучение молекулярных основ формирования нервной системы, повреждений и вызванных этими повреждениями нарушений функций головного мозга, а тгюге регенерации нервных волокон сфокусировало значительный интерес на поисках белков, являющихся юаочевыми молекулами б биохимических механизмах этих процессов. Одним из таких, белков, обнаруженных за последнее время, модно назвать белок В-50 (GAP-43), чья экспрессия в процессе роста и резкопрессия во время регенерации аксонов являются характерной особенностью обоих событий (Skene, Willard, 1981). Интенсивное изучение зтого белка последние пять лет показало, что он является участником молекулярных событий, лежащих в основе механизмов обучения и памяти (Cogglns, ZwJers, 1991). Однако, многое остается неясным, причем это касается не только молекулярной биохимии процессов, в которых он участвует, ко и самой молекулы белка В-50 (GAP-43): ее структуры, посттрансляционных модификаций, точного места .ю-

кашзации.

Белек В-50 (GAP- 43), являясь одним из ключевы;- регу¿шторных белков синаптической плазматическое мембраны, определяющих специфику биохимических реакций внутри нервной клетки в ответ на подученный извне сигнал, з то же время является структурным белком, участвуя в формировании плазматической мембраны во время роста аксонов и взаимодействуя с цитоскелетом при поддержании пространственной организации конусов роста. Но каким образом этот белок вовлекается в столь различные процессы в нейронах? Этот вопрос в настоящее время сдается открытым. Приблизиться к ответу на этот ьопрос позволит дальнейшее исследование свойств [¡-50 (GAF-4.3), а также выявление новых бедкеч синаптической области, которые вместе с В-50 (GAP-43) осуществляют ключевые функции нейронов. Настоящая работа является составной частью эту -г исследований, поскольку посвящена изучению новой группы кислоторастворимых белков мозга млекопитающих, в состав которой входят лве формы нейроспецифического белка В-50 (GAP-43).

Цель и задачи исследования. Нелью настоящей работы являлось физико-химическое исследование новой группы кислоторастворимых белков головного мозга млекопитсиовдх (BASP - Brain Acid Soluble Proteins). Для выполнения поставленной цели решались следующие задачи:

1 - подбор оптимальных условий для выделения белков BAS'P из ткак'-i мозга;

2 - определение некоторых физике-химических свойств белков ВАЗР, в частности,значений молекулярной массы и изозлектрическэй точки на' дого из белков группы;

3 - выявление посттрансляционных модификаций белков BASP;

Л - определение внутриклеточной локализации белков;

Ь - установление тглневей и видовой специфичности белков группы-.

б - сопоставление белков группы BASP с другими известными белками головного мозга млекопитающих;

'' - получение чистых фракций индивидуальных белкоз группы 8ASP.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые из голоэного мозга млекояитащих выделена группа кислоторастворимых белкоь, обозначенная нами BASP (Brain Acid Soluble Proteins). В

составе группы, кроме известного нейронного белка В-50 CGAP-43), обозначенного нами BASP2-1, идентифицированы два новых белка BASP1 и BASP3, а такхе нэ известная ранее цитоплаз'/.атичеасая форма бедка В-50 (GAP-43), обозначенная BASP2-2. Проведенное исследование бежов новой группы имеет фундаментальное значение, поскольку расширяет возможности в поиске недостающих звеньев молекулярных событий, происходящих в мозге и являющихся составной частью сложных интегратквных функций, характеризующих высшую нервную деятельность.

В ходе анализа белков BASP были разработаны модификации двумерного электрофореза белков, которые могут быть широко применены в лабораторных исследованиях.

Апробация работа. Материалы диссертации быни представлены в доктадах на научных семинарах лаборатории биополимеров и Отдела молекулярной и радиационной бисфизт^и Санкт-Петербургского института ядерной физики им. Б.П.Константинова; на VI симпозиуме СССР-Италия (Ленинград, 1988); на XIV симпозиуме Международного нейрохимического общества (Montpellier,1993)

Публикации. По теме диссертации.опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит иэ введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает 131 работу.

МАТЕРИАЛЫ К МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Велки выделяли из гомогенатов мозга млекопитающих (крыса,_ бык, мышь, кролик, человек), экстрагируя их 5/С-ной ({СЮд и 1%-ннм тритоном Х-100 и осг'вдая из экстрактов 5-ю объемами ацетона. Обогащения белками BASP достигали, применяя ионообменную хроматограф™ на ОЕАЕ-целлюлозе. Индивидуальные белки BASP получали методом препаративного электрофореза & система О,ОМ уксусная кислота - &,5М мочевина (Panyim, Chalkley, 19ôrJ).

Определение молекулярной массы белков BASP проводили по методу Фергюсона (Fercuson, 1S&4; Benowitz et.al., 198?), используя электрофорез в полиакрилачядних гелях с различной концентрацией акрилачвда в присутствии 0,1Х-ного ДЦС-Na (Laemmlii, 1Q70), и

- 6 -

метод гель-фильтрации при высоком давлении.

Язозлектрические точки и состав изоформ белков BASP определяли методом двумерного электрофореза, в первом направлении которого использовали изоэлектрофокусирование (ИЭФ), а во втором -систему 0,9М уксусная кислота - 2,5М мочевина.

Гидрофобные свойства белков BASP изучали методами: 1)-двумерного электрофореза, в первом направлении которого применяли систему 0,9М уксусная кислота - 2,5М мочевина, а во втором - систему О,SM уксурная кислота - 2,БМ мочевина - 0,5% тритон Х-100; 2)-гидрофобной обратнофазовой хроматографией.

Б качестве методов для установления фосфорилирования белков BASP использовали окрашивание фосфопротеинов с помощью красителя "Stains-all" (Green et.al., 1973) и метод включения [32РЗ а белки в системе эндогенного фосфорилирования.

В работе также использованы методы субклеточного фракционирования (Dunkley et.al., 1988), получения синаптических плазматических мембран (Matus, Jones, 1974),иммуноблотташга, ограниченного чротеолиза белков с помощью протеазы V8 из Staphylococcus aureus (Cleveland et.al., 1977), окрашивания белковых зон в ПААГ растворами серебра (Morrisey et.al'., 1981). Быни выделены гли-альный кислий фибриллярный белок (Eng et.al., 1971) к белок В-50 (GAP-43) (Oestreicher et.al.. 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И Ж ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выделение группы кислоторастворимих белков из гомогенатов головного мозга млекопитающих.

Электрофоретический анализ экстрактов 5%-ной HCIO4 гомогенатов головного мозга млекопитающих "выявил в этой ткани rpjfvny белков, обладавших близкими значениями подвижности в Г1ААГ в системе 0,9М уксусная кислота - 2,5М мочевина. Поскольку эта группа белков была выявлена практически только.в ткани мозга, она была названа нами "группой кислоторастворимых белков мозга" - BASP (Brain Acid Soluble Proteins ). Всего в группу включено четыре белка: BASP1, BASP2-1, BASP2-2 и BA.SP3. Номер каждому белку присвоен в соответствии с его положением в ПЛАТ относительно стартового торца геля при электрофорезе в системе 0.9М уксусная

BASF

_ к,. __. ZU ^ $

Рис.1. Бэлки, экстрагированные 5?.-яой HCIO4 из гомогенатов головного мозга различных млекспи-тахфщх.

HI

4-* ♦

1 2.5 4 5

1-крыса,2-мышь,3-кролик. 4-бик,5-человек.

кислота - 2.5М мочевина, результат которого представлен на рис.1. Баям ВASP мигрировали в ПААГ компактной группой и при электрофорезе в присутствии ДДС-Na.

Так же, как и 5%-ной НС104.,все белки BASP можно было экстрагировать и 2%-ной ГХУ, и 0.S5M Nadl. Однако обработка осадков, оставшихся после экстракции (в том числе и 5?.-кой НС!Од), 1%-кым тритоном Х-300 показана, что нэ веб белки BASF в одинаковой степени хорошо экстрагируются этими агентами. Для полного извлечения белка BASP1 из гомогеката требовалось присутствие неионного детергента. Количество дополнительно экстрагированного белка BASP1 составляло 30-502 от общего его содержания. При осаждекми белкоз В ASP кз экстрактов они не продемонстрировали больших различий в свойствах, Белки BASF можно было осалить lOt-ной ТХУ или 6-ю объемами ацетона, иди 50-60£-ным раствором сульфата аммония.

В результате изучения условий экстракции белков ВЛ5Р была предложена схема быстрого и эффективного выделения этих белков из гомогенатов головного мозга млекопитавдич. Выделение включает два этапа;1 -- экстракция белков раствором, содержащим 5% HCIO4 и 17. тритона Х-100; 2 --- осаждение белков добавлением к экстракту б-ти объемов ацетона.

1-08 направление

--iTe 4 Л* ...... tf.

PHfASp BASP i

« '%

lv© a <-<T-->

Рис.2. Лвумерный электрофорез белков BASF из мозга крысы.Первое направление - ИЭФ з диапазоне рН 3-5,5 (а) к рН 3,7-4,8 (0), (второе - электрофорез в системе 0,9М уксускат кислота - 2.5М мочевина).

2. Изоэлектричеокое (фокусирование (ИЭФ) белков BASP.

Поскольку хорошая растворимость в кислой среде характерна для основных'белков так же, как и подвижность при электрофорезе в системе 0,9М уксусная кислота - 2,5М мочевина, первоначально предполагалось, что белки BASP, подобно гистокам и НМб белкам являются основными белками. Однако ИЭФ показало, что все белки ВА5Р имеют изоточки в кислой области рН от 4 до 5 (pi 4,3 -4,6). Несколько вытянутые пятна в гелях по градиенту рН (3,5-10) давали основания предполагать наличие изоформ у каждого белка. Действительно, использование узких градиентов рН (3 - 5,5 и 3.7 - 4,8) при КЭФ белков BASF из мозга крысы показало, что белг ки BASP1 и 3ASP3 имеют по три изоформы, а белки BASP2-1 и BASP2-2 - по пять, причем у последних белков три изоформы имеют совпадающие зна^ния pi, а по двум изоформам белки имеют сдвиг: BASP2-1 в кислую область, BASP2-2 - в щелочную, соответственно (рис.2).

Поскольку при всех вариантах выделения белков: экстракция кислотами или солью, осаждение 10£-ной ТКУ, 6-ю объемами ацетона, сульфатом аммония, - мы наблюдали один и тот же состав иго-Зори у всех белков BASP, следует рассматривать эти изоформы как присущие натиьным белкам, а не артефактные.

Установление изото' к белков BASP в кислой области позволило предложить способ получения обогащенного препарата этих белков.' Ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе экстрактов 5%-ной

НС104 гомогенагов мозга-можно было получить препарат, состоящий на 80% из белков BASP.

Изоформы белков BASF2--1 и BASP2-2 удалось наблюдать благодаря впервые предложенному варианту двумерного электрофореза, в первом направлении которого проводили ПЭТ, а во втором - электрофорез в системе 0,9М уксусная кислота - 2,5М мочевина. Широко используемый вариант двумерного электрофореза, в первом направлении которого проводится ИЭФ, а во втором - электрофорез в присутствии ДДС-Na - не эффективен для анализа этих белков, поскольку BASP2-1 и BASP2-2 умеют одинаковую подвижность в ПАЛГ при электрофорезе с ДДС-Na.

3. Электрофорез в присутствии ДЦС - Na. Определение молекулярных масс белков BASP.

Электрофорез белков группы BASP, выделенных из мозга всех проанализированных млекопитающих (крыса, мышь, кролик, бык, человек), в системе с ДДС-Na показал совпадение подвижности белков 8ASP2-1 и BASP2-2. В остальном порядок миграции зон белков сохранялся в зтоЛ системе таким же, как и в системе 0,9 М уксусная кислота - 2,Ш мочевина, т.е. наиболее быстрым членом группы являлся BASP3, a BASP1 демонстрировал самую медленную скорость миграции в гелях. В экспериментах, когда при проведении электрофореза в присутствии ДДС-Na использовались гели различной плотности, была выявлена закономерность: при уменьшении концентрации акриламида наблюдалось относительное замедление миграции всех белков группы BASP. Изменение электрофоретической подвижности белков BASP фиксировалось относительно белков, млеющих прчмой характер зависимости скорости миграции в ПААГ в присутствии ТДС-Na от концентрации акриламида, а именно: фосфорилазы В (ФВ). бычьего сывороточного альбумина (БСА), овальбумина (ОБА), карбо-ангидраза (КА). Аномальное поведение белков BASP при элект^ фо-резе с ДДС-Na сделало невозможной попытку оценить их молекулярные массы, построив график зависимости молекулярной массы (Мг) белков от их электрофоретической подвижности при определенной концентрации акриламида Weber, Osborn, 1269). Эта зависимость имеет линейный характер для большинства белков, связывающихся с ЛЛС-Иа в соотношении 1:1,4, благодаря чеуу эти белки приобретают избыт очи;;:"! отрицательный заряд (приносимый детергентом), йссле-

дуемая группа белков, по-видимому, оказалась принадлежащей ¡с той категории белков, для которой количественное соотношение в комплексе с ДДС-Na значительно отличается от 1:1,4. На скорость продвижения таких белков в гелэ начинает, оказывать существенное влияние собственный заряд белковой ыоле1сулы, и в случае наличия большого положительного заряда (как у белков BASF), который частично компенсирует отрицательный заряд, привнесенный детергентом, может наблюдаться снижение подвижности белков в 11ААГ при уменьшении концентрации акрил&мица в нем. Для сценки Мг таких белков используется метод Фергюсона (Ferguson, 1964; Benowitz et.al., 1987), позволяющий определить зависимость относительной подвижности белков от концентрации геля. На рис.3 показан график зависимости относительной подвижности от концентрации акриламида в ПААГ для стандартных белков и бел>са BASP2-1 из мозга крысы. Подвижности всех белков отнесены к подвганости овальбумина. Для стандартных белков эта зависимость имеет линейный характер: значение логарифма относительной подвижности (In R) обратно пропорционально концентрации акриламида в ПААГ (XT). Для BASP2-1 наблюдается другая картина: зависимость In R от Т для этого белка имеет нелинейный характер. Так;й же характер зависимости In R от Т обнаружили остальные белки 3ASP. Наклон графика (Кг), который служит основным параметром при вычислении молекулярных масс по Фергюсону, определяли,аппроксимируя с помощью критерия наименьших квадратов,зту зависимость линейной в том ее участке, который соответствует наиболее концентрированным гелям (14-22Х). В таких гелях из факторов, влияющих ка подвижность белка, на первое место выдвигается размер белковой глобулы, который определяет скорость ситовлния белков через поры ПААГ. На рис.4 представлены значения молекулярных масс для всех белков BASP из мозга крысы. Наибольшей молекулярной массой обладают белли BASP2-1 и BASP2-2, несколько меньшее значение имеет BASP3, a BASP1 имеет наименьшее значение. Таким образом, белок BASP1 при электрофорезе в присутствии ДДС-Na .показал' самую сильную зависимость подвижности от концентрации геля.

Значения молекулярных масс для белков BASP, определенные методом Сергюсона,были подтверждены в экспериментах по гель-фильтрации белков при высоком давлении.

Рис.3. График зависимости относителькой подвижности белков (Я) от концентрации акриламида в ПАЯ' (£Т). 1-карбоангидраза (29 кДа), 2-овальбумии (45 кДа), 3-бычнй сывороточный альбумин, 4-ВАЗР2-1. Подвижности белков отнесены к подвижности овальбумина.

Значения Мг,определенные после

Белок электрофореза в гелях с указанной КЙТ

концентрацией акриламида. 7.

6 10 14 18 | 22

ВАБР1 ' 77 63 54 38 1 32 21

8А5Р2-1 68 58 50 37 33 24

ВАЗР2-2 68 60 50 37 33 24

ВАБРЗ 68 50 46 36 32 23

Примечание. Мгг - молекулярная масса, вычисленная по методу Фергюсона.

Рис.4. Таблица относительных молекулярных масс (Мг) белков ВАЬ'Р из мозга крысы, определенных методом электрофореза в присутствии ДДС-Ыа.

4. Анализ гидрофобных свойств белков BASP.

Анализ некоторых физико-химических свойств белков BASP (растворимость в широком интервале pH, осаждение довольно высокой концентрацией сульфата аммония, аномальная миграция при электрофорезе с ДДС-Na) свидетельствовал в пользу того, что в составе аминокислотных последовательностей этих белков большую часть составляют заряженные аминокислоты, вследствие чего белки BASP гвляютсл очень гидрофильными. А отсутствие сколь-либо значительного поглощения в УФ-области при длине волны 280 нм, очевидно, связано с тем, что они практически нз имеют ароматических аминокислот в своем составе. Однако, обладая всеми этими свойствами, белок BASP1 все асе отличается от других оелков BASP наличием признаков гидрофобности. Наиболее яркое проявление гидрофобных свойств у молекулы BASP1 наблюдалось при двумерном электрофорезе , в первом направлении которого использовали систему 0,9М уксусная кислота - 2,5М мочевина, а во втором - ту те систему, но в ПААГ присутствовал 0,5Х-ный тритон Х-100 (рис.5). Зоны белков ВАЗР2-1, BASP2-2 и BASP3 укладывались на диагональ, а белок ВАЗР1 демонстрировал значительное отставание, выпадая из диагонали.

Аналогичное явление наблюдали многие авторы анализировавшие гетерогенность "коровых" гисгонов, проявлявшуюся при электрофорезе в присутствии тритона Х-100 (Haniana, Iwal, 1976; Franklin, Zvteidler. 1977). Подробный анализ аминокислотных последовательностей позволил этим акторам установить корреляцию между степенью замедления миграции этих гистонов при электрофорезе с тритоном X-iOO и наличием в них неспиральных гидрофобных областей, содержащих коротки*" последовательности, способные в определенных условиях формировать а-спирали: Существование таких коротких и-сппрапей в катизных молекулах термодинамически невыгодно, однако, при появлении во в«еш"ем окружении агентов, которые в состоянии их стабилизировать, они могут существовать (Lewis, Bradbury, 1974). Тритон Х-100 является именно таким агентом. Молекулы тритона ?<-1С0 в растворе способны к взаимодействию с гидрофобными а-спиральными участками молекул белков, образуя-высо-помолекулйрние ксмплекш неионного детергента с белками. Очевидно, что при электрофорезе подобные ксмпдет.си должны мсш-

©

1-ое направление

©

к а> »4

s

(П.

ш

и,

<и

0

1

CJ

Л А

BASP

г-i

1-г

Hi

Рис.5. Двумерный электрофорез белков из мозга крисы в присутствии 0,5%-ного тритона Х-100 (первое направление -электрофорез б системе 0,9М уксусная к-та - 2.5М мочевина),

©

тывать значительной торможение.

Наличие гидрофобное™ у молекулы белка BASP1 проявилось и при обратнофазовой хроматографии при высоком давлении. Белок имел время задержки на колонке значительно болт-тее, чем другие белки BASP (особенно это проявилось у белка BASP1 из мозга быка и человека). Все остальные белки BASP элюировались с колонки компактной группой, имея очень близкие времена задержки. Некоторую разницу удалось зафиксировать между белками BASP2-1 и BASP 2-2. Белок BASP2-2 элюировался раньше белка ВАЗР2-1.

5. Определение посгтрансляционных модификаций белков BASP.

Посттрансляционные изменения, происходящие с молекулш.ш белков в клетках; являются главным механизмом регуляции участия белков в тех или иных процессах. В ткани мозга одним из главных путей управления активностью ключевых регуля-торных белков является фосфорилирование. Поэтому тестирование белков мо?га на присутствие в

Рис.б.Эндогенное фосфорилирование белков из мозга крысы с помошыэ [32Р] АТФ. Электрофорез ~ системе G.9M уксусная к-та -2,5tí мочевина.

(Радиоавтограф гс-ля).

С

basp

г-i

э

I . —

I Ш Hl

¡<м» -bas?

1

Рис.7. Субклеточная локализация белков BASP.

Белки экстрагированы 5%-ной HCIO4-1%-ньш тритоном Х-100 из фракции синаптосом (а), цитозоля (б) и гомогената мозга крысы (в). Электрофорез в системе О.РМ уксусная к-та - 2,5М мочевина.

А б £

составе их молекул остатков фосфатных групп является первым приближением к установлению функций белков. Белки BASF были протестированы двумя способами: дифференциальным окрашиванием фос-фопротеиаов в ПАЛГ с помощью красителя "Stains-all" и мечением с помощью [32РЗАТФ в эндогенной системе фосфорилированкя (результат последнего представлен на рис.6). Оба метода показали присутствие фосфатных групп в составе молекул всех белков BASP.

Белок BASP1 из мозга быка показал также присутствие в составе своей молекулы остатков АДФ-рибозы, выявленных с помощью моно-клональных антител к синтетическим полимерам АДФ-рибозы, полученных и предоставленных М. Имшенетской (Университет, г.Концепти-оп, Чили).

5. Субклеточная локализация белков BASP.

Выполнение белками определенных функций всегда связано с их специфкчеасой локализацией в различных структурах и ксмпартмен-тах клетки. При изучении белков мозга в первую очередь встает вопрос о связи, этих белков с синалтосомами - частицами, образованными синаптическими окончаниями нейронов в процессе механического разрушения клеток. Для получения синаптосом нами был ¡шорам метод быстрого субклеточного фракционирования в градиенте плотности перкола (Dunk ley et.al., 1988). В результате центрифугирования били получены фракции, обогащенные клеточным материалом различного характера, в том числе, фракция, обогащенная си-

наптосомами. Экстракция белкой кз этих фракций с помощью 5Х-ной НСЮ4 ч 17.--ного тритона Х-100 и анализ состава белковых экстрактов методом электрофореза в системе 0,9 M уксусная кислота - 2,5 M мочевина, позволили сделать вывод о том, что фракция синаптосом обогащена белками BASP1, BASP2-1 и BASP3 (рис 7а). Эти белки связаны с мембранным материалом. Однако сзявь с мембраной у этих белков имеет различный характер. Белок BASP1 интегрирован в липидную мембрану, поскольку для его солвбилизации необходимо присутствие неионного детергента тритона Х-100, а белки BASP2-1 и BASP3 ассоциированы с мембраной, скорей всего, с помощью электростатических взаимодействий, поскольку легко экстрагируются растворами кислот (HCIO4, ТХУ) и соли (NàCl). Белок BASF2-2 является белком цитоводя (рис. 76) и поэтому определенной локализации не тлеет.

7. Идентификация белков BASP.

Установив ряд физико-химических свойств белков BASP и их посгтрансляционных модификаций, а гагасе определив их внутриклеточную локализацию, можно было с большой степенью точности сопоставить эти белки с уже известными белками мозга. Наиболее вероятным кандидатом на идентификацию в качестве одного из белков BASP представлялся известный нейронный белок В-50 (SAP-43), имеющий подвижность при электрофорезе в присутствии ДДС-На, зависящую от концентрации акриламида в геле, близкое значение молекулярной массы (23 kDa), изоточку в кислой области рН (pi 4,6), несколько изоформ, фосфорилированность молекулы и локализацию в синалтической области (Coggins, Zwlers.1991). Идентификацию проводили тремя способами: 1) выделение белка В-50 (GAP-43) по описанной ранее методике (Oest^eicher et.al., 1983) и сравнение с белками группы BASP, выделенных по методу, предложенному нами; 2) пептидный анализ белков BASP; 3) иммунохимическое сопоставление белков с помощью моноклональных антител к белку В-50 (GAP-43), любезно предоставленных К. Меири (Университет штата Нью-Йорк, США).

Выделенный по методу Оестрейхер и соавторов (Oestrelcher et.al, 1983) белок B-50 (GAF-43) имел одинаковую подвижность с белком BASP2-1 при электрофорезе как системе 0.9М уксусная кислота - 2,5М мочевина, тек и в системе с ДЦС-Na. Пептидные карты

Рис.8. Идентификация белков ВASP из мозга крысы: иммунс-химическое соответствие мо-ноклональккм антителам к белку В-50 (6АР-43). а-электроф реграмма белков; б-имчунореплика.

белков ВASP, полученные с помощью протеазы V8 из Staphylococcus aureus, и сравнение их с имеющимися в литературе данными по бел-icy В-50 (GAP-43) .показали полное соответствие пептидов у белков BASP2-1, BASP2-2 и B-5G (GAP-43). Иммунохимичес^ий анализ подтвердил тождественность этих трех белков (рис. 8).

Анализируя литературные данные по известным к настоящему моменту Селкш мозга, мы не обнаружили белков, соответствующих белкам BASP1 и BASP3. Поэтому эти белки рассматриваются нами как впервые описанные.

8. Присутствие белков BASP в различных тканях млекопитающих.

Пг схеме выделения белков BASP из головного мозга млекопитающих были получены белки из ряда других тканей крысы (селезенка, печень, почка, семенники). Анализ белковых экстрактов методом электрофореза в системе G.9M уксусная кислота - 2,5М мочевина' выявил белек, имеющий подвижность в ПААГ, аналогичную белку BASP1, в ткани семенников крысы.По всем другим проверенней параметрам: изоэлектрическая точка, состав игофоом, молекулярная масса, отставание при проведении электрофореза в присутствии тритона Х-100 в ПАА<\ время задержки на колонке при обратнофазо-вой хроматографии, пептидная каста, полученна с помощью протеазы V8 из Staphylococcus aureus - этот белок полностью соответствовал белку BASP1 из мозга крысы. Аналогов другим белкал: BASP в тканях селевекки, почки, печени, сердца и семенников крысы не найдено.

BASP

1 2-Х ¿-2 3 i i 2-Я 3

&

- 17 -

ВЫВОДЫ

1. Выделена и охарактеризована новая группа кислотораство-римых белков головного мозга млекопитающих BASP (Brain Acid Soluble Froteins). Эта группа состоит из четырех белков - BASP1, BASP2-1, BASP2-2, BASP3, для которых характерны следующие общие признаки:

растворимость в 5% НСЮ4;

близкие иг " течки в кислой области pif (pi 4,3 - 4,6);

наличие изоформ;

высокая гидрофильность;

близкие молекулярные массы (21 24 кДа);

аномальная мигоация при электрофорезе в присутствии ДДС-Na;

фосфорилированность мслекул.

2. Белок BASP1 в отличие от других белков группы BASP обнаруживает признаки гидрофобности.

3. Белки BASP1, BASP2-1 и BASP3 присутствуют в корпускулярной фракции гомогената ткани головного мозга млекопитающих и локализованы в оинаптической области нейронов. Белок BASP2-2 является белком цитозоля.

4. Белки BAS'P2-1, BASP2-2 и BASP3 не обнаружены в тканях печени, селезенки, почек, сердца и секэнникоЕ крысы, поэтому рассматриваются нами как нейроспецифические белки. Белок BaSPI, кроме ткани головного мозга, присутствует в ткани семенников крысы.

5. Белок BASP2-1 отождествлен с известным белком пресинап-тической мембраны нейронов В-50 (6АР-43).Белок ВА5Р2-2 является ранее не исследованной цнтозольной формой белка Е -50 (йАР-43).Белки BASP1 и BASP3 являются новыми, впервые описанными белками головного мозга млекопитающих.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Skladtchikova Q.Yu., Novitskaya 7.А., Ktosevitsky M.i. Study of a group of proteins specific for brain of manwials.-Abstr. VI USSR-italy Meeting, 1Ö83, p.12a.

2. Мосевицкий И.И..Новицкая В.А..Плеханов А.¡0. .Складчикова Г.Ю. Группа кислоторастворишх белков мозга, включающая две формы нейронного белка GAP-43. - Доклады Академии наук, 1992, т.324, Ni, с.711-713.

3. Mosevltsky U.l., Novitskaya V.A.. Skladtchikova G.Yu.. Plekhanov A.Yu. Novel group of brain proteins. - Abstr. XIV Meeting of the International Society for Neurochemistry -

J. Neurochem., 1993, v.61 N1. Suppl. S34D.

4. Новицкая В.А..Складчикова Г.Ю..Плеханов А.Ю..Мосевицгсий М.И. Обнаружение белка головного мозга BASP1 в репродуктивной ткани крысы. - Доклады Академии наук, 1994, т. 335, N 1, с. 101-102.

5. Mosevitsk.y M.I., Novitskaya V.А., Plekhanov A.Yu., Skladtchikova G.Yu. Neuronal protein GAP 43 Is a member of a novel group of brain acid-soluble proteins (BASP) - J. Neurosci., 1994, V. 19, H 2 , p. 223-228.

PTJI mm, зак.212, тир.100, уч.-изд.л.0,8;15/1У-1994г.

Бесплатно