Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейроспецифические белки мозга человека в норме и при психической патологии: характер распределения, содержание, активность

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нейроспецифические белки мозга человека в норме и при психической патологии: характер распределения, содержание, активность"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР *у

ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ /^Х.

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПЛТРИСА ЛУМУМБЫ

На правах рукописи БУРБАЕВА Гульнур Шингожиевна

УДК 616.895.8—07 : 616.831—008.931 : 577.175.8

НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ БЕЛКИ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ПСИХИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ: ХАРАКТЕР РАСПРЕДЕЛЕНИЯ, СОДЕРЖАНИЕ, АКТИВНОСТЬ

(03.00.04 — биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

р/. Ми/с Г-19

А1 о с к в а —

1 989

Работа выполнена во Всесоюзном научном центр! психического здоровья АМН СССР.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. К. Наградова,

доктор биологических наук, профессор М. Ш. Промыслов,

доктор биологических наук, профессор Р. И. Кругляков.

Ведущая организация — Институт биологической и медицинской химии АМН СССР.

Защита диссертации состоится « » 1989 г,

в « » часов на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Университете дружбы народов им. П. Лумумбы (117198, Москва ,ул. Миклухо-Маклая, 8).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Университета дружбы народов им. П. Лумумбы (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6).

Автореферат разослан « » 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

В. Э. ТОРБЕК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Исследование молекулярных основ ин-тегративной деятельности мозга является одним из ведущих и пер--спективных направлений современной нейробиологии. Значительное внимание при этом уделяется белкам, поскольку они, являясь объектом многообразных форм регуляции, в свою очередь, выполняют различные регуляторные функции и играют таким образом важную • роль в интеграции основных морфофизиолошческих процессов в мозге.

Особый интерес вызывают белки, определяющие характерные особенности функционирования мозга, то есть нейроспецифические белки (НСБ). Эти белки вовлечены в процессы, протекающие тольно в нервной ткани: синтез и обмен нейромедиатс.ров, синаптическая передача нервного импульса, молекулярные механизмы процессов обучения и запоминания. Кроме того НСБ участвуют в процессах, не являющихся специфичными для мозга. Они выполняют цитоскелетну» роль, транспортную функцию, яэляются ферментами основных метаболических путей, модуляторами рецепторного связывания и т.д. По-видимому, НСБ определяют особенности протекания соответствующих биохимических процессов в мозге: интенсивность, направление, локализацию.

Большое внимание уделяется поиску новых НСБ, поскольку их выявление открывает возможности для обнаружения метаболических путей, характерных только для мозга; выявление неизвестных маркеров различных типов нейронов, аксонов, дендритов может дать принципиально новые возможности для изучения функциональных систем мозга; выявление НСБ, специфически или преимущественно локализованных в той или иной структуре мозга способствует обнаружение особенностей биохимического состава »тих структур.

Исследование HÇK ипжвт иметь тякжв п*«»»« 2**»ч?ние дяя обнаружения и раскрытия патологических процессов, развивающихся в мозге при различных нервных и психических заболеваниях. В настоящее время уже получен ряд данных, подтверждающих это предположение. Так, при болезни Альцгеймера выявлены модифицированные нейрофиламентные и микротуСулоассоциируемые НСБ (crundïe-Iqbnl L. «t al, 1986; Hltto A.et al Д968), установлено нарушение процесса полимеризации тубулина (Iqbal К. et al, 1968),

показано значительное понижение уровня экспрессии одного из ней-рофилаыентных белков, а именно белка с молекулярный весом 67 кДа (Me Laclan D.et al, 1988).

Важная информация о структурно-функциональных нарушениях в мозге при этих заболеваниях может быть получена посредством определения НСБ в крови.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа проведена с целью выявления характера распределения, содержания и активности НСБ при шизофрении, сенильной деменции альцгейыеровского типа и болезни Альцгеймера.

Основанием для проведения этого исследования являлись полученные нами данные о выявлении у больных шизофренией антителС в высоком титре) к антигенам фракции цитоплазматических белков мозга (фракция 10), содержащей несколько НСБ (Игнатов, Бурбаева, 1977; Вартанян, Бурбаева, 1979). Эти данные позволяют предполагать, что НСБ фракции 10 могут являться маркерами патологических "процессов, развивающихся в мозге больных шизофренией. Для решения вопроса о наличии деструктивных изменений в мозге больных шизофренией необходимо было подтвердить выход индивидуальных НСБ фракции 10 в кровь и исследовать содержание (активность) НСБ, обнаруженных в крови, в различных структурах мозга при шизофрении. Для оценки характера выявляемых изменений и их специфичности проводилось сравнительное исследование мозга больных шизофренией, сенильной деменцией и болезнью Альцгеймера. Выбор этих заболеваний для исследования был обусловлен лучшей изученностью морфологических и биохимических нарушений в мозге при данных болезнях.

Исследование выполнялось в несколько этапов, каждый из которых характеризуется своими задачами.

Основные этапы исследования. I. Выбор НСБ для исследования.

На этом этапе решались следующие задачи:

а) Идентификация НСБ фракции 10 на основе их выделения и изучения свойств.

»

•б) Оценка выхода этих НСБ в кровь при психических заболеваниях.

в) Выбор НСБ на основе полученных денных.

2. Изучение регионального распределения НСБ в мозг* человека.

• г

Проведение этого исследования ставило следующие задачи:

а) Разработка количественных методов определения содержания НСБ в экстрактах мозга.

б) Составление карты регионального распределения этих белков в мозге человека.

, Характеристика патологического процесса в мозге при шизофрении, сенильной деменции и болезни Альцгеймера.

Задачи этого этапа исследования включали:

а) Составление карты регионального распределения НСБ при всех изучаемых заболеваниях.

б) Выявление звеньев патологического процесса и его особенностей при изучаемых заболеваниях на основе сопоставления карт . распределения НСБ при психической патологии и в норме.

Научная новизна. В мозге человека выявлены два новых нейро- , шьных НСБ: белок 10-40-4 и видоспецифическая форма белка 5у-1, «ее обнаруженного только в мозге крысы ( Сеппаг1п1 с.ег а!Д903). и белки выделены и охарактеризованы по физико-химическим свойс-ам, уровню иммунологического подобия с аналогичными белками мо-а различных животных, изучено их распределение по структурам зга и показано высокое содержание в продолговатом мозге. Для Б 10-40-4 мозга человека и крысы установлен аминокислотный со-ав и выявлены различия, возможно обуславливающие его видовую ецифичность.

Впервые составлены карты регионального распределения в мозге ловека нейроспецифической енолазы (НСЕ), мозговой тоеатинфосфо-назы (КФК ВВ) и глиального фибриллярного кислого белка (ГфКБ).

Разработан и апробирован новый подход к характеристике пато-гичзского процесса в мозге при психических заболеваниях, заклю-юсциЯся п изучении особенностей распределения, оценке содержания активности НСБ в мозге при шизофрении, сенильной дямвнгсии и бо-зни Альцгеймера.

При реализации этого подхода выявлено неизвестное ранее зве-патологического процесса: нарушение функционирования креатин- -эатин>}осфатной системы обмена энергии, обусловленное значителъ-* понижением (в десятки раз) активности и содержания К$К ВВ в зга больных психозами.

При анализе суммарных изменений содержания НСБ обнаружены

особенности патологического процесса, характерные для шизофрении, сенильной деменции и болезни Альцгеймера. Для шизофрении характерно концентрирование всех изменений в структурах лимбической и "сенсорной функциональных систем мозга. Патологический процесс при сенильной деменции и болезни Альцгеймера имеет более диффузное . распределение и отличается большей интенсивностью.

Наряду с изменениями в мозге, впервые обнаружена сенсибилизация организма больных к НСБ 10-40-4 и ПСЕ, в крови этих больных выявлена КФК ВЗ.

Практическая значимость. Практическое значение результатов исследования определяется прежде всего полученньми в настоящей работе данными о характере распределения, содержании и активности НСБ при шизофрении, сенильной деменции и болезни Альцгеймера, Получение таких данных представляется важным для понимания патогенеза этих заболеваний..

Полученные данные о пониженной ферментативной активности КЙС -ВВ ориентируют внимание исследователей на изучение механизмов снижения активности этого фермента и поиск фармакологических препаратов, предотвращающих это снижение или способных восстановить исходный уровень ферментативной активности.

Выявление сенсибилизации организма больных шизофренией к НСЦ а также обнаружение КФК ВВ в крови этих больных создаст основы для более углубленного изучения аутоиммунного компонента при психических заболеваниях и разработки для прогнозирования тестов течения заболевания.

Обнаружение в мозге человека новых НСБ, установление цх свойств, распределения в нервной системе, а также распределения белков НСЕ, КФК ВВ и ГОШ имеет важное теоретическое значение, расширяя наши представления о белковом составе функционально различающихся отделов мозга человека, о некоторых свойствах и функциональной значимости НСБ.

Фактический материал работы включен в лекционный курс для студентов (Московский государственный университет, Днепропетровс-'кий. государственный университет).

На защиту выносятся основные положения диссертационной работы: наличие в мозге человека новых НСБ - белка 10-40-4 я видоспе-Ци фи ческой формй белка Sy-I; способы очистки, получения ыоио-

¡пецифических антисывороток, характерные физико-химические и иммунологические свойства распределения в нервной системе этих бел-еов; закономерности распределения НСБ-НСЕ, КОК ВВ и ГФКБ - в моз-чз человека в норме и при психической патологии; обнаружение НСБ [ аутоантител к ним в крови больных психическими заболеваниями.

Апробация работы^ Материалы диссертации доложены: на 1-ом Ь>езде психиатров социалистических стран (Москва, 1985), на 9 и' :0 Всесоюзных конференциях по биохимии нервной системы (Ереван, !985; Горький, 1987), б и 7 съездах Европейских нейрохимических )бществ (Прага, 1986; Гетеборг, 1988), Всесоюзном симпозиуме "Хи-; мя, фармакология и клиника нейролептиков" (Таллинн, 1986), 8 1 1сесоюзном съезде невропатологов, психиатров и наркологов (Москва :988), на межотделенческой научной конференции ВНЦ психического доровья АМН СССР (апрель 1989) и на научной конференции кафедры ; мохимии медицинского факультета Университета дружбы народов им. ; ■ [.Лумумбы (июнь, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, бзора литературы, 6 глав, включающих описание собственных иссле-,ований и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитированной итературы (580 названий). Работа изложена на страницах, ил- ! юстративный материал представлен в виде 14 рисунков и 60 таблиц.

СОДЕРЯАШЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования«. Ответом исследования слу- ■ или аутопсийный мозг и другие ткани человека и животных. Вьделв-ие НСБ проводили из человеческого мозга, полученного через 3,5-часов после смерти, последовавшей от несчастного случая или кн-аркта миокарда. Региональное распределение НСБ изучали на ауто- j сийноы мозге лиц без нервно-психической симптоматики (21 чел.) и иц, страдавщих псих<:чвс;сиай: з^бо^свапКлл«; шизофренией о пспргри-внотекущим и приступообразно-прогредиентньа течением (18 чел.), енильной деменцией (12 чел.), болезнью Альцгейыера (5 чел.). ' ричинами смерти во всех грушах были, в основном, острая сердач-ая недостаточность и инфаркт миокарда, кроме того тромбоэмболия оточной артерии и кахексия. Исследуеныз группы были составлены учетом возраста и времени, прошедшего от момента смерти. Из _g^g3ra с использованием цитоархитвктоничэских вар? и атласа. .

(Ваколюк, 1979) были выделены следующее структуры, входящие в основные функциональные системы мозга: лобная кора (поле 10), слуховая кора (поле 21), соматосенсорная кора (поле 1-3), зрительная кора (поле 17), лимбическая кора (поле 23/24), гиппокамп, гипоталамус, таламус, а также хвостатое ядро, продолговатый мозг, кора мозжечка.

Для выделения НСБ применяли солевое фракционирование, ионообменную и аффинную хроматографию, препаративный электрофорез в ПААГ. Гомогенность ввделенных белков оценивали диск-электрофорезом (Laemmli U, 1970). Ферментативную активность енолазы и креати-нфосфокиназы определяли соответственно по методу Rider С, Taylor < (1974) и Kia E.et ы(1978). Специфичность полученных антисывороток оценивали методом 2-ой иммунодиффузии (Гусев, 1968), ракетным им-муноэлектрофорезом (Laureil С,. 1966), имиуноэлектробиоттингом (Towbin Н. et al, 1979), флуоресцентны! окрашиванием криостатных срезов (Востриков, 1988). Содержание иммунореактивной формы НСБ 'определяли иммуноферментным методом (Toller А.et а} 1976). Для идентификаций ввделенных НСБ, помимо полученных в лаборатории, были использованы антисыворотки и моноклональные антитела, предоставленные: антисыворотка к белку ГФКБ - проф. В.А.Борезинш (Дне-~ пропетровский государственный университет), антисыворотка к белку S-I00 - д-ром А.Б.Полетаевым (Институт нормальной физиологии АМН СССР), антисыворотка к белку Sy-I - проф. В.Витиелло (Университет г.Бари, Италия), моноклональные антитела к белку KSK ВВ -д-ром С.Халдре (Тартусский государственный университет) и проф. Г.Моррисом (Уэльский институт, Англия).

Статистическую оценку результатов проводили методами параметрической и непараметрической статистики (Урбах, 1975).

Основные результаты исследования.

I. Выявление НСБ фракции 10, их ввделение, изучение физико-химических характеристик, иммунологических свойств и распределения в мозге»

Прежде всего необходимо было идентифицировать НСБ фракции 10 Учитывая, что фракция 10 по условиям выделения (Игнатов и соавт., 1977) может содержать только кислые белки, она проверялась на наличие в ней следующих кислых НСБ: S-I00, ОДБ, НСЕ и KSK ВВ.

Во фракции 10 была выявлена енолаэная м креаткнфосфокин&э-

ная ферментативная активность, что свидетельствует о присутствии в ней НСЕ и KSK ВВ. Наличие НСБ S-I00 и ГЖБ определяли иммунохи-мически с использованием тест-систем на эти белки. Было установлено, что фракция 10 содержит только один из этих белков, а именно ГФКБ. Всего, таким образом, во фракции 10 было идентифицировано три НСБ: НСЕ, КФК ВВ и ГФКБ..

Следующий этап работы состоял в ввделении этих белков. В основу разработанной нами схемы вцделения было полокено общее свойство этих белков - специфичность для нервной системы. Это свойство позволило на первой же стадии вцделения методом аффинной хроматографии (с использованием антисывороток к белкам сыворотки 1фо-ви, печени, почек, мышцы) разделить экстракт мозга на фракции.не-йро- и ненейроспецифических белков. Далее белки "нейроспецифичес-койн фракции разделяли по способности осаждаться сульфатом аммо-иия при различной степени насыщения и затем ионообменной хроълто-графией, окончательная очистка достигалась препаративным электрофорезом в ПААГ.

На рис. I приведена схема вцделения этих белков.

Экстракт мозга

истощение на иымуносорбенте

сефароза 4B-(j& к белкам ,

сыворотки крови, печени и других органов

Экстракт мозга (истощенный)

осаждение сульфатом аммония при 40$ насыцении

фр*

кислотное осаждение при pH 4,7

фр. 4СК

»лектрофорез в ПААГ а элюция иэ геля

ГФКБ

5 я на

рехроматогр ДЭАЭ-целлюлозе

KSK ВВ

фр. 40 (супернатант)

осаждение сульфатом аммония при 60% насьадении

I . ■

фр. 40-60

ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлоза

фр. 6

электрофорез в ПААГ и элюция из геля

НСЕ •

Рис. I. Схема вцделения НСЕ, Ш ВВ и ГИБ.

Применение этой схемы дает возможность провести одновременное веделение всех трех белков в отдельные фракции. Электрофорети чески гомогенные препараты белков использовали для получения анти сывороток, которые были охарактеризованы различными иымунохими-ческими и биохимическими методами. Во всех используемых при проверке антисывороток тестах была показана их специфическая направленность к соответствующим белкам: НСЕ, КФК ВВ и ГФКБ. Следующий этап работы состоял в разработке методов количественного определения этих белков. С этой целью из антисыво^оток вьделяли антитела, которые использовали при постановке имыуноферментного метода определения НСБ. Разработка оптимальных условий для проведения этого анализа- (выбор концентраций посадочных антител, разведений конъвгата антитела-перокси^аза хрена, разведений субстрап для пероксидазы) позволила определять НСЕ в диапазоне концентраций 5-250 нг/мл с чувствительностью 5 нг/мл, ГФКБ - 10-500 нг/мл с чувствительностью 5 нг/мл и КФК ВВ - в концентрациях от I до "100 нг/мл с чувствительностью 0,5 нг/мл. Иммунрферментньы методом была подтверждена нейроспецифичность изучаемых антигенов.

С целью обнаружения "новых" НСБ было проведено дальнейшее фракционирование фракции 10 последовательным высаливанием при 40, 60 и 80% насыщении сульфатом аммония. В полученных фракциях проводилось выявление и идентификация НСБ. Так как при поиске "новых" НСБ использовались иммунохимические методы, то было целесообразно продолжить исследования с фракцией, содержащей наименьшее количество НСБ. Такой фракцией являлась фракция 10-40, вццеленнаг осаждением при 4055 насыщении сульфатом аммония. К ней были получены антисыворотки. После истощения антисывороток (то есть удаления антител к ненейроспецифическим белкам) среди них были выявлены антисыворотки, содержащие, кроме антител к ГФКБ, антитела к неизвестны« НСБ. Причем в реакции 2-ой иымунодиффузии было показано наличие двух видов антисывороток, содержавших антитела к но-ндентичньм между собой НСБ. Эти антисыворотки давали преципитацн онные линии только с мозгом человека, но но реагировали о мозгом различных животных, что свидетельствует о видовой специфичности обеих обнаруженных антигенов.

Выделение "новых" НСБ из экстракта мозга человека проводи-

лось аффинной хроматографией. С этой целью из антисыворотки к неизвестны« НСБ удаляли антитела к ГФКБ, используя их способность реагировать не только с экстрактом мозга человека, но и крысы-(истощение проводили на иммуносорбенте сефароза 4В - белки мозга крысы). В результате было получено два вида моноспецифических антисывороток, направленных к двум разным антигенам. Иммуноглобулины, вьщеленныэ из этих антисывороток, использовали для приготовления иммуносорбентов. При проведении аффинной хроматографии экстракта мозга человека на каждом из иммуносорбентов были получены фракции, содержащие только один "новый" НСБ. Окончательна очистку этих белков проводили методом электрофореза в ПААГ. Один из этих белков был впоследствии идентифицирован как НСБ Бу-!,(на основании изучения свойств), обнаруженный Звппаг1п1 О.о* а1^1983) в ыозго крысы; второй НСБ не бьи идентифицирован и получил название 10-40-4 по номеру фракции, из которой он был ввделен. Схема ввделения НСБ 10-40-4 представлена на рис. 2.

а) получение ионоспецифической антисыворотки в НСБ фр.10-40:

Ас к НСБ фр. 10-40

истощение на иммуносорбентах:

1 - сефароза 4В-белки сыворотки крови, печени, почек

2 - сефароза 4В-белки мозга крысы моноспецифическая Ас к НСБ фр. 10-40

б) приготовление имыуносорбента:

ыоноспецифическая антисыворотка к НСБ фр. 10-40

осаждение сульфатом аммония I при 40% насыщении

1вО -фракция

|иммобилизация на сефарозе 4В

ймжуИисОрСйНТ

сефароза 4В-ХбО в НСБ фракции 10-40

в) авдвлвняо НСБ 10-40-4:

экстракт мозга

Iиммуноаффинная хроматография фракция Ю-40-4 __ ¡электрофорез в ПААГ, Iэлюция из голя

белок 10-40-4

Рис. 2. Схема выделения НСБ 10-40-4* „

3-870 *

По аналогичной схеме с использованием соответствующей антисыворотки был вьделен и НСБ 8у-1. Эту хе схему использовали для ввделения НСБ 10-40-4 и Бу-1 из мозга 1фысы. В этом случае удаление из антисывороток антител к Г5КБ проводили на иммуносорбен-те сефароэа 4В-белки мозга человека. Идентификация НСБ Бу-1 была подтверждена иммунохиыически с использованием антисыворотки к НСБ гу-1 мозга крысы, полученной от авторов, впервые обнаруживших « этот белок в мозге крысы (Сеппаг1п1 а1., 1963). Белки 10-404 и X были охарактеризованы.

Оба белка осаждаются сульфатом аммония при 40% насыщении, не содержат углеводного и липидного компонента, являются кислдаи белками (изоэлектрическая точка НСБ 10-40-4 - 4,7 и НОВ Бу-1 - 5,0), имеют близкие значения молекулярных масс, определенных электрофорезом в градиентном ПААГ "РАА 4/30" ( Мал-, масса белка 10-40-4 - 78 кДа и Бу-1 - 80 кДа). Однако, в отличие от НСБ 10-40-4, НСБ Бу-1 имеет субъединичное строение и состоит из двух одинаковых субъединиц с мол. массой 40 <' кДа, что было- показано электрофорезом в ПААГ с додецилсульфатом натрия.

Белок 10-40-4, выделенный из мозга человека и мозга 1фысы, также как НСБ Эу-1 из мозга человека и крысы практически не отличаются между собой по физико-химическим свойствам.

Белок 10-40-4 мозга человека и мозга вдысы имеют близкий аминокислотный состав. Однако, обнаружены и некоторые различия. Ток, белок 10-40-4 мозга крысы, в отличие от белка мозга человека, характеризуется более высоким содержанием глицина и низким -аспарагиновой кислоты. Кроме того, втот белок содержит неиденти-фицироваяную по биологическим стандартам аминокислоту, отсутствующую в составе белка 10-40-4 мозга человека. Эти различия, по-видимому, обуславливают иммунологическую специфичность изучаемых белков.

С-фв-^Р^З^Л!1* Установлено, что НСБ 10-40-4 м Яу-1 видоспецифичны: антисыворотки к этим белкам из мозга человека не реагируют в реакции 2-ой иммунодиффузии с экстрактами мозга крысы н морской свкнкн, в, напротив, антисыворотки к белку 10-40-4 в Зу-1 на мозга крысы - с вкстрактом мозга человека.

На основе вцделенных методой аффинной хроматографии антител

к НСБ 10-40-4 и з у-1 мозга человека были разработаны условия им-муноферментного определения этих белков в экстрактах с чувствительностью 2 нг/мл в диапазоне концентраций 2-100 нг/мл.

Применение иммуноферментного анализа позволило дать количественную оценку степени иммунологического сходства антигенных детерминант обоих НСБ мозга человека и различных млекопитающих, которую определяли по кривьы связывания этого белка мозга человека и животных при иммобилизации на платах антител к соответствующим белкам.

Кая видно из таблицы I, степень иммунологического сходства антигенных детерминант даже с ближайшим видом составляет для белка 10-40-4 мозга человека всего 6%, для белка ^г-1 - 205?.

Таблица I. Степень иммунологического сходства антигенных детерминант НСБ 10-40-4 и ^г-1 мозга человека и животных.

' ' ' ' ' ' " , '' ' ' ' ' " ' ' ■ " ■■■"■■■■■■ ■ . I I I.

Экстракт мозга }Степень иммунологического сходства (%)_

_{ 10-40-4 | Зг-1

человек 100,0 100,0

мартыпка 6,0 23,3

собака 3,0 6,3

корова 1,2 3,3

кролик 0,8

морская свинка 0,3 -

крыса 0,2

Распределение НСБ 10-40-4 и 8у-1 в мозге человека, а) Клеточная локализация. Белок по даннш Овппаг1п1 ей. (1983) локализован в нейронах. Антисыворотка к НСБ 10-40-4 при обработке криостатных срезов мозга такао выявляет нейроны на фоне диффузного свечения пойрспнлл, что ««илот бит» ссяэй."? о присутствием этого белка не только в теле клетки, но и в синапти-ческих окончаниях. Наиболее яркая реакция наблюдалась на срезах продолговатого мозга и талацуса.

Нейрон&льная принадлежность обоих белков была подтверждена иммунодиффузионнш анализом при использовании в качестве антигенного препарата фракции глиальных клеток, выделенной из мозга человека (Демувкин и соавт., 1964). Антнсыворотки к НСБ

10-40-4 и ^у—I, также как к нейрональному белку НСЕ, не реагировали с антигенами глиальных клеток, в то время как антисыворотки к глиальным белкам г-100 и ГФКБ давали положительные реакции.

б) Локализация в цитгооле и в мембранносвязанной фракциях. Имму-нодиффузионньы методом показано присутствие белка 10-40-4 как в цитоплазматической фракции, так и во фракции мембранносвязанных белков, белок Б у-1 присутствует только в цитоплазматической фракции.

в) Региональное распределение НСБ 10-40-4 и ¡^-1 изучали иммуно-ферыентнш методом. Данные по белку 3 у-1 представлены в таблице № 2. Как видно из этой таблицы, наиболее высокое содержание НСБ Б у-1 в продолговатом мозге, но и в этой структуре белок Э у-1 распределен неравномерно: его максимальный уровень выявлен в комплексе нижних олив.

Региональное распределение НСБ Бу-1 и 10-40-4 близки между собой: высокое содержание в продолговатом мозге и низкое - в областях коры. Однако, имеются и различия: высокое содержание НСБ 10-40-4 обнаружено в таламусе и четверохолмии, в то время как для НСБ I в этих областях отмечено относительно низкое содержание, хотя и вьше, чом в коре.

Отличительной чертой обоих НСБ при их сопоставлении с изве-стнши нейрональндаи НСБ (НСЕ, триплет нейрофиламентных белков, Ва-50, Р?Р-9 и др.) является их вцраженная видовая специфичность и особенности распределения в нервной системе: высокое содержание в продолговатой мозге и низкое - в коре.

Таким образом, при изучении состава фракции 10 мозга человека бшо обнаружено 5 НСБ, из которых 3 (НСЕ, КФК ВЗ и Ш£Б) известные белки, о 2 белка (10-40-4 и 5у-1) не были описаны ранее для мозга человека.

На следующей отапе работы мы изучали вопрос о возможном выходе в кровь этих белков при психических заболеваниях.

2. Выявление НСБ фракции 10 в крови при шизофрении.

О наличии при шизофрении циркулирующих в крови НСБ судили как ро сенсибилизации организма больных к этим белкам, так и по непосредственному выявлению их в русле крови.

Сенсибилизацию организма больных выявляли методом кскно-аллергичаских проб. При этом регистрировались два типа реак-

Таблица JP 2. Региональное распределение НСБ Sy-I б мозге

человека.

..................j ■' 1 f ■ ■■ ............. I I.

труктура аутопсийного j число | содержание белка sy-I (мкг/мг озга !образцов ! водорастворимого белка_

I ! 1 » I . ! ш

обная кора (поле 10) 3 2,6 0,5

оматосенсорная кора поле 1,2,3) 8 3,8 1,4

пуховая кора (поле 21) 3 2,5 1.7

эительная кора (поле 17) 3 3,0 0,7

шбическая кора (поле 23) 8 2,7 0,9

шпокамп 8 5,5 0,8

юстатое ядро 3 2,4 0,5

шамус 3 5,8 1,3

шоталамус 3 7,0 2,7

тверохолмие 3 9,4 2,2

>ра мозжечка- 9 8,5 1,8

одолговатый мозг 5 29,0 4,4

рамида яняя олива 5 9 35,1 50,1 2,0 2,1

инной мозг 5 22,8 2,8

- средняя арифметическая; п - стандартное отклонение.

II: реакция Артоса, развивающаяся через 4 часа, укалывающая на янчив в крови антител и иммунных комплексов, и реакция заыед-кной гиперчувствительности (через 24 часа), свидетельствующая присутствии в организме сенсибилизированных лимфоцитов. Иссле-»анив проводилось на двух группах больны* шизофренией- У гутой уппы больных изучали эти реакции к НСБ НСЕ, к ненейроспецифи-гкоыу белку - тубулину и к немоэговому чужеродному белку -гьому сывороточному альбумину (БСА). У другой группы больных -истрировались реакции и НСБ 10-40-4 а НСБS-100 (белок3-100 I введен в исследование в качества внутреннего положительного (троля, поскольку для него ранее была выявлена роль аутоанти-ia Cfonoorio В et яД 1985).

-Реакция на БСА (чужеродный белок) у больных и здоровых бы-

ла отрицательной. Положительные кожные реакции развивались у всех исследованных лиц только к мозговым белкам, при этом больные отличались от здоровых большей выраженностью этих реакций (р4),01).

При сравнении реакций к НСЕ и тубулину у больных (также и у здоровых) была выявлена более интенсивная реакция к НСЕ, чем к тубулину (р<0,01), что, по-видимому, связано с большей иммуноген-ностью НСЕ по сравнению с ненейроспецифическим белком тубулином и подтверждает ведущую роль НСБ как аутоантигенов.

В группе больных реакция к глиальному белку s -100 была более выражена, чем к нейрональному белку 10-40-4 (р-=0,01).

Исследование было дополнено непосредственным измерением НСБ, а именно КФК ВЗ в крови больных. Присутствие КФК ВВ в крови опрвт деляли по выявлению специфической ферментативной активности, которую регистрировали биолгаминисцетным методом с помощью тест-наборов С Wallach", Финляндия).'Активность КФК ВВ в .крови больных шипофренкей увеличена в несколько раз.

Таким образом, как при изучении сенсибилизации организма, так и при непосредственном определении КФК ВВ показано появление повышенных концентраций НСБ в крови больных шизофренией. Учитывая различную клеточную локализацию этих белков, можно предположить повреждение как нервных, так и глиальных клеток. Для однозначного решения вопроса о наличии деструктивных изменений в ткани мозга больных шизофренией необходимо было, на наш взгляд, исследовать содержание НСБ, обнаруженных в крови, в различных структурах мозга при этом заболевании.

3. Региональное распределение НСЕ, ГФКБ и КФК ВВ в мозге человека.

Для сравнительного-исследования мозга больных психическими заболеваниями и мозга лиц контрольной группы использовали белки НСЕ, ИЖБ и KSK ВЗ. Uu остановили свой выбор именно на этих НСБ фракции 10 как белках, функция которых, в отличие от НСБ 10-40-4 и су-I установлена: НСЕ является ферментом гликолиза (КФ 4.2.1. II), ГЙКБ - цитоскелетнш белком, концентрация которого в клетке характеризует реактивность астроглии, и КФК ВВ - ферментом (КФ 2.7.S.2), катализирующим обратимое фосфорилирование креатина -основную реакцию, регулирующую уровень AM в клетке. Это позволяет, измеряя содержание или функциональную активность втих ■ белков, судить об интенсивности биохимических процессов, идущих 1»

с их участием. Кроме того, поскольку НСЕ и Г5КБ являются маркерами соответственно нервных и глиальных клеток, то по изменению содержания этих белков можно определить локализацию патологического процесса [• том или ином типе клеток.

Вместе с тем, надо отметить, что изучение регионального распределения белков НСЕ, Г5КБ и КФК ВВ в мозге человека имеет'самостоятельное значение, так как информация по этому вопросу в литературе отсутствует.

3.1. Региональное распределение НСЕ. Распределение НСЕ изу- . чали, определяя ее содержание в различных структурах мозга. (Активность НСЕ не регистрировали, поскольку в мозге енолаза представлена двумя изофермантами: нейро-и ненейроспецифическим).

Как видно из таблицы № 3, НСЕ распределена в мозге относительно равномерно. Высокий уровень этого изофермента наблюдается во всех областях коры головного мозга, а также в ряде подкорковых структур: гипоталамусе, таламусе и хвостатом ядре; наиболее низкое его содержание - в продолговатом мозге.

Содержание НСЕ в различных структурах мозга человека исследовалось впервые. Аналогичное исследование было проведено на мозге крысы Marangoa p.et aiI979). Общая картина распределения [ICE в мозге человека и крысы оказалась сходной (г^0,93 р<0,01).

3.2. Региональное распределение РЗКБ. Этот белок имеет две шмунологически идентичные формы: водорастворимую и филаментную. 3 напей работе изучалось распределение в нервной системе только водорастворимого Р5КБ. Полученные результаты приведены в таблице 9 4. Как видно из этой таблицы, ГФКЕ распределен по различным регионам неравномерно: его содержание максимальное в продолговатом мозге (комплекс нижних олив) и минимальное - в областях коры головного мозга. Но и в коре головного мозга он также распределен псрагкс^?р::о: а стгрсЯ коре (г".;ппспгмп) его содсрго::и5 z ::о-гхолько раз (от двух до четьрех) вше по отношению к различным эбластяы новой коры, в новой коре в лобной области - выпе, чем в зрительной. В подкорковых структурах его содержание выше, чем в ювой коре. Повышение содержания Р5КБ в гипоталамусе и некоторых цругих структурах по сравнению с корой головного мозга может 5ыгь обусловлено не столько увеличением количества глиальных щеток, сколько изменением соотношения фиброзных и протоплазма-

тических астроцитоа. Это предположение подтверждается . «

данными морфологических исследований (Востриков и соавт., 1988).

Региональное распределение ГФКБ в мозге человека было определено впервые. При сравнении наших результатов и данных Patel А. et al. (1985), изучавших распределение ГФКБ в мозге крысы, можно отметить сходную картину распределения (г » 0.83 р<0,05).

3.3. Региональное распределение КФК ВВ. Распределение КФК ЙВ по структурам мозга человека изучали, измеряя ее удельную ферментативную активность. В таблице № 5 представлены результаты определения активности KSK ВВ в ряде структур аутопсийного мозга человека. Полученные данные указывают на неодинаковую активность К$К ВВ в этих структурах. Если сравнивать между собой поля новой коры, то максимальная активность обнаружена в зрительной коре и минимальная - в слуховой коре. В старой коре - гиппокампе выявлена очень низкая активность этого фермента. При изучении подкорковых структур наиболее высокая активность обнаружена в таламусе, однако она была ниже, чем в зрительной коре. Различия между максимальным уровнем активности (в зрительной коре) и минимальным (в гиппокампе) являются 40-кратными.

4. Региональное распределение НСЕ, Г$КБ и КФК ВВ в мозге при психической патологии (шизофрения, сенильная деменция, болезнь Альцгеймера).

4.1. Региональное распределение НСЕ в мозге при психической патологии. Данные по определению содержания НСЕ в различных областях мозга больных шизофренией приведены в таблице * 3. Региональное распределение белка НСЕ в мозге больных шизофренией, в целом, подчиняются тем же закономерностям, что и в контрольной труппе: высокое содержание НСЕ выявлено в коре головного мозга и минимальное - в продолговатом мозге.

При сравнении содержания НСЕ в отдельных структурах мозга между группой больных и контрольной группой были выявлены достоверные отличия в нескольких образованиях мозга. Для мозга больных шизофренией характерно повышение уровня НСЕ э соматосенсор-ной коре и его понижение в Лимбической коре, гиппокампе и таламусе. Максимальное снижение уровня НСЕ (более, чем в 2 раза) обнаружено в таламусе мозга больных.

Чтобы выяснить, является ли снижение уровня НСЕ при шизофрении следствием деструктивных процессов, эти данные

были сопоставлены с результатами, полученными при изучении ио?"а . больных сенильной деменцией и болезнью Альцгеймера, для которых развитие этих процессов в мозге является установленным фактом.

Однако, при сенильной деменции не бьшо выявлено изменения содержания НСЕ ни в одной из исследованных структур. При болезни Альцгеймера пониженный уровень этого белка был обнаружен в гиппо-кампе и у одной больной во всех областях коры. Таким образом, сопоставление полученных данных для разных групп больных позволяет изменения, наблюдаемые при шизофрении, относить не только к чис- . лу деструктивных, хотя, по-видимому, эти процессы в мозге также развиваются, о чем свидетельствует выявление повышенных концент- , раций НСБ в крови.

Надо отметить, что независимо от факторов, вызывающих изменение уровня НСЕ в ряде структур мозга больных шизофренией, их следствием, по-видимому, является нарушение гликолиза, причем поскольку НСЕ локализована в нейронах, эти нарушения следует ожидать именно в нервных клетках.

. 4.2. Региональное распределение Г5КБ в мозге при психичес-жой патологии.

Данные по определению содержания ГФКБ в разлитых структурах мозга больных шизофренией и больных сенильной деменцией приведены в таблице * 4. В связи с подверженностью ПВКБ протеолити-ческой деградации (Dahl D. et а} 1976; Березин, 1968), группы были составлены со строгим учетом времени, прошедшего после смерти. Мозг больных болезнью Альцгеймера не изучался из-за различий в величине постмортального интервала.

Как видно из таблицы № 4, региональное распределение ГФКБ в мозге больных подчиняется тем же закономерностям, что и в Meiere лиц контрольной группы: низкое содержание в коре головного мояги и высокое - в продолговатом мозге= 0дн2.::с, пс с

контрольной группой для мозга больных шизофренией характерно снижение содержания ГФКБ в лимбической коре, гиппокампе, таламусе и гипоталамусе, причем максимальные изменения обнаружены в лимбической коре и таламусе. При сенильной деменции отмечено снижение содержания ГФКБ в лимбической коре, гиппокампе, таламусе и гипоталамусе, причем максимальные изменения обнаружены в лимбической воре и таламусе. При сенильной деменции отмечено снижение уровня

17 -

Таблица № 3. Содержание НСЕ в некоторых структурах мозга лиц контрольно" группы и больных шизофренией

структура мозга

Содержание НСЕ в мкг/мг водораствор. белка (медиана и ее доверительный интервал

р.<о»о1)_г_._;_

п {контрол.группа { п {группа больных

лобная кора (поле 10) 18 10,0 <11,2-42,4 10 6,3<П,Ы6,6

соматосенсорная

кора (поло 1-3) 17 5,2<7,6<9,б 10 6,3<12,8<15,6

слуховая кора (поло 21) 17 8,4<10,4<Н,9 10 7,2<13.4<14,8

зрительная кора (поле 17) 17 9,8<12,6<15,0 10 4,0<И,2*13,1

лимбическь,- кора (поле 23/24) 16 Ю,4<13,0<14,7 10 6,8<Ю,6<13,3 *

гиппокамл 15 10,7<13,0<15,4 10 6,3<11,2<12,8 *

иозолистое тело 15 6,6<7,6<8,5 10 6,3<8,0<11,9

хвостатое ядро II 9,4<П,2<13,4 9 6,5^11,0<18,3

скорлупа 10 3,5<4,8<Ю,0 9 3,6*4,8<8,2

бледный вар 9 5,6<0,5<12,5 8 4,6<7,5<И,6

таламус 16 6,0<П,0<13,8 10 2,8<4,4<10,5 к

гипоталамус 13 8,2<12,5«15,5 6 8,2<12,0<13,б

черная субстанция 10 4,6<5,0<5,6 6 4,6<5,(Х6,2

кора мозжечка II 6,0<б,7<7,6 6 б,0<6,4<7,8

продолговатый мозг II 2,8г3,5<4,2 6 2,6*3,4<4,0

нижняя олива 9 4,8«5,6*7,2 0 4,0<7,б<10,8

Примечание: п - число обследованных образцов, к - р<0,01 - в сравнении с контрольной группой

РЖБ также как при шизофрении - в таламусе, гиппокампо и громо того в слуховой коре, в хвостатом ядре и коре мозжечка; в лим-бической коре и гипоталамусе изменений не выявлено.

Исходя из данных литературы, можно полагать, что низкий уровень этого белка при обоих заболеваниях является следствием различных процессов. Так, снижение содержания ГФКЕ при сенильной деменции, выявленное в нашей работе, по-видимому, происходит вследствие перехода водорастворимого Г8КЕ в фидаыентную форму, 1в

Это заключение совпадает с результатами морфологических исследований, свидетельствующих о преобладании именно этой реакции глии в мозге больных сенильной деменцией (Tobo M.et al, ISG4; Востри-kod и соавт., 1988), Оно также подтверждается данньми биохимических исследований, в которых показано увеличение количества ГФКБ в мебранной фракции Сзлков мозга больных сенильной деменцией (Duffy P.at al, 1980) при неизменном уровне биосинтеза (UoLach-lan D. et a} i988;Doebler O.ot al , Í988) этого белка,

В то же время для шизофрении характерна низкая реактивность астроглии (Сухорукова, 1972; Орловская, 1933), и поскольку реактивность астроглии коррелирует с содержанием в ней ГФКБ (JJnlioob o.et а} 1987), то вероятнее всего в астроцитах при этом заболевании ГШ5 содержится в низких концентрациях.

4.3. Региональное распределение К$К ВВ при психических заболеваниях. В таблице № 5 представлена удольнал активность KSK ВВ в структурах мозга больных шизофренией, болезни Альцгеймера и сенильной деменцией. Для мозга больных психическими заболеваниями можно выделить ряд характерных особенностей. К -ним относится болев равномерное, чем в контрольной группе распределение активности KSK ВВ по структурам ыозга. Так, если в контоольной группа' различия между максимальным и минимально уровнем удельной фергло-нтативной активности являются 40-кратными, то при исследуемых заболеваниях - 2-5-кратнш.

Другой особенностью мозга больных психическими заболеваниями является перераспределение активности КФК ВВ по структурам мозга. Так, например, если в контрольной группе удельная ферментативная активность максимальная в зрительной коре, то у больных сенильной деменцией и болезнью Альцгеймера - в слуховой коре, а при шизо({рении она одинаковая во всех областях новой коры, а Tájese г тгл«1£'се :: гяпсталг^усг.

И, наконец, в ряде структур мозга больных обнаружено понижение активности КФК ВВ. Из 8 обследованных структур мозга это понижение при шизофрении отмечено в 4-х образованиях мозга, а при сенильной деменции и болезни Альцгеймера - в 6-ти: в отличие от шизофрении, это снижение наблюдается также в лобной и сомато-сенсорной коре. При этом в лимбической, соматосенсорной, зритель- вой коре и таламусв активность КФК ВВ мозга больных

Таблица № 4. Содержание НЖБ в некоторых структурах мозга лиц к.лтрольной группы, больных шизофренией и сенильной деменцией

структура мозга} $

{обследованные | группы

! !

содержание Г5КБ в ыкг/мг водораст.белка (медиана и ее доверит.интервал

I 1 2 I 3 1 4

лобная кора 1,8<5,0<9,6

(поле 10) 13 контр, группа

II больн. шизофренией 1,2<4,2<9,0

6 сенильной деменцией 5,4<8,4<15,0

соыатосенсорная 13 контр, группа 0,7<3,К5,8

кора (поле 1-3) 12 больн.шизофрениеЙ 1,2<4,5<5,7

5 сенильной деменцией 2,0<3,6<4,5

слуховая ко^ 10 2,1<3,7<5,5

(поле 21) контр, групп

9 больн.шизофренией 2,2<3,0<5,7

6 сенильной деменцией 1,6<1,9<4,8 *

зрительная кора 9 I,4*2,1*2,6

(поле 17) контр, группа

12 больн.шизофренией 0,5<3,0<4,4

5 сенильной деменцией 1,Б<1,9<4,0

димбическая кора 1,8<3,8<5,4

(поле 23-24) 12 контр, группа

12 больн.шизофренией 0,5<0,7<2,3 к

6 сенильной деменцией 2,0<3,7<8,4

гиппокамп 9 контр, группа 4,0<9,0<12,0

10 больн,шизофренией 1,(Х6,4<8,0 н

б сенильной деменцией 2,7<4,0<6,5 й

мозолистое тело 12 контр, группа 6,5<8,3<9,3

II больн.шизофренией 3,5<5,8<15,0

6 сенильной деменцией 2,5<9,0<15,0

хвостатое ядро 12 контр, группа 1,8'4,3<8,4

10 больн.шизофренией 1,0<4,0<5,6

6 сенильной деменцией 2,б<1,6*7,7 й

;корлупа 10 контр, группа 4,2<5,0<9,0

8 больн.шизофренией 3,5*4,0*12,7

ЭЛ 5 сенильной деменцией 1,2<4,7<8,4

I

2

3

4

нижняя олива

кора мозжечка

таламус

гипоталамус

10 II

5 10

9

6 II

8 б 7 9 5

контр, группа больн.шизофренией сенильной деменцией контр, группа больн.шизофренией сенильной деменцией контр, группа больн.шизофренией сенильной деменцией контр, группа больн. шизофренией .сенильной деменцией

б,0<10,8<24,0 2,4<3,2<И,0 » 3,4<4,3<5,б* 25,0<3G,0<37,5 12,5<25,0<29,4 * 17,5*25,0*37,5 6,0*9,0 <15,8 I.e^.Kte.O 1,0<1,7<4,5 * 21,8<37,5<30,5 17,8<37,5<38,5 20,6<21,9<37,5

Примечание: п - число обследованных образцов, и - р<0,01 - отличие больных от контрольной группы.

сенильной деменцией и болезньв Альцгеймера ниже, чем при шизофрении (р<0,01 и р<0,05 соответственно).

Таким образом, на основании приведенных данных можно заклп-' чить, что процесс снижения активности К5К ЗВ является общим для ■., всех рассмотренных заболеваний. Максимальное снижение активности выявлено в зрительной коре и таламусе (при пизофронии соотвзтст-оенно в 10 н 5 раз, при сенильной деиенции и болезни Альцгоймэра - в 20 и 10 раз).

Интересно отметить, что в двух структурах, а именно! в ntnn> каппе и слуховой коре (поле 21) - при шизофрении, сенильной до-конции и болезни Альцгеймера креатинфосфокиназная активность остается на контрольном уровне. Отсутствие изменений активности КФК ВВ в слуховой коре при сенильной деменции показано тйкяв Court J.et al, 1987).

5. Ыеханизмы снижения активности KSK ВВ при психи «а свой патологии.

Снижение удельной активности К9К ВВ, выявленное в иоого больных шизофренией, сенильной деменцией и болезньв Альцгейиэра может быть вызвано инактивацией фермента или уиеньсекиеы его содержания. • 21

Таблица № 5. Удельная ферментативная активность КФК ВВ в некоторых структурах мозга лиц контрольной группы, больных шизофренией, сенильной деменцией и болезнью Альцгеймера.

структура мозга № обследованные {активность КФК ВВ в Ед/ группы }мг водораст.белка (ме-,диана и ее доверит, интервал р<0,01)

г 2 1 3 1 4

лобная кора (поле 10)

соматосенсорнал кора (поле 1-3)

слуховая кора (поле 21)

зрительная кора (поле 17)

лямбическая кора (поле 23-24)

гиппокамп

таламус

21 контр, группа

17 больн.шизофренией 12 сен. деменцией

5 болезнью Альцгеймера

21 контр, группа

18 больн.шизофренией 10 сен. деменцией

5 болезнью Альцгеймера

18 контр, группа

17 больн.шизофренией 12 сен. деменцией

5 болезнью Альцгеймера

21 контр, группа .

18 больн.шизофренией

12 сен. деменцией

5 болезнью Альцгеймера

21 контр, группа

Í8 больн.шизофренией

2 сен. деменцией

5 болезнью Альцгеймора

20 контр, группа

18 больн.шизофренией

10 сон. деменцией

4 боленью Альцгеймера

21 контр, группа

18 больн.шизофренией

10 сен. деменцией

4 боленью Альцгеймера

0,21<0,55<1,00 0,07<0,42<0,73 0,06*0,07*0,59 * 0,06*0,1<0,39 * 0,44*0,б5<1,05 0,31*0,46*0,80 0,07<0,09<0,14 * 0,07*0,08*0,10 к 0,20*0,30*0,52 0,09*0,21*0,41 0,47*0,51*0,56 0,11*0,18*0,28 1,28*2,80 <4,09 0,14<0,27<0,76 в

0,П<0,13<0,19 в "

8:&Ш:8 5

0,12<0,14*0,18 в 0,04<0,07<0,06 О,06<0,08*0,10 0,05<0,07<0,И 0,05*0,06*0,10 1,02<1,87<2,б8 0,13<0,34<0,78 я 0,06*0,10<0,78 * 0,09*0,12<0,16 ■

I

2

3

4

гипоталамус

17 17 10 2

контр, группа больн.шизофренией сен. деменцией болезнью Альцгеймера

0,32<0,41<0,54 ' 0,11г0,14<0,25 * 0,09<0,I7<0,23 н О,10;1,06

Примечание: п - число обследованных образцов; >

х - р 0,01 по сравнению с контрольной группой

Инактивация фермента может быть следствием его посттрансляционной модификаций. Одним из возможных механизмов модификации j К® ВВ является окисление фермента активированными формами кислорода. О наличии активированных форм кислорода в организме больных психическими заболеваниями свидетельствует накопление в крови виффовых оснований - конечных продуктов перекисного окисления (ПОЛ), которое инициируется активированным кислородом (Прилипко, 1987). В связи с этим, правомерно ожидать, что активация молекулярного кислорода может быть причиной нарушения ферментативной активности цитозольных ферментов, в том числе и КФК ВВ.

Для решения этого вопроса исследовали влияние системы? аскорбата, инициирующей активацию молекулярного кислорода, на креатинфосфокиназную активность и содержание малоновогр_даальда_т_: гида (МДА) - продукта ПОЛ в синаптосомах мозга крыс.

Показано, что, наряду с интенсификацией ШЛ, происходит снижение активности креатинфосфокиназы. Связь между снижением активности креатинфосфокиназы и накоплением ММ подтверждается высокими значениями коэффициента корреляции между апаш залита наше ( г = - 0,9 р<-0,05).

Поскольку снижение количества активных молекул ип*й* бит», обусловлено также понижением содержания КФК ВВ, проводилось определение уровня иммунореактивной KSK ВВ в различных структурах мозга при исследуемых психических заболеваниях.

Методом вммуноэлектроблоттинга с использованием антисыворотки к КФК ВВ на блотах экстрактов различных структур мозга больных шизофренией, сенильной деменцией, болезнью Альцгеймера выявлено значительное снижение интенсивности (почти до исчезнове-

ния) белковой зоны с мол. массой 40 *Дя, соответствующей KSK ВВ. Эти результаты были подтверждены при проявлении блотов монокло-нальнши антителами к КФК ВВ, предоставленными проф. Моррисом (Уэльский университет, Англия).

Надо отметить, что поскольку определение содержания КФК ВВ проводилось иммунохимическими методами, то понижение содержания иммунореактивной формы этого фермента может отражать не только понижение его уровня, но также может отражать изменение его им-ыунореактивности в результате посттрансляционных модификаций. По-видимому, КФК ВВ подтверждается посттрансляционным модификациям (возможно и окислительной модификации, рассмотренной вше), приводящим к изменению его иммунореактивности, что и выявляется одной из антисывороток к КФК ВВ. Однако, допустимо предположение о налички "арушений на уровне транскрипции и трансляции, приводящие к е^атезу измененной формы фермента, нераспознаваемой антисывороткой.

6.' Оценка специфичности изменения содержания НСЕ: КФК ВВ и ГФКЕ в мозге больных шизофренией, сенильной деманцией и болезнью Альцгеймера.

Регрессионный анализ не выявил корреляционной взаимосвязи изменения содержания (активности) исследуемых белков от возраста и пола лиц, аутопсийный мозг которых исследовался, а также от интервала времени после смерти.

При экспериментальном изучении действия психотропных препаратов не было обнаружено влияния нейролептиков (аминазина, гало-перидола) и антидепрессанта молипрамина на содержание НСЕ и активность КФК ВВ о мозге крыс. В то же время выявлено понижение содержания ГФКБ в лимбичеожой коре этих животных при отсутствии изменений в лобной, зрительной, височной, теменной коре, коре моажечка м в продолговатом мозге. Сопоставление данных, полученных для мозга больных шизофренией с даннъми для мозга больных сенильной деменцией ы болезнью Альцгеймера, не принимавших психотропные препараты, дает возможность исключить влияние этих лекарств хая основную причину нвменения содержания ГФКБ для большинства исследованных структур мозга. 24

Заключение. Результаты, полученные в нашей работе, свидете- : льствуют о перспективности использования аффинной хроматографии на ишуносорбентах с различными иммунобилизованньми лигандами для выявления и вьделения новых НСБ. В мозге человека обнаружено 2 новых нейрональных видоспецифических белка, отличающихся от известных НСБ распределением в нервной системе. Возможно, что эти белки локализованы в серотонин- или глицинэргических нейронах, которые находятся преимущественно в продолговатом и среднем мозге (Оленев, 1987; Шеперд, 1988). Однако, не исключена возможность, что белки 10-40-4 и sy-I являются не только "новыми" белками, но я маркерами еще не изученных нейронов и нервных сетей.

Сравнительное изучение содержания и активности ряда НСБ с известной функцией при шизофрении, сенильной деменции и болезни Альцгеймера позволило выявить новое звено патологического процесса в мозге при этих заболеваниях - нарушение обратимого фосфори-дирования креатина. Эта реакция, регулирующая уровень АТФ в клетке и катализируемая КФК ВВ (КФ 2.7.3.2), практически н^ изучена в мозге как в норме, так и при патологии.

В нашем исследовании обнаружено понижение удельной активности КФК ВВ в ряде областей мозга при всех исследованных заболеваниях, причем при болезни Альцгеймера и сенильной деменции это но-' нижение более выражено, чем при шизофрении.

Наряду с понижением активности КФК ВВ, выявлено также понижение содержания нейронального белка НСЕ и глиального белка Г5КБ. Таким образом, изучение аутопсийного мозга больных шизофренией, сенильной деменцией и болезнью Альцгеймера показало, что патологические процессы затрагивают как нервные, так и глиальнне клетки, что подтверждается определением повышенных концентраций нейрональных п глиальных НСБ в крови больных этими заболеваниями. .

Анализ данных по локализации обнаруженных изменений содер- , вания или активности НСБ в структурах мозга при исследуемых болезнях показал, что для каждого из заболеваний характерна своя картина распределения изменений. Так, изменения НСБ при шизофрения сконцентрированы в сенсорной и лимбичэской функциональных системах мозга. Для сенильной деменции я болезни Альцгеймера наблюдается более диффузная картина распределения изменений : наряду со структурами сенсорной я лимбической системы, эти изменения выявлены в структурах других функциональных систем мозга (в

25 •

лобной коре, коре мозжечка, хвостатом ядре).

Саким образом, предложенный в настоящей работе методологический подход, заключающийся в сравнительном изучении содержания и активности НСБ с известной функцией в мозге больных и лиц контрольной группы, позволил выявить новое звено патологического процесса при шизофрении, сенильной деменции и болезни Альцгейме-ра и обнаружить особенности этого процесса при исследуемых заболеваниях.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружен, выделен и охарактеризован по физико-химическим, иммунологическим свойствам и распределению в мозге человека новый видо- и нейроспецифический белок 10-40-4.

Белок 10-40-4 содержит одну полипептидную цепь, его молекулярный вес павен 78 кДа, изоэлектрическая точка - 4,6. Определен аминокислот.Л состав белка 10-40-4 мозга человека и крысы; выявлено относительное увеличение аспарагиновой кислоты и уменьшение глицина в белке 10-40-4 мозга человека. Установлена степень иммунологического сходства белка 10-40-4 мозга человека и аналогичных белков животных. Изучена локализация белка 10-40-4 мозга человека на субклеточном, клеточном и региональном уровнях. Белок 10-40-4 относится к числу нейрональных белков и выявляется в водорастворимой и мембранной фракциях мозговых экстрактов. Его содержание максимально в таламусе, четверохолмии, продолговатом мозге и минимально - в областях новой коры.

2. Показано присутствие в мозге человека видо- и нейроспе-цифического белкаБ у-1. Проведено ввделение этого белка и изучэ-ние его физико-химических,, иммунологических свойств; определено региональное распределение белка б у-1 в мозго чоловока.

Белок у-1 мозга человека содержит две субъединицы с молекулярными массами 40 кДа, его изоэлектрическая точка равна 5,0. Установлена степень иммунологического сходства белказу-1 н аналогичных белков мозга животных. Изучена локализация белкаву-1 в мозге человека на региональном уровне; содержание этого бедка максимально в продолговатом мозге и минимально - в областях но- -вой коры.

3. Выявлена значительная вариабельность содержания нейро-слецифичесхих белков НСЕ и ГФКБ, а также активности КФК ВВ в различных отделах мозга человека: различия между максимальней и

26

минимальным содержанием для ГФКБ - 10-кратные, для НСЕ - 2-крг,-тные, различия между максимальные и минимальньм уровнем удельной активности КФК ВВ - 40-кратные.

4. Региональное распределение этих белков, а также активности КФК ВВ в ткани мозга больных шизофренией, сенильной деменцией и болезнью Альцгеймера достоверно изменено; при каждом из этих заболеваний выявлен характерный комплекс изменений, охватывающих разные структуры мозга.

5. Для шизофрении по сравнению с нормой характерно снижение содержания НСЕ, ГФКБ q таламусе, лимбической коре, гиппокампе и гипоталамусе; в то время как для сенильной деменции - отсутствие изменений НСЕ, сопровождающееся пониженным содержанием Г5КБ в таламусе и гипоталамусе, при болезни Альцгеймера снижение содержания НСЕ наблюдается только в гиппокампе.

6. Для шизофрении, сенильной деменции и болезни Альцгеймера обнаружено перераспределение региональной удельной активности КФК ВВ: максимальная активность КФК ВВ в норме выявлена в зрительной коре и таламусе, при сенильной деменции и болезни Альцгеймера -

в слуховой коре, в то время как при шизофрении выявлен одинакопый уровень креатинфосфокиназной активности во всех областях новой коры, а тахже таламусе и гипоталамусе.

7. Удельная активность КФК ВВ в различных отделах мозга при шизофрении, сенильной деменции и болезни Альцгеймера снижена в несколько раз по сравнению с нормой.

Снижение удельной активности КФК ВВ при шизофрении отмечено в зрительной коре, таламусе, лимбической коре и гипоталамусе (максимальное снижение - в зрительной коре и таламусе: соответственно в 10 и 5 раз).

При сенильной деменции и болезни Альцгеймера кроме этих структур, снижение активности наблюдается в лобной и соматосен-сорной коре (максимальное снижение, как и при шизофрении, в зрительной коре и таламусе: соответственно в 20 и 10 раз).

8. Выявлен повшенный уровень НСБ в крови при шизофрении. Обнаружена сенсибилизация организма больных к нейрональным бел-хам НСЕ я 10-40-4 и глиальному белкуs -100; показана повышенная активность КФК ВВ в крови.

j Список работ, опубликованных по теме диссертации, i С.А.Игнатов, Л.В.Ведерникова, Г.Ш.Бурбаева, Д.В.Лозовс-

кий. Антигенный сост-d белковых фракций коры головного мозга человека, полученных хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе // Ж.невропа-тол. и психиатр. - 1979, - Ш. - С. 273-278. , j 2. M.E.Yartanian, G.I.Kolyaskina, D.V.Lozovaky, G.Sh.Burbae-j та, S.A.Ignatov. Aspecto of humoral and collular Immunity in : schizophrenia // Birth Defecto. - 1978, - Т.Н., 5. - P.339-3&4. ! 3. Г.И.Коляскина, Г.Ш.Бурбаева. Современные подходы к изучению иммунитета при шизофрении П Вестник АМН СССР, - 1979, - Ü7. - С. 76-84.

4. М.Е.Зартанян, Г.Ш.Бурбаева, С.А.Игнатов, К.Б.Назарян. Органоспецифаческие водорастворимые белки коры головного мозга; ' возможное участие в физиологических функциях и патологических проявлению*. . / Вопроса биохимии мозга. - 1979, - Т. 13. - С. 144-

б.Т.П.Клшник, Г.Ш.Бурбаева. Выделение и некоторые физико- [ . :химические свойства нового нейроспецифического белка 10-40-4 из мозга человека // Биохимия. - 1983, - Т. 48, й 7. - С. 1203-1208.

6. Т.П.Клшник, Г.Ш.Бурбаева, С.Г.Волощук, Иммунохимичеоков изучение нейроспецифического белка 10-40-4 в экстрактах мозга

¡млекопитающих // Тезисы докладов 9 Всесоюзной конференции по Öno-i химии нервной системы. - Ереван,I9B3. - С. 61-62.

7. Н.И.Соколова, С.Д.Зайко, Г.Ш.Бурбаева. Выделение нейро- 1 специфического изофермента енолазы из мозга человека // Тезисы докладов 9 Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы. -Ереван,1983. - С.88.

8. С.Д.Зайко, Н.И.Соколова, Т.П.Клшник, Г.Ш.Бурбаева. Выделение и свойства нейроспецифических белков 14-3-2, 14-3-3 в

. 10-40-4 // Биохимия. - 1984, - Т.49, ЯЗ. - С. 355-360.

i

9. Т.П.Клшник, О.Г.Башкирова, Г.Ш.Бурбаева. Сравнительное иммунохимическое и физико-химическое изучение нейроспецифического антигена 10-40-4 из мозга человека и крысы // I. эволюционной ¡ биохимии и физиологии. - 1984, - Т.20, й13. - С. 257-260.

10. Т.П.Клшник, С.Г.Волощук, И.В.Аксенова, Г.Ш.Бурбаева. ¡Иммуноферыентное определение нейроспецифического антигена 10-40, ¡4 в экстрактах тканей и органов человека и животных // Болл.ззо-¡пернм. биол. и мед. - 1985, - Й2. - С. 178-180. j

' 28

11. Т.П.Клипник, С.Г.Кушнер, М.В.Аксенова, Г.Ш.Еурбаеза. Клеточная я региональная локализация нейроспецифического антигена 10-40-4 в мозге человека If Бплл.экоперим. биол. и мед.

!1985, - ЙЗ. - С. 296-298.

12. Ы.В.Аксенова, Т.П.Клшник, Г.Ш.Бурбавва. Сравнительная характеристика по физико-химическим свойствам и региональной локализации в мозге человека кейроспвцифаческих белков 10-40-4 и

;Sy-I // Актуальные вопросы психиатрия. - Томск, 1985. - С. 129' 130.

13. Г.Ш.Бурбавва, Т.П.Клппник, М.Я.Цуцульковская, Б.Д.Янко-вич, Й.Хорват. Реакция Артюса и реакция замедленной гилерчувст-вительности к нейроопвцифичеоким белкам S-I00 и 10-40-4 у больных шизофренией //I. невропатол. и психиатр. - 1986, - Jtl. -

С. 103-105.

14. Ы.В.Аксенова, Г.Ш.Бурбавва, Т.П.Клшник. Выявление нзй-роспвцифичвского белка Э/--1 в мозге человека и его региональная локализация в нервной ткани // Биохимия. - 1986, - Т.^1, Я2. -С. 267-272.

. 15. С.Д.Зайко, Г.Ш.Бурбавва. Содержание нчйроспвцифиче'ского1 н нянвйроспвцифвчвского изоферментов енолазы в различных структурах мозга человека // Билл.эксперам. биол. и мед. - 1986, -*7. - С. 21-22.

16. O.Soh.BurbaeTa, T.Í.Kluahnilc, lí.V.Aksenova. The reglo -nal localisation of brain-epecifio protein Sy-1 in brain óf nor» nal and oental diseases subjeots // Abstracts of б KSH General iHeeting. - Prague,1986. - F.422.

17. Г.Ш.Бурбавва, II.В.Аксенова. Содержание я активность хреатянфосфокиназы в некоторых структурах мозга человека в нор-Ш S ШЛ ПОЯХЦЧвОКОв ПЯТЛЛОГНИ // Т*ЧИСУ £0fI5.4OB 10 B0iC9?!3!íCÜ конференция по биохимия нервной сяотемы. - Горький,1987,- С. 30.

18. Г.Ш.5урбавва, С.Д.Зайко. Содержание нейро- я нонайро-опацифичвского взофврментов енолазы в различных отруктурах мозга 7 психически здоровых лвдвй и больных шизофренией // 2.невропатол. я психиатр. - 1987, - II. - С. 104-109.

19. С.Д.Завхо, Г.П.Вурбаева. Содержание нвйроспвцифяческой я нвкейроспецифичвско! виолазы в нервной ткани человека на ран-

29

них стадиях эмбриогенеза // I. эволюционной биохимии и физиологии. - 1967, - JSI. - С. 48-52.

20. Г.Ш.Бурбаева, М.В.Аксенова, В.И.Бибикова. Активность ВВ-креатинфосфокиназы в некоторых структурах мозга у психически здоровых ладей и больных шизофренией // Я.невропатол. и психиатр. - 1987, - JW. - С. 1924-1928.

21. Г.Ш.Бурбаева, М.В.Аксенова, В.И.Бибикова. Активность я содержание ВВ-креатинфосфокиназы в некоторых структурах мозга

, при сенильной деменции и болезни Альцгеймера // 2.невропатол. в психиатр. - 1967, - №9. - С. 1374-1378.

1 22. Бурбаева Г.Ш., Аксенова М.В. Распределение креатинфос-фокинаэы ВВ в различии структурах головного мозга человека // Ж.высшей нервной деятельности. - 1987, - Мб. - С. 1034-1039.

23. Ю.Д.Турсунова, Т.П.Клшник, Г.Ш.Бурбаева. Количество водораствор1.. ,го глиального фибриллярного кислого белка в некоторых регионах головного мозга больных сенильной деменцией // Новое в иммунологии и терапии психических заболеваний. - 11,1988,. |С. 45-4824. Ю.Д.Турсунова, Т.П.Клшник, Г.Ш.Бурбаева, В.М.Воотриков. Иммуноферментное определение глиального фибриллярного белка в некоторых зонах коры больших полушарий и мозжечке человека // Ней- 1 рохимия. - Деп.ШШЛИ. - » I62I-B 88.

25. T.P.Kluohnik, C.Sh.BarbaevQ, I.H.Akulov. Significant dif-1 forencoe of protein шаро of the thaloniuo and frontal cortox of

schizophrenic braino // JJeurochea.lntorn, - I960,- V.13. - Р.139»

26. M.В.Аксенова, Г.Ш.Бурбаева. Увеличение актавнооти KSii ВВ в сыворотке крови больных шизофренией // Тезисы докладов 8 Всесоюзного съезда невропатологов,психиатров,наркологов. - Ц.,1988, - , С. 182-183.

27. В.М.Востриков, Т.П.Клшник, Г.Ш.Бурбаева. Иммуногнотохл-маческое шлвление фиброзных остроццтов при поыоща аптиоивороткн к глиальноыу фибриллярному кислому белку в коре головного мозга при болозни Альцгеймера // Ж. невропатол. и психиатр. - 1988, -#7. - С. 50-52.

Тематический план 1989 г. Я 33G

Подписано в печать 10.07.89 г. Л-29052. Формат 60x90/16. Ротапринтная печать. Усл.печ.л. 2,0. Усл.кр.-отт. 2,125. Уч.-изд.л. 1,98. Тираж 100 экз. Заказ 370. Бесплатно.

Издательство Университета дружбы народов I17923, ГСП-I, Москва, ул.Орджоникидзе,3

Типография Издательства УДК. II7923, ГСП-I, Москва, , ул.Орджоникидзе,3