Антитела к белкам нервной ткани при нервных и психических заболеваниях (иммунохимическое и клинико-иммунологическое исследование)

Морозов, Сергей Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антитела к белкам нервной ткани при нервных и психических заболеваниях (иммунохимическое и клинико-иммунологическое исследование)
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антитела к белкам нервной ткани при нервных и психических заболеваниях (иммунохимическое и клинико-иммунологическое исследование)"

•\ Я !''г\ •¡С;-77 На правах рукописи

УДК 616.89-078+616.8008.939.6- 092 : 612.092.17

Морозов Сергей Георгиевич

АНТИТЕЛА К БЕЛКАМ НЕРВНОЙ ТКАНИ 1РИ НЕРВНЫХ И ПСИХИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ И КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.00.04 - БИОХИМИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории биохимии Государственного научного центра наркологии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Л.Ф. Панченко

доктор медицинских наук А.Б. Полетаев

Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор медицинских наук, профессор Е.А. Строев

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор И.П. Ашмарин

доктор медицинских наук, профессор И.Н. Марокко

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии РАМН.

Защита диссертации состоится 19 мая 1997 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.001.02.01 при Институте Питания РАМН (г.Москва, Устьинский проезд 2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

В.М. Жминченко

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Для глубокою понимания ме-:анизмов функционирования отдельных нервных клеток и моз-■а в делом необходимо изучение метаболических и регуляторных фоцессов, лежащих в их основе. Перспективным направлением в »том плане является изучение белков нервной ткани, представ-[яющих собой уникальные продукты биосинтеза нейронов и гли-льных клеток (Bock Е., 1978; Alberts В. et al., 1983; Полетаев А.Б., [987; Чехонин В.П., 1989; Березин В.А., 1985, 1990; Штарк М.Б., £95), и тех процессов, в которые они вовлечены. В связи с этим >собую актуальность приобретает исследование аутоантител к 5елкам ткани мозга в норме и при патологии, а также их физио-югической или патофизиологической значимости (Штарк М.Б., 1995).

За последние несколько десятилетий получено множест-ю экспериментальных данных, подтверждающих теорию сетевой )егуляции Erne N.K. (1974), согласно которой иммунная система продуцирует антитела (AT) не только к чужеродным, но и со всем собственным антигенам (АГ) организма, т.е. аугоантите-ia (а-АТ). Таким образом, естественные а-АТ являются нормаль-шм физиологическим компонентом организма. На их синтезе специализируются С D5-позитивные лимфоциты, составляющие от [О до 30 % всех B-клеток (Casali P., Notkins A.L., 1989).

По мнению Cohen I.R. (1991), естественные аутореактив-ше лимфоциты и а-АТ отражают образ антигенной, биохими-[еской индивидуальности организма ("иммунологический ■омункулюс"), представляя всю специфичность его молекуляр-юго состава. Примечательно, что а-АТ не только "отражают" биохимический состав организма, но и взаимодействуют с соответствующими АГ-мишенями. Спектр их биологического дей-

ствия чрезвычайно широк - они принимают участие в регуляции всевозможных процессов, происходящих в организме: влияют на связывание рецепторов с лигандами, изменяют проницаемость ионных каналов, вликхг на характер межклеточной адгезии, на процессы транскрипции, трансляции и репликации ДНК и т.д. (Галчева-Гаргова З.И., 1979; Clementi F. et al., 1980; Полетаев А.Б., 1986; Johnson К. et al., 1986; Кущ AA. с co-авт., 1988). Антиидиотипические антитела (АИАТ), или "антитела против антител", вариабельные участки которых по своей конформации имеют сходство с АГ, могут взаимодействовать с рецепторами данного АГ и индуцировать различные процессы (Casenave Р.А. et al., 1983). Имеются сообщения, что не только гиперпродукция, но и недостаточный синтез а-АТ влекут неблагоприятные последствия, проявляющиеся регуляторными дисфункциями (Лебедев КА., Понякина И.Д., 1988). Есть сведения о том, что почти у всех больных с аутоиммунными и неаутоиммунными заболеваниями отмечаются значительные изменения титров широкого спектра а-АТ (Avrameas S., 1991).

Согласно изложенному выше, а-АТ могут претендовать на роль универсальных коммуникаторов организма, координирующих активность различных клеток, органов и тканей. Все это создает предпосылки для кардинального расширения представлений о роли иммунной системы. В том числе, для формирования новых взглядов на роль взаимодействия нервной и иммунной систем в условиях нормы и патологии.

За последние годы было получено множество экспериментальных данных, свидетельствующих о многообразных нарушениях клеточного и гуморального иммунитета при различных нервных и психических заболеваниях (Чехонин В.П., 1989; Кры-жановский Г.Н. с соавт., 1997; Dahlstrom A. et al., 1990; Bernard С.С. et al., 1992; Zeballos R., McPherson R.A. 1992; Amital H., Shoenfeld Y., 1993; Banki K. et al., 1994; Banati KB. et al., 1995). В то же время, множество вопросов, касающихся возможной роли таких нарушений, до сих пор остаются открытыми. Пересматриваются традиционные взгляды на нервную систему как иммуно-логически привилегированную (Lassman Н., 1992; Steck AJ., 1994; Roberts М. et al., 1994).

Несмотря на поиски иммунных нарушений, специфических уш того или иного заболевания нервной системы, особенно а-\Т, служащих "маркерами" этих заболеваний, убедительных, воспроизводимых доказательств такой специфичности до сих пор яе получено. Вероятно, сложности в обнаружении тех, очевидно минорных антигенных компонентов нервной ткани, измененная реактивность к которым определяет нозологическую форму разбивающихся изменений, пока не позволяют однозначно продемонстрировать такую специфичность (исключением может ;лужить, пожалуй, лишь миастения гравис, основным патогенетическим фактором которой является повышение титров а-АТ к щетилхолиновым рецепторам (ВаЛоссюш Е. & а]., 1991)).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель данной работы за-слючалась в комплексном изучении уровня/аффинности а-АТ сласса 1^0 к различным белковым АГ ткани мозга в норме и 1ри ряде нервно-психических заболеваний (НПЗ); идентификации АГ, а-АТ к которым могли бы быть маркерами ряда таких 1аболеваний; а также разработке подходов к специфической им-1унокоррекции повышения уровня/аффинности а-АТ. В соответчик с этим были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать, очистить и изучить физико-химиче-:кие свойства белкового АГ, являющегося одним из основных шшеней повышения титров а-АТ при опийной наркомании.

2. Разработать вариант иммуноферментного анализа (ИФА), помощью которого предоставляется возможным оценить уро-

;ень/аффинность АТ к широкому комплексу антигенных детер-пшант белка, в том числе, к скрытым детерминантам.

3. Создать иммуноферментные тест-системы для опреде-юния АТ к белкам ткани мозга 8-100, вРАР, МР-65 и впервые ;ыделенному белку, обозначенному как НКП, с помощью стан-дртного метода, разработанной оригинальной методики, а таксе тест-систем для определения АИАТ к ним.

4. С помощью созданных тест-систем провести комплекс-1ый анализ образцов сыворотки пациентов с различными НПЗ.

5. Разработать иммуноферментные тест-системы с помощью стандартного метода для определения АТ к нейроросто-

вым факторам НВ-ОАМ (р18) и атрЬо1епп (рЗО) и провести тестирование образцов сыворотки пациентов с разными НПЗ.

6. Разработать иммунохимические подходы к диагностике опухолей головного мозга.

7. Разработать иммунохимический тест доклинической диагностики поражения нервной системы при гепато-церебраль-ной дистрофии (ГЦЦ).

8. Изучить на моделях проницаемость интактного гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) для АТ против АГ мозга.

9. Разработать подход к специфической иммунокоррекции патологического повышения титров а-АТ на основе применения соответствующих АИАТ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

1. В ткани мозга человека впервые идентифицированы три ранее неописанных белка - НКП, НВР-50 и НВР-60. Разработаны методы их очистки. Изучены основные физико-химические свойства и клеточная локализация НКП.

2. Показано, что определение а-АТ к НВР-50 и НВР-60 имеет диагностическую значимость при опухолях головного мозга.

3. Разработан новый вариант И ФА с использованием Р(аЬ)2-фрагментов АИАТ вместо соответствующих АГ, с помощью которого представляется возможным оценивать уровень/аффинность АТ к широкому комплексу антигенных детерминант (эпитопов) белковых молекул.

4. С помощью разработанных иммуноферментных тест-систем проанализирован характер изменений титров а-АТ первого и второго (АИАТ) порядков к белкам ткани мозга 8-100, ОРАР, МР-65 и НКП, а также а-АТ к нейроростовым факторам НВ-ОАМ (р18) и ашрЬогепп (рЗО) в сыворотке крови пациентов с различными НПЗ.

5. Установлено, что повышение сывороточного уровня/аффинности а-АТ к белковому компоненту НЬтр 43 является предвестником клинических признаков поражения нервной системы у больных ГЦЦ.

6. Показано избирательное накопление в ткани мозга внутривенно введенных АТ к нейроспецифическому белку НКП у крыс с неповрежденным ГЭБ.

7. Продемонстрирована принципиальная возможность коррекции повышенной сывороточной иммунореактивности к АГ и нарушенных поведенческих реакций с помощью введения специфических АИАТ (на биологических моделях с индуцированным гипериммунным ответом к белку мозга 8-100).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты, полученные в ходе работы, могут быть широко внедрены в клиническую практику, в том числе, для разработки эффективных диагностических подходов и новых методов терапии. Практическая значимость проведенных исследований может быть сформулирована в виде следующих положений:

1. Разработанные иммуноферментные тест-системы для определения АТ первою и второго (АИАТ) порядков к ряду белков нервной ткани могут быть использованы в клинической практике для оценки степени изменений иммунореактивности к нейроантгенам и выбора адекватного метода терапии.

2. Разработан иммуноферментный тест для диагностики опийной наркомании, основанный на комплексном определении сывороточного уровня/аффинности а-АТ к нейроростовому фактору НВ-ОАМ (рЩ и белкам мозга НКП, МР-65, 5-100 и СРАР.

3. Показана диагностическая значимость определения сывороточных а-АТ к белкам НВР 50 и НВР 60, а также уровня ферритина в СМЖ для выявления опухолей головного мозга.

4. Показана диагностическая значимость определения а-АТ к белковому компоненту мозга НЬтр 43 как предвестника клинических признаков поражения ЦНС при ГИД.

5. Установленный факт избирательного накопления введенных в кровоток опытных животных АТ к НКП в ткани мозга при неповрежденном ГЭБ может иметь принципиальное значение для создания методов направленного транспорта лекарственных препаратов в мозг с помощью соотвествующих АТ.

6. Продемонстрирована возможность коррекции нарушений гуморального "противомозгового" иммунитета с помощью специфических АИАТ.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА. По теме диссертации сделано 18 различных сообщений и докладов. Основные положения диссертационной работы доложены на I Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996 г.), I Международной конференции Украинской противоэпилептической лиги (Киев, 1996 г.), 10 съезде Европейской Федерации Иммунологических Обществ (Эдинбург, 1990 г.), на заседании Московского отделения Российского биохимического общества, на межлабораторных конференциях ГНЦ наркологии Минздрава РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 3££ машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, 7 глав, в которых представлены собственные результаты, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Диссертация содержит 52 рисунка и 70 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалом исследования явились органы, ткани и биологические жидкости человека, быка, кролика, крысы и мыши.

Ткань мозга человека, а также образцы тканей нормальных органов случайно погибших людей (возраст от 20 до 50 лет) брали на вскрытиях, которые проводились в судебно-медицинском морге при РГМУ Минздрава РФ. Ткань перинатального мозга человека (40 недель) получали из патологоанатомического отделения Научного Центра акушерства, гинекологии и пери-натологии РАМН. Причина смерти не была связана с поражением нервной системы. Для получения препаратов белков нервной ткани нами был использован мозг, взятый только в первые 4 часа после смерти, так как в течение этого времени аутолиз ещё не приводил их к значительной протеолитической модификации, что давало возможность получать качественные результаты.

Образцы тканей и органов быка были получены на бойнях мясокомбината им. А.И.Микояна, а образцы органов и биологических жидкостей кроликов, крыс и мышей из вивария лаборатории биохимии ГНЦ наркологии Минздрава РФ.

В работе использовались экстракты из ткани мозга человека, быка и крысы, а также коллекция экстрактов из следующих органов и тканей человека: из сердца, почки, легких, селезенки, диафрагмы, мышцы, печени, тонкого и толстого кишечника, желудка, желчного пузыря, яичников, надпочечников, щитовидной железы, тимуса, матки, яичка, хряща, кожи и аорты. Полученный биологический материал хранили при -40° С.

Образцы сыворотки крови здоровых доноров получали на станциях переливания крови. Коллекция образцов ликворов больных с опухолями головного мозга и здоровых людей была предоставлена доц. В.В. Белопасовым (кафедра нервных болезней Астраханскою медицинского института). Образцы сыворотки крови больных получали из НИИ неврологии РАМН, ГНЦ наркологии Минздрава РФ, лаборатории пароксизмальных состояний ГНЦ социальной и судебной психиатрии им. В.П.Сербско-го Минздрава РФ, клиники им. Корсакова при Московской медицинской Академии Минздрава РФ, отделения нейрохирургии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Научного Центра Психического Здоровья РАМН, специализированной "Клиники неврозов" им. З.П. Соловьева (московская гор. б-ца №8). Полученные образцы биологических жидкостей консервировали с добавлением азида натрия (0,02%), и подвергали однократной заморозке при -40° С.

Применяли схемы очистки белков, основанные на комбинации методов осаждения, ионообменной, гидрофобной, аффинной хроматографии, гель-фильтрации, изохроматофокусирования и препаративного диск-электрофореза.

Препараты S-100 и GFAP, полученные на базе лаборатории биохимии ГНЦ наркологии, были полностью иммунохими-чески идентичны соответствующим препаратам фирмы "Sigma" (США).

При изучении физико-химических свойств белков применяли адсорбционную хроматографию и различные виды элек-

трофореза. Белок определяли по методу Lowiy О.Н. (1951), углеводы - фенол-сернокислым методом. Клеточную локализацию НКП изучали с помощью иммунофлюоресценции.

Для характеристики сывороток и антисывороток, препаратов АТ и АГ применяли методы иммунохимического анализа: иммунодиффузию, перекрестный иммуноэлектрофорез в агароз-ном геле, иммуноблоттинг, высокочувствительные методы имму-ноферментного анализа. С помощью последних определяли уровень/аффинность (иммунореактивность) сывороточных АТ класса IgG.

Для введения тритиевой метки в препарат кроличьих АТ к НКП использовали отечественный препарат меченного бор-гидрида натрия с удельной активностью 0,5 Ки/мМ.

В работе исследовались простейшие поведенческие реакции животных (мышей) в "открытом поле". Регистрировали: общую моторную активность; частоту стоек животных на задних лапах, частоту "исследования нор" и груминг.

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента. Применяли метод множественного сравнения по наименьшей значимой разности (LSD test).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Комплексное исследование иммунореактивности сывороточных АТ к ряду белков нервной ткани в норме и при различных НПЗ проводилось с использованием ранее описанных белков ткани мозга S-100, GFAP, МР-65 (Полетаев А.Б., 1995), а также впервые выделенного белка НКП (нейроспецифический кислый протеин).

Способ получения НКП представлен на схеме 1. Данный белок выделяли под контролем сывороток больных опийной наркоманией, которые, как было установлено, содержат высокие титры АТ к гомогенатам ткани мозга человека. После каждого этапа очистки отбирали ту фракцию, реакция которой с сыворотками пациентов данной группы, определяемая с помощью твердофазного ИФА, была наиболее интенсивной. Цель данного этапа работы заключалась в идентификации АГ, повыше-

ние титров АТ к которому является характерным признаком опийной наркомании. Мы полагали, что получение такого АГ и последующая разработка ИФА для определения АТ к нему может быть использована в комплексной оценке состояния гуморального иммунитета у этих больных и контроля за проводимой терапией. В результате реализации приведенной схемы очистки (схема 1) получали препарат НКП 98% чистоты.

Схема 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НКП

Водно-солевой экстракт ткани мозга человека +

Охлажденный ацетон (равный объем') После центрифугирования при 20 ООО % в течение 40 мин для дальнейшей

работы брали осадок, который растворяли в минимальном объеме 0,05 М РВ5.

Высаливание сульфатом аммония Добавляли сульфат аммония до 70 % насыщения. Центрифугирование проводили при 20 000 д в течение 30 мин. Отбирали осадок, который

растворяли в 0,05 М РВ8.

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе

Элюция в диапазоне концентраций хлорида натрия от 0,35 до 0,6 М.

Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе Элюция в диапазоне концентраций сульфата аммония от 0,6 до 0,2 М. Эту фракцию диализовалн против 0,05 М натрий-ацетатного буфера рН 7,6,

содержащего 1 мМ хлоридов магния, кальция и марганца +

Аффинная хроматография на Кон А-сефарозе Элюция в диапазоне концентраций альфа-метил-В-глюкопиранозида от 0,01 до

0,45 М.

Изохроматофокусирование

Фракция с изоалектрической точкой при рН 3,3-3,1 +

Препаративный диск-электрофорез Вырезали зону, соответствующую альфа-2-глобулинам. Белок экстрагировали

рабочим буфером.

Для определения данного белка в биологических жидкостях был разработан "сендвич"-вариант твердофазного ИФА, предел чувствительности которого составил 1 нг/мл. С помощью

разработанной тест-системы не удалось выявить НКП в гомо-генатах тканей и органов человека, быка и крысы ненейрональ-ного происхождения. В результате был сделан вывод о том, что НКП является нейроспецифическим белком или, по крайней мере, обладает высокой степенью нейроспецифичности, что и нашло свое отражение в его названии. НКП не видоспецифичен. В ткани мозга человека он содержится в диапазоне концентраций 3200±1670 нг/г. В ткани мозга крысы и быка его содержание равно 375±60 нг/г и 740+70 нг/г соответственно.

Сравнение физико-химических свойств НКП (таблица 1) со свойствами известных белков нервной ткани дало основание сделать заключение, что он является не идентифицированным ранее АГ.

Проведение морфологического исследования на парафи-низированных срезах ткани мозга человека показало, что НКП локализуется в астроцитах.

Таблица 1

Основные физико-химические свойства НКП

Физико-химические свойства НКП

Термостабильносгь выдерживает 30 мин инкубацию при 80*С

Относительная молекулярная масса, измеренная методом :

1) гель-фильтрации 67 + 10 кДа

2) диск-электрофореза в ПААГ с ДСН 65 + 2 кДа

Относительная элекгрофоретическая подвижность 0,64 + 0,03

Изоалекгрическая точка рН 3,1-3,3

Наличие просгетической группы углеводный компонент

Были разработаны стандартные иммуноферментные тест-системы для определения АТ к белкам ткани мозга Б-ЮО, О БАР, МР-65 и НКП.

Помимо стандартного твердофазного И ФА была применена предложенная нами методика с помощью которой возможно оценивать иммунореактивность АТ к широкому спектру эпитопов белка. Дело в том, что при применении стандартного ИФА часть эпитопов белковой молекулы при сорбции на планшет меняют конформацию и уже не могут взаимодействовать с соответствующими АТ. Белковые молекулы содержат также "скрытые" эпитопы, недоступные для связывания АТ в данных условиях. Кроме того, тестируемые АТ, связываясь с частью обращенных в пространство наиболее иммуногенных детерминант, могут стерически блокировать другие детерминанты.

Учитывая это, нами была предложена следующая модификация ИФА. Известно, что сыворотка иммунизируемых белком животных содержит не только АТ первого порядка с различной эпитопной направленностью, но и АИАТ, или АТ второго порядка, вариабельные участки которых являются как бы "зеркальным отображением" эпитопов белка и способны связывать АТ первого порядка. Исходя из этого при постановке твердофазного ИФА проводили активацию планшет не самим белковым АГ, 1 Р(аЬ)2-фрагментами соответствующих АИАТ, как бы "раздвигая" таким образом антигенные детерминанты и делая их дос-гупными для соответствующих АТ.

Кроме того, были разработаны тест-системы для опреде-тения иммунореактивности АИАТ к указанным выше белкам. В этом случае планшеты активировали Р(аЬ)2-фрагментами соответствующих антител первого порядка. Это связано с тем, что данные молекулы существенно влияют на иммунный ответ к эазличным АГ (Ройт А, 1991). Сосуществование вдиотипов и ан-гиидиотипов является условием саморегуляции и функционирования иммунной системы (Но1Ье^ Б. й а1., 1984). Поэтому комплексное исследование иммунореактивности АТ первого и второго порядка может дать более целостное представление о состоянии гуморального иммунитета.

Таким образом, на данном этапе работы было создано 12 гест-систем.

Результаты тестирования образцов сыворотки оценивали в процентах относительно эталона. В качестве эталона было при-

нято среднее значение иммунореакгивности сыворотки здоровых доноров, выраженное в единицах оптической плотности. Для определения границ "нормальной иммунореактивности" 576 образцов сыворотки здоровых доноров (от 18 до 54 лет; 402 м + 174 ж) были тестированы во всех 12 разработанных тест-системах. При этом было выявлено, что все определяемые границы "нормальной" иммунореактивности исследуемых АТ первого и второго порядка (по отношению к эталону) примерно одинаковы (таблица 2).

Иммунореакгивность эталона была принята за 100%. В таблицах 2 и 3 представленные значения являются разницей между иммунореакгивностыо тестируемой сыворотки и эталоном (в %).

Таблица 2

Границы нормальной сывороточной иммунореактивности а-АТ и _АИАТ к белкам Б-ЮО, вРАР, МР-65 и НКП, (р< 0,01)_

АГ а-АТ, определяемые стандартным методом а-АТ, определяемые оригинальным методом АИАТ

Б-100 от - 25 до + 35% от - 20 до + 35% от - 25 до + 35%

СРЛР от - 25 до + 48% от - 20 до + 35% от - 25 до + 45%

МР-65 от - 25 до + 35% от - 20 до + 40% от - 20 до + 40%

НКП от - 25 до + 35% от - 20 до + 43% от - 20 до + 45%

Для характеристики выявляемых субстанций был проведен следующий эксперимент. Через колонки с иммобилизованными белками 8-100, ОРАР, МР-65 и НКП пропускали образцы сыворотки здоровых доноров. Иммуноаффинно полученные препараты давали реакцию в иммунодиффузии с кроличьими антителами против человека. При проведении с этими препаратами диск-электрофореза с ДСН наблюдали полосы, соответствующие Н-цепи 1§М и ^О, а также Ь-цепи. Аналогичные результаты получали при изучении препаратов выделенных иммуноаффинно из образцов сыворотки здоровых доноров, когда на колонках иммобилизовали как первичные кроличьи, так

и вторичные кроличьи АТ к указанным выше белкам. В результате был сделан вывод о том, что сыворотка здоровых людей содержит АТ первого и второго порядка к данным белкам, которые предположительно можно обозначить как регуляторные а-АТ.

С помощью набора разработанных тест-систем были проанализированы образцы сыворотки пациентов с различными НПЗ. Полученные после статистической обработки данные представлены в таблице 3.

Исследовали пациентов с опийной наркоманией. Возраст больных - 28+9 лет (24 м + 9 ж). Употребление наркотика от 5 мес до 8 лет. Наблюдали достоверное увеличение всех исследуемых показателей, что, скорее всего, является следствием токсического действия наркотиков на ткань мозга. Наиболее характерным было повышение антител к НКП. Вероятно, свою роль сыграли и описанные Н.Б. Гамалея (1992) нарушения у таких больных в системе комплемента, ведущие к пролонгации циркуляции АТ.

Было обследовано 2 "полярные" группы больных рассеянным склерозом. В первую вошли 28 пациентов (19 м + 9 ж) с непрерывно-прогредиентным течением болезни. Давность заболевания - от 2 до 5 лет. Забор крови был произведен при обострении заболевания при поступлении в стационар. Другую группу составили 32 пациента (24 м + 8 ж) с ремиттирующим течением в периоде ремиссии во время их амбулаторного приема. Давность заболевания - от 2 до 10 лет. Кроме того, было проведено тестирование сывороток 11 пациентов из первой группы через одну неделю после окончания проведения им курса плазмафереза (ПФ).

В группе пациентов с благоприятным течением болезни не было выявлено какой-либо однонаправленной тенденции в изменении иммунореактивности. Большинство исследуемых показателей были в пределах нормы. У больных с непрерывно-прогредиентным течением рассеянного склероза наблюдалось достоверное повышение всех исследуемых параметров. Причем иммунореактивность определяемая с помощью предложенной нами методики была во всех случаях достоверно выше по срав-

нению с определяемой стандартным ИФА, что говорит о повышении уровня/аффинности исследуемых а-АТ, в первую очередь, к "минорным" антигенным детерминантам. После проведения ряду больных этой 1руппы курса ПФ титры исследуемых а-АТ у них существенно понизились, что можно объяснить их удалением во время данной процедуры.

У пациентов с болезнью Паркинсона также наблюдали корреляцию между тяжестью течения заболевания и выявляемыми изменениями в системе гуморального аутоиммунитета. Обследовано 24 человека (14 м + 10 ж) с тяжелым течением заболевания (неврологический дефицит - 18-21 балл по шкале Webster D.D. (1968)), 19 человек (И м + 8 ж) с течением средней тяжести (неврологический дефицит - 9-15 баллов), 25 пациентов (15 м + 10 ж) с легким течением болезни (неврологический дефицит менее 9 баллов). Возраст больных от 42 до 65 лет. Давность заболевания от 4 до 14 лет. Семи больным с тяжелым течением заболевания был проведен курс ПФ. Образцы сыворотки у них брали три раза: до сеансов ПФ и спустя 1 и 3 недели после их окончания.

Уровень/аффинность всех исследуемых а-АТ у больных с тяжелым течением болезни Паркинсона были достоверно выше нормы, а у больных с легким течением от нее не отличались. Пациенты с течением болезни средней тяжести занимали промежуточное положение между двумя предыдущими группами.

У семи пациентов, которым был проведен курс ПФ, через неделю после его окончания отмечено уменьшение неврологического дефицита с 20±2 до 8+2 баллов по шкале Webster. Как и у больных с рассеянным склерозом уже ни у одного из них не наблюдался повышенный уровень/аффинность исследуемых а-АТ. Напротив, у нескольких человек некоторые из исследуемых показателей оказались ниже нормальных значений, что можно объяснить механическим удалением а-АТ во время плазма-фереза. Результаты полученные через 3 недели после курса ПФ были приблизительно такие же. По данным клиницистов, при сопоставлении неврологического статуса этих больных через 1 и 3 недели после сеансов ПФ различий также не отмечалось. Таким образом, наблюдаемое клиническое улучшение коррелировало с

нормализацией или, точнее, с понижением значений определяемых титров а-АТ.

Возможно, снижение титров а-АТ к антигенам мозга в сыворотке крови после курсов ПФ до нормальных значений (или ниже) при указанных заболеваниях является одним из значимых факторов, способствующих временной частичной нормализации различных функциональных систем мозга.

Исследованы образцы сыворотки 48 женщин в возрасте от 19 до 54 лет с невротической депрессией. Исследование проводилось сразу при поступлении в стационар до назначения медикаментозной терапии. По-началу, были протестированы образцы сывороток 20 женщин с различными формами невротической депрессии. Анализ полученных данных свидетельствует об их крайней неоднородности. В этой группе встречались образцы как с патологически повышенным так и пониженным значением каждого из исследуемых параметров. Объяснение этому, вероятно, в неоднородности невротической депрессии, которая в свою очередь подразделяется на различные клинические формы.

Для дальнейшего исследования была отобрана группа больных с одной формой невротической депрессии - астенической, состоящая из 28 человек. У этих пациентов наблюдались достаточно однородные изменения иммунореакгивности. Около половины всех исследуемых показателей были меньше нижней границы нормы. Повышение титров определяемых а-АТ было для них не характерно. Таким образом, в целом, у пациентов с астенической невротической депрессией наблюдалось снижение сывороточной иммунореакгивности к используемым в работе ней-роантигенам (по большинству исследуемых параметров это было статистически достоверно), и это наглядно свидетельствует о функциональной взаимосвязи между нервной и иммунной системами.

При исследовании образцов сыворотки больных эпилепсией не удалось установить выраженных корреляций между изменениями гуморального иммунитета и особенностями течения, формой, давностью заболевания. Полученный результат был объяснен гетерогенностью самой эпилепсии и различием патогене-

тических факторов, лежащих в основе ее генеза. По-вцдимому, не всегда нарушения в системе аутоиммунитета оказывают существенное влияние на генерацию патологических очагов возбуждения. В то же время были обнаружены определенные корреляции между уровнем/аффинностью исследуемых а-АТ и эффективностью проводимой терапии.

Всего было исследовано 54 образца сыворотки больных эпилепсией (29 м +• 25 ж) с различными формами болезни. Возраст пациентов составлял от 14 до 42 лет. В первую группу были отобраны больные, резистентные к проводимой терапии, а во вторую - те, у кого наблюдался положительный эффект от проти-восудорожных средств. Для больных первой группы в большей степени было характерно патологическое повышение исследуемых показателей. У пациентов второй группы все изучаемые параметры были достоверно ниже чем у больных первой группы, и во многих случаях сывороточная иммунореактивность определяемых а-АТ была меньше нижней границы нормы.

Известно, что сенсибилизация лабораторных животных экстрактом ткани мозга способствует более выраженным индуцированным эпиприпадкам (Ерениев С.И., Степанов С.С., 1989). Исходя из этого можно сделать предположение, что низкая иммунореактивность к нейроантигенам способствует повышению "порога" судорожной активности.

При анализе образцов сыворотки пациентов с ГЦЦ (И ж + 9 м; возраст от 24 до 39 лет; давность заболевания от 8 до 15 лет) характерных однонаправленных изменений иммунореакгив-ности не выявлено. В литературе содержаться сведения о повышении уровня протавомозговых а-АТ у таких больных, направленных против астрощггов (Ганнушкина И.В., Алиева Л.М., 1974). Однако судя по результатам нашего исследования, повышение сывороточной иммунореакгивности к тем астроцитарным белкам, которые были использованы в работе, для больных ГЦЦ не характерны. Наоборот, многие показатели были ниже нормы.

Также не удалось выявить изменений, характерных для болезни Шарко-Мари. Было проанализировано 22 образца сыворотки таких больных (15 ж + 7 м; давность заболевания от 4 до 21 года).

Было обследовано три группы больных пожилого и старческого возраста. В первую вошли 32 человека (21 ж + 11 м) в возрасте от 60 до 72 лет с болезнью Альцгеймера пресенильно-го типа. Вторая группа состояла из 28 человек (17 ж + 11 м) в возрасте от 68 до 79 лет с болезнью Альцгеймера сенильного типа. Третью группу составили 41 человек (29 м + 12 ж) с сосудистой деменцией в возрасте от 70 до 81 года. Обсчет полученных данных вели относительно возрастной нормы. В группу контроля вошли 30 человек (19 ж + 11 м) в возрасте от 69 до 82 лет. Состояние их здоровья было оценено как возрастная норма. Границы относительной "нормальной" иммунореактивности в этом возрасте оказались такие же, как и у взрослых лиц 18-54 летнего возраста (таблица 2).

Наблюдалось увеличение среднего значения каждого из параметров иммунореактивности от первой группы ко второй, а от второй к третьей. Для болезни Альцгеймера пресенильного типа какие-либо статистически достоверные однонаправленные изменения изучаемых показателей оказались не характерны. Наиболее высокие титры а-АТ наблюдались у пациентов с сосудистой деменцией, и они достоверно отличались от нормы. Такие результаты согласуется с данными, полученными Mecocci Р. (1995). Возможно, высокие титры AT у последней группы связаны с повышенной проницаемостью ГЭБ у этих больных вследствие атеросклеротической или амилоидной ангиопатии сосудов головного мозга (Lopez O.L. et al., 1992), обуславливающей выход AT нервной ткани в систему циркуляции и стимуляцию ими иммунокомпетентных клеток.

При исследовании образцов сыворотки больных шизофренией каких-либо изменений иммунореактивности, которые были бы характерны для этой болезни в целом или для отдельной ее формы, обнаружено не было. Как и при исследовании образцов сыворотки больных эпилепсией наблюдался большой разброс полученных данных, что также, вероятно, связано с гетерогенностью самого заболевания.

Последняя группа пациентов, которая была обследована с помощью набора описанных тест-систем, состояла из 30 больных (23 м + 7 ж) с отдаленными последствиями черепно-моз-

говой травмы (ЧМТ) в виде неврозоподобных расстройств, проявляющихся ветето-сосуцистыми нарушениями, расстройствами сна, навязчивыми состояниями. Возраст пациентов от 19 до 48 лет. Период после ЧМТ составлял от 2 до 7 лет.

При исследовании образцов их сыворотки с помощью стандартного И ФА патологии выявлено не было. Однако, когда была применена методика ИФА, основанная на активации планшет не АГ, а Р(аЬ)2-фрагментами соответствующих АИАТ, примерно у 20 % пациентов были выявлены высокие титры а-АТ первого порядка. Причем, если наблюдалось их повышение к одному из используемых АГ, то была велика вероятность того, что они будут повышены и к какому-либо другому АГ. Характер изменений иммунореактивности был похож на наблюдаемый при прогредиентной форме рассеянного склероза. Однако в этом случае не наблюдалось адекватного повышения титров соответствующих АИАТ. Таким образом, был сделан вывод о том, что для некоторых пациентов с отдаленными последствиями ЧМТ характерно значительное повышение уровня а-АТ первого порядка к "скрытым" детерминантам белков ткани мозга. Можно полагать, что значение аутоиммунных механизмов при травматической болезни мозга не одинаково у разных больных, и это следует учитывать при подборе адекватной терапии.

В целом, на основании результатов проведенных исследований всех групп больных, можно сделать следующие выводы. Прежде всего, обращает на себя внимание тот факт, что аномальные отклонения в сывороточной иммунореактивности (в ту или иную сторону от экспериментально определенных значений физиологической нормы реакции) наблюдались у большинства обследованных пациентов с разными формами НПЗ. Даже в тех группах больных, у которых не удавалось выявить каких-либо однонаправленных изменений иммунореактивности и их средние значения не отличалось от нормы, один или несколько из 12 определяемых показателей в большинстве случаев выходили за ее границы.

Другой принципиально важный вывод - это то, что отклонения сывороточной иммунореактивности за пределы нормы наблюдались не только в положительную (гиперреактивность),

но и в отрицательную (гипореактивность) сторону. В литературе обычно описывается лишь первое, что свидетельствует о га-перпродукции исследуемых а-АТ, либо о повышении их аффинности. Однако, нередко выявляемое патологическое снижение иммунореакгивности вряд ли следует игнорировать. Если исходить из представлений о регуляторной роли "естественных" а-АТ (lerne N.K., 1974), то снижение их содержания/аффинности ниже допустимых пороговых значений может вести к дисрегу-ляторным метаболическим и функциональным нарушениям.

Еще одна выявленная интересная особенность - это характерная однонаправленность наблюдаемых изменений. Имеется в вцду, что если у больного отмечается повышение титров а-АТ к одному из используемых в работе белков, то велика вероятность того, что и к другим белкам они тоже будут повышены. И наоборот, снижение иммунореакгивности к одному из белков часто сопровождалось снижением интенсивности реакции сывороточных а-АТ и с другими АГ.

У обследованных пациентов, за исключением ряда больных с отдаленными последствиями ЧМТ, изменения уровня/аффинности а-АТ первого порядка сопровождались сходными изменениями в системе АИАТ. Возможно, это следует расценивать как компенсаторную (защитную) реакцию, направленную на то, чтобы "вернуть" уровень а-АТ первого порядка к исходному. Известно, что АИАТ могут препятствовать развитию патологических процессов и их синтез регулируется специфическими идиотипами (Cohen S.A. et al., 1982).

Изменений сывороточной иммунореакгивности, специфических для исследуемых форм нервно-психических заболеваний выявить не удалось. Вероятно, разного рода первичные нарушения в деятельности нервной системы могут вести к сопряженным дисфункциям каких-то малоспецифичных базисных имму-норегуляторных механизмов. Если же исходить из гипотезы о примате иммунных нарушений в развитии различной патологии нервной системы, то можно полагать, что в основе таких заболеваний лежит неполноценность (возможно врожденная) именно базисных звеньев иммунорегуляции, а специфичность вторичных нарушений со стороны ЦНС (нозологическая специ-

фика) определяется какими-либо дополнительными механизмами.

Оценивая практическую значимость используемых на данном этапе работы тест-систем, можно сделать вывод, что в клинической практике в большинстве случаев вполне можно ограничиться исследованием а-АТ к панели нейроантигенов с помощью стандартного метода ИФА. Однако при рассеянном склерозе и травматической болезни мозга более обоснованно применять предложенную методику ИФА, так как используя стандартный метод не всегда удается выявить имеющиеся нарушения иммунореактивности. Исследование же титров АИАТ, судя по полученным данным, имеет ограниченное значение, хотя в ряде случаев их определение в комплексе с соответстующими идиотипами может дать информацию о нарушениях идиотип-антицдиотипической регуляции.

Следующим этапом работы было определение уровня/аффинности а-АТ к нейроростовым факторам HB-GAM (р18) и amphoterin (рЗО) в образцах сыворотки крови пациентов с различными НПЗ. К настоящему времени известен целый ряд ней-ротрофических и нейроростовых факторов белковой природы (Thoenen H., 1991), нарушения синтеза которых связывают с развитием нейродегенеративных процессов (Hefti F. et al., 1986; Shults C.W., 1992). В связи с этим было предположено, что изменение иммунореактивности к молекулам данной группы может быть вовлечено в патогенез некоторых НПЗ. Исследования, касающиеся изучения уровня а-АТ к этим молекулам очень ограничены. В литературе нам не встретились данные, касающиеся изучения а-АТ к рЗО и р18. Данные белки у взрослого человека присутствуют только в нервной ткани (Rauvala H. and Pihlaskari R., 1987; Bloch B. et al., 1992). Получены данные, свидетельствующие о важной их роли в процессах развития, дифференцировки, поддержания жизнедеятельности нервной ткани, а также роста нейритов (Raulo Е. et al., 1992; Parkkmen J. et al., 1993).

Данные белки выделяли из перинатального мозга крысы, взяв за основу схемы, предложенные H. Rauvala (1987, 1989). При их реализации удалось получить препараты белков рЗО и р18 высокой степени гомогенности (95% и 96%). Верификацию

рЗО и р18 проводили с помощью иммуноблоттинга, используя препараты соответствующих АТ, любезно предоставленных профессором Н. Яаиуа1а. Очищенные нейроростовые факторы использовали для разработки стандартного метода ИФА для определения АТ к ним.

По методике, описанной ранее, было показано наличие а-АТ к рЗО и р18 в сыворотке здоровых доноров. С помощью разработанных тест-систем проанализированы образцы сыворотки пациентов с различной патологией нервной системы. Их имму-нореактивность оценивали в единицах оптической плотности проводимой реакции. Результаты исследования представлены в таблицах 4, 5.

При многих исследуемых заболеваниях наблюдалось как повышение, так и снижение титров а-АТ к рЗО и р18 по сравнению с нормой. Особо следует отметить снижение а-АТ к НВ-ОАМ у 94 % обследованных пациентов с болезнью Паркинсо-на и у 85 % с опийной наркоманией. Причем у многих пациентов это снижение было очень существенным. Ни у одного пациента из этих групп не наблюдалось повышения уровня/аффинности а-АТ к данному нейроростовому фактору. 4 из 5 больных опийной наркоманией, у кого титры а-АТ к р18 не отличались от нормы, употребляли наркотики менее 6 месяцев. Остальные употребляли их более длительный период. На основании только этих данных не предоставляется возможным делать окончательный вывод о том, связано ли снижение титров а-АТ к р18 с патогенезом наблюдаемых деструктивных изменений в ткани мозга при этих заболеваниях. Для этого необходимы дополнительные исследования. Однако, в любом случае, это может иметь диагностическую значимость. Так, учитывая результаты предыдущего этапа работы, можно сделать заключение, что для опийной наркомании характерно повышение иммунореактивности а-АТ к белкам мозга 8-100, ОРАР, МР-65 и НКП, сочетающееся со снижением титров а-АТ к р18. Набор таких тест-систем может быть рекомендован для применения в комплексной диагностике опийной наркомании, особенно принимая во внимание тот факт, что наблюдаемые изменения иммунореактивности исследуемых а-АТ (особенно к р18) были характерны и для больных, находящихся в стойкой ремиссии.

Иммунореактивность сывороточных антител первого и второго порядка к белкам 6-100, вРАР, МР-65 и НКП у больных с различными нервно-психическими заболеваниями

Нозологическая АТ к Б-100 АТ К О^'АР АТ к МР-65 АТ к НКП

форма N V аАТ1 аАТ2 АИАТ аАТ1 аАТ2 АИАТ аАТ1 аАТ2 АИАТ аАТ1 аА72 АИАТ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1. Опийная наркомания 33 1 2 39,3 25,5 49,7 21,1 35,5 19,1 32,8 17,1 40.6 18.7 27,7 20,5 57,1 26,3 59,4 27,0 68,3 30,2 90,0 26,3 83,1 25,5 79,2 28,4

2. Рассеянный склероз : а) иепрерывно-прогредиентное течение 28 1 2 16,0 18,2 94,4 44,7 72,6 45,2 16,0 24,4 70,0 56,9 54,0 45,8 19,5 30,8 39,6 43,2 42,9 44,1 18,7 20,3 2М 45,4 76,7 40,6

б) больные из группы "а" после курса ПФ 11 1 2 -14,2' 13,2 -18,4' 14,4 -21,3' 14,9 -10,8' 12,5 -17,9' 9,7 -14,1' 9,7 -11,4' 12,5 -11,9' 13,2 -9,3' 16,6 -18,0' 15,3 -19,1' 14,2 -22,9' 12,9

в) ремиттирую-щее течение 32 1 2 6,0 20,0 9,3' 20,6 5,9' 21,8 1,5' 20,6 3,7' 21,6 6,0' 19,2 5,3' 23,5 6,2' 22,3 8,2' 22,0 9,3 21,4 15,9' 22,6 7,6' 18,1

3. Болезнь Паркинсона: а) тяжелое течение 24 1 2 43.2 31.3 47.8 26.9 44,5 30,8 27,9 21,3 35.1 19.2 31,4 22,3 36,2 22,4 30,9 20,6 29,9 24,7 50,5 24,9 38.5 27.6 44,3 25,8

б) больные из группы "а" через 1 неделю после курса ПФ 7 1 2 -1,0' 10,1 -1,1' 14,8 -7,4' 8,7 -4,3' 9,4 -14,6' 10,6 -4,6" 14,2 -3,9' 12,7 -11,9' 14,0 -9,4' 16,0 -3,6' 6,6 -4,6' 11,6 -10,4' 13,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

в) больные из 7 1 1,6' -1,3' -3,4' -1,7' -7,9' -1,9' -3,6' -7,7' -3,9' -1,4' -4,0' -5,9'

группы "а" через 2 11,4 7,8 11,8 9,5 9,9 9,6 7,5 16,0 10,9 8,7 13,8 8,6

3 недели после

курса ПФ

г) течение сред- 19 1 12,3' 29,2' 18,У 8,2' 17,3' 23,5 10,9' 14,1 16,0 21,7" 11,7' 18,2'

ней тяжести 2 18,1 20,5 20,5 13,2 17,9 14,0 15,3 15,1 15,9 23,7 12,0 20,2

д) легкое течение 25 1 2,4' 0,3" 2,8" -4,8" -1,4" -5,5" 5,2' 6,5' 2,9' 3,4" 1,9' 4,6'

2 13,4 15,7 23.2 14,4 18.4 13,6 13,7 22,1 20,0 14,3 21,0 17,0

4. Невротическая

депрессия :

а) различные 20 1 23,1 15,7 3,3 11,2 11,0 20,3 14,3 27,2 20,0 4,8 14,8 11,3

формы 2 50,0 33,4 33,0 30,5 44,8 54,8 28,6 38,7 45,2 24,8 40,3 36,6

б) астеническая " 28 1 -19,0 -17,9 -22,5 -17,3 -20,9 -23,6 -12,8 -17,1 ■19,3 -20,1 -21,2 -18,7

2 19,8 19,5 17,9 15,6 18,8 22,8 П,9 19,7 20,1 20,2 14,4 17,1

5. Эпилепсия.

Больные :

а) резистентные к 21 1 25,4 48.4 17,3 20,3 44,1 26,1 18,9 45,5 18,1 21,9 50,4 40,9

терапии 2 30,4 44,0 35,2 28,8 47,0 44,5 28,6 46,6 29,2 33,1 47,1 45,7

б) поддающиеся 33 1 -4,1' 4,3' -14,2' -3,2' -0,5' -10,2' 1,3' 11,2' -5,8' -4,3' 0,5' -5,2'

терапии 2 23,5 29.7 30,3 20,3 34,8 36,4 30,4 40,2 32,2 29,7 27,3 33,3

6. Гепато- 20 1 1,9 -3,5 -6,2 -5,2 -11,0 -8,6 -7,8 -8,8 -2,1 -7,7 -15,4 -5,8

церебральная 2 24,3 20,0 23,6 21,3 24,0 24,5 18,8 25,3 21,0 19,3 14,4 15,3

дистрофия

7. Болезнь 22 1 4,5 13,8 -1,3 0,1 0,8 0,9 6,4 0,8 0,1 0,6 4,6 6,8

Шарко-Мари 2 21,1 25,8 25,5 13,7 18,8 24,0 26,3 24,2 16,0 14,3 22,1 20,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

8. Болезнь

Альцгеймера :

а) пресенильнош 32 1 -7,0 -5,5 -6,0 -5,1 -7,2 -6,6 -3,0 -0,5 -0,5 -0,1 3,4 -0,5

типа 2 26,1 26,7 27,8 18,7 20,4 21,7 16,2 18,5 20,3 16,5 18,8 23,8

б) сенильного 28 1 16,6' 13,9' 15,5' 17,2' 14,7' 19,0' 21,3' 16,9' 20,1' 14,0' 17,8 19,0'

типа 2 29,4 24,1 23,9 28,9 24,7 28,7 36,4 35,5 38,7 29,9 30,5 35,8

9. Сосудистая 41 1 41,0" 37,5" 41,5" 34,5" 34,0" 45,2" 39,6" 38,1" 43,5" 40,6" 40,4" 34,8"

деменция 2 33,5 26,3 27,1 25,7 21,7 31,5 28,1 30,4 36,1 28,7 35,4 25,2

10. Шизофрения :

а) вялотекущая 26 1 12,1 12,4 -2,4 0,5 -1,3 6,3 30,7 10.4 28,1 7,6 8,9 4,1

2 29,4 24,6 15,1 28,5 29,4 30,2 42,1 35,8 33,1 23,2 21,8 25,4

б) прогредиент- 22 1 8,8 19,2 -9,6 3,5 2,3 17,3 19,2 24,1 20,7 22,1 21,6 13,3

ная 2 32,0 28,0 14,2 19,4 27,1 33,5 40,1 33,7 26,1 30,2 25,8 23,6

в) пристулооб- 21 1 0,6 6,4 -10,8 -2,5 -11,5 16,5 0,9 17,0 8,5 13,6 5,2 6,5

разно-лрогредиентная 2 22,9 26,7 19,4 19,5 24,1 34,0 36,0 34,6 25,5 37,4 31,9 23,5

г) рекуррентная 24 1 10,5 19,9 -3,6 2,7 8,8 24,3 27,2 36,« 21,6 -5,0 12,9 25,0

2 28,3 32,6 22,6 21,4 32,2 35,7 50,5 40,3 30,1 29,8 31,3 40,5

11. Отдаленные 30 1 1,9 24.6 2,3 2,6 6,6 1,1 -1,5 29,2 -0,8 -0,5 31,6 -4,8

последствия ЧМТ 2 16,0 49,3 19,6 18,2 19,2 15,1 14,0 50,8 14,8 13,4 46,8 11,6

12. Здоровые 576 1 0,3 0,2 0,2 0,6 0,3 -0,2 -0,1 -0,1 0,1 0,1 -0,4 0

доноры 2 9,4 14,8 14,5 16,5 18,0 18,6 11,1 15,6 17,8 15,3 14,7 16,1

N - число образцов;

V 1 - среднее значение показателя иммунореахтивности; 2 - стандартные отклонения;

аАТ1 - аутоанпггела первого порядка, определяемые стандартным ИФА;

аАТ2 - аутоанпггела первого порядка к широкому комплексу антигенных детерминант белка;

АИАТ - акгиидиотшшческие аутоанпггела;

р<0,05

X - выделенным шрифтом обозначены средние показатели распределений, достоверно отличаличающихся от нормы;

X' - в группах "26" и "2в" означает достоверное отличие от "2а"; в группе "56" - от "5а";

Х'(Х") - в группах "Зб-д" означает достоверное отличие от "За"; в группах "86" и "9" - от "8а";

X" - в группе "Зд" означает достоверное отличие от "Зг"; в группе "9" -от "86";

X - показатель аАТ2, достоверно отличающийся от аАТ1.

Результаты определения а-АТ к нейроростовому фактору НВ-йАМ (р18) в сыворотке пациентов с различными нервно-психическими

заболеваниями

Нозологическая форма N Количество образцов с реакцией (00): % (-) % (+)

менее 0,15 от 0,15 ДО 0,25 от 0,25 До 0,41 от 0,41 до 0,76 норма от 0,76 ДО 0,9 от 0,9 ДО 1,1 более 1,1

Острая воспалительная демиели-нюирующая полинейропатия 29 29 0 0

Болезнь Паркинсона 31 4 19 6 2 94 0

Болезнь Лльцгеймера 18 _ _ 1 15 3 6 17

Опийная наркомания 34 5 17 7 5 __ _ 85 0

Болезнь Шарко-Мари 24 __ 2 16 6 __ __ 8 25

Невротическая депрессия 30 _ __ 21 9 70 0

Рассеянный склероз 21 4 6 7 4 _ 48 19

Боковой амиотрофичес-кий склероз 10 1 9 10 0

Гепато- церебральная дистрофия 14 1 6 7 7 50

Эпилепсия 33 -- __ 14 15 2 1 -- 42 9

Шизофрения 35 — 4 24 4 2 1 11 20

N - число образцов;

% - процент образцов со сниженной (-) и повышенной (+) иммунореакгивностыо

Результаты определения а-АТ к нейроростовому фактору апр^епп (рЗО) в сыворотке крови пациентов с различными нервно-психическими заболеваниями

Нозологическая форма N Количество образцов с реакцией (ОО): % (-) % (+)

менее 0,15 от 0,15 до 0,34 от 0,34 до 0,68 норма от 0,68 до 0,9 от 0,9 до 1,1 более 1.1

Острая воспалительная демиели-низирующая полинейропатия 29 5 21 3 29 10

Болезнь Паркинсона 25 _ .. 19 4 2 __ 0 24

Болезнь Алыцеймера 21 3 11 5 2 14 33

Опийная наркомания 16 13 3 0 19

Болезнь Шарко-Мари 9 „ 5 3 1 0 44

Невротическая депрессия 15 __ 2 7 2 4 13 40

Рассеянный склероз 20 1 4 12 3 .. 25 15

Боковой амиотрофичес-кий склероз 5 2 3 40 0

Гепато- церебральная дистрофия 23 12 7 4 0 48

Эпилепсия 31 -- 3 20 3 2 3

Шизофрения 27 — 1 13 6 4 3 4 48

N - число образцов;

% - процент образцов со сниженной (-) и повышенной (+) иммунореактивносгью

Во время отработки первого этапа очистки нейроросто-вых факторов рЗО и р18, при проведении аффинной хромато-

графии на гепарин-агарозе во фракции, содержащей р18, с помощью диск-электрофореза с ДСН были выявлены две белковые субъединицы с молекулярными массами 60 и 50 кДа с очень высокой аффинностью к гепарину. Они присутствовали и во фракциях, полученных аналогичным образом из мозга человека. Интенсивность полос, соответствующих этим субьединицам, на диск-электрофореграммах была выше во фракциях, полученных из перинатального мозга человека и ткани мультиформной гли-областомы по сравнению с мозгом взрослого (особенно 50 кДа). В литературе нами не было обнаружено описания белков с такими свойствами. Исходя из этого было сделано предположение, что выявляемые белки являются неидентифицированными ранее.

Была разработана схема очистки данных белков (схема 2) из ткани перинатального мозга человека (40 нед.), где их содержание составляло около 4-20 мкг каждого на 100 г нативного материала. Полученные белки были обозначены как НВР-60 и НВР-50 (Нерапп-ВтсИг^ Рго1еш). Реализация приведенной схемы позволяла получать препараты высокой степени гомогенности - 91%. Диск-электрофорез в ПААГ с ДСН показал, что белки состоят из одной субъединицы. В Институте Биотехнологии Университета г. Хельсинки было проведено изучение их аминокислотной последовательности. С 1Ч-конца установлена последовательность 10 аминокислот (НВР-60: 1ЧН2-МРУМ11ЬРРСР; НВР-50: МН2~КМУК8Т8КХ>А). Последующий анализ полученной информации с банками данных позволил сделать вывод о том, что эти белки являются не идентифицированными ранее.

Схема 2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НВР-50 И НВР-60

Водно-солевой экстракт ткани перинатального мозга человека

Аффинная хроматография на гепарин-атарозе

Элюция 1,0-1,4 М №С1 +

Гель-фильтрация на вгшегске-П 50+3 кДа 60+3 кДа

НВР-50 НВР-60

Так как содержание НВР-60 и НВР-50 в исследуемых образцах ткани мулътиформной глиобластомы было на порядок выше по сравнению с тканью мозга человека, было предположено, что сывороточный уровень а-АТ к ним может существенно повышаться при опухолевых процессах в ткани мозга. Были созданы стандартные твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения АТ к данным белкам, с помощью которых были протестированы образцы сыворотки пациентов с различными опухолями головного мозга. Их иммунореактивность оценивали в единицах оптической плотности проводимой реакции. Результаты исследования представлены в таблице 6.

Таблица 6

Результаты определения а-АТ к НВР-60 (I) и НВР-50 (II) в образцах сыворотки пациентов с опухолями головного мозга

Количество образцов с реакцией (ОБ):

Вид опухоли N до 0,05 (норма) от 0,05 до 0,2 от 0,2 до 0,4 выше 0,4 %

I II I 11 I II I II I II

Метастаз рака различных органов в мозг 19 17 16 2 2 1 11 16

Глиобласгома 25 16 13 5 7 3 3 1 2 36 48

Астроцитома 21 14 20 4 1 2 — 1 — 33 5

Олигодецдроглиома 19 18 16 1 3 5 16

Менингаома 14 14 14 0 0

Ангиоретикулома 5 5 5 0 0

Гемангиома 8 8 8 0 0

Аденома гипофиза 8 8 8 0 0

Эпевдимома 7 7 7 0 0

Нейрофиброма 9 9 9 0 0

N - количество образцов; % - процент положительных проб.

Ложноположительных результатов отмечено не было. Самый высокий показатель выявления опухоли был в группе больных с глиобластомой, где а-АТ к НВР-50 определялись в 48% образцов сыворотки, а к НВР-60 в 36%.

Следует иметь в виду, что уровень данных а-АТ в сыворотке, вероятно, может повышаться и при опухолях ненейрональ-ного происхождения. Причем это может происходить даже в том случае, если НВР-60 и НВР-50 белки нейроспецифические, так как опухоль может синтезировать и гетероорганные АГ. Поэтому, для того, чтобы данные тесты имели диагностическую значимость для опухолей головного мозга, было предложено проводить их в комплексе с определением неспецифического маркера злокачественного процесса - ферритина в СМЖ.

Известно, что ферритин выходит в СМЖ при злокачественных заболеваниях ненейронального происхождения с вовлечением ЦНС (Vincente V. et al., 1982; Zandman-Goddard G. et al., 1986). В то же время мы не обнаружили в литературе данных об уровне ферритина в СМЖ при различных опухолях головного мозга и провели самостоятельное исследование. Был разработан сендвич-вариант твердофазного ИФА для определения ферритина, с помощью которого протестировали образцы сыворотки пациентов с опухолями головного мозга. Полученные результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7

Результаты определения ферритина в СМЖ больных с опухолями головного мозга

Вид опухали N Число проб с концентрацией ферритина: (нг/мл) %

50-100 100-200 выше 200

Метастаз рака различных органов в мозг 19 2 3 13 95

Глиобластома 25 10 7 4 84

Астроцитома 21 6 3 — 43

Олигодендроглиома 19 5 2 — 37

Менингиома 14 4 3 — 50

Ангиоретикулома 5 1 1 — 40

Гемангаома 8 2 — — 25

Аденома гипофиза 8 — — — 0

Эпендимома 7 — — — 0

Нейрофиброма 9 - - - 0

N - количество образцов; % - процент положительных проб.

, В норме содержание ферритина в СМЖ не превышало 15 нг/мл. Наблюдалась корреляция между концентрацией ферритина в СМЖ и степенью злокачественности опухоли мозга. Следует особо отметить пробы СМЖ у больных с метастазами рака в головной мозг, у которого были особо высоки концентрации данного белка в СМЖ. При доброкачественных опухолях головного мозга уровень ферритина в СМЖ не превышал 200 нг/мл.

Выход ферритина в СМЖ можно объяснить активацией его синтеза в опухолевых клетках (МаШюг У. ег а1., 1980; Ра1е1 К. ее а]., 1980) и нарушением морфологических структур, служащих барьером между тканью мозга и ликвором при опухолевых процессах такой локализации (¡^ющ! 8., 1985).

Мы полагаем, что разработанные тест-системы можно рекомендовать для клинической практики в качестве дополнительных тестов комплексной диагностики опухолей головного мозга.

Исходя из положения о том, что естественные а-АТ являются регуляторами множества гомеостатических процессов, можно полагать, что изменения в спектре антигенной специфичности а-АТ мо1уг предшествовать последующим нарушениям на уровне целостного организма. Одним из подтверждений этому служат работы Г. Носсаля и его сотрудников (1991), показавших, что если у здоровых людей начинают обнаруживаться характерные изменения в спектре циркулирующих а-АТ, то через 3-12 и более месяцев у них часто развивается сахарный диабет.

Одна из задач, которую мы ставили перед собой, заключалась в поиске иммунохимического маркера-предвестника поражения нервной системы при ГИД, проявляющегося клинически. Данная нозологическая форма была выбрана не случайно, т.к. диагноз при этом заболевании обычно выставляют до появления первых клинических признаков поражения нервной системы при наличии печеночных синдромов или же на доклиническом уровне, ориентируясь на низкие показатели сывороточного церрулоплазмина, а затем проводя ДНК-диагностику. Следует полагать, что этому предшествует период патоиммунохимических нарушений. Таким образом, мы имели возможность исследовать

группу пациентов, у которых в последующем следует ожидать развитие неврологической симптоматики.

Было сделано предположение, что предвестником такой симптоматики может быть повышение уровня/аффинности а-АТ к каким-нибудь белкам ткани мозга. С этой целью было решено исследовать мембранную фракцию гепарин-связывающих белков головного мозга человека, которая содержит большое количество трофических факторов (Rauvala Н., 1992).

Данную фракцию получали с помощью детергента октил-глюкозида с проведением аффинной хроматографии на гепарин-сефарозе. Был проведен иммуноблотгинг полученной фракции с 21 образцом сыворотки больных ГЦЦ, у которых наблюдается неврологическая симптоматика, а также с образцами сыворотки пацинтов с другими неврологическими заболеваниями: болезнью Паркинсона, рассеянным склерозом, боковым амиотро-фическим склерозом, оливопонтоцеребеллярной дегенерацией, торсионной дистонией, болезнью Фридрейха и здоровых доноров (5 образцов сыворотки каждой нозологической формы и 19 - здоровых доноров).

Все тестируемые образцы сыворотки больных ГЦЦ реагировали с полученным препаратом, выявляя белковый компонент массой 43+2 кДа, получивший название НЬшр 43 (Heparin-bind-ing membrane protein). Сыворотки больных других нозологических форм и здоровых доноров не давали реакции с этим АГ.

Результаты эксперимента не дают возможности исключить, что Hbmp 43 содержится не только в ткани мозга, но также и в печени. А наблюдаемое повышение уровня/аффинности а-АТ к нему у больных ГЦЦ является аутоиммунной реакцией в ответ на ее поражение. В связи с этим был поставлен ряд контрольных экспериментов. Провели иммуноблотгинг той же фракции с образцами сыворотки пациентов с другой патологией, при которой наблюдалось поражение печени. Было исследовано 9 образцов сыворотки больных с алкогольной дегенерацией печени, 15 - с вирусным гепатитом. Ни один из исследуемых образцов не выявлял в данной фракции Hbmp 43. Если фракцию мембранных гепарин-связывающих белков получали не из ткани мозга, а из печени, то образцы сыворотки больных ГЦЦ не выявляли в препарате АГ с массой 43+2 кДа.

При постановке иммуноблотгинга фракции мембранных гепарин - с вяз ывающих белков головного мозга человека с образцами сыворотки больных с начальными проявлениями ГОД, у которых нервная система, по результатам клинического обследования, ещё не вовлечена в патологический процесс, 6 образцов из 14 выявляли в препарате НЪшр 43, реакция остальных 8 была отрицательной. При сравнении между собой этих двух подгрупп больных было установлено, что давность заболевания у пациентов с положительной реакцией на НЬтр 43 была больше, чем у второй подгруппы и составляла от трех до шести лет. Отсутствие неврологической симптоматики можно объяснить успешно проводимой терапией. Во второй подгруппе было 3 пациента, у которых только что диагносцировали ГЦД с помощью лабораторных методов исследования. У 4 других пациентов давность заболевания составляла до трех лет и у одного пациента три с половиной года. Отсутствие у данной подгруппы определяемого уровня а-АТ к НЬтр 43 мы объяснили тем, что пато-иммунохимические процессы еще не затронули ткань мозга. Данный эксперимент был проведен в 1995 г., а к началу 1997 г. у двоих из шести пациентов, сыворотки которых выявили НЬтр 43, появились первые клинические признаки поражения нервной системы. У пациентов второй подгруппы они пока отсутствуют. Таким образом, есть основания полагать, что повышения уровня/аффинности а-АТ к НЬтр 43 является предвестником физиологических нарушений в нервной системе.

При изучении сывороточной активности а-АТ к белкам мозга одним из ключевых является вопрос о том, могут ли эти а-АТ проникать в ткань мозга через ГЭБ? В настоящее время получено множество данных, свидетельствующих о том, что гис-тогематические барьеры, в частности ГЭБ, не являются непреодолимой преградой для АТ. Так, например, было показано, что введение в кровоток животных "противомозговых" АТ существенно влияет на врожденные и приобретенные поведенческие реакции (Казначеев В. П., Штарк М.Б., 1971; Штарк М.Б., 1985). Механизмы предполагаемой пенетрации АТ сквозь ГЭБ на пути к своей мишени во многом остаются неясными. Высказана гипотеза об их активном транспорте (Полетаев А.Б., 1995). По мне-

нию других исследователей, интактный ГЭБ является непреодолимым препятствием для циркулирующих AT, и лишь патологические его изменения приводят к проникновению таких AT в мозг (Бредбери М, 1983).

В связи с этим мы поставили перед собой задачу дополнительно изучить возможность проникновения в ткань мозга "противомозговых" AT через неповрежденный ГЭБ. С этой целью использовали AT к НКП, выделенные иммуноаффинно из сывороток гипериммунных кроликов, которые метили боргидри-дом натрия (Na3HB04) и вводили однократно внутривенно опытной группе беспородных крыс (самцы), состоящей из 90 животных, в дозе 500 мкг. Контрольной группе (90 особей) вводили аналогичную дозу неиммунного кроличьего IgG. Спустя 1, 3, 5, 7, 9 и 11 суток после инъекции по 15 животных из опытной и контрольной группы перфузировали физиологическим раствором, забирая у них перед этим образцы крови для анализа. После перфузии животных забивали, забирая для скенирования следующие органы: головной мозг, почки, печень и легкое.

В таблице 8 представлено распределение меченных AT к НКП и неиммунного кроличьего IgG через сутки после их введения. В 1 г ткани мозга опытных животных было аккумулировано 53,4+6,1 мкг меченных AT, что соответствует примерно 20% от введенной дозы препарата. Последующее их снижение показано на рисунке 1. А у животных, которым вводили неиммунный кроличий IgG, содержание вводимого препарата в ткани мозга составляло 1,8+0,3 мкг, что соответствует примерно 0,8% от введенной дозы. На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что интактный ГЭБ не является непреодолимым препятствием для AT, направленных против АГ ткани мозга.

Возможно, при тех патологических состояниях, которые сопровождаются нарушением функции ГЭБ, аккумуляция таких AT в ткани мозга более выражена. Учитывая, что при многих НПЗ в сыворотке крови обнаруживаются высокие титры "противомозговых" AT, полученный результат косвенным образом может свидетельствовать об их влиянии на процессы, происходящие в нервной ткани (Полетаев А.Б., 1987).

Таблица 8

Распределение меченных Ыг? НВ04 АТ к НКП и неиммунного 1дС _через сутки после введения препаратов_

Образцы весом 1 г Содержание меченных АТ к НКП, мкг Содержание неиммунного кроличьего ^О, мкг

Головной мозг 53,4±6,1 1,8+0,3

Кровь 2,0±0,1 5,4±0,3

Печень 8,7±1,3 13,2±2,0

Почка 3,510,5 6,8±1,4

Легкое 2,2±0,2 3,1±0,3

10-

< \...................................... ...................................

*......;.....*......;......1

0 1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

дни

Рис. 1 Графическое изображение динамики содержания меченых АТ к НКП в ткани мозга опытных (сплошная линия) и контрольных (пунктирная линия) крыс (на 1 г ткани).

Заключительный этап представленной работы состоял в разработке метода специфической иммунокоррекции патологической гиперпродукции AT. Данная проблема является актуальной задачей сегоднянего дня, решение которой еще не принесло ожидаемых результатов. Следует обратить особое внимание на появившиеся многочисленные публикации, свидетельствующие об эффективнсти внутривенного введения гаммаглобулина, полученного из сывороток здоровых доноров, при многих, особенно аутоиммунных, заболеваниях. Согласно F. Rossi с коллегами (1989), этот эффект может быть связан с нейтрализацией ауто-антител антиидиотипическими антителами, содержащимися в нормальной сыворотке. Кроме того, установлено, что АИАТ являются одним из основных регуляторов иммунного ответа и механизмов толерантности (Colvin R.Y., Olson К А., 1985), могут стимулировать или супрессировать функции Т- и В-лимфоцитов (Пинегин Б.В., 1985). Известно, что предварительное введение мышам 10 нг монокланальных АИАТ к определенному АГ значительно увеличивает долю первичных AT в ответ на последующее введение самого АГ. В то же время введение 10 мкг АИАТ существенно подавляет экспрессию первичных специфических AT, если через несколько недель животным ввести АГ.

В данной работе была поставлена обратная задача - изучить возможность подавления экспериментально индуцированного гуморального иммунного ответа с помощью специфических АИАТ и их Fab-фрагаентов на примере белка S-100. Данный белок был выбран в связи с тем, что гиперпродукция а-АТ и сенсибилизация организма к нему характерны для целого ряда заболеваний нервной системы, например, для детского церебрального паралича, некоторых форм деменции (Полетаев А.Б., 1987; Jankovic B.D., Djordjijevic D., 1991; Mecocci P. et al., 1995).

Препарат АИАТ к S-100 получали из сывороток пшерим-мунных кроликов.

Моделирование аутоиммунного процесса к белкам группы S-100 проводили на взрослых мышах BALB/c (самки), которых трехкратно иммунизировали конъюгатом S-100-гемоцианин (в молярной пропорции 6:1) с равным объемом полного адъюван-та Фройнда (ПАФ) с интервалами в 14 дней (10 мкг коныоги-

рованного S-100 на мышь) внутри- и подкожно в 8-10 точек в зоны лимфатических узлов. Контрольную группу мышей иммунизировали аналогичными дозами конъюгата бычий сывороточный альбумин (БСА)-гемоцианин с ПАФ. В сыворотке неимму-низированных животных с помощью ИФА был выявлен определенный уровень а-АТ к S-100, который при обработке результатов, полученных в ходе дальнейшей работы, был принят за 100 %. Сывороточную анти-S-lOO иммунореактивность определяли с помощью ИФА до и после иммунизации, а также после специфической иммуносупрессии (на 2, 5, 7 и 28 день).

Препараты АИАТ к S-100 или их Fab-фрагментов вводили внутрибрюшинно однократно спустя 10 дней после последней иммунизации, когда у мышей устанавливались высокие титры антител к S-100 (1:10000 и более). Применялись 3 различные дозировки АИАТ к S-100: 200 мкг, 2 мкг и 20 нг в 200 мкл 0,9% раствора NaCI. Другим группам животных вводили РаЬ-фрагмен-ты АИАТ к S-100 в дозах 140 мкг; 1,4 мкг или 14 нг, что примерно соответствовало удельным дозам Fab-фрагментов в вводимых препаратах цельных АИАТ. Контрольным группам животных вводили аналогичные дозы неимунного кроличьего IgG или их Fab-фрагментов. Каждая группа опытных и контрольных животных составляла 30 особей.

На рис. 2 представлена наблюдаемая динамика уровня/аффинности AT к S-100 после введения АИАТ. Полученные результаты свидетельствовали, что АИАТ являются эффективным инструментом для коррекции гуморального иммунного ответа. На 5 день после их введения в дозе 20 нг иммунореактивность сыворотки опытных животных к S-100 достоверно не отличалась от неиммунизированных животных и существенно не изменялась по крайней мере в течение последующих 23 дней. При использовании дозы 2 мкг аналогичный эффект наблюдался на 7 день. Титры AT к S-100 у животных, которым вводили 200 мкг АИАТ, так и не достигли исходных значений за весь период наблюдения (28 суток).

Измерение иммунореактивности на второй день показало выраженный дозозависимый эффект. Чем меньше была доза вводимых АИАТ, тем сильнее была выражена иммуносупрессия. Раз-

2,000

1,500

1,000

500

100

II III IY

Периоды тестирования

I.. I - неиммунные кроличьи IgG в дозе 20 нг, 2 мкг, 200 мкг m - 20 нг АИАТ к S-100 [771 - 2 мкг АИАГ к S-100 |\Гч1 - 200 мкг ЛИАТ к S-100

Рис.2 Уровень антител к белку S-100 у мышей в процентах от нормы в зависимости от дозы вводимых кроличьих АИАТ в различные периоды. По оси 0Х - периоды тестирования: I - перед введением; II, III, ГУ, У - через 2, 5, 7, 28 дней соответственно после введения препаратов. По оси 0У -aimi-S-lOO иммунореактивносгь (в процентах; анти-S-lOO иммунореак-тивность неиммунизированных животных принята за 100%).

личия в трех исследуемых группах между собой, а также с контролем были достоверны (р<0,01). У животных, которым вводили Fab-фрагменты АИАТ к S-100 наблюдался аналогичный имму-носупрессивный эффект, однако он был менее выражен. Вводимые контрольным группам неиммунные кроличьи IgG или его Fab-фрагменты не оказали существенного влияния на им-мунореактивность к S-100. Мы полагаем, что снижение наблюдаемого эффекта при введении Fab-фрагментов АИАТ к S-100 по сравнению с цельными молекулами АИАТ объясняется не удалением видоспецифического участка молекулы AT - Fc-фраг-мента, а повреждением Fab-фрагментов ферментом в процессе их гидролиза/очистки.

Исходя из полученных данных, можно сделать предположение, что механизм наблюдаемого эффекта связан не с изме-

I | - неиммунные кроличьи IgG в дозе 20 кг, 2 мкг, 200 мкг Е23 - 20 яг АИАТ к S-IQ0 [771 - 2 мкг АИАТ к S-100 РГЧ - 200 мкг АИАТ к S-100

Периоды тестирования

| I - неиммунные кроличьи IgG в дозе 20 нг, 2 мкг, 200 мкг ЕВ - 20 нг АИАТ к S-100 1771 - 2 мкг АИАТ к S-100 £¡23 - 200 мкг АИАТ к S-100

Периоды тестирования

| I - неиммунные кроличьи IgG в дозе 20 нг, 2 мкг, 200 мкг Г—1 - 20 нг ЛИАТ к S-100 Х7~А - 2 мкг АИАТ к S-100 ЕЗ - 200 мкг АИАТ к S-100

120 -г—

I II III IY У

Периоды тестирования

I I - неиммунные кроличьи IgG в дозе 20 нг, 2 мкг, 200 мкг СЗ - 20 нгАИАТ KS-100 Г771 -2 мкг АИАТ к S-100 ЕЗ - 200 мкг АИАТ к S-100

Рис. 3. Динамика показателей моторной активности (А), частоты груминга (Б), частоты стоек на задних лапах (В), частоты осматривания "нор" (Г) мышами в "открытом поле" в процентах от нормы в зависимости от дозы вводимых кроличьих АИАТ к S-100 в различные периоды. По оси 0Х - периоды тестирования: I -перед введением; II, III, IY, Y - через 3 часа, 2, 5, 20 дней соответственно после введения препаратов. По оси 0Y - параметры поведения (в процентах; показатель частоты осматривания "нор" неиммунизированными животными принят за 100%).

нением баланса идиотипов-антиидиотипов, а с дозозависимыми различиями чувствительности к АИАТ иммунокомпетентных клеток (например, специфических Т-хелперов и Т-супрессоров), принимающих участие в модуляции иммунного ответа. Вероятно, эффективность такой стимуляции достигается высокой аффинностью препарата примененных АИАТ, которые были получены из сывороток гипериммунных кроликов, многократно иммунизированных Б-100 на протяжении нескольких лет.

В "открытом поле" у животных изучали общую моторную активность (число пересеченных квадратов), груминг и показатели исследовательского поведения (частота стоек на задних лапах и частота осматривания "нор"). Исследование проводили до и после курса иммунизации конъюгатами 8-100 и БСА, а также 4 раза после введения АИАТ или их РаЬ-фрагментов (через 3 ч, через 2, 5 и 28 дней после инъекции). Длительность одного сеанса составляла 10 мин. У животных, иммунизированных конъ-югатом 8-100, выявлено достоверное снижение всех этих показателей. В группе контрольных животных, иммунизированных конъюгатом БСА, не выявлено заметных изменений поведенческих реакций.

Моторная активность достоверно не отличалась от нормы через 2 дня после введения АИАТ к 8-100 в указанных дозах и существенно не изменялась по крайней мере в течение 20 дней. У животных, которым ввели 20 нг, этот показатель не отличался от нормы уже через 3 ч после инъекции (рис. ЗА).

Груминг достоверно не отличался от нормы через 2 дня после введения АИАТ к 8-100 в дозе 200 мкг и существенно не изменялся по крайней мере в течение 20 дней. У других животных, которым вводили данный препарат в количестве 20 нг и 2 мкг, этот показатель так и не достиг исходных значений. В данном случае большая доза оказалась значительно эффективней (рис. ЗБ).

Частота стоек на задних лапах нормализовалась через 3 ч после инъекции 20 нг АИАТ, а после инъекции 2 мкг этого препарата не отличалась от нормы через 2 дня. Эффект сохранялся по крайней мере 20 дней. Введение 200 мкг препарата так и не привело к нормализации этого показателя (рис. ЗВ).

Частота осматривания "нор"достоверно не отличалась от нормы уже через 3 часа после введения препарата в дозе 20 нг и 2 мкг, что сохранялось по крайней мере 20 дней. А введение 200 мкг препарата не привело к нормализации этого показателя (рис.ЗГ).

Изменения поведения опытных животных, которым вводили РаЬ-фрагменты АИАТ к Б-100 были менее выражены, хотя и наблюдались похожие дозозависимые эффекты. Не иммунный кроличий ^О, а также его РаЬ-фрагменты, вводимые группе контрольных животных, не оказали значимого влияния на их поведение.

Мы считаем, что полученные данные свидетельствуют о физиологической значимости иммунорегуляторных механизмов и возможности их участия в патогенезе ряда нервных и психических заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. В сыворотке здоровых людей идентифицированы антитела первого (идиотипы) и второго (антиидиотипы) порядков к ряду белков нервной ткани, которые предположительно обозначили как регуляторные аутоантитела.

2. Для большинства пациентов с различной патологией нервной системы характерно изменение сывороточной имму-нореакгивности к белкам нервной ткани, которое проявляется не только ее повышением, но и снижением по сравнению с нормой.

3. Ткань мозга человека содержит не идентифицированный ранее нейроспецифический белок, обозначенный как НКП в концентрации 3200+1670 нг/г, аутоантитела к которому существенно повышены у больных опийной наркоманией. Разработан метод очистки НКП, позволяющий получить данный белок 98% чистоты. Изучены его основные физико-химические свойства. Показано, что НКП является гликопротеидом с молекуляр-

ной массой 65±2 с изоэлектрической точкой при рН 3,3-3,1, относительной электрофоретической подвижностью 0,64±0,03.

4. Ткань мозга человека содержит не идентифицированные ранее 2 белка (подтверждено результатами изучения их аминокислотной последовательности), имеющие высокую тропность к гепарину, обозначенные как НВР-50 и НВР-60. Их молекулярная масса составляет 50±2 кДа и 60+1,7 кДа соответственно. Разработаны стандартные иммуноферментные тест-системы для определения антител к ним класса Тест-системы отличаются высокой точностью и надежностью (коэффициенты вариации 4,27 и 4,45% соответственно). Показано значение определения сывороточной иммунореакгивности антител к НВР-50 и НВР-60 в комплексе с измерением уровня ферритина в спин-но-мозговой жидкости как дополнительного лабораторного метода в диагностике опухолей головного мозга.

5. Разработан метод твердофазного иммуноферментного анализа для определения иммунореакгивности антител к широкому комплексу антигенных детерминант белков. Метод основан на активации планшетов не самим белком, а Р(аЬ)2-фраг-ментами соответствующих антивдиотипических антител.

6. Разработаны и апробированы в клинической практике твердофазные иммуноферментные тест-системы, созданные на основе стандартного иммуноферментного анализа и предложенного метода (см. п.5) для определения идиотипических и антивдиотипических антител класса к белкам мозга Б-100, ОРАР, МР-65 и НКП. Все тест-системы отличаются высокой точностью и надежностью (коэффициенты вариации от 2,72 до 4, 39%).

7. Разработаны и апробированы в клинической практике стандартные иммуноферментные тест-системы для определения антител класса к нейроростовьм факторам ашр1ю1епп (рЗО) и НВ-ОАМ (р18). Тест-системы отличаются высокой точностью и надежностью (коэффициенты вариации от 4,28 и 2,29% соответственно).

8. С помощью созданных тест-систем показаны изменения сывороточной иммунореакгивности, характерные для различных нервно-психических заболеваний, что позволяет рекомендовать

их к использованию в комплексной диагностике заболеваний ЦНС, а также при оценке состояния больного.

8.1. Для опийной наркомании характерно повышение им-мунореакгивности аугоантител к белкам НКП, S-100, GFAP, МР-65, сочетающееся со снижением уровня/аффинности аугоантител к нейроростовому фактору р18, что может быть использовано для диагностики данного заболевания.

8.2. Особенностью непрерывно-прогредиентного течения рассеянного склероза является преимущественное повышение иммунореакгивности аугоантител к "минорным" детерминантам белков S-100, GFAP, МР-65 и НКП, сопровождающееся повышением уровня/аффинности соотвествующих антиидиогипов.

8.3. Для больных с невротической депрессией, в целом, характерны неоднородные изменения иммунореакгивности аугоантител к белкам нервной ткани. Для пациентов с астенической формой невротической депрессии характерно ее патологическое снижение.

8.4. Уровень/аффинность аугоантител к белкам S-100, GFAP, МР-65 и НКП у больных эпилепсией, резистентных к проводимой терапии достоверно выше чем у тех пациентов, которые поддаются лечению.

8.5. Для болезни Паркинсона характерны снижение уровня/аффинности аугоантител к р18, а также корреляция между тяжестью течения и повышенной иммунореактивностыо аугоантител к белкам нервной ткани S-100, GFAP, МР-65 и НКП.

8.6. При шизофрении, а также болезни Шарко-Мари не выявлено каких-либо однонаправленных изменений изучаемых параметров.

8.7. Уровень/аффинность аугоантител к белкам S-100, GFAP, МР-65 и НКП у пациентов с болезнью Альцгеймера сенильно-го типа достоверно выше чем при болезни Альцгеймера пресе-нильного типа, при которой данные параметры достоверно не отличаются от возрастной нормы, и достоверно меньше, чем у пациентов с сосудистой деменцией.

8.8. Примерно для половины больных с отдаленными последствиями черепно-мозговой травмы характерно повышение иммунореакгивности аугоантител к "минорным" детерминан-

там белков 8-100, МР-65 и НКП, не сопровождающееся повышением соответствующих антиидиотипов, что свидетельствует о нарушении у таких больных идиотип-антиидиотипической регуляции.

9. Установлено, что повышение уровня/аффинности ауто-антител класса к гепарин-связывающему белковому компоненту мембранной фракции мозга человека с массой 43±2 кДа, определяемое с помощью иммунобдоттинга с сыворотками больных гепато-церебральной дистрофией, является предвестником развития клинических симптомов поражения ЦНС при этом заболевании.

10. Экспериментально показано, что антитела к белку нервной ткани НКП, введенные в кровоток крыс с неповрежденным ГЭБ избирательно аккумулируются в ткани мозга.

11. На биологических моделях с индуцированным гипериммунным ответом к белку мозга Б-100 установлено, что специфические антиидиотипические антитела могут использоваться для коррекции повышенной сывороточной иммунореакгивности к антигену и нарушенных поведенческих реакций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Immunoabsoiption of autoantibodies to neurospecific proteins (NSP) during therapy of diseases accompanied by the break of blood brain barrier (BBB). - European federation of immunological societies. 10th Meeting. Edinburgh 1990. Abstract N 21 (co-authors V.P. Chekhonin, G.V. Morozov, E.A. Koroteeva, AS. Lebedev, I.A. Ryabukhin).

2. Результаты клинического и иммуноферментного изучения ней-роспецифической лейцинаминопегггидазы у неврологических больных.

- Журн. невропат, и психиат. им. С.С. Корсакова. - 1990. - №12. - С. 20-24 (в соавторстве с АП. Хохловым, Ю.Н. Савченко, В.П. Чехониным, Е.Е. Зотовой, Т.Е. Шмидт, ТД Жученко).

3. Механизмы аутоагрессии антител к нейроспецифическим белкам в эксперименте. - В кн. "Актуальные проблемы общей и судебной психиатрии". - Москва. - 1993. - С. 352-359 (в соавторстве с В.П. Чехониным, Н.Ю. Беляевой, B.C. Пауковым и др.).

4. Иммунохимические показатели структурного повреждения мозговой ткани в различные периоды травматической болезни головного мозга. - Журн. невропат и пскхиаг. им. С.С. Корсакова. - 1994. - №3. -С.74-77 (в соавторстве с В. В. Белопасовым, Н.А. Хрусталевой, С.А. Гроппа, И. А Рябухиным, JI.T. Михальчук).

5. Иммунохимическое изучение состояния гемато-энцефалическо-го барьера в наркологической клинике. - Вопр. наркологии. - 1994. - №3.

- С.41-44 (в соавторстве с Л.Ф. Панченко, А.Г. Врублевским, Е.А Брю-ном, О.С. Абрамовой).

6. Иммунофермеотньгй анализ ферритина в диагностике опухолей головного мозга. - Вопр. мед. хим. - 1995. - Том 41. - №2. - С.43-45 (в соавторстве с В.П. Чехониным, В.В. Белопасовым, Л.Ф. Панченко, И.А. Катковым, Р.Г. Биктимировым, О.С. Абрамовой).

7. Уровень аутоантител к антигенам нервной ткани при опийной наркомании. - Вопр. наркологии. - 1995. - №4. - С.45-48 (в соавторстве с Л.Ф. Панченко, М.И. Сокуром, Т.Ю. Дородных).

8. Changes of the levels of the autoantibodies to neurospecific proteins in patients with morphinism. - Тез. докл. международной конференции "Нейрохимия и фармакология наркоманий и алкоголизма". - С.Петербург, 1996. - С.85-86.

9. Об изменениях уровней аугоантител к белкам мозга у больных опийной наркоманией. - Вопр. наркологии. - 1996,- №1. - С.60-65 (в соавторстве с Л.Ф. Панченко, Б.Б. Гнеденко).

10. Применение ангиидиотипических антител для коррекции аутоиммунных реакций к белку мозга S-100. - Бюлл. эксп. биол. и мед. -1996. - №11. - С. 508-511 (в соавторстве с АБ. Полетаевым).

11. The cellular and humoral immunological parameters in therapy of multiple sclerosis patients with plasmapheresis. - The abstracts of I World Congress of Neurological Rehabilitation. - Newcastle upon Tyne, 1996. - abstr. №125. - P. 87 (co-authors DA Labunsky, S.V. Danilenko, IA Zavalishin).

12. Аутоантитела и нейропатология. - International Journal on Immunorehabilitation. - Moscow, 1996. - №2. - abstr. 158. - P. 105 (в соавторстве с АБ. Полетаевым, О.С. Абрамовой). 13. Антиген Hbmp 43 - мишень аутоаититсл при болезни Вильсона. - Там же. - Abstr. №.159. - Р. 105 (в соавторстве с ДА. Лабунским, С.В. Даниленко, О.С. Абрамовой).

13. Аутоантитела к антигенам ткани мозга при патологии нервной системы. - Тез. докл. Первого Российского Конгресса по патофизиологии. - Москва, 1996. - С. 156 (в соавторстве с Л.Ф. Панченко, Б.Б. Гнеденко, О.С. Абрамовой, С.В. Даниленко, ДА. Лабунским).

14. О возможной роли белка Hbmp 43 в развитии симптомов поражения ЦНС при гелатоцеребральной дистрофии. - Там же. - С. 155 (в соавторстве с Л.Ф. Панченко, Д.А Лабунским, В.В. Полещук, С.В. Даниленко, О.С. Абрамовой).

15. Мозгоспецифические белки и антитела к ним при наследственной дегенеративной патологии мозжечка. - Там же. - С.20 (в соавторстве с Д.А Лабунским, В.П. Чехониным).

16. Аутоантитела к белкам ткани мозга при патологии нервной системы. - Нейрохимия. - 1996. - Том 13. - №2. - С.98-102 (в соавторстве с Б.Б. Гнеденко, Л.Ф. Панченко, В.В. Полещук, С.В. Даниленко).

17. Аутоантитела к антигенам ткани мозга у больных эпилепсией.

- Жури, невропат, психиат. им. С.С. Корсакова. - 1996. - Том 96. - №4. -С.71-74 (в соавторстве с Б.Б. Гнеденко, Я.М. Асановой, О.С. Абрамовой).

18. Нарушение гуморального иммунитета у больных эпилепсией.

- Материалы I Международной конференции Украинской противоэпи-лептической Лиги. - Киев, 1996. - С.49 (в соавторстве с Л.М. Асановой, Т.Н. Лавровой, Б.Б. Гнеденко).

19. Autoantibodies to heparin-binding protein 43 kDa at serum of patients with Wilson's Disease. - Official Journal of the Movement Disorder

Society. - Lippincott-Raven Publishers, 1996. - Vol.11. - Suppl. 1. - Abstr. N P157. - P.49 (co-authors DA Labunsky, V.V. Poleschuk).

20. Brain-specific proteins and its antibodies in patients with hereditary spino-cerebellar ataxia. Там же. Abstr. N P125. - P.41 (co-authors D.A. Labunsky, S.N. Illariosbidn).

21. Autoantibodies to glial proteins S-100 and GFAP in patients with different forms of multiple sclerosis.- The abstracts of 9th Asian and Oceanian Congress of Neurology. - Seoul, 1996. - Abstract N 630 (co-authors D.A. Labunsky, B.B. Gnedenko, IA. Zavalishin).

22. Application of plasmapheresis in the treatment of patients with Parkinson's disease. - The abstracts of 9th Asian and Oceanian Congress of Neurology. - Seoul, 1996. - Abstract N 639 (co-authois Poleschuk V.V., LA. Ivanova-Smolenskaja, MA Piradov).

23. Regulatory autoantibodies during neuropsychiatrie disorders. - Abstracts society for neuroscience. 26 Annual Meeting, Washington, 1996. - V. 22. - Pt. 3. - P. 1794. - Abstr. N 705.19 (co-authors A.B. Poletaev, N.K. Vabishevich, B.B. Gnedenko, IA Zavalishin, T.I. Demidenko).

24. Аутоантитела к белкам нервной ткани в отдаленном периоде черепно-мозговой травмы. - Вопр. мед. хим. - 1996. - Том 42.- Выпуск 2. -С. 147-152 (в соавторстве с JI.M. Асановой, Б.Б. Гнеденко, Л.Ф. Панчен-ко, Т.Н. Лавровой).

25. Some immunochemical criteries of the treatment effectiveness in epilepsia patients. - Matherials of 5th International Expert Forum of Immunotherapy and Gene Therapy. - Jerusalem, 1996. Abstract N 14-67 (co-au-thois L.M. Asanova, B.B. Gnedenko, T.N. Lavrova, DA Labunsky).

26. Dynamics of immunological state in dilteric polyneuropathy patients treated with intraglobin F. - Matherials of 5th International Expert Forum of Immunotherapy and Gene Therapy. - Jerusalem, 1996. Abstract N 14-69 (co-authors DA. Labunsky, S.V. Danilenko).

27. Иммуномодулмрующее действие гиролиберина у больных эпилепсией. - Нейрохимия. - 1996. - Т. 13. - №3. - С.217 (в соавторстве с Л.М. Асановой, Г.А Изыкеновой, Т.Н. Лавровой).

28. Antibodies to the brain tissue proteins in some movement disorders. - Matherials of the 2nd Congress of the European Federation of Neurological Societies. - Rome, 1996. - Abstr. N 29 (co-authors DA Labunsky, V.V. Poleschuk, S.V. Danilenko).

29. Иммунопатологические проявления при гепато-церебральной дистрофии. - Вестник практической неврологии. - 1996. - №2. - С.81-82

(в соавторстве с ДА. .Лабунским, И.Г. Жирновой, В.В. Полещук, М.И. Царевой).

30. Specific correction of high levels of antibodies against brain protein S-100. - Matherials of First Congress of the Federation of Immunological Societies of Asia-Oceania (FIMSA). - Adelaide, Australia, 1996. - Abstr. N 227 (co-autors AB. Poletaev, E.Y. Maximova).

31. Заявка на изобретение N° 95105847. Способ скринингового обследования женщин детородного возраста с помощью тест-системы ELI-P для прогноза развития эмбриона/плода и рождения здорового либо анормального ребенка. Положительный результат экспертизы (в соавторстве с А.Б. Полетаевым, Н.К. Вабшцевич).

32. Мозгоспецифические белки и иммунопатологические проявления при гепато-церебральной дистрофии. - Материалы конференции "Нейроиммунология на пороге XXI века". С.-Петербург, 1996. - С. 16-18 (в соавторстве с Д.А Лабунским, И.Г. Жирновой, В.В. Полещук).

33. Заявка на изобретение № 96121426. Способ диагностики опийной наркомании. Положительный результат экспертизы (в соавторстве с Л.Ф. Панченко, Н.Н. Иванцом, С.В. Котовым, О.С. Абрамовой).

34. Иммунохимические корреляты тяжести течения болезни Пар-кинсона. - Вопр. мед. хим. - 1997. - Том 43. - Выпуск 1. (в соавторстве с ИА. Ивановой-Смоленской, В.В. Полещук, Д.А. Лабунским, МА Пира-довым, Б.Б. Гнеденко).

Информация о работе

Морозов, Сергей Георгиевич
доктора медицинских наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.04

Автореферат

Антитела к белкам нервной ткани при нервных и психических заболеваниях (иммунохимическое и клинико-иммунологическое исследование) - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы