Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноферментный анализ естественных антител к катехоламинам и простагландинам

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трубачева, Жанна Николаевна, Москва



ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ Трубачева Жанна Николаевна

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ЕСТЕСТВЕННЫХ АНТИТЕЛ К КАТЕХОЛАМИНАМ И

ПРОСТАГЛАНДИНАМ

03.00.04. - БИОХИМИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Научные руководители Доктор биологических наук М.А.Мягкова Доктор медицинских наук А.В.Погожева

МОСКВА-1998

СОДЕРЖАНИЕ.

Введение._____3

Список используемых сокращений.__7

Глава 1. Обзор литературы. _8

«ЕСТЕСТВЕННЫЕ АНТИТЕЛА К ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМ СОЕДИНЕНИЯМ»

1.1. Естественные антитела к макромолекулярным физиологически активным соединениям.__________9

1.1.1. Происхождение естественных антител, их связь с ауто- и индуцированными антителами.__11

1.1.2. Иммунохимические свойства естественных антител._.13

1.1.3. Физиологическая роль естественных антител._15

1.2. Естественные антитела к низкомолекулярным соединениям._20

1.2.1. Биосинтез естественных конъюгированных антигенов, содержащих

в качестве гаптенов простагландины, катехоламины и гистамин._22

1.2.2. Физиологическая роль естественных и аутоантител к низкомолекулярным соединениям.__26

Глава 2. Материалы и методы исследований.__30

2.1. Материалы исследования._;_30

2.2. Методы исследований._31

2.3. Синтез конъюгированных антигенов._32

2.3.1. Синтез конъюгированных антигенов на полимерной матрице._32

2.3.2. Синтез конъюгатов на белковом носителе._32

2.3.3. Синтез конъюгированного антигена простагландинаНг__33

2.4. Выделение и очистка Fab' и Fc фрагментов иммуноглобулинов человека.__33

2.5. Проведение реакции иммунопреципитации._34

2.6. Измерение связывания простагландннаРг« с иммуноглобулином человека методом радиоиммунного анализа._35

2.6.1. Определение константы связывания простагландинаРга с

иммуноглобулином человека.__36

2.7. Разработка ИФА для выявления естественных антител к

катехоламинам и простагландинам.__36

2.7.1. Определение оптимальных условий проведения ИФА._36

2.7.2. Проведение ИФА естественных антител к катехоламинам и простагландинам.____________37

2.7.3. Проведение ингибиторного ИФА. _37

2.7.4. Определение константы связывания в ИФА._38

2.8. Клиническая характеристика обследованных больных._38

Глава 3. Результаты и их обсуждение._ 39

3.1. Разработка метода иммуноферментного анализа естественных антител к катехоламинам и простагландинам._39

3.1.1. Синтез конъюгированных антигенов на полимерной матрице._40

3.1.2. Синтез конъюгированных антигенов на белковом носителе.__41

3.1.3. Синтез конъюгированного антигена простагландинаН2._42

3.1.4. Выбор оптимальных условий проведения твердофазного иммуноферментного анализа для выявления естественных антител

к катехоламинам и простагландинам._42

3.2. Исследование иммунохимических свойств естественных антител к

гапгенам._52

3.2.1. Локализация эпитопов, взаимодействующих'с выявляемыми в ИФА

естественными антителами к простагландинуР^, 52

3.2.2. Определение связывающей способности естественных антител против простагландинар2а и их субмолекулярных фрагментов РаЬ\_54

3.2.3. Изучение перекрестной реактивности естественных антител в ИФА методом ингибиторного анализа._57

3.3. Сравнительный анализ естественных антител к катехоламинам и простагландинам в сыворотке крови больных и здоровых людей._61

Выводы._77

Список литературы.

78

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Изучение естественных антител является актуальной задачей современной биохимии, особенно той ее части, в которой исследуются вопросы гуморального иммунитета. К настоящему времени обнаружено участие иммунных механизмов в патогенезе ряда сердечно-сосудистых и нервных заболеваний. Особое место занимает изучение у этой категории больных изменения факторов гуморального иммунитета, которое рассматривается как одна из причин, способная привести к развитию иммунорегуляторного дисбаланса.

Исследования последних лет показали, что важной составной частью циркулирующих иммуноглобулинов являются естественные антитела. Так были обнаружены естественные антитела к нуклеиновым кислотам, фосфолипидам большому числу белковых антигенов и ряду пептидных биорегуляторов. Показано, что при патологических состояниях происходит изменение нормального уровня естественных антител, которое как правило связано с нарушением метаболизма того или иного ключевого эндогенного соединения, участвующего в патогенезе заболевания.

Однако, на сегодняшний день имеется не много исследований, посвященных функционированию факторов гуморального иммунитета в норме, т. е. изучению нормальных иммуноглобулинов, физиологическая роль таких компонентов гуморального иммунитета остается пока, главным образом, предметом гипотез и дискуссий.

В данной работе была предпринята попытка выявления естественных антител к таким низкомолекулярным эндогенным соединениям, как катехоламины и простагландины , которые обладают высокой биологической активностью и являются универсальными медиаторами различных физиологических процессов.

Известно, что индуцированные иммунизацией антитела к эндогенным соединениям могут выступать в организме в роли специфических антагонистов. Возможно аналогичную роль могут выполнять и естественные антитела. Наличие корреляций между колебаниями их уровней, с одной стороны, и активацией или ослаблением физиологических процессов, опосредуемых антигенами, против которых эти антитела направлены, с другой, могло бы служить подтверждением высказанного предположения.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является разработка анализа естественных антител к катехоламинам и простагландинам в сыворотке крови людей, изучение биохимических свойств этих антител, а также их содержания в норме и при сердечно-сосудистых и нервных заболеваниях.

В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

- разработать твердофазный иммуноферментный метод для определения уровней естественных антител к катехоламинам и простагландинам;

провести исследование по выявлению антител к указанным выше соединениям в сыворотке крови людей;

- исследовать биохимические свойства (афинность, специфичность) естественных антител к простагландинам и катехоламинам;

провести сравнительный анализ содержания этих антител в сыворотке крови людей при сердечно-сосудистых и нервных заболеваниях, с целью выявления их функциональной значимости в организме.

Научная новизна работы.

Разработан твердофазный иммуноферментный анализ для определения уровней естественных антител к катехоламинам и простагландинам. Для этой цели синтезированы искусственные антигены адреналина, норадреналина, дофамина, простагландинов Р2а, Ег, Нг на полимерном и белковом макромолекулярных носителях.

Биохимическое исследование выявляемых разработанным методом естественных антител показало, что их связывание с антигеном имеет многоцентровый характер и происходит за счет эпитопов иммобилизованного на белке-носителе гаптена.

С помощью разработанного метода удалось выявить естественные антитела к катехоламинам и простагландинам в сыворотках крови практически здоровых людей. Анализ содержания этих антител у больных сердечно-сосудистыми и нервным]'

заболеваниями показал, что при данных патологических процессах уровни естественных антител к указанным медиаторам достоверно отличаются от нормы.

Практическая ценность работы.

Полученные в работе результаты имеют важное значение для практического использования в медицине и с 1996 года применяются в Клинике лечебного питания Института питания РАМН, где разработанный твердофазный иммуноферментный анализ для определения уровней естественных антител к катехоламинам и простагландинам в сыворотке крови успешно используется в клинической диагностике.

Выявлено увеличение содержания естественных антител к катехоламинам и простагландинуРга у больных инфарктом миокарда и гипертонической болезнью. Показана возможность использования анализа естественных антител к указанным биорегуляторам в клинической практике для наблюдения за эффективностью лечения.

Найдены корреляционные взаимосвязи между содержанием естественных антител и характером протекания сердечно-сосудистых заболеваний. Отмечено, что повышенный уровень естественных антител к простагландинуРга способствует увеличению устойчивости организма к патологическому действию этого медиатора.

Полученные результаты важны с практической точки зрения, поскольку содержание естественных антител, участвующих в патогенезе тех или иных заболеваний может стать диагностическим критерием для оценки иммунологической резистентности больных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработан твердофазный иммуноферментный метод определения естественных антител к катехоламинам и простагландинам в сыворотке крови человека.

2. Проведено исследование биохимических свойств естественных антител к простагландинуРга.

3. Проведено сравнительное изучение содержания естественных антител к катехоламинам и простагландинам при сердечно-сосудистых и нервных заболеваниях, которые сопровождаются нарушением метаболизма указанных биорегуляторов.

Апробация работы.

Основные материалы и положения диссертационной работы доложены и утверждены на:

- XI - Европейском конгрессе по рассеянному склерозу (Израиль 1995 год).

V - Международном форуме по иммунотерапии и диетотерапии (Израиль 1996 год).

Ш-ем Международном симпозиуме «Питание и здоровье. БАД в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний» (г. Тюмень 1997 год).

- Межлабораторной конференции Института физиологически активных веществ РАН (протокол №4 от 27 сентября 1998 года).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

А - адреналин; АГ - антигены; АД - артериальное давление; AT - антитела;

БСА - бычий сывороточный альбумин; ГБ - гипертоническая болезнь; ГЛП - гиперлипопротеидемия; ГН - гистамин;

ГУПГНИИВ - Государственное унитарное предприятие Государственный

научно-исследовательский институт витаминов;

ДА - дофамин;

ДМФА - диметилформамид;

ДНФ - динитрофенол;

Е-АТ - естественные антитела;

ЗФР - забуференный фосфатный раствор;

ИБС - ишемическая болезнь сердца;

ИБХ РАН - Институт биоорганической химии РАН;

ИМ - инфаркт миокарда;

ИТР - ингибитор трипсина из сои;

ИФА - иммуно-ферментный анализ;

ИФАВ РАН - Институт физиологически активных соединений РАН; Ксв. - константа связывания; К-АГ - конъюгированные антигены; НА - норадреналин;

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты;

1ТГЕ2 - простагландинЕ2;

ПГН2 - простагландинН2;

nrF2 а — П Р О ста гл a Н Д И HF2 а;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РАМН - Российская академия медицинских наук;

РАН - Российская академия наук;

IgG - иммуноглобулин класса G;

IgM - иммуноглобулин класса М;

OD - оптическая плотность;

PBS - 0,01 М солевой фосфатный буфер;

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

«ЕСТЕСТВЕННЫЕ АНТИТЕЛА К ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМ

СОЕДИНЕНИЯМ.»

В 1966году С.Бойден определил естественне антитела (Е-АТ) как белки (глобулины) нормальной сыворотки, способные связывать "иммунологически несовместимые" антигены (АГ), то есть такие антигены, которые могут индуцировать иммунный ответ (115). Термин "иммунологически несовместимые" АГ был введен вместо "чужеродные" АГ, поскольку случаи образования антител (AT) к нечужеродным антигенам (аутоантител) были уже широко известны. Однако, как указывал сам С.Бойден, понятие иммунологической несовместимости относительно и не определяет достаточно строго круг рассматриваемых антигенов, поскольку отвечаемость на один и тот же АГ может быть различной даже у особей данного вида в зависимости от их генетических или физиологических особенностей. Поэтому в последующих исследованиях под естественными антителами стали подразумевать любые антитела, содержащиеся в сыворотке практически здорового, неиммунизированного животного или человека.

Само понятие Е-АТ поставило ряд вопросов: а) возникают ли они спонтанно в организме или синтезируются в ответ на стимуляцию ауто-антигенами; б) какова взаимосвязь между естественными антителами, антителами, индуцированными иммунизацией и ауто-антителами, обнаруживаемыми при аутоиммунных заболеваниях; в) какие функции выполняют естественные антитела в организме. Эти вопросы были сформулированы и проанализированы еще в 1966году (115), но наиболее существенный, на наш взгляд, экспериментальный материал для их решения получен в последнее время.

Все многообразие известных в настоящее время Е-АТ условно можно разделить на три группы. Первую группу составляют AT, которые содержатся в относительно высокой концентрации (свыше 1 мкг/мл) в нормальной сыворотке и легко могут быть выявлены без предварительного обогащения. Эти антитела обладают, как правило, узкой специфичностью и способны различать близкие по структуре детерминанты, такие как, например, углеводные маркеры групп крови. Антитела данной группы представлены преимущественно иммуноглобулинами класса

М (1ф(). К таким АТ можно отнести изоагглютины, антитела к АГ Форсмана, антиэритроцетарные антитела (9), антитела к аутологичным ^О (38) и ^А (82).

Для Е-АТ второй группы характерны невысокое содержание в сыворотке и полиспецифичность. Выявление их стало возможным, главным образом, с развитием иммунофермент пых методов. Круг этих Е-АТ достаточно широк и постоянно растет в результате исследований последних лет. К настоящему времени обнаружены естественные антитела как к высокомолекулярным антигенам, например ДНК (48), белкам цитоскелета (64), сывороточному альбумину (117), пептидам (94,114), так и к низкомолекулярным соединениям, таким как фосфолипиды, фосфостидная кислота(109), ссротонин (120), ганглиозиды (125) и динитрофенол (ДНФ) (127).

К третьей группе относятся антиидиотипические антитела. Останавливаться специально па их характеристике в данном обзоре считаем нецелесообразным, поскольку это отдельная, обширная тема. Кроме того, большинством авторов антиидиотипические АТ считаются регуляторными антителами, функциональное значение которых не выходит за рамки иммунной системы.

В обзоре мы сочли необходимым подробно рассмотреть исследования, касающиеся структурных и функциональных особенностей Е-АТ, их происхождение и взаимосвязи с другими видами АТ: индуцированными и ауто-антителами. Основные данные по этим вопросам получены для естественных антител к макромолекулярным антигенам. Анализу этих данных посвящена первая глава обзора. Предметом рассмотрения во второй главе являются исследования Е-АТ к низкомолекулярным соединениям. Здесь рассматриваются факты их выявления, анализируются возможные пути индукции и физиологическая роль таких антител в организме. В заключении приводятся сведения о попытках обнаружения естественных антител к простаглаидинам и биогенным аминам, которые являются объектом данного исследования.

1.1. Естественные антитела к макромолекулярным физиологически активным соединениям.

Несмотря на то, что Е-АТ к эндогенным антигенам известны уже давно, например Е-АТ первой группы - антиэритроцетарные, долгое время обнаружение в сыворотке антител к собственным молекулам организма считалось признаком аутоиммунного расстройства, в соответствии с постулатом, выдвинутым Бернетом, согласно которому: "здоровый организм никогда не реагирует иммунологически

против своих собственных структур" (3). Однако, с развитием различных иммунологических методов выявления АТ, наиболее чувствительный и употребимый из которых - твердофазный иммуноферментный анализ, а также благодаря использованию афинной хроматографии для обогащения специфических АТ, в нормальных сыворотках человека и животных были обнаружены антитела практически ко всем группам эндогенных антигенов: к АГ клеточного ядра - анти-ДНК антитела (48), к белкам цитоскелета (64), к мембранным структурам -фосфолипидам, мембранным белкам (например, цитохрому С) (109,64), к белкам сыворотки крови (117,64,134,81), гормонам (45,90) , рецепторам (58,80,133,130,113,105).

В то же время, повышенное содержание таких антител может являться одним из признаков аутоиммунного заболевания. Классическим примером тому служат АТ против ДНК и фосфолипидов при системной красной волчанке. В этом случае их принято называть ауто-АТ, что отражает патологическую природу таких АТ в отличие от Е-АТ. И кроме того, аналогичные АТ можно индуцировать искусственно активной иммунизацией животного. В связи с этим, вопрос о природе и происхождении естественных антител необходимо рассматривать с точки зрения их взаимоотношения с индуцированными и ауто-антителами. Особенно важные и информативные результаты, касающиеся этой проблемы, были получены в результате исследований последних лет, анализ которых будет представлен ниже.

1.1.1. Происхождение естественных антител, их связь с ауто- и индуцированными анти